Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Явление лизогении у Pseudomonas pseudomallei и сравнительная характеристика мелиоидозных фагов

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Явление лизогении у Pseudomonas pseudomallei и сравнительная характеристика мелиоидозных фагов"



'Г".

I'. ■

На правах рукописи

ГРИШИНА Татьяна Александровна

ЯВЛЕНИЕ ЛИЗОГЕШШ У РЗЕ1Ю0М0!1ЛЯ РЗЕШЮМАИЕ1 И СРАВНИТЕЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА МЕЛИСЩГОНЫХ ФАГОВ

03.00.07 - микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

I". Саратов - 1996

- £ -

Работа выполнена в Волгоградском научно-исследовательском противочумном институте.

Научные руководители:доктор медицинских наук,профессор В.И. ИлюХ1 кандидат медицинских наук, старший научный сотрудник Л.К. Меринова

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук,

профессор Н.М. Остроумова, кандидат медицинских наук, старший научный сотрудник Л.В. Саяпина

Ведущая организация: Ростовский-на-Дону научно-исследовательский противочумный институт

Защита состоится 1596 г. в__часов

на заседании диссертационного совета Д 074.32.01 по задние диссертаций на соискание ученой степени доктора наук при Российском научно-исследовательском противочумном институте "Микроб" ( 410071 г.Саратов, Университетская, 46 ). С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке института "Микроб".

Автореферат разослан ^^ 1996г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук, профессор

Корнеев Г.

_ з -

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Мелиоидоз - тя-rei.ce заболевание человека и животных, относящееся к категории особо опасных инфекций. Возбудитель иелиоидоза Pseudomonas pseudomalle 1 впервые Сил выделен и охарактеризован английским патологоанатомом WhИтоге в 1912-1913 годах. До настоящего времени ряд особенностей биологии возбудителя остается иаяо изученным, что затрудняет разработку методов диагностики и профилактики вызываемого им заболевания. К их числу относится и Феномен лнэогении, фактически отмеченный несколькими исследователями как обяигаткый видовой признак. Первое сообщение о иелиокдозних фагах сделано R. Legreих и К. DJ ей11 в 1931г. Последующие исследования зарубежных и отечественных авторов заявили феномен лкзогении у этого микроорганизма (Томов с со-ант., 1970; АдимовЛ.Б., 1936).

До настоящего времени работы по изучению явления лизогении у"возбудителя иелиоидоза и особенностей мелиондозных бактериофагов немногочисленны. Предпринимались попытки использования мелиокдозных фагоз для диагностики и фаготипирования, но они кг б щи достаточно эффективными, так как предложенные схемы не являлись универсальными и основывались на результатах анализа небольшого числа аггачмоз. Электронно-микроскопическое изучение Фаговых частиц обнаружило неоднородность юг структуры, на основании чего келиокдозные бактериофаги бьиш распределены по отдельным группа« (Денисов с соазт., 1991; 1995). Исследование траксдуцирующих способностей показало, что мелиовдоаные фаги осуществляют перекос отдельных маокеров, при этом транедукдая

косила межвидовой характер и имела низкую частоту (Манзекш с соавт., 1993).

В настоящее Epewa неяснш остается вопрос о том, в какой мера собственные фаги возбудителя иелиоидоза участвуют в процессах изменчивости н формировании вирулентности бактериального хозяина, в то время как подобные явления, обусловленное ли-зогенной конверсией, достаточно хорошо изучены у других, в* том числе родственных микроорганизмов (Freeman et al., 1951; Gos-horh et al., 1589; Hayoshi et al., 19S3).

Участие фагов в процессах изменчивости не ограничивается придание« бактериальной клетке новых свойств вследствие присутствия фагов или их влиянием на механизмы регуляции генома бактериального хозяина. Фаги можно рассматривать как перемещающиеся генетические элементы, способные осуществлять обмен наследственным материалом в природной клеточной популяции. В практике лабораторных исследований широко используют метод трансдукции - перенос участков хромосому или плазмиды фагами. Он дополняет и уточняет картину взаиморасположения генов, полученную с помощь» трансформации и конъюгации. Некоторые авторы склонны расценивать значение рекомбинациоккых процессов, включая к трансдукцию, в более сиротам смысле, а именно, как взаимодействие различных форм организмов, результатом которого является повышение уровня биологической организации, то есть осуществление прогрессивной эволюции видов (Суходолец, 19S4; 1988), Возможность использования мелиоидозных бактериофагов для выполнения исследований по указанным выззе направления« оценить довольно сложно, так как в настоящее время о&ьем знаний в этой области крайне ограничен, а отсутствие единой кол-

лекции и обозначения фагоз затрудняют анализ имекдихся в литературе Данных.

