Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Металлопротеиназа семян гречихи. Характеристика и регуляция активности

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Металлопротеиназа семян гречихи. Характеристика и регуляция активности"

Р 8 0 5 Н

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА, ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М. В. ЛОМОНОСОВА

БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи

УДК 577.152.34

ВОСКОБОЙНИКОВА Наталья Ефимовна

МЕТАЛЛОПРОТЕИНАЗА СЕМЯН ГРЕЧИХИ. ХАРАКТЕРИСТИКА И РЕГУЛЯЦИЯ АКТИВНОСТИ

(03.00.03 — молекулярная биология)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва, 1988

Работа выполнена в Межфакультетской проблемной научно-исследовательской лаборатории молекулярной биологии и биоорганической химии им. А. Н. Белозерского МГУ.

Научный руководитель: доктор биологических наук М. А. Белозерский

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук,

профессор, зав. лабораторией В. В. Мосолов

кандидат химических наук Н. И. Ларионова

Ведущая организация — Институт физиологии растений АН СССР

Защита состоится « б » 1988 г. в /Г^асов

на заседании специализированного совета Д 053.05.70 при Московском государственном университете им. М. В. Ломоносова по адресу: 119899, Москва, Ленинские горы, МГУ, Биологический факультет.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ.

Автореферат разослан « О » <мсис 1988 г.

Ученый секретарь специализированного совета кандидат химических наук

В. Н. Каграманов

;: ОБдАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Важность всестороннего изучения протеолитических ферментов определяется тоц ролью, которую они играют в регуляции разнообразных процессов внутриклеточного метаболизма. Однако, в силу многих причин о цротеазах растешм известно сейчас значительно меньше, чем о протеолитических ферментах нивотных и бактерий. В то же время, получение лротеоди-тических ферментов растений в высокоочищенном виде, знание их свойств и выяснение их физиологических функций имеют большое значение для понимания механизмов синтеза белка в растениях, транспорта белков, механизмов запасания и утилизации белков при прорастании семян и т.д.

Одним из ключевых процессов метаболизма растения является лротеолиз запасных белков при прорастании семян. Имеющиеся сейчас данные указывают на то, что основную роль в этом процессе (главным образом, у бобовых) играет цистеиновые протеиназы, синтезируемые de novo при прорастании се;лян ( shutov and vaintraub, 1987). В ряде случаев соответствующие цистеиновые протеиназы были выделены из семян в высокоочищенном виде и подробно охарактеризованы (Щутов а др., 1976, 1978; Baumgartner, Chrlapeels, 1977).

Вместе с тем, в последнее время в литературе появились отдельные указания на присутствие в покоящихся семенах некоторых растений металлопротеиназ, такге способных участвовать в гидролизе запасных белков (нага, Matsubara, I9gQ; БеЛОЗеРСК&Й и др., 1983, Bond, Bowies, 1983). Однако, сведения об этих протеича-зах немнбгочисленны, в высокоочищенном виде они не выделялись, отсутствуют данные о механизме регуляции их активности.

Цель и- задачи исследования. Целью' настоящей работы было изучение мэталлопротеиназы покоящихся семян гречихи и ее роли в протеолизе главного запасного белка се1дян гречихи - I3S глобулина при прорастании.

В соответствии с этим были поставлены и репались следующие экспериментальные задачи:

1. Ввделевие в высокоочищенном состоянии препарата метал-лопротеинази из покоящихся, семян гречихи.

2. Изучение физико-химических свойств, природы активного центра, субстратно! специфичности выделенной ыеталлопротенназы.

3. Изучение в-гутриклеточной локализации и возможных меха-

- z -

низмов регуляции активности металлопротеиназы при прорастании секян гречихи.

Научная новизна и практическая ценность. Впервые из высших растений (семена гречихи) получен гомогенный препарат металлопротеиназы, изучены его физико-химические свойства, природа функциональных групп активного центра, субстратная специфичность и сделано заключение о возможной физиологической роли.

Показано, что ыеталлопротеиназа осуществляет ограниченный протеолиз главного запасного белка семян гречихи - I3S глобулина на первой стадии деградации этого белка при прорастании семян.

Из покоящихся семян гречихи получен высокоочищенный препарат ингибитора металлопротеиназы, изучены его свойства,.изменение активности при прорастании.

Установлено, что, как ыеталлопротеиназа, так и ингибитор этого фермента локализованы преимущественно в белковых телах -внутриклеточных органеллах, служащих местом отлогения главного запасного белка - I3S глобулина.

Проведенные исследования позволили сделать заключение о том, что в покоящихся семенах гречихи существует регуляторная система "протеиназа - ингибитор - субстрат", контролирующая начальный этап протеолиза главного запасного белка семян гречихи-ISS глобулина при прорастании семян.

Разработанные методы препаративного выделения металлопротеиназы и ингибитора семян гречихи могут быть использованы для получения аналогичных белков из других растительных объектов.

Выводы диссертационно! работы о существовании в семенах гречихи регуляторяой системы "протеиназа - ингибитор - субстрат" имеют значение для общего понимания механизмов метаболизма белков и регуляции активности ферментов у растений.

Апробация работы. Материалы диссертации были долсаены на ■ 16-ой конференции Федерации европейских биохимических обществ (Москва, 1984), на 18-ой конференции молодых ученых Биологического факультета МГУ (Москва, 1987) и на научной конференции молодых ученых Межфакультетской проблемной научно-исследовательской лабораторш им. А.Н.Белозерского, посвященной 70-летию Октября (Москва, 1987).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 2 печатные работы.

Структура и объем работы. Диссертация излоаена на 154 страницах машинописного текста, содержит 30 рисунков, таблиц и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследойашя, изложения результатов и их обсуждения, выводов и списка цитированной литературы (268 наименование, из них 60 на русской языке).

Список использованных сокращений

БСА - бычий сывороточный альбущн

ДЦС - додецалсульфат

Д© - динитрофенил ■

ДТТ - датиотрейтол

ДФФ - диизопропилфтор^осфат

ДЭАЭ - диэтилашноэтил

2-МЭ - 2-меркапроэтанол

ПААГ - полиакрилашдный гель

ПХМБ - п-хлорйеркурибензоат

ТНБС - 2,4,6-тринитробензолсульфокпслота

ЭДТА этилендиакинтетраацетат

ААС - атошо-абсорбционная спектроскопия

{ДАТЕШАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В работе использовали семена гречихи ра^орукит езои1вг\1ит сорта Большевик и Шатиловская 5.

Определение протеолитической активности по отношении к 135 глобулину семян гречихи, гемоглобину, БСА и легумшгу семян вики проводили методом тринитрофенилирования с использованием ТНБС

(НаЬееЬ, 1966).

Протеолитическую активность по отношению к Д®-теурапепти-дам и к ДО-ала-ала-лиз определяли по методу Люблинской и др. (1377).

Протеолитическув активность по расщеплению казеина определяли по методу Ансопа (апзоп, 1эзз).

Протеолитическую активность по расщеплению азокодла определяли спектрофотометрически при длине волны 520 км <Yoshida,

Nöda, 1965).

Протеолитпческую активность по расщеплению карбобензокси-гли-фен определяли методом тринитрофенилирования (наьееь, гэбб).

Выделение I3S глобулина из свегеразмолотых семян гречихи проводили с помощью фракционирования ацетоном и гель-фильтрации на сефарозе 6В. Чистоту полученного препарата контролировали с помощью электрофореза в ПААГ.

Концентрацию белка в растворах определяли по методу Лоури ( Lowry et al, 1951) и по измерению оптической плотности при 280 нм. .

Электрофорез белков в ПААГ проводили в нативных условиях при pH 8,9 Í Davis , 1964), a тшсхе в присутствии ДДС натрия ( Laeitimii , 1970). В работе использовали аналитический вариант электрофореза.

Афюинную хроматографию проводили на колонке с трипсин-се-фарозой 4В.

Высокоэффективную жидкостную хроматографии проводили на колонке MOHOS HR 5/5 ("Pharmacia", Швеция).

Изозлектрофокусирование белков проводили в колонке типа LXB-8100 по методу Хаглунда (Hugiund , 1Э67). Градиент pH 4-6 создавали с помощью ам^олинов.

Молекулярную массу белков определяли методами гель-фильтрации (Andrews , 1965) и электрофореза в ПААГ в присутствии ДДС натрия ( Laemmii , 1970) с использованием белков-маркеров xw Kit ("Pharaacia", Швеция).

Концентрирование разбавленных растворов белков проводили в ячейках для ультрафильтрации на мембранах УМ-5, УМ-10 и ХМ-30 при давлении азота 3 атм.

Определение Шд-концевых аминокислот проводили дансильным • методом р последующей идентификацией методом тонкослойной эфо-матографии на полиамидных пластинках (Gray, Hartfej, 1963).

РЕЗУЛЬТАТУ И ОБСУЖДЕНИЕ

Выделение и изучение металлопротеиназы покоящихся семян гречихи

Разработанный наг® мётод выделения металлопротеиназы включал семь стадий очистки: экстракцию, осаздение сульфатом аммония при 80^-ном насыщении, гель-филЬтрацию на сефарозе 6В, ионообменную хроматографию на ДЭАЭ-Тойоперл 650М, гель-фильтрацшо на ультрогеле АсА54, ионообменную хроматографию и рехроматографию на MohoS .

В результате выделения был получен препарат фермента, очищенный в 1000 раз с выходом 3,4% (табл. I). При электрофорезе в присутствии ДДС натрия препарат протеиназы давал одну полосу (рис. I).

Молекулярная масса протеиназы, определенная методом гель-фильтрации на сефадексе Г-150, составляла 39000, а методом электрофореза в присутствии ДДС натрия и 2-МЭ - 34000.

Исходя из полученных данных, можно заключить, что молекула фермента не имёет четвертичной структуры и состоит из одной полипептидной цепи.

Величина изоэлектрической точки, по данным изоэлектрофоку-сировалшя, была больше 10.'

_ Оптимум активности фермента по расщеплению эндогенного субстрата - I3S глобулина находятся при рй 8,2. Это значение близко к величине рй оптимума металлопротеиназы семян сои - 8,0 ( Bond, Bowies, 1983), но выше рН оптимума металлопротеиназы семян тыквы - 6,0 (нага, Matsubara, 1980).. Следует отметить, что для многих изученных металлопротеиназ бактерий и животных характерен рН оптимум в слабощелочной области.

Для выяснения природы функциональных групп активного центра выделенной протеиназы проводился ингибиторный анализ. Было показано, что ингибиторы металлопротеиназ - ЭДТА, о-фенантролин, цин-коя - подавляли активность фермента на 100$. в то время как ингибиторы сериновых протеиназ - ]Щ и аспартильных протеиназ - пенс-татин не оказывали влияния на активность фермента, а ингибитор цистеиновых протеиназ - ПХМБ инактивировал протеиназу йа 20$ (табл. 2).

Таблица I

Очистка глеталлопротеиназы покоящихся семян гречихи

! Белок, ! Активность 'Выход,! Степень

| т ! общая, [удельная,| * } очистки | | ед. | ед. }

Зтапы очистки

Экстракция и осаэде-ние сульфатом аммония

Гель-фильтрация на сефарозе 6В

Хроматография на ДЭАЭ-Тойоперл

Гель-фильтрация на ультрогеле АсА54

Хромат ографФШ на Моно

10500 420 210 7

31500 13440 87360 . 3150

0,03 3000

3,0 32,0 416 450 3000

100 3,6 3,4

1,0 10,7 138,7 150,0 1000,0

М,

94000 67000

43000 30000

38 900

Рис. I. Электрофорез в ПЛАТ с ДДС натрия очищенного препарата металлопро-теиназы покоящихся семян гречихи.

20100 -

Таким образом, полученные данные по блеянию ингибиторов на активность изучаемого фермента указывают на его принадлежность к классу металлопротеиназ.

Анализ на наличие ионов металла, проведенный с помощью метода ААС показал, что фермент содержат ионы цинка. Расчеты по-

Таблица 2 Действие ингибиторов на активность металлопротеиназы семян гречихи

Реагенты | Концентрация, М | Ингибированпе, 7=

ЭДТА о 10 " 100

Цинкон Ю-3 100

I,10-фенантролин Ю-3 100

ГШ® 2 х КГ4 20

JM 8,5 х Ю-4 0

Пепстатин 1,6 х ПГ4 0

зволлли установить, что на I моль фермента приходится 1,23 моля цинка.

В ходе дальнейшей работы изучалось действие ЭДГА и некоторых двухвалентных катионов металлов на активность металлопротеиназы. Препарат металлопротеиназы, отдиализованный в течение 1618 ч последовательно против буфера, содержащего 10 ЫА ЭДГА, и против буфера без ЭДТА, полностью шгактпвировался. Анализ с помощью метода ААО показал, что ингкбировадше ферментативной активности не сопровождается удалением ионов цинка из. препарата фермента.

Опыты по изучению действия ионов кальция,'кобальта, магния • и цинка на активный фермент показали, что в присутствии этих катионов не наблюдается дополнительной стабилизации ж активации металлопротеиназы по отношения к нативному 13S глобулину. В то яе время активность предварительно заингибнровзлкого ЭДГА фетаента полностью восстанавливалась при добавлении к нему -I мМ Щ I ыЦ Со2+ ила 0,1 мМ Zn2"*". Это позволяет' считать, что экзогенные катионы магния, кобальта и цинка конкурируют с ионом цинка, содержащимся в молекуле протеиназы, за связывание с ЭДГА, что приводит к восстановлению активности ферлента.

Изучение субстратной специфичности металлопротеиназы с использованием в качестве субстрата окисленной B-цепи инсулина показало, что фермент гидролпзует пептидные связи, образованные

- ö -

аминогруппами лейцина, тирозина и, возможно, фенилалашша (рис. 2). Далее проводились опыты по гидролизу Д®-тетрапептадов, различающихся предпоследним аминокислотный остатком. Из 3-х использованных субстратов (ДНФ-гли-гли-мет-арг, ДШ>-гли-гли-вал-арг и ДО-гли-гли-иле-арг) металлопротеиназа .гидролизовала только ДНФ-гли-гли-мет-арг, причем расщеплялась связь, в образовании которой принимала участие аминогруппа метиояина (-гли^мет-). Эти данные указывает на то, что не любая связь, в образовании которой принимает участие аминогруппа гидрофобной аминокислоты, может расщепляться ферментом.

Полученные результаты могут свидетельствовать о том, что изучаемая протеиназа обладает довольно узкой специфичностью и рас-, щепляет связи, образованные аминогруппами некоторых ароматических и гидрофобных аминокислот, что характерно для металлопротеиназ .животного и бактериального происхождения.

5 I 10

Фен-Вал-Асн-Глн-Гисчйей-ЦисЗОзН-Глм-Сер-Гис-

Л5 | } 20

Дей-Вал-Глу-АлаАЛей1-ТирЧ[ей-Вал-Цис50зН-Гли-

j i 25 i 30

Глу-Арг-Гли-Фен-Фен-Тирь-Тре-Про-Лиз-Ала

Рис. 2. Первичная структура B-цепи; стрелкой указаны преполагаеше места разрывов пептидных связей после гидролиза металлопротеиназой.

Данные по субстратной специфичности были дополнены результатами опытов по действии металлопротеиназы на различные белковые субстраты.

Препарат протеиназы не расщеплял такие белковые субстраты, обычно используемые для определения протеолитической активности, как ВСА и гемоглобин, и осуществлял ограниченный протеолиз эндогенного субстрата - I3S глобулина и запасного белка семян вики - IIS легушна, который заключался, в основном, в расщеплении высокомолекулярных субьединиц этих белков (рис. За). Активность " протеиназы .резко возрастала по отношению к денатурированным I3S

глобулину и легушну и проявлялась по отн^лению к денатурированным БСА и гемоглобину (табл. 3), причем при гидролизе денатурированных легушна и I3S глобулина наблюдалась утрата специфичности /и расщеплялись практически все субъединицы этих белков (рис. 36).

На основании полученных данных модно заключить, что ограниченный протеолиз неденатурировакньсх растительных запасных белков и отсутствие активности по отношению к белкам животного происхождения определяется не только узкой субстратной специфичностью ферлента (природой аминокислотных остатков, образующих расщепляемую связь), но и особенностями пространственной структуры этих белков.

Таблица 3.

Действие металлопротеиназы на белковые субстраты

Субстраты ; Степень расщепления, %

1 ■ ; неденатурированные j денатурированные

ЕСк 0 27,2

гемоглобин 0 25,6

легумин 16 Д 180,0

13S глобулин 28,2 100,0

За 100$ активности принимали степень расщепления денатурированного 138 глобулина.

Металлопротезназа покоящихся семян гречихи осуществляет ограниченный протеолиз 13 Б глобулина: Анализ электрофоре грамм 13Б глобулина до и после его инкубации с препаратом ферлента показал, что фермент расщепляет высокомолекулярные, субъедошщ 135 глобулина с образованием более шзкоиоле.кулярных фрагментов (рис. 4а).

■ Действие металлопротеиназы приводит к изменении электрофо-ретической подвияности 138 глобулина, -что видно на электрофорег-pai.ii.iax после электрофореза в натнвных условиях (рис. 46).

Рис. 3. Электрофорез в ПААГ с ДДС натрия

а) неденатурированннх и б) денатурированных легушша (А) и I3S глобулина (Б): I, 3 - до гидролиза и 2, 4 - после гидролиза металлопротеиназой.

Препараты 13S глобулина, выделенного из семян гречихи на 3-й день прорастания и полученного после обработки металлопротеиназ ой, практически идентичны (рис. 4). Поэтому можно считать, что модификация 13 S глобулина in vitro в присутствии металяо-протеиназы происходит и tn vivo.

В связи с этим представляют интерес опыты по изучению совместного действия металлопротеиназы и цистеиновой протеиназы семян гречихи HaI3S глобулин.

В нашей лаборатории была получена иэ прорастающих семян гречихи цкстеиновая протеиназа, которая гидролизовала только I3S глобулин из семян, отобранных на 3-й день прорастания, и не действовала па 13S глобулин из покоящихся семян. Однако, эта цистеино-вая протеиназа полностью гидролизовала и I3S глобулин из покоящихся семян гречихи, предварительно модифицированный ыеталлопро-

А б

Рис. 4. Электрофорез в ПААГ (А) в отсутствие и

(Б) в присутствии ДДС натрия 138 глобулина I - до -инкубации и 2 - после инкубации с металлопротеиназой. ' • .

3-135 глобулин из .3-х дневных семян гречихи.

теиназой (рис". 5).

Таккы образом, имеющиеся данные позволяют предполагать, что металлопротеиназа покоящихся семян гречихи подвергает 135 глобулин первичной модификации путем 'ограниченного протеолиза на первом этапе утилизации запасных белков при прорастании семян гречихи. По основным физико-химическйл свойствам, строению активного центра, характеру инст'бирования и субстратной специфичности она обнаруживает сходство с другими металлопротеиназами аивотного и бактериального происхождения.

Выделение и изучение ингибитора металлопротеиназы семян гречихи

Большой интерес представляет вопрос о механизме регуляции активности протеаз растений под действием белковых ингибиторов.

Рис. 5. Денс'итограмш 135 глобулина после электрофореза в НААГ в отсутствие МС натрия: 1 I - исходного; 2 - после обработки ыеталлопротеиназой; 3 - после расщепления цистеи-новой протеиназой.

Однако, четких данных на этот счет пока нет. Большая часть работ, посвященных этой проблеме, была выполнена на экстрактах. Имеется работа (сЬг1зреа1з, 1976), в которой из семян маша был получен в высокоочищенном виде ингибитор вицилишгептидгидролазы - фермен-га, действующего на собственный запасной белок. Последующее исследование показало, что эта протеиназа и ее ингибитор имеют различ- . зую внутриклеточную локализацию и поэтому ингибитор, видимо, не участвует в регуляции активности этого фермента.

В ходе нашей работы были получены данные о существовании в юкоящихся семенах гречихи ингибитора, подавляющего активность мследуемой металлопротеиназы. В связи с этим представляло интерес зыделить этот ингибитор из семян гречихи и изучить его физико-хи-гаческие свойства.

В результате была разработана схема очистки ингибитора, со-. ¡тоящ&ч из следующих этапов: экстракция;

!. осаждение сульфатом аммония при 80#-ном насыщении; !. хроматография на трипсин-сефарозе 4В;

хроматография на ДЭАЭ-целлюлозе ДЭ-52; >. изоэлектрофокусирование в градиенте рН 4-6.

О' чистоте препарата в ходе выделения судили д помощью анали-■ического электрофореза в 1ШГ (рис. 6). В результате выделения ¡ыл получен высокоочищенный препарат ингибитора, которое на 'лектрофореграмме (рис. 6) соответствовали I основная и 3 минор-не зоны. Этот препарат подавлял активность металлопротеиназы, а ■акже иягибировал на.21% активность трипсина и на 14$ - активность имотрипсина.

Молекулярная масса ингибитора составляла около 10000.

Изозлектрическая точка ингибитора, определенная с помощью зоэлектрофокусирорания, была приблизительно равна 5,0.

После инкубации в присутствии пепсина при рН 2,2 в течение 4 ч при 37° С препарат ингибитора переставал действовать на ме-аллопротеиназу и трипсин, тогда как в контрольном препарате (без бработки пепсином) активность-по отношению к этим ферментам со-раняласъ полностью.

Опыты по инактивации ингибитора пепсином свидетельствуют о ом, что он имеет белковую природу.

Изучаемый ингибитор был стабилен при рй 2,2 в течение 24 ч

- imm

¿iim S3 ЕЯ ш

ESI ш Eu ш КЩ »mi

ESS

1 2 3

Рис. 6. Схема электрофореграмм препарата ингибитора

после электрофореза в ЦААГ в натавных условиях:

1 - после хроматографии на трипсин-сефарозе;

2 - после хроматографии на ДЭАЭ-целлшозе;

3 - после изоэлектрофокусирования.

при 37°С. Препарат ингибитора также выдерживал кипячение в течение 10 мин без потери активности.

Данные по стабильности ингибитора говорят -о высокой степени устойчивости молекулы этого белка к денатурирующим воздействиям, что, видимо, объясняется жесткостью ее глобулярной структуры. Такая стабильность,- как известно из лит.ературы, является важным от-, личительным признаком практически всех белковых ингибиторов про-теиназ растительного происхождения (-Richardson, 1977).

Инактивацию металлопротеиназы семян-гречихи по отношению к I3S глобулину препаратом ингибитора контролировали с помощью электрофореза в ШАГ в присутствии и в отсутствие ДДС натрия. Из электрофореграмм (рис. 7) видно, что металлопротеиназа, обработанная препаратом ингибитора, в отличие от'контроля, не изменяет электрофоретическую подвижность I3S глобулина и не расщепляет высокомолекулярные субъединицы этого белка.

Опыты по действию ингибитора на активность других металло-ферыентов показали', что, .кроме металлопротеиназы семян гречихи, полученный 'препарат ингибитора шактивировая также карбоксипепти-дазу Т ЕЗ Thermoactlnomyces vulgaris . Z Метайлопротеиназу ИЗ

12 3

.Рис. 7. Электрофорез в ПААГ (А) в отсутствие и (Б) в присутствии МО натрия 13 Б глобулина: I - до инкубации с металлопротеиназой; 2'- обработанного металлопротеиназой; -3 - обработанного металлопротеиназой в . присутствии препарата ингибитора.

Ьед1опе11а рпешюрМ1а (табл. 4).

Таким образом, из покоящихся семян гречихи был выделен белковый препарат ингибитора эндогенного.протеолитического фермента -металлопротеиназы'.

Регуляция активности металлопротеиназы сешш гречихи .

В связи с обнаружением ингибитора дальнейшая работа была посвящена выяснению его возможной роли в регуляции активности металлопротеиназы.в процессе прорастания семян гречихи.

Как уже говорилось выше, для решения вопроса о возможности

Таблица 4

Действие препарата ингибитора метаялопротеиназы семян гречихи на некоторые металлоферменты

Металлоферменты * Ингибированае, %

Металлопротеиназа семян гречихи 100 Карбоксилептидаза Т ИЗ Thermoactlnornyces

vulgaris 80

Металлопротеиназа ИЗ Legionella pneuroophilla 44

Коллагеназа из ciostriaivun hystoiiticum 0

Карбоксипептидаза А из бычьего панкреаса 0

взаимодействия фермента и его ингибитора in vivo необходимы сведения об их внутриклеточной локализации.

Поскольку 13S глобулин при созревании семян откладывается в белковых телах клеток семядолей семян гречихи, было проведено исследование по определению активности метаялопротеиназы и ее ингибитора в этих органеллах. Для работ использовали препараты белковых тел и взятой в качестве контроля цитоплазмы, полученные ■в нашей лаборатории Е.Н.Элпидиной из клеток семядолей семян гречихи методом фракционирования в безводной среде. Полученные дан-Htíe показали, что как металлопротеиназа, так и ее ингибитор локализованы в белковых телах' (табл. 5).

Таблица 5

Наличие активности метаялопротеиназы семян гречихи • и ингибитора метаялопротеиназы во фракциях ■ белковых тел и цитоплазмы

Внутриклеточная фракция j Уд. активность j ферлента j Уд. активность { ингибитора

Белковые тела Цитоплазма 1,37 1,03 14,23 . 3,36

Локализация металлопротеиназы, ее природного субстрата - 138 глобулина и ее ингибитора в одних и тех же внутриклеточных органел-лах - белковых телах указывает на возможность существования в семенах гречихи регуляторной системы "протеиназа - ингибитор -субстрат", играющей важную роль в утилизации запасных белков при прорастании семян. •

Это подтверждается также данными по изменению протеолитичес-

ДНИ ПРОРАСТАНИЯ

Рис. 8. Изменение А - протеолитичесйой активности и Б - активности ингибитора в процессе прорастания семян гречихи.

кой активности и активности ингибитора во время прорастания семян гречихи (рис. 8), которые свидительствуот о тсхл, что увеличение протеолитической активности к первому дню прорастания коррелирует с уменьшением активности ингибитора.

По-видимому, в покоящихся семенах металлопротеиназа находит-

ся в виде неактивного комплекса с ингибитором. При изменении физиологических условий в начале прорастания комплекс распадается и металлопротеиназа подвергает ограниченному протеолизу 135 глобулин.

Для выяснения возможного механизма взаимодействия ингибитора и фермента и причин распада образущегося комплекса изучалось действие на комплекс двухвалентных ионов некоторых металлов.

При обработке комплекса ингибитора - металлопротеиназы

Рис. 9. Расщепление денатурированного 135 глобулина белковым экстрактом покоящихся семян гречихи: * - в присутствии 7x10"^ М Са2+; л - в присутствии Ю-2 М М^2*; • - в присутствии 3,7x10-3 М Са2*; а - без добавления ионов металлов.

I мМ 'I мМ Сог+ и ОД мМ гп2+ происходило расщепление 138 глобулина, тогда как в присутствии комплекса ингибитора и металлопротеиназы, не обработанного катионами металлов, гидролиза 135 глобулина не наблюдалось. На основании этих данных можно предполагать, что экзогенные ионы металлов конкурируют с молекулой металлопротеиназы за связывание с молекулой ингибитора. Из этого следует, что ингибитор может инактивировать металлопротеиназу по типу хелаторов ионов металлов, взаимодействуя с ионом цинка в активном центре молекулы фермента.

По данным Соколова (1984), в белковых телах семян гречихи содержатся значительные количества разнообразных ионов металлов. При набухании семян в начале прорастания катионы двухвалентных металлов могут оказывать дестабилизирующее воздействие на комплекс металлопротеиназа-ингибитор, способствуя его диссоциации и активируя, таким образом, фермент.

В пользу такого предположения говорят результаты опытов по действию экзогенных двухвалентных катионов металлов на протеоли-тическу» активность экстракта семян гречихи, где, по всей вида- ' мости, ингибитор и металлопротеиназа существуют в виде комплекса. Добавление ионов кальция и магния приводит к значительному возрастанию активности металлопротеиназы, по-видимому, в результате вытеснения ингибитора из комплекса (рис. 9).

ВЫВОДЫ

1. Из семян высших растений впервые получен в гомогенном состоянии препарат металлопротеиназы, осуществляющей ограниченный протеолиз главного запасного белка.

2. Показано наличие в покоящихся семенах гречихи ингибитора металлопротеиназы, белковой природы,. который получен в высокоочи-щенном состоянии.

3. Изучены свойства металлопротеиназы и ингибитора, их в;1ут-риклеточная локализация и изменение активности_в процессе прорастания семян гречихи. '

4. Полученные данные указывают на существование в семенах гречихи регуляторной систеш протеолиза "фермент - ингибитор -субстрат", участвующей в деградации главного запасного белка семян гречихи при прорастании.

По материалам диссертация опубликованы следующие работы:

I. Белозерский 1,1.А., Дунаевский Я.Е., Воскобойникова Н.Е. Наличие в семенах гречихи ингибитора собственного протеолитичес-кого фермента.- Докл. АН СССР, 1982, т. 264, & 4, с. 991-993.

2. Белозерский 1.1. А., Дунаевский Я.Е., Воскобойкикова Н.Е. Регуляция протеолиза главного запасного белка в прорастающих семенах гречихи.- В сб.: 16-я конференция ФЕБО, Тез. докл.- М., 1984, с. 176.