Регуляция соматического эмбриогенеза у видов лиственницы в культуре in vitro

Барсукова, Алена Владимировна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Регуляция соматического эмбриогенеза у видов лиственницы в культуре in vitro
ВАК РФ 03.01.05, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Регуляция соматического эмбриогенеза у видов лиственницы в культуре in vitro"

БАРСУКОВА Алена Владимировна

РЕГУЛЯЦИЯ СОМАТИЧЕСКОГО ЭМБРИОГЕНЕЗА У ВИДОВ ЛИСТВЕННИЦЫ В КУЛЬТУРЕ IN VITRO

03.01.05 - физиология и биохимия растений

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 О ЯН3 2011

Красноярск-2011

004619196

Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Института леса им. В.Н. Сукачева СО РАН, г. Красноярск

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Третьякова Ираида Николаевна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Гольд Виктор Моисеевич,

доктор биологических наук, профессор Медведев Сергей Семенович

Ведущая организация: Институт биологии УНЦ РАН (г. Уфа)

Защита диссертации состоится «28» января 2011 г. в Ю00 часов на заседании диссертационного совета ДМ 212.099.15 при Сибирском федеральном университете по адресу: 660041, г. Красноярск, пр. Свободный, 79, ауд. Р8-06.

Тел./факс: 8(391)244-87-90, e-mail: nikgna@gmail.com

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Сибирского федерального университета

Автореферат разослан « ¿Ь » декабря 2010 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета д.б.н., доцент

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы диссертации. Достижения в области культуры клеток и тканей растений привели к созданию принципиально нового метода - клонального микроразмножения в культуре in vitro, т.е. получения in vitro генетически идентичных исходному экземпляру растений (Носов, 1999). Наиболее перспективным направлением в данной области является соматический эмбриогенез. В основе метода лежит уникальная способность растительной клетки реализовывать при определенных условиях имеющуюся у нее генетическую информацию и давать начало целому организму (тотипотентность) (Бутенко, 1964).

Соматический эмбриогенез является модельной системой для исследования факторов, влияющих на морфогенез и развитие зародыша. С помощью соматического эмбриогенеза можно изучать морфогенетические программы (детерминация и дифференциация), а также проводить физиологические и молекулярные исследования (изучение функции генов). Кроме того, соматический эмбриогенез позволяет сохранять генетические ресурсы в течение длительного периода времени, благодаря высокой продуктивности эмбриональной массы и способности ее подвергаться длительной криоконсервации, а также проводить исследования, направленные на массовое тиражирование генетически улучшенных растений (Park, 2002; Klimaszewska et al., 2002; Lelu-Walter et al., 2009).

Исследования соматического эмбриогенеза у сибирских видов хвойных, в том числе лиственницы, начали проводить в первом десятилетии XXI века в лаборатории лесной генетики и селекции Учреждения Российской академии наук Института леса им. В.Н. Сукачева Сибирского отделения РАН. Исследователями были получены эмбриогенные каллусы и соматические зародыши на ранних стадиях эмбрионального развития у лиственницы сибирской (Третьякова и др., 2007; Беяоруссова и др., 2008). Однако зрелые соматические зародыши и массовая регенерация растений до сих пор не были получены.

Между тем, виды рода Larix, являющиеся основными лесообразователями сибирских лесов, характеризуются неравномерностью урожаев в многолетаем цикле и низким качеством семян (Дылис, 1947; Милютин, 1973; Ирошников, 2004; Коропачинский и др., 2006). Кроме того, деревья лиственницы сильно поражаются насекомыми, оказывающими негативное влияние на урожай семян лиственничных лесов, а также отмечается негативное влияние патогенной микрофлоры (наибольшую опасность представляют грибы род Fusarium) на развитие проростков и сеянцев, приводящее к инфекционной гибели практически половины всходов при выращивании лиственниц (Громовых и др., 2007). Поэтому проведение исследований, направленных на оптимизацию физико-химических условий культивирования изолированных клеток и тканей в культуре in vitro для получения соматического эмбриогенеза является необходимым у различных видов лиственницы.

Пели и задачи исследования. Цель работы - разработка и усовершенствование биотехнологии соматического эмбриогенеза у видов лиственницы: лиственницы Гмелина (Larix gmelinii (Rupr.) Rupr.), лиственницы Сукачева {Larix sukaczewii DylisJ и лиственницы сибирской (Larix sibirica Ledeb.), в культуре in vitro.

Для реализации данной цели были поставлены следующие задачи:

- оптимизировать условия для индукции эмбриогенного каллуса и пролиферации эмбриональной массы, а также созревания и прорастания соматических зародышей путем манипуляции с условиями культуры in vitro для лиственницы Сукачева и

лиственницы Гмелина, с использованием в качестве контроля лиственницы сибирской;

- индуцировать соматический эмбриогенез из гибридных семян лиственницы, полученных в результате контролируемого опыления;

- стимулировать рост зародышей и проростков лиственницы путем их обработки метаболитами биоконтрольных штаммов грибов рода Trichoderma и Streptomyces,

- провести цито-эмбриологический контроль соматического эмбриогенеза на всех стадиях биотехнологического процесса.

Научная новизна исследования заключается в том, что впервые для таких видов лиственницы, как лиственница Гмелина и лиственница Сукачева, были разработаны биотехнологические приемы клонального микроразмножения в культуре in vitro, в частности, соматический эмбриогенез. Подобраны условия образования эмбриогенного каллуса, индукции эмбриогенеза и развития соматических зародышей. Разработан новый состав питательной среды, позволяющий получать эмбриогенный каллус и соматические зародыши, а главное, проростки лиственницы Сукачева и ее гибридов. Для созревания соматических зародышей впервые для лиственницы Сукачева были подобраны оптимальные концентрации компонентов питательной среды (АБК, активированного угля, концентрации сахарозы и желирующего агента). Кроме того, в результате контролируемого опыления впервые получено пять высокопродуктивных клеточных линий, способных продуцировать соматические зародыши и растения-регенеранты. Выявлено стимулирующее действие метаболитов биоконтрольных штаммов грибов рода Trichoderma на развитие побега проростков лиственницы Сукачева в культуре in vitro.

Теоретическая и практическая ценность полученных результатов.

Разработанные биотехнологии соматического эмбриогенеза могут стать основой генетико-селекционных работ, направленных на плантационное выращивание лиственниц. В результате реализации работ по соматическому эмбриогенезу видов лиственницы возможно получение массового количества сеянцев лиственницы Сукачева и ее гибридов, устойчивых к поражению насекомыми.

Положения, выносимые на защиту:

1. Оптимизация биотехнологического процесса у видов лиственницы приводит к образованию соматических зародышей и растений - регенерантов.

2. Регенерационный потенциал лиственницы Сукачева в культуре in vitro связан с генотипом дерева.

Личный вклад соискателя. Представленные в диссертации экспериментальные данные получены непосредственно автором.

(Новосибирск, 2009); Международной конференции «Advances in Somatic Embiyogenesis of Trees And Its Application for the Future Forests and Plantations» (Сувон, Корея, 2010), ХХШ IUFRO мировом конгрессе «Forests for the Future: Sustaining Society and the Environment» (Сеул, Корея, 2010), Международной конференции «Генетика, геномика и биотехнология растений» (Новосибирск, 2010); Всероссийской конференции с участием иностранных ученых «Эколого-географические аспекты лесообразовательного процесса» (Красноярск, 2009); всероссийского масштаба: Ш Всероссийской научно-практической конференции «Биотехнология как инструмент сохранения биоразнообразия растительного мира» (Волгоград, 2010), и регионального уровня: I Региональной научной студенческой конференции по биологии (Красноярск, 2007), Конференции молодых ученых «Исследования компонентов лесных экосистем Сибири» (Красноярск, 2007, 2009), второй общегородской ассамблее «Красноярск - технологии будущего» (Красноярск, 2009).

Пу&шкаиии. По материалам диссертации опубликовано 23 работы, в том числе 4 статьи в реферируемых журналах из перечня ВАК.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, пяти глав, заключения, выводов, списка литературы и трех приложений. Работа изложена на 136 страницах, содержит 14 таблиц и 40 рисунков. Библиографический список включает 201 наименование, 168 из которых - иностранные источники.

Благодарности. Автор выражает глубокую признательность научному руководителю д.б.н., профессору Третьяковой Ираиде Николаевне, а также к.б.н. Иваницкой A.C., к.б.н. Носковой H. Е. за всестороннюю помощь во время работы над диссертацией и ценные советы. Автор благодарит Dr. Marie-Anne Lelu-Walter (TNRA) за ценные советы при проведении экспериментов по соматическому эмбриогенезу хвойных растений. Благодарю к.б.н. AIL Барченкова за предоставление семенного материала лиственницы сибирской и лиственницы Гмелина, а также к.б.н. Садыкову B.C. и асп. Бондарь П.Н. за предоставление метаболитов грибов рода Trichoderma и Streptomyces .

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

ГЛАВА 1. МИКРОКЛОНАЛЬНОЕ РАЗМНОЖЕНИЕ ДРЕВЕСНЫХ РАСТЕНИЙ В КУЛЬТУРЕ IN VITRO

В главе проводится обзор литературных данных по исследованию соматического эмбриогенеза у хвойных видов. Приводятся материалы о современном состоянии данного направления в мире, его преимуществах перед другими методами размножения растений и практической значимости соматического эмбриогенеза. Особенно детально рассматриваются методические вопросы получения эмбриогенного каллуса, его пролиферации и созревания соматических зародышей, наряду с морфологическими изменениями, происходящими во время всего процесса формирования соматических растений. Также обсуждается роль генетических маркеров в соматическом эмбриогенезе хвойных. Приводятся достижения в области соматического эмбриогенеза для видов лиственницы произрастающих в Европе.

ГЛАВА Z МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Работа выполнена в лаборатории лесной генетики и селекции Учреждения Российской академии наук Института леса им.В.Н. Сукачева Сибирского отделения РАН в 2007-2010 гг.

В качестве исходного материала использовали экспедиционные сборы семян с деревьев лиственницы сибирской, лиственницы Гмелина и лиственницы Сукачева, произрастающих в зеленых насаждениях г. Красноярска (р-он Академгородка) и Красноярского края (Ужурский лесхоз, Э/х «Погорельский бор»), а также из Каларского района Читинской области (лиственница Гмелина). Материалом исследования служили зиготические (половые) зародыши данных видов, находящиеся на разных этапах эмбрионального развития.

Контролируемые скрещивания исследуемых деревьев проводили в начале мая 2009 - 2010 гг. в следующих вариантах: L sukaczewii X L. sibirica, L. sibirica X L. Sukaczewii, L. sukaczewii X L. gmelinii, L. sukaczewii X L. sukaczewii. Для оценки качества пыльцы определяли размеры пыльцевых зерен и проводили гистохимический анализ на содержание крахмала (раствор Люголя), а также проращивали в культуре in vitro на различных питательных средах.

Работы по получению соматического эмбриогенеза проводили в стерильных условиях ламинар-бокса. Все инструменты, питательные среды, посуду и чашки Петри стерилизовали в автоклаве под давлением 0,5-1 А0 при температуре 120" С в течение 20-30 мин. Стерилизацию растительных эксплантов проводили 5% спиртовым раствором йода в течение трех минут. После трехкратной промывки в стерильной дистиллированной воде, мегагаметофиты обрабатывали перекисью водорода в течение 5-10 мин. Зародыши извлекали из мегагаметофитов в стерильных условиях, помещали на увлажненную фильтровальную бумагу в чашках Петри и затем переносили на питательную среду.

Для индукции формирования эмбриогенного каллуса (ЭК) использовали базовые среды 'Л MS (Murashige et al., 1962), MSG (Becwar et al., 1987) и MA (собственная разработка авторов), с добавлением мезоинозита (0,1 - 1г/л), аскорбиновой кислоты (0,4 г/л), казеина (0,1 -1 г/л), глутамина (0 - 0,5 г/л), сахарозы (30 г/л) и агара (7 г/л) или Gelrite (4 г/л). В качестве регуляторов роста использовали 2,4-Д (2 мг/л) и БАП (1 мг/л). рН среды был приведен к 5.8 до автоклавирования.

Для пролиферации применяли среды того же базового состава, но с пониженным в 1,5 и 2 раза содержанием сахарозы и БАП, соответственно. Также использовали метод суспензионных культур.

Для перехода к созреванию ЭК помещали в жидкую или твердую безгормональную питательную среду на 3-7 дней.

Созревание соматических зародышей проводили на твердых питательных средах MSG и МА, с добавлением мезоинозита (0,1 -1 г/л), L-глютамин (0,5 -1,45 г/л), казеина (1 г/л), сахарозы (30 -60 г/л), АБК (5,3 -34 мг/л), ИМК (0 - 0,2 мг/л), 2,4-Д (0 - 0,2 мг/л) и ПЭГ (0 -10%). В качестве желирующего агента использовали Gelrite (4-8 г/л). Культивирование осуществляли на свету при 16-ти часовом фотопериоде, при 25°С±1°С. Растительные регуляторы роста (АБК и ИМК) и гшотамин стерилизовали фильтрованием и добавляли в охлажденную питательную среду после автоклавирования.

Прорастание соматических зародышей проводили на питательных средах с полным и редуцированным содержанием макро-, микроэлементов, железа и витаминов. В некоторых экспериментах проводили добавление активированного угля. Культивирование осуществляли на свету до появления эпикотиля.

Для стимуляции роста соматических проростков использовали метаболиты трех штаммов Trichoderma и одного штамма Streptomyces гербарной коллекции из музея культур Центра биотехнологии и микологии Сибирского государственного

технологического университета, выделенные из целинных и окультуренных почв лесных питомников Средней Сибири в период с 1997 по 2002 гг. Метаболиты добавляли в базовые среды Vi MS и MA путем фильтр-стерилизации, в концентрации 1%. Культивирование эксплантов проводили на свету.

Для цитологических исследований использовали метод давленых препаратов (Паушева, 1987). Статистическую обработку данных проводили по стандартным методикам (Лакин, 1973; Рокицкий, 1973, Шмидт, 1984) при помощи программ Microsoft Excel и Statistica 6.0 (1999).

ГЛАВА 3. СОМАТИЧЕСКИЙ ЭМБРИОГЕНЕЗ ВИДОВ ЛИСТВЕННИЦ

Процесс соматического эмбриогенеза включает индукцию эмбриогенного каллуса, пролиферацию эмбриогенных культур, созревание соматических зародышей, их прорастание и регенерацию растений.

Индукцня соматического эмбриогенеза

Как было отмечено многими исследователями (Lelu et al., 1994; Klimaszewska et al., 2002), на индукцию соматического эмбриогенеза и формирование эмбриогенного каллуса особое влияние оказывает стадия развития экспланта. Большинство авторов отмечает наилучший отклик экспланта при инокуляции глобулярного зародыша (Lelu-Walter et. al., 2008; Lelu et al., 1991; Klimaszewska et al., 1989). Однако для лиственницы сибирской наилучший отклик (98%) был показан для стадии позднего эмбриогенеза (Белоруссова, Третьякова, 2008). Введение в культуру лиственницы Гмелина и лиственницы Сукачева показало ту же тенденцию (рис.1). Практически все введенные в культуру экспланты на стадии развития семядолей (стадия Ш) индуцировались к формированию эмбриогенного каллуса (96-98%).

^Л1стаеямщэсиб«фшя зшстеенкяца Гиеяжа слнсгаешнн Сукзчевэ

Рис. 1. Формирование ЭК из зиготических зародышей видов лиственницы на различных стадиях развития: стадия I - глобулярный зародыш (а), стадия П -поздний эмбриогенез, на стадии инициации семядолей (б); стадия Ш- поздний эмбриогенез, на стадии семядольного кольца (в); стадия IV-зрелый зародыш (г) (масштаб: 200 мкм)

Известно, что огромную роль на индукцию соматического эмбриогенеза оказывает состав питательной среды (Юнпаагеуузка е* а1., 2002; 81азо!1а е* а1., 2003). Проведенные исследования показали, что уменьшение концентрации макро-солей ('А МЯ) или исключение некоторых элементов из питательной среды (МЯО) значительно стимулировало образование ЭК и дальнейшую его пролиферацию у всех исследуемых видов лиственницы.

Рис. 2. Формирование эмбриогенного каллуса у лиственницы Сукачева (А) и лиственницы Гмелина (Б) в зависимости от состава питательной среды

Так. частота формирования эмбриогенного каллуса у лиственницы Гмелина на среде М8С5 была значительно выше - 73 (дерево - 93% (дерево (в зависимости от растения донора), тогда как на среде 'Л М8 частота формирования каллуса составила всего 50% (рис. 2Б). Аналогичные результаты были получены и для лиственницы сибирской - 70 - 98 % эксплантов индуцировали ЭК на среде МвО, тогда как на МБ и М> МБ - 50 и 58%, соответственно. Формирование эмбриогенного каллуса у лиственницы Сукачева происходило на всех используемых питательных средах с высоким процентом отклика эксплантов - 98%. Однако дальнейшее развитие ЭК и формирование эмбриональной массы происходило только у лиственницы Сукачева на среде МА в 18 % случаев (рис. 2А). На остальных питательных средах наблюдалось формирование эмбриогенного каллуса, не способного к пролиферации эмбриональной массы (ЭМУ_____________________________________

□ эмбриогенный К8ПЛ1С ■ эмбриональная масса

Lg2 193

SMSG 11/2MS

Интенсивность прироста ЭК также зависела от состава питательной среды. Достоверно больше прирост был на среде MSG в сравнении с другими питательными средами у всех исследуемых видов (рис. 3).

1! 20 30 40 50 60 70 0 10 20 30 40 S0 60

аремя «утрирований, сут. ' время культивирования, сут.

-»-MSG -«-ItfMS MS] ^ | Ct-MSG-B-IMS Б

Рис. 3. Пролиферация эмбриогенного каллуса лиственницы сибирской (А) и лиственницы Гмелина (Б) на различных питательных средах

Наиболее важной задачей исследователей соматического эмбриогенеза является поиск эмбриогенных деревьев, то есть деревьев, способных продуцировать эмбриогенный каллус, формировать далее эмбриональную массу и переходить к созреванию соматических зародышей. Исследования показали, что формирование

эмбриогенного каллуса происходило у всех видов лиственницы, введенных в культуру in vitro - 3 вида, 39 деревьев. Из них 14 деревьев были не способны к формированию ЭК. У остальных введенных в культуру деревьев формирование ЭК происходило в широком диапазоне от 5 до 98 %. При этом пролиферации эмбриональной массы у лиственницы сибирской и лиственницы Гмелина не происходило. Однако у лиственницы Сукачева было обнаружено дерево, экспланты которого не только обладали высоким уровнем индукции эмбриогенного каллуса (98%), но и были способны в дальнейшем переходить к пролиферации эмбриональной массы — генотип (.'¡. г;.

Морфологические наблюдения за формированием эмбриогенного каллуса показали, что его индукция происходила на 8-14-е сутки культивирования на всех используемых в экспериментах питательных средах Образование ЭК происходило равномерно по всей поверхности экспланта (у лиственницы Гмелина) или в области корешка и гипокотияя (у лиственницы Сукачева). Аналогично лиственнице сибирской, каллус, полученный из зиготических зародышей лиственницы Гмелина и лиственницы Сукачева, имел белый цвет, рыхлую либо твердую текстуру (рис. 4А).

Образование эмбриональной массы происходило значительно позднее - на 25-35 сутки культивирования. ЭМ появлялась «из под» или «на поверхности» ЭК. Хорошей пролиферационной активностью обладала только ЭМ, которая образовалась «из под» каллуса (рис.4Б). Во втором случае - ЭМ постепенно деградировала.

Рис. 4. Формирование эмбриогенного каллуса (ЭК) и эмбриональной массы (ЭМ) у лиственницы Гмелина (А) и лиственницы Сукачева (Б) (масштаб: 5 мм).

Таким образом, в результате проведения работ по индукции формирования ЭК и пролиферации ЭМ у лиственницы Сукачева были получены четыре клеточные линии, способные к дальнейшему развитию:

• клеточная линия 1 (08-03-00-01) - получена в 2008 году на среде МА в результате свободного опыления лиственницы Сукачева (Сщ^)

• клеточные линии 2 (09-03-00-02), 3 (09-03-00-03) и 4 (09-03-00-04) - получены в 2009 году на среде МА в результате свободного опыления лиственницы Сукачева (С^О

Пролиферация эмбриогенного каллуса и эмбриональной массы

Полученные в результате индукции клеточные линии отличались по пролиферационной активности, а также по содержанию незрелых соматических зародышей внутри эмбриональной массы. Так, удвоение эмбриональной массы в зависимости от генотипа происходило на 11 - 14 сутки культивирования в цикле пролиферации (рис. 6А). Рост ЭМ шел по экспоненте и за четыре недели культивирования на среде для пролиферации суммарный вес ЭМ от одного экспланта

Кл1 достиг - 12,2 г, у КлЗ - 16,5 г. Интенсивность прироста эмбриогенного каллуса у других видов лиственницы (лиственницы сибирской и лиственницы Гмелина) была значительно ниже. Так, через шесть недель культивирования масса ЭК у эксплантов лиственницы Гмелина дерево Lg5 составила 0,467 ± 0,005 г, в то время как у других деревьев Lg4, Lg3 и Lg2 достоверно меньше (от 0,165 ± 0,005 до 0,256 ± 0,005 г). Таким образом, через шесть недель культивирования вес ЭМ лиственницы Сукачева превышал массу ЭК лиственницы Гмелина уже в 77 раз. Спада пролиферационной активности, характерного для ЭК лиственницы сибирской, у эмбриональной массы лиственницы Сукачева за 18 месяцев культивирования не наблюдалось.

Число соматических зародышей в пролиферирукяцей эмбриональной массе варьировало (рис. 6Б) от 210 шт в 100 мг ЭМ (КлЗ) до 390 шт в 100 мг ЭМ (Rui). Содержание соматических зародышей в эмбриогенных каллусах у лиственницы сибирской и лиственницы Гмелина было значительно ниже: в 5 (75±5,6 у лиственницы сибирской, что совпадает с предыдущими исследованиями данного вида (Белоруссова, Третьякова, 2008)) и 185 раз (всего 1±1,6 на 100 мг ЭК у лиственницы Гмелина). Необходимо также отметить, что количество соматических зародышей у Кл1, индуцированной в 2008 году, через 14 месяцев культивирования

Рис. 6. Пролиферация эмбриональной массы клеточных линий лиственницы (А) и содержание соматических зародышей в пролиферирующей ЭМ (Б).

Цитюмбриологический контроль соматического эмбриогенеза

Цитоэмбриологический контроль соматического эмбриогенеза показал, что формирование каллуса у всех исследуемых видов лиственницы идет одинаково и начинается с удлинения клеток экспланта и их неравного деления, аналогично описанному для лиственницы сибирской (Белоруссова, Третьякова, 2008; Третьякова и др., 2007). Именно неравное деление клеток является ключевым моментом, запускающим весь процесс соматического эмбриогенеза. В результате, происходит образование эмбриональных трубок с прилегающей на другом конце эмбриональной инициалью. Подобно зиготическому эмбриогенезу далее эти клетки претерпевают последовательные деления в обеих плоскостях, в результате чего происходит формирование 8 клеточной и затем 16 клеточной структуры зародыша. Такой зародыш состоит из эмбриональных (меристематических клеток округлой формы) и суспензорных (сильно вытянутых) клеток (рис. 5). Таким образом, через 30-40 дней в ЭК обнаруживались соматические зародыши на ранних стадиях эмбрионального развития (глобулярные зародыши).

В структуре ЭК некоторые ученые выделяют несколько этапов развитая (РЕМ1, РЕМП и РЕМШ), от достижения, которых зависит важный этап соматического эмбриогенеза - созревание соматических зародышей (р11опоуа е1 а1., 2000; ШиДУаНег й а1., 2008). Применительно к сибирским видам лиственниц было отмечено, что эмбриогенный каллус лиственницы Гмелина и лиственницы сибирской соответствовал начальным стадиям развития - РЕМ1 и РЕМП, перехода к стадии РЕМШ не происходило, в то время как для лиственницы Сукачева данный этап развития эмбриональной массы был успешно получен.

Созревание соматических зародышей

Введение ЭК лиственницы сибирской и лиственницы Гмелина на питательные среды для созревания соматических зародышей не привело к формированию зрелых зародышей. Использование среды с небольшой концентрацией АБК (5,3 мг/л), приводило к потере эмбриогенной способности и переходу ЭК к автотрофному типу питания - культуры приобретали зеленую окраску. На питательных средах с более высокими концентрациями АБК (15 -24 мг/л), созревания соматических зародышей так же не происходило. Эмбриогенный каллус через две недели культивирования приобретал коричневую окраску, соматические зародыши внутри ЭК распадались на отдельные клетки.

Таким образом, формирования зрелых соматических зародышей у лиственницы сибирской и лиственницы Гмелина на используемых средах, рекомендуемых зарубежными авторами для созревания соматических зародышей лиственницы европейской и ее гибридов (Ъе1и^аИег е* а1., 2006,2008), не происходило. Вероятно, это связано с неспособностью генотипа использованных деревьев к переходу РЕМП в стадию РЕМШ, что является ключевым моментом в развитии ЭК. Как отмечается канадскими учеными, РЕМП не восприимчив к действию АБК и обычно погибает в его присутствии (БЦопоуа е1 а1., 2000).

Созревания соматических зародышей лиственницы Сукачева проводили на среде МА с использованием различных концентраций АБК, ПЭГ, Ое1гйе и сахарозы. При этом на среде, содержащей АБК (40 цМ), повышенное содержание сахарозы (60 г/л) и желирующего агента (7 г/л 6е1гйе), развитие соматических зародышей не происходило (табл.1). Наблюдалось иссушение ЭМ, соматические зародыши не переходили к созреванию и погибали. Применение в качестве осмотического агента ПЭГ, оказалось более продуктивным. Однако низкие его концентрации (5-7,5%) все же были малопригодными для достижения созревания соматических зародышей, в этом случае наблюдались обводнение и деградация ЭМ, соматические зародыши распадались на отдельные клетки.

Оптимальной для развития соматических зародышей оказалась среда, содержащая 60 цМ АБК, 10% ПЭГ, 40 г/л сахарозы и 4 г/л СеМе (МА1У(9))- На данной среде уже через три-четыре недели культивирования происходило формирование семядольных соматических зародышей. Эмбриональная масса к этому времени уже состояла из глобулярных зародышей, а также зародышей на стадии Торпедо, длина которых достигала 400 мкм (рис.5Ж). Через две недели культивирования соматические зародыши увеличивались в размерах до 0,7/0,4 мм. Происходили закладка и формирование семядольного кольца. На 50 сутки культивирования на среде для созревания соматические зародыши достигали размера 1,1 - 1,5 мм, имели хорошо выраженную биполярную структуру тела зародыша и полностью сформированные семядоли (рис.53).

Таблица 1

Созревание соматических зародышей лиственницы Сукачева на различных

Соматические

АБК, ПЭГ, Сахароза, имк, зародыши,

Среда мг/л •Л гЛ1 г/л мг/л шт/500мгЭМ

МАху(1) 16 5 40 4 0,2 0

МАпгр) 16 7,5 40 4 0,2 0

МАпго) 16 10 40 4 0,2 1

МА1\г(4) 24 5 40 4 0,2 0

МАГ*С5) 24 7,5 40 4 оа 0

МАвд«) 24 10 40 4 0,2 2

МА^ 32 5 40 4 0,2 0

МАкт 32 7,5 40 4 0,2 4

МА]гл 32 10 40 4 вг 30

МАргаад 32 0 60 8 0,2 0

МАдац 16 10 40 4 0 1

МАда) 16 0 60 7 0 0

Для перехода соматических зародышей клеточных линий лиственницы к созреванию использовали предобработку эмбриональной массы в жидкой питательной среде. После такой обработки даже спустя 14 месяцев активной пролиферации у Кл1 удалось снова получить зрелые соматические зародыши. При данной технике также происходило более массовое формирование зрелых соматических зародышей.

Сроки появления зрелых соматических зародышей сильно варьировали в зависимости от экспланта. Так, для созревания соматических зародышей у Кл1 требовалось 38-41 день, для Кл2 - 48-55 дней и для КлЗ - 60 и более дней. У Кл4 созревания соматических зародышей даже спустя три месяца культивирования на среде МАр/(9) не происходило.

Прорастание соматических зародышей

Соматические зародыши с хорошо развитыми семядолями переносили на среду дня прорастания (МА базового состава, без растительных регуляторов роста с добавлением активированного угля (10 мг/л)). Через 7-10 дней культивирования происходило удлинение гипокотиля и развитие семядолей. Еще через несколько дней наблюдалось развитие корешка (на свету гипокотиль и корешок приобретали красный оттенок) (рис.5И). Однако в 90 % случаев нормального развития растений не происходило - гипокотиль изгибался или утолщался, а вместо корня формировался каллус. Такие регенеранты были нежизнеспособными и погибали.

Снижение концентрации макро-, микроэлементов и железа (в два раза), а также исключение источников органического азота и витаминов (МАур)) положительно сказывались на прорастании соматических зародышей - в 70% происходило нормальное развитие соматических зародышей в проростки. На данной среде на пятые-седьмые сутки культивирования отмечены удлинение гипокотиля и появление корешка.

Рис. 5. Развитие эмбриогашмх структур в культуре in vitro у сибирских видов лиственницы: лиственницы сибирской - Л,Б (формирование эмбриональных июб)л и эмбриональных грубок ); лиственницы Гчелина - ВЛ (образование эмбриональных и клеток суспсп iopitoj о типа): лиечпениипм Сукачева - ДЛ (формирование глобулярш» о зародыша), Ж (стадия горпедо). 3 (зрелый соматический зародыш). И (пророс го к )

Появление эпикотиля происходило через две-три недели культивирования на среде для прорастания. Соматические зародыши с хорошо развитым корешком и эпикотилем считали полноценными растениями и переносили в экопочву.

Таким образом, впервые были получены четыре клеточные эмбриогенные линии лиственницы Сукачева, способные продуцировать массовые соматические зародыши.

ГЛАВА 4. СОМАТИЧЕСКИЙ ЭМБРИОГЕНЕЗ ГИБРИДНЫХ СЕМЯН ЛИСТВЕННИЦЫ

Для проверки влияния материнского растения на получение соматического эмбриогенеза а также получения новых клеточных линий в 2009 - 2010 гг. проводили контролируемое опыление деревьев лиственницы Сукачева и Cm4, способных и не способных продуцировать эмбриогенный каллус. В качестве опылителей использовали пыльцу тех же деревьев лиственницы Сукачева (С^ С^), а также пыльцу лиственницы сибирской, обладающей высоким эмбриогенным потенциалом (Ду), устойчивых к поражению лиственничной почковой галлицей, и пыльцу дерева лиственницы Гмелина произрастающей на территории Погорельского стационара (э/х «Погорельский бор»), выделяющегося в древостое по обильности формирования генеративных органов (Ld2).

Введение в культуру in vitro гибридных зародышей, полученных в результате контролируемого опыления, проводили в Ш декаде июля в 2009 - 2010гг.

Индукция эмбриогенного каллуса при всех вариантах опыления происходила только у эксплантов материнским растением которого служило дерево лиственницы Сукачева, обладающего высоким эмбриогенным потенциалом, способного к формированию эмбриональной массы (см. главу 3) - дерево Cmi. Индукции эмбриогенного каллуса у не способного к формированию ЭК дерева СШ4 (см. главу 3) при опылении пыльцой эмбриогенных деревьев С^ и Ду не произошло. Формирование эмбриональной массы, происходило у отдельных эксплантов только гибрида лиственницы Сукачева с лиственницей сибирской, в 3-4 % случаев (табл. 15). У других гибридов формирования эмбриональной массы не происходило.

В результате индукции эмбриогенного каллуса и его активной пролиферации была получена клеточная линия, способная формировать соматические зародыши и растения регенеранты: клеточная линия 5 (09-03-01-05) - получена в 2009 году на среде МЛ в результате перекрестного опыления лиственницы Сукачева (CmI) с лиственницей сибирской (Ду)

Полученная клеточная линия отличалась более высокой скоростью пролиферации в сравнении с другими клеточными линиями лиственницы Сукачева (Кл1, Кл2, КлЗ, Кл.4). Так, удвоение эмбриональной массы происходило уже на девятые сутки культивирования в цикле пролиферации (рис. 6А), и на четвертой неделе культивирования вес ЭМ достигал 22,7 г. Число соматических зародышей в пролиферирующей эмбриональной массе было аналогично Кл1 и Кл4 до 390 шт в 100 мг ЭМ (рис.6 Б).

Для перехода соматических зародышей к созреванию использовали предобработку эмбриональной массы в жидкой питательной среде. Для созревания использовали питательную среду MArvp)- Появление зрелых соматических зародышей происходило аналогично Кл1 на 38-41 день культивирования.

Прорастание соматических зародышей Кл5 активно происходило на среде с уменьшенной концентрацией макро-, микроэлементов, железа и сахарозы (МАур))-

Удлинение гипокотиля и развитие корешка наблюдались уже на седьмые сутки культивирования.

Клеточные линии заметно различались по морфометрическим показателям полученных растений. Так, у Кл5 отмечалось развитие длинных семядолей (5,9±0,3 мм), а у Кл2 - более короткого гипокотиля (4,1±0,4). Длина развивающегося корня, между линиями достоверных отличий не имела (Р < 0,05).

Появление эпикоталя происходило через две-три недели культивирования на среде для прорастания (рис. 7). Соматические зародыши с хорошо развитым корешком и эпикотилем считали полноценными растениями и переносили в экопочву. Растения, помещенные в экопочву, активно развивались, и через два месяца культивирования наблюдалось развитие второго побега в условиях светокультуры.

Рис. 7. Соматические проростки гибрида лиственницы: А - развитие эпикотиля через две недели на среде для прорастания, Б - проросток лиственницы через пять недель на среде для прорастания (масштаб: 5 мм)

Таким образом, были проведены работы по контролируемому опылению видов лиственницы и получены клонированные проростки. На основании данных исследований можно утверждать, что способность к соматическому эмбриогенезу, вероятно, заложена в материнском растении. Следовательно, для получения соматического эмбриогенеза у деревьев, не поддающихся к индукции данного процесса возможно использование контролируемого опыления эмбриогенных деревьев, однако необходимо провести цикл экспериментальных работ по адаптации клонированных растений к условиям почвенного грунта.

ГЛАВА 5. ОБРАБОТКА МЕТАБОЛИТАМИ РОДА TRICHODERMA И STREPTOMICES ПРОРОСТКОВ ЛИСТВЕННИЦЫ

При прорастании зародышей лиственницы в условиях культуры in vitro отмечается развитие аномальных проростков (с отсутствием корней, разрастанием гипокотиля, не развитием семядолей). Одним из возможных вариантов преодоления данных проблем может служить использование современных биопрепаратов на основе метаболитов жизнедеятельности мокроорганизмов. О стимулирующем действии метаболитов штаммов рода Trichoderma и Streptomices указывалось в многочисленных работах как отечественных, так и зарубежных исследователей, а также установлено, что они выделяют элиситоры, оказывающие ростостимулирующий эффект (Harman et al., 2004).

Исследования, проведенные на зиготических зародышах лиственницы сибирской показали, что использование метаболитов штамма 19/97М Streptomices lateritius приводит к аномальному развитию проростков в 80% случаев. Поэтому для

выявления роетстимулирующего эффекта на клоновые проростки лиственницы Сукачева использовали далее только метаболиты различных штаммов грибов рода ТИскснкгта.

Обработку метаболитами клонированных зародышей лиственницы Сукачева проводили на твердой питательной среде МА без добавления растительных регуляторов роста. В качестве эксплантов использовали аномальные (без корешка) и нормальные (с корнем, гипокотилем и развитыми семядолями) соматические проростки лиственницы Сукачева в возрасте одного месяца.

Исследования показали, что метаболиты не оказали достоверного влияния на формирование корня у исследуемых соматических проростков лиственницы. Формирование корня происходило как в контрольном варианте (без использования метаболитов), так и в вариантах с добавлением метаболитов.

Влияние метаболитов штамма рода ТпсИос1егта на развитие гипокотиля у соматических проростков лиственницы Сукачева также не прослеживалось. Удлинение гипокотиля происходило аналогично контрольным эксплантам, как у аномально развитых проростков, так и у проростков с нормальным строением. Однако, при культивировании наблюдались морфологические изменения в развитии гипокотиля - происходило его утолщение, и в редких случаях развитие каллуса, как в контрольном, так и в вариантах с использованием метаболитов.

* к

2 ®

ЕЭ аномальный проросток + мг-6 □ нормальный проросток + мг-6 Ш аномальный проросток - контроль

§3 аномальный проросток-4- М99/5 □ нормальный проросток + м99/5 ЕЭ нормальный проросток - контроль

Рис. 9. Влияние метаболитов штамма рода ТпскЫегта на развитие побега у соматических проростков лиственницы Сукачева

Исследования действия метаболитов штамма рода Тпскос1егта на развитие побега соматических проростков лиственницы Сукачева показали достоверное влияние данного фактора на удлинение и формирования побега (Р < 0,05). В варианте с нормально развитыми проростками наблюдались различия в длине побега при действии различных метаболитов (рис. 9, 10). Достоверно лучше развитие побегов происходило на среде с метаболитом МГ-6 (14,1±0,7 мм), в сравнении с контролем (7,4±0,5 мм) и с метаболитом М99/5 (11,8±0,5 мм). В варианте с аномально развитыми проростками лиственницы Сукачева тенденция наблюдалась в обратном направлении: наилучшее развитие происходило на среде с добавлением метаболита М99/5 (73±0,5 мм), в контроле - 6,8±0,5 мм и наименьший результат был получен с метаболитом МГ-6 (4±0,8 мм).

Таким образом, в результате проведения ряда экспериментов была разработана методика для получения клоновых проростков видов лиственницы и их гибридов. Прослежены морфологические процессы, происходящие во время развития

соматических зародышей, а также установлено влияние метаболитов биоконтрольных агентов грибов рода ТпсИос1егта (штаммы МО-б и М99/5) на развитие полученных проростков. Кроме того, в результате проведения контролируемого опыления были получены пять клеточных линий с высоким эмбриогенным потенциалом.

Рис. 10. Развитие соматических проростков на среде МА при обработке метаболитами Trichoderma MG-6 (А) и М99/5 (Б) и без обработки (В), (масштаб: 1 см)

ВЫВОДЫ

1. Оптимальной для индукции и развития соматических зародышей является разработанная нами питательная среда МА, с увеличенным содержанием мезоинозита, гидролизата казеина, тиамина, добавлением L-глутамина и аскорбиновой кислоты.

2. Формирование каллуса и эмбриональной массы у видов лиственницы (лиственницы Гмелина, лиственницы Сукачева и лиственницы сибирской) идет по одной схеме: под действием регуляторов роста (ауксины и цитокинины) происходит вытягивание клеток и их асинхронное деление, далее клетки претерпевают последовательные деления, в результате чего происходит формирование эмбриональных трубок и эмбриональных глобул, ведущих к формированию соматического зародыша.

3. Для остановки пролиферации и перехода соматических зародышей к созреванию наиболее продуктивным является культивирование эмбриональной массы в жидкой питательной среде без добавления растительных регуляторов роста и активированного угля в течении 3-5 дней.

4. Оптимальными условиями для созревания соматических зародышей является культивирование на питательной среде МА, дополненной АБК (60 |iM), ИМК (1 рМ), сахарозой (40 г/л), ПЭГ (10%) и Gelrite (4 г/л).

5. Для прорастания зрелых соматических зародышей необходимо исключение из питательной среды растительных регуляторов роста, источников органического азота, витаминов и снижение концентрации сахарозы.

6. Генотип растения донора оказывает доминирующее влияние на индукцию и пролиферацию, а также на способность к созреванию и прорастанию соматических зародышей;

7. Ростстимулирующая активность метаболитов биоконтрольных агентов грибов рода Trichoderma (штаммы МГ-6, М-99/5) проявляется на росте побега развивающихся соматических проростков в культуре in vitro.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Барсукова А.В, Белоруссова А.С. Закономерности микроспориального эмбриогенеза (андроклинии) у лиственницы сибирской в зависимости от состава питательных сред // Экология Южной Сибири и сопредельных территорий. Абакан. 2006. Вып. 10, Т.1. С. 10.

2. Белоруссова АС., Барсукова А.В. Влияние экзогенных факторов на микроспориальный эмбриогенез лиственницы сибирской // Материалы II международной школы молодых ученых «эмбриология, генетика и биотехнология». Уфа. 2007. С. 22-23.

3. Барсукова А.В., Белоруссова А.С. Индукция андроклинии in vitro у лиственницы сибирской // Материалы конференции молодых ученых «Исследования компонентов лесных экосистем». Красноярск. - 2007. Вып. 8. С. 10-12

4. Иваницкая А.С., Барсукова А.В., Третьякова И.Н. Содержание эндогенных фито гормонов в микростробилах и андрокливном каллусе лиственницы сибирской // Тезисы IX международной конференции «Биология клеток растений in vitro и биотехнология». Москва. 2008. С.150-152.

5. Третьякова И.Н., Иваницкая АС, Барсукова А.В., Ижболдина М.В., Носкова Н.Е. Биотехнология хвойных in vitro: проблемы и перспективы // Материалы конференции «(Факторы экспериментальной эволюции организмов». Киев. 2008. Т.5. С. 323-328.

6. Третьякова И.Н, Белоруссова А.С., Носкова Н.Е., Савельев С.С, Лукина Н.В., Барсукова А.В., Ижболдина М.В., Череповский Ю.А. Перспективы применения методов биотехнологии для размножения генетически ценных форм лесных древесных видов хвойных // Хвойные борсальные зоны. 2007. Т. 2, № 23. С. 1 -8.

7. Третьякова И.Н, Иваницкая А.С, Носкова Н.Е., Савельев С.С, Барсукова А.В., Ижболдина М.В. Регуляция морфогенеза клеток при образовании соматических зародышей у сибирских видов хвойных в культуре in vilro // Матер.Ш международной научной конференции «Теоретические и прикладные аспекты биохимии и биотехнологии растений». Минск. 2008. С. 328-333.

8. Барсукова Л.В., Иваницкая А.С, Ижболдина М.В. Особенности размножения хвойных видов через соматический эмбриогенез // Материалы ХП международной Пущинской школы конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века». Пущино. 2008. С. 194.

9. Боцдарь П.Н, Ижболдина М.В, Барсукова А.В. Оценка возможности использования сибирских штаммов Trichoderma для создания биопрепаратов защиты растений нового поколения // Материалы ХП международной Пущинской школы конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века». Пущино. 2008. С. 197-198.

10. Третьякова И.Н, Иваницкая А.С, Иванова А.Н, Барсукова А.В. Содержание фитогормонов в микростробиллах и андроклинном каллусе in vitro у лиственницы сибирской (Larix sibirica L.) // Физиология растений. 2009. №5. С.718-725.

П.Третьякова И.Н, Садыкова B.C., Носкова Н.Е, Боцдарь П.Н, Гаидашева И.И, Громовых Т.И, Иваницкая А.С, Ижболдина М.В, Барсукова А.В. Ростстимулирующая активность штаммов рода Streptomyces и Trichoderma и перспективы их использования для микрокпонального размножения хвойных // Биотехнология. 2009. №1. С. 39-44.

12. Барсукова А.В. Особенности соматического эмбриогенеза у лиственницы сибирской И Материалы Ш международной школы молодых ученых «эмбриология, генетика и биотехнология». Саратов. 2009. С. 155-158.

13. Третьякова И.Н, Барсукова А.В., Ижболдина М.В. Проблемы и перспективы соматического эмбриогенеза: инициация, пролиферация вызревание // Материалы конференции «Факторы экспериментальной эволюции организмов». Киев. 2009. Т.7. С. 189-193.

Н.Третьякова И.Н., Иваницкая A.C., Барсукова A.B., Савельев С.С., Сиренко A.C. Перспективы плантационного лесовыращивания хвойных при помощи современных методов селекции и биотехнологии, такой как соматический эмбриогенез // Материалы Всероссийской конференции с участием иностранных ученых «Эколого-географические аспекты лесообразовагелыгаго процесса». Красноярск. 2009. С. 219222.

15. Бажина Е.В., Третьякова И.Н., Барсукова A.B. Динамика состояния пихты сибирской в горах Южной Сибири и сохранение ее генофонда в культуре in vitro // Материалы Всероссийской конференции с участием иностранных ученых «Эколого-географические аспекты лесообразовательного процесса». Красноярск. 2009. С. 184187.

16. Третьякова И.Н., Барсукова A.B. Сохранение генофонда хвойных видов Сибири при помощи соматического эмбриогенеза in vitro - современного метода биотехнология // Хвойные бореалыюй зоны. 2010. Т.28, .№ 1. С.1-8.

17. Барсукова A.B. Размножение лиственницы сибирской (Larix sibirica LEDEB.) путем соматического эмбриогенеза // Материалы международной научно-практической конференции молодых ученых и специалистов «Современные проблемы и перспективы рационального лесопользования в условиях рынка». Санкт-Петербург.

2009. С.54-56.

18. Третьякова И.Н., Барсукова A.B. Соматический эмбриогенез хвойных в культуре in vitro: фундаментальные и прикладные аспекты // Материалы III Всероссийской научно-практической конференции «Биотехнология как инструмент сохранения биоразнообразия растительного мира». Волгоград. - 2010. - С. 282-288.

19. Барсукова A.B. Размножение лиственницы сибирской (Larix sibirica Ledeb.) путем соматического эмбриогенеза // Материалы конференции . молодых ученых «Исследования компонентов лесных экосистем Сибири». Красноярск. 2009. Вып. 10. С. 10-12.

20. Третьякова И.Н., Барсукова A.B., Савельев С.С., Сиренко A.C. Сочетание классической селекции и применение современных методов биотехнологии для сохранения генофонда хвойных видов Сибири // Материалы международной научной конференции «Актуальные проблемы прикладной генетики, селекции и биотехнологии растений». Ялта, Украина. 2009. Т.131. С.5-9.

21. Третьякова И.Н., Барсукова A.B. Проблемы и перспективы биотехнологии хвойных в культуре in vitro в России // Лесохозяйственная информация. - 2009. - №1-2. - С.51-57.

22. Tretyakova I.N., Barsukova A.V. Somatic embryogenesis of coniferous species in Russia: theoretical and experimental data // Abstract of conference «Advances in somatic embryogenesis of trees and its application for future forests and plantations». Suwon, Korea.

2010. P.43-44.

23. Barsukova A.V., Tretyakova I.N. Somatic embiyogenesis of Siberian larch // Abstract of conference «Advances in somatic embryogenesis of trees and its application for future forests and plantations». Suwon, Korea. 2010. P.80.

Подписано в печать 22.12.10 Формат 60x84/16 Бумага офсетная 80 г/м2. Отпечатано на ризографе. Заказ Ка 333. Тираж 100 экз

Отпечатано в типографии «ДарМа-печать» 660036 г. Красноярск, Академгородок, 50/28, оф. 156 Тел. 290-72-32

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Барсукова, Алена Владимировна

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. МИКРОКЛОНАЛЬНОЕ РАЗМНОЖЕНИЕ ДРЕВЕСНЫХ РАСТЕНИЙ В КУЛЬТУРЕ IN VITRO.

1.1. Преимущества микроклонального размножения в культуре in vitro перед традиционными способами размножения растений.

1.2. История открытия соматического эмбриогенеза у хвойных растений

1.3. Современные достижения в области соматического эмбриогенеза у хвойных растений.

1.3.1. Индукция соматического эмбриогенеза.

1.3.2. Пролиферация эмбриональной массы.

1.3.3. Созревание соматических зародышей.

1.3.4. Прорастание соматических зародышей.

1.4. Генетический контроль соматического эмбриогенеза.

1.5. Соматический эмбриогенез видов лиственницы.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. Объекты исследования и их место произрастания.

2.1.1. Общая характеристика видов лиственницы.

2.1.2. Характеристика условий произрастания деревьев лиственницы используемых в экспериментах.

2.1.3. Характеристика исследуемых деревьев.

2.2. Растительный материал и методы исследования.

2.2.1. Контролируемое опыление лиственниц.

2.2.2.Растительный материал.

2.2.3. Стерилизация помещений, посуды и эксплантов.

2.2.4. Получение соматического эмбриогенеза у видов лиственницы.

2.2.5. Обработка метаболитами грибов штамм МГ-97, МГ-б, М99/5 Trichoderma и 19/97МStreptomyces зародышей и проростков видов лиственницы.

2.3. Цитологический анализ, морфометрические исследования и статистический анализ.

ГЛАВА 3. СОМАТИЧЕСКИЙ ЭМБРИОГЕНЕЗ ВИДОВ ЛИСТВЕННИЦ

3.1. Индукция соматического эмбриогенеза.

3.2. Пролиферация эмбриогенного каллуса и эмбриональной массы.

3.3. Цитоэмбриологический контроль соматического эмбриогенеза.

3.4. Созревание соматических зародышей.

3.5. Прорастание соматических зародышей лиственницы Сукачева.

ГЛАВА 4. СОМАТИЧЕСКИЙ ЭМБРИОГЕНЕЗ ГИБРИДНЫХ

ЗАРОДЫШЕЙ ЛИСТВЕННИЦЫ.

4.1. Контролируемое опыление видов лиственницы.

4.2. Соматический эмбриогенез гибридных семян лиственницы.

ГЛАВА 5. ОБРАБОТКА МЕТАБОЛИТАМИ РОДА TRICHODERMA И

STREPTOMICES ПРОРОСТКОВ ЛИСТВЕННИЦЫ.

5.1. Обработка метаболитами МГ-6 и МГ-97 Trichoderma и 19/97-М Streptomyces зиготических зародышей лиственницы сибирской в культуре in vitro.

5.2. Обработка метаболитами МГ-6 и М99/5 Trichoderma соматических зародышей лиственницы Сукачева в культуре in vitro.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Регуляция соматического эмбриогенеза у видов лиственницы в культуре in vitro"

Достижения в области культуры клеток и тканей растений привели к созданию принципиально нового метода — клонального микроразмножения в культуре in vitro, то есть получения in vitro генетически идентичных исходному экземпляру растений (Носов, 1999). Наиболее перспективным направлением в данной области является соматический эмбриогенез. В основе метода лежит уникальная способность растительной клетки реализовывать при определенных условиях имеющуюся у нее генетическую информацию и давать начало целому организму (тотипотентность) (Бутенко, 1964).

Исследования соматического эмбриогенеза у сибирских видов хвойных, в том числе лиственницы, начали проводить в первом десятилетии XXI века в лаборатории лесной генетики и селекции Учреждения Российской академии наук Института леса им. В.Н. Сукачева Сибирского отделения РАН. Исследователями были получены эмбриогенные каллусы и соматические зародыши на ранних стадиях эмбрионального развития у лиственницы сибирской (Третьякова и др., 2007; Белоруссова, Третьякова, 2008). Однако зрелые соматические зародыши и массовая регенерация растений до сих пор не были получены.

Между тем, виды рода Larix, являющиеся основными лесообразователями сибирских лесов, характеризуются неравномерностью урожаев в многолетнем цикле и низким качеством семян (Дылис, 1947; Милютин, 1973; Ирошников, 2004; Коропачинский и др., 2006). Кроме того, деревья лиственницы сильно поражаются насекомыми, оказывающими негативное влияние на урожай семян лиственничных лесов (Баранчиков, 2006), а также подвергаются негативному влиянию патогенной микрофлоры (наибольшую опасность представляют грибы род Fusarium) на развитие проростков и сеянцев, приводящее к инфекционной гибели практически половины всходов при выращивании лиственниц (Громовых и др., 2007). Поэтому проведение исследований, направленных на оптимизацию физико-химических условий культивирования изолированных клеток и тканей в культуре in vitro для получения соматического эмбриогенеза является необходимым у различных видов лиственницы.

Цели и задачи исследования. Цель работы - разработка и усовершенствование биотехнологии соматического эмбриогенеза у видов лиственницы: лиственницы Гмелина (Larix gmelinii (Rupr.) Rupr.), лиственницы Сукачева {Larix sukaczewii Dylis) и лиственницы сибирской {Larix sibirica Ledeb.), в культуре in vitro.

Для реализации данной цели были поставлены следующие задачи:

- стимулировать рост зародышей и проростков лиственницы путем их обработки метаболитами биоконтрольных штаммов грибов рода Trichoderma и Streptomyces; провести цито-эмбриологический контроль соматического эмбриогенеза на всех стадиях биотехнологического процесса.

Теоретическая и практическая ценность полученных результатов.

Положения. выдвигаемые на защиту:

2. Регенерационный потенциал лиственницы Сукачева в культуре in vitro связан с генотипом дерева.

Апробация работы. Основные положения и результаты работы были представлены и обсуждены на конференциях международного уровня: X Международной научной школе-конференции студентов и молодых ученых «Экология Южной Сибири и сопредельных территорий» (Абакан, 2006), II международной школе молодых ученых «Эмбриология, генетика и биотехнология» (Уфа, 2007), IX международной конференции «Биология клеток растений in vitro и биотехнология» (Звенигород, 2008), 12-й Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2008), III международной школе молодых ученых «Эмбриология, генетика и биотехнология» (Саратов, 2009), международной научной конференции «Актуальные проблемы прикладной генетики, селекции и биотехнологии растений» (Ялта, Украина, 2009), 2-м международном совещании по сохранению лесных генетических ресурсов Сибири (Новосибирск, 2009); Международной конференции «Advances in Somatic Embryogenesis of Trees And Its Application for the Future Forests and Plantations» (Сувон, Корея, 2010), XXIII IUFRO мировом конгрессе «Forests for the Future: Sustaining Society and the Environment» (Сеул, Корея, 2010), Международной конференции «Генетика, геномика и биотехнология растений» (Новосибирск, 2010); Всероссийской конференции с участием иностранных ученых «Эколого-географические аспекты лесообразовательного процесса» (Красноярск, 2009); всероссийского масштаба: III Всероссийской научно-практической конференции «Биотехнология как инструмент сохранения биоразнообразия растительного мира» (Волгоград, 2010), и регионального уровня: I Региональной научной студенческой конференции по биологии (Красноярск, 2007), Конференции молодых ученых «Исследования компонентов лесных экосистем Сибири»

Красноярск, 2007, 2009), второй общегородской ассамблее «Красноярск -технологии будущего» (Красноярск, 2009).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 23 работы, в том числе 4 статьи в реферируемых журналах из перечня ВАК.

Заключение Диссертация по теме "Физиология и биохимия растений", Барсукова, Алена Владимировна

выводы

1. Оптимальной для индукции и развития соматических зародышей является разработанная нами питательная среда МА, с увеличенным содержанием мезоинозита, гидролизата казеина, тиамина, добавлением Ь-глутамина и аскорбиновой кислоты.

2. Формирование каллуса и эмбриональной массы у видов лиственницы (лиственницы: лиственницы Гмелина, лиственницы Сукачева и лиственницы сибирской) идет по одной схеме: под действием регуляторов роста (ауксины и цитокинины) происходит вытягивание клеток и их асинхронное деление, далее клетки претерпевают последовательные деления, в результате чего происходит формирование эмбриональных трубок и эмбриональных глобул, ведущих к формированию соматического зародыша.

4. Оптимальными условиями для созревания соматических зародышей является культивирование на питательной среде МА, дополненной АБК (60 цМ), ИМК (1 цМ), сахарозой (40 г/л), ПЭГ (10%) и векке (4 г/л).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Микроклональное размножение растений в культуре in vitro привлекает все большее внимание исследователей. Применение биотехнологии соматического эмбриогенеза в последнее десятилетие распространилось на огромное количество видов, как покрытосеменных, так и голосеменных, и особенно, хвойных растений. С каждым годом увеличивается число стран, включающихся в изучение данного процесса у хвойных (по данным FAO, 2005). В России данная технология только начинает развиваться (Третьякова и др., 2007).

Проведенные исследования позволили впервые разработать методику клонального микроразмножения через соматический эмбриогенез для таких видов лиственниц, как лиственница Гмелина и лиственница Сукачева. Рекомендуемые зарубежными исследателями питательные среды (Lelu et al., 1994; Lelu-Walter et al., 2008) оказались мало пригодными для получения эмбриональной массы у исследуемых видов лиственниц. Однако, использование модифицированой нами по минеральному составу и органическим веществам среды МА, позволило получить не только эмбриональную массу, но и зрелые соматические зародыши у лиственницы Сукачева и ее гибрида. Кроме того, ключевым фактором созревания соматических зародышей лиственницы Сукачева явилось использование ПЭГ в сочетании с АБК на средах для созревания, в то время как западные технологии для лиственниц рекомендуют использование повышенных концентраций желирующего агента и сахарозы (Lelu-Walter et al., 2008).

Морфологические наблюдения за формированием эмбриогенного каллуса у видов лиственницы определили, что процесс соматического эмбриогенеза начинается и протекает одинаково, вне зависимости от видовой принадлежности экспланта.

Введение в культуру огромного количества эксплантов, выявило донорное эмбриогенное растение (дерево), способное в культуре in vitro продуцировать эмбриональную массу, состоящую из незрелых соматических зародышей. Кроме того, показано, что действие генотипа растения-донора проявляется не только на индукции эмбриогенного каллуса и эмбриональной массы, но также и на этапе созревания и прорастания соматических зародышей.

Опыты по контролируемому опылению показали доминирующее влияние материнского растения (дерева опыляемого) на способность к соматическому эмбриогенезу. Применение контролируемого опыления с использованием эмбриогенных материнских деревьев, позволит получать генетически разнородный материал, размножать необходимые линии деревьев и с помощью криоконсервации депонировать полученные культуры для длительного хранения, которые в дальнейшем могут быть успешно использованы для регенерации будущих лесов (Park, 2002).

В результате работ по контролируемому опылению и введению в культуру гибридных зародышей семян лиственницы впервые было получено пять высокопродуктивных эбриогенных клеточных линий лиственницы Сукачева и ее гибрида с лиственницей сибирской, способных продуцировать полноценные соматические растения. В наших исследованиях наблюдался высокий процент аномальных растений при проращивании соматических зародышей, что является обычным явлением при соматическом эмбриогенезе (Lelu-Walter et al., 2008). Манипуляции с составом питательной среды МА для проращивания соматических зародышей позволили оптимизировать процесс прорастания и значительно снизить колличество аномально развивающихся проростков. Использование метаболитов биоконтрольных штаммов грибов рода Trichoderma МГ-6 и М99/5 для стимуляции роста проростков не показало ростстимулирующего действия на развитие корня. В то же время, как показали исследования, можно рекомендовать использование данных агентов для ускорения развития побега соматических сеянцев лиственницы Сукачева.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Барсукова, Алена Владимировна, Красноярск

1. Баранчиков Ю.Н. Природа устойчивости лиственниц к воздействию личинок галлицы Dasineura rozhkovi Маш. et Nik. (Díptera, Cecidomyiidae) // Экология. 2006. Вып. 4. С. 318-320.

2. Баранчиков Ю.Н. Этапы морфогенеза вегетативных почек лиственницы сибирской и его модификация насекомыми-галлообразователями // Ботанические исследования в Сибири. Красноярск, 1995. Вып. 4. С. 12-18.

3. Белоруссова A.C., Третьякова И.Н. Особенности формирования соматических зародышей у лиственницы сибирской: эмбриологические аспекты // Онтогенез. 2008. Т.39, № 2. С. 1-10.

4. Бобров Е.Г. Лесообразующие хвойные СССР. // Л.: Наука. Ленингр. Отд-ние. 1978. 188с.

5. Бутенко Р.Г. Культура изолированных тканей и физиология морфогенеза растений ИМ.: Наука, 1964. 146 с.

6. Громовых Т.И., Ушакова В.А., Сизых Г.А., Литовка Ю.А., Садыкова

7. B.C., Гайдашева И.И. Перспективы получения препаратов для защиты сеянцев хвойных путем твердофазного культивирования штамма 19/97М Streptomices lateritius Sveschnikova // Хвойные бореальной зоны. 2007. № 4-5.1. C. 482-486.

8. Дерябин А.Н., Орешников A.B., Юрьева Н.О., Бутенко Р.Г. Рост столонов и индукция микроклубней картофеля in vitro при разных типах культивирования // Докл. РАН. 1997. № 4/5.

9. Дылис H.B. Лиственница Восточной Сибири и Дальнего Востока // М.: Изд-во АН СССР. 1961. 209 с.

10. Дылис Н.В. Лиственница сибирская. Материалы к систематике, географии и истории // М.: МОИП. 1947. 137 с.

11. Жизнь растений: в 6-ти т. Т.4. / М.: Просвещение, 1978. 447 с.

12. Здруйковская-Рихтер А.И. Получение сортов плодовых растений in vitro методом культуры изолированных зародышей // Докл. АН СССР. 1985. №1. С. 246-249

13. Ирошников А.И. Лиственницы России. Биоразнообразие и селекция // М.: ВНИИЛМ. 2004. 182 с.

14. Комаров В.Л. Класс Coniferales. Флора СССР // Л.: Изд-во АН СССР. 1934. Т.1.С. 130-195

15. Коропачинский И.Ю., Милютин Л.И. Естественная гибридизация древесных растений // Новосибирск., Академическое из-во «ГЕО», 2006, 222с.

16. Коропачинский И.Ю. Милютин Л.И. Интрогрессивная гибридизация лиственниц сибирской и даурской в южной части их ареалов // Селекция древесных пород в Восточной Сибири // М.: Наука, 1964. С. 20-31.

17. Лакин Г.Ф. Биометрия // М.: Высшая школа. 1973. 343 с.

18. Милютин Л.И. Половая репродукция хвойных // Новосибирск: Наука. 1973. Т.2. 145 с.

19. Милютин Л.И., Муратова E.H., Ларионова А.Я. Генетико-таксономический анализ популяций лиственницы сибирской и Сукачева // Лесоведение. 1993. №5. С.55-63.

20. Милютин Л.И. Естественная гибридизация лиственниц сибирской и даурской на территории МНР // Тез. докл. Междунар. конф. «Природные условия и биологические ресурсы Монгольской Народной Республики. М.: Наука. 1986. С. 93-94.

21. Минина Е.Г., Третьякова И.Н. Геотропизм и пол у хвойных // Новосибирск: СО АН СССР. 1983. 199 с.

22. Моисеева H.A. Молекулярные и клеточные механизмы морфогенеза в культуре клеток растений // Биология культивируемых клеток и биотехнология растений / Под. Ред. Бутенко Р.Г. М.: Наука. 1991. С. 166-185.

23. Молчанов A.A., Смирнов В.В. Методика изучения прироста древесных растений//М.: Наука, 1967. 100 с.

24. Носов A.M. Культура клеток высших растений уникальная система, модель, инструмент // Физиология растений. 1999. Т. 46, №6. С. 837-844.

25. Паушева З.П. Практикум по цитологии растений // М.: Колос. 1980. С.340.

26. Рокицкий П.Ф. Биологическая статистика // Минск: Высшая школа. 1993.320 с.

27. Северова А.И. Вегетативное Размножение Хвойных // Москва: Изд. Академии Наук СССР. 1951. 158 с.

28. Сукачев В.Н. Дендрология // Изд. 2-е, испр. И доп. Л.: Гослестехиздат. 1938. 574 с.

29. Тренин В.В. Цитоэмбриология лиственницы // Л.: Наука. 1986. 88 с.

30. Третьякова И.Н. Эмбриология хвойных: физиологические аспекты // Новосибирск: Наука. Сиб. отд-ние. 1990. 157 с.

31. Шмидт В.М. Математические методы в ботанике // JL: Изд-во Ленингр. ун-та. 1984. 288 с.

32. Afele J.C., Seneratna Т., McKersie B.D., Saxena Р.К. Somatic embryogenesis and plant regeneration from zygotic embryo culture in blue spruce (.Piceapungens Engelman.) // Plant Cell Rep. 1992. V.l 1. P. 299-303.

33. Arrigoni O., De Gara L., Tommasi F., Liso R. Changes in the ascorbate system during seed development in Vicia faba L. // Plant Physiol. 1992. V.99. P. 235-238.

34. Arya S., Kalia R.K., Arya I.D. Induction of somatic embryogenesis in Pinns roxburghii Sarg. // Plant Cell Reports. 2000. V.19. P. 775-780.

35. Ashihara H., Stasolla C., Loukanina N., Thorpe T.A. Purine metabolism during white spruce somatic embryo development: salvage of adenine, adenosine and inosine // Plant Sci. 2001. V.l60. P. 647- 657.

36. Attree S.M., Fowke L.C. Embryogeny of gymnosperms: advances in synthetic seed technology of conifers // Plant Cell Tiss. Organ Cult. 1993. V.35. P. 1-35.

37. Attree S.M., Pomeroy M.K., Fowke L.C. Manipulation of conditions for the culture of somatic embryos of white spruce for improved triacylglycerol biosynthesis and desiccation tolerance// Planta 1992. V.l87. P. 395-404.

38. Attree S.M., Budimir S., Fowke L.C. Somatic embryogenesis and plantlet regeneration from cultured shoots and cotyledons of seedlings from stored seeds of black and white spruce {Picea mariana and Picea glauca) // Can. J. Bot. 1990. V. 68. P. 30-34.

39. Bandyopadhyay S., Cane K., Rasmussen G., Hamill J.D. Efficient regeneration from seedling explants of two commercially important temperate eucalypt species Eucalyptus nitens and E. globulus. II Plant Sci. 1999. V.140. P. 189-198.

40. Becwar M.R., Noland T.L., Wann S.R. A method for quantification of the level of somatic embryogenesis among Norway spruce callus lines // Plant cell Rep. 1987. V.6. P. 35-38.

41. Becwar M.R., Nagmani R., Wann S.R. Initiation of embryogenic cultures and somatic embryo development in loblolly pine (Pinus taeda) // Can. J. For. Res. 1990. V.20. P. 810-817.

42. Belmonte M.F., Stasolla C. Application of DL-buthionine-S,R.-sulfoximine deplete cellular glutathione and improve white spruce (Picea glauca) somatic embryo development // Plant Cell Rep. 2007. V.26. P. 517-523.

43. Bercetche J., Paques M. Somatic embryogenesis in maritime pine (Pinus pinaster). // In: Jain S, Gupta PK, Newton RJ (Eds) Somatic Embryogenesis in Woody Plants (Vol 3) Gymnosperms, Kluwer Akademic Publisher, The Netherlands. 1995. P. 269-285.

44. Bewley J., Black M. Seeds: physiology of development and germination // New York: Plenum Press. 1994. 128 pp.

45. Bondarev N.I., Nosov A.M. Trophic and Hormonal Factors Influence on Stevia rebaudiana Shoot Growth in the Roller Bioreactor: Abstr. Congress on in vitro Biology II In Vitro Cellular and Develop. Biol. 1998. V.34. P.77.

46. Bonga J.M., Durzan DJ. Cell and tissue culture in forestry // Dordrecht: Martinus Nijhoff Publishers. 1987. 422 pp.

47. Bonga J.M., Von Aderkas P. In vitro culture of trees // Dordrecht: Netherlands, Kluwer. 1992. 236 pp.

48. Bourgkard F., Favre J.M. Somatic embryos from callus of Sequoia sempervirens II Plant Cell Rep. 1988. V.7. P. 445-448.

49. Bozhkov P.V., Ahn I.S., Park Y.G. Two alternative pathways of somatic embryo origin from polyembryonic mature stored of Pinus koraiensis Sieb et Zucc. // Canadian Journal of Botany. 1997. V.75. P. 509-512.

50. Chalupa W. Somatic embryogenesis and plantlet regeneration from cultured immature and mature embryos of Picea abies (L.) // Karst. Communi. Inst. For. Cech. 1985. V.14. P. 57-63.

51. Charest P.J. Biotechnology in Forestry: Examples from the Canadian Forest Service//For. Chron. 1996. V.72, №1. P. 37-42.

52. Chavez V.M., Litz R.E., Norstog K. Somatic embryogenesis and organogenesis in Zamia fischeri, Z. furfuracea and Z pumila. II Plant Cell Tiss. Org. Cult. 1992. V.30. P. 99-105.

53. Cheliak W.M., Klimaszewska K. Genetic variation in somatic embryogenic response in open-pollinated families of black spruce // Theor. Appl. Genet. 1991. V.82.P. 185-190.

54. Cornu D., Geoffrion C. Aspects de l'embryogenese somatique chez le meleze. //Euk. Soc. Bot. Fr. 1990. V.137. P. 25-34.

55. Cornu D. Forêt, de la gélose à la terre // Biofutur, Février. 1994. P. 25-31.

56. Cyr D.R., Klimaszewska K. Conifer somatic embryogenesis: II. Applications //Dendrobiology. 2002. V.48. P. 41-49.

57. Cyr D.R. Cryopreservation of embryogenic cultures of conifers and its application to clonal forestry // In: Somatic Embryogenesis in Woody Plants, Vol.4. Jain S.M., Gupta P.K., Newton R.J. (eds). Kluwer Academic, Boston, MA. 1999. P. 239-261.

58. Dong J.-Z., Dunstan D.I. Characterization of three heat-shock-protein genes and their developmental regulation during somatic embryogenesis in white spruce Picea glauca (Moench) Voss. //Planta. 1996. V.200. P. 85-91.

59. Dong J.-Z., Dunstan D.I. Expression of abundant mRNAs during somatic embryogenesis of white spruce Picea glauca (Moench) Voss). // Planta. 1996. V.200. P. 459-466.

60. Dong J.-Z., Perras M.R., Abrams S.R., Dunstan D.I. Gene expression patterns, and uptake and fate of fed ABA in white spruce somatic embryo tissue during maturation. // J. Exp. Bot. 1997. V.48. P. 277-287.

61. Dong J.-Z., Perras M.R., Abrams S.R., Dunstan D.I. Induced gene expression following ABA uptake in embryogenic suspension cultures of Picea glauca. II Plant Physiol. Biochem. 1996. V.34. P.579-587.

62. Dong J.-Z., Dunstan D.I. Molecular biology of somatic embryogenesis in conifers // In: Jain SM & Minocha SC (eds) Molecular Biology of Woody Plants Vol. 1 Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, The Netherland. 2000. P. 51-87.

63. Dumas E., Monteuuis O. Régénération in vitro de pins maritimes âgés par bourgeonnement adventif sur euphylles // Ann. AFOCEL. 1991. P. 43-58

64. Dunstan D.I., Dong J-Z, Carrier DJ., Abrams S. Events following ABA treatment of spruce somatic embryos. // In Vitro Cell Dev. Biol.-Plant. 1998. V.34. P. 159-168.

65. Dunstan D.I., Bethune T.D., Bock C.A. Somatic embryo maturation from long-term suspension cultures of white spruce {Picea glauca ) // In Vitro Cell. Dev. Biol. Plant. 1993. V.29. P.109-112.

66. Dunstan D.I., Tautorus T.E., Thorpe T.A. Somatic embryogenesis in woody plants // In: Thorpe, T. A., ed. In vitro embryogenesis in plants. Dordrecht, The Netherlands: Kluwer Academic Publishers. 1995. P. 471-541.

67. Durzan D .J., Chalupa V. Growth and metabolism of cells and tissue of jack pine (Pinus banksiana). III. Growth of cells in liquid suspension cultures in light and darkness // Can. J. Bot. 1976. V.54. P. 456-467.

68. Durzan D.J. Progress and promise in forest genetics // Proceedings of the 50th Anniversary Conference, Paper Science and Technology, The Cutting Edge: The Institute of Paper Chemistry. 1980. P. 31-60

69. Durzan D.J., Gupta P.K. Somatic embryogenesis and polyembryogenesis in Douglas-fir cell suspension cultures // Plant Sci. 1987. V.52. P. 229-235.

70. Dyachok J.V., Wiweger M., Kenne L., von Arnold S. Endogenous Nod-factor-like signal molecules promote early somatic embryo development in Norway spruce // Plant Physiol. 2002. V.128. P. 523-533.

71. Dyachok J.V., Tobin A.E., Price NPJ., von Arnold S. Rhizobial Nod factors stimulate somatic embryo development in Picea abies II Plant Cell Rep. 2000. V. 19. P. 290-297.

72. Egertsdotter U., von Arnold S. Development of somatic embryos in Norway spruce//J. Exp. Bot. 1998. V.49. P. 155-162.

73. Egertsdotter U., von Arnold S. Importance of arabinogalactan proteins for the development of somatic embryos of Norway spruce (Picea abies) // Physiol. Plant. 1995. V.93.P. 334-345

74. FAO. 2000. How appropriate are currently available biotechnologies for the forestry sector in developing countries?. Background Document to Conference 2 (25 April to 30 June 2000) of the FAO Biotechnology Forum. (www.fao.org/biotech/C2doc.htm)

75. Filonova L.H., Bozhkov P.V., von Arnold S. Developmental pathway of somatic embryogenesis in Picea abies as revealed by time-lapse tracking // J. Exp. Bot. 2000. V.51. P. 249-264.

76. Filonova L.H., Bozhkov P.V., Brukhin V.B., Daniel G., Zhivotovsky B., von Arnold S. Two waves of programmed cell death occur during formation anddevelopment of somatic embryos in the gymnosperm, Norway spruce. // J. Cell Sci. 2000. V.113. P. 4399-4411.

77. Firmer J .J., Kriebel H.B., Becwar M.R. Initiation of embryogenic callus and suspension cultures of eastern white pine {Pinus strobus L.) // Plant Cell Reports 1989. V.8.P. 203-206.

78. Galiana A., Goh D., Chevallier M.H., Gidiman J., Moo H., Hattah M., Japarudin Y. Micropropagation of Acacia mangium x A. auriculiformis hybrids in Sabah // Bois For. Trop. 2003. V.275. P. 77-82.

79. Gould J.H., Zhou Y., Padmanabhan V., Maria E. Transformation and regeneration of loblolly pine: shoot apex inoculation with Agrobacterium // Molecular Breeding. 2002. V.10. P. 131-141

80. Guevin T.G., Kirby E.G. Induction of embryogenesis in cultured mature zygotic embryos of Abies fraseri (Pursh) Poir. // Plant Cell Tiss. Organ Cult. 1997 V.49. P. 219-222.

81. Guevin T.G., Micah V., Kirby E.G. Somatic embryogenesis in cultured mature zygotic embryos of Abies balsamea. // Plant Cell Tiss. Organ Cult. 1994. V.34. P. 205-208.

82. Gupta P.K., Durzan D.J. Biotechnology of somatic polyembryogenesis and plantlet regeneration in loblolly pine. // BioTechnology. 1987. V.5. P. 147-151.

83. Gupta P.K., D.J. Durzan Plantlent regeneration via somatic embryogenesis from subcultured callus of mature embryos of Picea abies (Norway spruce) // In Vitro Cell. Dev. Biol. 1986. V.22. P. 685-688.

84. Gupta P.K., Grob J.A. Somatic embryogenesis in conifers // In: Jain S., Gupta P.K., Newton R.J., eds. Somatic embryogenesis in woody plants. V.l. Dordrecht, The Netherlands: Kluwer Academic Publishers. 1995. P. 81-98.

85. Gupta P.K., Durzan D.J. Somatic polyembryogenesis from calles of mature sugar pine embryos//BioTechnology. 1986. V.4. P. 643-645.

86. Gutmann M., von Aderkas P., Label P., Lelu M. Effects of abscisic acid on somatic embryo maturation of hybrid larch // J. Exp. Bot. 1996. V.47. P. 19051917.

87. Gyorgyey J., Gatner A. Alfalfa heat shock genes are differentially expressed during somatic embryogenesis //Plant Mol. Biol. 1991. V.16. P. 999-1007.

88. Hakman I., Rennie P., Fowke L.C. A light and electron microscopy study of Picea glauca (white spruce) somatic embryos //Protoplasma. 1987. V.140. P. 100109.

89. Hakman I., Fowke L.C. Somatic embryogenesis in Picea glauca (white spruce) and Picea mariana (black spruce) // Can.J. Bot. 1987. V.65. P. 656-659.

90. Hakman I., Fowke L.C., Von Arnold S., Eriksson T. The development of somatic embryos in tissue cultures initiated from immature embryos of Picea abies (Norway spruce) //Plant Sci. 1985. V.38. P. 53-59.

91. Harman G.E., Horman C.R., Chet I. Trichoderma species opportunistic avirulent plant symbiont // Nature revieves. 2004. V.2. P. 43 - 56.119

92. Jain S.M., Dong N., Newton R.J. Somatic embryogenesis in slash pine {Pinus elliottii) from immature embryos cultured in vitro // Plant Sci. 1989. V.65. P. 233241.

93. Jones N.B., van Staden J. Plantlet production from somatic embryos of Pinus patula. //Journal of Plant Physiology. 1995. V.145. P. 519-525.

94. Jourdain I., Lelu M-A., Label P. Hormonal changes during growth of somatic embryogenic masses in hybrid larch // Plant Physiol. Biochem. 1997. V.35, №9. P. 741-749.

95. Joy IV R.W. Nitrogen metabolism during somatic embryogenesis in Picea glauca and Daucus carota: a NMR study, Ph.D. Dissertation, The University of Calgary, Calgary. 1994.

96. Joy IV R.W., Vogel H.J., Thorpe T.A. Inorganic nitrogen metabolism in embryogenic white spruce cultures. A nitrogen 14-15 NMR study // J. Plant Physiol. 1997. V.151. P. 306-315.

97. Joy IV R.W., Kumar P.P., Thorpe T.A. Long-term storage of somatic embryogenic white spruce tissue at ambient temperature // Plant Cell Tiss. Organ Cult. 1991. V.25.P. 53-60.

98. Kainonen-Mettala K., Jalonen P., Eurola P., von Arnold S., von Weissenberg K. Somatic embryogenesis of Pinus sylvestris // Scandinavian Journal of Forest Research. 1996. V.l 1. P. 242-250.

99. Kartha K.K., Fowke L.C., Leung N.L., Caswell K.L., Hakman I. Induction of somatic embryos and plantlets from cryopreserved cell cultures of white spruce (Picea glauca) II J. Plant Physiol. 1988. V.132. P. 529-539.

100. Kim Y.W., Moon H.K. Regeneration of plant by somatic embryogenesis in Pinus rigida x-P. taeda II In Vitro Cell. Dev. Biol.Plant. 2007. V.43. P. 335-342.

101. Klimaszewska K., Cyr D.R. Conifer somatic embryogenesis: I. Development // Dendrobiology. 2002. V. 48. P. 31-39.

102. Klimaszewska K., Smith D.R. Maturation of somatic embryos of Pinus strobus is promoted by a high concentration of gellan gum // Physiol. Plant. 1997. V.l 00. P. 949-957.

103. Klimaszewska K., Park Y. S., Overton C., MacEacheron I., Bonga J. M. Optimized somatic embryogenesis in Pinus Strobus L. // In vitro cell.Dev. Biol.Plant. 2001. 37. P. 392-399.

104. Klimaszewska K. Plant development from immature zygotic embryos of hybrid larch through somatic embryogenesis // Plant Sci. 1989. V.63. P. 95-103.

105. Klimaszewska K., Trontin J.F., Becwar M., Devillard C., Park Y.S., Lelu-Walter M.A. Recent progress on somatic embryogenesis of four Pinus sp. // Tree For. Sci. Biotechnol. 2007. V.l. P. 11-25.

106. Kong L., Yeung E.C. Development of white spruce somatic embryos: II. Continual shoot meristem development during germination // In Vitro Cell. Dev. Biol. Plant. 1992. V.28. P. 125-131.

107. Kong L., Yeung E.C. Effects of ethylene and ethylene inhibitors on white spruce somatic embryo maturation//Plant Sci. 1994. V.l04. P. 71-80.

108. Kong L., Attree S.M., Fowke L.C. Effects of polyethylene glycol and methylglyoxal bis (guanylhydrazone) on endogenous polyamine levels and somatic embryo maturation in white spruce {Picea glauca ) // Plant Sci. 1998. V.133. P. 211-220.

109. Kong L., Yeung E.C. Effects of silver nitrate and polyethylene glycol on white spruce {Picea glauca) somatic embryo development: enhancing cotyledonary embryo formation and endogenous ABA content // Physiol. Plant. 1995. V.93.P. 298-304.

110. Krogstrup P. Embryo-like structures from cotyledons and ripe embryos of Norway spruce {Picea abies) II Can. J. For. Res. 1986. V.16. P. 664-668.

111. Malabadi R.B., Van Staden J. Somatic embryogenesis from vegetative shoot apices of mature trees of Pinus patula II Tree Physiology. 2005. V.25. P. 11-16.

112. Misra S., Green M.J. Developmental gene expression in conifer embryogenesis and germination. II. Crystalloid protein synthesis in the developing embryo and megagametophyte of white spruce {Picea glauca Moench. Voss) // Plant Sci. 1991. V.78. P. 61-71.

113. Misra S., Attree S.M., Leal I., Fowke L.C. Effect of abscisic acid, osmoticum, and desiccation on synthesis of storage proteins during the development of white spruce somatic embryos // Ann. Bot. 1993. V.71. P. 11-22.

114. Mo L.H., von Arnold S., Lagercrantz U. Morfogenic and genetic stability in longterm embryogenic cultures and somatic embryos of Norway spruce {Picea abies L.) //Plant Cell Rep. 1989. V.8. P. 375-378.

115. Monteuuis O., Goh D. About the use of clones in teak // Bois For. Trop. 1999. V.261.P. 28-38

116. Monteuuis O., Alloysius D., Garcia C., Goh D., Bacilieri R. Field behavior of an in v//ra-issued Acacia mangium mature selected clone compared to its seed-derived progeny // Aust. For. 2003. V.66. P. 87-89.

117. Monteuuis O., Dumas E. Morphological features as indicators of maturity in acclimatized Pinus pinaster from different in vitro origins // Can. J. For. Res. 1992. V.22.P. 1417-1421.

118. Murashige T., Skoog F.A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures // Physiol. Plant. 1962. V.15, №4. P. 473-497.

119. Nagmani R, Bonga J.M. Embryogenesis in subcultured callus of Larix decidua II Can. J. For. Res. 1985. V.15. P. 1088-1091.

120. Nagmani R., Dinner A.M., Sharma G.C. Somatic embryogenesis in longleaf pine (Pinus palustris) I I Canadian Journal of Forest Research 1993. V.23. P. 873976.

121. Newton C.H., Flinn B.S., Sutton B.C.S. Vicilin-like seed storage proteins in the gymnosperm interior spruce (Picea glauca/engelmanii ) // Plant Mol. Biol. 1992. V.20. P. 315-322.

122. Niskanen A-M., Lu J., Seitz S., Keinonen K., Von Weissenberg K., Pappinen A. Effect of parent genotype on somatic embryogenesis in Scots pine (Pinus sylvestris) // Tree Physiology. 2004. V.24. P. 1259-1265.

123. Norgaard J.V., Krogstrup P. Cytokinin induced somatic embryogenesis from immature embryos of Abies nordmandiana Lk. I I Plant Cell Rep. 1991. V.9. P. 509-513.

124. Norstog K. Induction of apogamy in megagametophytes of Zamia integrifolia. //Amer. J. Bot. 1965. V.52. P. 993-999.

125. Park Y.S. Implementation of conifer somatic embryogenesis in clonal forestry: technical requirements and deployment considerations // Ann.For. Sci. -2002. V.59.P. 651-656.

126. Percy R.E., Klimaszewska K., Cyr D.R. Evaluation of somatic embryogenesis for clonal propagation of western white pine // Canadian Journal of Forest Research. 2000. V.30. P. 1867-1876.

127. Pullman G.S., Skryabina A. Liquid medium and liquid overlays improve embryogenic tissue initiation in conifers // Plant Cell Rep. 2007. V.26. P. 873-887.

128. Quoirin M. Micropropagation of Acacia species II In S.M. Jain, K. Ishii, eds. Micropropagation of woody trees and fruits, Dordrecht, Netherlands, Kluwer. 2003. P. 245-268.

129. Rahman M.S., Messinamg M.G., Newton R.J. Performance of loblolly pine (Pinns taeda L.) seedlings and micropropagated plantlets on an east Texas site. I. Above- and belowground growth II For. Ecol. Manage. 2003. V.178. P. 245-255.

130. Roberts D.R., Flinn B.S., Webb D.T., Webster F.B., Sutton BCS Characterization of immature embryos of interior spruce by SDS-PAGE and microscopy in relation to their competence for somatic embryogenesis // Plant. Cell. Rep. 1989. V.8. P. 285-288.

131. Ruaud J.N., Bercetche J., Paques M.First evidence of somatic embryogenesis from needles of 1-year-old Picea abies II Plant Cell Rep. 1992. V.l 1. P. 563-566.

132. Saebo A., Skjeseth G., Appelgren M. Light quality of the in vitro stage affects the subsequent rooting and field performance of Betula pendula (Roth.) // Scand. J. For. Res. 1995. V.10. P. 155-160.

133. Salajova T., Salaj J. Somatic embryogenesis in European black pine (Pinus nigra Arn.) // Biologia Plantarum. 1992. V.34. P. 213-218.

134. Santanen A., Simola L.K. Changes in polyamine metabolism during somatic embryogenesis of Picea abies II J. Plant Physiol. 1992. V.140. P. 475^180.

135. Saxena S., Dhawan V. Large-scale production of Anogeissus pendula and A.latifolia by micropropagation // In Vitro Cell. Dev. Biol.-Plant. 2001. V.37. P. 586-591.

136. Schiavone F.M., Cooke T.J. Unusual patterns of somatic embryogenesis in the domesticated carrot: developmental effects of exogenous auxins and auxin transport inhibitors // Cell Diff. 1987. V.21. P. 53-62.

137. Schmincke K.H. Teak plantations in Costa Rica: precious woods experience // Unasylva. 2000. V.201. P. 29-35.

138. Schopf J .M. The embryology of Larix // Illinois Biol. Monogr. 1943. Y.19. P. 1-97.

139. Schuller A., Reuther G., Geier T. Somatic embryogenesis from seed expiants of Abies alba II Plant Cell Tiss. Org. Cult. 1989. V.17. P. 53-58.

140. Smertenko A.P., Bozhkov P.V., Filonova L.H., Von Arnold S., Hussey P. Reorganization of the cytoskeleton during developmental programmed cell death in Picea abies embryos // Plant J. 2003. V.33. P. 813-824.

141. Stasolla C., Yeung E.C. Ascorbic acid metabolism during white spruce somatic embryo maturation and germination // Physiol. Plant. 2001. V.lll. P. 196-205.

142. Stasolla C., Yeung E. Endogenous ascorbic acid modulates meristem reactivation in white spruce somatic embryos and affects thymidine and uridine metabolism // Tree physiology. 2006. V.26. P. 1197-1206.

143. Stasolla C., Kong L., Yeung E.C., Thorpe T.A. Maturation of somatic embryos in conifers: morphogenesis, physiology, biochemistry and molecular biology // In Vitro Cell. Dev. Biol.-Plant. 2002. V.38. P. 93-105.

144. Stasolla C., Loukanina N., Ashihara H., Yeung E.C., Thorpe T.A. Pyrimidine nucleotide and nucleic acid synthesis in embryos and megagametophytes of white spruce {Picea glauca) during germination // Physiol. Plant. 2002. V.115. P. 155— 165.

145. Stasolla C., Yeung E. Recent advances in conifer somatic embryogenesis: improving somatic embryo quality // Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 2003. V.74. P. 15-35

146. Stasolla C., van Zyl L., Egertsdotter U., Craig D., Liu W., Sederoff R. The effects of polyethylene glycol (PEG) on gene expression of developing white spruce somatic embryos // Plant Physiol.2003. V.131. P. 49-60.

147. Sundas-Larsson A., Svenson M., Liao M., Engstrom P. A homeobox gene with potential developmental control function in the meristem of the conifer Picea abies II Proc. Natl Acad. Sci. USA 1998.V.95.P. 15118-15122.

148. Tautorus T.E., Fowke L.C., Dunstan D.I. Somatic embryo genesis in conifers // Can. J. Bot. 1991. V.69. P. 1873-1899.

149. Tompson R.G., von Aderkas P. Somatic embryogenesis and plant regeneration from immature embryos isolated from western larch // Plant Cell Rep. 1992. V.ll.P. 379-385.

150. Tremblay L., Tremblay F.M. Effects of gelling agents, ammonium nitrate, and light on the development of Picea mariana (Mill.) B.S.P. (black spruce) and Picea rubens Sarg. (red spruce) somatic embryos. // Plant Sci. 1991. V.77. P. 233-242.

151. Vales T., Feng X., Ge L., Xu N., Cairney J., Pullman G.S., Peter G.F. Improved somatic embryo maturation in loblolly pine by monitoring ABA-responsive gene expression // Plant Cell Rep. 2007. V.26.P. 133-143.

152. Von Aderkas P., Bonga J., Klimaszewska K., Owens J. Comparison of larch embryogeny in vivo and in vitro II Woody plant biotechnology. New York: Plenum press. 1991. P. 139-155.

153. Von Aderkas P., Klimaszewska K., Bonga J. Diploid and haploid embryogenesis in Larix leptolepis, L. decidua, and their reciprocal hybrids // Can. J. For. Res. 1990. V.20. P. 9-14.

154. Von Aderkas P., Bonga J. Formation of haploid embryoids of Larix deciduas: early embryogenesis II Am. J. Bot. 1988 . V.75. P. 690-700.

155. Von Aderkas P., Lelu M-A., Label P. Plant growth regulator levels during maturation of larch somatic embryos // Plant Physiol. Biochem. 2001. V.39. P. 495-502.

156. Von Arnold S., Woodward S. Organogenesis and embryogenesis in mature zygotic embryos of Picea sitchensis / // Tree Physiology. 1988. V.4. P. 291-300.

157. Von Arnold S., Hakman I. Regulation of somatic embryo development in Picea abies by abscisic acid (ABA) / // J. Plant Physiol. 1988. V.132. P. 164-169.

158. Watt M.P., Blakeway F.C., Mokotedi S.M., Meo J. Micropropagation of Eucalyptus // In S.M. Jain & K. Ishii, eds. Micropropagation of woody trees and fruits. Dordrecht, Netherlands, Kluwer. 2003. P. 217-244.

159. Webb D.T., Osborne R. Cycads // In: BAJAJ YPS (Ed) Trees II. Biotechnology in Agriculture and Forestry, Springer-Verlag, Berlin. 1989. V.5. P. 591-613.

160. Westcott R.J. Embryogenesis from non-juvenile Norway Spruce {Picea abies) //Abstr. In Vitro II. 1992. V.28. P.101.

161. Wright J.W. Genetics of forest tree improvement // FAO forestry and For. Products Studies. Roma. 1962. №16. P. 399.

162. Yeung E.C., Stasolla C., Kong L. Apical meristem formation during zygotic embryo development of white spruce // Can. J. Bot. 1998. V.76. P. 751-761.

163. Yeung E.C., Stasolla C. Somatic embryogenesis-apical meristem formation and conversion // Korean J. Plant Tiss. Cult. 2000. V.27. P.253-258.

164. Yeung E.C. Structural and developmental patterns in somatic embryogenesis // In: Thorpe T. A., ed. In vitro embryogenesis in plants. Dordrecht, The Netherlands: Kluwer Academic Publishers. 1995. P. 205-249.

Информация о работе

Барсукова, Алена Владимировна
кандидата биологических наук
Красноярск, 2010
ВАК 03.01.05

Диссертация

Регуляция соматического эмбриогенеза у видов лиственницы в культуре in vitro - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы