Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Закономерности гидролиза легумина вики эндогенными протеиназами

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, До Нгок Лань, 0

1. ВВЕДЕНИЕ

2. МОБИЛИЗАЦИЯ ЗАПАСНЫХ БЕЛКОВ В ПРОРАСТАЮЩИХ СЕМЕНАХ БОБОВЫХ (обзор)

2.1. Краткие сведения о запасных легумино- и вици-линоподобных белках

2.2. Закономерности протеолиза запасных белков

2.3. Ферменты, осуществляющие мобилизацию запасных белков II

2.3.1. Протеиназы, гидролизующие нативные запасные белки (протеиназы А)

2.3.2. Протеазы, гидролизующие запасные белки, модифицированные в процессе прорастания семян

2.3.3. Протеазы, участвующие в завершающих этапах распада запасных белков

2 .4. Действие протеолитических ферментов на запасные белки

2.4.1. Гидролиз запасных белков эндогенными протеиназами

2.4.2. Гидролиз запасных белков экзогенными протеиназами

2.4.3. Обобщение результатов исследования гидролиза запасных белков

2.5. Возможные механизмы мобилизации легумина в прорастающих семенах вики

2.6. О единстве основных закономерностей мобилизации запасных белков в семенах двудольных

3. МАТЕРИМЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

3.1. Материалы

3.2. Определение активности протеолитических ферментов

3.3. Определение степени гидролиза белков

3.4. Последовательный и одновременный гидролиз легумина-Т трипсином и карбоксипептидазой С

3.5. Определение белка

3.6. Выделение протеолитических ферментов

3.7. Электрофорез

3.8. Другие методы

4. ОЧИСТКА И ЧАСТИЧНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ПРОТЕИНАЗЫ В

4.1. Очистка протеиназы В

4.2. Частичная характеристика протеиназы В

5. ЗАКОНОМЕРНОСТИ ПРОТЕОЛИЗА ЛЕГУМИНА

5.1. Гидролиз легумина трипсином

5.2. Гидролиз легумина протеиназой А

5.3. Последовательный гидролиз легумина протеиназами

А и В

5.4. Действие карбоксипептидазы С на продукты частичного гидролиза легумина протеиназами

Введение Диссертация по биологии, на тему "Закономерности гидролиза легумина вики эндогенными протеиназами"

В последнее десятилетие достигнуты значительные успехи в изучении механизмов мобилизации запасных белков (ЗБ) в прорастающих семенах и ферментов, осуществляющих этот процесс. Это обусловлено повышенным интересом исследователей к ЗБ семян вообще - как резерву для восполнения белкового дефицита в питании и как удобному модельному объекту при изучении двух диаметрально противоположных процессов обмена внутриклеточных белков - биосинтеза и катаболизма.

В семенах бобовых идентифицированы основные протеазы, осуществляющие мобилизацию ЗБ, разработаны методы очистки некоторых из них, установлена последовательность их действия /35, 177/.

Однако, закономерности расщепления ЗБ каждым из этих ферментов остаются невыясненными. Между тем, исследование характера гидролиза ЗБ эндогенными протеиназами in vitro очевидно, является необходимым дальнейшим этапом выяснения механизмов мобилизации ЗБ в прорастающих семенах. Такое исследование и явилось целью настоящей работы. Разработан метод очистки протеиназы В из прорастающих семян вики, изучены некоторые ее свойства. Получены высокоочищенные препараты протеиназ А и В и частично очищенный препарат карбоксипептидазы С. Изучен гидролиз легумина вики под действием этих эндогенных ферментов и трипсина. Это позволило установить ряд закономерностей распада ЗБ в прорастающих семенах.

Научная новизна и практическая ценность работы. Разработан метод получения хроматографически и электрофоретически однородного препарата протеиназы В, получены данные о ее субстратной специфичности.

Установлены типы протеолиза запасного белка под действием трипсина и эндогенных протеиназ. Показаны два этапа гидролиза легумина трипсином: последовательный ("zipper») тип протеолиза на первом этапе сменяется "поодиночным" ("опе-Ъу-опе") на втором. Гидролиз легумина протеиназой А имеет смешанный характер. Протеиназа В "поодиночно" расщепляет легумин, модифицированный протеиназой А.

Показано, что природными субстратами карбоксипептидазы С являются преимущественно промежуточные продукты расщепления легумина протеиназами А и В.

Полученные в работе экспериментальные данные вносят вклад в установление закономерностей мобилизации ЗБ в прорастающих семенах бобовых и других двудольных. Сведения о типах протеолиза легуминоподобных белков под действием трипсина и эндогенных протеиназ позволят установить рациональный уровень воздействия протеиназ при ферментативной модификации функциональных свойств белковых изолятов из семян, используемых для приготовления новых форм высокобелковой пищи.

На защиту выносятся следующие положения:

1. Однородный по данным хроматографии и электрофореза препарат протеиназы В, не содержащий примеси других протео-литических ферментов, может быть получен по схеме, включающей хроматографию на ДЭАЭ-целлюлозе, ковалентную хроматографию на Hg-сефарозе и гель-фильтрацию.

2. Расщепление легумина в прорастающих семенах вики, осуществляемое протеиназами А и В, происходит преимущественно по "поодиночному" механизму.

3. Различия в общем характере действия на легумин протеи-назы А, трипсина и, вероятно, ряда других экзогенных протеиназ определяется, главным образом, различиями в соотношении скоростей последовательного и "поодиночного" процессов.

4. Высокомолекулярный остаток легумина, обнаруживаемый в прорастающих семенах, представляет собой конечный продукт его превращений как белка. Продукты дальнейшего гидролиза, имеющего исключительно "поодиночный" характер, уже являются пептидами.

5. Основными природными субстратами карбоксипептидазы С являются промежуточные продукты расщепления ЗБ эндопептидаза-ми. Вклад карбоксипептидазы С в мобилизацию ЗБ на разных стадиях развития этого процесса определяется, главным образом, соотношением карбокси- и эндопептидазной активностей в прорастающих семенах.

Настоящая работа выполнялась в проблемной лаборатории химии белка Кишиневского государственного университета им. В.й.Ленина в связи с плановой темой "Исследование белков семян культурных растений, разработка основ повышения их качества и методов получения белковых изолятов для пищевых целей" (номер госрегистрации 8I0I2I94).

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", До Нгок Лань, 0

6. Заключение

Полученные в настоящей работе экспериментальные данные о ходе гидролиза легумина in vitro протеиназами А и В и яарбо-ксипептидазой С позволяют сделать ряд заключений о закономерностях мобилизации этого ЗБ in vivo.

Расщепление легумина в процессе прорастания семян вики обусловлено преимущественно "поодиночным" его протеолизом, поскольку обе эндопептидазы, участвующие в мобилизации ЗБ, гидролизуют легумин "поодиночно" - протеиназа А преимущественно, а протеиназа В - практически исключительно. Одновременно протекает и последовательный гидролиз легумина, но под действием только протеиназы А. Последовательный процесс заключается в отщеплении пептидов (как коротких, так и крупных, осаждаемых ТХУ) и расщеплении кислых субъединиц на крупные фрагменты, удерживаемые в молекуле частично гидролизованного белка как с участием, так и без участия дисульфидных связей. В соответствии с нашими данными об изменении молекулярной массы легумина при гидролизе протеиназой А, количество мобилизуемого в результате последовательного гидролиза белка (весовое количество отщепившихся пептидов) не превышает 15% от его исходного содержания. В связи с участием в гидролизе легумина протеиназы В реальный вклад последовательного процесса в мобилизацию легумина, очевидно, еще меньше.

Весьма вероятно, что в A3 прорастающих семян вики содержатся и другие протеиназы, участвующие в мобилизации ЗБ. Однако, по литературным данным /177/, такие протеиназы (если они есть) не действуют ни на нативный легумин, ни на высокомолекулярный остаток, образующийся in vivo под действием протеиназы А, и, следовательно, могут включаться в процесс мобилизации, гидролизуя лишь промежуточные продукты "поодиночного" расщепления легумина протеиназами А и В и ускоряя, таким образом, этот процесс.

Итак, высокомолекулярный остаток легумина, обнаруживаемый in vivo представляет собой конечный продукт его превращений как белка. Продукты дальнейшего гидролиза, имеющего исключительно "поодиночный" характер, уже являются пептидами.

Мобилизация легумина в прорастающих семенах вики инициируется протеиназой А, модифицирующей его отщеплением в начале последовательного процесса I или 2 коротких пептидов /37/. Дальнейшее расщепление модифицированного легумина осуществляется совместным действием протеиназ А и В. По мере развития последовательного гидролиза легумина протеиназой А вклад протеиназы В в его расщепление увеличивается, поскольку увеличивается скорость "поодиночного" гидролиза легумина последней.

Свободные аминокислоты, являющиеся конечным продуктом распада ЗБ, образуются в связи с участием в этом процессе эк-зопептидаз и, вероятно, пептидаз. Поскольку экзопептидазы со-' держатся уже в покоящихся семенах, очевидно, что скорость образования не только пептидных, но и конечных продуктов распада ЗБ определяется уровнем активности эндопептидаз А и В.

Существенный вклад в образование конечного продукта распада ЗБ, по всей вероятности, вносят карбоксипептидазы. Как показано в разделе 5.4, основным природным субстратом карбоксипептидазы С могут быть не столько конечные, сколько промежуточные продукты расщепления ЗБ эндопептидазами. Участие карбоксипептидазы в гидролизе этих промежуточных продуктов, очевидно, определяется соотношением скоростей их гидролиза карбокси- и эндопептидазами. Чем ниже активность эндопепти-даз, тем успешнее карбоксипептидаза С может конкурировать с последними в гидролизе пептидов, тем крупнее пептиды, которые карбоксипептидаза может гидролизовать вплоть до образования трипептидов, тем меньше при этом образуется ди- и три-пептидов, являющихся субстратами аминопептидаз и пептидаз, и поэтому тем меньший вклад могут гнести последние в мобилизацию ЗБ.

Таким образом, на начальных этапах развития процесса мобилизации ЗБ, когда активность эндопептидаз еще невысока, свободные аминокислоты образуются, вероятно, преимущественно в результате действия карбоксипептидазы. По мере увеличения активности эндопептидаз все большее значение приобретает действие аминопептидаз и пептидаз. Количественно оценить относительный вклад карбокси- и аминопептидаз в мобилизацию ЗБ на разных стадиях этого процесса пока не представляется.возможным. Укажем лишь, что по литературным данным /37,177/ через 4 дня прорастания, когда расщепление суммарного белка в семядолях вики уже достигло максимальной скорости, активность карбоксипептидазы С даже по белковому субстрату почти на порядок превышает суммарную активность протеиназ А и В.

7. ВЫВОД Н

1. Получен хроматографически и электрофоретически однородный препарат протеиназы В из прорастающих семян вики. В А- и В-цепях инсулина протеиназа В расщепляет лишь связи, образованные карбоксильной группой аспарагина.

2. При действии трипсина на легумин вики начальный протео-лиз имеет последовательный характер ("zipper") а дальнейший - "поодиночный" ("опе-Ъу-опе").

3. При действии протеиназы А на легумин последовательный и "поодиночный" протеолиз происходят параллельно с преобладанием "поодиночного" процесса.

4. Расщепление протеиназой В легумина, частично гидролизо-ванного протеиназой А, имеет практически только "поодиночный" характер. Значительную часть конечных продуктов гидролиза составляют крупные пептиды.

5. Последовательный процесс гидролиза легумина определяется, главным образом, его структурой, протекает сходным образом при действии протеиназы А и трипсина и заключается в отщеплении от кислых субъединиц пептидов (как коротких, так и крупных, осаждаемых ТП) и расщеплении кислых субъединиц на фрагменты, удерживаемые в молекуле частично гидролизованного белка как с участием, так и без участия дисульфидных связей. В отличие от кислых, основные субъединицы легумина гидролизуются только "поодиночно".

6. Карбоксипептидаза С может успешно конкурировать с протеиназами А и В в гидролизе пептидов, являющихся промежуточными продуктами действия этих эндопептидаз на запасные белки.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, До Нгок Лань, 0, Кишинев

1. Белозерский М.А., Дунаевский Я.Е. Начальные превращения главного запасного белка в прорастающих семенах гречихи. -Биохимия, 1983,т.48,Ш,с.508-511.

2. Белозерский М.А., Дунаевский Я.Е., Воскобойникова Н.Е. Наличие в семенах гречихи ингибитора собственного протео-литического фермента. -Докл. АН СССР, 1982,т.264,М,с.991-993.

3. Белозерский М.А., Емпева И.Б., Курсанова Т.А. Выделение и свойства протеолитического фермента из семян гречихи. -Докл. АН СССР, 1973,т.209,$5,c.I2I5-I2I8.

4. Белозерский М.А., Дунаевский Я.Е., Руденская Г.Н., Степанов В.М. Карбоксильные протеиназы из семян гречихи. -Биохимия, I984,т.49,$3,с.479-485.

5. Бульмага В.П. Очистка и изучение физиологической роли про-теазы А прорастающих семян вики. -Дис. . канд. биол. наук. -Кишинев, 1983, -139 с.

6. Бульмага В.П., Шутов А.Д. Частичная очистка и характеристика протеазы А прорастающих семян вики, гидролизующей на-тивные запасные белки. -Биохимия, 1977,т.42,№П,с.1983-1989.

7. Вайнтрауб И.А. Исследование глобулинов семян бобовых. -Дис. . докт. биол. наук. -Кишинев, 1970. -421 с.

8. Вайнтрауб И.А. Четвертичная структура запасных, белков семян бобовых. -В кн.: Растительные белки и их биосинтез. М.: Наука, 1975,с.142-152.

9. Ю. Вайнтрауб И.А., Нгуен Тхань Туен. О четвертичной структуре легумина вики. -Молекул, биол., 1971,т.5,ЖЕ,с.59-67.

10. Горпинченко Т.В., Вакар А.Б., Кретович В.Л. Исследование протеиндисульфидредуктазы пшеницы, -Биохимия, 1975,т.40, 1§2, с.323-330.

11. Гофман Ю.Я., Вайнтрауб И.А. О применении электрофореза на бумаге для проверки однородности белков. -Биохимия, I960, т.25,$6,с.1049-1054.

12. Дженн Р.К., Амен Р.Д. Что такое прорастание? -В кн.: Физиология и биохимия покоя и прорастания семян, М.: Колос, 1982,с.19-46.

13. До Нгок Лань, Шутов А.Д., Вайнтрауб И.А. Действие трипсина на легумин вики: семена типов протеолиза. -Биохимия, 1985,т.50,(в печати).

14. До Нгок Лань, Шутов А.Д., Вайнтрауб И.А. Гидролиз легумина эндогенными протеиназами. -Биохимия, 1985,т.50,в печати).

15. Дунаевский Я.Е., Белозерский М.А., Элпидина Е.Н. Протеиназа семян гречихи, гидролизующая главный запасный белок этих семян.-Биохимия, 1983,т.48,№4,с.572-576.

16. Дюкянджиев С.В., Саянова O.B.i Вайнтрауб И.А., Шутов А.Д. Распад запасных белков и протеолитическая активность в прорастающих семенах фасоли. -Изв. АН МССР, сер. биол. хим. наук. 1980,$2,с.48-51.

17. Иордан А.Т., Белозерский М.А. Свойства и субстратная специфичность протеиназы из семян гречихи. -Биохимия, 1976,т.41,М,с.673-678.

18. Колодзейская М.В., Пилявская А.С. Дептидазы. -Киев: Наукова думка, 1982, -176 с.

19. Кретович В.Л. Белковый обмен высшего растения. -В кн.: Совещание по белку: сб. докл. 5-й конф. по высокомоле-кул. соедин. М.-Л.: АН СССР, 1948,0.239-256.

20. Локшина Л.А. Реакции ограниченнго протеолиза и их регу-ляторное значение. -Усп. биол. химии, 1977,т.18,с.162-184.

21. Маурер Г. Диск-электрофорез. -М.: Мир, 1971, -247 с.

22. Попов М.П., Карпиленко Г.П. Исследование кислых протеаз ячменя и ячменного солода. -Прикл. биохим. микровиол., 1974,т.10,№2,с.301-305.

23. Попов М.П., Карпиленко Г.П. Свойства кислой протеиназы ячменя. -Прикл. биохим. микробиол., 1975,т.II,№5,с.757-759.

24. Попов М.П., Карпиленко Г.П., Глинская Е.Н. Исследование продуктов протеолиза альбуминов и белков эндосперма ячменя кислой протеиназой ячменя. -Прикл. биохим. микробиол. 1976,т.12,Ш,с.438-441.

25. Скаженник М.А., Гумилевская Н.А., Куваева Е.Б., Кретович вич В.Л. Электрофоретический анализ компонентного составасуммарного белка семядолей семян гороха. -Прикл. биохим, микробиол., I981,т,17,№6,с.918-926.

26. Степанов В.М. Протеолитические ферменты структуры, функциональные особенности, эволюция. -В кн.: Химия про-теолитических ферментов. Матер. П Всесоюзн. сими. Углич, 1979,с.3-6.

27. Степанов В.М. Эволюция протеолитических ферментов. -В кн.:1У Всесоюзный биохимический съезд. Тез. докл. М.: Наука, 1979,с.37-38.

28. Тахтаджян А.Л. Происхождение и расселение цветковых растений. Л.: Наука, 1970, -147 с.

29. Толстогузов В.Б. Искусственные продукты питания. -М.: Наука, 1978, -231 с.

30. Хавкин Э.Е. -В кн.: Физиология семян. -М.: Наука, 1982, с.275-310.

31. Шварц B.C., iiiyTOB А.Д., Вайнтрауб И.А. Хроматографичес-кое выделение и аминокислотный состав легумина и вици-лина кормовых бобов. -Биол. науки, 1968,№12,с.99-106.

32. Щутов А.Д. О модификации запасных белков при прорастании семян вики. -Изв. АН МССР, сер. биол. хим. наук, 1976,№5,с.20-26.

33. Шутов А.Д., Бульмага В.П., Бодцт Э.К., Вайнтрауб И.А. Исследование модификации белков семян вики при прорастании и ограниченном протеолизе. -Биохимия, I981,т.46, №5,с.841-850.

34. Щутов А.Д., Бульмага В.П., Болдт Э.К., До Егок Лань, Вайнтрауб И.А. Роль ограниченного протеолиза запасных белков семян в их распаде при прорастании. -В кн.: Химия протеолитических ферментов. Матер. Д Всесоюзн. симп., Углич, 1979,с.93-94.

35. Шутов А.Д., Вайнтрауб И.А. Первоначальные изменения запасных белков при прорастании семян вики. -Физиол. растений, I973,т.20,№3,с.504-509.

36. Шутов А.Д., Вайнтрауб И.А. Дротеолиз запасных белков в. прорастающих семенах бобовых растений. -В кн.: Механизмы усвоения азота и биосинтеза белка в растениях. Матер. Всесоюзн. симп., Алма-Ата, I981,с.33-34.

37. Шутов А.Д., До Нгок Лань, Вайнтрауб И.А. Очистка и частичная характеристика протеазы В из прорастающих семян вики. -Биохимия, 1982,т.47,№5,с.814-821.

38. Щутов А.Д., Королева Т.Н., Вайнтрауб И.А. Об участии протеаз покоящихся семян вики в распаде запасных белков при прорастании. -Физиология растений, 1978,т.25,№4,с.735-742.

39. Щутов А.Д., Королева Т.Н., Нгуен Тхи Хонг Хань, Вайнтрауб И.А. Дротеаза прорастающих семян вики, гидролизуюг щая нативные запасные белки. -Докл. АН СССР, 1976,т.231, №4,c.I0I0-I0I3.

40. Abe М., Arai S.,Pu;jimaki М. Purification and characterization of a protease occuxing in endosperm of germinating corn. fAgric. Biol. Chem., 1977,v.41,H5,p.893-899.

41. Abe M., Arai S., Pujimaki M. Substrate specifity of a sulfhydryl protease purified from germinating corn. -Agric. Biol. Chem., 1978,v.42,N10,p.1813^1817.

42. Ainouz I.b., Benevides N.B., Preitas A.L.P. Proteolytic activities in seeds of Vigna unguiculata.(b.) Walp. -Biol. Plant., 1981,v.23,N2,p.133-140.

43. Ashton P.M. Mobilization of storage proteins of seeds. -»Ann. Rev. Plant Physiol., 1976,v.27,p.95-117*

44. Ashton P.M., Dahmen W.J. A partial purification and characterization of two aminopeptidases from Cucurbita maxima cotyledons. -Phytochem., 1967,v.6,N5,p.641-653.

45. Ashton P.M., Dahmen W.J. Purification and characterization of a dipeptidase from Cucurbita maxima cotyledons. -Phytochem.,1967,v.6,U9,p.1215-1225.

46. Ashton P.M., Dahmen W.J. Purification and characterization of an aminotripeptidase from Cucurbita maxima cotyledons. -Phytochem., 1968,v.7,N2,p.189-197.

47. Barret A.J. Human cathepsin B1. Purification and someproperties of the enzyme. -Biochem. J., 1973»v.131$I4, p.809-822.

48. Basha S.M.M., Beevers' Ь. The development of proteolytic activity and protein degradation during the germination of Pisum sativum L. -Planta, 1975,v.124,Fl,p.77-87.

49. Basha S.M.M., Cherry J.P. Proteolytic enzyme activity and storage protein degradation in cotyledons of germinating peanut (Arachis hypogaea L.) seeds. -J. Agric. Pood Chem., 1978,v.26,N1,p.229-233.

50. Baumgartner В., Chrispeels M.J. Partial characterization of a protease inhibitor which inhibits the major endo-peptidaSe present in the cotyledons of mung bean. -Plant Physiol., 1976,v.58,Fl,p.1~6.

51. Baumgartner В., Chrispeels M.J. Purification and characterization of vicilin peptidohydrolase,the major endo-peptidase in the cotyledons of mung-bean seedlings. -Eur. J. Biochem., 1977,v.77,H2,p.223-233.

52. Baumgartner В., Tokuyasu K.T., Chrispeels M.J. localization of vicilin peptidohydrolase in the cotyledons of mung bean seedlings by immunofluorescence microscopy. -J. Cell Biol., 1978,v.79,N1,p.10-19.

53. Baxter E.D. The use of hordein fractions to estimate proteolytic activity in barley and malt. -J. Inst.

54. Brew., 1976,v.82,H4,p.203-208.

55. Baxter E.D. Purification and properties of malt carboxypeptidases attacking hordein, -J. Inst, Brew.,1978,v.84,H5,p*271~275.

56. Baxter E.D., Booer C.D., Wainwright I. Degradation of hordein by the proteolytic enzymes of barley and malt. -J. Inst. Brew., 1978,v»84,11,p.30-33.

57. Bewley J.D., Black M. Physiology and biochemistry of seeds in relation to germination. I. Development, germination, and growth. -Berlin etc.; Springer, 1978. -306 p.

58. Beynon R.J. Protein modification and the control of intracellular protein degradation. -Ins The enzymology of posttranslational modification of proteins. Uew-Xorkj Acad. Press, 1980,p.363-385.

59. Bond H.M., Bowles D»J# Characterization of soybean en-dopeptidase activity using exogenous and endogenous substrates. «Plant Physiol., 1983,v.72,12,p.345-350.

60. Bradford M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of pritein utilizing the principle of protein-dye binding. -Analyt. Biochem., 1976,v.72,H1-2,p.248-254»

61. Brinegar A.C., Peterson D.M. Synthesis of oat globulin precursors. Analogy to legume 11S storage protein synthesis. -Plant Physiol., 1982,v.70,N6,p.1767-1769.

62. Brinegar A.C., Peterson D.M. Separation and characterization of oat globulin polypeptides. -Arch, Biochem. Biophys., 1982,v.219,N1,p.71-79.

63. Burger W.C.,Multiple forms of acidic endopeptidase fromgerminated barley. -Plant Physiol», 1973,v.51,N6, p.1015*1021.

64. Chrispeels M.J., Bollini H., Harris N. Biosynthesis, accumulation and catabolism of reserve proteins in legume seeds. -Ber. Dtsch. Bot. Ges., 1980, B.92,H2-3, S.535-551.

65. Chrispeels M.J., Boulter D. Control of storage protein metabolism in the cotyledons of germinating mung beans: role of endopeptidase. -Plant Physiol., 1975,v*55,N6, p.1031-1037.

66. Collier M.D., Murray D.R. beucylf-naphthylamidase activities in developing seeds and seedlings of Pisum sativum L. -Aust. J. Plant Physiol., 1977,v.4,H4,p.571-582.

67. Croy R.R.D., Gatehouse J.A., Evans M.J., Boulter D. Characterization of the storage protein subunits synthesisea in vitro by polyribosomes and RNA from developing pea (Pisum sativum Ь.). I. begumin. -Planta,1980, v.148,111,p.49-56.

68. Daussant J., Neucere N.J., Conkerton E.J. Immunochemical studies on Arachis hypogaea proteins with particu-larreference to the reserve proteins. II. Protein modification during germination. -Plant Physiol.,1969, v. 44, M, p.480-484.

69. Dechary J.M., Talluto К.P., Evans W.J., Carney W.,B., Altschul A.M. оС-conarachin. -Nature, 1961,v.190,N4781, p#1125-1126.

70. Derbyshire E., Wright DvJ., Boulter D. begiimin and vi~ cilin, storage proteins of legume seeds. -Phytochem., 1976,v.15,N1,p.3~24.

71. Dieckert J.W., Dieckert M.C. The comparative anatomy of the principal reserve proteins of seeds. -In: Seed Proteins of Dicotyledonous Plants: Proc. Symp. Gaters-leben, 1977. -Abhand. Akad. Wiss. DDR, Abt. Mathem. Naturwiss. Technik, 1970,N4,pЛЗ-86.

72. Doi E., Komori N., Matoba Т., Morita Y, Some properties of carboxypeptidases in germinating rice seeds and rice leaves. -Agric. Biol. Chem., 1980,v.44,N1, p.77-84.

73. Doi E«, Zomori N., Matoba 2., Morita Y. Purificationand some properties of a carboxypeptidase in rice bran. -Agric. Biol. Chem., 1980,v.44,FI,p.85«92.

74. Doi E., Shibata D., Ш-toba Т., Yonezawa D. Evidence for presence of two types of acid proteinases in germinating seeds of rice. -Agric. Biol. Chem., 1980,v.44,112, p.435-436.

75. Doi E., Shibata D., Matoba Т., lonezawa D.Characterisation of pepstatin-sensitive acid protease in resting rice seeds, -Agric. Biol. Chem., 1980,v.44,H4,p.741-747.

76. Elleman I.C. Aminopeptidases of pea. -Biochem. J., 1974,v.141,lT1,p.113-118.

77. Feller U., Soong T.S.T., Hageman R.H. Patterns of proteolytic enzyme activities in different tissues of germinating corn (Zea mays b.). -Planta, 1978,v.140,H2,p.155-162.

78. Fujimaki f£., Abe M., Arai S. Degradation of zein during germination of corn. -Agric. Biol. Chem., 1977,v.41,H5, p.887-891.

79. Ganesh Kumar K., Venkataraman L.V. Chickpea seed proteins: modification during germination. -Phytochenu, 1978,v.17,N4,p.605-609.95* Ganesh Kumar K., Venkataraman L.V., Appu Hao A.G.

80. Chickpea seed proteins: oonformotional changes in 10.3S protein during germination. -J. Agric. Pood Chem., 1980,v.28,H3,p.518-524.

81. Garg G.K., Virupaksha Т.Е. Acid protease from germinated sorgum. II. Substrate specifity with synthetic peptides and ribonuclease A. -Eur. J. Biochem., 1970,v.17, Ш1,p.13-18.

82. Gatehouse J.A., Croy R.R.D., Morton H., Tyler M., Boulter D. Characterization and subunit structures of the vicilin storage proteins of pea (Pisum sativum Ъ). -Eur. J. Biochem., 1981,v.118,N3,p.627-633.

83. Gilroy J., Wright D.J., Boulter D. Homology of basic subunits of legumin from Glycine max and Vicia faba. -Phytochem., 1979,v.18,p.315-316.

84. Gray W.E., Hartley B.S. A fluorescent end-group reagent for proteins and peptides. -Biochem. J., 1963,v.89,Fl, P.59P-.

85. Нага I., Matsubara H. Pumpkin (Cucirbita sp.) seed globulin. Y. Proteolytic activities involved in globulin degradation in ungerminated seeds. -Plant Cell Physiol., 1980,v.21,N2,p.219-232.

86. Harris N., Chrispeels M.J. Histochemical and biochemical observations on storage protein metabolism and protein body autolysis in cotyledons of germinating mung beans. -Plant Physiol., 1975,v.56,N2,p.292-299.

87. Harris N., Chrispeel M.J., Boulter D. Biochemical and histochemical studies on protease activity and reserve protein metabolism in the cotyledons of germinating cowpeas (Vigna unguiculata). -J. Exp. Bot., 1975,v.26,1. N95,p.544-557.

88. Hatch M.D., Turner J .P . A protein disulphiae reductase from pea seeds. -Biochem. J., 1960,v.76,N3,p.556-562.

89. Holzer H., Heinrich P.O. Control of proteolysis. -Ann. Eev. Biochem., 1980,v.49,p.63-91.

90. Humphreys I. Cytoplasmic pH of maize scutellum cells. -Phytochem., 1982,v.21,N9,p.2165-2171.

91. Huystea R.B. van. A study on the degradation of arachin by proteolytic enzymes. -Canad. J. Bot., 1973,v.51, N11,p.2217-2222.

92. Ihle J.N., Dure l.S. The developmental biochemistry of cottonseed embryogenesis and germination. I. Purification and properties of a carboxypeptidase from germinating cotyledons. -J. Biol. Chem., 1972,v.247,N16,p.5034-5040.

93. Ihle J.N., Dure b.S. The developmental biochemistry of cottonseed embryogenesis and germination. II. Catalytic properties of the cotton carboxypeptidase. -J. Biol.

94. Chem., 1972,v.247,N16,p.5041-5047.

95. Ihle J.N., Dure b.S. The developmental biochemistry of cottonseed embryogenesis and germination. III. Regulation of the biosynthesis of enzymes utilized in germination. -J. Biol. Chem., 1972,v.247,Fl6,p.5048-5055.

96. Ingle J., Bageman R.H. Metabolic changes assoiated with the germination of corn. III. Effects of gibbere-llic acid on endosperm metabolism. -Plant Physiol.,1965,v.40,N4,p.672-675.

97. Jacobsen J.V., Varner J.E. Gibberellic acid-induced synthesis of protease by isolated aleurone layers of barley. -Plant Physiol., 1967,v.42,Fl 1,p.1596-1600.

98. Kamata I., Kikuchi M., Shibasaki K. Non-dissociative small fragments of glycinin-T. -Agric. Biol. Chem., 1980,v.44,N3,p.575-580.

99. Kamata Y., Kimigafukuro J., Shibasaki K. Limited tryp-tic degradation of urea denatured glycinin. -Agric. Biol. Chem., 1979,v.43,N9,p.1817-1823.

100. Kamata Y., Otsuka S., Sato M., Shibasaki K. Limited proteolysis of soybean beta-conglycinin. -Agric. Biol. Chem., 1982,v.46,N11,p.2829-2834.

101. Kamata Y., Shibasaki K. Degradation sequence of glycinin by tryptic hydrolysis. -Agric. Biol* Chem.,1978, v.42,N11,p.2103-2109.

102. Kamata Y., Shibasaki K. formation of digestion intermediate of glycinin. -Agric. Biol. Chem., 1978,v.42, N12,p.2323-2329.

103. Kang S.-M., Matsui H.,. Titus J.S. Characteristics and activity of proteolytic enzymes in apple leaves duringautuninal senescence. -Plant Physiol., 1982,v.70,N5, p.1367-1372.

104. Kern R., Chrispeels M.J. Influence of the axis on the enzymes of protein and amide metabolism in the cotyledons of mung bean seedlings. -Plant Physiol., 1978, v.62,N5,p.815-819.

105. Kloz J., Turkova V., Klozova E. Proteins found during maturation and germination of seeds of Phaseolus vulgaris L. -Biol, plant., 1966,v.8,N2,p.164-173.

106. Kolehmainen b., Mikola J. Partial purification and enzymatic properties of an aminopeptidase from barley. -Arch. Biochem. Biophys., 1971,v.145,N2,p.633-642.

107. Korolyova T.N., Shutov A.D., Taintraub I.A. The actioji of the proteolytic enzymes of dry vetch seeds on their own reserve proteins. -Plant Sci. betters, 1975,v.7, N5,p.309-313*

108. Kruger J.E., Preston K. The distribution of carboxy-peptidases in anatomical tissues of developing and- germinating wheat kernels. -Cereal Chem., 1977,v.54,N1,p.167-174.

109. Kruger J.E., PrestonK.R.Changes in aminopeptidases of wheat kernels during growth and maturation. -Cereal Chem., 1978,v.55,N3,p.360-372.

110. Kubota Y., Shoji S., Motohara K. Purification and properties of a prolidase from germinating soybeans,-J. Pharm. Soc. Jap., 1977,v.97,N1 ,p.111-115.

111. Kubota Shoji S., Yamanaka Т., Yamato M. Carbxypep-tidases from germinating soybeans. I. Purificatin and properties of two carboxypeptidases* -J* Pharm. Soq. Jap., 1976,v.96,N5,p.639-647.

112. Kubota Y., Shoji S., Yamanaka Т., Yamato M. Carboxypep-tidases from germinating soybeans. II. Stability and some kinetic and chemical properties of carboxypeptida-ses. -J. Pharm. Soc. Jap., 1976,v.96,N-|2,p.1421-1425.

113. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage 14. «Nature, 1970,v.227,N5259,p.680-685.

114. Ma I., Bliss F.A., Hall f.C. Peptide mapping reveals considerable sequence homology among the three polypeptide subunits of G1 storage protein from french bean seed. -Plant Physiol., 1980,v.66,15,p.897-902.

115. Melchner V.,• Varner J.E. Protein release by barley aleurone layers. -J. Inst. Brew., 1971,v.77,N5,p.456-462.

116. Mikola J. Activities of various peptidases in cotyledons of germinating peanut (Arachis hypogaea). -Physiol. Plant., 1976,v.36,H3,p.255-258.

117. Mikola J. Functions of different plant peptidases ingerminating seeds. -In: Seed Proteins of Dicotyledonous Plants: Proc. Symp. Gatersleben, 1977. -Abhand. Akad. Wiss DDR, Abt. Mathem. laturwiss. lechnik, 1979,U4, p.125-132.

118. Mikola J. Proteinases, peptidases and inhibitors of endogenous proteinases in germinating seeds. -In: Seed Protein, Ann. Proc. Phytochem. Soc. Eur., 1983,N4,p.241-252.

119. Mikola J., Enari I.M. Changes in the contents of barley proteolytic inhibitors during malting and mashing.-J. Inst. Brew., 1970,v.76,N2,p.182-188.

120. Mikola J., Kolehmainen L. Localization and activity of various peptidases in germinating barley. -Planta, 1972, v. 104,112,p. 167-177.

121. Mikola J., Pietola K., Enari T.M. The role of malt carboxypeptidases in the liberation of amino acids mashing* «In? European Brewery Convention: Proc. 13th Congr. 'Amsterdam: Elsevier, 1972,p.21-27.

122. Millerd A. Biochemistry of legumA seed proteins. -Ann. Rev. Plant Physiol., 1975,v.26,p.53-72.

123. Muntz Km, Baumlein H., Bassuner R., Manteuffel R., Puchel M., Schmidt P., Wobus U. Regulation von Biosyn-these und Akkumulation der Reserveproteine Wahrend der Entwicklung pflanzlicher Samen. -Biochem. Physiol. Pflanzen, 1981 ,B . 176, N5,S.401-422.

124. Nielsen N.C., Moreira M., Staswick P., Hermodson M.A., Turner N., Thanh I.E. The structure of glycinin from soybeans. «In: Regulation of Protein Biocynthesis and Degradation During Embryogenesis and Germination of Plant

125. Plant.Seeds: Proc. 2nd Symp. on seed proteins, Gaters-leben, 1980. -Abhand. Akad. Wiss. DDR, Abt. Mathem. Naturwiss. Technik, 1981,N5,p.73-91.

126. Nielsen S.S., biener I.E. Degradation of the major storage protein of Phaseolus vulgaris during germination. Role of endogenous proteases and protease inhibitors. -Plant Physiol., 1984,v.74,N3,p#494-498.

127. Ninomiya £., Tanaka S., Kawata S., Makisumi S. Purification and properties of an aminopeptidase from seeds of Japanese apricot. -J, Biochem., 1981,v.89,FI,p.193-201.

128. Nowak J., Mierzwinska T. Activity of proteolytic enzymes in rye seeds of different ages. -Z. Pflanzenphysi-ol., 1978,v.86,Fl,p.15-22.

129. Ozawa Y., Suzuki К», Mogi K. Automated measurement of proteolytic enzymes. -Analyt. Biochem., 1971,v.43,N1, p.15-24.

130. Palmiano E.P., Juliano B.O. Biochemical changes in the rice grain during germination. -Plant Physiol., 1972, v.49,N5,p.751-756.

131. Pernollet J.C. Protein bodies of seeds: ultrastructure, biochemistry, biosynthesis and degradation. -Phytochem., 1978,v.17,N9,p.1473-1480.

132. Peterson D.M. Subunit structure and composition of oatseed globulin. -Plant Physiol., 1978,v.62,N4,p.506-509.

133. Preston K.R., Dexter J.E., Kruger J.E. Relation shipof exo- and endoproteolytic activity to storage protein hydrolysis in germinating durum and hard red spring wheat. -Cereal Chem., 1978,v.55,N6,p.877-888.

134. Preston K.R., Kruger J.E. Purification and properties of two proteolytic enzymes with carboxypeptidase activity in germinating wheat. -Plant Physiol., 1976,v.58, N4,p.516-520.

135. Preston K.R., Xruger J.E. Physiological control of exo-and endoproteolytic activities in germinating wheat and their relationship to storage protein hydrolysis. -Plant Physiol., 1979,v.64»N3,p.450-454.

136. Pusztai A., Croy R.R.D., Grant G., Watt W.B. Compart-mentalization in the cotyledonary cells of Phaseolus vulgaris b. seedsj a differential sedimentation study. -New Phytol.,1977,v.79,N1 ,p.61 -71.

137. Ramana Т., Radhakrishnan T.M. Acid protease in germinated bajra (Pennisetum typhoides). -Indian J. Biochem. Biophys., t977,v.14,FI,p.49-51.

138. Ray b.E. barge scale isolation and partial characteri- . vzation of some carboxypeptidases from malted barley. -Carlsberg Res. Commun., 1976,v.41,U4,p«169~182.

139. Reilly C.C., 0*Kennedy B.T., Titus J.S., Splittstoes-ser W.E. The solubilization and degradation of pumpkin seed globulin during germination. -Plant Cell Physiol., 1978,v.19,K7,p.1235-1246.

140. Romero J., Ryan D.S. Susceptibility of the major storage protein of the bean, Phaseolus vulgaris b., tothe in vitro enzymatic hydrolysis. -J. Agric. Pood Chem., 1978,v.26,N4,p.784-788.

141. Rupley J.A. Susceptibility to attack by proteolytic enzymes. -In: Methods in Enzymology. New-York, London: Acad. Press, 1967,v.11,p.905-917.

142. Ryan C.A. Proteolytic enzymes and their inhibitors in plants. -Ann. Rev. Plant Physiol., 1973,v.24,p.173-196.

143. Salmia M.A. Proteinase activities in resting and germinating seeds of Scotspine, Pinus sylvestris, -Physiol. Plant., 1981,v.53,N1,p.39-47.

144. Salmia M.A*, Mikola J.J. localization and activity of a carboxypeptidase in germinating seed of Scotspine, Pinus sylvestris. -Physiol. Plant., 1976,v.36,N4, p.388-392.

145. Salmia M.A., Mikola J.J. Localization and activity of naphthylamidases in germinating seeds of Scotspine, Pinus sylvestris. -Physiol. Plant., 1976,v.38,N2,p.73-77.

146. Shutov A.D., Bulmaga V.P., Vaintraub I.A. Protease Afrom germinating vetch seeds: purification by affinity chromatography and study of substrate specifity. -Bio-chem. Physiol. Pflanzen, 1983,v.178,p.191-196,N3.

147. DDR, Abt. Mathem. Haturwiss. Technik, 1979»H4,p.145-158.

148. Sopanen T. Purification and partial characterization of a dipeptidase from barley. -Plant Physiol., 1976,v.57, N6,p.867-871.

149. Sopanen I. Development of peptide transport activity in barley scutellum during germination. -Plant Physiol.,1979,v.64,N4,p.570-574.

150. SopanenT., Mikola J. Purification and partial characterization of barley leucine aminopeptidase. -Plant Physiol., 1975,v.55,U5,P«809-814.

151. Studier F.W. Analyses of bacteriophage T7 early RNAs and proteins on slab gels. -J. Mol. Biol., 1973,v.79, N2,p.237-248.

152. Sundblom И.О., Mikola J. On the nature of the proteinases secreted by the aleurone layer of barley grain. -Physiol. Plant., 1972,v.27,H3,p.281-284.

153. Sze H., Ashton P.M. Dipeptidase development in cotyledons of Cucurbita maxima during germination. -Phyto-chem., 1971,v.10,U12,p.2935-2942.

154. Tully R.E., Beevers H. Proteases and peptidases of castor bean endosperm. Enzyme characterization and changes during germination. -Plant Physiol., 1978,v.62, N5,p.746-750.

155. Vaintraub I,A., Bassuner E., Shutov A.D. The action r trypsin and chymotrypsin on the reserve proteins of some leguminous seeds. -Nahrung, 1976,v.20,N8/9,p.763-771.

156. Weber E., Neumann D. Protein bodies, storage organelles in plant seeds. -Biochem. Physiol. Pflanzen, 1980,v.175,N4,p.279-306.

157. Wilden W. van der, Gilkes N.E., ChrispeelsM.J. The endoplasmic reticulum of mung bean cotyledons. Eole in the accumulation of hydrolases in protein bodies during seedling growth. -Plant Physiol., 1980,v.66,N3,p.390-394.

158. Wilden W. van der, Herman E.M., Chrispeels M.J. Protein bodies of mung bean cotyledons as autophagic organelles. Proc. Natl Acad Sci. USA, 3980,V.77,N1,p.428-432.

159. Woods K.E., Wang K.T. Separation of dansylamino acidsby polyamide layer chromatography. -Biochim. Biophys. Acta, 1967,v.133,N2,p.369-370.

160. Yabuuchi b., Doi E., Hata I. Studies on malt carboxy-peptidases. -Nippon Nogei Kagaku Kaishi, 1972,v.46,N11, p.591-596.

161. Yabuuchi S., Doi E., Hata T. The mode, of action of carboxypeptidase from malt. -Agric. Biol. Chem.,1973, v.37,N3,p.687-688.

162. Yomo H#, Srinivasen K. Protein breakdown and formation of protease in attached and detached cotyledons of Phaseolus vulgaris b. -Plant Physiol., 1973,v.52,N6, p.671-673.

163. Yomo H., Varner J.E. Control of the formation of amylases and proteases in the cotyledons of germinating peas. -Plant Physiol., 1973,v.51,N4,p.708-713.