Таким образом, изучение феномена лиаогении у Р, pseudomal-lel, степени его распространения среди штаммов данного вида, а также исследование особенностей выделенных бактериофагов определяет актуальность настоящей работы. Исследования проводились в рамках двух плановых государственных тем (11-038-89, 11-023-92).

Цель, работы заключалась в получении экспериментальных данных, необходимых для систематизации представлений о явлении ллзогении у P. pseudcmllel и проведении сравнительной характеристики мелиоидозных бактериофагов.

Задачи исследования

1. Изучение распространения явления лизогении у P.pseudo-mallel,

2. Получение "чистых" линий мелиоидозных бактериофагов.

3. Исследование основных биологических свойств мелиоидоа-ных фагов.

4. Взделение фаговых ДНК и их изучение методом рестрикционно-го анализа.

КаучнаяноаизнаВ ходе работы впервые проведено изучение частоты спонтанной фагопродукцки у штаммов возбудителя мелиоидоза и разграничение их по данному показателю.

Установлена полклизогенность отдельных штаммов P. pseudo-mallei.

Изучена динамика репродукции фагов и определена их урожайность. .

Проведена сравнительная характеристика мелиоидозных бак-

териофагов по биологически« свойствам: круг "хозяев", эффективность адсорбции, индукция под воаденствиеи физических и химических факторов, морфология фаговых частиц.

Определена область локализации профагов на хромосоме Р.pseuaoma]leí.

Проведен рестрикционный анализ ЛНК мелиовдоэкых Фагов н

определен размер фаговых геномов.

Практическая ценность полученных результатов.

Выделены 15 "чистых" лянкй фагов Р. pseudanallei из музейных штаммов возбудителя мелиоидоза. Коллекция депонирована в Российском научно-исследовательском противочумном институте "Микроб", г. Саратов.

Разработана методика получения ыелиоидозных бактериофагов в высоком титре для препаративной работы.

Материалы диссертационной работы использованы при о$орцле-нии методических рекомендаций "Лабораторная диагностика, лечение и профилактика мелиоидоза", утвержденных 1.11.1994 г. заместителем председателя Госкомс&чзпнднадзора России Г.Г.Они-ценко.

Полученные характеристики мелиоидозных бактериофагов позволяют использовать их для создания схем фаготипирования и изучения биологических особенностей патогенных псевдомонад.

Апробация работы. Основные материалы диссертации представлены на Российской научной конференции 'Тенетика и биохимия вирулентности возбудителей особо опасных инфекции". Волгоград, 21-22 октября 1992 года и на научных институтских и межлабораторных конференциях Волгоградского НИПЧИ в 198S -

- ? -

1994 годах.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 9 работ, отражающие основное ее содержание.

Положения, выносимые на защиту.

3. Способность спонтанно продуцировать свободный фаг достаточно широко распространена среди штаммов возбудителя мели-окдоаа. Более 70Z изученных музейных штаммов являются дизоген-ными. Для данного вида характерна полилизогения, ряд штаммов содержит фаги, имеюние различную структурную организацию части ц.

2. Мелиоидоаиые бактериофаги обладают способностью репродуцироваться на бактериальных штаммах собственного вида, Р. mallei, а также некоторых штаммах P. cepacia. Они относятся к фагам умеренного типа, не индуцируются под воздействием ультрафиолетового облучения, акридинового оранжевого и нитрозогу-анидика. Для осуществления процесса адсорбции данные фаги не требуют присутствия кофакторов.

3. Среди изученных фагов выявлено три типа структурной организации фаговых частиц, сходных по форме (икосаэдр) и размерам (4Q нм по граням) калсида и различающихся по строению хвостовых отростков. Они отнесены к 3-й, 4-й и 5-й морфологическим группам по классификации Тихоненко.

4. На основании данных генетической трансформации установлено, что участок локализации профагов 128(м), 129(м) на хромосоме Р. pseudomalleí находится вблизи области мутаций met-i.

5. ДНК фагов имеют сайты рестрикции для звдонуклеаз Eco R 1, Xho 1, Sal з и по данным рестрикционного анализа разделяются на три группы гомологии.

Объем и структура работы.

Диссертация изложена, на 118 листах машинописного текста, состоит из введения. обзора литературы, собственных исследований с 16 таблицами и 15 рисунками, заключения, выводов и библиографического указателя, включающего 145 источников, в том числе 85 отечественных и 60 иностранных авторов..

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ

Материалы, и методы. В данном разделе диссертации содержится описание использованных в работе штаммов, сред, растворов и применявшихся методик. В работе были использованы 57 штаммов P. pseudotrallei. 14 штаммов P. mallei и 17 штаммов родственных псевдомокад (P. cepacia, P. stutseri, Р. fluorescens, P. mallophilia, P. alcaligenes, P.aeruginosa, Р. paucimobillis).

В работе использовали питательные среды: Nutrient agar, и Nutrient broth (Difco), минимальную среду G.L.Gilardi (1968) рН 6,8 с добавлением необходимы,4: аминокислот.

Мелиоидозные бактериофаги выделяли из лизогекных музейных штаммов P. pseudomallei. В качестве индикаторного использовали ализогекный штамм P. raallei Z-12. "Чистые" линии фагов получали по методу, описанному Д.М.Гольдфарбом (1951). Каждую линию Фага обозначали номером бактериального штамма, из которого она была выделена, и указывали вид негативных колоний - мутные (м) или прозрачные (пр).

Титр фага определяли методом агаровых слоев, предложенным Грациа (1961). Частоту спонтанной фагопродукции вычисляли при исследовании суточной бульонной культуры P.pseudomallei.

Эффективность адсорбции фага изучали хлорофорыенным мето-

дом по М.Адансу (1361), а динамику репродукции фагов исследовали в цккаах одиночного размножения (Стент Г., Кэлиндар Р., 1961). Для этого готовили смеси бактериальных клеток индикаторного штамма и исследуемого фага, помедали при 37 °С на 15 мин для адсорбции фага. Бактериальные клетки с адсорбировавшимся фагом осаждали центрифугированием при 6000 об/мин {ротор РУ180Л) в течение 20 мин. Супернатаят, содержавший неад-сорбированный фаг, удаляли, в то время как по оригинальной методике свободный фаг нейтрализовали антифаговой сывороткой.

Для изучения возможности индукции профага лизогенные птач-ш обрабатывали ультрафиолетовым облучением, нитрозогуанид ином и акридиновым оранжевым. Источник ультрафиолетового облучения предварительно калибровали и выбирали необходимое время облучения. в течение которого происходило отмирание 902 микробных клеток. Обработку нитрозогуанидкном и акридиновым оранжевым проводили в соответствии с общепринятыми методами (Миллер, 1976).

Для электронно-микроскопического исследования фагов каплю препарата фага наносили на сетку-объектодерхатель, покрытую формоваровой пленкой и дополнительно укрепленную слоем углерода. Контрастировали 1% раствором уранил-ацетата и просматривали при увеличении 50000 - 80000.

Выделение фаговой ДНК проводили в соответствии с общепринятыми методами, изложенными в руководстве Т.Маниатиса (1934). Для рестрикционного анализа фаговых ДНК использовали ферменты ВНИИ прикладной энзимологии, Вильнюс. Электрофоретическое разделение фрагментов проводили в 0,?г агарозном геле, в трис-бо-ратном буфере в течение 16 ч при комнатной температуре.

Р в а у лъча г ы исследований и их обсуждение Представление о существовании явления лизогении у возбудителя ыелиовдоза формировалось в процессе изучения его биологии, начиная от ранних работ, когда было выяснено, что штаммы Р. рзеийошаПе! содержат бактериофаги. 8 рамках данной работы было проведено изучение явления лизогении у всех штаммов Р. рзе-иЗотаИе!, находящихся в коллекции живых культур Волгоградского НИПЧИ. Выло установлено, что более 702 -изученных культур обладали способностью спонтанно продуцировать фаги. Это согласуется с результатами, полученными И.И.Денисовым с соавт. (1991), а также О.Ю.Манзешок с соавт. (1994) при исследовании ими менее представительного набора мелиоидозньи штаммов. Помимо наличия свободного фага, мы определили показатель частоты спонтанной продукции для лизогенных штаммов (табл. 1). Это повволило распределить изученные штамма Р. рэеисЗотаПе! на 8 групп. Для основной части штаммов, примерно 682, этот процесс проходил с частотой п х Ю'5 - п х 10"®. Мы учитывали, что данный показатель до некоторой степени является относительным, так как при исключении профага, в данном случае в результате спонтанного процесса, последуадее осуществление вегетативного цикла одной индуцированной частицы дает значительно большее число потомков. Фактическая частота процесса спонтзнной фагоп-родукции в цифровом выражении меньше установленной на величину урожайности фага. Практическая ценность этого показателя состоит в том, что он позволил проводить направленный выбор штаммов Р. рэеийошаИе! в соответствии с целыо исследования.

Таблица 1.

Распределение птаыиов Р. рэеи<1отаПе1 по частоте спонтанной фагопродукции

I-;--——-■-1

I Номер Частота спонтанной Количество

| штамма фагопродукции штаммов

1100.113,115.133.60631.51274, 0 16

1137.133.140.900.57576.56770.

156812,118.57562.56733

1 1108. 116 • П X 10~8 2

1 ............... ¡56830 » П X 10~7 1

I (107.111,117,119,141.60913,59214. 1129. 60263. 60839 п х 10

1 |1.99,101.109.112.60806,611083,860. 1132.134.135,139.57582,59361.59437 1 , п X 10~5 15

1 ..II 198.102,103.128,130,136.59426,61503 [ П X 10'* 8

( ¡2,110.114,131 1 П X 10"3 4

1 197 « П X 10"1 1

Бактериофаги на газоне чувствительного штамма вызывали образование зон лизиса, от изолированных негативных колоний до сливного лизиса, в зависимости от концентрации частиц фага. Мелиоидозные бактериофаги способны образовывать несколько типов негативных колоний, отличающихся по размеру к степени выраженности лизиса чувствительной культуры: прозрачные, мутные, мутные с вторичным ростом в центре и мутные с прозрачным центром. Фаги, содержавшиеся в лизатах некоторых штаммов возбудителя ыелноидоза, формировали негативные колонии различных типов.

Было установлено, что почти для 502 всех лизогенных штаммов был характерен подобный, полиморфизм негативных колоний. Бри этом частота спонтанной фагопродукции не коррелировала с типом негативных колоний. Полилизогения свойственна роду Pseudomonas. Вероятно, Р. pseudomalleí не является исключением, и это было показано И.И.Денисовым с соавт. (1995) при электронно-микроскопическом изучении структуры фаговых частиц. По их данным, штаммы Р. pseudamalleí С-141, 103, 56770 содержали бактериофаги, имевшие различную структурную организацию частиц, которые соответствовали 4-ой и 5-ой группам по классификации А.С.Тихоненко.

Бактериофаги возбудителя мелиокдоза не обладают абсолютной специфичностью в отношении штаммов собственного вида. Они способны репродуцироваться и на близкородственном микроорганизме - P. mallei. Это наблюдение было сделано, начиная с самых первых работ по изучению мелиоидозных фагов (Legroux et al. 1931.). В настоящее время показано, что Р. pseudomalleí и Р.mal leí имеют значительное сходство по биохимической актив-

ности и практически идентичны по организации генома (Palleronl et al., 1992. Yabuuchl et al.. 1992).

Проведенный нами сравнительный анализ чувствительности псевдомонад к ыелиоидозным фагам показал, что круг "хозяев" для данных бактериофагов не ограничивается штаммами собственного вида, а включает бактерии сапа, а из условно-патогенных -некоторые штаммы P.cepacia. Интересно отметить, что штаммы возбудителя сапа оказались более чувствительными к мелиоидоз-кым бактериофагам, чем птаммы собственного вида . Иы предполагаем, что в первую очередь это объясняется лизогенныы состоянием большинства культур P.pseudorallel. Следует добавить, что на большинстве штаммов возбудителя сала репродуцировались 1СШ полученных Фагов. Мы определили, что они являются более удобной моделью тест-штамма при работе с фагами этого вида. В пользу такого выбора свидетельствовали как более высокая чувствительность. так и отсутствие потенциально ограничивающих факторов, которые иогли бы вызвать неспецифические эффекты при изучении биологических свойств самих фагов.

Из 14 изученных штаммов возбудителя сапа в качестве индикаторного был выбран P. mallei 2-12, так как он был чувствителен к наибольшему числу фаголизатов мелиондозяых штаммов (табл. 2) и негативные колонии, образуемые на газоне этого штамма, имели четкую морфологию. При определении круга "хозяев" бактериофагов среди непатогенных псбвдомонад были отмечены проявления антагонистической активности возбудителя мелиоидо за, не связанной с действием бактериофагов. Природу этого явления изучали В.В.Сухов с соавт. (1992), которые показали, что возбудитель мелиоидоза продуцирует антиб'иотикоподобное вещест-

- н -

Таблица 2.

Сравнительная характеристика штампов P. mallei по чувствительности к медиоидозкыы фагам

1 | Штаммы I P. mallei --—------------1 1 Колкчество| Чувствительность к фаголи-| штаммов | затаи Р. рэеийоггаПе!, %

1-..... -...... ............... |2-12,"Иванович",Ц-4» 1"Будапешт",Ц-5,10230 1 6 100

г |"Багор" • 1 95

1 ............. | 11, В-120 1 2 S3

1 1 в 1 1 83

1 1"Муксовар" 1 1 75

1 ["Загреб" 1 1 65

1 1 5584 1 1 38

1 IP-1 • 1 35

во, отнесенное к классу ароматических соединений. При дальнейших исследованиях необходимо точное определение природы ре-' гистркруеиого бактерицидного действия возбудителя иелиокдоза и предпочтительное использование мелиоидозных бактериофагов в

виде препаратов "чистых" линий.

Нами выделены и клонированы 16 линий фагов, Для их получения использовали лизогенные штаммы P. pseudonallei, которые были устойчивы к литичесноыу действии как собственных» так и всех прочих мелиоидозных фагов (P. pseudomallei 107«, 128, 129, 130, Hi. 59214). Это было установлено при изучении спектра ¿этической активности бактериофагов на штаммах P. pseudonallei. Полученная наш? коллекция "чистых" линий фагов депонирована а Российском научно-исследовательской противочумном институте "Микроб", г.Саратов.

По характеру размножения на бактериальных клетках P. mallei Z-12 мелиоадозные бактериофаги относятся к фагам умеренного типа. Динамику процесса репродукции фагов мы изучали з циклах одиночного размножения. Латентный период составлял не менее 2 ч. Период нарастания титра фага продолжался 6-8 ч. Выход на "плато", как в случае с вирулентными фагами» не происходил. Урожайность фагов находилась в пределах 102 фаговых частиц. Фаги данного вида не вызывали полного просветления бульонных культур в результате лизиса клеток. По нашим наблюдениям, в смеси бактериальных клеток с фагами проходил процесс ашзогени-запии и исходная клеточная популяция постепенно замещалась ли-зогенными клетками. Одновременно с этим происходил, вероятно, отбор мутантньк линий фага, для которых было характерно изменение морфологии негативных колоний и появление clear вариантов. По времени это соответствовало 10-14 ч культивирования смеси.

Фаги P. pseudomallei не индуцировались под воздействием таких известных факторов, как ультрафиолетовое облучение, ак-

ридиновый оранжевый н нитрозогуадкдин, ка основании чего лизо-геккую систему P.pseudanallei т расценили как неиндуктабель-ную.

Нами была разработана методика по оптимизации условий разшкженкя фагов, которая позволяет получать фаги в высоком титре. Для получения фаголкзагов с титром фага 107 - 108 ф.ч./мл концентрация бактериальных клеток в смеси должна составлять 104 - 10s ы.к./мл, а ааражзодая доза фага не менее 103 - Ю5 ф.ч./мл, Дальнейшее увеличение концентрации микробных клеток отрицательно влияло ка выход фага при сохранении показателя множественности инфекции.

Электронно - микроскопическое исследование 10 линий фагов позволило установить, что выделенные мелиоидозные бактериофаги различаются по структуре частиц. Мы разделили их ка три вида и отнесли к 3. 4 и 5-й группам. по общепринятой классификации А.С.Ткхоненко. Фаги 129(пр) и 130(пр) по организации соответствовали 5-й морфологической группе, так как их частицы состояли из головки икосаэдраяьной формы (40 км по граням каясида), длинного хвостового отростка (150 нм) к сократительного чехла. Фаги 129(м), 9?(м), 112(м), 117, 141{и), 59214(м)„ 56830(и) относились к 3-й группе. Их частицы имели головку в форме икосаэдра (40 нм по граням капскда) к короткий хвостовой отросток (1 нм). Фаг 130(ы) был отнесен к 4 группе. Его частицы состояли кз головки в форме икосаэдра (40 нм) и гибкого хвостового отростка (300 нм). Шло установлено, что штаммы P. pseudomal-lei 129 к 130 несли фаги£ имевшие различную структуру и относившиеся к различным морфологическим труппам, что подтвердило наше предположение о полклизогенности данных штаммов, выдвину-

тое первоначально по признакам множественной фагоустойчивости и полиморфизма негативных колоний.

Мелиоидозные профаги локализованы на бактериальной хромосоме и передавались в реакциях генетической трансформации совместно с различными маркерами ауксотрофности (pro, lys, pur, trp, met, phe, his). Передачу опосредовали как гомологичны?

доноры, лизогенные штамш собственного вида, так и гетероло-

Ï»

гичкые доноры - штаммы возбудителя сапа, искусственно лизоге-низированные фагами 128(м) и 129(м). Наибольший процент сцеп-ленности прсфагоз Р, pseudomallel с хромосомными маркерами отмечался по pro-5 (47Z) и met-l (100%). Участки локализации профагоа 128(м) и 129(м) предварительно были определены в области мутации met-l.

ДНК мелиоидозных фагов ( 97(м), 97(пр), 107, 117, 112(м), 128(пр),129(м), . 141(м), 59214(м), 59214(пр) ) ииели сайты рестрикции для эндонуклеаз Eco R1, ХЬо 1, Sal 1. Сайты рестрикции для фермента Pst 1 отсутствовали. На основании злектро-форетического разделения фрагментоз ДНК указанных фагов, полученных после обработки эндонуклеазами Eco RI, Xho 1, и анализа подобия длины рестрикционных фрагментов, изученные фаги' были разделены на три гомологичные группы. Основная часть фагов была отнесена к 3 группе, и размер их ДНК составил 41400 пар оснований.

Выделенная коллекция "чистых" линий мелиоидозных фагов, охарактеризованная нами по основным биологическим свойствам, позволяет использовать мелиоидозные бактериофаги в качестве эффективного природного "инструмента" для генетических исследований возбудителя мелиоидоза. Дальнейшее углубленное изуче-

кие фагового генома, а также получение мутантных линий безусловно будет полезно для установления значения прокатов в жизнедеятельности возбудителя мелиовдоза.

ВЫЗОДЫ

1. Изучено распространение явления лизогении на представительной коллекции музейных штаммов Р. pseudomallei. Показано, что большинство (40 из 57) штаммов обладает способностью спонтанно продуцировать свободный Фаг с частотой п х Ю1 - п х Ю0, проявляя устойчивость к литическому действию собственных Фагов.

2. Получена коллекция фагов, состоящая из 16 "чистых" линий. Изучены эффективность адсорбции и динкмика репродукции бактериофагов. Показано, что профаги Р. pseudomallei не индуцируются под воздействием ультрафиолетового облучения, акридинового оранжевого и нитрозогуанидинз.

3. Установлено, что фаги Р. pseudomallei размножаются на бактериальных штаммах собственного вида и близкородственных псевдомонад: Р. mallei и Р. cepacla. Среди видов Р. stutseri, Р. fluorescens, Р. ¡naltopftiUa, Р. alcaligenes, Р. aeruginosa, Р. paucimoblllls не выявлены штаммы, чувствительные к мелиои-дозным фагам.

4. При электронно-микроскопическом изучении структуры фаговых частиц обнаружено три морфологических типа фагов, относящихся к 3-й, 4-й н 5-й группам по классификации А.С.Тихонен-ко. Показана полидизогенность штаммов Р. pseudomallei 129 и 130, содержащих фаги различных морфологических групп.

5. Молекулярно - биологическое изучение ДНК десяти "чистых" линий фагов выявило сайты рестрикции для эндонуклеаз Есо

Rl. Xho 1, Sal 1 и отсутствие сайтов для Pst 1. На основании данных рестрккционного анализа эти фаги разделены на три группы гомологии.

6. Размер ДНК фага 128(пр), как типичного представителя третьей группы гомологии, в которую входит ваибальвее количество изученных фагов (В из 10), составяет 41400 пар осяова-ний.

7. Исследована в генетической трансформации совместная передача области прокатов 128(h) я 129(h) с различными хромосомными маркерам! ауксотрофности. Локализация профагов определена в районе мутации met-l, псказавшей с ними 100Z - сцепление при котрансформации.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Меринова Л.К., Пчвень H.H., Замараев B.C., Агеева Н.П.„ Лу-ценкоЛ.В.. Сеимова И. К. „ Поповцева Л. S. „ Варыханова Т. Г., Гризкина Т. А. Получение маркированных штаммов возбудителя ме-лиоидоза и сапа //Особо огтасн. инф. забол.: диагн., профил. sí биол. свойства возбудителей. Сб. научн. работ. - Волгоград, 1990. - N4. - С.57-62.

2. Гркгкина Т.А., Меринова Л.К. Выделение и характеристика' умеренных фагов Pseudomonas pseudomallei //Генетика, микробная. и совершенствование методов лзб. диатк. особо спася, инф. Сб. научн. работ. - Саратов,1991. - С.131-135.

3. Гргспкина Т.А., Меринова Л.К. Изучение возможности индукции профага под действием физических и химических факторов у Pseudomonas pseudcynallei //Генетика и биохим. вирулентностп воз-буд. особо опасн. инф. Матер. Российской научн.

конф..- Тез.докл. - Волгоград» 1992. - С. 13.

4. Гршкина Т. А. „ Меринова Л. К. Бактерицидное действие штаммов Pseudomonas pseudomallel на различные виды псевдомонад //Там »е. - С.187.

5. Гркшкина I.A., Меринова Л.К. Изучение спонтанной фагопро-дукции Pseudomonas pseudocnallei и круга "хозяев" мелиоидозкых фагов среди представителей рода Pseudomonas //Шкробиол. курн.

- 1993. - N4. - С.43-47.

6. Гркшкина I.A.„ Меринова Л.К. Метод получения умеренных фагов Pseudomonas pseudonallel % высоком титре// Мехведомств. научи, совет по сан.-зпид. ог.раке территории РФ. Кнформ. балл.

- Саратов,1994. - С.35-37.

7. Илюхин В.И., Агеева Н.П., Антонов В.А., Батманов В.П., Буд-ченко A.A.р Дунаев Г.С., Замараев B.C.,- Замарин А.Е., Ларионов Г.М. t Пивень H.H.» Яковлев АЛ. „ Грижнна I.A. Лабораторная диагностика, лечение и профилактика мелиоидоза. //.Там же -С. 30.

8. Меринова Л. К. t Гршжина Т.А., Каплиев В.И. Изучение явления лизогенки в биологии Pseudomonas pseudomallel //Там же. -С.68-69.

9. Меринова Л.К., Гркшкина Т.А., Тарасова Т.Д., Антонов В.А. Генетика возбудителя мелиоидоза // В кн.: "Мелиоидоз" под ред. Н.Г.Тихонова. - Волгоград.; Нижне-Воджское кн. изд-во. - 1995.

- С,£6-46.