Ядерный антиген пролиферирующих клеток (PCNA): координатор клеточных функций в норме и патологии

Нарыжный, Станислав Николаевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Ядерный антиген пролиферирующих клеток (PCNA): координатор клеточных функций в норме и патологии
ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Ядерный антиген пролиферирующих клеток (PCNA): координатор клеточных функций в норме и патологии"

На правах рукописи

НАРЫЖНЫЙ Станислав Николаевич

ЯДЕРНЫЙ АНТИГЕН ПРОЛИФЕРИРУЮЩИХ КЛЕТОК (РС.ЧЛ): КООРДИНАТОР КЛЕТОЧНЫХ ФУНКЦИЙ В НОРМЕ И ПАТОЛОГИИ

03.01.04 - биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

2 1 ДПР 2011

Москва 2011 г.

4844232

Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Петербургском институте ядерной физики им. Б. П. Константинова РАН.

Научный консультант:

доктор биологических наук,

профессор, академик РАМН Арчаков Александр Иванович.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук,

профессор Говорун Вадим Маркович,

доктор медицинских наук,

профессор Ларина Ирина Михайловна,

доктор биологических наук Маргулис Борис Александрович.

Ведущая организация:

Учреждение Российской академии наук "Институт биохимии им. А. Н. Баха РАН".

Защита состоится " 19 " _мая__ 2011 г. в _ часов на заседании совет

Д 001.010.01 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Учреждении Российско академии медицинских наук Научно-исследовательском институте биомедицинской хими им. В. Н. Ореховича РАМН (ИБМХ РАМН) по адресу: 119121, г. Москва, Погодинская ул., д. 10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИБМХ РАМН. Автореферат разослан " 2, "О^/и^-Р_2011 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета Д 001.010.01 кандидат химических наук

Карпова Е. А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Центральным подходом в системной биологии является объединение взаимодействующих друг с другом клеточных компонентов (белков) в многочисленные сети, образующие функциональные модули, а вся совокупность этих взаимодействий, характерная для каждого объекта, носит название "интерактома" (Sanchez. Lachaize et al.. 1999). Некоторые белки отличаются особенно повышенным количеством партнеров и выглядят на картах интерактомики как объединяющие центры, или хабы. В зависимости от характера белок-белковых взаимодействий хабы подразделяются на две категории: "центры вечеринок" (party hubs), где взаимодействие происходит со многими партнерами одновременно, и "центры свиданий" (date hubs), когда взаимодействие с разными партнерами происходит в разных местах и в разное время (Han. Bertin et al.. 2004). Наиболее известными хабами являются, например, такие белки с разнообразными функциями, как актин, 14-3-3 или р53. Анализ последствий, вызванных нарушениями в сети белок-белкового взаимодействия, позволил предложить некую модель организации протеома из отдельных модулей или биологических процессов. Каждый модуль регулируется через "центр вечеринок", в то время как "центры свиданий" организовывают протеом, связывая отдельные модули. Причем весь протеом является более чувствительным к нарушениям в работе date hubs, чем party hubs. Внутри модуля "репликация ДНК" особенно интересен ядерный антиген пролиферирующих клеток (PCNA, roliferating cell nuclear antigen). Этот белок долгое время был известен только как вспомогательный елок для ДНК полимераз. Однако развитие методов протеомики, возникновение интерактомики и истемной биологии привели к расширению представлений о функционировании белков в общем и ;NA в частности. Поэтому актуальной является задача по выяснению механизмов, регулирующих ежбелковое взаимодействие и белковую полифункциональность. Для решения этой задачи необходимо привлечение не просто отдельных биохимических методов, а комплексный подход и истемный взгляд на работу белков. Причем PCNA в этом смысле является чрезвычайно одходящим и своевременным объектом исследования.

Целью работы явилось 'выяснение структурно-функциональных аспектов организации нтерактомики на примере PCNA, как хаба, обладающего широким спектром действия.

Основные задачи исследования

1) Выявление форм, которые может принимать PCNA, подвергаясь посттрансляционным одификациям.

2) Изучение роли данных модификаций в механизмах работы PCNA в качестве белка, заимодействующего с множеством других белков.

3) Оценка аспектов, касающихся роли PCNA в качестве онкогена и маркера пролиферации.

4) Анализ, систематизация и дополнительный поиск белков, взаимодействующих с РСЫА разработкой и использованием нетривиальных подходов.

6) Выяснение функций РСЫА не только в ядре, но и в цитоплазме.

7) Прояснение деталей структурной организации РСЫА, обеспечивающей выполнение многообразных функций.

8) Разработка модели (моделей) функционирования РСЫА в качестве хаба широкого спе действия.

Научная новизна. Детальный анализ с помощью двумерного электрофореза высок разрешения и чувствительности выявил наличие разнообразных форм у РСЫА млекопитающих ( называемый нанопротеом), вызванных посттрансляционными модификациями.

Впервые показано, что РСЫА присутствует в клетке в виде двойного тримера, более то было доказано, что именно такая структура обеспечивает те свойства, которые делают РС координирующим хабом широкого спектра действия. Была предложена модель работы РСЫА качестве координатора процессов, происходящих на решшкативной вилке ДНК при синтезе Щ сборке хроматина.

Систематический анализ белков, взаимодействующих с РСЫА, привел к раскрыт совершенно новых сторон функционирования РСЫА. Одна из этих сторон связана с его возможн участием в процессах гликолиза. В совокупности с тем фактом, что канцерогенез сопровожда увеличением как уровня гликолиза, так и экспрессии РСЫА, это позволяет по-новому взглянуть процессы канцерогенеза.

Основные положения, выносимые на защиту

Имеет место широкий спектр взаимодействий РСЫА, причем не только в ядре, но и цитоплазме.

Обнаружено, что РСЫА присутствует в клетке в виде комплекса из двух кол обеспечивающих одновременное взаимодействие с несколькими белками-партнерами, что позволи сформулировать модель координирующего действия РСЫА на решшкативной вилке ДНК. Та показано взаимодействие РСЫА с гликолитическими ферментами и предложена модель участ РСЫА в гликолизе.

Показано наличие множественных посттрансляционных модификаций РСЫА, котор участвуют в регуляции взаимодействия РСЫА с другими белками.

Научно-практическая значимость представленной работы состоит в первую очередь существенном вкладе в дальнейшее понимание внутриклеточных процессов в общем и механизм функционирования белковых сетей, то есть интерактомики, в частности. Такое понимание важно

олько в общем плане познания, но и дает ключ к нашим возможностям при необходимости мешиваться в эти процессы. Например, знание того, что раковая клетка содержит значительно ювышенное количество PCNA и очень чувствительна к нарушениям его четвертичной структуры, казывает на возможность получения фармакологических противораковых препаратов, нарушающих труктуру PCNA и тем самым вызывающих апоптоз раковых клеток. А информация о белковых етях, образованных взаимодействиями PCNA, может служить инструментом в диагностике аболеваний, выяснении механизма их возникновения и развития, эффективности тех или иных ерапевтических подходов и разработке новых лекарственных препаратов.

Апробация работы. Материалы данного исследования представлялись на 2-м Всемирном онгрессе HUPO (Монреаль, Канада, 2003), 4-м Всемирном конгрессе HUPO (Мюнхен, Германия, 005), 5 Всемирном конгрессе HUPO (Лонг Бич, США, 2006), 7-м Всемирном конгрессе HUPO Амстердам, Голландия, 2008), 8-м Всемирном конгрессе HUPO (Торонто, Канада, 2009), на онференциях Канадского общества протеомики (Лондон, Канада, 2004; Оттава, 2005), на онференциях по протеомике (Canadian Proteomics Initiative) в Ванкувере (2003), Монреале (2004), оронто (2005), Оттаве (2007), на конференциях по двумерному электрофорезу (2-D Electrophoresis eeting, from Genome to Proteome) в Сиене, Италия, в 1996, 1998, 2000 и в 2002 годах, а также на еждународной конференции "Биокатализ-98" в Пущино в 1998 году и Всероссийской научной онференции "Медико-генетические проблемы онкологических заболеваний" (Стерлитамак, 2010). роме того, автор неоднократно выступал с докладами в Петербургском институте ядерной физики АН, Гатчина, Институте биомедицинской химии РАМН, Москва, в Лаврентьевском университете в адбери, Канада (Laurentian University, Sudbury, Canada), и в Онкологическом центре при егиональном госпитале в Садбери, Канада (Cancer Centre, Sudbury Regional Hospital, Canada).

Публикации, По материалам диссертации опубликовано 39 печатных работ в отечественных зарубежных изданиях, из которых 17 статей - в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора итературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов работы и их бсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 265 страницах, одержит 55 рисунков, 12 таблиц. Список литературы включает 434 источника.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ В работе использовано около 20 антител, предоставленных различными компаниями, азнообразные "нормальные" и раковые клеточные линии от АТСС. Штамм Е. coli BL21 (DE3), ансфецированный плазмидой pT7hPCNA, был получен от доктора Стиллмана (Dr. В: Stillman),

плазмиды pEGFPCNA и pEGFPCNAL2 любезно предоставлены доктором Кардосо (Dr. С. Cardoso Рекомбинантный PCNA человека (ALX-201-234) был получен от компании Alexis Biochemical очищенные ферменты - от компаний Sigma и Calbiochem. Глицеральдегид-фосфатдегидрогеназную (G3P) активность определяли, используя набор ферментов KDalert (Ambi Incorporation) и следуя инструкциям производителя. Альдолазную активность измеряли по мето Пинто (Pinto. Kaplan et al.. 1969). используя набор реагентов от компании Caldon Biot Incorporation.

Методы. В работе были использованы как стандартные биохимические подходы, так и модификации, а также ряд собственных оригинальных методов.

Синхронизацию по клеточному циклу проводили остановкой клеток в GO-фазе удаление из инкубационной среды изолейцина, а остановку на границе G1/S (старте S-фазы) - чер комбинацию удаления изолейцина и обработку ингибиторами репликации ДНК, мимозином и афидиколином (Gilbert. Neilson et al.. 1995: Lee. Lamer et al.. 1997).

Сортировку клеток (FACS) проводили экстракцией клеток буфером, содержащим 10 м Трис, pH 6.8, 100 мМ NaCl, 3 мМ MgCl2, 1 мМ EDTA, 10%-й глицерин, 0.5%-й Тритон Х-100, 1 м PMSF, и ресуспендированием ядер в окрашивающем растворе, который содержал 0.1%-й цитр натрия, 0.3%-й Тритон Х-100, 100 мкг/мл РНКазу А и 100 мкг/мл пропидиум иодида, использ проточный цитометр Beckman Coulter Epics® Elite (Palo Alto, CA, USA).

Мечение in vivo. Для метки фосфопротеинов клетки сначала инкубировали 4 часа в ME среде, не содержащей фосфатов с добавлением 10% диализованной эмбриональной сыворот коровы, а затем 9 часов при 37°С в свежей MEM-среде, содержащей [32Р]ортофосфат (0.4 mCi/м Далее клетки дважды промывали холодным раствором PBS, собирали с помощью пластиково шпателя в раствор PBS, содержащий коктейль из протеазных и фосфатазных ингибиторов, экспериментов по ацетилированию клетки инкубировали 6 часов в MEM-среде, содержащ [3Н]ацетат натрия (0.5 mCi/мл).

Субклеточное фракционирование проводили, используя последовательную экстракци разными буферами (Ramsbv and Makowski. 1999).

Клеточная трансфекция. Бактерии Е. coli BL21 трансфецировали плазмидой T7hPCN Клетки СНО и НЕК293 трансфецировали нормальными и мутантными плазмидами pEGFPCN используя липофектамин (Lipofectamin, Invitrogen) и следуя инструкциям производителя.

Выделение PCNA хроматографией и электрофорезом. Клеточные экстракты получали трансформированных бактерий BL21 (DE3) после разрушения клеток ультразвуком в буфер содержащем 25 мМ Трис, pH 7.4, 25 мМ NaCl, 1 мМ EDTA, 10%-й глицерин, 0.01%-й Тритон Х-1

и коктейль из ингибиторов протеаз. Экстракт последовательно фракционировали на колонках Sephacryl S200 (16/60), UnoQl и Superdex 200 10/300 GL. Выделение мономера PCNA с помощью денатурирующего электрофореза (SDS-PAGE) проводили в одну стадию на установке UDSFE (Narvzhnv. 19961. Фракции собирали и анализировали Вестерн-блотом, используя антитела к PCNA.

Сшивки формальдегидом. Клетки, выращенные на культуральной чашке, промывали один раз PBS и инкубировали при комнатной температуре в растворе PBS, содержащем 1.5%-й формальдегид (сшивка in vivo). Реакцию останавливали добавлением глицина в финальной концентрации 0.15 М. При метке in vitro обрабатывали 1.5%-м формальдегидом клеточный экстракт, а не клетки.

Денатурирующий одномерный электрофорез (SDS-PAGE') проводили в присутствии SDS с концентрацией полиакриламида от 8 до 12%. в разделяющем геле и 5%> в концентрирующем геле. Концентрацию белка в образцах определяли с помощью Кумасси (Coomassie Protein Assay Reagent kit, Pierce).

Нативный электрофорез проводили на основе метода прерывистого электрофореза Орнстейна и Дэвиса (Davis. 1964: Ornstein. 19641.

Двумерный электрофорез (2DE). Образцы растворяли в 100 мкл лизирующего буфера (7 М

мочевина, 2 М тиомочевина, 4% CHAPS, 1% ДТТ, 2% IPG буфер, pH 3-10, смесь протеазных

ингибиторов, 0.1 мМ MG132). Белки разделяли изоэлектрофокусированием (ИЭФ), используя

полоски DryStrip kit. Образцы в лизирующем буфере смешивали с регидрирующим буфером (7 М

мочевина, 2 М тиомочевина, 2% CHAPS, 0.3% ДТТ, 2% IPG буфер, бромфенол голубой) и

проводили регидратацию полосок 8 ч при 10°С в специальной кювете (Immobiline DryStrip

Reswelling Tray). ИЭФ вели при 20°С, используя аппарат Multiphor II (Amersham Biosciences).

Полоски перед вторым направлением вымачивали (2 раза по 10 мин) в уравновешивающем растворе (50 мМ Трис-HCl, pH 6.8, 6 М мочевина, 2% SDS и 30% глицерин), содержащем сначала 1 %-й ДТТ, а затем 5%-й иодацетамид. После завершения электрофореза гель фиксировали в растворе 25%-го изопропанола с 10%-й уксусной кислотой. Белки в геле окрашивали аммиачным серебром (Oakley. Kirschetal.. 19801 или же Кумасси R350.

Перенос белков на мембрану. По окончании электрофореза гель опускали в буфер для переноса (48 мМ Трис, 39 мМ глицин, 0.037% SDS, 20% метанол) и переносили на PVDF мембрану, используя аппарат для полусухого переноса (Bio-Rad).

Окрашивание мембран. После переноса мембрану вымачивали в метаноле, окрашивали Кумасси R350 и высушивали.

Иммунодетектирование (Вестерн-блот) проводили по "классическому", то ест общепринятому в большинстве лабораторий, методу, следуя в основном протоколу лаборатори Колд Спринг Харбора (Cold Spring Harbor) (Harlow D.L. (Ed.). 1999). Однако чаще использовал так называемый "голубой сухой Вестерн-блот" (Narvzhnv. 2009). когда PVDF мембран предварительно окрашивали и высушивали.

Фар-Вестерн проводили по методу Гуше с соавторами (Guichet. Copeland et al.. 1997 некоторыми модификациями, основанными на экспериментах по ренатурации белков по денатурирующего электрофореза (Narvzhnvi. 1992: Narvzhnv. 1997). Сначала белки после 2DE SDS-PAGE переносили на мембрану, которую промывали сначала 5 мин в TBS, затем 10 мин в ' с 5%-м БСА (блокирующий раствор), и оставляли на ночь при 4°С в ренатурирующем буфере (1 глицерин, 100 мМ NaCl, 20 мМ Трис, pH 7.6, 0.5 мМ ЭДТА, 0.1% Tween-20, 3% БСА и 1 мМ Д На следующий день этот буфер меняли на такой же, только содержащий PCNA (2.5 мкг/мл) инкубировали при 4°С 4 часа. Несвязавшийся PCNA отмывали сначала инкубацией ренатурирующем буфере (15 мин, 4°С), а затем в TBST с 3%-м БСА (15 мин, 4°С). Далее мембр обрабатывали практически таким же образом, как в случае "классического" Вестерн-блота.

Иммуноокпашнвание клеток проводили на покровных стеклах. После промывки клетки фиксировали, заливая холодным метанолом и выдерживая при комнатной температур течение 10 мин. После фиксации клетки промывали несколько раз TBS и блокировали Т содержащим 5%-ю бычью сыворотку, в течение 1 часа при 4°С. Затем их последовател обрабатывали первичными и вторичными антителами (метка FITC или родамин), разведенным блокирующем буфере. Слайды анализировали под флуоресцентным микроскопом Zeiss Axiovert 1 Моделирование структуры PCNA. Файлы с информацией о белковых структурах получ из банка PDB (Protein Data Bank). Использовали программы RasMol Version 2.7.2.1 или Swiss-P Viewer DeepView v4.0. Для поиска вариантов молекулярного взаимодействия использов программу Hex 4.2 (http://www.loria.fr/~ritchied/hexA.

Масс-спектрометрия. После разделения в 2DE и окрашивания Кумасси кусочки г соответствующие анализируемым белковым пятнам, вырезали и частично обесцвечи инкубацией 15 мин в 500 мкл 50%-го ацетонитрила (ACN), содержащего 25 мМ бикарбо аммония. Далее кусочки ужимали инкубацией в ACN. ACN удаляли и гель высушивали центрифуге Speed Vac. Высушенные кусочки геля вымачивали 25 мин на льду в 12 мкл 25 раствора бикарбоната аммония (АБК), содержащего трипсин (Trypsin Gold, Promega, USA, 4 мкг/ или же Lys-C (5 мкг/мл), или Asp-N (10 мкг/мл) (Roche, Switzerland). Излишек раствора удаля добавляли 10 мкл раствора 25 мМ АБК и проводили протеолиз инкубацией при 37°С как миниму

аса. Продукты гидролиза смешивали (1мкл + 1мкл) прямо на пластинке для масс-спектроскопии с атриксом СНСА (a-Cyano-4-hydroxycinnamic acid), растворенным в концентрации 10 мг/мл в 50%-м CN с 0.1%-й трифторуксусной кислотой (TFA), кристаллизовали и анализировали на масс-пектрометре MALDI микромас MX (Waters Inc). Спектры анализировали, используя программы ascot, FindPep, FindMod или Aldente.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

PCNA В ПРОТЕОМЕ

Первоначально был проведен детальный анализ положения PCNA на двумерной карте 2DE ис. 1). Большинство белков, расположенных близко к PCNA, отвечают за ведение, образно говоря, домашнего хозяйства" клетки. В частности, здесь широко представлены тропомиозины и разные ормы белков семейства 14-3-3 (рис. 1). Так как изоэлектрическая точка (р7) и молекулярная масса ли вес (Mw) являются фундаментальными физико-химическими параметрами любого белка, их очная оценка очень важна. Изначально масса PCNA, определенная денатурирующим леюрофорезом, SDS-PAGE, оказалась равной 36 кДа (Bravo and Celis. 19801. хотя его теоретическая асса равна примерно 30 кДа. Действительно, PCNA мигрирует в виде одной полосы в районе 3-36 кДа при использовании 12-20%-х полиакриламидных гелей, но в районе 30 кДа, то есть лизко к теоретическим значениям, при использовании 8-9%-х гелей (Narvzhnv. Desouza et al.. 2006). a 2DE видно, что PCNA детектируется в виде одного пятна. Однако более высокое разрешение и увствительность позволяют обнаружить дополнительные, сдвинутые по изоточкам, сателлитные ятна (рис. 2). Мажорное (М) пятно PCNA соответствует полипептиду с р/4.57 и массой 30 кДа. Эти исла почти с точностью соответствуют теоретическим параметрам PCNA, указывая на то, что ольшая часть PCNA не модифицирована. Наличие дополнительных пятен, детектированных с омощью Вестерн-блота, говорит о возможности присутствия различных модификаций.

PCNA В ФАЗАХ КЛЕТОЧНОГО ЦИКЛА

Чтобы яснее представить общую картину протеома при переходе клеток от стадии покоя фаза G0) к стадии деления (особенно репликации ДНК, S-фазе) и место в этой картине PCNA ровень экспрессии, локализация, модификации), была использована система синхронизации по еточному циклу клеток яичника китайского хомячка (СНО) с дальнейшим анализом белков, значально экспрессия некоторых белков в разных фазах клеточного цикла (от G0- к S-фазе) была роанапизирована с помощью одномерного электрофореза и Вестерн-блота. Так, циклин А не етектируется в клетках, находящихся в фазе покоя, GO, но обнаруживается через 10 часов после ыхода из GO, когда клетки уже подходят к границе фаз Gl и S(G1/S). Его уровень близок к

Рис. 1. Двумерная карта (2DE) белков эпителиальных раковых клеток MDA-MB468 положение на ней PCNA. (А) Клеточные белки (0.4 мг) были разделены 2DE (рН 3-10, 13 см, и !10¡ SDS-PAGE) и окрашены Кумасси R350. Идентификацию белков проводили белков: дактилоскопией (В). Увеличенная область 2DE карты вокруг PCNA. Тропомиозин альфа: (TPMI_HUMAN), тропомиозин альфа-3 (TPM3JHUMAN), 14-3-3 белок эпсилон (1433E_HUMAí 14-3-3 белок сигма (1433S_HUMAN), 14-3-3 белок бета/альфа (1433B_HUMAN), фактор элонгац^ 1 -бета (EF1B_HUMAN), нуклеофосмин (NPM_HUMAN).

максимуму после 14 часов роста в полной среде, содержащей афидиколин, после выхода из G1 фазы, когда большинство клеток находится в начале S-фазы. Максимального уровня экспресс! циклин А достигает в течение 2 часов после снятия блокировки афидиколином, когда начинает: активная репликация хромосом. Схожая картина наблюдается и с другим регулятором клеточное цикла - протеинкиназой Cdkl, которая также не детектируется в GO-фазе клеточного цикла. I-уровень Cdkl достаточно высок уже после 6 часов и достигает максимума после 10 часов выхода i GO-фазы, когда циклин А только начинает детектироваться. Эти данные согласуются с моделью, г. основные функции Cdkl приходятся на середину Gl-фазы, а циклина А - на фазу репликации ДН (S-фазу). Интересно то, что значительное количество PCNA обнаруживается в фазе G0. Общ» уровень PCNA увеличивается примерно в 2 раза, когда клетки входят в цикл деления, и остает таковым все время (рис. 3). Так как PCNA является одним из необходимых белков, участвующих репликации ДНК, его сравнительно постоянный уровень в течение клеточного цикла являет; несколько неожиданным. Более детально функционирование и роль PCNA може;

4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5

Р1

Рис. 2. Многочисленные пятна, соответствующие изоформам PCNA, могут быть выявлены с помощью 21)Е высокого разрешения и повышенной чувствительности.

I Иммуноокрашивание проводили с использованием анти-РСИА антител РСШ. А, М, В, Т и О обозначают, соответственно, "кислую", мажорную, "щелочную", тримерную и димерную формы РСЫА. 111 и и2 обозначают убиквитинированные формы мономера PCNA. Н - кластер продуктов гидролиза РСЫА. (А) 2ВЕ (рН 4-7, 13 см). (В) 20Е (рН 4-5, 18 см).

прояснить клеточное фракционирование. Как показывает рис. 3, уровень РСЫА в цитоплазме остается одинаковым в течение всего клеточного цикла, и даже в фазе й0. Однако следует особо подчеркнуть то, что в экстрактах ядер, хроматина и ядерном матриксе этот уровень значительно отличается в разных фазах клеточного цикла. Например, уровень РСИА в образцах ядерного матрикса был очень низким в фазе в0, но значительно повышен и постоянен начиная с середины фазы 01. А в образцах экстрактов ядер и хроматина уровень РСЫА был очень низким до середины фазы 01, достигая максимальных величин на границе 01/8 фаз (рис. 3). Для получения более полной картины белковых изменений в зависимости от клеточного цикла был проведен анализ 20Е как всех клеточных белков, так и отдельных субклеточных фракций. Среди 1 200 проанализированных 9 белков показали существенное изменение уровня экспрессии в в-фазе по сравнению с фазой 00.

Анализ распределения РСИА в разных субклеточных фракциях с помощью 20Е (рис. 4)

подтвердил данные одномерного Вестерн-блота и позволил более точно оценить уровень РСЫА.

д GO G1 Aph S PCNA I -«ОТ^ЩИВИМ—BW»

Cyclin A Cdkl Actin

PCNA Cyclin A

Cdkl

Actin

PCNA Cyclin A

Cdkl

Actin

PCNA Cyclin A

Cdkl Actin

Швк&ШNfllMfc

GO G1 Aph S

«шин ■■ЯШ» <Шр

GO G1 Aph S

Ядерный экстракт

хроматин

Ядерный матрикс

120 ттр

wfjggÈ

гТ ' ■ «ШШ

60 f'ii.j , - ' —

# -||

Q GO G1 Aph

ISP

00 ж

воЩг

2 г 'шШшЁт

u GO G1 Anh

F Ж i | |

lie ^ -, I

/ щштщ i

Г ' Г' i 1 —• SÉpiwiH

шЯЯШШготаШт

GO G1 Aph S

'.J "„Гч- -

ШШШ.ШЁШШШШШ^ЁШЁШШй

i.*?-iv.f: Vî- jfl ^«CSsiV-Tl

ML Cdltj СгсЦд Д i

GO G1 Aph S

Рис. 3. Определение уровня циклина A, PCNA и Cdkl в субклеточных фракциях кле : СНО в течение клеточного цикла. (A) SDS-PAGE белковых фракций (CF, NEF, CMF и NMF последующим Вестерн-блотом, используя антитела к PCNA, циклину A, Cdkl или актину. G1 g обозначают соответственно образцы из клеток, находившихся в середине G 1-й середине S-фазы, § Относительное количество каждого белка, детектированного Вестерн-блотом. '

Рис. 4. 2DE белковые профили клеточных экстрактов (слева) и ядерного матрикса (NMF) (справа). Белки разделяли в 2DE (рН 3.0-10.0, 13-см и 11% SDS-PAGE) и окрашивали серебром. (As, G0 и S) Образцы, полученные из несинхронизированных клеток, синхронизированных в G0- или в середине S-фазы. В случае образцов (G0 и S) показаны только области геля, содержащие белки, существенно изменяющие экспрессию в клеточном цикле (соответствующая область на (As) отмечена квадратом).

Можно сказать, что значительные качественные изменения в белковых профилях синхронизированных клеток СНО возникают, когда клетки переходят из состояния покоя (G0) в |стадию деления (GI). Дальнейший переход от G1- к S-фазе в основном приводит к количественному ^увеличению этих изменений. Общий уровень PCNA в клетках СНО увеличивается только в два раза во время перехода от G0- к S-фазе. Причем уровень PCNA в цитоплазме довольно высок и не меняется по фазам цикла. Однако уровень его в хроматине и ядерном матриксе возрастает до 12 раз при переходе от G0- к S-фазе. Следовательно, важным механизмом регуляции PCNA является его

транспорт в места функционирования.Следует отметить, что PCNA аккумулируется в ядерно матриксе в середине фазы Gl еще до того, как перейти в хроматин на границе фаз G1/S, ч указывает на возможное участие PCNA не только в синтезе, но и в преинициации синтеза ДНК.

PCNÁ И КАНЦЕРОГЕНЕЗ

Профили PCNA нормальных и раковых клеток. Анализ клеточных культур показал, ч раковые клетки имеют значительно более высокий уровень PCNA, чем нормальные клетки, даже том случае, если они имеют одинаковую скорость деления. Как показано на рис. 5, первичнь эпителиальные клетки (НМЕС) и две линии бессмертных нераковых клеток (Hs578Bst и 184В имеют очень низкий уровень PCNA. И наоборот, линии раковых клеток (MDA-MB468, MDA-MB23 и MCF-7) показывают уровень PCNA в 5-6 раз выше, чем "нормальные" клетки. Эти данн указывают на прямую связь клеточной трансформации и повышенного уровня PCNA, хотя следу сказать, что некоторые бессмертные клеточные линии также показывают высокий урове экспрессии PCNA (MCF10A и СНО, рис. 5). С другой стороны, количество PCNA (как минимум диапазоне тех уровней, которые присутствуют в данных клетках) не является лимитирующи фактором, определяющим скорость пролиферации клеток. Почти у всех вышеупомянутых клеток э скорость практически одинакова, и время удвоения количества клеток равно примерно 30 часам, исключением клеток СНО (19 часов). По-видимому, повышенная скорость деления клеток СН связана с какими-то иными причинами, а не с PCNA, так как его уровень в этих клетках такой ж как и у клеток MDA-MB468, MDA-MB231 или MCF-7, которые имеют меньшую скоро пролиферации. Все вышеупомянутые клетки далее были проанализированы на предмет присутств каких-либо специфических для раковых клеток изоформ PCNA. Сначала был проанализиров широкий спектр изоточек (рис. 6А). Данные, полученные после 2DE и Вестерн-блота, показ присутствие во всех клеточных линиях только "кислой" формы PCNA (р/ ~ 4.6). Затем изоформ PCNA были проанализированы с помощью 2DE более высокого разрешения. Как видно на рис. 6 PCNA во всех проанализированных клеточных линиях имеет 3 изоформы одной массы, но разными изоточками (рI 4.52, 4.57 и 4.62). Мажорная форма была далее проанализирована помощью масс-спектрометрии, которая не выявила в ней никаких различий между нормальными раковыми клетками (рис. 7). Таким образом, было показано отсутствие специфических раковых и нормальных форм PCNA. Более того, метод белковой дактилоскопии показал практичес идентичность рекомбинантного PCNA и эндогенного PCNA человека (нормальные или раков клетки, мажорная форма, рис. 6). Причем использование различных протеаз дало возможное перекрыть всю последовательность PCNA детектированными на масс-спектрометре пептидны фрагментами (рис. 7). Так как только техническая модификация (алкилирование цистеин

1 2 3 4 5 6 7 8

Actin

В» 'Win» ••

□ ПП

Cell sam р le

Рис. 5. Первичные и бессмертные нераковые клетки обычно имеют низкий уровень PCNA. (А) Вестерн-блот клеточных экстрактов. MDA-MB468, MCF10A, MDA-MB231, Hs578Bst, НМЕС, 184В5, MCF-7, СНО (IS). PCNA детектировали с помощью антител РС10. В качестве контроля та же мембрана была обработана антителами к актину. (В) Интенсивность сигнала в каждой полосе определяли, используя программу Phoretix 2D (Nonlinear Inc).

А В

105 75 ■ ' ■ v . -и:: , - '•Vj. ■:■ .-.^.".li -'V -i^i',':. ' .f-Д-

50 30 MCF7 -'-"."*'■:. ,ч;- ..'. V' Лу; ■>•'■'., . ' ■

МВ468

МСР10А

МШ31 ттшттт^Ъ!.

■fcS78BEt

нмн; Г? : '

18485

СНО « " \

PCNA

МО=7 MBW8 МСР10А МВ231

Hs578Ett НМЕС 184В6 СНО PCNA

* <+

* ■■ * -

■

рН 3

рН

4.52 4.57 4.62

Рис. 6. РС^ из первичных, бессмертных и раковых клеток детектируется одинаковым образом с помощью (А) Клетки лизировали в буфере для образца и разделяли в 2БЕ (рН 3-10, 7см и 10% ЗОв-РАСЕ). (В) 20Е более высокого разрешения и чувствительности (рН 4—5, 18 см). РСЫА детектировали с помощью антител РС10.

ев врщокопг 75® hi a>®íeoii 914!« аоог ощзм

Г" ¡.ш-пяив жвп?"*ям

Lys-C

tJStee

SI TmsEGFDTY RCPKNI.AMGV Nl.TSMSKH.K CAGNKPIITL. RAEPNARTIA 101 1У1КЛГГ.ОКК VSPYKMKl.MI^LPYEOLGirE QEYSO-VKMf SO^ARICRP

101 EPVQLTFALR YLNFFTKATP LSSTVTLSMS ADVTl.Wr.VK TAUMGH1.KYY

ÍLSQTSNVDK EEEAVT1EMN

1 Ml'KAKLVOGS UJiKVLEALK OLINEACWPI SSSOVNLQSM DSSHVSLVQL 51 TLR.SF.GFPTY KCPHNI.AMGV M.TSMSKI1.K CAGNEPIITI. KAEPNAPT1.A 101I VFF«PN0FK VSPYFMKIMP I.РУУО!.GIPF OEYSCVVKMP SGEFARirRD 131 ЩЦЙДДУИ SCAKPGVKFS ASGELGNGM KLSQT5NVDK EEEAVT1EMN 101 EPVQLTFALR 1 ----- --

151 Г

Рис. 7. Масс-спектрометрия указывает на то, что основная часть PCNA l модифицирована in vivo. После 2DE гель окрашивали Кумасси, пятна, соответствующие PCN вырезали и проводили белковую дактилоскопию. Последовательности PCNA, которые бы,! детектированы, показаны на врезках.

возникшее в процессе анализа образца) была обнаружена в этих фрагментах, было сдела: заключение, что мажорная форма представляет собой в основном немодифицированный PCNA. Э заключение хорошо согласуется с тем, что изоточка мажорной формы, р/ 4.57, точно совпадав : теоретической изоточкой PCNA.

ПОСТТРАНСЛЯЦИОННЫЕ МОДИФИКАЦИИ PCNA

При использовании антител к PCNA детектируются более чем 20 пятен на 2DE (рис. 2). дополнение к А-, М- и В-формам видны пятна, представляющие пептиды PCNA, имеющие рез отличные от теоретических величины физико-химических параметров PCNA (р/, Mw). Бел« соответствующие пятнам Т (возможно, тример) и D (возможно, димер) имеют те же, что и основн форма PCNA, изоточки. Их присутствие в денатурирующих условиях объясняется, по-видимо^ образованием цистеин-цистеин сшивок между отдельными полипептидами PCNA в процес электрофореза даже в присутствии ДТТ (Herbert, Galvani et al„ 2001). Большое количество пят представляет пептиды, меньшие по размеру, чем интактный полипептид PCNA. Наиболее логична объяснением их присутствия является эндопротеолиз PCNA, причем очень специфический, так К| картина протеолиза PCNA из клеток китайского хомячка и из клеток человека, отличающих только по 3 аминокислотам, практически одинакова. Это указывает на сходство метаболизма PCipj в разных клетках млекопитающих. Мажорное (М) пятно PCNA соответствует полипептиду с масс; в 30 кДа и изоточкой, р/, 4.57. Эти данные соответствуют теоретическим параметрам PCN

Минорные пятна образуются из-за изменений в заряде или молекулярной массе и отражают степень модификации PCNA. Причем надо иметь в виду, что эти модификации могут быть биологическими (функциональными) или техническими, то есть возникшими при анализе образца. В частности, многочисленные фрагменты PCNA образуются при протеолизе во время 2DE и могут быть исключены добавлением протеасомного ингибитора MG132 или тиомочевины. Считается, что данный протеолиз имеет место также и in vivo (правда, в гораздо меньшей степени, и его обнаружение требует более чувствительных методов) (Naryzhnv and Lee. 2003; Yamamoto. Kimura et al.. 2004). Убиквитинирование PCNA является другой модификацией, которая ведет к появлению на двумерной карте пятен, соответствующих полипептидам большей массы (~ 40 кДа) и более щелочной изоточки, р/ (~ 5.0) (рис. 2).

Низкомолекулярные фрагменты PCNA являются результатом действия протеасом. Протеасомный распад PCNA может быть частью общего процесса самоуничтожения, происходящего в апоптозных клетках, или же связан с функционированием PCNA in vivo. Возможно, верны оба этих предположения. Для ответа на эти вопросы PCNA из клеток, находящихся в различных фазах клеточного цикла, а также вошедших в процесс апоптоза, был проанализирован с помощью 2DE и иммунодетектирования. Клетки, находящиеся в фазе покоя (G0) или в процессе апоптоза, не содержат большого количества фрагментов PCNA (Naryzhnv and Lee. 2003). Однако образцы, взятые из делящихся клеток (S- или С2-фаза), содержат большое количество продуктов протеолиза PCNA. ти данные указывают на связь протеолиза PCNA с его функционированием в фазах S и G2. Если етки были лизированы и прогреты при 100°С в буфере с LDS или же протеасомный ингибитор G132 был добавлен при получении образцов, протеолиз не наблюдался. Причем присутствие MSF и других протеазных ингибиторов, не влияющих на протеасомы, не сказывается на ротеолизе, указывая на то, что он является протеасом-специфическим (Naryzhnv and Lee. 2003).

Протеолиз PCNA in vitro может происходить во время ИЭФ. Хотя результаты 2DE с оследующим Вестерн-блотом указывают на то, что в небольшой степени протеолиз наблюдается и л vivo, очевидно, что основная его часть происходит in vitro уже после лизиса клеток. Чтобы етально выяснить, когда происходит протеолиз, образцы белков инкубировали разное время при 7°С и анализировали Вестерн-блотом (Naryzhnv and Lee. 2003). Протеолиз наблюдается после пределенного инкубационного периода при 37°С, но не при 4°С. Следует отметить, что профили ротеолиза всегда очень похожи, указывая на то, что гидролиз является специфическим, причем дет в основном с N-конца (Naryzhnv and Lee. 2003). То есть протеолиз PCNA в основном роисходит во время изоэлектрофокусировки, которая идет при 20°С в течение как минимум 6 асов.

Протеолиз PCNA является убиквитин-зависимым. На то, что гидролиз PCNA являете убиквитин-зависимым, указывает присутствие убиквитинированых форм PCNA при распаде PCN" Так как белки клеточного цикла часто регулируются через убиквитин-зависимый протеолиз, был проанализирована возможность убиквитинирования PCNA. Изначально было обнаружено, что дв белка массой в 42 кДа (р/ 4.85 и 4.90) детектируются при 20Е-анализе с последующи иммунодетектированием антителами к PCNA(U1 и U2, рис. 2). Чтобы подтвердить то, что эти белк являются конъюгатом PCNA и убиквитина, 2DE и Вестерн-блот-анализ были повторены использованием анти-PCNA и антиубиквитин моноклональных антител. Как ожидалось, был обнаружены пятна, окрашивающиеся как анти-PCNA, так и антиубиквитин-антителами, приче положение коньюгата PCNA-убиквитин на 2РЕ-карте и вычисленные физико-химически параметры (p//Mw) очень близки к теоретическим величинам (Narvzhny and Lee. 2003).

Правильная структура PCNA жизненно важна для клеточных функций. Классически механизм протеасомного протеолиза PCNA через полиубиквитинирование обнаруживается экспериментах по трансфекции клеток вектором, экспрессирующим GFP-PCNA (рис. 8 Повышенный уровень PCNA в клетке (даже в виде GFP-PCNA) не влияет на ее жизнеспособност (рис. 8А). Однако присутствие в клетке PCNA с нарушением четвертичной структуры, вызванны внесением мутаций, приводит к апоптозу (рис. 8В и С). Причем белковый анализ этих клеток помощью 2DE и Вестерн-блота выявляет полиубиквитинирование GFP-PCNA и его протеоли (рис. 8D). В данном случае интересно то, что вызывает катастрофические для клетки последствия н только PCNA, имеющий большие делеции, но и PCNA всего лишь с одной аминокислотной замено (R5A). О роли данной аминокислоты в структуре PCNA можно узнать в дальнейшем изложении (с Аминокислотные остатки Arg-5 и Lys-110 являются критическими для формировани двойного тримера PCNA). Полиубиквитинирование GFP-PCNA, ведущее к его протеасомно деградации, идет по любому лизину или же по N-концу. Все протестированные конструкции разными делециями (АА1-100, АА101-120, 121-172, АА173-183, АА184-259 и др.) одинаков эффективно подвергались полиубиквитинированию и приводили к клеточной гибели.

PCNA не фосфорилирован in vivo. Чтобы прояснить вопрос с фосфорилированием PCN " был использован широкий спектр экспериментальных подходов, включая изотопную метку in v/v иммуноосаждение, иммуноблот в комбинации с 2DE высокого разрешения. Белки клеток СН разделяли в 2DE, переносили на мембрану и иммуноокрашивали, используя смесь антител фосфосерину, фосфотреонину и фосфотирозину. Ту же самую мембрану дополнительн обрабатывали моноклональными анти-PCNA антителами. PCNA, идентифицированный с помощь PC 10, не дает сигнала при использовании антител к фосфопротеинам, указывая на то, что он н

ABC D

Ub iquitmation

Hydrolysis

Рис. 8. PCNA с нарушенной структурой вызывает апоптоз и гидролизуется в клетке через убиквитин-зависимый механизм. Клетки СНО были трансфецированы нормальным вектором, кодирующим GFP-PCNA (А), а также мутантным, замена R5A (В) или деления АА173-183 (С). Снимки сделаны через 36 часов после трансфекции на микроскопе Zeiss Axiovert 100 (х50). (D) Белки, экстрагированные из образца, показанного на (С), были проанализированы с помощью 2DE с последующим Вестерн-блотом, используя анти-GFP антитела (В2, Santa Cruz).

фосфорилирован. Далее были проанализированы белки из клеток, которые были метаболически мечены с помощью [32Р]ортофосфата (рис. 9). После разделения белков и окрашивания серебром положение PCNA было идентифицировано (стрелка на рис. 9А1). Тот же самый гель был высушен и экспонирован на рентгеновскую пленку (рис. 9В). Аналогично данным с использованием антител следов фосфорилирования PCNA обнаружено не было (стрелка на рис. 9В1). Для большей уверенности и повышения чувствительности анализа PCNA был иммуноосажден. Иммуноосажденные белки были разделены двумерным электрофорезом, окрашены серебром, а гель высушен (рис. 10А1) и экспонирован на рентгеновскую пленку (рис. 10А). Четко видно, что PCNA не фосфорилирован (стрелка на рис. 10А). Заметно, что близко к PCNA находится фосфопротеин (незакрашенная стрелка, (А) и (Al)). Хотя относительное количество этого белка мало', уровень фосфорилирования его очень высокий. Чтобы полностью исключить отношение этого белка к PCNA, был проанализирован еще и иммунопреципитат РС10 антител в режиме максимально высокого разрешения 2DE (pH 4.0-5.0, 18-см и 11% SDS-PAGE, 14х14-см гель). Белки были перенесены на мембрану, которая сначала была экспонирована на рентгеновскую пленку (рис. 10В), а затем иммуноокрашена с помощью антител PC 10 (рис. 10В1). Опять фосфорилирования PCNA обнаружено не было (стрелка на рис. 10В). Как и в случае 2DE более низкого разрешения

Рис. 9. Анализ меченных in vivo белков показывает, что PCNA не фосфорилиров

Белки, метаболически меченные [32Р]ортофосфатом, были разделены двумерным электрофорез; (рН 3.0-10.0, 13 см, и 11% SDS-PAGE, 13x13 см). Гель был окрашен серебром, высушен (А) экспонирован на рентгеновскую пленку (В). Al, В1 - увеличенные области, содержащие PCN Стрелки указывают положение PCNA.

(незакрашенная стрелка на рис. 10А), присутствие фосфопротеина (33 кДа, р/ 4.47) очевид) (незакрашенная стрелка на рис. 10В). Этот фосфопротеин, не дающий сигнала с РС10, немн меньше и "кислее", чем А-форма (34 кДа, р/ 4.52) или М-форма (34 кДа, р/ 4.57) PCNA. Однако осаждается вместе с антителами к PCNA (по-видимому, взаимодействует с ним) и вполне мо быть принят за фосфорилированный PCNA при анализе электрофорезом невысокого разрешен!:! Это, вероятно, и является причиной того, что в нескольких работах делается вывод фосфорилировании PCNA. Однако, суммируя вышеизложенные данные, можно определен! сказать, что PCNA не фосфорилирован in vivo.

PCNA может быть ацетилирован in vivo. Для выяснения вопроса об ацетилировании РС внутриклеточные белки были сначала метаболически мечены in vivo добавлением [3Н]ацетата натр в ростовую культуру, а затем разделены 2DE и переведены на PVDF-мембрану. Далее мембра' была сначала проэкспонирована на рентгеновскую пленку, а затем обработана антителами PC I'

к Da 105

75 50

35 30

рН 3.0

рН 4.4 4.7 4.4 4.7

Рис. 10. Комплексный анализ с помощью метки in vivo, иммунопреципитации и Вестерн-блота показывает, что PCNA не фосфорилирован in vivo. (A, Al) Белки, экстрагированные из клеток, метаболически меченных [32Р]ортофосфатом, подверглись иммуноосаждению с использованием антител РС10. Иммунопрепипитат разделяли двумерным электрофорезом. Гель окрашивали серебром (Al), высушивали и экспонировали на рентгеновскую пленку (А). (В, В1) Тот же иммунопреципитат разделяли двумерным электрофорезом более высокого разрешения (рН 4.05.0, 18 см, и 11%-й SDS-PAGE, 14 х 14 см). Затем белки переносили на мембрану, которую сначала экспонировали на рентгеновскую пленку (В), а затем иммуноокрашивали антителами к PCNA, РС10 (В1). Обведенные зоны на (А) и (Al) обозначают положение PCNA. Стрелка указывает на положение М-формы PCNA. Окружность на (В1) показывает положение фосфопротеина, обозначенного незакрашенной стрелкой на (В).

Использование одной и той же мембраны позволило идентифицировать PCNA среди 3Н-меченых (ацетилированных) белков. Чтобы получить дополнительные доказательства, белки были осаждены антителами РС10 и проанализированы 2DE с последующим Вестерн-блотом, используя антитела к ацетилированным пептидам и к PCNA. Полученные результаты находятся в согласии с данными эксперимента с меткой ш vivo и четко указывают на то, что PCNA может быть ацетилирован. Чтобы определить статус ацетилирования трех основных форм PCNA (А, М, В), белки были обработаны гистондеацетилазой (HDAC1) или ингибитором деацетилаз TSA с добавлением субстрата для

ацетилирования ацетил-СоА. Обработка НОАС1 ведет к увеличению количества В-формы, в та время как ацетил-СоА плюс ТБА - к уменьшению количества В-формы и возрастанию количеству А- и М-форм. Эти данные указывают на то, что А- и М-формы, соответственно, высоко и средне ацетилированы, а В-форма деацетилирована.

цикле был детально проанализирован. Как видно из рис. ИВ, уровень PCNA в ядерном экстракт] (NEF, nuclear extract fraction), хроматине (CMF) и ядерном матриксе (NMF) меняется в течени<< клеточного цикла, в то время как в цитозольной фракции (CF) остается сравнительно постоянны]^ Уровень PCNA значительно повышен в NMF начиная с середины Gl фазы, а в NEF - начиная j границы фаз G1/S (рис. IIB, NMF и NEF). Однако наиболее драматическое увеличение количеств! PCNA (до 7 раз) наблюдается в хроматиновой фракции (CMF) на границе фаз G1/S (рис. 1 IB, CMF) В совокупности эти данные говорят о том, что в середине Gl-фазы PCNA сначала транспортируете!-в ядерный матрикс, а затем, когда начинается репликация ДНК (граница фаз G1/S), переходит Hj ядерного матрикса в хроматин. Также был проверен и уровень модификации PCNA в разны: фракциях. Как видно из рис. 11С, только М-форма присутствует в цитоплазме, но значительно: количество A-формы обнаруживается во фракциях ядерного экстракта, хроматина и ядерног: матрикса (NEF, CMF и NMF). Интересно то, что B-форма присутствует только в ядерном экстракт' (NEF) и на уровне, сравнимом с уровнем М-формы. В совокупности это позволяет предположить, чт! А- и М-формы напрямую участвуют в ДНК репликации, а B-форма - нет. Относительный уровень ái формы хоть и не намного, но выше в хроматиновой фракции по сравнению с ядерным матриксом. j Ацетилирование и деацетилирование PCNA может происходить с помощью аиегнлаз рЗОО и деацетилазы HDAC. Чтобы определить ферменты, ответственные за ацетилирование! деацетилирование PCNA, белки клеточного экстракта были иммуноосаждены антителами к РСШ (РС10), и иммунопреципитат был проанализирован Вестерн-блотом, при этом иепользовалиС| антитела к HDAC1 и рЗОО. HDAC1 эффективно осаждается вместе с PCNA, указывая на то, что это' фермент может быть ответственен за деацетилирование PCNA (Naryzhny and Lee. 20041. Факта! транскрипции, ацетилаза рЗОО, также осаждается вместе с PCNA. Таким образом, эти результат:; позволяют предположить, что PCNA может быть ацетилирован ацетилазой рЗОО и деацетилирова деацетилазой HDAC1. Ацетилирование PCNA с помощью рЗОО, возможно, необходимо для репликаци! ДНК, так как фибробласты с генотипом рЗОО (-/-) не способны вести синтез ДНК (Hasan. Hassa et al.. 2001 Ацетилированный PCNA имеет большее сродство с ДНК-полимеразами, че деацетилированиый. Чтобы выяснить, насколько ацетилирование PCNA влияет на его способности

Субклеточная локализация изоформ PCNA в контексте клеточного цикла. PCNA в различных субклеточных фракциях и в зависимости от положения клетки в клеточное

16h Ш

14 h И)П ■ГЛЩЗШ

12h mm

10h HHSSwiihR Мга » НИ

9h ШВАЯ

8 h КжЯ

5h ■МЩ

G1/S ят

GO um

2N 4N1

CF NEF CMF

NMF WCE

G0&101/SS

a M в

Рис. 11. Определение уровня PCNA в разное время клеточного цикла и распределение изоформ PCNA в различных субклеточных фракциях. (А) Анализ положения клеток в клеточном цикле с помощью проточной цитометрии. Клетки СНО были синхронизированы в фазе GO (GO), а затем переведены в полную среду, содержащую 200 мМ мимозин, в которой они проходили фазу Gl, но останавливались на границе Gl/S (G1/S). (А) Числа, показанные слева, - время выхода клеток после остановки в G1/S. (В) Белки из разных субклеточных фракций клеток, синхронизированных в фазах GO, Gl, Gl/S и S (8 часов после удаления мимозина), были проанализированы SDS-PAGE с последующим иммунодетектированием антителами РС10. (С) Анализ общих белков (WCE) или белков из отдельных субклеточных фракций асинхронных клеток СНО с помощью 2DE и иммунодетектирования антителами PC 10.

взаимодействовать с ДНК-полимеразами, иммунопреципитат, полученный осаждением анти-PCNA антителами РС10 из клеточных экстрактов, обработанных деацетилазой HDAC1 или ингибитором деацетилаз, TSA, был проанализирован Вестерн-блотом с использованием антител к ДНК-полимеразам. Оказалось, что PCNA, обработанный деацетилазой HDAC1, проявляет намного меньшее сродство к ДНК-полимеразе дельта или ДНК-полимеразе бета, чем образец, обработанный TSA. Эта разница в сродстве особенно заметна в случае деацетилированного PCNA и ДНК-полимеразы дельта (Narvzhny and Lee. 2004). Таким образом, ацетилирование и деацетилирование PCNA играют важную роль в его связывании с ДНК-полимеразами и, соответственно, в репликации ДНК. Кроме того, репликация ДНК была протестирована in vitro с использованием комплексов PCNA, иммуноосажденных из ядерных экстрактов (NEF), которые были обработаны деацетилазой HDAC1 или ацетил-СоА плюс TSA. Образцы, обработанные HDAC1 (то есть деацетилированные),

проявляют значительно более низкую ДНК-полимеразную активность, чем те, которые обработань ацетил-СоА плюс TSA Суммируя вышеизложенное, можно предположить, что PCNA в виде М формы занимает положение на ядерном матриксе, близкое к сайтам инициации репликации ДНК, промежуток времени с середины до конца G1-фазы (рис. 11). При инициации репликации PCN' загружается на хроматин тоже в виде М-формы, так как она является доминирующей, как хроматиновой фракции (CMF), так и во фракции ядерного матрикса (NMF) (рис. ПС). А- и В формы, по-видимому, каким-то образом связаны с репликацией ДНК, возможно, загрузкой/разгрузкой PCNA на хроматин, так как они отсутствуют в цитоплазме, но присутствуют ядерном экстракте, хроматине и ядерном матриксе (рис. 11). Следует заметить, что повышенны уровень В-формы отмечен в ядерном экстракте (рис. 11С). Так как В-форма не проявляет большог сродства к ДНК-полимеразам бета и дельта, она не может участвовать в репликации ДНК. Можно таким образом, заключить, что М-форма PCNA участвует в синтезе ДНК, а А- и В-форм образуются в процессе снятия PCNA с ДНК или его загрузки и являются его промежуточным формами. Таким образом, полученные данные показали, что PCNA не фосфорилирован in vivo однако ацетилирование и деацетилирование могут объяснить сдвиг PCNA по заряду и образовани дополнительных пятен. При этом фактор транскрипции рЗОО и гистон-деацетилаза HDAC1 moi быть ответственны, хотя бы частично, за ацетилирование и деацетилирование PCNA. Однак вероятность того, что эти изоформы (А-, В-пятна, рис. 11) содержат еще и другие модификации такие как окисление или метилирование, в настоящий момент исключать нельзя. В частности метилирование глютаминовой или аспарагиновой кислоты является модификацией, которая мож привести к сдвигу изоточки, рI, в щелочном направлении (В-пятно). Изоточка мажорной формы ( точно соответствует теоретическим параметрам PCNA (р/ 4.57), то есть пятно представляет основном немодифицированную форму PCNA. Однако имеется вероятность того, что часть белка М-пятне содержит одновременно две модификации. Одна модификация образует А-форм (ацетилирование или окисление, сдвиг р/ -0.05), а другая ведет к В-форме (метилирование, сдвиг р + 0:05). При одновременном наличии двух таких модификаций общий заряд белка не изменится, полипептид будет иметь все ту же изоточку - 4.57.

СТРУКТУРА PCNA

PCNA млекопитающих организован в виде двойного тримера. Мономеры PCNA образую тримерную структуру в виде тора (Krishna. Kong et а!.. 1994). Однако ряд косвенных данны свидетельствует о том, что тор PCNA является не просто тримером, а двойным тримером (Henderson Wieeand et а!.. 2000). Изначально, чтобы получить информацию о белковых взаимодействиях PCNA эндогенный PCNA был проанализирован с помощью обычного SDS-PAGE. Как и ожидалось, тольк

мономер с массой в ~ 33 кДа был обнаружен в 12% денатурирующем геле (рис. 12А, 0 мин). Однако после предварительной обработки клеток 1.5%-м формальдегидом PCNA обнаруживается в области 33, 100 и 200 кДа. Причем четко прослеживается кинетика перехода детектирования PCNA от одной полосы в 33 кДа до практически одной полосы в ~ 200 кДа (рис. 12А, 90 мин). Дальнейшее увеличение времени сшивки формальдегидом не дало никаких дополнительных комплексов тяжелее 200 кДа (рис. 12А, 180 мин), прямо указывая на то, что детектируемый комплекс PCNA образован специфически и имеет определенную структуру, а не является неспецифическим конгломератом. Эксперименты со сшивками на клеточных экстрактах оказались более эффективными и показали практически те же результаты, что и с интакгными клетками. Чтобы выяснить возможное участие других белков (помимо PCNA) в образовании 200-кДа комплексов, были проведены эксперименты с 2DE. Как видно на рис. 12В, уже после 20 мин обработки формальдегидом в дополнение к 33 кДа существенно присутствие белков с массой в 100 и 200 кДа. И практически все молекулы PCNA образованы в 200-кДа комплекс, когда экстракт был обработан 90 мин (рис. 12С). Следует отметить, что 100- и 200-кДа комплексы и мономер PCNA имеют очень близкие изоточки (pl). То есть с очень большой долей вероятности можно говорить, что они содержат только молекулы PCNA, и, учитывая его молекулярную массу, 100-кДа комплекс представляет собой гомотример, а 200-кДа - двойной гомотример. Чтобы перевести все тримеры в двойные тримеры, необходимо достаточно длительное время сшивки. Возможно, это вызвано тем, что двойной тример PCNA находится в динамическом состоянии, как бы пульсирует, и необходимый контакт между аминокислотами, обеспечивающий сшивку, возможен не все время. По-видимому, это является одной из причин того, что в кристаллографических экспериментах обнаруживается только тример. Таким образом, в этих экспериментах сшивки PCNA с другими белками не наблюдается. Объясняется это, по-видимому, тем, что все молекулы PCNA находятся в клетке в виде двойных тримеров, где лизиновые и аргининовые остатки находятся в положениях, удовлетворяющих условиям сшивки формальдегидом (не далее 2А друг от друга). С другой стороны, таких условий для сшивки между этими остатками в PCNA и в PCNA-связывающих белках не имеется. Тем более что большинство PCNA-связывающихся белков взаимодействуют с PCNA через гидрофобную ложбину, образованную центральной петлей (41DSSH44) и петлей, соединяющей внутренние домены (I21LDVEQLGIPEQE132), ни одна из которых не содержит аргинин или лизин. Таким образом, не следует ожидать сшивки PCNA с другими белками формальдегидом, даже зная, что такие взаимодействия имеют место in vivo. Чтобы окончательно подтвердить, что 200-кДа комплекс PCNA не содержит других белков, были проведены эксперименты по обработке формальдегидом очищенного PCNA. Сшивка нативного PCNA 1.0%-м формальдегидом уже через 15 мин ведет к

o ío м зо so во teown

Formaldehyde 20 min

FomialdeJiyde 90 лип

Q 25'

O — 20-

í* í-

IM 2M ¡2JS Я.0 ЯЛ »J> I

Рис. 12. PCNA клеток млекопитающих существует в виде двойного тримера. (А)

Человеческие раковые клетки MDA-MB231, находящиеся в PBS, были обработаны 1.5%-ní формальдегидом в течение 10, 20, 30, 60 или 180 мин. Далее, образцы были проанализированы SDS| PAGE и Вестерн-блотом с использованием антител к PCNA. "М," "Т" и "DT" обозначаю^ соответственно, мономер, тример и двойной тример PCNA. (В, С) 20Е-анализ показывает, чт*| мономер, тример и двойной тример PCNA имеют одну и ту же изоточку. (D) Сшитый двойной тример PCNA (180 мин на панели А) был хроматографически очищен, и его положение (пик I] относительно несшитого рекомбинантного PCNA (пик II) при гель-фильтрации былс проанализировано на колонке S200. {На вставке) С помощью SDS-PAGE и окрашивания серебром показана степень чистоты очистки препаратов PCNA. 1 - рекомбинантный PCNA, 2 - сшиты: PCNA. Обозначения по осям: х - объем элюируюшего буфера, у - интегральная оптическа^ плотность (IOD) PCNA, детектированная на Вестерн-блоте.

образованию тримеров и двойных тримеров. Масс-спектрометрический анализ дал возможное^' более точно определить молекулярную массу всех комплексов PCNA, которая для мономера димера, тримера и двойного тримера равна, соответственно, 29.3, 58.6, 87.4 и 174.9 кДа. Исходя и] того, что молекулярная масса мономера PCNA человека равна 28 768 Да, полученные данные очен^ близко согласуются с теоретическими расчетами. Что касается поведения в растворе, то в отличие от нативного PCNA, PCNA, очищенный с помощью денатурирующего электрофореза (SDS-PAGE)I образует двойные тримеры чрезвычайно неэффективно. Более того, он образует многс неспецифических конгломератов при сшивках. Кроме этого, следует заметить, что в отличие oí нативного PCNA, PCNA, полученный с помощью SDS-PAGE, дает большое количество димеро^ после ренатурации. Это говорит о том, что PCNA очень сложно вернуться в нативную форм (двойной тример) после денатурации, особенно когда шапероны и другие дополнительные факторь] отсутствуют при ренатурации. Это еще раз подтверждает, что нативная конформация очень важна для формирования двойного тримера PCNA. Стабильность четвертичных структур PCNA оченш сильно зависит от рН. Тример, как и двойной тример, наиболее стабилен при рН 6.8, но чрезвычайн

нестабилен при рН ниже 5.5 или выше 8.5. Использование сшивки очищенного PCNA формальдегидом позволило более детально изучить стабильность двойного тримера PCNA. PCNA, тример и двойной тример наиболее стабильны в фосфатном буфере (РВ, рН 7,2) независимо от добавления NaCl (до 1 М). Это указывает на то, что ионное взаимодействие между двумя тримерами не столь важно для стабильности двойного тримера. Также не имеют особого значения разные концентрации MgCI2 (1-10 мМ), АТФ (0.5-2.0 мМ) или даже Тритона Х100 (до 5.0%). Так как добавление EDTA (1-10 мМ) также не оказывает влияние на стабильность тримера или двойного тримера, следует, что ионы Mg вообще не нужны для стабильной четвертичной конформации PCNA. Формирование двойного тримера, но не тримера, понижается в 2 раза в 0.1М Трис-буфере или в 0.2 М мочевине. Возможно, что это связано просто с конкуренцией аминогрупп Триса или мочевины за взаимодействие с формальдегидом. Однако 50%-я сахароза также понижает в 2 раза образование двойного тримера при сшивках формальдегидом. Здесь можно предположить, что расстояние (не больше 2к) между тримерами несколько меняется из-за присутствия молекул сахарозы, не давая возможности для сшивки формальдегидом. Очень важно отметить, что 0.02%-й SDS почти полностью дестабилизирует двойной тример, не влияя на тример. По аналогии с сахарозой 50%-й глицерин или 10%-й PEG значительно понижают стабильность четвертичной структуры PCNA. Также негативно сказывается и наличие стадии осаждения сульфатом аммония при очистке PCNA. Хотя механизмы дестабилизации структуры PCNA вышеуказанными факторами неизвестны, их следует учитывать при очистке PCNA и анализе его структуры.

Аминокислотные остатки Arg-5 и Lvs-110 являются критическими для формирования двойного тримера. Для дальнейшего изучения двойного тримера PCNA в клетках млекопитающих был использован объединенный белок GFP-PCNA, который экспрессируется в клетках СНО, трансфецированных вектором pEGFPCNA. Ранее было показано, что GFP-часть такого белка не мешает формированию функционального тримера PCNA (Leonhardt, Rahn et al.. 2000). В согласии с этими данными объединенный белок, GFP с PCNA человека, ведет себя аналогично эндогенному PCNA в экспериментах по сшивкам (рис. 13А и В). Аналогично предыдущим публикациям (Leonhardt. Rahn etal.. 2000) объединенный белок GFP-PCNA и в нашем случае локализован в местах репликации (фокусах) (рис. 13С). Для дальнейшей характеризации GFP-PCNA был проведен 2DE с последующим иммуноокрашиванием анти-PCNA антителами РС10. Как было описано ранее, эндогенный PCNA детектируется в виде трех отчетливых изоформ (рис. 13D, где М,А и В являются соответственно, мажорной (р/ 4.57), "кислой" (рI 4.52) и "щелочной" (р/ 4.62) изоформами). Объединенный GFP-PCNA белок также содержит три четкие изоформы (рис. 13D, обозначенные как М*, А* и В*), которые практически идентичны трем эндогенным изоформам, за исключением

молекулярной массы (~ 66 кДа) и изоточек (р/, соответственно, 5.0,4.95, и 5.05). Этот сдвиг по масс и заряду объясняется вкладом GFP. Как ожидается, 30-минутная сшивка клеточных экстракте формальдегидом приводит к детектированию тримеров и двойных тримеров эндогенного PCN (рис. 13Е, Т и DT соответственно). Подобным же образом GFP-PCNA также формирует тримеры двойные тримеры (рис. 13Е, Т* и DT* соответственно). Для картирования точных точек контакте между тримерами внутри двойного тримера был проведен анализ формирования комплексов помощью внесения мутаций на поверхности PCNA. Для этого было получено несколько векторо pEGFPCNA, несущих точечные и делеционные мутации в определенных местах PCNA. Как анти GFP, так и анти-PCNA (PC 10) антитела были использованы при иммуноокраске для того, чтоб отличить мутаитные GFP-PCNA белки от эндогенных PCNA. Следующие мутации никак не влиял на образование как тримеров, так и двойных тримеров: К13А, К14А, К254А, К20А, К80А, К117А К191А, К240А и К248А. Следует заметить, что Lys-13 и Lys-20 находятся внутри тримерног кольца PCNA, в то время как Lys-117 и Lys-254 - на его передней поверхности. Все остальные сай мутации находятся на обратной стороне тримера PCNA. Дальнейший мутационный анали идентифицировал Arg-5 и Lys-110 как два критических аминокислотных остатка, участвующих формировании стабильного двойного тримера при сшивках формальдегидом. Далее был проанализирована возможность синтетических пептидов ингибировать образование двойног тримера. Синтетические пептиды, представляющие участки PCNA, расположенные в районе Arg-(1MFEARLVQGSIL12) или Lys-110 (104EAPNQEKV111), ингибируют формирование двойно тримера, в то время как пептид (251LAPKIEDEEG260), соответствующий последовательности на С конце (локализована в передней части тримера), - нет. Кроме того, ни один из этих пептидов н ингибировал формирование тримера. В согласии с данными, полученными путем мутационно анализа, эти результаты подтверждают, что остатки Arg-5 и Lys-110 являются существенным точками контакта между тримерами в двойном тримере PCNA. В дополнение необходимо отметить что ингибирование образования двойного тримера пептидами было эффективно только в буфере содержащем 15 мМ NaCl, и не было эффективным в клеточных экстрактах, содержащих 150 м NaCI. Это говорит о том, что PCNA существует в виде двойного тримера, который хотя динамичен, но все же не может быть легко разрушен при физиологических солевых условия синтетическими пептидами.

Образование двойного тримерного комплекса PCNA существенно для деления выживаемости клеток млекопитающих. Чтобы взглянуть на последствия нарушени формирования двойного тримера в клетках млекопитающих, клетки СНО были трансфецирован векторами, кодирующими дикий тип или же PCNA с двойной мутацией R5A/K110А. Оказалось, чт

~ 5 и 35% клеток, трансфецированных, соответственно, диким или мутантным вектором, проявляют так называемый округлый фенотип через 24 часа после трансфекции. Через 48 часов их содержание уже 10 и 70%. Анализ с помощью проточного цитофлуориметра показал, что округлые клетки в случае трансфекции мутантным вектором находятся в фазе G0/G1 и умирают через несколько дней. Однако большинство округлых клеток, наблюдаемых при трансфекции нормальным вектором, являются обычными митотическими клетками и не умирают при дальнейшем культивировании. Конструкции с одиночными мутациями R5A или Kl 10А показали такой же эффект, как и двойные мутанты, R5A/K110A. Эти данные указывают на то, что R5 и К110 являются существенными аминокислотными остатками для формирования двойного тримера PCNA, что в свою очередь очень важно для клеточного роста и выживаемости.

Только двойной, но не одиночный тримео может одновременно взаимодействовать с ДНК-полимеразой дельта и CAF-1. Передняя часть тримера PCNA может взаимодействовать со многими белками, включая ДНК-полимеразу дельта и CAF-1. Ранее предполагалось, что обратная сторона могла бы участвовать в регуляции различных функций PCNA через взаимодействие с другими регуляторными белками (Fukuda. Morioka et al.. 1995). Однако на сегодняшний день нет никаких доказательств того, что какие-то белки связываются с тримером PCNA через его обратную сторону. Модель двойного тримера "спина к спине" объясняет, почему белки не взаимодействуют с обратной стороной тримера PCNA. Более того, наличие двух передних сторон в одном двойном тримере PCNA позволяет ему одновременно связываться с двумя разными белками и "координировать" различные функции, такие как репликацию ДНК, репарацию ДНК и контроль клеточного цикла. Чтобы определить, действительно ли ДНК-полимераза дельта и CAF-1 могут одновременно взаимодействовать с PCNA, клеточный экстракт клеток, экспрессирующих GFP-PCNA, был обработан ДНКазой 1 и подвергнут иммуноосаждению антителами РС10, пришитыми к агарозным шарикам. Затем иммуноосажденные вместе с PCNA белки были диссоциированы с этих шариков и подвергнуты вторичному иммуноосаждению с использованием антител к ДНК-полимеразе дельта. Конечный преципитат, представляющий собой комплекс PCNA с ДНК-полимеразой дельта, был проанализирован с помощью SDS-PAGE и последующего иммуноокрашивания антителами анти-CAF-l, анти-ДНК-полимераза дельта, и анти-PCNA, PC 10. Полученные результаты говорят, что PCNA - ДНК-полимеразный комплекс содержит также и CAF-1, подтверждая то, что ДНК-полимераза дельта и CAF-1 могут одновременно взаимодействовать с PCNA. Чтобы усилить доказательства наличия такого взаимодействия, было проанализировано связывание нормального и мутантного PCNA. Комплексы CAF-1 были осаждены

1 2 3 kDa 1 2 3

rff 400 200 tz

WWW 66

33 t

А , в

DT* T*

Mono*

M* А,« в*

M А В

* DT* DT- ♦ Т*

Т»

Mono* Mono« Е

рН 4

Рис. 13. Эктопически экспрессированный в клетках млекопитающих GFP-PCNA веде! себя аналогично эндогенному PCNA. (А) Клеточные экстракты клеток СНО, трансфецированны вектором, экспрессирующим GFP-PCNA, были проанализированы в SDS-PAGE с последующий иммуноокрашиванием анти-GFP (А) или анти-PCNA (В) антителами. Образцы сшивал] формальдегидом 0, 30 или 60 мин (дорожки 1, 2, 3). Mono - мономер, Т - тример, DT - двойно] тример, * - GFP-PCNA комплексы (относительное количество эндогенного PCNA намного ниж чем GFP-PCNA в данном эксперименте, стрелка указывает положение эндогенного PCNA). (€ Клетки со стабильной экспрессией GFP-PCNA под флуоресцентным микроскопом (увеличени| х315). Обращает внимание локализация GFP-PCNA в репликативных фокусах. 2DE сшитого (Е) ] несшитого (D) клеточного экстракта с последующим иммуноокрашиванием антителами к PCN-М - мажорная форма, А - "кислая" форма, В - "щелочная" форма.

с помощью моноклональных антител к р150-субъединице CAF-1 и с использованием клеток трансфецированных нормальным или мутантным (R5A/K110A) вектором. Затем эти комплексу проанализировали Вестерн-блотом, используя антитела против ДНК-полимеразы дельта, CAF-1 ил! PCNA. Как ожидалось, субъединица CAF-1, р150, присутствует в общем клеточном экстракте ] иммунопреципитате, полученном из клеток, трансфецированных нормальным или мутантным п< PCNA вектором. Существенно то, что комплекс CAF-1, иммуноосажденный из клето трансфецированных нормальным PCNA, также содержит ДНК-полимеразу дельта. И наоборот: комплекс CAF-1, иммуноосажденный из клеток, трансфецированных R5A/K110A мутантнь»

Рис. 14. Близкий контакт между Arg-5 (US) и Lys-110 (К110) обеспечивается через замок петли BD2BE2 одного тримера в канавке, образованной BAI, ВВ2, ВН2 и BI2 другого тримера. (А) Вид спереди и сзади тримеров PCNA был получен с помощью программ RasMol и Swiss-PDB Viewer, а файла lAXC.pdb - из банка белковых структур PDB (Protein Data Bank). Затем тримеры PCNA были показаны в положении "спина к спине", используя PhotoEditor и PowerPoint, чтобы показать точки контакта сбоку (нижняя часть А). Для простоты показаны только 2 из 6 контактных точек. (В) Контактное положение показано с использованием slab mode программы RasMol Version 2.7.2.1. L и * являются, соответственно, петлей I3D2BE2 и канавкой вокруг BAI, J3B2,13Н2 и BI2 (Krishna. Kong et al., 1994).

Front

MFF.ARLVQGS SI

TLRSEGFDTY 101

LVFEAPNQEK IS1

LSHIGDAVVI 201

EPVQl.TFAl.R 281

i.At'Kii Ш I

tLKKVLF.Al.K DL1NKACWB1 61 71

RCDRNLAMCV NLTSMSKILK III 121

VSDVEMK1 Ml l.l>VFyi.<;il'E 161 111 SCAKOCVKFS ASGELGNGNI 2lt 221 YLNFFTKATP l.SSTVTLSMS 261

.11 41

SSSGVNl.QSM DvSIIVSLVQL

81 91

CAGNEDIITL RAEDNADTLA

131 141

QEYSC VVKMP SGEPARICRD

181 191

KLS(,> IsNVDK KFKWTIEMN

231 241

ADVPLVVEYK IADMGHLKYY

Виск Front

Рис. 15. Разные уровни организации PCNA. (А) Аминокислотная последовательность PCNA человека. Петля, соединяющая внутренние домены, IDCL (118LMDLDVEQLGIPEQEYSC135), центральная петля, CL (41DSSH44), С-конец, С (254KIEDEEGS261) показаны красным цветом; петля обратной стороны, BL (184QTSNVDKEEEAV195) - розовым цветом. (В) Трехмерная структурная модель мономера PCNA (показана цепь Е из файла 1АХС, http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do). IDCL, CL, С показаны красным; BL - розовым. Спиральные области - розовые и бета-структуры - желтые. (С) Организация тримера PCNA (1ХС) показана спереди. (D) Вид сбоку. (Е) Модель двойного тримера PCNA. ЮСЕ, CL, С показаны красным; BL - розовым.

вектором, не содержит ДНК-полимеразу дельта, хотя и нормальный PCNA и R5A/K110A мутант, очевидно, имеют одинаковое сродство к CAF-1 (Narvzhnv and Lee. 2004). Таким образом, следует, что тример PCNA может связываться с ДНК-полимеразой дельта или с CAF-1, но не с обеими одновременно. Так как нормальный PCNA может образовывать комплекс "спина к спине" из двух тримеров, он одновременно может связаться с ДНК-полимеразой дельта и CAF-1. Однако мутант R5A/K110A, по-видимому, такого комплекса образовать не может и, соответственно, не может одновременно связать ДНК-полимеразу дельта и CAF-1. Этот набор данных вместе с данными, приведенными на рис. 14С подтверждает, что нормальный PCNA, но не мутант R5A/K110A, образовывает двойной тример PCNA. Важно заметить, что хотя тример PCNA содержит 3 идентичных сайта для PCNA-связывающихся белков, взаимодействие каждого конкретного белка (комплекса) происходит на конкурентной основе за счет других взаимодействующих с PCNA белков. По-видимому, это происходит потому, что один белок (комплекс) при взаимодействии оккупирует большую часть передней поверхности тримера PCNA, как, например, хорошо видно в случае с ДНК-лигазой 1 (Pascal. O'Brien et al.. 2004). ДНК-полимераза дельта и CAF-1 образуют достаточно большие комплексы и состоят из, соответственно, четырех (р125, р60, р50 и р12) и трех (р150, р60 и р48) субъединиц. Таким образом, следует вывод, что один тример PCNA не может физически взаимодействовать одновременно и с ДНК-полимеразой дельта и с CAF-1.

Функциональная модель PCNA млекопитающих. Формальдегид является гомобифункциональным сшивающим амины агентом, требующим, чтобы расстояние между сшиваемыми аминокислотами было не больше чем 2Á. Поэтому для того чтобы обеспечить тесный контакт Arg-5 одного тримера с Lys-110 другого, петля BD2BE2 должна найти углубление на другом тримере PCNA. Таким образом, достаточно близкий контакт между Arg-5 и Lys-110 должен достигаться через замыкание двух тримеров PCNA посредством петель и ложбин. В согласии с этой идеей топологический анализ с использованием программы Hex 4.2 показал, что стыковка двух тримеров может произойти, если два тримера, расположенных симметрично напротив друг друга, немного повернуть так, что петля BD2BE2 (рис. 14В, L) одного тримера попадает в ложбину другого тримера, образованную вокруг BAi (аминокислоты 9-20, GSILKKVLEALK), ВВ2 (аминокислоты 209-211, LRYLNFFTKATPL), ВН2 (аминокислоты 235-241, LVVEYKI) и BI2 (254GHLKYYL). (рис. 14В, *). При этом Arg-5 одного тримера и Lys-110 другого тримера оказываются достаточно близко друг к другу для того, чтобы быть сшитыми формальдегидом. В свое время Хендерсон и соавторы, изучая PCNA в модельной системе Drosophila melanogaster, предположили, что результаты их генетических экспериментов могут быть объяснены, если предположить, что два тримера PCNA образуют комплекс "спина к спине" (Henderson. Wiegand et al.. 2000). Наши данные, основанные на

химических сшивках и мутагенезе, подтвердили, что РСКА в клетках млекопитающих находится в виде двойного тримера, и аминокислоты и Ьув110 играют ключевую роль в его формировании и детектировании. Более того, модель структуры двойного тримера РСКА "спина к спине" дает основание предполагать, что многие клеточные функций, такие как эпигенетический контроль, ДНК-метилирование и ДНК-репарация, тесно связаны с репликацией ДНК через дуплетный комплекс РСКА. Практически все молекулы РСКА в клетке млекопитающих могут быть химически сшиты формальдегидом и обнаружены в виде двойного тримера (рис. 12, 15).

ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ РСКА

Был проведен систематизированный анализ взаимодействующих с РСКА белков на основании поиска в базах данных и в журнальных публикациях. С одной стороны, такая систематизация дала возможность оценить масштаб взаимодействий РСКА, а с другой стороны, подняла ряд вопросов. Один из них касается полифункциональности белков вообще и РСКА в частности. Поэтому распределение связывающихся с РСКА белков по функциям, в которых они принимают участие, дает возможность оценить и возможную роль РСКА в этих процессах.

Репликация ДНК

Репликация ДНК является первым процессом, где было показано участие РСКА. Если изначально это участие связывали только с ролью "белка-скрепки", помогающего работе полимераз, то сейчас РСИА рассматривается как некая платформа, на которой разворачиваются многие события, происходящие при репликации ДНК. При этом организация в виде двойного кольца идеально подходит для такой функции. Две симметричные площадки для белкового взаимодействия, направленные в противоположные стороны на реплицирующейся ДНК, позволяют РСКА, например, одновременно связываться с несколькими ферментами, обеспечивающими процессинг на запаздывающей нити ДНК (рис. 16). Кроме того, такая структура РСКА позволяет ему участвовать в синтезе ДНК и других процессах, таких как сборка хроматина или метилирование ДНК (рис. 16).

Репарация ДНК

Репарация, так же как и репликация ДНК, в конечном итоге в большей степени зависит от синтеза ДНК. Поэтому достаточная гибкость репликативного аппарата вполне естественна, и участие многих ферментов репликации ДНК в репарации ДНК объяснимо. А присутствие их в списке белков, взаимодействующих с РСКА, еще раз указывает на то, что РСЫА является белком, координирующим эти процессы. Но помимо таких ферментов имеется еще и длинный список белков с чисто репаративными функциями, которые взаимодействуют с РСКА. Причем интересно то, что,

Рис. 16. Схематическое изображение координации работы белков при репликации ДНК млекопитающих. Для

упрощения показана репликативная вилка, образующаяся при расплетании двунитевой нити ДНК-хеликазным комплексом МСМ2-7 - Cdc45 - GINS с помощью топоизомеразы. В реальности реплицируется хроматин (нуклеопротеид). ДНК-полимеразы дельта и эпсилон закреплены на ДНК с помощью PCNA и ведут синтез, соответственно, на запаздывающей и лидирующей нитях ДНК. На запаздывающей нити также работают ДНК-полимераза альфа/праймаза и факторы, вовлеченные в созревание фрагментов Оказаки.

как следует из анализа полученных списков, координация возможна как на уровне переключения с I репликации на репарацию одного фермента (например, ДНК-полимеразы дельта), так и на уровне смены репликативного белка на репаративный белок. Так, например, происходит в случае большой группы полимераз, функционирующих только при наличии повреждений в ДНК. Это так i называемые ошибочные (TLS) полимеразы (ДНК-полимераза эта, йота, каппа, лямбда), способные вести синтез в обход повреждений (Hubscher. Maga et al.,2002). Все они взаимодействуют с PCNA. В данном случае с помощью убиквитинирования PCNA работает как переключатель ДНК-полимераз.

Контроль клеточного цикла, выживаемость. Как белок, количество которого изменяется в течение клеточного цикла, PCNA, возможно, участвует в его контроле через взаимодействие с циклинами, циклин-зависимыми киназами и их ингибиторами. Так как эти белки сами осциллируют по циклу, то, по-видимому, самый непосредственный путь связан с образованием мультимерных комплексов типа PCNA - Cdk - циклин D - р21 (Xiong. Zhane et al., 1993). Функции этих комплексов, возможно, могут быть как позитивными, так и негативными и заключаются в целенаправленном активировании циклин-зависимых киназ. Мишенью таких киназ могут служить самые разнообразные ключевые белки клеточного цикла, например RFC, DNA-лигаза или FEN-1. Детальные последствия этого фосфорилирования еще до конца не понятны. Возможно, что далее

PCNA

могут быть задействованы другие реакции, например, протеолиз. Интересно то, что в случае Cdtl е специфический . протеасомный гидролиз может обеспечиваться непосредственно за сч взаимодействия PCNA с Cdtl. Как это происходит, неизвестно, показано только, что при этом ид убиквитинирование по N-концу и в процессе участвуют белки Си14 и Ddbl, компоненты убиквити лигазы ЕЗ (Senea. Sivaprasad et al.. 20061 Возможно, по такому же принципу PCNA участвует контроле клеточного цикла и выживаемости на уровне транскрипции, где регуляция идет п контролем р53 (Saifudeen. Marks et alT 2002). В этом случае негативным регулятором р53 выступа другая убиквитин-лигаза, Mdm2. То есть во всех этих случаях PCNA выступает как своего ро "регулировщик", обеспечивая необходимую акцию в нужное время и в нужном месте.

Сборка хроматина, эпигенетика и когезия хроматид. Здесь роль PCNA в первую очере касается белок-белкового взаимодействия, в частности возможности PCNA одновремен взаимодействовать с несколькими белками и ориентации этого взаимодействия на репликативн вилке. Механизм этого взаимодействия весьма логично вписывается в модель координации синте ДНК и сборки хроматина, основанную на структуре PCNA в виде двойного кольца (рис. 1 Следовательно, ремоделирование, сборка хроматина и эпигенетические модификации мо происходить непосредственно в процессе репликации ДНК.

Транскрипция и другие разнообразные функции. На сегодняшний день все, что более и менее касается участия PCNA в транскрипции, связано с регуляцией им факторов транскрипци таких как рЗОО или р53. Причем здесь пока можно говорить только о негативной регуляции, как случае с р53. Хотя, казалось бы, PCNA мог бы и непосредственно принимать участие в рабо транскрипционного аппарата и регулировать экспрессию генов, как это делает "скользящая скрепк gp45 бактериофага Т4 (Herendeen. Kassavetis et al.. 1992: Brodv. Kassavetis et al.. 19951. Тем более ч взаимодействие PCNA с РНК-полимеразой III, во всяком случае у дрожжей, было показано (Н Gruhler et al., 2002V К сожалению, этот крайне интересный аспект координации репликативного транскрипционного аппаратов проясней крайне слабо. Причем из-за того, что для работы и того другого белкового комплекса необходимо раскрытие хроматиновоЙ структуры, процесс мог бы €ы обоюдовыгодным - или транскрипция инициирует репликацию ДНК (MacAlpine. Rodriguez et 2004). или репликация ДНК индуцирует транскрипцию (Humpherv-Smith. 1999). При этом PCNA м бы играть роль переключателя данных процессов.

Удивительно то, что имеется большой список связывающихся с PCNA белков, которь вовлечены в клеточные функции, где роль PCNA пока еще трудно объяснить (Narvzhny. 2008). случае с мембранными и цитоскелетными белками возникает искушение предположить, ч взаимодействие Р CNA с ними связано с транспортом. PCNA не содержит сигналов ядерной

локализации, является очень кислым белком, что не характерно для ядерных белков, но локализуется обычно в ядре. По-видимому, другие механизмы, не регулируемые по классической схеме импортином альфа и импортином бета, отвечают за импорт PCNA в ядро. Взаимодействие PCNA с факторами трансляции (EF1A, E1F1B) или ферментами метаболизма указывает как на возможность дополнительных функций этих белков, так и на участие PCNA в метаболических процессах. Например, EF1A, помимо того что является основным фактором трансляции, возможно, является также компонентом убиквитин-зависимой системы протеолиза (Gonen. Smith et al.. 1994). которая вовлечена в систему баланса между моно- и полиубиквитинированной формами PCNA (Toueille, I Saint-Jean et al.;2007). PCNA регулируется через убиквитинирование и SUMO-илирование, и он сам j также может управлять убиквитинированием и протеолизом других белков, таких, например, как Cdtl (Arias and Walter, 2006). Способность PCNA взаимодействовать с такими протеолитическими ферментами, как куллин-2 (CUL2_HUMAN), фактор б, ассоциированный с TNF (TRAF6_HUMAN), или убиквитин-протеин-лигаза Mdm2 (Banks. Wu et al., 2006), дополняет картину участия PCNA в j протеолизе других белков.

Взаимодействующие с PCNA белки, обнаруженные Фар-Вестерном. Подход с использованием Фар-Вестерна в комбинации с 2DE выявил многочисленные пятна, представляющие

Рис. 17. Координирующая модель работы PCNA. Двойной тример PCNA необходим для координации

репликации ДНК и других клеточных функций (например, эпигенетика).

(A) Двойной тример PCNA загружается на ДНК с помощью RFC.

(B) RFC отделяется от хроматина/PCNA, а ДНК-полимераза (дельта или эпсилон) присоединяется к комплексу PCNA со стороны направления полимеразной реакции.

белки в нормальных и раковых клетках, которые взаимодействуют с PCNA (рис. 18). Чтоб идентифицировать эти белки, каждый образец был подвергнут 2DE в дубликатах. Затем один ге был окрашен Кумасси, а другой переведен на PVDF-мембрану и обработан в соответствии протоколом Фар-Вестерна. Совмещая пленку и окрашенную мембрану, пятна, соответствующие сигналам на Фар-Вестерне, были выявлены в геле и самые мажорные из них был идентифицированы с помощью белковой дактилоскопии. Удалось идентифицировать более 1 взаимодействующих с PCNA белков, причем уровень экспрессии многих из них отличается нормальных и раковых клетках, и они являются известными или потенциальными онкомаркерам (табл.). Наиболее сильно уровень экспрессии в раковых клетках, по сравнению с нормальным клетками, увеличен у EF1A2, чуть менее у пептидил-пролил-цис-транс-изомеразы митохондриальной малат-дегидрогеназы и пероксиредоксина-6. Особенно интересно то, что шест белков в списке взаимодействующих с PCNA белков, обнаруженных Фар-Вестерном, являютс гликолитическими ферментами (табл.). Естественным образом сразу возникает предположение участии PCNA в гликолизе. Для получения дополнительной информации, подтверждающей эт предположение, были проведены следующие эксперименты. Сначала взаимодействие ферменто гликолиза с PCNA было подтверждено с использованием чистых белков и опять же Фар-Вестерн но в комбинации с одномерным электрофорезом. Шесть из десяти ферментов, участвующих в гликолиз (фруктозо-бифосфат альдолаза А, триозофосфатизомераза, глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназ фосфоглицерат киназа 1, фосфоглицерат мугаза 1, альфа-энолаза), подтвердили свое взаимодействи с PCNA. Интересно то, что эти ферменты отвечают за шесть последовательных стадий гликолиза, дополнение, взаимодействие некоторых из них с PCNA было подтверждено в экспериментах использованием иммуноосаждения и гель-фильтрации. Следует отметить, что в свое время был предложено множество гипотез и схем, объясняющих пространственную и временную организаци реакций гликолиза, который в большинстве клеток проходит в цитоплазме. Много усилий был потрачено также на обнаружение и выделение гликолизного комплекса. Однако убедительны доказательств его существования все еще не представлено. Трудность состоит в большом числ компонентов и их слабого взаимодействия друг с другом. Вполне возможно, что и PCNA также мо бы принимать участие в гликолизе за счет одновременного взаимодействия с разными белками ферментами, обеспечивая эффективный переход продукт-субстрат. Структурная организация PCN очень хорошо подходит для этой роли. Он может одновременно разместить на себе разные белки партнеры и, возможно, играть роль координирующей станции не только для репликации ДНК репарации ДНК и сборки хроматина, но и для ферментов гликолиза.

Far-Western: РС10 Coomassie

рНЗ 10 3 pHIO

Рис. 18. PCNA-связывающие белки, обнаруженные Фар-Вестерном в нормальных, НМЕС (А, В) и раковых, MDA-MB468 (С, D) клетках. (А) Клетки дотировали в буфере для образца, белки разделяли в 2DE, переводили на мембрану, ренатурировали, инкубировали с PCNA и PCNA-связывающие белки детектировали антителами к PCNA, РС-10 (А, С). Белки, разделенные в 2DE, окрашивали Кумасси R350 (В, D).

Локализация PCNA. Процессы гликолиза идут в цитоплазме и, соответственно, гликолитические ферменты локализованы в основном в цитоплазме. С другой стороны, PCNA, как даже следует из его названия, считается ядерным белком, и если имеется функциональный вклад PCNA в гликолиз, то, по-видимому, это должно происходить в цитоплазме. Чтобы прояснить данную ситуацию, аспект локализации PCNA был проанализирован более детально, в разных

Таблица

PCNA-связывающиеся белки, обнаруженные Фар-Вестерном

№ Название Функция Экспрессия при раке 1

1 ALDOA_HUMAN (Fructose-bisphosphate aldolase А) Альдолаза гликолиз, стадия #4 не меняется

2 TPIS_HUMAN (Triosephosphate isomerase) Триозофосфатизомераза гликолиз, стадия #5 не меняется

3 G3P_HUMAN (Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogena^ Гчицеральдегид-3-фосфшп дегидрогеназа гликолиз, стадия #6 не меняется (

4 PGK1_HUMAN (Phosphoglycerate kinase 1) Фосфоглицерат киназа 1 гликолиз, стадия #7 не меняется ' |

5 PGAMlJrIUMAN (Phosphoglycerate mutase 1) Фосфоглицерат мутаза 1 гликолиз, стадия #8 не меняется

6 ENOAJHUMAN (Alpha-enolase A) Альфа энолазаА гликолиз, стадия #9 не меняется

7 LDHAJHUMAN (L-lactate dehydrogenase A chain) Лактат дегидрогеназа гликолиз, стадия #11 не меняется 1

8 MDHM_HUMAN (Malate dehydrogenase, mitochondrial precursor) Manam дегидрогеназа метаболизм не меняется |

9 EF1A2_HUMAN (Elongation factor 1-alpha 2) Фактор элонгации 1 альфа 2 биосинтез белка, миграция клеток повышенная

10 PPIA_HUMAN (Peptidyl-prolyl cis-trans isomerase A) Пептидил-пролил цис транс изомеразаА структура белка повышенная 1

11 PRDX6_HUMAN (Peroxiredoxin-6) Пероксиредоксин 6 окислительно-восстановительные реакци, повышенная

12 CAH2_HUMAN (Carbonic anhydrase 2) Карбоноеая ангидраза 2 метаболизм не меняется

13 RSSA_HUMAN (40S ribosomal protein SA) Белок SA из 40S рибосом синтез белка, передача сигналов не меняется

14 !C2C7_HUMAN (Keratin, type II cytoskeletal 7) Кератин из цитоскелета - 7, тип 2 цитоскелет, клеточный рост, дифференцировка пониженная 1 ■

15 HNRH1_HUMAN (Heterogeneous nuclear ribonucleoprote H) Гетерогенный ядерныйрибонуклеопротеин H сплайсинг и процессинг нРНК не меняется - 1

16 ANXA2JHUMAN (Annexin А2) Аннексии А2 физиология мембран пониженная \

клетках и при различных условиях. Оказалось, что хотя PCNA и является в основном ядернк| белком, значительная часть его все-таки может присутствовать и в цитоплазме. Используя векщ кодирующий GFP-PCNA, можно получить клеточные линии, стабильно экспрессирующие GFii PCNA. Что любопытно, локализация GFP-PCNA в этих линиях может быть очень разной, основном ядерной и в основном цитоплазматической. Более того, распределение GFP-PCN. и ферментов гликолиза может быть очень похожим (Narvzhnv and Lee/20101. Таким образом, следу? отметить, что цитоплазматическая часть популяции PCNA может быть очень значительной. Однай по-видимому, из-за того, что роль PCNA в процессах, происходящих в хроматине хорошо известна!

А 160

0 12 3

0.14 0.12

О.Ю

> 0.06 1 0Л6 g 0.04 < 0.02 aOJOO

• GFP-PCNA

G3P — «■•*' PCNA

О 2 4 б 8 10 12 Reaction time in min

12 3 4

Рис. 19. Реакции гликолиза могут стимулироваться PCNA in vitro. (А) Присутствие PCNA в системе ферментов, содержащих альдолазу (ALDOA), триозофосфатизомеразу (TPIS) и глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназу (G3P), представляющих стадии №№ 4, 5, 6 гликолиза, заметно увеличивает скорость реакции. Альдолазную реакцию проводили после преинкубации (10 мин, 4°С) компонентов реакции с разными количествами PCNA (0 - нет PCNA, 1 - 2.5 мкг/мл, 12-5 мкг/мл, 3-10 мкг/мл). Использовали капорометрический набор от Caldon Biotech, Inc (Carsbad, j CA, USA), содержащий TPIS, G3P, NADH и альдолазу (1 мкг/мл). (В) Активность G3P в экстрактах НЕК клеток и в экстрактах НЕК клеток, стабильно экспрессирующих GFP-PCNA. Активность G3P определяли по поглощению при 560 нм, используя набор реагентов KDalert kit и следуя инструкциям производителя (Ambion Inc, Austin, ТХ, USA). (С) Следует отметить, что уровень G3P в таких клетках одинаков, зато общее содержание PCNA за счет экспрессии GFP-PCNA повышено в -1.5 раза (дорожки 3, 4- PCNA и GFP-PCNA). На дорожки 1, 3 наносили экстракт клеток НЕК 293, а на дорожки 2, 4 - экстракт клеток НЕК 293, экспрессирующих GFP-PCNA. (1, 2) Окрашивание Кумасси R350. (3,4) Иммуноокрашивание антителами к G3P, а затем антителами к PCNA (РС10).

интенсивно изучается, цитоплазматический РСЫА до сего времени рассматривался в лучшем случае

как артефакт, несмотря на то, что имеется много публикаций, касающихся цитоплазматической

Активность ферментов гликолиза и РСГСА. Чтобы изучить возможный вклад взаимодействия РСКА с гликолитическими ферментами, активность некоторых из них была

протестирована in vitro. Например, была измерена активность альдолазы, используя ферментативный набор, содержащий триозофосфатизомеразу и G3P. Оказалось, что присутствие PCNA стимулирует эту активность (рис. 19). В данном случае мы имеем подражание ситуации с

гликолизом in vivo, где вышеуказанные ферменты последовательно катализируют стадии гликолиза

• локализации PCNA.

Ж№ 4, 5, 6. А экстракт клеток, стабильно экспрессирующих цитоплазматический (ЗРР-РСЫА показывает более высокую активность вЗР по сравнению с таким же экстрактом, полученным и контрольных клеток (рис. 19). В связи с тем, что кроме ферментов гликолиза имеется еще мно других, взаимодействующих с РСИА, белков, которые в основном локализованы в цитоплазме проявляется функциональная значимость присутствия РСИА в цитоплазме. Эти функции могут быт связаны с передачей внутриклеточных сигналов и цитоскелетом через взаимодействие с таким белками, как аннексии А2, сарколектин, ЕР1А2, РР1А или рибосомальный белок ЗА. Другая обла! - метаболические пути и взаимодействие с такими белками, как малат дегидрогеназа пероксиредоксин 6, карбоновая ангидраза 2, альдолаза А, триозофосфатизомераза, бЗР фосфоглицерат киназа 1, фосфоглицерат мутаза 1 и альфа-энолаза. Большая часть эти метаболических ферментов представляет гликолиз, и, соответственно, логично предположить о участии РСИА в этом процессе. Если в случае репликации хроматина роль РСИА состоит координации различных процессов, происходящих в одном месте (на репликативной вилке ДНК), частности синтеза ДНК и сборки хроматина (рис. 17), то в случае гликолиза координирующая рол РСЫА может заключаться в. обеспечении более эффективного прохождения последовательно каскада реакций. При этом за счет локализации ферментов этого каскада на РСЫА продукт одно реакции может немедленно использоваться как субстрат в следующей.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Роль РСИА в клетке определяется способностью этого белка связываться с другим макромолекулами и координировать их функции. Эта координация обеспечивается за сч структуры РСЫА в виде симметричного двойного кольца. Такое кольцо нанизывается на ДНК обеспечивает связывание с белками, действующими в реакциях, направленных в противоположи направлениях цепи ДНК. Будучи связанным с ДНК и являясь движущейся платформой для ДНК полимераз и других белков, РСИА является своего рода "мастером-координатором" процессов происходящих в хроматине. Во время репликации ДНК, в 5-фазе клеточного цикла, коордикаци затрагивает в первую очередь синтез ДНК, который ведется разными полимеразами. Большинство этих полимераз имеет свою узкую. специализацию и приступает к своим функциям за сч взаимодействия с РС^. То есть в данном случае РСИА действует как переключатель, меняющи одного партнера на другого. Причем механизм такого переключения связан с модификациям РСЫА, в первую очередь с убиквитинированием. Помимо этого, РСКА также может действовать ка адаптер или координатор, взаимодействуя с несколькими белками одновременно, а не по очереди, таком режиме РСЫА, находясь в хроматине, обеспечивает взаимодействие между процессам

репарации/репликации ДНК и другими клеточными функциями, такими как сборка хроматина и эпигенетические модификации. PCNA может также служить платформой для различных белков, не взаимодействуя с ДНК. В таком случае возникает вопрос о том, как это связано с локализацией PCNA внутри клетки. Взаимодействует ли PCNA со специальными структурами типа ядерного матрикса или же свободно распределен в нуклеоплазме или цитоплазме? По-видимому, возможны все эти ситуации. Но если в ядре такие перемещения PCNA между нуклеоплазмой, ядерным матриксом и хроматином логично вписываются в картину регуляции процессов, связанных с генетическим и эпигенетическим материалом клетки, то в цитоплазме не все так очевидно. Однако обнаруженная связь PCNA с гликолизом в совокупности с тем, что повышенный уровень экспрессии PCNA и активация гликолиза являются характерными чертами раковых клеток, открывает для нас новые аспекты внутриклеточных белковых взаимодействий в нормальных и патологических ситуациях.

Среди возможных функциональных модификаций PCNA пока наиболее достоверно подтверждено убиквитинирование и ацетилирование. Высокочувствительный анализ с использованием изотопной метки показал отсутствие фосфорилирования PCNA in vivo. Полиубиквитинирование PCNA по любому лизину или же N-концу необходимо для его протеасомной деградации. Имеется ряд доказательств об ацетилировании PCNA и его участии в репликации ДНК и в стабилизации комплексов PCNA с другими белками.

Четвертичная структура PCNA имеет вид двойного кольца, в котором кольца (тримеры) взаимодействуют друг с другом своими обратными сторонами, а лицевые стороны остаются открытыми для взаимодействия с другими белками. Двойной тример PCNA с симметричной структурой является двухсторонней платформой, которая может скользить по ДНК и взаимодействовать одновременно с разными белками, координируя процессы, происходящие на ДНК. Кроме того, показано взаимодействие PCNA с множеством белков, часть из которых участвует в процессах, происходящих за пределами хроматина и даже за пределами ядра- в цитоплазме. Показано, что многие из этих белков связаны с канцерогенезом, а уровень самого PCNA значительно повышен в опухолевых клетках. Чрезвычайно важный вопрос состоит в том, как регулируется взаимодействие отдельных белков с PCNA в определенное время и в определенном месте. Основным механизмом этой регуляции, по-видимому, являются посттрансляционные модификации PCNA и других белков. Таким образом, выявление сигнальных механизмов, ведущих к модификациям и ассоциации/диссоциации белковых комплексов с PCNA, необходимо для раскрытия полной картины PCNA-зависнмых процессов. Изучение этих процессов затруднено из-за высокой динамики ассоциации и диссоциации PCNA с другими белками. Однако выяснение механизмов этого

динамического взаимодействия является чрезвычайно важным для объяснения регуля разнообразных клеточных функций.

ВЫВОДЫ

1) Показана многоплановая роль PCNA как одного из ключевых белков интерактомики. Име несколько модулей, таких как репликация хроматина и репарация ДНК, где PCNA достове является координирующим хабом. Интригующим выглядит участие PCNA в канцерогенезе гликолизе.

2) Впервые показано существование многочисленных изоформ PCNA, которые представлены 2DE в виде набора пятен различной интенсивности (нанопротеома). Основная (мажорная) фо PCNA млекопитающих располагается на 20Е-карте в точке, соответствующей теоретическ физико-химическим параметрам PCNA, и не модифицирована, а наличие множества минорн модифицированных, форм PCNA указывает на то, что модификации PCNA являются оч динамичными и короткоживущими образованиями и/или очень малая часть PCNA вовлечен процессы, где необходимы данные модификации PCNA.

3) Определены некоторые модификации PCNA и их функциональная роль. Достове подтверждено убиквитинирование и ацетилирование PCNA. Показано отсутст фосфорилирования PCNA in vivo. Ацетилирование PCNA связано с репликацией ДНК стабилизацией комплексов PCNA с другими белками, а неспецифическое убиквитинирова связано с метаболизмом (утилизацией) PCNA.

4) Проанализирован аспект, касающийся PCNA, как онкогена и маркера пролиферац Показано, что в раковых клетках значительно повышен общий уровень PCNA без появления как либо дополнительных изоформ этого белка. Причем это повышение связано не с усилен пролиферации, а с иными причинами, скорее всего метаболизмом (в частности, с активизац гликолиза).

5) Показано взаимодействие PCNA с множеством белков, часть из которых участвует процессах, происходящих за пределами хроматина и ядра в цитоплазме. Среди этих бел большую группу составляют ферменты гликолиза. Кроме того, многие из этих белков связань канцерогенезом.

6) Показано присутствие PCNA не только в ядре, но и в цитоплазме, причем это присутст может быть весьма существенным. Получены данные, указывающие на то, что PCNA игр стимулирующую роль в гликолизе.

7) Показано, что полная четвертичная структура РСЫЛ имеет вид двойного кольца, в котором кольца (тримеры) взаимодействуют обратными сторонами. Таким образом, лицевые стороны

стаются открытыми для взаимодействия с другими белками. Такая структура РСИА очень инамична и может быть нарушена под воздействием различных факторов, используемых при ыделении этого белка.

8) Предложена структурная модель, в которой РСЫА играет роль хаб-белка с широкими . ункциями.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Naryzhny S. N., Lee Н. Proliferating cell nuclear antigen in the cytoplasm interacts with components of lycolysis and cancer // FEBS Lett. 2010. V. 584. No 20. P. 4292-8.

Richard C., Lanner C., Naryzhny S. N., Sherman L., Lee H., Lambert P., Zehbe I. The immortalizing and ransforming ability of two common human papillomavirus 16 E6 variants with different prevalences in ervical cancer//Oncogene. 2010. V. 29. P. 3435-3445.

Naryzhny S. N. Blue Dry Western: simple, economic, informative, and fast way of immunodetection // nal. Biochem. 2009. V. 392. No 1. E 90-5.

Naryzhny S. N. Proliferating cell nuclear antigen (PCNA): a proteomics view (review) // Cell. Mol. Life ci. 2008. V. 65. No 23. P. 3789-808.

Naryzhny S. N., Lee H. Characterization of proliferating cell nuclear antigen (PCNA) isoforms in normal nd cancer cells: There is no cancer-associated form of PCNA II FEBS Lett. 2007. V. 581. No. 25. P. 49170.

Naryzhny S. N., DeSouza L.V., Siu K. W. M., Lee H. Characterization of the human proliferating nuclear tigen physico-chemical properties: aspects of double trimer stability П Biochemistry and Cell Biology. 006. V. 84. No 5. P. 669-676.

Lee H, Naryzhny S. N. Coordination of multiple cellular functions by PCNA: Implication of the PCNA ouble trimer model // Proliferating cell nuclear antigen (PCNA): Research Signpost, Kerala, India, 2006. P. 63-180.

Naryzhny S. N., Zhao H., Lee H. Human proliferating cell nuclear antigen (PCNA) may function as a ouble- homotrimer complex in the mammalian cell // J. Biol. Chem. 2005. V. 280. No 14. P. 138883894.

Naryzhny S. N., Lee H. The post-translational modifications of proliferating cell nuclear antigen (PCNA): cetylation, not phosphorylation, plays an important role in the regulation of its function // J. Biol. Chem. 004. V. 279. No- 19. P. 20194-20199.

. Naryzhny S. N., Lee H. Observation of multiple isoforms and specific proteolysis patterns of PCNA in the ontext of cell-cycle compartments and sample preparations // Proteomics. 2003. V. 3. P. 930-936. . Naryzhny S. N., Lee H. Protein profiles of the Chinese hamster ovary cells in the resting and proliferating tages // Electrophoresis. 2001. V. 22. P. 1764-1775.

.Naryzhny S. N. "Active" two-dimensional electrophoresis of rat liver DNA-polymerase alpha // lectrophoresis. 1997. V. 18. P. 553-556.

. Нарыжный С. H. Выделение каталитически активной субъединицы протеинкиназы из комплексной ормы ДНК-полимеразы альфа печени крысы методом электрофракционирования в енатурирующих условиях // Мол. Биол. 1996. Т. 30. № 6(2). С. 1403-1408.

14a. Naryzhny S. N. Purification of protein kinase catalytic subunit from the complex form of rat liver DN polymerase alpha by denaturing electrofractionation // Mol. Biol. 1996. V. 30. No- 6(2). P. 845-849.

15. Naryzhny S. N. Upside-down stopped flow electrofractionation of complex protein mixtures // Ana Biochem. 1996. V. 238. P. 50-53.

16. Шевелев И. В., Нарыжный С. Н., Крутиков В. М. Выделение протеинфосфокиназы из комплексно формы ДНК-полимеразы альфа печени крысы // Мол. Биол. 1993. Т. 27. № 3. С. 531-537.

16а. Shevelev I. V., Naryzhny S. N., Krutyakov V. M. Isolation of a proteinphosphokinase from the comple form ofrat liver DNA polymerase alpha//Mol. Biol. 1993. V. 27.No 3.P.531-537.

17. Нарыжный С. H. Обнаружение ДНК-связывающих белков в полиакриламидном геле поел денатурирующего электрофореза // Мол. Биол. 1992. Т. 26. № 2. С. 307-314.

17а. Naryzhny S. N. Detection of DNA-binding proteins in SDS-polyacrylamide gel electrophoresis // Mo Biol. 1992. V. 26. No. 2. P. 307-314.

18. Нарыжный С. H., Крутиков В. М. Анализ белков нормальной и регенерирующей печени крыс методом двумерного электрофореза // Биохимия. 1989. Т. 54. №. 12. С. 2030-2036.

18а. Naryzhny S. N., Krutyakov V. М. The analysis of normal and regenerating rat liver proteins by two dimensional gel electrophoresis // Biochemistry. 1989. V. 54. No 12. P. 2030-2036.

19. Нарыжный С. H. К вопросу об онкомаркерах: о чем нам может рассказать PCNA? // Материал Всероссийской научной конференции "Медико-генетические проблемы онкологических заболеваний' 2010. Стерлитамак. Креативная Хирургия и Онкология. 2010. № 4 (Приложение). С 43.

20. Naryzhny S. N., Lee Н. Role of PCNA Interactions in cancer: proteomics view // Materials of the HUP 8th Annual World Congress. 2009. Toronto, Canada. Clinical Proteomics. 2009. V. 5. SI. P. 72.

21. Naryzhny S. N., Lee H. Proteomics of PCNA: cell transformation is accompanied by up-regulation PCNA without post-translational modifications // Materials of the HUPO 7th Annual World Congres 2008. Amsterdam, NL. P. 85.

22. Naryzhny S. N., Lee H. Cell transformation is accompanied by up-regulated level of PCNA without pos translational modifications // Materials of CPI (Canadian Proteomic Initiative) Conference. 2007. Ottaw Canada. P. 56.

23. Naryzhny S. N. Coordination of multiple cellular functions by proliferating cell nuclear antigen (PCNA Structure-functional aspect // Бреслеровские чтения II. Молекулярная генетика, биофизика и медицин сегодня:. С.-Петербург. 2007. С. 1-13.

24. Naryzhny S. N., Lee Н. The high level of PCNA may result in genetic instability // Materials of the HUP 5th Annual World Congress. 2006. Long Beach, USA. Molecular & Celular Proteomics. 2006. V. 5. No 1 S. 76.

25. Naryzhny S. N., Lee H. Analysis of PCNA Structure and functions by proteomics approach // Materials the CPS (Canadian Proteomic Society) Conference. Ottawa, Canada. 2005. P. 44.

26. Naryzhny S. N., Zhao H., Lee H "The Lord of the Rings: PCNA can coordinate multiple cellular functio due to symmetrical double ring structure // Materials of the CPI (Canadian Proteomic Initiativ Conference. Toronto, Canada. 2005. P. 65.

27. Naryzhny S. N., Lee H. Human proliferating cell nuclear antigen (PCNA) may function as a doubl homotrimer complex in the mammalian cell // Materials of the HUPO 4th Annual World Congress. Munic Germany. Molecular & Cellular Proteomics. 2005. V. 4. No 8. S. 50.

28. Naryzhny S. N., Zhao H., Lee H. Mammalian proliferating cell nuclear antigen (PCNA) has a doubl homotrimer structure. Can it be molecular Janus? // Materials of the CPS (Canadian Proteomic Socie Conference. London, Canada. 2004. P. 55.

29. Naryzhny S. N., Lee H- Post-translational modifications of proliferating cell nuclear antigen (PCNA Acetylation, not phosphorylation, plays an important role in the regulation of PCNA function // Materials the CPI (Canadian Proteomic Initiative) Conference. Montreal, Canada. 2004. P. 61.

. Naiyzhny S. N.. Lee H. Heterogeneity (micro-proteome) of proliferating cell nuclear antigen - where is a bottom? II Materials of the CPI (Canadian Proteomic Initiative) Conference. Vancouver, Canada. 2003. P. 18.

, Naryzhny S. N and Lee H. PCNA Turnover in Cell Cycle and Involvement in DNA Repair is Linked to Modification by Ubiquitin // Materials of the HUPO 2nd Annual & IUBMB XIX World Congress. Montreal, Canada. Molecular <6 Cellular Proteomics. 2003. V. 2. No 9. P. 746.

. Naiyzhny S. N., Lee H. About multiple forms of PCNA, or proteomics (microproteomics) approach to PCNA heterogeneity // Materials of the -5th Siena 2-D Electrophoresis Meeting, (from Genome to roteomeSiena, Italy. 2002. P. 281.

. Naryzhny S. N., Lee H. Protein profiles of the Chinese hamster ovary cells in the resting and proliferating stages // Materials of the 4'h Siena 2-D Electrophoresis Meeting, (from Genome to Proteome). Siena, Italy. 000. P. 402.

. Naryzhny S. N.. Becker E. G., Sinitsyn A.P . Detection and study of cellulases and other proteins from haetomium cellulolyticum: 2D-electrophoresis maps of secreted proteins from different fungal strains // aterials of the International Conference "Biocatalysis-98, Fundamentals and Applications". Pushchino, •ussia. 1998. P. 47.

. Нарыжный С. H. Прибор для препаративного электрофракционирования ДНК и белков: видетельство № 4533, Российская Федерация, МПК С12Р19/00. № 95111359, заявл. 03.07.1995, публ. 16.07.1997, Бюл.№ 7.

.Нарыжный С. Н.; Метод препаративного электрофракционйрования ДНК и белков: патент № 104082, Российская Федерация, МПК B01D57/02, G01N27/28. № 95111365, заявл. 03.07.1995, опубл. 10.02.1998, Бюл.№ 4.

. Naryzhny S. N. Discrete preparative electrofractionation of complex protein mixture // PNPI Research eport 1994-1995. Gatchina. 1996. P. 215-217.

. Naryzhny S. N., Levina V. V., Varfolomeeva E. Y., Drobchenko E. A., Filatov M. V. Active dissociation f the fluorescent dye Hoechst 33342 from DNA in a living cell: Who could do it? II Materials of the 3* iena 2-D Electrophoresis Meeting, (from Genome to Proteome). Siena, Italy. 1998. P. 259. . Naryzhny S. N. "Active" two-dimensional electrophoresis of rat liver DNA-polymerase alpha // Materials fthe f Siena 2- D Electrophoresis Meeting, (from Genome to Proteome). Siena, Italy. 1996. P. 116.

Отпечатано в типографии ПИЯФ РАН

188300, Гатчина Ленинградской обл., Орлова роща Зак. 114, тир. 100, уч.-изд. л. 2,7; 28.03.2011 г.

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Нарыжный, Станислав Николаевич

ВВЕДЕНИЕ

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. РСИА, ОСНОВНЫЕ ФАКТЫ

1.2. МЕСТО РС1ЧА В ПРОТЕОМЕ (БАЗЫ ДАННЫХ 2БЕ)

1.3. РСТЧА И ПРОТЕОМ ПРИ КЛЕТОЧНОЙ ПРОЛИФЕРАЦИИ

1.4. РСЫА И КАНЦЕРОГЕНЕЗ

1.5. ПОСТТРАНСЛЯЦИОННЫЕ МОДИФИКАЦИИ

1.5.1. Убиквитинирование и БЦМО-илирование

1.5.2. Убиквитинирование РСКА может быть механизмом переключения работы полимераз

1.5.3. Фосфорилирование

1.5.4. Ацетилирование

1.6. СТРУКТУРА РС^ 35 1.6.1. Мономеры РСИА образуют тример в виде кольца

1.7. ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ РСМА

1.7.1. Структурные аспекты взаимодействий РСКА

1.7.2. Репликация ДНК

1.7.3. Репарация ДНК

1.7.4. Контроль клеточного цикла, выживаемость

1.7.5. Сборка хроматина, эпигенетика и когезия хроматид

1.7.6. Транскрипция и другие разнообразные функции 67 1.7.8. Гликолиз

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Реагенты

Антитела

Клетки, клеточные культуры и клеточные экстракты

Плазмиды

Синхронизация по клеточному циклу

Сортировка клеток (FACS)

Мечение in vivo

Субклеточное фракционирование

Клеточная трансфекция

Выделение PCNA хроматографией и электрофорезом

Сшивки формальдегидом

Одномерный электрофорез (SDS-PAGE)

Нативный электрофорез

Голубой нативный электрофорез (BNPAGE)

Двумерный электрофорез (2DE)

Окрашивание белков и сушка гелей

Иммуноосаждение

Перенос на мембрану

Окрашивание мембран

Иммунодетектирование

Голубой сухой Вестерн-блот

Классический" Вестерн-блот

Фар-Вестерн

Моделирование

Иммуноокрашивание клеток

Белки и ферменты

Масс-спектрометрия

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. PCNA В ПРОТЕОМЕ

3.2. PCNA В ФАЗАХ КЛЕТОЧНОГО ЦИКЛА

3.3. PCNA И КАНЦЕРОГЕНЕЗ 122 3.3.1. Профили PCNA нормальных и раковых клеток

3.4. ПОСТТРАСЛЯЦИОННЫЕ МОДИФИКАЦИИ PCNA

3.4.1. Низкомолекулярные фрагменты PCNA являются результатом действия протеосом

3.4.2.Протеолиз PCNA in vitro может происходить во время изоэлектрофокусирования

3.4.3. Протеолиз PCNA является убиквитин-зависимым

3.4.4. Правильная структура PCNA жизненно важна для клеточных функций

3.4.5. PCNA не фосфорилирован in vivo

3.4.6. PCNA может быть ацетилирован in vivo

3.4.7. Субклеточная локализация изоформ PCNA в контексте клеточного цикла

3.4.8. Ацетилирование и деацетилирование PCNA может происходить с помощью ацетилазы рЗОО и деацетилазы HDAC

3.4.9. Ацетилированный PCNA имеет большее сродство к ДНК-полимеразам, чем деацетилированный PCNA

3.5. СТРУКТУРА PCNA

3.5.1. PCNA млекопитающих организован в виде двойного тримера

3.5.2. Аминокислотные остатки Arg-5 и Lys-110 являются критическими для формирования двойного тримера PCNA

3.5.3. Образование двойного тримерного комплекса PCNA существенно для деления и выживаемости клеток млекопитающих

3.5.4. Только двойной тример, но не одиночный тример может одновременно взаимодействовать с ДНК-полимеразой дельта и CAF

3.5.5. Функциональная модель PCNA млекопитающих

3.6. ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ PCNA

3.6.1. Репликация ДНК

3.6.2. Репарация ДНК

3.6.3. Контроль клеточного цикла, выживаемость

3.6.4. Сборка хроматина, эпигенетика и когезия хроматид

3.6.5. Транскрипция и другие разнообразные функции

3.6.6. Взаимодействующие с PCNA белки, обнаруженные Фар-Вестерном

3.6.7. Локализация PCNA

Введение Диссертация по биологии, на тему "Ядерный антиген пролиферирующих клеток (PCNA): координатор клеточных функций в норме и патологии"

Белки являются основными участниками почти всех клеточных процессов, поэтому их поведение на молекулярном уровне лежит в основе механизмов, определяющих процессы клеточной жизнедеятельности. Функции и механизмы работы белков внутри клетки напрямую зависят от их локализации, количества и качества. Под качеством подразумевается правильная (нативная) структура белков, а также возможность динамики этой структуры. Динамика обеспечивается различными механизмами, в первую очередь посттрансляционными модификациями и межмолекулярными взаимодействиями (белок-белок, белок-ДНК, белок-РНК и т.д.). Если раньше оценить масштаб этих динамических изменений не было технических возможностей, то с приходом эры протеомики появились его первые оценки. Последние данные показывают, что в среднем каждый белок подвержен 6-7 модификациям, а количество обнаруженных партнеров растет лавинообразно с повышением чувствительности методик их обнаружения (Xenarios, Rice et al. 2000; Bader, Betel et al. 2003: Mann and Jensen 2003; Walsh, Garneau-Tsodikova et al. 2005: Stumpf, Thorne et alt 2008). Вслед за термином "протеомика" для того, чтобы более детально манипулировать данными по белковым модификациям и их взаимодействиям, стали появляться такие термины, как "интерактомика", "фосфопротеомика", "гликопротеомика" и т.д. Непрерывно продуцируемый огромный объем информации привел к востребованности биоинформатики и многочисленных баз данных ÍXenarios, Rice et al. 2000; Bader, Betel et al. 2003), а в конечном итоге - к образованию новой научной дисциплины, системной биологии (Ideker, Galitski et al. 2001: Liu 2005). Центральным подходом в системной биологии является объединение взаимодействующих друг с другом клеточных компонентов (белков) в многочисленные сети, образующие функциональные модули, а вся совокупность этих взаимодействий, характерная для каждого объекта, носит название "интерактома"(-8апсЬег, Lachaize et al. 1999V

Актуальность темы

Желание описать и вместить живой объект в рамки компьютерных технологий привело к созданию множества программ, различным образом манипулирующих с имеющейся информацией о белковых взаимодействиях и "визуализирующих" ее (Ju, Park et al. 2003; Batageli and Brandes 2005; Iragne, Nikolski et al. 2005; Klammer. Roopra et al. 2008; Minguez, Gotz et al. 2009; Fung, Wilkins et al. 2010). Возможность получения такой информации в большом объеме позволила создавать интерактомы даже на уровне целого организма (Ito, Tashiro et al. 2000; Uetz, Giot et al. 2000; D'Alessandro, Righetti et al. 2010). Некоторые белки отличаются особенно повышенным количеством партнеров и выглядят на картах интерактомики, как объединяющие центры или хабы (hubs). В зависимости от характера белок-белковых взаимодействий хабы подразделяются на две категории: "центры вечеринок" (party hubs), где взаимодействие происходит со многими партнерами одновременно, и "центры свиданий" (date hubs), когда взаимодействие с разными партнерами происходит в разных местах и в разное время (Han. Bertin et al. 2004). Так как для "центров вечеринок" характерно образование неких белковых комплексов, уровни их экспрессии и их партнеров должны коррелировать во времени тех процессов, где они задействованы. Наоборот, в случае "центров свиданий" такая корреляция отсутствует. Наиболее известными хабами являются, например, такие белки с разнообразными функциями, как актин, 14-3-3 или р53 CCollavin, Lunardi et al. 2010V Анализ последствий, вызванных нарушениями в сети белок-белкового взаимодействия, позволил предложить некую модель организации протеома из отдельных модулей или биологических процессов. Каждый модуль регулируется через "центр вечеринок", в то время как "центры свиданий" организовывают весь протеом, связывая отдельные модули. Например, в случае дрожжей, "центр свиданий" калмодулин связывает четыре разных биологических модуля: 1) катионовый гомеостаз, 2) упаковка и стабилизация белков, 3) отпочкование, полярность клеток и образование филаментов, 4) эндоплазматический ретикулум. А такие "центры вечеринок", как Sec 17, Sec22 и Vtil, все функционируют внутри модуля "эндоплазматический' ретикулум". Весь протеом является более чувствительным к нарушениям в работе date hubs, чем party hubs (Han, Bertin et al. 2004). Внутри модуля "репликация ДНК" особенно интересен ядерный антиген пролиферирующих клеток (PCNA, proliferating cell nuclear antigen) (Рис.1). Этот белок долгое время был известен только как вспомогательный белок для ДНК полимераз. Однако развитие методов протеомики, возникновение интерактомики и системной биологии привели к расширению представлений о функционировании белков в общем, и PGNA в частности. Поэтому актуальной является задача по выяснению механизмов, регулирующих межбелковое взаимодействие и белковую полифункциональность. Для решения этой задачи необходимо привлечение не просто отдельных биохимических методов, а комплексный подход и системный взгляд на работу белков. Причем PCNA в этом смысле является чрезвычайно подходящим и своевременным объектом исследования. Как будет видно из дальнейшего изложения, РСЫА является хабом, причем хабом с широкими функциями, который может координировать не только отдельный модуль, но и взаимодействие многих модулей. Изучение такой координации позволит пролить свет не только на конкретные функции, в которые вовлечен данный белок, но и на общеклеточные механизмы в целом.

Цель

Целью работы являлось выяснение структурно-функциональных аспектов организации интерактомики на примере РСЫА, как хаба, обладающего широким спектром действия.

Основные задачи исследования

1) выявление форм, которые может принимать РСЫА, подвергаясь посттрансляционным модификациям,

2) изучение роли данных модификаций в механизмах работы РСЫА в качестве белка, взаимодействующего с множеством других белков,

3) оценка аспектов, касающихся роли РСЫА в качестве онкогена и маркера пролиферации,

4) анализ, систематизация и дополнительный поиск белков, взаимодействующих с РСЫА, с разработкой и использованием нетривиальных подходов,

6) выяснение функций РСМА не только в ядре, но и в цитоплазме,

7) прояснение деталей структурной организации PCNA, обеспечивающей выполнение его многообразных функций,

8) разработка модели (моделей) функционирования РСЫА в качестве хаба широкого спектра действия.

Научная новизна

Детальный анализ с помощью двумерного электрофореза высокого разрешения и чувствительности выявил наличие разнообразных форм у РСЫА млекопитающих (так называемый нанопротеом), вызванных посттрансляционными модификациями.

Впервые показано, что РСМА присутствует в клетке в виде двойного тримера. Более того, было доказано, что именно такая структура обеспечивает те свойства, которые делают РСЫА координирующим хабом широкого спектра действия. Была предложена модель работы РСЫА в качестве координатора процессов, происходящих на репликативной вилке ДНК при синтезе ДНК и сборке хроматина.

Систематический анализ белков, взаимодействующих с РСКА, привел к раскрытию совершенно новых сторон функционирования РСКА. Одна из этих сторон связана с его возможным участием в процессах гликолиза. В совокупности с тем фактом, что канцерогенез сопровождается увеличением как уровня гликолиза, так и экспрессии РСКА, это позволяет по-новому взлянуть на процессы канцерогенеза.

Основные положения, выносимые на защиту

Имеет место широкий спектр взаимодействий PCNA, причем не только в ядре, но и в цитоплазме.

Обнаружено, что РСЫА присутствует в клетке в виде комплекса из двух колец, обеспечивающих одновременное взаимодействие с несколькими белками-партнерами.

Сформулирована модель координирующего действия РСИА на репликативной вилке ДНК.

Обнаружено взаимодействие PCNA с гликолитическими ферментами и предложена модель участия PCNA в гликолизе.

Показано наличие множественных посттрансляционных модификаций PCNA, которые участвуют в регуляции взаимодействия PCNA с другими белками.

Научно-практическая значимость

Научно-практическая значимость представленной работы состоит в первую очередь в существенном вкладе в дальнейшее понимание внутриклеточных процессов в общем и механизмов функционирования белковых сетей, то есть интерактомики, в частности. Такое понимание важно не только в общем плане познания, но и дает ключ к нашим возможностям при необходимости вмешиваться в эти процессы. Например, знание того, что раковая клетка, содержит значительно повышенное количество PCNA и очень чувствительна к нарушениям его четвертичной структуры, указывает на возможность получения фармакологических противораковых препаратов, нарушающих структуру PCNA и тем самым вызывающих апоптоз раковых клеток. А информация о белковых сетях, образованных взаимодействиями PCNA, может служить инструментом в диагностике заболеваний, выяснении механизма их возникновения и развития, эффективности тех или иных терапевтических подходов и разработке новых лекарственных препаратов.

Апробация работы

Материалы данного исследования представлялись на 2 Всемирном конгрессе HUPO в Монреале, Канада (Montreal, QC, Canada) в 2003 году, на 4 Всемирном конгрессе HUPO в Мюнхене, Германия (Munich, Germany) в 2005 году, на 5 Всемирном конгрессе HUPO в Лонг Бич, США (Long Beach, USA) в 2006 году, на 7 Всемирном конгрессе HUPO в Амстердаме, Голландия (Amsterdam, Netherlands) в 2008 году, на 8 Всемирном конгрессе HUPO в Торонто, Канада (Toronto, Canada) в 2009 году, на конференциях Канадского Общества Протеомики в Лондоне (London, ON, Canada) (2004 год) и в Оттаве (Ottawa, ON, Canada) (2005 год), на конференциях Канадской Инициативы по Протеомике (Canadian Proteomics Initiative) в Ванкувере (Vancouver, ВС, Canada) (2003 год) в Монреале (Montreal, QC, Canada) (2004 год), в Торонто (Toronto, ON, Canada) (2005 год), в Оттаве (Ottawa, ON, Canada) (2007 год), на Конференциях по Двумерному Электрофорезу (2-D Electrophoresis Meeting, from Genome to Proteome) в Сиене, Италия (Siena, Italy) в 1996, в 1998, в 2000 и в 2002 годах, а также на Международной Конференции "Биокатализ-98"в Пущино в 1998 году и Всероссийской научной конференции "Медико-генетические проблемы онкологических заболеваний" (Стерлитамак, 2010 год). Кроме того, автор неоднократно выступал с докладами в Петербургском Институте Ядерной Физики РАН, Гатчина, Россия, Институте Биомедицинской Химии РАМН, Москва, Россия, в Лаврентьевском Университете в Садбери, Канада (Laurentian University, Sudbury, Canada) и в Раковом Центре при Региональном Госпитале в Садбери, Канада (Cancer Centre, Sudbury Regional Hospital, Canada).

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 39 печатных работ в отечественных и зарубежных изданиях, из которых 17 статей в рекомендованных ВАК РФ изданиях.

Структура и объем диссертации

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов работы и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 265 страницах, содержит 55 рисунков, 12 таблиц. Список литературы включает 434 источника.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Нарыжный, Станислав Николаевич

выводы

1) Показана многоплановая? роль РС^ТА, как одного из ключевых белков интерактомики. Имеется: несколько модулей (функциональных процессов), таких как репликация хроматина и репарация ДНК, где РСКА достоверно является координирующим хабом. Интригующим выглядит участие РСЫА в канцерогенезе и гликолизе.

2) Впервые показано существование многочисленных изоформ РСЫА, которые представлены на 2БЕ в виде набора пятен различной интенсивности (нанопротеома). Основная (мажорная) форма РОИА млекопитающих располагается; на 2ВЕ-карте в точке,, соответствующей теоретическим физико-химическим параметрам РСЫА, и не модифицирована, а наличие множества минорных, модифицированных, форм РС^ТА указывает на то, что? модификации: РСИА являются очень динамичными и короткоживущими событиями, и/или очень малая часть'-РСМА вовлечена в процессы, где необходимы данные модификации РСЫЛ.

3) Определены некоторые модификации; РСЫА и их роль в его функционировании? Достоверно подтверждено убиквитинирование и ацетилирование РСЫА. Показано отсутствие фосфорилирования РСЫА 1п

Ацетилирование РСЫА связано с репликацией ДНК и стабилизацией комплексов РСИА с другими белками, а неспсцифическое убиквитинирование. связано с метаболизмом (утилизацией) РСЫА.

4) Проанализирован аспект, касающийся РСКА, как онкогена и маркера пролиферации. Показано, что в раковых клетках значительно повышен общий уровень РСЫА без появления каких-либо его дополнительных изоформ этого белка. Причем, это повышение связано не с усилением пролиферации, а с иными причинами, скорее всего метаболизмом, в частности с активацией гликолиза.

5) Показано взаимодействие РСЫА с множеством белков, часть из которых участвует в процессах, происходящих за пределами хроматина и ядра, в цитоплазме. Среди этих белков большую группу составляют ферменты гликолиза. Кроме того, многие из этих белков связаны с канцерогенезом.

6) Показано присутствие РСКА не только в ядре, но и в цитоплазме, причем, это присутствие может быть весьма существенным. Получены данные, указывающие на то, что РСИА, локализованный в цитоплазме, играет стимулирующую роль в гликолизе.

7) Показано, что полная четвертичная структура РСИА имеет вид двойного кольца, в котором кольца (тримеры) взаимодействуют обратными сторонами. Таким образом, лицевые стороны остаются открытыми для взаимодействия с другими белками. Такая структура РСКА очень динамична и чувствительна к различным факторам, применяемым при выделении этого белка.

8) Предложена структурная модель, согласно которой PCNA играет роль хаб-белка с широкими функциями.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ

ДИССЕРТАЦИИ

1. Naryzhny S. N., Lee Н. Proliferating cell nuclear antigen in the cytoplasm interacts with components of glycolysis and cancer // FEBS Lett. 2010. V. 584(20). P. 4292-8.

2. Richard C., Lanner C., Naryzhny S.N., Sherman L., Lee H., Lambert P., Zehbe I. The immortalizing and transforming ability of two common human papillomavirus 16 E6 variants with different prevalences in cervical cancer // Oncogene. V. 29. P. 3435-3445.

3. Naryzhny S. N. Blue Dry Western: simple, economic, informative, and fast way of immunodetection//Anal. Biochem. 2009. V. 392(1). P. 90-5.

4. Naryzhny S. N. Proliferating cell nuclear antigen (PCNA): a proteomics view (review) // Cell. Mol. Life Sci. 2008. V. 65(23). P. 3789-808.

5. Naryzhny S. N., Lee H. Characterization of proliferating cell nuclear antigen (PCNA) isoforms in normal and cancer cells: There is no cancer-associated form of PCNA // FEBS Lett. 2007. V. 581(25). P. 4917-20.

6. Naryzhny S. N., DeSouza L.V., Siu K.W.M., Lee H. Characterization of the human proliferating nuclear antigen physico-chemical properties: aspects of double trimer stability // Biochemistry and Cell Biology 2006. V. 84(5). P. 669-676.

7. Lee H ,Naryzhny S. N., Coordination of multiple cellular functions by PCNA: Implication of the PCNA double trimer model // in the book "PCNA" 2007. P. 163-180 (ed. H.Lee) Research Signpost, Kerala, India.

8. Naryzhny S. N., Zhao H., Lee H. Human proliferating cell nuclear antigen (PCNA) may function as a double- homotrimer complex in the mammalian cell//J. Biol. Chem. 2005. V. 280(14). P. 13888-13894.

9. Naryzhny S. N., Lee H. The post-translational modifications of proliferating cell nuclear antigen (PCNA): acetylation, not phosphorylation, plays an important role in the regulation of its function // J. Biol. Chem. 2004. V. 279(19). P. 20194-20199.

10. Naryzhny S. N., Lee H. Observation of multiple isoforms and specific proteolysis patterns of PCNA in the context of cell-cycle compartments and sample preparations // Proteomics 2003. V. 3. P. 930-936.

11. Naryzhny S. N., Lee H. Protein profiles of the Chinese hamster ovary cells in the resting and proliferating stages // Electrophoresis 2001. V. 22. P. 1764-1775.

12. Naryzhny S.N., Levina V.V., Varfolomeeva E.Y., Drobchenko E.A., Filatov M.V. Active dissociation of the fluorescent dye Hoechst 33342 from DNA in a living cell: Who could do it? // Electrophoresis 1999. V. 20. P. 1033-1038.

13. Naryzhny S.N. "Active" two-dimensional electrophoresis of rat liver DNA-polymerase alpha//Electrophoresis 1997. V. 18. P. 553-556.

14. Нарыжный C.H. Выделение каталитически активной субъединицы протеинкиназы из комплексной формы ДНК-полимеразы альфа печени крысы методом электрофракционирования в денатурирующих условиях // Мол.Биол. 1996. Т. 30. № 6(2). С. 1403-1408.

14а. Naryzhny S.N. Purification of protein kinase catalytic subunit from the complex form of rat liver DNA polymerase alpha by denaturing electrofractionation // Mol. Biol. 1996. V. 30. No 6(2). P. 845-849.

15. Naryzhny S.N. Upside-down stopped flow electrofractionation of complex protein mixtures // Anal. Biochem. 1996. V. 238. P. 50-53.

16. Шевелев И.В., Нарыжный С.Н., Крутяков В.М. Выделение протеинфосфокиназы из комплексной формы ДНК-полимеразы альфа печени крысы // Мол.Биол. 1993. Т. 27. № 3. С. 531-537.

16а. Shevelev I.V., Naryzhny S.N., Krutyakov V.M. Isolation of a proteinphosphokinase from the complex form of rat liver DNA polymerase alpha//Mol. Biol. 1993. V. 27. No 3. P. 531-537.

17. Нарыжный C.H. Обнаружение ДНК-связывающих белков в полиакриламидном геле после денатурирующего электрофореза // Мол.Биол. 1992. Т.26. № 2. С. 307-314.

17а. Naryzhny S.N. Detection of DNA-binding proteins in SDS-polyacrylamide gel electrophoresis //Mol.Biol. 1992. V. 26. No 2. P. 307-314.

18. Нарыжный C.H., Крутяков В.М. Анализ белков нормальной и регенерирующей печени крысы методом двумерного электрофореза // Биохимия 1989. Т. 54. № 12. С.2030-2036.

18а. Naryzhny S.N., Krutyakov V.M. The analysis of normal and regenerating rat liver proteins by two-dimensional gel electrophoresis // Biochemistry 1989. V. 54. No 12. P. 2030-2036.

Тезисы конференций, сборники и др.

1. Нарыжный С.Н. К вопросу об онкомаркерах: о чем нам может рассказать PCNA? // Материалы Всероссийской научной конференции "Медико-генетические проблемы онкологических заболеваний". - 2010. - Стерлитамак. - Креативная Хирургия и Онкология. - 2010. - N2.4 -Приложение. — САЗ.

2. Naryzhny S. N., Lee Н. Role of PCNA Interactions in cancer: proteomics view // Materials of the HUPO 8th Annual World Congress. ~ 2009. ~ Toronto, Canada. - Clinical Proteomics. — 2009. — V.5- SI. - P. 72.

3. Naryzhny S. N., Lee H. Proteomics of PCNA: cell transformation is accompanied by up-regulation of PCNA without post-translational modifications // Materials of the HUPO 7th Annual World Congress. - 2008. - Amsterdam, NL. - P. 85.

4. Naryzhny S. N., Lee H. Cell transformation is accompanied by up-regulated level of PCNA without post-translational modifications // Materials of CPI (Canadian Proteomic Initiative) Conference. - 2007. - Ottawa, Canada. -P. 56.

5. Naryzhny S.N. Coordination of multiple cellular functions by proliferating cell nuclear antigen (PCNA): Structure-functional aspect // Бреслеровские чтения. -2007. - Гатчина. - С. 168-177.

6. Naryzhny S.N., Lee H. The high level of PCNA may result in genetic instability // Materials of the HUPO 5th Annual World Congress.- 2006. ~ Long Beach, USA. - Molecular & Celular Proteomics. - 2006. - V.5. -No.10.-S.76.

7. Naryzhny S.N., Lee H. Analysis of PCNA Structure and functions by proteomics approach // Materials of the CPS (Canadian Proteomic Society) Conference. -2005. - Ottawa, Canada. — P.44.

8. Naryzhny S.N., Zhao H., Lee H "The Lord of the Rings: PCNA can coordinate multiple cellular functions due to symmetrical double ring structure // Materials of the CPI (Canadian Proteomic Initiative) Conference. — 2005. - Toronto, Canada. - P. 65.

9. Naryzhny S.N., Lee H. Human proliferating cell nuclear antigen (PCNA) may function as a double-homotrimer complex in the mammalian cell // Materials of the HUPO 4th Annual World Congress. - 2005. Munich, Germany. - Molecular & Cellular Proteomics. - 2005. - V.4. - No.8. - S.50.

10. Naryzhny S.N., Zhao H., Lee H. Mammalian proliferating cell nuclear antigen (PCNA) has a double homotrimer structure. Can it be molecular Janus? //Materials of the CPS (Canadian Proteomic Society) Conference. -2004. - London, Canada. -P.55.

11. Naryzhny S.N., Lee H. Post-translational modifications of proliferating cell nuclear antigen (PCNA): Acetylation, not phosphorylation, plays an important role in the regulation of PCNA function // Materials of the CPI (Canadian Proteomic Initiative) Conference. -2004. - Montreal, Canada. -P.61.

12. Naryzhny S.N., Lee H. Heterogeneity (micro-proteome) of proliferating cell nuclear antigen - where is a bottom? // Materials of the CPI (Canadian Proteomic Initiative) Conference. —2003. - Vancouver, Canada. — P. 18.

13. Naryzhny S.N and Lee H. PCNA Turnover in Cell Cycle and Involvement in DNA Repair is Linked to Modification by Ubiquitin // Materials of the HUPO 2ncl Annual & IUBMB XIX World Congress. 2003. - Montreal. -Molecular & Cellular Proteomics. -2003. -V.2. ~No9. - P. 746.

14. Naryzhny S.N., Lee H. About multiple forms of PCNA, or proteomics (microproteomics) approach to PCNA heterogeneity // Materials of the -5th Siena 2-D Electrophoresis Meeting, (from Genome to Proteome. - 2002. -Siena, Italy. -P.281.

15. Naryzhny S.N., Lee H. Protein profiles of the Chinese hamster ovary cells in the resting and proliferating stages // Materials of the 4th Siena 2-D Electrophoresis Meeting, (from Genome to Proteome). - 2000. - Siena, Italy. -P. 402. •

16. Naryzhny S.N., Becker E.G., Sinitsyn A.P. Detection and study of cellulases and other proteins from Chaetomium cellulolyticum: 2D-electrophoresis maps of secreted proteins from different fungal strains // Materials of the

International Conference "Biocatalysis-98, Fundamentals and Applications". - 1998. -Pushchino, Russia. - P.47.

17. Нарыжный C.H.; Прибор для препаративного электрофракционирования ДНК и белков: Свидетельство №4533, Российская Федерация, МПК С12Р19/00. №95111359, заявл. 03.07.1995, опубл. 16.07.1997, Бюл. №7.

18. Нарыжный С.Н.; Метод препаративного электрофракционирования ДНК и белков: Патент №2104082, Российская Федерация, МПК B01D57/02, G01N27/28. №95111365, заявл. 03.07.1995, опубл. 10.02.1998, Бюл. №4.

19. Naryzhny S.N. Discrete preparative electro fractionation of complex protein mixture // PNPI Research Report 1994-1995. - 1996. - Gatchina. - P.215-217.

20. Naryzhny S.N., Levina V.V., Varfolomeeva E.Y., Drobchenko E.A., Filatov M.V. Active dissociation of the fluorescent dye Hoechst 33342 from DNA in a living cell: Who could do it? // Materials of the 3th Siena 2-D Electrophoresis Meeting, (from Genome to Proteome). - 1998. - Siena, Italy. -P.259. •

21. Naryzhny S.N. "Active" two-dimensional electrophoresis of rat liver DNA-polymerase alpha // Materials of the 2th Siena 2-D Electrophoresis Meeting, (from Genome to Proteome). - 1996. - Siena, Italy. - P. 116,

Информация о работе

Нарыжный, Станислав Николаевич
доктора биологических наук
Москва, 2011
ВАК 03.01.04

Диссертация

Ядерный антиген пролиферирующих клеток (PCNA): координатор клеточных функций в норме и патологии - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы