Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Иммунологическое обоснование повышения устойчивости томатов к фузариозу

ВАК РФ 06.01.11, Защита растений

Автореферат диссертации по теме "Иммунологическое обоснование повышения устойчивости томатов к фузариозу"

& -

ч.

л

ВСЕСОЮЗНАЯ АКАДЕМИЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ НАУК имени В. И. ЛЕНИНА

ВСЕСОЮЗНЫЙ ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ НАУЧ НО-ИССЛ ЕДОВАТЕЛЬСКИй ИНСТИТУТ ЗАЩИТЫ РАСТЕНИЙ

На правах рукописи УДК 635.64:632.4/938.1

Р. НАНДА КУМАР

ИММУНОЛОГИЧЕСКОЕ ОБОСНОВАНИЕ ПОВЫШЕНИЯ УСТОЙЧИВОСТИ ТОМАТОВ К ФУЗАРИОЗУ

Специальность: 06.01.11 — Защита растений от вредителей и болезней

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ

(ЛЕНИНГРАД) 1991

Диссертационная работа выполнена в лаборатории иммунитета растений ВИЗР.

Научные руководители: доктор биологических наук, профессор Гусева Н. Н.; доктор биологических наук, профессор Лескова Л. Я.

Официальные оппоненты: доктор сельскохозяйственных наук Кото-ва В. В.; кандидат биологических наук Гаранъко И. Б.

Ведущее учреждение — ВНИИССОК, Московская обл.

I

Защита состоится 30 января 1992 г. в /0 * час. на заседании Специализированного совета при Всесоюзном институте защиты растений по адресу: 189620, Санкт-Петербург—Пушкин-6, шоссе Подбельского, д. 3, ВИЗР.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Всесоюзного научно-исследовательского института защиты растений.

Автореферат разослан » ^еЛС-О-Зр1'^' 199} г.

Ученый секретарь Специализированного совета

Г. А. Наседкина

; 'fcrtJWi,

' i ОБЩАЯ XAFAKTEffiCTMCA РАБОТЫ

> J

Актуальность темы. Переход растениеводства n период интенсив но--го^.оздрАнвания сельскохозяйственных культур стал в большинство • TfipaffTffipa очевидным. Это повлекло за собой применение высоких доз фунгицидов и удобрений, часто не сбалансированных в сеязи с требованием данной культуры в определенном регионе. А. как следствие - • возрастание вредоносного значения патогенов, а из числа возбудите- ■ лей болезней - грибов рода Fusarium . Основным возбудителем фуза-риозного увядания тоглатов /Lycopersicon eaculentum Tourn. / является гриб Fusarium охузрогша / Schlect. /1. lycopersici /Sacc» Snyd. et Hans / , о фузаргозной инфекции томатов в литературе имеется много сведений /Пугачева, 1982; Власова, 1988/.

Увядание резко снижает урожай и качество продукции. Существук>-щие методы борьбы с этой болезнью мало эффективны, более перспективно - выделение устойчивых сортов и гибридов. Районированные в СССР и Индии сорта и гибриды сильно поражаются фузариозом и устойчивого материала в коллекции сортов Индии также мало. Нет перспективных для селекции доноров,- поэтому исследователи все чаще обращаются к методам биотехнологии. Важное значение в создании новых сортов растений■занимает метод клеточной селекции.

Цель и задачи исследований. Цель работы - иммунологическое обоснование повышения степени устойчивости перспективных сортов томатов к возбудители фузариозного вилта - P.oxyeporum f. lycopersioi. Для осуществления этого нами были поставлены следующие задачи:

- определение и выделение агрессивных, вирулентных клонов гриба;

- использование и сравнение разных методических подходов для ранней оценки устойчивости у сортообразцов томата;

- отбор питательных сред и сортов томатов^ для селекции in vitro ■ ;

- оптимизация сред для разных генотипов /сортов томатов/;

- создание селективного фона для отбора устойчивых каллусов и определения влияния культуральных фильтратов и фузариевой кислоты возбудителей вилта в качестве селективного агента; в том числе, влияние ингибитора трипсина на развитие каллусов; j

- разработка ускоренного метода определения степени устойчивости каллусов, отобранных на селективном фоне, и оценка каллусов по устойчивости к F.oxysporum f. lycopersioi.

Научная норизна. Показана приемлемость методологических подходов ВИЗР для изучения гетерогенности лопуляции возбудителя фузари-

озного вилта томатов и выделена наиболее агрессивные и вирулентные клоны. Установлена достоверность ускоренных методов диагностики для ранжировки сортов по устойчивости. Показана возможность повышения фузариозоустойчивости томатов методом клеточной селекции, где. доказана важная роль культурального фильтрата F.oxyaporum f. lyco-peraici в качестве селективного агента и изучены ингибиторы ферментов /трипсина/ в культуральной жидкости гриба и их .роль в процессе селекции томатов in vitro . Составлена формула для определения интенсивности каллусогэнеза и разработан метод для ускоренной диагностики устойчивости в стадиях каллусов и регенерантов на основании биохимического анализа устойчивости.

Практическая ценность. Показана целесообразность применения биохимических методов для определения и отбора агрессивных и вирулентных клонов, в поиске и создании селективного фона для селекции томатов in vitro . Получена сыворотка к белкам культуральной жид-кости и мицелию гриба. Установлено сходство между iшхзммами и клонами гриба и хозяином /томат/ на уровне■"белок к белку". '

Ускоренные методы диагностики, в,частности, активизация синтеза фенольных соединений, как отьет да заражение патогена у сортов томатов, способствует экспресс-диагностике устойчивости.

Разработана схема селекции томатов in vitro на устойчивость ' к фузариозному вилту. Оптимизированные питательные среди для каллу-согенеза и прямой регенерации у 5 сортов томата, которые могут использоваться для микроклонального'размножения. Возможно использовать формулу для определения продуктивности каллусов и ускоренный , метод диагностики ступени устойчивости каллусов.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены на заседаниях кафедры фитопатологии ЛГАУ'/Ленинград, 1989, 1990, 1991/; на Всесоюзной конференции молодых ученых /Ленинград, 1990/; Всесоюзной конференции молодых ученых /Одесса,-1990/; IX. Всесоюзном совещании /Шнек, 1991/; Международном симпозиуме и школе /шебсо / "Биотехнологии и генной инженерии"-/Киев, 1990/; 24-ои Международном конгрессе - "Овощеводство и цветоводство" /Ита-'лия, 1990/; Международной конференции по "Технологии семян и семеноводство" /Индия, 1990/; Международном конгрессе по биотехнологии /Швейцария, 1991/ и В-м Международном конгрессе по протопластам. /Швеция, 1991/. ■ '

Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано 6 работ и 3 работы находятся в печати. .. • .

Объем и структура диссертации. Работа состоит из введения, 4-х глав экспериментальной частя, выводов, практических рекомендаций. Содержит страниц машинописного текста, в том числе таблиц и рисунков. Список использованной литературы включает работ, в том числе иностранных авторов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОШ

Объект« и методы исследования. Исследования проводились в течение 1989-1991 гг. в лаборатории иммунитета растений. ВШИ защиты растений, г. Пушкин. В качестве инфекционного материала использовали семь шташов гриба Fuaarioa oxyeporum /Schlecfr. /f. lyco-persiol /sacc. / Snyd. et Нала , представленные лабораторией иммунитета ВИР им. Н.И. Вавилова и лаборатории иммунитета растений ВЙЗР. В исследования были включены 60 сортов томатов /LycoperslcoD esculentum Toura. / индийской и советской селекции из коллекции ВИР.

■ Очистка, клонирование и хранение чистых культур гриба P.oxyeporum f. lyooperalci бнли проведены на питательной среде Чапена-Докса. Изучали мор^олого-культурные признаки: рост мицелия, биомассы, скорость спороношения и т.д. Агрессивные свойства-.клонов, их биохимических показателей, активность" пектолитических ферментов: пектинметилзстеразн /ЛЩ/, полигалактуроназы /ПГ/ и биосинтеза фу-зариевой кислоты /ФК/ изучали согласно методических указаний БИЗР /1985, 1990/, а также рекомендаций Я.Г.Оголовец, B.C.Пономаревой '1956/. В определении агрессивности и вирулентности гриба включали 25-30 клонов из каждого штамма. Использовали фитопатологичесниэ тесты для определения фитотоксичности клонов. Вирулентность у некоторых, клонов гриба была установлена используя метод искусственного заражения разных.сортов томатов с разными клонами патогена; ' Применяли серологический метод для изучения изменчивости по пока- . зателям иммунологической реакции между водорастворимыми белками культуральной жидкости /К®/ клонов и сыворотками, полученными к белкам клонов патогена, согласно методических указаний БИЗР /1982/.

Сорта томатов выращивали в тепличных условиях и использовали растения в фазе 1-го настоящего листа. Для диагностики устойчивости применяли разные методы - биохтличесние, биофизические и фито-патологические. Определение степени устойчивости у сортов томатов /в интактннх тканях/ били проведены по показателям проницаемости клеточных мембран методом прямого титрования вытяжки листьев тома-

та раствором 0,01Н КНМцО^ и методом злектрокондуктометрии, используя электрокондуктоыер /ММ34-04/.

Определение1 устойчивости у сортов томатов проводили по степени увядания растений, при помещении растений в культуральную жидкость агрессивного клона /AKg/ гриба. Использовали серологический метод для изучения устойчивости у некоторых сортов томатов. Определение активизации синтеза фенольных соединений как ответ на»заражение в тканях томатов дало возможность установить степень устойчивости. • Б исследованиях использовали американский сорт Вовпу Beet как стандартный сорт.

Проведение асептических приемов в изолированной культуре осуществляли общепринятыми методами для культуры щ vitro /Бутенко, 1964; Калинин, Сарнацкая и др., 1980; Vaail , 1904; Kepp-liddel, • 1991/. В качестве зксплантов использовали сегменты гипокотиля. Длительность культивирования зависела от дели эксперимента. Испол! эовали питательные среди Мурасиге-Скуга/МС/ /llurashige and Skoog, 1962/, Гамбург Bg и среду без экзогенных фитогормонов /Смирнов, ^Советова, 1988/. ,Оптимизацию питательной среды Мурасиге-Скуга проводили по методике Г.И.Растягина и В.А.Смирнова /1982/ и О.С.Ива-■ новой /1990/. Определяющими параметрами являлись размер каллусов /, масса сырого каллуса /ык / л интенсивность регенерации / на 23-й день культивирования.

В качестве селективного агента в среде МС-КТ4 и КИ использовали /10, 25, 50 и 75 %/ стерильный фильтрат культуральной жидкости /Ш/, в присутствии фузариевой кислоты /КЖ + ©S/; культуралыю: . жидкости, где фузариевая кислота отсутствует /И - ФК/ и чистую фузариевую кислоту /ФК/ /25, 50,, 100 и 125 шг/л/. .Использовали мембранные фильтраты /дм . пор 0,4 им/ для получения .стерильных фильтратов гриба. 1 ■'

Клеточную селекцию проводили по схеме /рис. 1/. Наблюдали фор мирование адвентивных почек в гипокотильных каллусах, выращиваемы на селективном фхэне. Адвентивные почки обнаруживали по юс интенсивно^ зеленой окраске, при увеличении на М£С в 16 раз. Отмечали ' инициации прямой регенерации и морфогенез. Отобрали устойчивые каллусы-регенерантн и каллусы с морфогенезом. Для определения'устойчивости использовали искусственное заражение каллусов методом двойной культуры /выращивания полученных форм каллусов и гриба F.ojcysporuts i. lycopsraiei 'шесте на питательной среде/. Оценку степени поражения каллусог, томата проводили ко 5-ти балльной mmi

Схема клеточной селекции томатов по устойчивости ' к фузариозному вилту

Определение и отбор агрессивных клонов

F.oxy-gporvm f.lye.o-

рагзltd получение куль-туралъннх фильтратов .

Создание селективного фона. Определение селективных факторов и отбор концентрации КЖ

Отбор перспективных ' сортообразцов томатов для улучшения по устойчивости к фузари-озному вилту

Отбор эисшгантов и определение среды для прямой регенерации и каллусогенеза

1 путь: 2 путь: .. 3 путь:

Посев пгаокошльных Посев ггаюкотилъных Пересадка каллусов на энсплантов для цря- эксплантов для кол- среде КТ1 с КЖ для

мой регенерации на лусогенеза на среде пролиферации

среде КТ4 КЗ!

Селективнне факторы:

Фузаргевой 3. Чистая йузариевая Тга-ФК/ кислота /Ж/ •

25, 50, 100 и 125 мкг/л 4. Среда без селективных агентов как контроль в опытах

1. КЯ с фузариевой 2. КЖ без

кислотой /КЖ+ФК/ кислоты Концентрации:

20, 25, 50 и 75 %

Отбор устойчивых,морфо- Определение интенсив-

генных, регенерирующих ности каллусогенеза

и пролиферирующих кал- с формулой < лусов

Определение повышения устойчивости в отобран ннх каллусах фе'нольннм Иммунологичнне методом . •

Продолжение микро- . оценки по устой- размножения получен-чивости к фуза- пых устойчивых кал-Определенйе устойчивости риозному йилту . лусов $ятопатологичным тестом ■

Рис. 1

/Беляева, Агапова, 1975/ с. модификацией. Определяли тип устойчивости, который выводился на основании данных:'учетов, выраженных в баллах /Пугачева, 1982/.

Использовали плотность каллусов, число адвентивных почек, кал--лусообразование как параметры в разработке формулы для определения интенсивности продуктивности каллусогенеза. Фенольный метод определения устойчивости включали для экспресс-диагностики устойчивости в стадии каллусов.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Глава 2. Характеристика клонов УиаагЛит охуарогиа 1рсорегя1с1.

Изученные клоны гриба отличались друг от друга по морфолого-культуральным признакам. Бее штаммы и их клоны продуцировали макро-и микроконидии, характерные для г.ох^арогшп г. 1усорега1с1 . Юганы гриба У.охуарогшт Г. 1усорега1.с1 ; АК^, АК^, КВ^, КВ2 и КВд образовали воздушный тип мицелия, где клоны Лен^, Лзн^ имели плотные мицелии по поверхности питательных субстратов. Клон Сочд из штамма ^очи-88 обладал яркой фиолетовой окраской. Клоны штамма АК52» Е тем числе АКц и АК^, обладали большей, скоростью спороношения на единице поверхности зараженных растений и являлись одним из наиболее агрессивных по сравнению с другими клонами патогена. Отмечали высокие темпы роста мицелия в кавказских клонах. Скорость роста клонов АК5, АК^ и С0Ч5 была медленнее, чем рост клонов Лен5, Лвн^ и П55. По мнению некоторых авторов продуцирование биомассы связано с агрессивностью. Нами отмечалась закономерность в связи с биомассой клонов .штамма АК^ и Соч2д> Морфолого-культуральные признаки не определяют изменчивости, тем ~ более гетерогенности популяции г.охузро-■ гит г. 1усорегвД.с1 для целей селекции.

Для определения агрессивности и вирулентности клонов возбудителей увядания, кроме общеизвестных морфолого-культуральнш: признаков, используются биохимические оценки агрессивности и вирулентности: по активности некоторых гидролитических, б частности пектолитичеекга ферментов, такие как пектинметилэстеразы /ПМЭ/ и полигалактуроназы /ПГ/ /Гусева, 1966, 1990/. Изоляты, обладающие более высокой агрессивностью, имеют и-более'высокую активность НМЭ и ПГ. Отмечали 'высокие' активности ПМЭ и ПГ в клонах АК^ и АК^ чем у других клонов из штаммов Лен-86, ПБ-86, Соч-88. Самая низкая активность псктоли-тических форинтов наблюдалась в кавказских клонах. Бее клонн пока-

."зали разные динамики активности ШЭ. и ПГ /табл. 2.1./.

Таблица 2,1. Определение пектинметилэстеразы/ПМЭ/ и полигалак-гуроназы /ПГ/ у культуральных фильтратов

Клони Врет определения активности ПМЭ и ПГ. дни_

. гриба 6 день_10 день_14 день_16 день

ШЭ ПГ ШЛЭ ПГ ШЭ ПГ ШЭ ПГ

АК5 0,26 0,07 0,45 0,29 0,58 . 0,96. 0,57 1,14

JfeH5 0,27 0,07 0,44 0,21 0,34 0,70 0,57 0,70

ПБ5 0,21 0,07 0,35 0,17 0,37 0,61 0,40 0,62"

Соч5 0,23 0,08 0,40 0,22 0,54 0,45 0,53 0,54

КВ2 0,22 0,07 0,24 0,06 ' 0,27 0,41 0,29 0,43

В числе факторов, определяющих агрессивность, обнаруживаются и токсины. К числу.токсических веществ, ответственных за фузариозное увядание, относится и фузариевая кислота /Наишалп , 1954; Ка1уала-аип1агат, 1963/. Изученные нлонн охуэрогив X. 1усорегз3.с1 обладают разнили уровнями биосинтеза и динамики синтеза фузариевой кислоты. Клони штамма АК синтезировали наиболее высокое ноличе- • ство фузариевой кислоты ^ на 21-й день выращивания /56 мкг/мл и 54 мкг/мл/. Затем по количеству биосинтеза ФК следовали клоны штамма ПБ-86, Соч-89, Леи-86. Саше меньшее накопление токсина и самая низкая динамика была у кавказских клонов /табл. 2.2./.

Таблица 2.2. Определение биосинтеза фузариевой кислЬты клонами, мкг/мл

Клоны ' Время инкубации клонов, дни_■

гриба _6 день' 8 день 12 день 16 день 21 день

АК5 26,64 48,09. 57,09 • 60,30 54,39

AK¿ . 0,0 0,0 54,69 55,38 56,76

Iffi5 ' 0,0 . 0,0 13,17 20,07 43,89

Соч^ 0^0 . 0,0 41,61 37,08 21,60

Соч5 0,0 0,0 40,77 18,69 14,31!

Лен 5 . 0,0 0,0- .1,35 5,07 13,89

KBg- • 0,0 0,0 ' 0,0 0,0 1,86

' . Существует мнение, что при незначительном количестве фузарие-вой кислоты значительно повышается активность пектолитических ферментов, а большое количество штаммов, выделяющих фузариевую кислоту, отличается сравнительно пониженной ферментативной активностью /Ко-коев, 1975/. Однако, в настоящей работе отмечены прямые средние корреляции между активностью БМЭ, ПГ и синтезом фузариевой кислоты у всех изучаемых клонов /х - ±0,42, Р = 0,95/. У клона KBg отмечена обратная корреляция связи с образованием фузариевой кислоты и активностью ферментов /-0,08, г= ¿0,42/.

Определение фмтотоксичности клонов разных популяций патогена' фитопатологическими методами дало возможность сопоставить методы, и выделить агрессивный штамм и клон в популяции, вызыЕавдие высокую степень поражения растений томатов - сорта Bonny Beet. Оказалось, что клон AKg обладал самой высокой фитотоксичностью, уменьшая всхожесть семян до 12,15 %, энергию прорастания семян до 9,67 и до 87,0 % гибель растений. Самым слабым клоном оказался клон ■ Ю^, где гибель растений достигла всего 15,0 % /табл. 2.3./.

Таблица 2,3. Определение фитотокбичности клонов гриба

Клоны Всхожесть- семян тома- Энергия прорастания Зараженных гриба тов,обработанных куль- семи, отн.ед. • растений, %

туральным фильтратом

АК£ Лен,

пбб

Соч5 %

кв2

КБз

5

контроль опыт контроль опыт контроль опыт

100 12,50 758,00 ■ 9,62 0 87,00

100 16; 50 758,00 19,63 0. . 75,00

' 100 21,50 ' 758,00 30,74' 0 77,50

100 46,50 758,00 ■. '165,07 0 .'65,50

100 82,50 758,00 528,82 .0 22,50

100 '90,50 ' 758,00 649,59. . ■ 0 15,00

100 88,50 758,00 641,70 ; о 24,00

• ' Бы^а установлена высокая линейная зависимость между биомассой грийа, активностью пектолитических ферментов, биосинтезом фузариевой кислоты, фиготоксичностыо культуральной жидкости и патогенно-стью у клона АКд гриба Р.охузрогшп 1усорега1с1 г= +0,85 /Р = 0,05/. • ■

Клоны гриба P.oxyeporum f. lycopersicl AKg

ПБК

внделен-

ю из Ленинградского и Прибалтийского регионов, обладали иконой [рулентносТью, поражая все 15 сортов, вопчешше в работу, а клони

и КВ2 показали низкую степень вирулентности. Пять сортов из ее обладали разнили уровнями поражаекости клонами патогена. Уста-далено, что клоны АК5 и ПБд более вирулентны, чем Соч5 и КВ5, од-жо увеличение процента зараженных растений было отмечено, когда ¡пользовали все клони в суммарном виде /табл. 2.4./. Это подтверж-ает, что существует сходство между клонами и вирулентность также 1висит от степени устойчивости сортов.

Т&блица 2,4. Определение вирулентности клонов гриба

•_У. охуэрогит f. 1усорегз1с1_

эрта томата Заражение сортов томатов клонами гриба. %

АК5 ПБ5 ' Соч5 КВ2 АК^ПБ^Соч^ __

знтроль . 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0

эсковский осенний 3,10 3,01 8,25 0,0 7,75

энинградский короспелый 38,87 27,30 12,37 1,35 45,60

?иаа Ее! Р1чт 27,22 . 30,90 .24,15 1,56 ., 40,14

)оппу ВевЬ 73,21 44,45 50,50 3,34 " 82,20

аус1регз1соп )егиг1апш 1,56 1,42 0,0 0,0 4,65

Применение метода двойной диффузии для анализа изменчивости в опуляции Р.охузрогша 1. 1усорег81о1 на основании образования по-ос преципитации отмечали сходство между разными клонами и штамма-и гриба, выделенными из разных районов СССР.

Клок, характеризуются высоким темпом роста, обладал высокой, иомассой, имел воздуиную форму, белый мицелий, образовал большое оличество конидий. Этог клон обладал самой высокой активностью ектолитических ферментов /ПМЭ и ПГ/ на 1В-й день выращивания, с ;лительной динамикой и мог синтезировать фузариевую кислоту на 4-й ;ень инкубации и с высоким накоплением этого токсина на 21-й день щращивания. Хотя фузариевая кислота является не специфичным ток-ином в отношении к томатам и имеет вторичную фитотоксическуп роль 'Иванова, 1990/, яо для поражаемых сортов биосинтез этой кислоты гмеет значение в патогенезе заболевания /Билай, 1977/. Кулътураль-¿ая жидкость клона ЛК5 обладает высокой фитотонсяческим действием

.на всхожесть и прорастание семян томата сорта Bonny Beat и мицелии этого клона дам при заражении большие выпады проростков растений. Эти результаты подтверждают агрессивный характер клона AKg и удостоверяют эффективность методов дли определения агрессхшных■ свойств .гриба и применение- KJC этого клона для пели селекции томатов in vitro как селективного агента.

Глава 3. Методы диагностики устойчивости сортообразцов томатов к фузариозному увяданию

Б понимании принципов диагностики устойчивости растений к болезням существуют 3 методических подхода: 1/ Определение устойчивости в интактннх тканях растений; 2/ Определение устойчивости в ответ на заражение косвенным методом и 3/ Фитопатологический тест К числу физиологических показателей устойчивости растений относится интенсивность экзоосмирования клеточных органических веществ, что обуславливается коллоидным состоянием протоплазмы, сте пенью проницаемости мембран. Чем выше проницаемость, тем больше зкзоосмос. Проницаемость .протоплазмы тесно связана с устойчивость > растений, что было показано в работах физиологов СССР еще в 30-е годы, 'В нашей работе было отмечено, что экзоосг.шрованнне в дистил лированную воду- органические вещества количественно определяются окислением их в растворе 0,05 и КМпО^. Экэоосмос тканей устойчива и относительно устойчивых сортов томатов значительнее слабее, чен у восприимчивых сортов. Электрокондуктометрическое определение Э1 зоосмирующих веществ из дисков листьев разных сортов томатов оказалось более удобным. Полученные данные свидетельствовали об обратно-пропорциональной зависимости устойчивости сортов.с прошща« мостью.' У устойчивых сортов томатов электропроводность била на бс лее низком уровне, чем у восприимчивых сортов /табл. ЗД./J-

Степень увядания растений зависит от степени потери тургора клетки. Показатели потерь и 'восстановления тургора у сортов томатов, при помещении растений в культуральную жидкость патогена,- о) ределяет степень устойчивости у сортов томата. Более восприимчив! . ми были сорта, необратимо увядшие в короткий срок при помещении ] КН. У относительно устойчивых растений после слабого увядания- эт< - явление оказывается обратимым, а устойчивые сорта томатов сохран: ют гургор более длительное время.

К числу биохимических показателе:! устойчивости растений относятся активизация синтеза «¿¡енолышх соединений, как ответ на yap

Таблица 3.1. Диагностика степени устойчивости и сравнительный 1 анализ пригодности разных методов определения устойчивости

Сорта томатов

Кат.

ВИР

Б интакгаих тканях

I

о - и .

О. -ф 1 О 1

но о 14 о

ГЗ G мг"! о. в л S п

•jJ О И ю "

о 0.0 • я*

о аз H о о/"

-5 ^ К Л о о

<13 et Сч С-1

га. crf « « О О, О £3

сз ет я ОТ pq M>iH EH

I s

-d Я I О.ГС I « д : « 1-; о !

& 33 I

к о : е* |

н

0) «t д <D

F4 гз

О В I <13 *

M M

: X

) а

: я

! ^ "3 i о я а: о <ï>

• Й

с Я О)

i я о ; ао

<о о в

в • •

03 <ц вз П rj о гз [ч Я M « ОУЙЯ

о И а о

fc->Ctj CD tl И Р.ГЗ О О Я5 !в 53 со сага,

I

о

О й

и о

о из ¡3 я Ж

s «

а- р о.к

Московский 3626 0,88 3,88 1 255, 55 1,50

осенний

Прометей 4621 1,15 5,50 2 242,55 5,66 стойчивые сорта

Новичек 4482 2,50 5,58 2 217,64 8,33

Пундааб Чухарра 4426 1,32 6,60 2 123,76 6,83

Калянпус кубер 3558 1,66 3,77 2 100,87 6,00 >3

Искорка 4753 1,30 4,38 3 128,88 20,16 о

Пуса Ред Плум 2901 1,17 3,59 2 161,11 24,16 я л 2 fc! 3

Кечруг Агети 9960 0,72 4,87 2 162,79 23,83 1 > <13 (Ч и S

Ленинградский 2581 1,33 4,89 3 110,09 27,16 s в1 О»?

скороспелый О о аз н

Венета 4618 2 5,48 2 135,13 26,83 У О >1

Волгоградец 4483 2,23 5,58

Ж«1 2984 2,67 6,79

Цунджаб тропик 10498 0,27 5,01

Рыганский 4833 '1,25 6,01

Bonny Best g/2 4,07 9,20

101,07 97,34 76,64 88,73 57,30

62,50 50,50 54,60 57,83 83,63

Э я

Я н

3 о. я о. о. о а

о <о о Я (Ч (Ч

жениз патогеном. После заражения увеличивается количественное содержание фенолов, которое можно принимать как показатель устойчивости сорта. Таким образом, нами было установлено, что у устойчивых образцов растений томата,, пораженных грибом Р.охузрагит 1усорегз1с1' /клоном АКсД- значительно увеличивается количественное содержание фенолов по сравнению с относительно устойчивыми и восприимчивыми сортами растений. Это согласуется с принципом опре-

деления устойчивости у сдртов хлопчатника к фузариозному и верти-циллезному заболеванию фенолышм методом /Гусева, 1980/. Метод двойной диффузии и образования полос преципитации между сывороткой /полученных к белку КЖ патогена/ и белком из семян некоторых сортов томатов дает возможность для определения устойчивости на основании интенсивности образующихся полос преципитация.

Показатели фитопатологического метода определения /искусственное заражение растений/ устойчивости у сортов томатов в тепличных условиях к одному из агрессивных клонов гриба F.oxysporum f. lyco-pereicL /AKg/ дали возможность отобрать более перспективные сорта томатов по устойчивости и сравнивать преимущество разных методов, использующихся в решении задачи диагностики устойчивости /табл. З.1./.

Более точное определение устойчивости отмечается, когда возбудитель болезней находится в контакте с хозяином. Это относится к методам определения -активизации синтеза фенолов в ответ на заражение. Хорошая корреляция между фанольным методом и фитопатологичес-(ким тестом / г =.+0,78; Р= 0,05/ представляет фенольный метод кш-более ускоренный и перспективный для определения устойчивости у ' сортов томатов. В результате было отобрано 5 сортов, обладающих разной степенью'устойчивости, и они били перспективными для даль-' нейшего улучшения .по устойчивости к фузариозному увяданию методом селекции in vitro.

Глава 4. Отбор сортов, эксплантов и оптимизация среды . для культивирования томатов in vitro

Б работе отмечали, что среда Мурасиге-Скуга /МС/ способствует каллусогенезу у разных изучаемых' сортов томатов, Гипокотильные экспланты сортов Московский осенний, Ленинградский скороспелый, Pasa Red Plum, Bonny Best и дикий вид Lyooperaioon peruvi&nuni продуцировали компактные зеленые каллусы на среде МС по сравнению с сортами Аврора, Титан, Ageti и Caubattia Hed , которые обладал некомпактными каллусами с низкими культивируемыми качествами. Сре . да МС оказалась более эффективной по сравнению со средой Гамбурга Вд. Среда Bg способствовала каллусогенезу у сортов Apeti ch'aubat-. ifia Eei , Аврора, Титан и Pasa Ruby . Были отобраны гипокотильные экспланты 'для следующей работы, так как они являются частями pací нкй хозяина, • способствующими интенсивному заселению возбудителя ¡j зариоза в Сосудистых системах / Ûliarest , 1984; Bishop, Cooper,

.193-1/. .

Били отобраны 5 сортов: Московский осенний, Ленинградский скороспелый, Puaa Red Plum, Bonny Best И L.peruvlanum для целей повышения устойчивости к фузариозному вилту. Из 5-ти оптимизируемых сред МС показано, что среда КИ с составами: 0,1 мг/л витамин Bj_; 0,5 мг/л витамин Б6; 0,5 мг/л никотиновой кислоты; 0,5 мг/л ПУК и 1 мг/л кинетин способствовала образованию каллусов, обладающих высокой массой у сортов Московский осенний, Pusá Red Plum и Bonny Beat , но не способствовала образованию адвентивных почек, кроме сортов Ленинградский скороспелый и L.peruvianum . Среда КТ4 с 2,0 мг/л КУК и 4,5 мг/л 6Ш1 оказалась более эффективной и обладала высокой скоростью каллусообразования, появления адвентивных почек /эмбриоидов/ и прямой регенерации у сортов Ленинградский скороспелый и L.peruvianun . Гидролизат казеина /500 мг/л /, глу-тамгновой кислоты /20 мг/л /, сС-ШК /0,5 мг/л /, 2,4-Д /1,мг/л / и 6 БАП /0,5 мг/л / в состава среды КТ2 способствовали только высокой массе каллусов и адвентивные почки отсутствовали.

Отмечали, что у всех сортов, культивируемых на среде КТ1-3 с составом: 2,4-Д /4,5 мг/л / и 6 EUI /2,0 мг/л /, каллусы достигли большого размера, но из-за отсутствия плотности, обладали низкой массой /табл. 4.1./. Соблюдать полярность /гипокотильных/ эксплан-тов на питательной среде оказалось важным. Показано, что один цикл . развития каллусов /со стадии посева•эксплантов в среду до оптимального возраста каллусов для пересадки на свежей среде/ продолжается до 25-26 дней, затем каллусы постепенно темнеют и погибают.

Применение в качестве селективных агентов метаболитов патогена или культурального фильтрата повволяет получить" значительное количество генетических изменчивых форм и'расширить спектр на экстремальном фоне. ' ■

В нашей работе было отмечена, что применение.культуральной жидкости гриба Р.онузрогит f. lycopersici в присутствии. Фузарие-вой кислоты /К£ + ФК/ более перспективно, чем использование куль-.турального фильтрата без фузариевой кислоты /КЖ - ФК/ или только ' чистых'растворов фузариевой кислоты /ФК/ как селектипных агентов для отбора устойчивых форм каллусов и регенерантов томатов к фуза-риозу. Било установлено, что та культуральнал жидкость, где отсутствует фузарневая кислота /I®-®/ /во всех концентрациях/, вызывает полную гибель гипокотилъннх эксплантов у всех сортов томатов, включенных в работу /в среде КТ4 и КТ1/. Эксплантн погибают посто-

Таблица 4.1. Сравнительный анализ каллусогенеза и регеае-' рации в оптимизируемых питательных средах

Сорта/чид томатов

Кат. ВИР

Оптимизируемые среды МС

■ KH KT2 KT1-3 KT4 KT4

2581 2,20 1,53 1,26- 2,36 2,13

\ 1,93 1,33 0,40 2,12 2,96

Л 2,76 0,00 0,00 ' 5,23 5,13

3626 2,03 1,16 ' 1,46 1,96 1,80

Ч- 1,83 1,43 0,43 2,13 2,13

^ 0,00 0,00 0,00 ' 2,60 2,16

2901 dk 2,00 1,50 ' 1,10 1,76 1,76

4s 2,23 j 1,03 0,46 2,30 2,23

Hn 0,001 0,00 0,00 ?,03 1,83

9/2 dk 1,53 2,13 1,76 1,53 1,53

1,90 2,13 ' 0,66 1,83 1,76

«n 1,56 . 0,00 ' 0,00 2,76 2,20

2020 ' A 1,60 1,03 1,20 2,03 '2,13

"le 1,90 0,66 0,36 3,13 2,90

Hn 3,96 0,00 0,00 5,00 4,73

Ленинградский скороспелый

Московский осенний

Puaa Ked Plum

,Bonny Béat

Lycoperaicon Peruvianum

^ - диаметр каллусов, см; - сырая масса каллусов, г;

Вд - число адвентивных почек.'

пенно после 3-4 дней культивирования. Аналоги для такого действия в томатах или у других культур в литературе отсутствуют. Однако, хороший наллусогенез был отмечен в средах КТ4 и КТ1, содержащих КН+ФК и ФК в качестве селективных агентов. Этот факт подчеркивает, второстепенную роль фузариевой кислоты в патогенезе и для цели селекции /в качестве селективного агента/.

Бее сорта томатов, включая дикий вид L.peruvierium , кроме сорта Bonny Beat ', обладали высоким каллусогенезом /100-87,5 %f на средах КТ4 и КП, содержащих 10 .и 25 % селективного'агента' КН+ФК. При концентрации 75 % селективного агента /КЖ+ФК/ в среде ингибируется развитие гнпокоткля у сортов Bonny Beat и Puaa Hed Plum ; уменьшается качлусОобразование в сортах Московский . осенний п Ленинградский скороспелый. Фузариевая кислота при кон-

цингрглки 50 мкг/ил но действует на образование каллусов у всех со]тон томатов, кроме сорта Bonny Best , где каллусоосразование достигло 87,5 При концентрации 125 мкг/мл ФК в среде КТ-1 било .устошошиню фитотоксическое свойство фузариевой кислоты на всех сортах, кроме сорта Московский осенний. Каллусы, полученные из ги-покотклл, потеряли собственную структуру, и погибли, на сродо К'11, содержащей 100 мкг/мл фуоаркевой кислоты.

Хорошев развитие каллусов и высокая степень прямой регенерации били установлены у сортов Ленинградский скороспелой и 1.peruviana , культивируемых на среде КТ4, содержащей 50 % /КйЖ/ селективного агента.•

Применение таких параметров, как размер каллусов /d /, сырая масса каллусов /ы^ / и число адвентивных почек / на каллусах дало возможность для разработки формулы определения интенсивности каллусов /!'к/, с помощью которой можно прогнозировать общее качест-го селекционируемых каллусов, как в случае определения энергии прорастания семян /Abdul Bakll Anderson , 1977/.

Интенсивность каллусов определяется следующим образом:

и - Дк- Дл . ' -

* '7-1

гдо Дк = плотность каллусов

Rn - число адвентивных почек • Кх - процент образования каллусов V - объем среды /1 сма/ 1 - средняя длина гипокотиля /0,5 мм/.

Плотность каллусов / \ / определяется формулой:

Л = ^ где Ык - сырая масса каллусов

^ . 7 ' - объем каллусов

Гак к,!!( образование каллусов на селективном 'фоне-имеет форму полусферы, объем каллусов /V / определяется по формуле:

\ 2 2

Сщвчелвто интенсивности /Н/ отобранных каллусов показало, ч.'о п.ч ср»еде КТ4 сорта Ленинградский скороспелый обладал высокой • • !I m.'-i селекции на фоле, содержащем 25 и 50 % КЯ+Ж /68,60 и 56,73

срл пош'п с контролем - 512,5/', а на сродо КТ1 - 50,00; 30,00 и 1Г>,0 но ор'-'.г.нения с контролем - 50,0 /среда, содержащая 10,25 и

50 % КЖ+ФК/. Ljcoperaioos peruvianum также обладал высокой UK, но средняя степень была отмечена у сортов Московский осенний и самая низкая ^ была установлена у сорта Bonny Best /табл. 4.2./.

Таблица 4.2. Определение интенсивности каллусов /Ик/

у отобранных каллусов, устойчивых к фузариозу, отн.ед.

Сорта томатов КЖ+ФК в среду КТ4. % . ШФК в среду КН. % ■ - _контроль 10 25 50 ■ конттоль 10 25 50

Ленинградский 512,50' О 6SJ.60 56,73 50,00 51,00 30,0 15,39 скороспелый •

Московский 65,52.1,20 2,28 72,96 58,0 48,0 42,0 25,25 осенний

Pusa Hed Plum 170,64 1,80 15,64 56,42 f 72,0 22,75 14,14 14,25

Bonny Beat 209,76 0,33.17,13 0 ' 80,0 0 9,50 0

Lycopersicon 520,00 1,12 93J48 128,20 76,00 30,0 133,25 19,5 peruvianum i

Б нашей'работе впервые была показана роль ингибиторов ферментов /в частности, ингибиторы трипсина/ в культуральной жидкости, в случаях КЖ+ФК и КЖ-ФК, полученных от клонов АКд и АК^ гриба -У.оху-врогит 1. 1усорегз1(^1.Трипсин способствует расщеплению белков в тканях растений и его нарушение влияет на развитие каллусов. Существует мнение, что ингибиторы трипсина имеют специфичность действия и мы предполагаем, что у КЖ+ФК действие ингибиторов более специфично на трипсине в культуральной жидкости, чем в растительных тканях, и поэтому каллусы образуются и развиваются. Однако, в КН-ФК действие ингибиторов трипсина не только ингибирует трипсин в культуральной жидкости, но и действует на растительную ткань, нарушая каллусооб-разование. В связи с этим было отмечено, что действие ингибитора трипсина в культуральной жидкости гриба не коррелирует """с оинтези-. руемой фузариевой кислотой.

Полученные результаты по действию культуральной жидкости с фузариевой кислотой /КЖ+ФК/ и чистой фузариевой кислоты при оптимальной концентрации /до 100'мкг/мд/; в качестве селективного агента и высокого фитотоксического качества культуральной жидкости, где отсутствует фузариевая кислота /КН-ФК/, дают возможность предполагать, что:

- присутствие фузариевой кислоты в культуральных фильтратах гриба может ускорить каллусообразогание в качестве "фитогормонов". Спо-

"собность грибов рода í.oxyoporum f. lycoperalci продуцировать экзогенный ПУК / Ыасе, Coltt ., 1966/ тоже может ускорить процесс каллу сообразования и регенерации у томатов;

. - при высокой концентрации фузариевая кислота в чистом вида /более 100 мкг/глл/ может действовать в качество токсина и отвечает за уменьшение интенсивности кадлусогенеза /Ид/;

-отсутствие фузариевой кислоты у культуральных фильтратов; ферменты и токсины, образующиеся в культуральной жидкости, могут действовать специфично к томатам и могут резко ингибировать каллусооб-разование у гипокотилей. В этом случае ингибиторы ферментов, п частности, трипсина, могут косвенно .влиять на снижение каллусообра-зования iy сортов томатов на селективном фоне КЖ-ФК; - детальное изучение действия ликомаразмина /специфичный токсин в развитии вилта томатов, о котором существует мало сведений в литературе/ может способствовать в решении многих вопросов, касающихся фузариозного увядания гошгов.

На основании этих предположений оказалось перспективным использовать экзометаболиты гриба F.oxyaporum f. lycopersici в присутствии фузариевой кислота /для цели селекции устойчивых форм томатов/ в качестве селективного агента.

Перспективно использовать фанольный метод для определения степени улучшения устойчивости в стадиях каллусов. Было установлено, что у каллусов, отобранных на селективном фоне и после заражения патогеном, в два раза увеличивается содержание фенолъных соединений в ответ на заражение. Било отмечено, что перспективно использовать 'сорт Ленинградский скороспелый для получения устойчивых форм растений, имеющих большой потенциал регенерации при концентрации 25 и 50 % селективного агента в ерэде, загём L ..perú vi anuo • как донор 'устойчивости к фузариозу. Сорт Московский осенний оказался не перспективным в нашей работе. Puaa-Bed Plum является перспективным сортом, но требует испытания в агроклиматических условиях.в Индии. У сорта Bonny Beot повышается степень устойчивости, но она оказалась недостаточной /табл. 4.3./.'

Высокая прямая корреляция между / г = +0,83; Р = 0,05/ феноль-ным методом и фитопатологическим тестом /проверен методом двойной культуры каллусн-грибн/, для определения устойчивости у каллусов способствует применение фр.нолъного метода как экспрссс-мотод диаг-'. ностики устойчивости в стадиях каллус'ов.

Таблица 4.3. Определение активизации синтеза фенольных Соединений в ответ на заражение в каллусах, отобранных на селективной среде КТ4 /*10^/, % '

Активизация синтеза фенольных соединений. %_

Сорта томатов конт- конт- После отбора на Отобранные после за-роль роль фоне КК+Ф1С ражения грибом на 1 П __тоне КЖ+ФК

_• _10 2 5 50 10 25 50

Ленинградский 1,11 1,09 0,85 1,22 1,50 0,99 1,39 2,01

скороспелый

Московский 2,48 2,39 2,05 2,51 2,68 2,08 2,61 2,74

осенний ■'

Pusa Bed Plum 1,63 1,59 1,10 1,12 1,81 0,41 1,16 1,84 2,01

Воину Best 0,58 0,54 .0,42 0,60 0,76 0 . . 0

Ь.Peruvianurn 1,91 1,87. 1,36 1 1,80 2,10 1,34 1,95 2,30

ВЫВОДЫ

• 1. Для проведения иммунологической работы на первом этапе необходимо детальное исследование гетерогенности популяции' патогена, выявление клонов, характеризующихся наибольшей агрессивностью и-вирулентностью.

■ * 2. Для характеристики агрессивных свойств возбудителя фузарио-за томатов достоверными оказались методы: '

- определение активнойти пектолйтических ферментов в экзометаболи-тах гриба Я.охуорогшв Г. 1усорег81с1,

- определение биосинтеза фузариевой кислоты,

- определение сходства ме.-эд клонами и штаммами из разных популяций серологическим методом ,

- морфолого-культуральные признаки возбудителя фузариозного увядания томатов ,

- фятопатологические тесты для определения фитотоксичности энзо-ферментов и патогещюсти гриба.

3. Клон АКб выделен из штамма АК52 /ленинградского/ и являлся самым агрессивным, вирулентным, имэадим высокую фитотоксичность и был испольжован для оценки на устойчивость и в биотехнологических работах. . .

4. Изучение -динамики накопления токсина /фузариевая кислота/ и

■гидролитических ферментов показало необходимость использования для биотехнических целей суммарных метаболитов гриба.

5. На втором этапе из изученных методов экслрэсс-диагностк;;л .устойчивости томатов к фузариозу наиболее достоверным оказался фе-нольный метод /основан на сопоставлении способности сортов активизировать синтез фенодьных соединений в ответ на заражение/.

- 6. По возможности диагностирования апробированные методы находятся в следующем порядке:

- фитопатологический метод определения устойчивости,

- фенолышй метод для диагностики устойчивости,

- серологический метод для определения сходства между белками гриба и белками семян томатов,

- определение устойчивости по степени потери и восстановления тур-гора у сортов томатов при помещении растений в культуральную жидкость патогена,

• - определение методом электрокондуктометрии и прямого титрования проницаемости клеточных мембран.

7. Отобрано 10 сортов томатов из' индийских и советских коллекций, песпективных для улучшения степени устойчивости, методом клеточной селекции. -

8. .В третьем этапе разработана схема для проведения отбора устойчивых каллусов и регенерантов на селективном фоне /содержащих обцие метаболиты патогена/. .'

9. При сравнительном изучении селективных факторов-установлена важная роль экзометаболитов гриба F.oxysporuai f. lycoperslcl в присутствии фузариевой кислоты в селекции томатов по устойчивости к фузариозу и показано их фштогоксическое действие в отсутствии •

. фузариевой кислоты. ' ■

10. Установлена роль ингибитора трипсина в культуральном фильтрате клонов AKg й AKj_ гриба F.oxysporum f. -lycoperatoi ' и подтверждена второстепенная фитотоксическая роль фузариевой кислоты в патогенезе фузариозного увядания томатов.

Iii Разработана.формула определения интенсивности /продуктивности/' каллусогенеза. •

12. ■ Показана возможность использования фенольного метода как экспресс-метода диагностики устойчивости в стадиях каллусов.

: ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

В иммунологических- работах с целью повышения устойчивости сортов томатов к фуэариозному вмлту рекомендуется:

1. Изучить популяции гриба рода Fusarium oxjßporum f. lyco-persici и выделить агрессивные и вирулентные клоны для создания высокоактивного селективного агента для селекции томатов на устойчивость in vitro . /клоны возбудителя фузариоза томатов AKj_ и AKg, выделенные из популяции AKgg -. Ленинград-89, переданы в музей чистых культур ВНИИСХМ. '

2. Использовать фенольный метод определения активизации синтеза фенольных .соединений в ответ на заражение для ускорения диагностики устойчивости у сортов томатов.

3. Применять разработанную схему клепочной селекции для повышения устойчивости у перспективнее сортов томатов к F« oxysporum

f. lycopersiciH использовать я.кзометаболиты клонов гриба F.oxysporum f. lycopersici с фузарнезой кислотой как селективным .• фактором в процессе селекции in-vitro .' . •

4. Испрльзовагь разработанную формулу для определения интенсивности /продуктивности/ каллусогенеза /\\J и использовать ф>ецольный метод для ускоренного, анализа степени устойчивости у селекционируемых каллусов и регенерантов.

•Методические подходы к иммунологическому обоснованию селекции растений на устойчивость к болезням разработаны на разных культу- " pax, в том числе томатах, в ВИЗР ./Ленинград/., были доложены в Италии, Швеции и будут в дальнейшем использованы в Индии. .

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ.РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1. Панда Кумар Р. Ускоренные метод« диагностики устойчивости тома-

тов к фузариозу.//Материалы конференции молодых ученых "Экологические проблемы защиты растений". Ленинград, 21-24 ноября 1990 г. С. 285.

2. Handa Капах R., Guseva Я.Я. Kapid techniques to evaluate resis-

tance to fueariosis in tooato eultivara. Materials presented In the XXIII international horticultural congress,' Florence, Italy, 27 lug. to I Sep. 1990."

3. Иванова O.C.', Панда Кумар P. Использование патогенов в селекции

на устойчивость к болезням.//Тезисы докладов Всесоюзной научно-технической конференции молодых ученых. Одесса, 22-26 апреля 1991 г. С. 103.

4, Nanda Kumar H., Ivanova O.C. Perspectives of mathematical

planning la biological experiments. Paper presented la the International Symposium on Plant Biotechnology and its . 4 contribution to plant development multiplication and improvement. Geneva, Ewitzreland, 19-20 April, 1991, So 269.

5. Eonda Kumar H., Ivaaova O.C., Guseva Н.Я. In-vitro induction

of,morphogenesis in tomatos using harmone-difflcient medium.' Abstracts of the paper presented in the 8ТИ International "Protoplast Symposium, Uppsala, Sweden, 16-20 June, 1991. Physiologia Plantarum 82(I)«AI-A42. 6. Панда К/пар .P. Перспективы экспресс-цетодов диагностики устойчивости в селекции сортов тоиатсв.//Тезиса докладов IX всесоюзного совещания по иммунитету растений к болезням и вредителям. Минск, сентябрь 1991 г. Т.П. С. 237.