Адвентивное почкообразование и каллусогенез у сибирских видов хвойных в культуре in vitro

Филиппова, Ирина Панфиловна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Адвентивное почкообразование и каллусогенез у сибирских видов хвойных в культуре in vitro
ВАК РФ 03.01.05, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Адвентивное почкообразование и каллусогенез у сибирских видов хвойных в культуре in vitro"

На правах рукописи

Филиппова Ирина Панфиловна

АДВЕНТИВНОЕ ПОЧКООБРАЗОВАНИЕ И КАЛЛУСОГЕНЕЗ У СИБИРСКИХ ВИДОВ ХВОЙНЫХ В КУЛЬТУРЕ IN VITRO

03.01.05 - физиология и биохимия растений

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 7 ЯН В ¿011

Красноярск - 2010

4843455

Работа выполнена в федеральном автономном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Сибирский федеральный университет»

Научный руководитель

доктор биологических наук, профессор

Третьякова Ираида Николаевна

Официальные оппоненты

доктор биологических наук, профессор

Тихомиров Александр Аполлинарьевич

доктор биологических наук Новикова Татьяна Ивановна

Ведущая организация

Сибирский институт физиологии и биохимии растений СО РАН (г. Иркутск)

Защита состоится « 27 » января 2011 г. в 13 часов на заседании диссертационного совета ДМ 212.099.15 при Сибирском федеральном университете по адресу: 660041, Красноярск, пр. Свободный, 79

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Сибирского федерального университета.

Автореферат разослан « » декабря 2010 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук, доцент Гаевский Н. А,

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Методы культуры тканей растений in vitro находят все большее применение в фундаментальных и прикладных исследованиях в области физиологии, генетики, эмбриологии и целом в биологии развития растений. Достижения в области культуры клеток и тканей привели к созданию принципиально новых методов вегетативного размножения, таких как микрочеренкование, адвентивное почкообразование и соматический эмбриогенез (Биотехнология растений, 1989). Использование этих методов, разработанных на покрытосеменных растениях, представляет значительный интерес для микроклонального размножения хвойных видов.

Культура тканей хвойных in vitro может играть важную роль в генетико-селекционных программах лесовосстановления древесных видов, так как репродуктивный потенциал этих видов снижается (Третьякова, Бажина, 1996). Однако, в исследованиях, которые проводятся с культурами in vitro органов, тканей и клеток растений одной из наиболее актуальных проблем является индукция морфогенеза. Особенно остро эта проблема стоит перед исследователями, работающими с древесными в том числе и хвойными растениями, поскольку известно, что морфогенетические процессы в условиях in vitro индуцируются у них с большим трудом, характеризуются нестабильностью и трудной воспроизводимостью (Савельев и др., 2008). В то же время открытие у хвойных соматического эмбриогенеза (Hakman et al., 1985; Chalupa, 1985) и адвентивного почкообразования (Хмара, Катаева, 1993; Arnold, 1982; Lapp et al., 1995; Gonzales et al., 1998; Renau-Morata et al., 2005) в культуре in vitro свидетельствует о множественности реализации морфогенетических программ у данного класса растений в контролируемых условиях и способности хвойных видов к массовому размножению через методы культуры тканей.

Цель и задачи исследования. Цель исследования - изучение закономерностей адвентивного почкообразования и каллусогенеза у ели сибирской {Picea obovata Ledeb.), лиственницы сибирской (Larix sibirica Ledeb.) и сосны обыкновенной (Pinus sylvestris L.) в культуре in vitro.

В соответствии с поставленной целью в задачи исследований входило:

- выбор эксплантов и подбор оптимальных условий культуры in vitro для каллусогенеза;

- установление оптимальных концентраций цитокининов в питательной среде для адвентивного почкообразования;

- проведение гистологического контроля на разных сроках культуры in vitro у эксплантов в условиях направленного органогенеза;

- оценка эффективности индуцирующего действия «импульсной» обработки эксплантов высокими концентрациями цитокинина (6-БАП) на образования адвентивных почек.

зародышей ели сибирской, сосны обыкновенной и лиственницы сибирской. Впервые к эксплантам сибирских видов хвойных (зрелым зиготическим зародышам и семядольным хвоинкам проростков) была применена методика пульсирующей обработки с высокими концентрациями цитокинина, в результате чего происходило активное адвентивное почкообразование в условиях культуры in vitro.

Теоретическая и практическая значимость. Полученные данные о закономерностях адвентивного почкообразования и каллусогенеза у ели сибирской, лиственницы сибирской и сосны обыкновенной расширяют информацию о роли фитогормонов в регуляции процессов онтогенеза растительного организма. Результаты исследований могут быть использованы в генетико-селекционных программах лесовостановления лесных древесных видов, а также могут быть включены в учебную программу подготовки специалистов по специальности Биология.

Положения, выносимые на защиту:

1. Цитокинины стимулируют образование адвентивных почек у хвойных в культуре in vitro.

2. Формирование адвентивных почек идет по типу развития апикальных меристем.

Личный вклад соискателя. Диссертантом непосредственно проведен информационный поиск и сделан анализ данных научной литературы, подготовлен обзор. Автором спланированы и проведены лабораторные эксперименты, изготовлены временные и постоянные препараты, собраны почки и семена с изучаемых объектов (семена из Богучанского лесхоза любезно предоставлены к.б.н. Кузьминой Н. А.).

Апробация работы. Основные материалы, содержащиеся в диссертационной работе, были представлены и докладывались на следующих конференциях: II Российской конференции «Флора и растительность Сибири и Дальнего Востока» (Красноярск, 1996), международной научно-практической конференции «Генетика и селекция на службе лесу» (Воронеж, 1996), конференции молодых ученых КНЦ СО РАН (Красноярск, 1997), VII международной конференции «Биология клеток растений in vitro, биотехнология и сохранение генофонда» (Москва, 1997), международной конференции по анатомии и морфологии растений (С- Петербург, 1997), международной конференции «The supporting roots structure and function» (France, Bordeaux, 1998), II (X) съезде Русского ботанического общества «Проблемы ботаники на рубеже XX-XXI веков» (С-Петербург, 1998), IX международном симпозиуме «Реконструкция гомеостаза» (Красноярск, 1998), IUFRO Interdivisional Symposium «Larix-98: World Resources for Breeding Resistance and Utilization» (Красноярск, 1998), международной конференции «Леса и лесообразовательный процесс на Дальнем Востоке» (Владивосток, 1999), X международного симпозиума «Концепция гомеостаза: теоретические, экспериментальные и прикладные аспекты» (Красноярск, 2001), международной конференции «Биологические ресурсы и

устойчивое развитие» (Пущино, 2001), международном симпозиуме «Молекулярные механизмы генетических процессов и биотехнология» (Москва, 2001), II международной конференции по анатомии и морфологии растений (С-Петербург, 2002).

Публикации. По материалам диссертации была опубликована 21 работа, три из которых в рецензируемых научных журналах, рекомендуемых перечнем ВАК РФ.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 145 страницах и состоит из введения, пяти глав, выводов, списка использованной литературы (246 источников, в том числе 149 иностранных) и включает 17 таблиц и 44 рисунка.

Благодарности. Автор признателен д.б.н. П.П.Силкину за оказанное содействие в выполнении ряда микрофотографий. Особую благодарность автор выражает научному руководителю - д.б.н. Третьяковой И.Н.

Диссертационная работа выполнена при частичной финансовой поддержке грантов РФФИ (96-04-48257, 99-04-48578-а, 02-04-48168-а),

Содержание работы

Введение

Во введение обозначены актуальность темы, цель и задачи исследования, научная новизна, теоретическая и практическая значимость исследования.

Глава 1. Обзор литературы

В главе представлен анализ литературы по теме исследования. Рассматриваются компоненты питательных сред для культивирования in vitro (Смолов, Опанасенко, 2009; Измайлов, 1986; Бутенко, 1964; Иванова и др., 1997; Николаева и др., 2001; Winder, Nishio, 1995; Shelp et al., 1995; Romeu-Moreno, Mas, 2000; Takatsuju, 1999; и др.). Обсуждается роль ауксинов и цитокининов в регуляции морфогенеза растений (Полевой, 1982; Кефели, 1974; Муромцев и др., 1987; Запрометов и др., 1994; Гусаковская и др., 2000; Ломин, Романов, 2008; Журавлев, Омелько, 2008; Legocka et al., 1990; Gan, Amasino, 1995; Saenz, Jones, 2003; Stirk, Novak, 2003 и др.). Особое внимание уделено вопросам использования методов культуры in vitro (каллусных культур и адвентивному почкообразованию) применительно к хвойным растениям (Момот, 1977; Руте, Мауриня, 1989; Хмара, Катаева, 1993; Кунах, 1999; Галеева и др. 2001; Румянцева и др., 2005; Arnold, 1982; Toribio, Pardos, 1986; Flinn et al., 1988; Budimir, Vujicic, 1992; Harry, Thorpe, 1994; Lambardi et al., 1995; Lapp et al., 1995; Calixto, Pais, 1997; Gonzales et al., 1998 и др.).

Глава 2. Объекты и методы исследований

Объектами исследований являлись представители семейства Pinaceae: лиственница сибирская (Larix sibirica Ledeb.), сосна обыкновенная (Pinns sylvestris L.) и ель сибирская (Picea obovata Ledeb.), произрастающие в естественных древостоях и в искусственных насаждениях. С этих видов растений в качестве растительного материала были взяты почки и семена.

Сбор терминальных и латеральных почек проводили с деревьев Larix sibirica и Picea obovata в возрасте 25-30 лет вступивших в фазу семеношения, произрастающих в Дендрарии и на Погорельском ОЭП Института леса СО РАН. Семена Picea obovata были получены из Емельяновского лесхоза, Pinus sylvestris - из Дендрария Института леса, Larix sibirica - с Богучанского лесхоза и Дендрария Института леса.

Зиготические зародыши из семян, проростки и почки деревьев вводились в культуру in vitro для получения каллусогенеза и органогенеза ( Бутенко 1964, 1999; Калинин и др.,1980, Биотехнология растений, 1989; Biotechnology in Agriculture and Forestry, 1985).

Для выращивания культур in vitro использовали следующие питательные среды: MS, В5 (Биотехнология растений, 1989), LP (Arnold von, Eriksson, 1976) и T-SS (Taesdale, et al., 1986).

Полученные культуры регулярно пересаживали, на свежую среду через 28-30 суток. Культуры выращивали при 16 ч фотопериоде (освещение люминесцентными лампами 5 кЛк), при температуре воздуха 25±1°С днем и 22±1°С ночью и 70 % относительной влажности воздуха.

Частоту индукции каллусообразования (%) определяли как соотношение количества эксплантов, продуцирующих каллус, к общему количеству эксплантов. Интенсивность прироста сырой биомассы в течение пассажа рассчитывали по формуле К = (М-Мо)/Мо, где М - биомасса в конце пассажа, М0 - биомасса в начале пассажа (Perez-Frances et al., 1995; Nin et al., 1996).

Для определения состояния фотосинтетического аппарата культур хвойных in vitro использовали метод термоиндуцированных изменений нулевого уровня флуоресценции хлорофилла (ТИНУФ) (Гаевский и др., 1991; Нестеренко и др., 2001).

Пульсирующую обработку растворами цитокинина (6-БАП) проводили по методике описанной в работе S. Arnold и Т. Eriksson (1985). Для приготовления постоянных и временных препаратов использовали стандартные методы (Паушева, 1988). Эксперименты были проведены в трехкратной повторности, что дало 150 и более эксплантов для каждого эксперимента. Полученные данные обрабатывались с помощью общепринятых статистических приемов (Плохинский, 1970; Лакин, 1990). Достоверность оценивали с помощью критерия Стьюдента (Р<0,05). Математическая обработка материала и построение графиков проведены с помощью пакета прикладных программ «STATISTICA» и «MS Excel for Windows».

Глава 3. Каллусные культуры ели сибирской, лиственницы сибирской и сосны обыкновенной

На первом этапе изучения каллусогенеза хвойных проведено введение в культуру in vitro терминальных и латеральных почек, взятых от 25-30 летних деревьев Picea obovata и Larix sibirica. Для определения оптимальной питательной среды для культивирования исследуемых видов хвойных было

протестировано несколько сред MS, LP, В5 и T-SS, различающихся по уровню содержания и соотношения макро- и микроэлементов при полном составе, а также сред MS и LP в разведении 1:1. Все среды содержали одинаковое количество витаминов, инозита, сахарозы, гидролизата казеина и регуляторов роста растений (2,4-Д 1 мг/л и 6-БАП 1 мг/л).

Результаты экспериментов показали, что состав среды оказал существенное влияние на инициацию каллусов из почек деревьев исследуемых хвойных. Минеральный состав сред В5 и T-SS не способствовал каллусообразованию. На средах MS и LP полного минерального состава у эксплантов наблюдалось образование каллуса с разной интенсивностью от 8% (брахибласты Larix sibirica) до 40% (у Picea obovata). Снижение концентрации макроэлементов этих двух сред, разведением 1:1 увеличило процент каллусообразования у почек в 1,5-2 раза. Максимальная индукция каллуса наблюдалась у терминальных и латеральных почек ели сибирской (каллусообразование достигнуто в среднем у 53- 65% эксплантов). Все полученные каллусы имели зеленый цвет и плотную консистенцию. Однако в ходе нескольких последующих пересадок происходила гибель каллусов.

На следующем этапе экспериментов была проведена оценка каллусообразующей способности ювенильных эксплантов у ели сибирской, лиственницы сибирской и сосны обыкновенной. Проростки семян и зиготические зародыши этих видов, на всех типах сред (MS, Vi MS, LP, Vi LP, V* LP), с различным содержанием регуляторов роста растений ауксинов 2,4-Д, НУК, ИМК (0,5-2 мг/л) или с добавлением цитокининов 6-БАП, кинетина (0,5-5 мг/л) были способны к каллусогенезу.

Для проростков и зиготических зародышей этих трех видов хвойных максимальная частота образования первичного каллуса зарегистрирована на среде Vi MS с разным соотношением ауксинов (2,4-Д, НУК, ИМК) и цитокининов (6-БАП, кинетин) - 2:0,2:1, 1:1,1:2,1:5.

Гистологический анализ каллусообразования у эксплантов зрелых зиготических зародышей лиственницы сибирской, ели сибирской и сосны обыкновенной на 3-21 сутки культивирования показал, что первыми появились антиклинарные клеточные деления в первичной коре гипокотиля (3-5е сутки). На 10 сутки клетки этой ткани увеличились в три раза и были расположены рыхло. На 21 сутки, в образовании каллуса были вовлечены и другие ткани зародышей, а именно клетки прокамбия гипокотиля, эндодермы и центрального цилиндра.

Сравнение сырой биомассы первичных каллусов в зависимости от среды и концентрации регуляторов роста растений проведено на исследуемых видах хвойных, где в качестве эксплантов использовали двухнедельные проростки. Полученные результаты показали, что увеличение концентрации 2,4-Д (с 1 мг/л до 2 мг/л) в среде привело к увеличению биомассы первичных каллусов у всех исследуемых видов хвойных. Снижение концентрации макросолей MS в два раза, а также добавление 1

мг/л 6-БАП вместе с ауксином благоприятно сказалось на интенсивности каллусообразования. Однако, дальнейшее повышение концентрации 6-БАП, при постоянном количестве ауксина в питательной среде не привело к заметному отличию показателей биомассы от предыдущего варианта.

Наряду с 2,4-Д в работе был использован НУК. Сравнение воздействия двух ауксинов на некоторые характеристики каллусных тканей двух видов хвойных показало, что на среде Уг МБ с 2,4-Д для ели и лиственницы прирост сырой биомассы за время второго пассажа был выше в полтора раза, чем на среде Уг МБ с НУК. Замена 2,4-Д на НУК увеличило количество и размеры трахеид, но снизило величину митотического индекса (табл. 1).

Таблица 1 - Характеристика каллусных тканей ели сибирской и лиственницы сибирской в зависимости от используемого ауксина (2,4-Д 1 мг/л или НУК 1 мг/л) ____

Вид Ауксин Дифференцированные трахеальные элементы Интенсивность прироста биомассы Митоти-ческий индекс, %0

количество, шт/на поле длина, мкм ширина, мкм

Picea obovata 2,4-Д 4,5±2,4 35,1±1,0 25,7±1,5 11,7 2,2

НУК 10,2±1,9 42,3±1,0 41,3±1,2 6,6 0,2

Larix sibirica 2,4-Д 5,7±1,7 36,6±1,0 24,3±0,8 10,5 2,4

НУК 12,3±2,1 40,6±0,8 38,9±1,9 7,1 0,4

В дальнейшей работе с каллусными культурами эти два ауксина (2,4-Д и НУК) использовали совместно, в результате чего были получены каллусные линии, которые росли 18 и более пассажей. Изучение интенсивности прироста сырой биомассы семи каллусных линий на среде одного состава показало, что более высокие темпы прироста биомассы каллусов у трех исследуемых видов хвойных наблюдались за время четвертого пассажа (каллусы 1-1, 2-1, 3-1) либо пятого пассажа (каллусы 2-2, 3-2, 3-3). Затем скорости роста замедлялись и оставались постоянными в ходе следующих пассажей, при этом присущая им окраска сохранялась.

По-видимому, наблюдаемое замедление роста каллусов исследуемых видов следует отнести к специфическим особенностям в культуре in vitro клеток голосеменных и, в частности, хвойных.

Использование метода ТИНУФ показало, что клетки каллусных культур исследуемых видов хвойных имели агранальный тип организации хлоропластов, с низким уровнем развития ФС II. В отличие от каллусов у проростков и органогенных культур преобладала гранальная организация, характерная для хлоропластов растений в условиях in vivo, с высокой степенью развития ФС II.

Еще одним фактором, определявшим успешный рост и существование изолированных органов и тканей растений in vitro, являлось количество углеводов в среде. Оценка влияния количества углеводов в среде на прирост биомассы каллусных культур исследуемых видов хвойных, (исходные

каллусы росли на среде Уг MS с 2,4-Д 0,5 мг/л, НУК 0,5 мг/л, 6-БАП 1 мг/л и 3 % сахарозой) проведена на двух средах, отличающиеся концентрацией углевода 1% и 3%. Прирост биомассы на среде с 1% сахарозой был ниже в 1,5 и более раз, чем на 3% сахарозе.

Все каллусы изучаемых видов хвойных, полученные на средах с добавлениями ауксинов, оказались не способными образовать какие либо органоподобные структуры, то есть не имели регенерационного потенциала.

Глава 4. Адвентивное почкообразование у ели сибирской, лиственницы сибирской и сосны обыкновенной и гистологический контроль эксплантов видов хвойных на средах с цитокининами.

Адвентивное почкообразование. Изучение способности к направленному органогенезу проводилось на терминальных и латеральных почках ауксибластов деревьев лиственницы сибирской и ели сибирской в возрасте 25-30 лет на среде Уг MS с цитокининами. В качестве контроля служили экспланты посаженные на ту же среду, но без регуляторов роста (Vi MS-0).

Результаты экспериментов показали, что на способность к реализации органогенеза de novo у почек взрослых деревьев лиственницы сибирской и ели сибирской влияли сроки взятия почек и тип цитокинина. Максимальное количество образовавшихся адвентивных почек на эксплант зарегистрировано для почек, взятых с деревьев в мае, и составило в среднем 2,4 почки de novo для лиственницы и 2,7 - для ели. Наиболее эффективным оказался 6-БАП (2 мг/л), в то время как другой фитогормон - кинетин, не способствовал появлению органогенеза у данных эксплантов.

Эксперименты по получению адвентивного почкообразования были сделаны и с использованием в качестве эксплантов зиготических зародышей ели сибирской, лиственницы сибирской и сосны обыкновенной.

Результаты показали, что повышение уровня 6-БАП в среде с 1 мг/л в два раза увеличило индукцию адвентивных почек у трех исследуемых видов хвойных, а концентрация 3 мг/л, по видимому, была уже избыточной, поскольку количество адвентивных почек существенно не отличалось от предыдущей концентрации фитогормона. Однако способность к органогенезу была различна между исследуемыми видами. Наибольшей органогенной активностью отличались экспланты ели сибирской, продуцировавшие в среднем до 15 почек на эксплант, при концентрации 2 мг/л 6-БАП.

На количество образовавшихся адвентивных почек воздействовало не только количество 6-БАП в среде, но и продолжительность индукционного периода на среде с этим фитогормоном. Экспозиция на гормональной среде с добавлением 2 мг/л 6-БАП в течение недели не влияла (сосна и лиственница), или влияла очень слабо (ель) на индукцию морфогенеза у зиготических зародышей. Увеличение индукционного периода до 14 и 21 суток способствовало повышению образования почек de novo у всех трех видов и

достигло максимально зарегистрированных величин, когда продолжительность экспозиции на среде с цитокинином составила 28 суток.

Изучение влияния кинетина на органогенез у трех видов хвойных показало, что этот фитогормон был менее эффективным по сравнению с 6-БАП, при всех исследуемых концентрациях. Так, для зиготических зародышей ели сибирской максимальное количество адвентивных почек составило в среднем всего 5,2 при 2 мг/л кинетина, для сосны и лиственницы - 1,8 и 2,7 соответственно. Удлинение адвентивных почек в побеги достигнуто на среде Уг МБ-О (рис. 1).

■ : б в

Рис. 1. Развитие побегов на среде Уг MS-0 из адвентивных почек, полученных на зародышах хвойных под действием цитокинина QA MS + 2 мг/л 6-БАП): а - ель сибирская (80 суток), б - лиственница сибирская (180 суток), в - сосна обыкновенная (180 суток).

Гистологический анализ эксплантов ели сибирской (зрелых зиготических зародышей) растущих на среде с 6-БАП (0-35 сутки). Для

выяснения характера гистологических изменений у эксплантов под влиянием цитокинина были взяты зиготические зародыши ели сибирской, помещенные на среду Уг МБ с 2 мг/л 6-БАП, контроль - зародыши на среде Уг Мв-О. В контроле у зародышей на 3-21 сутки культивирования наблюдались единичные антиюшнарные клеточные деления в корневой меристеме, прокамбии и апикальной меристеме побега, а также увеличение размеров центрального цилиндра и первичной коры, за счет растяжения клеток, так как количество клеточных слоев оставалось постоянным (рис. 2).

Морфологическая трансформация эксплантов ели наблюдалась на среде Уг Мв+б-БАП, в отличии от контроля. Отмечено увеличение гипокотиля в диаметре. Анализ эксплантов ели сибирской, росших на среде '/й МБ+б-БАП, на разных сроках культивирования проведенный с использованием постоянных препаратов, показал существенные гистологические изменения.

Рис. 2. Гистологические изменения в первичной коре гипокотилей зародышей ели сибирской в культуре in vitro под воздействием 2 мг/л 6-БАП: а - количество клеточных слоев в коре, б - ширина клеток коры: 1- среда lA MS-0, 2- среда Vi MS+ 6-БАП (2 мг/л).

Отмечены периклинальные клеточные деления в слоях первичной коры гипокотиля на 3 сутки культивирования. Митотический индекс этой ткани составил 8 %о. Однако, структурно увеличение количества слоев в коре еще не было выражено.

На 5 сутки культивирования в результате продолжающихся активных периклинальных делений происходила пролиферация новых слоев в первичной коре. Митотический индекс увеличился до 25 %о. В этот период ядра клеток этой ткани нередко содержали по 2-6 и более ядрышек на срез ядра, что свидетельствует об интенсивных процессах белкового синтеза.

Количество слоев клеток в первичной коре возросло (до 20) на 7 сутки культивирования (Рис. 2 а). Эти клетки продолжали делиться и формировали группы мелких клеток (14,3±0,6 мкм), с плотной цитоплазмой. На 14 сутки культивирования количество слоев в первичной коре увеличилось до 40. На 21 сутки под эпидермальным слоем гипокотиля происходили интенсивные клеточные деления (митотический индекс - 46,3 %о), в результате чего формировались локализованные органогенные участки - меристемоиды, предшественники меристем.

Изучение закономерностей формирования адвентивных почек у эксплантов ели сибирской под воздействием 6-БАП показало, что меристемоиды вначале своего развития еще не выступали над поверхностью экспланта (рис. 3 а). В результате продолжающих клеточных делений они начинали выдаваться над поверхностью эксплантов (рис. 3 б). Клетки этих участков приближались по размерам к клеткам апикальной меристемы побега (14-18,5 мкм), и характеризовались крупным ядром, расположенным в центре и ограниченной вакуолизацией.

Рис 3. Этапы развития адвентивных почек у эксплантов ели сибирской под воздействием 6-БАП: а - появление меристемоида (х40), б, - меристемоид начинает выступать в виде бугорка (х40), в - формирование меристемы адвентивного побега (х20), г - появление первых примордиев хвоинок (х20), д -развитие хвоинок (х20), е - рост почки (х20).

На 28 сутки культивирования характер гистологических изменений сохранялся. Прослеживался постепенный переход от меристемоидов к апексам адвентивных почек. Меристемоиды росли в высоту и проходили

через стадию латерального расширения, они становились разделенными на отдельные области и появилась хорошо выраженная, характерная для хвойных зональность апикального купола. Таким образом, произошла дифференциация меристемы адвентивной почки (рис. 3 в). В этот срок в боковых частях некоторых апексов отмечено появление первых примордиев хвоинок (рис. 3 г). Формирование листового примордия началось с выбора группы клеток в периферийной зоне меристемы, сопровождаемого инициированием локального роста.

На 35 сутки наблюдалось развитие примордиев в хвоинки и образование следующих примордиев (рис. 3 д, е). В этот период в адвентивных почках ели сибирской уже отмечен прокамбий, меристематическая ткань, состоящая из удлиненных, цитоплазматически плотных клеток с характерным расположением (см. рис. 3 д, е).

Молекулярные сигналы, вызывающие формирование прокамбия не известны. Анализ маркерных генов в некоторых видах растений показал, что судьба клетки в растении определена, прежде всего, местоположением, и в меньшей степени происхождением клетки (Carland et al., 1999).

Самые базальные клетки прокамбия почек ели de novo начинали дифференцироваться в элементы ксилемы. Это раннее дифференцирование трахеальных элементов могло быть важным для успешного функционирования меристемы почки. Например, дифференцирование трахеальных центров являлось необходимым для формирования in vitro цветочных почек de novo на эксплантах Nicotiana tabacum (Wilms, Sassen, 1987).

Дифференцирование трахеид в эксплантах исследуемых видов хвойных на ранних сроках культуры in vitro. На 5 сутки культивирования на среде с 6-БАП у эксплантов ели сибирской отмечены группы коротких трахеид под апикальной меристемой побега в месте отхождения прокамбия семядолей и тяжи длинных трахеид в центральном цилиндре гипокотиля. В последнем случае каждый тяж состоит из двух рядов трахеид. Все трахеальные элементы имели сетчатые либо спиральные утолщения клеточных стенок.

Дифференцировка трахеид из прокамбия семядолей произошла на 7 сутки. В центральном цилиндре количество прозенхимных трахеид в тяжах увеличилось до 4 - 5. На 14 сутки в гипокотиле отмечены трахеиды с окаймленными порами. Таким образом, начиная с 5 суток культуры in vitro начала формироваться первичная проводящая система эксплантов.

Такие же закономерности в развитии ксилемы зафиксированы и у зародышей ели на среде Vi MS-0. Сходная зависимость прослежена и у зиготических зародышей лиственницы сибирской и сосны обыкновенной на среде с 6-БАП и в отсутствии фитогормона. Однако, у последнего вида процесс дифференцировки трахеид шел более интенсивно в семядолях, чем в гипокотиле. На 5 сутки in vitro у эксплантов сосны обнаружены элементы протоксилемы в семядолях и в месте отхождения прокамбия семядолей. На 7

сутки в гипокотиле дифференцировались трахеиды со спиральными утолщениями, а также трахеиды с окаймленными порами.

Гистологический анализ эксплантов ели сибирской культивируемых 60 суток в культуре in vitro. На поперечных срезах эксплантов ели сибирской (60 суток) среди паренхимных клеток обнаружены слои камбия в количестве 5-6. Просмотр серии срезов показал, что этот камбий никак не связан с первичной ксилемой. Расстояние, на котором расположен камбий от поверхности эксплантов в среднем составляет 210,3 ± 10,9 мкм. Протяженность камбия у эксплантов различна - от 426 мкм до 1560 мкм. Внутренние слои камбия дифференцировались в трахеиды с окаймленными порами, образуя, по-видимому, вторичную ксилему. Эти поры расположены в 2-3 ряда на тангетальных стенках, на радиальных стенках трахеид поры отсутствовали. Образования флоэмных элементов не отмечено.

Стимулом к появлению камбия, по-видимому, являлись развивающиеся адвентивные почки. Если адвентивные почки были расположены близко, то образовывался непрерывный тяж, поскольку камбий соединялся с прокамбием почки.

Таким образом, в условиях культуры тканей in vitro у ели сибирской наблюдалась дифференциация специализированной меристематической ткани - камбия. Такой характер анатомических изменений обнаружен только у ели.

У ряда эксплантов ели сохранился зародышевый корешок. На поперечном срезе он имел хорошо выраженную первичную кору и центральный цилиндр. Первичная кора состояла из экзодермы, с утолщенными клеточными стенками, мезодермы и эндодермы. В тоже время центральный цилиндр не был дифференцирован, проводящие элементы в нем не были развиты. Следовательно, зародышевый корешок у эксплантов ели сибирской в культуре in vitro, на среде с 6-БАП не получил своего дальнейшего развития, через растяжение и дифференцировку. Изменения затронули только первичную кору.

Гистологический анализ адвентивного почкообразования у эксплантов лиственницы сибирской и сосны обыкновенной. Образование адвентивных почек у сосны обыкновенной и лиственницы сибирской происходило на семядолях зиготических зародышей, у сосны на кончике семядолей, а у лиственницы в основании семядолей. Гистологический анализ проведенный на ранних сроках культивирования in vitro показал, что у лиственницы и сосны, уже на 5 сутки культуры на среде с 6-БАП митозы интенсивно шли только в семядолях.

Митотический индекс ткани будущего мезофилла семядолей составил 5 %о. Выявлено, что в первичной коре гипокотиля у эксплантов сосны и лиственницы митозы практически отсутствовали. Клеточные деления у сосны наблюдались только в субэпидермальных слоях кончиков семядолей (рис. 4 а). На 10-14 сутки кончики семядолей сосны обыкновенной увеличивались, за счет интенсивного образования новых клеток (рис. 4 б, в).

Развитие меристемоидов отмечено на 21 сутки культивирования в присутствии цитокинина (рис. 4 г).

Рис. 4. Анатомические изменения семядолей сосны обыкновенной в процессе культивирования на среде с 6-БАП: а - митозы (М) в кончике семядоли на 5 сутки (х20), б - разрастание кончика хвоинки сосны на 10 сутки (х10), в -кончик хвоинки сосны на 14 сутки (х10), г -образование меристемоидов на кончике хвоинки сосны на 21 сутки (х10).

Проведено изучение строения хвоинок и стебля адвентивных растений и сравнение их с данными литературы и собственными наблюдениями. Показана общность структуры изученных органов хвойных растений в условиях in vitro и in vivo.

Глава 5. Адвентивное почкообразование у эксплантов видов хвойных с использованием импульсной обработки цитокинином

Морфогенетический ответ у культивируемых in vitro тканей хвойных зависит от ряда факторов: вида, содержания питательных веществ, регуляторов роста и концентрация агара в среде (David et al., 1982; Bornman, 1983; Debergh, 1983). Эти факторы оказывают влияние на индукцию и развитие адвентивных почек у эксплантов. Одним из перспективных направлений в индукции адвентивных почек у хвойных является импульсная обработка (ИО) эксплантов цитокининами (Bornman, Vogelmann, 1984).

Проведена серия экспериментов для оценки возможности применения ИО в растворе 6-БАП (28 мг/л и 56 мг/л) разной продолжительности для получения адвентивных почек in vitro у сосны обыкновенной, лиственницы сибирской и ели сибирской с использованием двух типов эксплантов.

Экспланты - зрелые зиготические зародыши хвойных. Зрелые зиготические зародыши сосны обыкновенной были подвергнуты ИО в растворе 6-БАП с концентрацией 28 мг/л в течение 2, 4 и 6 ч. Затем помещены на среду Уг MS-0 вертикально или горизонтально по отношению к поверхности среды.

Исследование показало, что ориентация эксплантов относительно поверхности среды оказала влияние на размеры гипокотиля и семядольных хвоинок (табл. 2), которые одновременно зависели и от продолжительности ИО (при 28 мг/л 6-БАП). Отмечено, что уже на 7-е сутки культуры in vitro у горизонтально ориентированных эксплантов верхняя часть гипокотиля поднялась над поверхностью среды, в результате чего площадь контакта со средой уменьшилась. У вертикально ориентированных эксплантов площадь соприкосновения со средой в течении первой субкультуры (28 суток) не изменялась, а удлинение гипокотиля блокировалось. Во всех вариантах опыта на 28 сутки культуры размеры гипокотиля и длина семядольных хвоинок у горизонтальных эксплантов оказались больше (Р< 0,05) чем у вертикальных и уменьшались с увеличением времени экспозиции.

Таблица 2 - Параметры развития зиготических зародышей сосны обыкновенной и количество адвентивных почек в зависимости от ориентации на среде Уг MS-0 (28 суток) после импульсной обработки раствором 28 мг/л

Время Положение Длина Ширина Длина Количество

ПО, ч эксплантов гипокотиля, гипокотиля, семядольных адвентивных

на среде мм мм хвоинок, мм почек на эксплант, шт

2 В 2,8 ±0,1 2,0 ± 0,1 1,7 ±0,1 1,9 ±0,5

2 Г 6,3 ± 0,3 2,4 ±0,1 3,6 ±0,1 1,9 ±0,6

4 В 3,1 ±0,2 2,1 ±0,1 1,6 ± 0,1е 2,9 ±0,5

4 г 5,6 ±0,2 2,6 ±0,1 3,1 ±0,2 3,1 ± 0,5

6 в 2,7 ±0,3 1,9 ±0,1 1,4 ± 0,1е 3,8 ± 0,4

6 г 4,5 ±0,2 2,5 ±0,1 2,7 ± 0,1 4,3 ± 0,4

Примечание. В - вертикально ориентированные и Г - горизонтально ориентированные экспланты.

Обнаружено, что только длительность индукционного периода в растворе 6-БАП (28 мг/л) влияла на количество сформировавшихся почек de novo на одном зиготическом зародыше. При одной и той же продолжительность ИО и горизонтальные и вертикальные экспланты производили одинаковое число адвентивных почек (см. табл. 2). Увеличение времени ИО с 2 до 4 и 6 ч приводило к росту числа почек de novo у сосны

обыкновенной. Однако этот показатель все еще оставался достаточно низким, в среднем 3-4 почки на эксплант.

Для повышения количества адвентивных почек в следующих экспериментах была увеличена концентрация раствора 6-БАП для ИО в два раза (56 мг/л). Воздействие данной концентрации на зиготические зародыши сосны обыкновенной разной длительности (2-6 часов) привело к появлению витрифицированных эксплантов, тогда как при ранее используемой концентрации 6-БАП (28 мг/л) такие экспланты отсутствовали.

Результаты экспериментов показали, что при концентрации агара 6 г/л экспозиция при ИО зиготических зародышей сосны обыкновенной с 6-БАП сильно влияла на интенсивность витрификации (рис. 5). Так при выдерживании в растворе 6-БАП в течение 2 ч количество витрифицированных эксплантов составило 32-30%, тогда как при 6 часовой обработке этот показатель увеличился до 62-82%, в зависимости от положения экспланта на среде. Повышение содержания агара с 6 г/л до 8 г/л позволило резко снизить витрификацию до 10% у вертикальных эксплантов и до 25% у горизонтальных (2 ч и 4 ч).

Таким образом, в ходе дальнейших исследований для преодоления витрификации у исследуемых видов хвойных была использована среда 1А МБ-О с добавлением 8 г/л агара. При этом зиготические зародыши помещались вертикально.

а б

Рис. 5. Влияние длительности импульсной обработки в растворе 56 мг/л БАП, концентрации агара (6 г/л и 8 г/л) и ориентации эксплантов на интенсивность витрификации у эксплантов сосны обыкновенной на 21 сутки в культуре in vitro: а - вертикально ориентированные, б - горизонтально ориентированные экспланты.

Результаты опытов со зрелыми зиготическими зародышами сосны обыкновенной показали, что продолжительность ИО в растворе 56 мг/л 6-БАП влияла на реакцию эксплантов в ответ на органогенный стимул. Если

при 3 ч продолжительности ИО количество почек на эксплант в среднем составило 4,8 то при 4, 5 и 6 ч -10,4, 17 и 20 соответственно (рис. 6 а).

а б

Рис. 6. Среднее количество адвентивных почек на эксплант (зиготические зародыши) у сосны обыкновенной (а) и лиственницы сибирской (б) в зависимости от продолжительности импульсной обработки в растворе 56 мг/л 6-БАП: Д - семена лиственницы собранные в Дендрарии Института леса, Б -семена из Богучанского лесхоза.

Закономерности образования и развития адвентивных почек на зародышах сосны обыкновенной были одинаковыми при ИО двумя разными концентрациями 6-БАП (28 и 56 мг/л). К 10 суткам после ИО на кончиках семядолей отмечено образование адвентивных структур - катафиллов ( от двух до пяти). На 10 сутки между ними формировался апекс адвентивной почки. В дальнейшем катафиллы не увеличивались, а на апексах развивались хвоинки адвентивных почек. Развитие почек de novo в побеги получено в ходе последовательных пересадок на ту же среду (Уг MS-0). При этом, в первую очередь происходило образование и рост хвоинок, при этом каждые последующие хвоинки были длиннее предыдущих. Таким образом, происходило развитие побегов-ауксибластов. На этот период (45 суток) зарегистрировано спонтанное укоренение у 10 % эксплантов.

Образовавшиеся адвентивные побеги регулярно пересаживали (через 28-30 суток) на свежую среду. Скорость роста отделенных адвентивных побегов зависела от количества образованных хвоинок. Наличие 10 хвоинок и более способствовало более интенсивному росту побегов. Возможно, что это связано не только с количеством производимых фотоассимилятов, но и с размерами апикальной меристемы побега. Так показано, что у проростков хвойных размер апикальной меристемы с возрастом увеличивался и достигал максимального размера на 140 день после прорастания (Gregory, Romberger, 1972).

В ходе проведенных экспериментов выяснено, что реакция зиготических зародышей лиственницы сибирской на воздействие ИО с 6-БАП отличалась от зародышей сосны. Зоны органогенеза у лиственницы были приурочены к базальным частям семядольных хвоинок зародышей. Уже на 14 сутки на них и между семядолями появились адвентивные хвоинки, а позднее между последними и апексы почек de novo. Максимальное количество адвентивных почек на эксплант получено при продолжительности ИО при 56 мг/л 6-БАП - 6 ч, и составило в среднем около 13 шт. (рис. 6 б).

Влияние продолжительности ИО в растворе 6-БАП на образование адвентивных почек на зародышах ели сибирской представлено на рисунке 7 а. Максимальное количество почек de novo, в отличии от эксплантов сосны и лиственницы, зарегистрировано при 4 ч периоде индукции (в среднем более 25 почек на эксплант). Адвентивные почки на эксплантах ели под действием раствора фитогормона образовывались по всей поверхности гипокотиля, приводя к его разрастанию (рис. 7 б). Однако, чаще всего, первыми появлялись адвентивные почки в верхней части гипокотиля, затем органогенез продолжался в базипетальном направлении. На 28 сутки, формирующиеся почки de novo находились на разных стадиях развития. У образовавшихся первыми адвентивных почек происходило распускание хвоинок и начиналось удлинение побега. В отличии от сосны обыкновенной и лиственницы сибирской для эксплантов ели сибирской не обнаружено формирование каких либо промежуточных структур (катафиллов или адвентивных хвоинок) предшествующих дифференцировке адвентивных почек.

Рис. 7. Среднее количество адвентивных почек на эксплант, образовавшихся на зиготических зародышах ели сибирской на 28 сутки после импульсной обработки (56 мг/л 6-БАП), в зависимости от ее продолжительности (а); внешний вид экспланта с почками de novo на 28 сутки in vitro (б).

Экспланты - семядоли проростков семян хвойных. Семядоли, взятые от проростков ели сибирской, сосны обыкновенной и лиственницы сибирской, показали органогенную способность при воздействии ИО в растворе 6-БАП (56 мг/л). При этом семядольные экспланты ели сибирской значительно различались по их отклику на ИО цитокинином в зависимости от возраста проростков. В то время как, семядоли от полностью проросших семян (14 суток) не показали ни какого органогенного отклика, семядоли от частично проросших семян были отзывчивыми на органогенный стимул.

Результаты экспериментов показали, что образование адвентивных почек на семядольных хвоинках у трех исследуемых видов происходило более интенсивно в апикальной части семядолей, чем серединной части эксплантов. Базальная часть не обладала регенерационным потенциалом.

Максимальное число сформированных почек de novo на эксплант отмечено для ели сибирской при 3 ч ИО (рис. 8), как для апикальной части семядолей (для одной хвоинки - в среднем 8 адвентивных почки), так и для их серединной части (в среднем - 3). Наибольшее количество образовавшихся почек de novo из апикальной части семядолей сосны обыкновенной и лиственницы сибирской зарегистрировано при 5 ч ИО и составило в среднем 9,5 и 8,7 штук на эксплант соответственно (см. рис. 8). В ходе последующих пересадок продолжался рост адвентивных побегов.

а б

Рис. 8. Количество адвентивных почек на эксплант (семядольную хвоинку) у ели сибирской, сосны обыкновенной и лиственницы сибирской в зависимости от продолжительности импульсной обработки в растворе 56 мг/л 6-БАП: а -апикальная часть семядоли, б - серединная часть семядоли.

Таким образом, при использовании ИО 6-БАП у зрелых зиготических зародышей интенсивность органогенеза достигала у сосны - 20, ели - 27 и лиственницы - 13 адвентивных почек на эксплант. Для семядольных хвоинок

этот показатель составил соответственно - 15, 11 и 12 адвентивных почек на эксплант.

Выводы

1. Для каллусогенеза у ели сибирской, сосны обыкновенной и лиственницы сибирской можно рекомендовать в качестве эксплантов проростки и зрелые зиготические зародыши. Максимальный прирост биомассы каллусов отмечен на среде Уг MS с добавлением 2,4-Д (2 мг/л) и 6-БАП (1 мг/л). Для получения долгоживущих каллусных линий необходимо совместное присутствие в среде ауксинов (2,4-Д и НУК) и цитокинина (6-БАП). В ходе длительного культивирования каллусных линий хвойных прирост биомассы уменьшался. Клетки каллусных культур имели агранальный тип организации хлоропластов, с низким уровнем развития ФС II.

2. Адвентивные почки получены у ели сибирской, сосны обыкновенной и лиственницы сибирской на среде Уг MS с цитокининами. Почки взрослых деревьев имели слабый органогенный потенциал. Максимальное количество образовавшихся адвентивных почек зарегистрировано для почек, взятых с деревьев в мае, и составляет в среднем 2,4 для лиственницы и 2,7 для ели. Наибольшее число почек de novo образовалось на зрелых зиготических зародышах после индукции на среде с 6-БАП в течение четырех недель. У ели сибирской сформировалось в среднем 15 адвентивных почек на эксплант, у лиственницы сибирской и сосны обыкновенной - 4.

3. Локализация клеток, реагирующих на цитокинин, у зрелых зиготических зародышей хвойных является видоспецифичным. У ели сибирской органогенные клетки находились во внешнем слое первичной коры гипокотиля, у сосны обыкновенной - в основной ткани кончика семядолей, у лиственницы сибирской - в основной ткани основания семядолей.

4. Применение импульсной обработки эксплантов раствором 6-БАП (56 мг/л) увеличило количество адвентивных почек de novo. При использовании в качестве эксплантов зрелых зиготических зародышей Интенсивность органогенеза у зрелых зиготических зародышей достигала у сосны обыкновенной - в среднем 20, ели сибирской - 27 и лиственницы сибирской - 13 адвентивных почек на эксплант, у семядольных хвоинок этот показатель составил соответственно - 15, 11 и 12 адвентивных почки на эксплант.

5. Закономерности формирования и развития адвентивных почек в культуре in vitro на зиготических зародышах ели сибирской и сосны обыкновенной, укладываются в схему развития апикальных меристем.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. *Филиппова И.П. Витрификация у эксплантов сосны обыкновенной {Pinus sylvestris L.) в культуре in vitro // Вестник КрасГАУ. 2009. № 8. С. 85-88.

2. *Филиппова И.П. Каллусные культуры сибирских видов хвойных // Вестник КрасГАУ. 2010. № 9. С. 54-59.

3. *Филиппова И.П. Адвентивное почкообразование у сибирских видов хвойных на средах с цитокининами // Вестник КрасГАУ. 2010. № 12. С. 69-74.

4. Филиппова И.П. Применение методов культуры тканей in vitro в размножении хвойных Сибири // Флора и растительность Сибири и Дальнего Востока. Тез. докл. II Российской конф. Красноярск, 1996. С. 359-360.

5. Филиппова И.П. Использование методов культуры ткани в размножении ели сибирской и лиственницы сибирской // Генетика и селекция - на службе лесу. Тез. докл. международной науч.-практ. конф. (2829 июня 1996 г.). Воронеж, 1996. С. 24-25.

6. Philippova I.P. The employment of culture tissue methods in vitro reproduction of Picea obovata and Larix sibirica 11 Genetics and breeding in forest service. Abst. of Intern. Scient. Practic. Confer. Voronezh, 1996. P.114-115.

7. Филиппова И.П. Методы культуры тканей в размножении сосны обыкновенной // Генетика и селекция на службе лесу. Матер, международной, науч.-практ. конф. Воронеж, 1997. С. 76-77.

8. Филиппова И.П. Использование методов культуры тканей в размножении хвойных Сибири // Тез. докл. конфр. молодых ученых КНЦ СО РАН. Красноярск, 1997. С. 108-109.

9. Tretyakova I.N., Philippova I.P. The peculiarity of morfogénesis of Picea obovata zygotic embryos in cultures in vitro II Биология клеток растений in vitro, биотехнология и сохранение генофонда. Тез. докл. VII международной конф. (25-28 ноября 1997 г.). Москва. 1997. С. 173-174.

10. Филиппова И.П., Третьякова И.Н. Гистологический анализ процессов раннего онтогенеза адвентивных почек в культуре in vitro у Picea obovata II Труды международной конф. по анатомии и морфологии растений (2-6 июня 1997 г.). С- Петербург, 1997. С 209-210.

11. Филиппова И.П. Роль цитокининов в морфогенезе зиготических зародышей у Picea obovata (Pinaceae) в культуру in vitro II Проблемы ботаники на рубеже XX-XXI веков. Тез. докл. II (X) съезда Русского ботанического общества (26-29 мая 1998 г.). С- Петербург, 1998. С. 85.

12. Philippova I.P., Tretyakova I.N. The pecularity of conifer embryo roots in culture in vitro II The supporting roots structure and function 20-24 July 1998. France, Bordeaux, 1998. P 89.

13. Филиппова И.П., Третьякова И.Н. Цитологический контроль адвентивного почкообразования у зародышей семян ели сибирской в культуре in vitro И Реконструкция гомеостаза. Матер. IX международного симпозиума Красноярск, 16-20 марта 1998 г. Красноярск, 1998. С. 200-204.

14. Philippova I.P., Murzina A.N. Reproduction of Larix sibirica in vitro // Larix-98: World Resources for Breeding Resistance and Utilization. IUFRO Interdivisional Symposium. Красноярск, 1-5.09.1998. Красноярск, 1998. C.76-77.

15. Филиппова И.П., Мурзина А.Н., Третьякова И.Н. Особенности размножения хвойных в культуре in vitro II Леса и лесообразовательный процесс на Дальнем Востоке. Матер, международной конф. Владивосток, 2325 августа 1999 г. Владивосток, 1999. С. 218-219.

16. Филиппова И.П. Особенности появления и развития проводящих тканей у эксплантов ели сибирской при адвентивном почкообразовании в культуре in vitro // Гомеостаз лесных экосистем. Матер. X международного симпозиума "Концепция гомеостаза: теоретические, экспериментальные и прикладные аспекты". Красноярск, 13-19 декабря 2001. Новосибирск: Наука. 2002. С.158-161.

17. Третьякова И.Н., Филиппова И.П., Новоселова Н.В. Особенности биотехнологии сибирских видов хвойных // Матер, международной науч. конф. "Биологические ресурсы и устойчивое развитие", Пущино, 29 октября-2 ноября 2001 г. Москва: НИА-Природа. 2001. С.222-223.

18. Третьякова И.Н., Новоселова Н.В., Филиппова И.П., Мурзина А. Н. Биотехнология сибирских видов хвойных. // Матер, международного симпозиума «Молекулярные механизмы генетических процессов и биотехнология». Москва 18-21 ноября 2001 г. Москва. 2001. С. 421-422.

19. Филиппова И.П., Гаевский Н.А. Влияние гормонов на фотосинтетический аппарат хвойных в культуре in vitro IIVI международной конф. «Регуляторы роста и развития растений в биотехнологиях». Москва.

2001. С. 171.

20. Tretyakova I., Novoselova N., Philippova I., Murzina A. Biotechnology of Siberian Coniferous Species // International symposium «Molecular mechanisms of genetic processes and biotechnology». Moscow 18-21 november 2001. Moscow. 2001. P. 374-375.

21. Филиппова И.П. Образование вторичного камбия у Picea obovata в культуре in vitro / Труды II международной конф. по анатомии и морфологии растений. С-Петербург, 14-18 октября 2002 г. С-Петербург,

2002. С. 247.

* - Статьи в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Подписано в печать Формат 60x84/16. Уч.-изд. л. 1,3 Тираж 100 экз. Заказ № 2524

Отпечатано полиграфическим центром БИК СФУ 660041, г. Красноярск, пр. Свободный, 82а

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Филиппова, Ирина Панфиловна

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. Обзор литературы.

1.1. Компоненты питательных сред.

1.2. Каллуспые культуры.

1.3.Адвентивное почкообразование у хвойных в культуре in vitro.

ГЛАВА 2. Объекты и методы исследования.

ГЛАВА 3. Каллусные культуры ели сибирской, сосны обыкновенной и лиственницы сибирской.

ГЛАВА 4. Адвентивное почкообразование у ели сибирской, лиственницы сибирской и сосны обыкновенной и гистологический контроль эксплантов видов хвойных на средах с цитокининами.

4.1. Адвентивное почкообразование.

4.1.1. Экспланты - почки деревьев.

4.1.2. Экспланты - зрелые зиготические зародыши.

4.2. Гистологический анализ эксплантов (зрелых зиготических зародышей) растущих на среде с 6-БАП.

4.2.1. Гистологический анализ эксплантов ели сибирской (0-35 суток in vitro) культивируемых на средах '/2 MS-0 и Vi MS+6-БАП.

4.2.2. Дифференцирование трахеид в эксплантах исследуемых видов хвойных на ранних сроках культуры in vitro.

4.2.3. Гистологический анализ эксплантов ели сибирской культивируемых 60 суток в культуре in vitro.

4.2.4. Гистологический анализ адвентивного почкообразования у эксплантов лиственницы сибирской и сосны обыкновенной.

4.2.5. Гистологический анализ адвентивных растений.

ГЛАВА 5. Адвентивное почкообразование у эксплантов видов хвойных с использованием импульсной обработки цитокинином.

5.1. Экспланты - зрелые зиготические зародыши хвойных.

5.2. Экспланты - семядоли проростков семян хвойных.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Адвентивное почкообразование и каллусогенез у сибирских видов хвойных в культуре in vitro"

Термин "культура тканей растений" охватывает многие типы стерильно выращиваемых культур. Это каллусные культуры, культуры изолированных меристем, зародышей, пыльников, корней, суспензионные культуры клеток и тканей. Методы in vitro позволяют создавать в строго контролируемых условиях модельные системы, что облегчает возможность слежения за изменениями строения и физиологии растительных объектов. В культуре изолированных тканей и клеток отчетливо появляется свойство тотипотентности растительной клетки, в основе которого лежит реализация различной наследственной информации в конкретных условиях, складывающихся в клетке под влиянием внешних и внутренних факторов (Бутенко, 1964).

Методы культуры растений in vitro находят все большее применение в фундаментальных и прикладных исследованиях в области физиологии, генетики, эмбриологии растений и целом в биологии развития растений. Достижения в области культуры клеток и тканей привели к созданию принципиально новых методов вегетативного размножения, таких как микрочеренкование, адвентивное почкообразование и соматический эмбриогенез (Биотехнология растений, 1989). Использование этих методов, разработанных на покрытосеменных растениях, представляет значительный интерес для микроклонального размножения хвойных видов.

Культура тканей хвойных in vitro может играть важную роль в генетико-селекционных программах лесовосстановления древесных видов, так как репродуктивный потенциал этих видов снижается (Третьякова, Бажина, 1996). Однако, в исследованиях, которые проводятся с культурами in vitro органов, тканей и клеток растений одной из наиболее актуальных проблем является индукция морфогенеза. Особенно остро эта проблема стоит перед исследователями, работающими с древесными в том числе и хвойными растениями, поскольку известно, что морфогенетические процессы в условиях in vitro индуцируются у них с большим трудом, характеризуются 3 нестабильностью и трудной воспроизводимостью (Савельев и др., 2008). В то же время открытие у хвойных соматического эмбриогенеза (Hakman et al., 1985; Chalupa, 1985) и адвентивного почкообразования (Хмара, Катаева, 1993; Arnold, 1982; Lapp et al., 1995; Gonzales et al., 1998; Renau-Morata et al., 2005 и др.) в культуре in vitro свидетельствует о множественности реализации морфогенетических программ у данного класса растений в контролируемых условиях и способности хвойных видов к массовому размножению через методы культуры тканей.

Цель исследования: изучение закономерностей адвентивного почкообразования и каллусогенеза у ели сибирской {Picea obovata Ledeb.), лиственницы сибирской (Larix sibirica Ledeb.) и сосны обыкновенной (Pinus sylvestris L.) в культуре in vitro.

В задачи исследований входило:

-выбор эксплантов и подбор оптимальных условий культуры in vitro для каллусогенеза;

-установление оптимальных концентраций цитокининов в питательной среде для адвентивного почкообразования;

-проведение гистологического контроля на разных сроках культуры in vitro у эксплантов в условиях направленного органогенеза;

-оценка эффективности индуцирующего действия «импульсной» обработки эксплантов высокими концентрациями цитокинина (6-БАП) на образование адвентивных почек.

Научная новизна. Выявлены общие закономерности и специфические особенности культивирования эксплантов сибирских видов хвойных in vitro. Впервые проведен гистологический анализ образования адвентивных почек у зародышей ели сибирской, сосны обыкновенной и лиственницы сибирской. Впервые к эксплантам сибирских видов хвойных (зрелым зиготическим зародышам и семядольным хвоинкам проростков) была применена методика импульсной обработки высокими концентрациями цитокинина, в результате чего происходило активное адвентивное почкообразование в условиях культуры in vitro.

Положения, выносимые на защиту:

1. Цитокинины стимулируют образование адвентивных почек у хвойных в культуре in vitro.

2. Формирование адвентивных почек идет по типу развития апикальных меристем.

Заключение Диссертация по теме "Физиология и биохимия растений", Филиппова, Ирина Панфиловна

выводы

1. Для каллусогенеза у ели сибирской, сосны обыкновенной и лиственницы сибирской можно рекомендовать в качестве эксплантов проростки и зрелые зиготические зародыши. Максимальный прирост биомассы каллусов отмечен на среде 14 MS с добавлением 2,4—Д (2 мг/л) и 6-БАП (1 мг/л). Для получения долгоживущих каллусных линий необходимо совместное присутствие в среде ауксинов (2,4-Д и НУК) и цитокинина (6-БАП). В ходе длительного культивирования каллусных линий хвойных прирост биомассы уменьшался. Клетки каллусных культур имели агранальный тип организации хлоропластов, с низким уровнем развития ФС II.

2. Адвентивные почки получены у ели сибирской, сосны обыкновенной и лиственницы сибирской на среде 14 MS с цитокининами. Почки взрослых деревьев имели слабый органогенный потенциал. Максимальное количество образовавшихся адвентивных почек зарегистрировано для почек взятых с деревьев в мае, и составляет в среднем 2,4 для лиственницы и 2,7 для ели. Наибольшее число почек de novo образовалось на зрелых зиготических зародышах после индукции на среде с 6-БАП в течение четырех недель. У ели сибирской сформировалось в среднем 15 адвентивных почек на эксплант, у лиственницы сибирской и сосны обыкновенной - 4.

119

Интенсивность органогенеза у зрелых зиготических зародышей достигала у сосны обыкновенной — в среднем 20, ели сибирской - 27 и лиственницы сибирской - 13 адвентивных почек на эксплант, у семядольных хвоинок этот показатель составил соответственно - 15, 11 и 12 адвентивных почки на эксплант.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Филиппова, Ирина Панфиловна, Красноярск

1. Аветисова J1. М., Марьяхина И. Я. Ультраструктура клеток каллуса капусты на средах с различными регуляторами роста // Физиология растений. 1987. Т. 34, № 5. С.1012-1024.

2. Антипова О. В., Швалева A. JI. Подготовка к прорастанию зародышей пшеницы в связи с поступлением воды // ДАН. 1999.

3. Ахметов Р. Р., Гилязетдинов Ш. Я., Вахитов В. А. Фитогормоны и активность хроматина / Регуляторы роста и развития растений. Тез. док. I Всесоюзной конфер. Москва, 1981. С. 17.

4. Биотехнология растений: культура клеток / Пер. с англ. В. И. Негрука; с предисл. Р. Г. Бутенко. М.: Агропромиздат, 1989. 280 с.

5. Бутенко Р. Г. Биология клеток высших растений in vitro и биотехнология на их основе. М.: ФБК-ПРЕСС, 1999. 160 с.

6. Бутенко Р. Г. Культура тканей и физиология морфогенеза растений. М.: Наука, 1964. 272 с.

7. Валиева А. И., Румянцева II. И., Лозовая В. В. Динамика полисахаридного состава клеточных стенок каллусов татарской гречихи с различным морфогенным потенциалом в процессе роста и морфогенеза // Цитология. 1999. Т. 41, № 7. С. 598-604.

8. Василевска Л. Д., Вельгат Б., Янковски Я. М., Бральчик Е. Регуляция обмена растительных нуклеиновых кислот гиббереллином ГА3 / Регуляторы роста и развития растений. Тез. док. I Всесоюзной конфер. Москва, 1981. С. 13.

9. Веселов С. Ю., Вальке 3. С., Ван Онкелен X., Кудоярова Г. Р. Содержание и локализация цитокининов в листьях исходных и трансгенных растений табака // Физиология растений. 1999. Т. 46, № 1. С. 34^40.

10. Власюк П. А., Жидков В. А., Ивченко В. И., Климовицкая 3. М., Охримепко М. Ф., Рудакова Э. В., Сидоршина Т. Н. Участие микроэлементовв обмене веществ растений / В кн.: Биологическая роль микроэлементов. М.: Наука, 1983. С. 97-104.

11. Вонсавичене В. Н., Новицкене Л. Л., Марчюкайтис А. С. Взаимодействие ИУК с медью и марганцем в процессе роста картофеля / В кн.: Регуляция роста и питания растений. Вильнюс.: Мокслас, 1980. С. 49—53.

12. Гаевский Н. А., Ладыгин В. Г., Гольд В. М. Новые данные о природе высокотемпературного подъема флуоресценции хлорофилла // Физиология растений. 1989. Т. 36, № 2. С. 274-277.

13. Гаевский Н. А., Сорокина Г. А., Гольд В. М., Ладыгин В. Г., Гехман А. В. Изучение природы термоиндуцированпых изменений флуоресценции хлорофилла с использованием мутантов СЫатуйотопаъ геткагсШ И Физиология растений. 1985. Т. 32, № 4. С. 674-680.

14. Гаевский Н. А., Сорокина Г. А. Гольд В. М., Миролюбская И. В. Сезонные изменения фотосинтетического аппарата древесных и кустарниковых растений // Физиология растений. 1991. Т. 38, № 4. С. 685692.

15. Галеева Е. И., Максютова Н. И., Тарчевский И. А., Зумянцева Н. И. Полипептидный состав каллусов гречихи татарской Fagopyrum (Шапсит (Ь.) с различным морфогенным потенциалом // ДАН. 2001. Т. 377. С. 116-118.

16. Гамбург К. 3., Рекославская Н. И., Швецов С. Г. Ауксины в культурах тканей и клеток растений. Новосибирск: Наука, 1990. 243 с.

17. Гольд В. М., Гаевский Н. А., Григорьев Ю. С., Гехман А. В., Попельницкий В. А. Теоретические основы и методы изучения флуоресценции хлорофилла. Красноярск: Изд-во КГУ. 1984. 84 с.

18. Гродзинский А. М., Гродзинский Д. М. Краткий справочник по физиологии растений. Киев: Наукова думка. 1973. 591 с.

19. Гудвин Т., Мерсер Э. Введение в биохимию растений. Т. 2. М.: Мир, 1986. 312 с.

20. Гуревич А. С., Якушина Н. И. Цитокинины как один из факторов влияния меди на фотосинтетический аппарат картофеля // Физиол. и биох. культ, раст. 1989. Т. 21, № 2. С. 156-161.

21. Гусаковская М. А., Блинцов А. Н., Баринова Ю. В., Ермаков И. П. Изменение содержания эндогенных цитокининов в завязях Triticum aestivum до и после оплодотворения // Физиология растений. 1998. Т. 45, № 6. С. 865869.

22. Гусаковская М. А., Блинцов А. Н., Ермаков И. П. О гормональной регуляции развития завязи пшениц Triticum aestivum II ДАН. 2000. Т. 370, № 5. С. 689-692.

23. Дерфлинг Г. Гормоны растений: системный подход / Под ред. В. И. Кефели. М.: Мир, 1985. 303 с.

24. Джохадже Д. И., Гоглидзе Р. И., Гиголашвили Г. Г. О механизмах влияния фитогормонов на транскрипцию / Регуляторы роста и развития растений. Тез. док. I Всесоюзной конфер. Москва, 1981. С. 25.

25. Дорогова Н. В., Шамина Н. В. Особенности цитокинеза в клетках, высших растений // Цитология. 1994. Т. 36, № 9. С. 899-915.

26. Еркеев М. И., Камалетдинов М. А., Гилязетдинов Ш. Я. Исследование состава новообразованных РНК в проростках разных линий кукурузы после действия фитогормонов / Регуляторы роста и развития растений. Тез. док. I Всесоюзной конфер. Москва, 1981. С. 25—26.

27. Журавлев Ю. Н., Омелько А. М. Морфогенез у растений in vitro II Физиология растений. 2008. Т. 56, № 5. С. 643-664.

28. Загоскина Н. В., Гончарук Е. А., Алявина А. К. Изменения в образовании фенольных соединений при действии кадмия на каллусные культуры, инициированные из различных органов чайного растения // Физиология растений. 2007. Т. 54, № 2, С. 267-274.

29. Загоскина Н. В., Запрометов М. Н. Влияние 1-нафтилуксусной кислоты на рост и образование фенольных соединений в культуре ткани чайного растения // Физиология растений. 1979. Т. 26. С. 681-687.123

30. Запрометов М. Н., Субботина Г. А., Николаева Т. Н. Влияние кинетина на образование фенольных соединений и ультраструктурную организацию каллусных тканей чайного растения // Физиология растений. 1994. Т. 41, № 3. С. 354-358.

31. Зубо Я. О., Селиванкина С. Ю., Ямбуренко М. В., Зубкова Н. К., Кулаева О. Н., Кузнецов В. В. Цитокинины активируют транскрипцию хлоропластных генов // ДАН. 2005. Т. 400, № 3. С. 396-399.

32. Иванов В.Б. Активные красители в биологии. М.: Наука, 1982. 224 с.

33. Иванова А. Б., Анцыгина Л. Л., Ярин А. Ю. Современные аспекты изучения фитогмонов. Цитокинины // Цитология. 2001. Т. 43, № 6. С. 537543.

34. Иванова А. Б., Полыгалова О. О., Гордон Л. X. Ионы кальция в регуляции некоторых метаболических процессов растительной клетки // Цитология. 1997. Т. 39, № 4/5. С. 352-359.

35. Измайлов С. Ф. Азотный обмен в растениях. М.: Наука, 1986. 320 с.

36. Калашникова Е. А. Методы совершенствования технологии клонального микроразмножения сосны обыкновенной //Лесное хозяйство. 1994. №3. С. 36-38.

37. Калимова И. Б., Демченко Н. П., Демченко К. Н. Тканевая реакция корней проростков ТгШсит аеяйуит на действие избытка никеля в среде / Тез. докл. II Междунар. конфер. по анатомии и морфологии растений. С-Пб., 2002. С. 283.

38. Калинин Ф. Л., Сарнацкая В. В., Полищук В. Е. Методы культуры тканей в физиологии и биохимии растений. Киев: Наукова Думка, 1980. 488 с.

39. Карабаев М. К., Джардемалиев Ж. К. Культивируемые клетки пшеницы и кукурузы. Морфогенез и толерантность // Физиология растений. 1994. Т. 41, №6. С. 807-814.

40. Карначук Р. А., Гвоздева Е. С. Влияние света на баланс фитогормонов и морфогенез в культуре ткани зародышей пшеницы // Физиология растений.1998. Т. 45, №2. С. 289-295.

41. Карначук Р. Г., Головацкая И. Ф. Гормональный статус, рост и фотосинтез растений, выращенных на свету разного спектрального состава // Физиология растений. 1998. Т. 45, № 6. С. 925-934.

42. Катаева И. В., Аветисов Н. П. Клональное микроразмножение растений / В кн.: Культура клеток растений и биотехнология и биотехнология. Под ред. Р.Г. Бутенко. М.: Наука, 1986. С. 31-35.

43. Кефели В. И. Природные ингибиторы роста и фитогормоны. М.: Наука, 1974. 252с.

44. Ковелев А. Г., Обручева Н. В. Клеточный анализ S-образной кривой роста корня, особенности деления клеток в корнях конского каштана // Онтогенез. 1977. Т. 8. № 4. С. 397^02.

45. Котеева Н. К. Изменение структуры ядрышек в клетках апикальной меристемы побега и мезофилла хвои сосны обыкновенной в годичном цикле // Цитология. 1999. Т. 41, № 6. С. 480^184.

46. Кудоярова Г. Р., Докичева Р. А., Трапезникова В. К. Влияние 6-бензиламинопурина на рост и содержание эндогенных гормонов у растений пшеницы в зависимости от уровня минерального питания // Физиол. и биохим. культ, раст. 1991. Т. 23, № 6. С. 557-563.

47. Кунах В. А. Изменчивость растительного генома в процессе дифференцировки и каллусообразования in vitro II Физиология растений.1999. Т. 46, №6, С. 919-930.

48. Курсанов A. JI. Транспорт ассимилятов в растении. М.: Наука, 1976. 415 с.

49. Лакин Г. Ф. Биометрия: учебное пособие для вузов. М.: Высшая школа, 1990.351 с.

50. Ломин С. Н., Романов Г. А. Анализ гормон-рецепторного взаимодействия. Теоретические и практические аспекты // Физиология растений. 2008. Т. 55, № 2. С. 283-299.

51. Лыгин А. В., Иванова А. Б., Гордон Л. X. Особенности дыхания и липидного состава клеток каллуса гороха // Цитология. 1996. Т. 38, № 2. С. 219-220.

52. Лянгузова И. В. Влияние никеля и меди на прорастание семян и формирование проростков черники // Физиология растений. 1999. Т. 46, № 3. С. 500-502.

53. Марченко А. О. Реализация морфогенетического потенциала растительных организмов // Успехи современной биологии. 1996. Т. 116, №. 3. С. 306-319.

54. Митриченко А. Н., Фатхутдинов Р. Г., Теплова И. Р., Веселов С. Ю., Кудоярова Г. Р. Динамика и распределение цитокининов в проростках пшеницы при изменении температуры // Физиология растений. 1998. Т. 45, № З.С. 468-471.

55. Момот Т. С. Способность к органогенезу ели европейской и сосны обыкновенной в культуре in vitro II Цитология и генетика. 1977. Т. 9, № 6. С. 497-503.

56. Муромцев Г. С., Чкаников Д. И., Кулаева О. Н., Гамбург К. 3. Основы химической регуляции роста и продуктивности растений. М.: Агропромиздат, 1987. 383 с.

57. Нестеренко Т. В., Шихов В. Н., Тихомиров А. А. Термоидукция флуоресценции хлорофилла и возрастное состояние листьев высших сосудистых растений // Физиология растений. 2001. Т. 48, № 3. С. 282-290.

58. Николаева Б. А., Алексеева В. Я., Гордон Л. X. Влияние ионов лития на рост корней пшеницы и роль фосфоинозитидного цикла в регуляции ростовых процессов // Цитология. 2001. Т. 43, № 10. С. 969-974.

59. Николаева Т. Н., Загоскина Н. В., Запрометов М. Н. Образование фенольных соединений в каллусных культурах чайного растения под действием 2,4-Д и НУК // Физиология растений. 2009. Т. 56. № 1. С. 53-58.

60. Обручева Н. В., Антипова О. В. Запуск роста осевых органов и его подготовка при прорастании семян, находящихся в вынужденном покое. 2. Инициация "кислого роста" в осевых органах семян кормовых бобов // Физиология растений. 1994. Т. 41, № 3. С. 443-447.

61. Обручева Н. В., Антипова О. В. Общность физиологических механизмов подготовки к прорастанию у семян с разным типом покоя // Физиология растений. 1999. Т. 46, № 3. С. 426^131.

62. Озолина Н. В., Кузеванов В. 3., Саляев Р. К., Котова J1. Г. Электрофоретическое изучение белков морфогенных и неморфогенных каллусов яровой пшеницы // Физиология растений. 1995. Т. 27, № 4. С. 254258.

63. Паушева 3. П. Практикум по цитологии растений. М.: Агропромиздат, 1988. 271 с.

64. Плохинский H.A. Биометрия. М.: Изд-во МГУ, 1970. 365 с.

65. Полевой В. В., Саламатова Т. С. Физиология роста и развития растений. Л.: ЛГУ, 1991. 240 с.

66. Попов А. С., Волкова Л. А. Криосохранение и некоторые изменения культур клеток диоскореи на среде без витаминов // Физиология растений. 1994. Т. 41, № 4. С. 923-928.

67. Решетников В. Н., Ненадович Р. А. Особенности липидного состава ядерного матрикса каллусных тканей тритикале // ДАНБ. 1995. Т. 39, № 6. С. 68-71.

68. Рипецкий Р. Т., Кит Н. А., Матасов В. И. Влияние кинетина на образование хлоропластов в спорах лиственных мхов / Регуляторы роста и развития растений. Тез. док. I Всесоюзной конфер. Москва, 1981. С. 38-39.

69. Романов Г. А. Как цитокинины действуют на клетку // Физиология растений. 2009. Т. 56, № 2. С. 295-319.127

70. Романов Г. А. Цитокинины и т-РНК: новый взгляд на старую проблему // Физиология растений. 1990. Т. 37, № 6. С. 1196-1210.

71. Романов Г. А., Медведев С. С. Ауксины и цитокинины в развитии растений // Физиология растений. 2006. Т. 53, № 2. С. 309-319.

72. Рощина В. Д., Рогцина В. В. Действие фитогормонов на быстрые светозависимые реакции растений / Регуляторы роста и развития растений. Тез. док. I Всесоюзной конфер. Москва, 1981. С. 40.

73. Румянцева Н. И., Валиева А. И., Самохвалова Н. А., Мухитов А. Р., Агеева М. В., Лозовая В. В. Особенности лигнификации клеточных стенок каллусов гречихи//Цитология. 1998. № 10. С. 836-843.

74. Румянцева Н. И., Валиева А. И., Федосеева Н. В., Самохвалова Н. А., Яблокова Е. В. Биохимические и цитоморфологические особенности культивируемых каллусов растений с разной способностью к морфогенезу // Цитология. 1996. Т. 38, № 2. С. 244-245.

75. Румянцева Н. И., Сальников В. В., Лебедева В. В. Изменение структуры клеточной поверхности каллуса Fagopyrum esculentum Moench. при индукции морфогенеза // Физиология растений. 2005. Т. 52, № 3. С. 430— 437.

76. Руте Т. Н., Мауриня X. А. Клональное микроразмножение ели {Picea abies) // Физиология растений. 1989. Т. 36, №1. Р. 154-165.

77. Свинцова В. С., Буторина А. К. Характеристика ядрышковой активности клеток разных типов в раннем эмбриогенезе Pinns sylvestris L. // Цитология. 2002. Т. 44, № 12. С. 1199-1204.

78. Серегин И. В., Иванов В. Н. Является ли барьерная функция эндодермы единственной причиной устойчивости корней к солям тяжелых металлов // Физиология растений. 1997. Т. 44. № 6. С. 922-925.128

79. Силкин Ю. А., Коф Э. М. Изменение содержания эндогенных цитокининов в процессе зеленения проростков гороха / В кн.: Экологические аспекты регуляции роста и продуктивности растений: Матер. Науч. конф. Ярославль, 1991. С. 35.

80. Смирнова О. Ю., Мишина В. А., Зацепина О. В. Цитопатические эффекты воздействия ингибитора синтеза белка эметина на клетки и ядрышки культуры Hela II Цитология. 2003. Т. 45, № 12. С. 1179-1187.

81. Смоленская И. Н. Зоринянц С. Э., Смирнова Ю. Н., Носов А. В., Чайко А. Л., Носов А. М. Суспензионная культура клеток Panax japonicus var. repens. 1. Параметры роста и цитогенетические характеристики // Биотехнология. 2005. № 5. С. 21-28.

82. Смолов А. П., Опанасенко В. К. Аммонийный фактор в жизнедеятельности растительной клетки // Цитология. 2009. Т. 51, № 4. С. 358-365.

83. Суханова М. А., Бондарев Н. И., Горяева О. В., Андреева С. Е., Носов А. М. Ультраструктурная характеристика клеток растений и каллусных культур Stevia rebaudiana в связи с синтезом стевиол-гликозидов // Биотехнология. 2007. № 5. С. 51-59.

84. Теплова И. Р., Кудоярова Г. Р., Никитина В. С. Изменение эндогенного гормонального баланса под действием 6-бензиламинопурина: возможная связь с повышением устойчивости / В кн.: II съезд Всеросс. о-ва физиологов растений: тез. докл. М. 1992. С. 206.

85. Толочко В. В., Гамбург К. 3. Возможные функции мезоинозита в растениях // Успехи современной биологии. 1978. Т. 85, № 1. С. 50-61.

86. Тонкоштан JI. А. Анатомическое строение хвои основных древесных пород Красноярского края // Труды института Леса и древесины "Древесиноведение и защита древесины". М.: Изд-во Академии наук, 1963. С. 118-127.

87. Третьякова И. Н., Бажина Е. В. Семенная продуктивность макростробилов и качество семян пихты сибирской в нарушенных лесных экосистемах // Экология. 1996. Т. 27, № 6. С. 35^-2.

88. Уоринг Ф., Филлипс И. Рост растений и дифференцировка. М.: Мир, 1984. 512 с.

89. Хмара К. А., Катаева Н. В. Влияние генотипа материнского растения и веществ цитокининового типа действия на способность тканей зародыша ели обыкновенной {Picea abies L.) к органогенезу in vitro II Физиология растений. 1993. Т. 40, № 5. С. 802-805.

90. Хотылева А. В., Матвеенко С. Н., Рубан В. В., Калинская Л. Н. Особенности структуры цитоплазматических органелл в клетках каллуса и регенерантах табака // Цитология и генетика. 1995. Т. 29, № 1. С. 23—28.

91. Чавчавадзе Е. С. Древесина хвойных: морфологические особенности, диагностика, значение. М.: Наука, 1979. 192с.

92. Чережанова Л. В., Мелик-Саркисов О. С., Овчинникова В. Н. Цитогенетический эффект Сахаров // Генетика. 1991. Т. 27, № 8. С. 1372— 1378.

93. Чжань К. Г., Ли В., Мао И. Ф., Чжао Д. Л., Донь В., Гуо Г. К. Содержание гормонов в каллусах Scutellaria baicalensis, индуцированных тидиазуроном // Физиология растений. 2005. Т. 52, № 3. С. 392-398.

94. Шамина 3. Б., Савина Т. А., Осипова Е. А., Попов Ю. Г. Повышение продуктивности культуры клеток стефании гладкой — Stephania glabra (Roxb) Miers // Физиология растений. 1994. Т. 41, № 6. С. 885-890.

95. Школьник М. Я. Физиологическая роль бора у растений в свете новейших данных / В кн.: Физиологическая роль микроэлементов у растений. Л.: Наука. 1970. С. 45-56.

96. Abe H., Fucuda R., Ohtani J., Fukazawa K. Changes in the arrangement of microtubules and microfibrils in differentiating conifers tracheids during expansion of cells //Ann. Bot. 1995. Vol. 75. P. 305-310.

97. Afele J. C., Senaratha T., Saxena P. Somatic embryogenesis and plant regeneration from zygotic embryo culture Picea pungens II Plant Cell Reports. 1992. Vol. 11, № 5-6. P. 299-303.

98. Aloni R., Baum S.F., Peterson C.A. The role of cytokinin in sieve tube regeneration and callose production in wounded Coleus internodes II Plant Physiol. 1990. Vol. 93, № 3. P. 982-989.

99. Arnold von S: Factors influencing formation, development and adventitious shoots from embryos of Picea abies II Plant. Sci. Lett. 1982. Vol. 27. P. 275-287.

100. Arnold von S. Impotence of genotype on the potential for in vitro adventitious buds production of Picea abies II For. Sci. 1983. Vol. 30. P. 312-316.

101. Arnold von S., Eriksson T. Induction of adventitious buds on buds of Norway spruce {Picea abies) grown in vitro II Physiol. Plant. 1976. Vol. 45. P. 2934.

102. Arnold von S., Eriksson T. In vitro studies of adventitious shoot formation in Pinus contorta II Can. J. Bot. 1981. Vol. 59. P. 870-874.

103. Arnold von S., Eriksson T. Initial stages in the course of adventitious bud formation on embryos of Picea abies II Physiol. Plant. 1985. Vol. 64. P. 41-47.

104. Arnold von S., Hawes C. Differentiation of bud meristems and cataphylls during adventitious bud formation on embryos of Picea abies II Can. J. Bot. 1989. Vol. 67. P. 422-428.

105. Bassard N., Brissette L., Lord D., Laliberte S. Elongation, rooting and acclimatization of micropropagated shoots from mature material of hybrid larch // Plant Cell, Tissue, Organ Cult. 1996. Vol. 44. P. 37-44.

106. Beinsberger S. I., Valske R. L., Deblaere R. Y., Clijster M. M., De Greef J. A., Van Onckelen H. A. Effects of the introdaction of Agrobacterium tumefaciens T-DNA ipt-gene in Nicotiniana tabaccum L. // Plant Cell Physiol. 1991. Vol. 79. P. 7-12.

107. Biesaga-Koscielniak J., Koscielniak J., Filek M., Janeczko A. Rapid production of wheat cell suspension cultures directly from immature embryos // Plant Cell, Tissue, Organ Culture. 2008. Vol. 94. p. 139-147.

108. Binns A. N. Cytokinin accumulation and action. Biochemical, genetic and molecular approaches // Annu. Rev. Plant Physiol, and Plant Mol. Biol. 1990. Vol. 45. P. 173-196.

109. Bogunia H., Przywara L. Rola cukrowcow w roslinnych kulturach in vitro II Wiad. Bot. 1999. Vol. 43, № 1-2. P. 25-36.

110. Bonga J. M. Organogenesis in vitro of tissues from matures conifers // In vitro. 1981. Vol. 17. P. 511-518.

111. Borkowska B., Opitowska M. Influence of BA and other cytokinins on proliferation and metabolic status of sour cherry cultures cultivated in vitro II Fruit Science Reports. 1988. Vol. 15, № 4. P. 147-156.

112. Bornman, C. H. Possibilities and constraints in the regeneration of trees from cotyledonary needles of Picea abies in vitro II Physiol. Plant. 1983. Vol. 57. P. 5-16.

113. Brand M. H. Influence of agar and ammonium nitrate on tissue nitrogen, culture growth, and vitrification // Hort. Science. 1993. Vol. 28. P. 546-591.

114. Budimir S., Vujicic R. Benzyladenine induction of buds and somatic embryogenesis in Picea omorica Purlc. // Plant Cell, Tissue, Organ Cult. 1992. Vol. 31. P. 89-94.

115. C. Kevers, T. Franck, R. J. Strasser, J. Dommes, T. Gaspar. Hyperhydricity of micropropagated shoots: a typically stress-induced change of physiological state // Plant Cell, Tissue, Organ Culture. 2004. Vol. 77. P. 181-191.

116. Calixto F., Pais S. M. Adventitious shoots formation and plant regeneration from Pinus pinaster II In Vitro Cell. Develop. Biol. Plant. 1997. Vol. 33, № 2. P. 119-124.

117. Campbell R. A., Duran D. J. Induction of multiple buds and needles in tissue cultures of Picea glauca II Can. J. Bot. 1975. Vol. 53. P. 1652-1657.

118. Capuana M., Giannini R. Micropropagation of young and adult plants of cypress (Cupressus sempervirens L.) // J. Hort. Sci. 1997. Vol. 72. P. 453-460.

119. Carland F. M., Berg B. L., Fitzgerald J. N., Jinamornphongs S., Nelson T., Keith B. Genetic regulation of vascular tissue patterning in arabidopsis // The Plant Cell. 1999. Vol. 11,№ 11. P. 2123-2137.

120. Chalupa V. Development of isolated Norway spruce and Douglas fir buds in vitro II Comm. Inst. For Czech. 1977. Vol. 10. P. 79-87.

121. Chalupa V. Somatic embryogenesis and plantlet regeneration from cultured immature and mature embryos of Picea abies (L.) // Karst. Commun. Inst. For. Cech. 1985. Vol. 14. P. 57-63.

122. Chalupa V., Dursan D. Growth and development of resting buds of conifers in vitro II Can. J. For Res. 1973. № 3. P. 196-208.

123. Chandhry Z., Rashid H., Qurashi A. Analysis of protein and peroxidase from embriogenic and non-embriogenic cultures of Citrus reticulate II J. Sci. Ind. Res. 1993. Vol. 36, № l.P. 20-22.

124. Chang S. H., Ho C. K., Chen Z. Z., Tsay J.Y. Micropropagation of Taxus mairei from mature trees // Plant Cell Rep. 2001. Vol. 20. P. 496-502.

125. Cheah K.-T., Cheng T.-Y. Histological analysis of adventitious bud formation in cultured douglas fir cotyledon // Amer. J. Bot. 1978. Vol. 65. P. 845849.

126. Chin-Atkins A. N., Craig S., Hocart C. H., Dennis E. S., Chaudhury A. M. Increased endogenous cytokinin in the Arabidopsis amp 1 mutant corresponds with deetiolation responses // Planta. 1996. Vol. 198, № 4. P. 549-556.

127. Collett C. E., Harberd N. P., Leyser O. Hormonal interactions in the control of arabidopsis hypocotyl elongation II Plant Physiol. 2000. Vol. 124. P. 553-561.

128. Cortizo M., Diego de N., Moncalean P., Ordas R. J. Micropropagation of adult Stone Pine (Pinus pinea L.). // Trees. 2009. Vol. 23. P. 835-842.

129. David A., David H., Mateille T. In vitro adventitious budding on Pinus pinaster cotyledons and needles // Physiol. Plant. 1982. Vol. 56. P. 102-107.

130. Davies P. J. The plant hormones: their nature, occurrence, and functions / Plant hormones: physiology, biochemistry and molecular biology, (ed. P. J. Davies). The Netherlands: Kluwer academic publishers. 1995. P. 1—12.

131. De Loose M., Alliotte T., Bauw G., Vandekerckhove J., Van Montadu M., Inze D. Molecular analysis of auxin and cytokinin effects on Nicotiniana plnmbaginifolia cell suspensions // Arch. Int. Physiol, et Biochim. 1987. Vol. 95, №5. P. 189-195.

132. Drake P. M., Johm A., Power J. B., Davey M. R. Cytokinin pulse-mediated shoot organogenesis from cotyledons of Sitka spruce (Picea sitchensis) and high frequency in vitro rooting of shoots // Plant Cell, Tissue, Organ Cult. 1997. Vol. 50. P. 147-151.

133. Dursan D., Chafe S., Lopushanski S. M. Effects of environmental changes on sugars, tannins and organized growth in cell suspension cultures of white spruce // Planta. 1973. Vol. 113. P. 241-249.

134. Ewald D., Siiss A. A system for repeatable formation of elongating adventitious buds in Norway spruce tissue cultures // For. Genet. 1993. Vol. 42, № 4-5. P. 169-175.

135. Ewald D., Kretzchmar U. Tissue culture of adult larch as a tool for breeding purposes / Larch genetics and breeding. IUFRO working party S2.02-07. Sweden, 1995. P. 153-163.

136. Fink S. The occurrence of adventitious and preventitious buds within the bark of some temperate and tropical trees // Am. J. Bot. 1983. Vol. 70, № 4. P. 532-542.

137. Flinn B. S., Webb D. T., Georgis W. In vitro control of caulogenesis by growth regulators and media components in embryonic explants of eastern white pine {Pinus strobus) II Can. J. Bot. 1986. Vol. 64. P. 1948-1956.

138. Flinn B. S., Webb D. T., Newcomb W. The role of cell clusters and promeristemoides in determination and competence for caulogenesis by Pinus strobus cotyledons in vitro II Can. J. Bot. 1988. Vol. 66, № 8. P. 1556-1565.

139. Flygh G., Cronroos R., Arnold von S. Induction, rooting, and capacity of adventitious shoots of Pinus contorta I I Can. J. For. Res. 1993. Vol. 23. P. 19071916.

140. Fukazawa J., Sakai T., Ishida S., Yamaguchi I., Kamiya Y., Takahashi Y. Repression of shoot growth, a bZIP transcriptional activator, regulates cell elongation by controlling the level of gibberellins // Plant Cell. 2000. Vol. 12. P. 901-915.

141. Fukuda H. Xylogenesis initiation, progression, and cell death // Annu. Rev. Plant. Physiol. Plant. Mol. Biol. 1996. Vol. 47. P. 299-325.

142. Gan S., Amasino R. M. Inhibition of leaf senescence by autoregulated production of cytokinin // Science. 1995. Vol. 270, № 5244. P. 1986-1988.

143. Garcia-Ferriz L., Serrano L., Pardos J. A. In vitro shoot organogenesis from excised immature cotyledons and microcutting production in stone pine // Plant Cell, Tissue, Organ Culture. 1994. Vol. 36. P. 135-140.

144. Gendreau E., Traas J., Desnos T., Grandjean O., Caboche M., Hofte H. Cellular basis of hypocotyl growth in Arabidopsis thaliana II Plant Physiol. 1997. Vol. 114. P. 295-305.

145. Gonzales M. V., Rey M., Tavazza P., Malfa S. L., Cuozzo L., Ancora G. In vitro adventitious shoot on cotyledons of Pinus pinea II Hort. Sci. 1998. Vol. 33, № 4. P. 749-750.

146. Gregory R. A., Romberger J. A. The shoot apical ontogeny of the Picea abies seedling. I. Anatomy, apical done diameter, and plastochron duration // Amer. J. Bot. 1972. Vol. 59, № 6. P. 587-597.

147. Gupta D., Purohit M., Srivastana P. S. Adventitious buds from cotyledonary leaves of Pinus gerardiana Wall. // Beitrage zur Biologia der Pflanzen. 1994. Vol. 68. P. 291-296.

148. Hakman I., Fowke L. C., Arnold von S., Eriksson T. The development of somatic embryos in tissue cultures initiated from immature embryos of Picea abies II Plant. Sci. 1985. Vol. 38. P. 53-59.

149. Halos S. C., Go N. E. Micropropagation of Pinus caribaea Morelet. // Plant Cell, Tissue, Organ Cult. 1993. Vol. 33, № 1. P. 47-53.

150. Harry I. S., Thorpe T. A. Regeneration of plantlets through organogenesis from mature embryos of jack pine // Plant Cell, Tissue, Organ Culture. 1994. Vol. 37. P. 159-164.

151. Hausman J. F., Kevers C., Gaspar T. Putrescine control of peroxidase activity in the inductive phase of rooting in poplar shoots in vitro, and the adversary effect of spermidine // J. Plant. Physiol. 1995. Vol. 146. P. 681-685.

152. Havel L, Scarano M. T, Durzan D. J. Xylogenesis in Cupressus callus involves apoptosis // Adv. Hort. Sci. 1997. Vol. 11. P. 37-40.

153. Hernandez J. J., Conzales R. H. In vitro morphogenesis of Pinus patula Schb. et Cham // Revista Chapingo. 1991. Vol. 15 (75). P. 7-17.

154. Horgan R. Present and future prospects for cytokine research // Physiol, and Biochem. of Cytokinins in Plants. 1990. P. 3-13. '

155. Hrib J., Vookova B., Kormutak A. Biochemical difference between normal callus and embryogenic suspensor mass of silver fir // Biol. Plant. 1997. Vol. 39. P. 507-513.

156. Jansson E., Bornman C. H. In vitro initiation of adventitious structures in relation the abscission zone in needle explants of Picea abies: anatomical considerations //Physiol. Plant. 1981. Vol. 53. P. 191-197.

157. Jansson E., Bornman C. H. Morphogenesis in dormant embryonic shoots of Picea abies: influence of the crown and cold treatment // Physiol. Plant. 1983. Vol. 59. P. 521-527.

158. Joy R. W., Bender L., Thorpe T. A. Nitrogen metabolism in cultured cotyledon explant of Pinus radiata during de novo organogenesis // Physiol. Plant. 1994. Vol. 92, № 4. P. 681-688.

159. Kaliamoorthy S., Krishnamurthy K. V. Secondary wall deposition in tracheary elements of cucumber grown in vitro II Biol. Plant. 1998. Vol. 41. P. 515-522.

160. Kaul K. Factors influencing in vitro micropropagation of Pinus strobus L. // Biologia Plantarum. 1990. Vol. 32. P. 266-272.

161. Kaya Z., Gokce F. In vitro regeneration of Anatolian black pine {Pinus nigra Arnold subsp. pallasiona (Lamb.) Holmboe) from excised embryos // Turkish J. of Bot. 1997. Vol. 27, № 4. P. 197-202.

162. Kevers C., Franck T., Strasser R. J., Dommes J., Gaspar T. Hyperhydricity of micropropagated shoots: a typically stress-induced change of physiological state // Plant Cell, Tissue, Organ Culture. 2004. Vol. 77. P. 181-191.

163. Kikuchi A., Satos S., Nakamura N. Differences in pectin polysaccharides between carrot embryogenic and non- embryogenic calli // Plant Cell Reports. 1995. Vol. 14. P. 279-284.

164. Kobayashi M!, Maton T., Sekiya H. Responses to boron deprivation in cultured tobacco cells // Plant and Cell Physiol. 1999. Vol. 40. P. 150-158.

165. Kong L., Yeung E. C. Effects of silver nitrate and polyethyleneglycol on white spruce (Picea glauca) somatic embryo development // Physiol. Plant. 1995. Vol. 93. P. 298-304.

166. Kretzchmar U. Improvement of larch micropropagation by induced short shoot elongation in vitro II Silva Genetica. 1993. Vol. 42, N 4-5. P. 163-169.

167. Kulchetscki L., Harry I. S., Yeung E. C., Thorpe T. In vitro regeneration of pacific silver fir (Abies amabilis) plantlets and histological analysis of shoot formation // Tree Physiology. 1995. Vol. 15, № 11. P. 727-738.

168. Lambardi M., Sharma K. K., Thorpe T. A. Optimization of in vitro bud induction and plantlet formation from mature embryos of aleppo pine (Pinus halepensis Mill.) // In Vitro Cell. Dev. Biol. 1993. Vol. 29. P. 189-199.

169. Lambardi M., Capuana M., Sozzi L., Giannini R. Factors affecting in vitro adventitious bud induction from excised embryos of Swiss stone pine {Pinus cembra L.) // For. Genet. 1995. Vol. 2, № 1. P. 46-57.

170. Lapp M. S., Malinek J., Coffey M. Microculture of western white pine {Pinus monticola) by induction of shoots on bud explants from 1-to 7-year-old trees // Tree Physiol. 1995. Vol. 16, № 4. P. 447-451.137

171. Legocka J., Dok Su Li, Schneider J. Cytokinin-mediated nucleic acid synthesis in the tissue culture of Diantus caryophyllus II Acta physiol. plant. 1990. Vol. 12, №2. P. 111-117.

172. Lemay J. F. Organogenese adventive sur des embryons matures de pin gris {Pinus banksiana Lamb.) in vitro. Rapport de maitrise, University du Quebec a Montreal. 1993. P. 123-135.

173. Leshem B., Sachs T. Vitrified Dianthus teratomata in vitro due to growth factor umbalans // Annals of Botany. 1985. Vol. 56. P. 613-617.

174. Lin Y. A., Wagner M. R., Heidmann L. J. In vitro formation of axillary buds by immature shoots of ponderosa pine // Plant Cell, Tissue, Organ Cult. 1991. Vol. 26, N3. P. 161-166.

175. Lin X., Leung D. Culture of isolated zygotic embryos of Pinus radiata D. Don. Part I: factors influencing in vitro germination and growth of isolated embryos // In Vitro Cell. Dev. Biol. Plant. 2002. Vol. 38. P. 191-197.

176. Lin X., Leung D. Culture of isolated zygotic embryos of Pinus radiata D. Don. Part II: biochemical changes associated with the conversion of isolated embryos // In Vitro Cell. Dev. Biol. Plant. 2002. Vol. 38. P. 198-202.

177. Martinez P., Harry I. S., Thorpe T. A. Effect of various bud induction treatment on elongation and rooting of adventitious shoots of Canary Island pine {Pinus canadensis) // Plant Cell, Tissue, Organ Cult. 1994. Vol. 39, № 3. P. 225230.

178. Mathur G., Nadgauda R. In vitro plantlet regeneration from mature zygotic embryos of Pinus wallichiana A. B. Jacks // Plant Cell Reports. 1999. Vol. 19. P. 74-80.

179. Maton T., Matsuda A., Kobayashi M., Sekiya H. Localization of boron (B) in higher plants apoplast // Plant and Cell Physiol. 1999. Vol. 40. P. 149-156.

180. McCann M. C., Stacey N. J., Dahiya P., Milioni D., Sado P. E., Roberts K. Zinnia. Everybody Needs Good Neighbors // Plant Physiology. 2001. Vol. 127, № 12. P. 1380-1382.

181. Medford J. J., Horgan R., El-Sawi Z., Klee H. J. Alteration of endogenous cytokinins in transgenic plants using a chimers isopentenyl transferase gene // Plant Cell. 1989. Vol. l.P. 403-413.

182. Mench M., Morel J., Gurkert A. Metil binding properties of high moleculer weight soluble exudates from maise {Zea malus L.) roots // Biol. Fertil. Soils. 1987. Vol. 3. P. 165-169.

183. Mo L. H., Arnold von S. Origin and development embryonic cultures from seedling of Norway spruce // J. Plant. Physiol., 1991. Vol. 138, № 2. P. 223-230.

184. Möller R, McDonald A. G, Walter C., Harris P. J. Cell differentiation, secondary cell-wall formation and transformation of callus tissue of Pinus radiata D Don. // Planta. 2003. Vol. 217. P. 736-747.

185. Möller R., Ball R. D., Henderson A. R., Modzel G., Find J. Effect of light and activated charcoal on tracheary element differentiation in callus cultures of Pinus radiata D. Don // Plant Cell, Tissue, Organ Culture. 2006. Vol. 85. P. 161171.

186. Morel J., Mench M., Gurkert A. Measurement of PI, cuand Cd binding with mucilage exudates from maise {Zea malus L.) roots // Biol. Fertil. Soils. 1986. Vol. 2. P. 29-34.

187. Mott R. L: Mehra-Palta A., Smeltzer R. H. An anatomical and cytological perspective on pine organogenesis in vitro // TAPPI Forest Biology Wood Chemistri Conference Papers, 1977. P. 9-14.

188. Murashige T., Scoog F. A. A revised medium for rapid growth and bioassay with tobacco tissue culture // Physiol. Plant. 1962. Vol. 15. P. 473^179.

189. Nadgauda R. S., Nagarwala N. N., Parasharam V. A., Mascarenhas A. F. Bud break and multiple shoot formation from tissues of mature trees of Pinus caribaea and Pinus kesiya // In Vitro Cell. Dev. Biol. 1993. V. 29. P. 131-134.

190. Nin S., Morosi E., Schiff S., Bennici A. Cullus culture of Artemisia absinthium L.: Innitiation, growth optimization and organogenesis // Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 1996. V. 45. P. 67-72.

191. Noh E. W., Minocha S. C., Riemenschneider D. E. Adventitious shoot formation from embryonic explants of red pine (.Pinus resinosa) II Physiol. Plant. 1988. Vol. 74, № 1. P. 119-124.

192. Norgaard J. V., Kogstrup P. Cytokinin induced somatic embryogenesis from immature embryos of Abies nordmaniana // Plant. Cell. Rep., 1991. Vol. 9, № 9. P. 509-513.

193. Owens J., Molder M. Bud development in Picea glauca. I. Annual growth cycle of vegetative buds and shoot elongation as they relate to date and temperature sums // Can. J. Bot. 1977. Vol. 55. P. 2728-2745.

194. Pasqualetto P. L., Zimmerman R. H., Fordham I. The influence of cation and gelling agent concentrations on vitrification of apple cultivars in vitro II Plant Cell, Tissue, Organ Culture. 1988. Vol.14. P. 3140-3146.

195. Patel K. R., Thorpe A. T. In vitro regeneration of plantlets from embryonic and seedling explants of Engelmann spruce {Picea engelmannii Parry) // Tree Physiology. 1986. Vol. 1. P. 289-301.

196. Pelletier G., Laliberte S. Effect of embryo orientation on the developmental sequence of adventitions organogenesis in jack pine {Pinus banksiana Lamb.). // Can. J. Bot. 2000. Vol. 78. P. 1348-1360.

197. Perez-Frances J. F., Valdes F., Martin R. Callus induction and culture from explants of Erysimum scoparium in a growth regulator-free medium // Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 1995. Vol. 43. P. 223-228.

198. Potikha T. S., Collins C. C., Johnson D. I., Delmer D. P., Levine A. The involvement of hydrogen peroxide in the differentiation of secondary walls in cotton fibers // Plant Physiology. 1999. Vol. 199. P. 849-858.

199. Prehn D., Serrano C., Mercado A., Stange C., Barrales L., Arce-Johnson P. Regeneration of whole plants from apical meristems of Pinus radiata II Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 2003. Vol. 73. P. 91-94.

200. Ramage C. M., Williams R. R. Mineral nutrition and plant morphogenesis // In Vitro Cell. Dev. Biol. Plant. 2002. Vol. 38. P. 116-124.

201. Ramsden L, Northcote D. H. (1987) Tracheid formation in cultures of pine {Pinus sylvestris) //J. Cell. Sci. 1987. Vol. 88. P. 467^174.

202. Rashotte A. M., DeLong A., Muday G. K. Genetic and chemical reductions in protein phosphatase activity alter auxin transport, gravity response, and lateral root growth // The Plant Cell. 2001. Vol. 13, № 7. P. 1683-1697.

203. Renau-Morata B., Ollero J., Arrillaga I., Segura J. Factors influencing axillary shoot proliferation and adventitious budding in cedar // Tree Physiol. 2005. Vol. 25. P. 477-486.

204. Romeu-Moreno A., Mas A. Effects of copper exposure in tissue cultured Vitis vinifera I I Vitis. Viticulat. And Enol. Abstr. 2000. Vol. 39, № l2. P. 14-21.

205. Rosas M. M., Avila V. M. C., Boettler R. B. In vitro regeneration of plantlets from immature zygotic embryos of Picea chihuahuana martianez, an endemic mexican endangered species // In Vitro Cell. Dev. Biol. Plant. 2001. Vol. 37. P. 73-78.

206. Rumary C., Patel K. R., Thorpe T. A. Plantlet formation in black and white spruce. II. Histological analysis of adventitious shoot formation in vitro II Can. J. Bot. 1986. Vol. 64. P. 997-1002.

207. Saborio F., Dvorak W. S., Donahue J. K., Thorpe T. A. In vitro regeneration of plantlets from mature embryos of Pinus ayacahuite II Tree Physiol. 1997. Vol. 17, № 12. P. 787-796.

208. Saenz L., Jones L. H. Endogenous isoprenoid and aromatic cytokinins in different plant parts of Cocos nucifera (L.) // Plant Growth Regul. 2003. Vol. 39. P. 205-215.

209. Salajova T. Adventitious bud development in vitro on mature zygotic embryos of Pinus nigra Arn // Biologia (Bratislava). 1993. Vol. 48, № 1. P. 105108.

210. Savidge R. A. In vitro wood formation in 'chips' from merchantable stem region of Larix laricina IIIAWA J. 1993. Vol. 14, № 1. P. 3-11.

211. Scaltsoyiannes A., Panetsos K., Economou A., Tsoulpha P. Micropropagation of the pine hybrid Pinus bruta (Ten.) x Pinus halepensis (Mill.)141by culturing fascide shoots // Annales des Sciences Forest. 1994. Vol. 51. P. 175— 182.

212. Schloupt R. M., Splittstoesser W. E., Skirvin R. M. 250 induction and avoidance of vitrification of micropropagated onion (Allium cepa L.) // Hort. Science. 1994. Vol. 29. P. 427-581.

213. Selavankina S., Moshkov I., Novikova G., Pereverseva I. Does protein kinase C-like protein from barley leaves participate in the cytokinin action? // Physiol. Plant. 1990. Vol. 79. P. 35^14.

214. Selby C., Watson S., Harvey B. M. R. Morphogenesis in Sitka spruce (Picea sitchensis (Bong.) Carr.) bud cultures -tree maturation and explants from epicormic shoots // Plant Cell, Tissue, Organ Cult. 2005. Vol. 83. P. 279-285.

215. Sen S., Magallanes-Cenedo M. E., Kamps R. H., McKinley C. R., Newton R.J. In vitro micropropagation of Afghan pine // Can. J. For. Res. 1994. Vol. 24, № 6. P. 1248-1252.

216. Shelp B.J., Marantes E., Kitheka A.M., Vevekanandan P. Boron mobility in plants // Physiol. Plant. 1995. Vol. 94, № 2. P. 356-361.

217. Singh S., Letham D.S., Palni L.M. Biosynthesis and metabolism of cytokiknins in relation to progressive leaf senescence in tobacco. In: 15th Int. Bot. Congr. Yokagama, Aug. 28-Sept. 3. 1993.: Abstr. Yokagama, 1993. P. 465.

218. Sinska I. Polyamines and proteins in flax regenerated in vitro // Biol. Plant. 1994. Vol. 36. P. 92-101.

219. Stirk W.A., Novak O. Cytokinins in macroalgae // Plant Growth Regul. 2003. Vol. 41. P. 13-24.

220. Stojicic D., Budimi S., Culafic L. Micropropagation of Pinus heldreichii II Plant Cell, Tissue, Organ Culture. 1999. Vol. 59. P. 147-150.

221. Stojicic D., Budimir S. Cytokinin-mediated axillary shoot formation in Pinus heldreichii II Biolog. Plant. 2004. Vol. 48. P. 477-479.

222. Sul I.-W., Korban S. S. Effects of salt formulations, carbon sources, cytokinins, and auxin on shoot organogenesis from cotyledons of Pinus pinea L. // Plant Growth Regulation. 2004. Vol. 43. P. 197-205.142

223. Sul I.-W., Korban S. S. Direct shoot organogenesis from needles of three genotypes of Sequoia sempervirens II Plant Cell, Tissue, Organ Culture. 2005. Vol. 80. P. 353-358.

224. Taji A. M., Williams R. R., Sheather W. H. Comparative anatomy of four rare australian plants grown in vitro II Botanic Gardens Micropropagation News. 1996. Vol. 2. P. 2-5.

225. Tang W., Ouyang F., Guo Z. Plant regeneration through organogenesis from callus induced from mature zygotic embryos of loblolly pine // Plant Cell Rep. 1998. Vol. 17. P. 557-560.

226. Tang W., Guo Z. In vitro propagation of loblolly pine via direct somatic organogenesis from mature cotyledons and hypocotyls // Plant Growth Regulation. 2001. Vol. 33. P. 25-31.

227. Tang W., Newton R. J. Plant regeneration from callus cultures derived from mature zygotic embryos in white pine {Pinus strobus L.) // Plant Cell Rep. 2005. Vol. 24. P. 1-9.

228. Tataki H., Matuo H., Yasukouchi A., Saeki Y. Aukxin-induced root formation and zink // Plant and Cell Physiol. 1999. Vol.40. P. 45-54.

229. Tautorus T. E., Wang H., Fowke L. C., Dustan D. Embryogenic cultures of black spruce (Picea mariana) and jack pine (Pinus banksiana) I I Plant. Cell. Rep. 1992. Vol. 11, № 8. P.419-423.

230. Teasdale R. D., Dawson P. A., Woolhouse H. W. Mineral nutrient requirements of a loblolly pine {Pinus taeda) cell suspension culture // Plant physiol. 1986. Vol. 82. P. 942-945.

231. Thorpe T. A., Patel K. R. Clonal propagation: adventitious buds / In Cell Culture and Somatic Cell Genetics in Plant. Vasul I. K. (Ed.). Academic Press: New-York, 1984. Vol. 1. P. 49-60.

232. Tompson R., Anderkas von P. Somatic embryogenesis and plant regeneration form immature embryos of western larch // Plant. Cell. Rep. 1992. Vol. 11, №8. P. 379-385.

233. Toribio M., Pardos J. Scots pine (.Pinus sylvestris) II Biotechnology in agriculture and Forestry. 1986. Vol. 5. P. 479-506.

234. Vieitez A., Ballester A., SanJose M. C., Vieitez E. Anatomical and chemical studies of vitrified shoots of chestnut regenerated in vitro II Physiol. Plant. 1985. Vol. 65. P. 177-184.

235. Villalobos V. M., Oliver M. J., Yeung E. C., Thorpe T. A. Cytokinin-induced switch in development in excised cotyledons of radiata pine cultured in vitro I I Can. J. Bot. 1984. Vol. 61. P. 483^189.

236. Villalobos V. M., Oliver M. J., Thorpe T. A. Origin of adventitious shoots in excised radiata pine cotyledons cultured in vitro II Can. J. Bot. 1985. Vol. 63. P. 2172-2176.

237. Vogelmann T. C., Bornmann C., Nissen P. Uptake of benzyladenin in explants of Picea abies and Pinus sylvestris II Physiol. Plant. 1984. Vol. 61. P. 513-517.

238. Wilms E. H. A., Sassen M. M. A. Origin and development of floral buds in tobacco explants // New Phytol. 1987. Vol. 105. P. 57-65.

239. Winder T. L., Nishio J.N. Early iron deficiency stresses response in leaves of sugar beet // Plan Physiol. 1995. Vol. 108, № 4. P. 1487-1494.

240. Woffenden B. J., Freeman T. B., Beers E. P. Proteasome inhibitors prevent tracheary element differentiation in zinnia mesophyll cell cultures // Plant Physiol. 1998. Vol. 118. P. 419^430.

241. Wyman J., Temblay M., Laliberte S. Cell cycle activation during imbibition and visible germination in embryos and megagametophytes of jack pine {Pinus banksiana) II Annals of botany. 1996. Vol. 78. P. 245-253.

242. Yakovleva L.A., Cheredova E.P., Karavaiko N.N. Cytokinins and cytokinin binding sites in transgenic potato plants // Plant Growth Regul. 1997. Vol. 21. P. 71-73.

243. Yen H. E., Yen S. Effect of high salinity on tracheary element differentiation in light-grown callus of Mesembryanthemum crystallinum II Plant Cell, Tissue, Organ Culture. 1999. Vol. 58. P. 59-65.

Информация о работе

Филиппова, Ирина Панфиловна
кандидата биологических наук
Красноярск, 2010
ВАК 03.01.05

Диссертация

Адвентивное почкообразование и каллусогенез у сибирских видов хвойных в культуре in vitro - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы