Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

ВЗАИМОСВЯЗЬ СТРУКТУРЫ И ФУНКЦИИ ПОЛИЕНОВЫХ АНТИБИОТИКОВ

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "ВЗАИМОСВЯЗЬ СТРУКТУРЫ И ФУНКЦИИ ПОЛИЕНОВЫХ АНТИБИОТИКОВ"

/\-ЪОШ

ТБИЛИССКИИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. Ив. ДЖАВАХИШВИЛИ 6ИОЛОГИЧЕСКИИ ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи

САМЕДОВА АРИФА АЛИ ГАСАН кызы

УДК 577.3Т

ВЗАИМОСВЯЗЬ СТРУКТУРЫ и ФУНКЦИИ ПОЛНЕНОВЫХ АНТИБИОТИКОВ

03.00.02 — биофизика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Тбилиси — 1991

Работа выполнена в Институте ботаники ЛИ Азербайджанской республики.

Научный руководитель:

доктор биологических наук, ст. научи, сотр. КасумовХ. М.

Официальные оппоненты:

кандидат биологических наук, ст. научи. сотр. Сорокина А, Д.

доктор биологических паук, проф. Ониани Д. А.

Ведущая организация: Институт биохимии АН республики Грузии.

Защита состоится « » 1991 г. в_ часов

на заседании специализированного совета Д. 057.03.19 по защите докторской диссертации по специальности «биофизика» при Тбилисском государственном Университете по адресу: 380043, Тбилиси, ул. Унигикчт кая, 2, ТГУ, Биологический факул ьтет.

С диссертацией можно (чмпкг^шться в библиотеке Тбилисского государственного Унии»':- '~ета.

Автореферат разослан ...91 г.

Ученый секретарь специализированного совета, д. б. н., проф.

КОТРИКА^ЭЕ ..

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Дктуа^^носуь twh. Исследование молекулярной организации и фуякциои ирован и я воннкх кенилов биологических мембран является одной из фундаментальных проблем бисфиэикя клетки. Одним из путей рьшьния этой проблема является образование конных каналов на биолойных липидных мембранах (ЕШ) о введенными в них вещеетсами-кан&локормерами о известной структурой молекул. Ус- -пехж, достигнутые в этом направлении, обусловлена, в основном, автибиотиками природного происхождения. К числу таких относятся полиеновие антибиотики (ПА), продуцированные акт ииомиш теля, для многих из которых установлена химическая структура (Uamllton-Miiler, 1973). Молекула НА представляет собой лак-тонное кольцо, содоржьшев солряявнну» систему двойных связей, заряженные аминную, карбоксильную и гидроксидьные группировки в гидрофильной части молекулы.

ПА представляет собой большой класс меыбраноактквних соединений, в основе биологического действия которых лежит увеличение проницаемости меточных и модельных мембран по механизму образования ионных каналов (Касумов, 1986). Полвеновыа каналы имеют два основных состояния: проводяцве г непроводящее. Время пребывания канала в проводящем состоянии зависит от структуры молекул НА. Так, например, модификация молекулы ам^отеряцива В по полярным группам, резво сокращает . время нахождения кайУ-ла в проводящем состоянии. Избирательная проницаемость мембран также зависит от структуры молекул Ш* Так, уменьшение числа гилрокенлытых групп в гидрофильной цепи молекул поддонов меняет избирательную проницаемость о анионной (аыфотериция В) на катионну® (ловОрин). Исследование свойств каналов в вавгеи-мооти ст структуры молекул ПА дает болыпу» информация о структуре канала, молекулярных процессах, протекающих в нем, и позволяет установить связь между их структурой и функцией в ли-пидякх мембранах.

Важность исследования ПА обусловлена^еща. и тем, что они являются основными лекарственными соединениями, используемыми в клинической медицине для лечения грибковых инфекций, Одявио Токсичность указанных антибиотиков резко ограничивает их приме-

венке и т^бует сеэданля во них лекарств енттых }орм. Этому спо-собстрокдля расшифровка химической структуры ПА в разработка путе1> нодя'1 я летит и полисного;: »юл о кули, Исследование пнтеграль-ноП прородп№сте мембран и сроЛств одуясчнах ионних каналов з присутетрк/ ПА » кх производных на IШ создает уникальнута возможность для ркреботки практически обосковат'нх рекомгаядашШ .целенаправленного с^нтчоя новых ПА с заданными его;;стезей.

Целуй задачи исслйдсват^дОсновная цель работы состояла и том, чтобы экспериментально установить взаимосвязь кеяцуг структурой молекул ПА а их ^ункчкей в липидннх мембранах путем исследования интегральной проводимости, избирательной проницаемости крыбратт, а также сро^сте одиночных ионних каналов.

Задачи исследования:

1. Исследовать кнтегральтгуто проводимость б к сложных мембран в присутствии полкеновых ант;:<5 по тиков с различной структурой молекул (тетраены, пентоены, гептаены).

2. Изучить свойства одиночных ионних каналов ПА с известной структурой молекул.

3. Определить избирательную проницаемость ВС.1 для ионов в присутствии ПА.

4. Изучить эйект-емЬотервшва В, вводв:лсго с одно!! стороны «ембраны и взаимодействие двух разных по селективности ПА. •

Рау^ра.я.ковуркз, га^о^ц. Впервые проведено исследование кембранотропноЯ активности большой группы полкеновых антибиотиков - тетраены. пентаены, гептаены на Сиоло.'ных липидных мембранах, содержащих холестерин. Обнаружено,.что все изученные ДА увеличивает проводимость бесложных ляпидных мембран по механизму образования ионных каналов.

Нейтральный появеновий антибвотгк - филваин, в отлнчсте от ранее существующих представления, резко увеличивает прово-дкчос.ть мембран во канальному механизму. Проводимость филгпв-нСйого канала примерно в 3,-4 раза-выаге проводкмостк ш^отери-ыинового канала! Проводимость комбинированных каналов, формируемых в ЕЛМ филипином с одной стороны, к ам^отеришном В с другой стороны составляет 30 пС. Время жизни канатов 25 е.

Впервые получены к были исследованы одиночные со^нтие

какали б ГЛМ в присутствии индивидуальных компонентов нистатина, отличающиеся по проводимости и временным параметрам. Обнаружено, что индивидуальные компоненты нистатина Aj, А2. А3 и В увеличивают проводимость ЕШ по канальное механизму. Определены времена ж.иини б проводящем и непроводящем состоянии,

В присутствии нистатина А обнаружено обратимое потенциал-зависимое включение короткоживуших каналов. Несмотря на различия структур молекул нистатина Aj к Аэ со стороны гидро-фобнол части молекулы,' наблюдаются их. взаимодействие по разные сторона мембраны.

Впервые показано, что при модификации мембраны с одной стороны анион-селективным ПА-ам£отеришщом й,.а с другой - ка~ тион-транспортируышш-левори ном k-¿% происходит образование комбинированных каналов, селективность которых определяется молекулами ам^отерицина В. Проводикость комбинированного канала составляет 2-3 пС, что вдвое меньше проводимости индивидуальных аьф)тарицинових каналов.

Обнаружено, что аафугерицин В, добавленный с одной сторона мембраны а водно-солевых растворах <рН = 3,0) резко увеличивает проводимость мембран. При концентрации 2*1СГ^М обнаружены долгожиеувде ионнне каналы ( ~ 20 сек) с большеа дисперсией проводимости 2*20 пС, В отличие от симметричных каналов , число асимметричных каналов при фиксированной концентрации ам$отервцина в не зависит от концентрации холестерина в диапазоне 2+10 мг/мл мембрьно^ормирукщего рвстворе.

Практическаяр^бут^ Полиеновие антибиотики являются одними из самих эффективных соединений, широко ис-пользуемнх в клинической медицине для лечения грибковых инфекция, Медицинская промышленность кипуекает для практического адрароохренения такие препараты, как нистатин, емфетерицин В, микогептин и лоьорин. в последнее время наметились реальные перспективу расширенue о£еры применения противогрибковых антибиотиков для борьон с такими широко распространенными заболпванкямя человека, как вярусные инфекция, злокачественные, доброкачественные образования, атеросклероз и т.д. Поскольку в мембране опухолевых клеток содержится больше холестерина , чем в нормальных клетках, а стероидный гомеостаз он-

ко логических больных существенно меняется, представляется целесообразным воздействовать на рззЕктие опухолевого процесса с помощью па. Степень повреждения клеток антибиотиков зависит не только ст" уровня инлуиироэанкоЛ проводимости (т.е. от концентрации антгбротпке), но и от времен» нахождения антибиотика в мембране, что мотет слулить характеристикой токсичности ■данного антибиотика. Это время определяется в экспериментах с EJW при удалении антибиотика иэ мембран». Лгннне показали, что исходный ам{отерпцен ß ,в зависимости от его концентрации, аффективно воздействует на клетки грибов, мембрана которых содержит эргостерли, но нетоксичен для животных клеток; мембрана которых содержит холестерин. Подобрав соответствуюту» концентрацию антибиотика, можно регулирозать время функционирования антибиотика в мембране жявотных и растительных клеток.

Исследуя действие fiA на мембраны, содержащие различные стериин, разработан новый метод вдентк^кации стерина в мембранах, защищенный авторским свидетельством.-

jippofiанид, . Основные результаты была представлены на 1-ом Всесоюзном биофизическом съезде (Москва, ), на 2~оХ научно-практическоЯ конференций молодых ученых по проблемам социально-экономического развития г.Валу в XI пятилетка и в перспективе (Баку, 1983}, на XII Советско-Швейцарском симпозиуме: Биологические мембраны.' Структура в функции (Ташкент, IS83), на 16-ой конференции ФЕБО (Федерация Европейского Биохимического Общеотаа) (Москва, 1964), а также обсуждались на научных семинарах в институте ботаники АН АзССР.

рбъем саботн. Диссертация состоит из введений, трех глав, выводов и списка литературы ( наименований). Работа изложена на страницах машинописного текста и содержит таблиц и ■;. рисунков.

Первая глава посвящена обзору литературных данных о стрости и свойствах каналообряэуютх соединений. В главе IX описаны материалы и методы исследований, использованные в ходе эксперимента. В главе III изложены собственные экспериментальные данные я приводится их обсуждение.

ртблнкаиаи. По материалам диссертации опубликовано Б печатных работ, включая авторское свидетельство.

МАТШШШ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

Бимолекулярные липиднне мембраны получали на с<3птах фос-фолипидах выделенных кэ белого ветества бычьего мозга. Мембраны формировали на отверстии в теХлоновоЙ ячейке диаметром 0,5 . мм я толшной стенки примерно 30 мкк по способу, описанному Мюллером С соав-г, <Ыие11ог ег , 1.963) * Дня приготовления мембран испольэсваны различные типы мглорелных раствора: в основном, использовался раствор обоих £0 Долила доз бычгего мозга а хлороформе о метанолом, выделении по методу Фолч « Лиз (Го1вН, Ьвевв, 1957) с исходной концентрацией 20 мг/мл. Обшие фоофо-липиды очищали от нейтральных липидов, промывал в адетопе, и хранили в системе хлорсфорл-мотанол (2:1) и концентрации 20 мг/мл при 0°С. Затем к этим липпдам добавляли, необходимое количество перекристаллизованного холестерина или другие стери-новые компоненты в соответствующих концентрациях.

Перед началом опыта исходные мембранные'смеси путем испарения переводились в раствор гептана« из которого затем формировали бимолекулярные мембраны.

В работе били использованы следующие ПА: тетраены-пима-ряшн, индивидуальные компоненты нистатина - А^, А^, А3 и В* пентаены - филипин, ауренин, фунгихромин, ганнибалкцнн - ЛИА-0323, 0690, гептаены - Ллавумицкны А и В, перпмицян и индивидуальные компоненты ловорена - Ад, А^, А^, А^, любезно предоставленные Ленинградским Всесоюзным научно-исследовательским технологическим институтом антибиотиков и ферментов медицинского назначения. Их физико-химические и биологические свойства описаны в литературе (Шенин с соавт., 1980).

Антибиотики растворяли в двм.тилсульфоксвде в концентрации I мг/мл, а затем микрошприцем добавляли в водно-солевой раствор, окружающий мембрану. Кинетика изменения мембранного потенциала и сопротивления регистрировалась о помощью двух-координатного самописца "ЕпйЧга". Интегральные характеристике мембран и одиночные ионные каналы измеряли методом фиксация мембранного потенциала, регистрируя ток через мембрану о ио-ммиью влектрсметтического усилителя У5-&. флена раствора электролита производилась с помощь» перистальтического насоса в

градггмте плотности сахарозы.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУШШЕ.

I. вутргр^лы^у; пртводиудсту

КечДрая", yor.^t^iri'pptra^f'üy биру^кши, с.^'-постр^; суртя;туго\\/.:от*егу.^.

t Изучено действие различных по структуре полиеновнх.антибиотиков на проводимость ¡г избирательную проницаемость бислоЯ-' них **ембрэн. - Все исследованные антибиотики оказались мембрено-- трошшми соединениями»' отличаппиккся ао'.своей э^ктке^ости и избирательной пронкцаемостр. На риз,I показана химическая структура некоторых исследованных полиеновнх антибиотиков.

".' Тетпаеяы. Палненовый антибиотик-оимарииин при концентрация 4-10"®М приводит к слабому увеличению нроводяуости кембрвн, как ари симметричной, ток п при односторонней моди£ккзаии мембран» Увеличение концентрации штмэ^кпияане приводит х дальнейшему росту проводимости. В>присутствие этого антибиотика величина мембранного потенциала при ссздовии десятикратного градиента проникающего иока первоначально составляет (+24,5 от), а затем происходит реверсия знака мембранного потенциала к отрицательному значению (-40 mV), значение которого показано в таблице I. ' ■"•.' \

Исходный нистатин был впервые выделе» из*культуры strep-tomycee albulee ÍHasea, Brown, 1950). Он представляет Собой сложную смесь нескольких компонентов, которые были выделены в . чистом виде я охарактеризована как нкствтииы Aj, А2, А3 и В, близкие по своим физико-химическим свойствам, но различавшиеся по структуре полиеновоЯ молекулы (Шенг» с соавт.» 1980). Основным компонентом этой антибиотической смеси является нистатин,^. Все изученные чгндивидуальнке компоненты оказались мем-браноактивными соединениями. Они резко увеличивают проводи-кость мембран по механизму образования каналов. *

На рвс.З-цредстевлемн характерные записи одяночщос каналов в-присутствии индивидуальных котончнтев нистатина. За •. время жизни канала/в мембране наблюдаются обратимые переходы'-"

РисЛ. Хим.структура исследованных полиеновых • антибиотиков. .

Рис.2. Одиночные каналы индивидуальных компонентов

нистатина в симметричных условиях (конпентра-ция - 2»Ю-7М'р 2« KCI (рн » 6,8). t е 22°С, и * 200 иу, фосфолипед/холестерин = 2:1, I - нистатин Aj, 2 - нистатин А2. 3 - нистатин А3, 4 - нистатин В.

между проводящим в непроводящим состоянием.

Для нистатина А3 время жизни каналов намного меньше, чем для других компонентов* В данном случав наблюдается потенциал-зависимая сборка и разборка ионных каналов, т.е. в ответ на изменение мембранного йотевпиала каналы могут обратимо.включаться в выключаться. Несмотря на различия в хвкеческой структуре нистатина Aj и А3 со стороны гидрофобной частв молекулы, ohtr, яаходобь по разные стороны мембраны, взаимодействуют между собой, образуя проводящее конные каналы. Одна подупора формируется из молекул нистатина A¿, а другая' - из молекул риога-тина А^, что соответствует ранее предложенной модели Da KmyíX (De Kruyíf, Deroel, 1974).

Для всех антибиотиков отмечена преимущественная анионная

Ряс.З, Кинетика приводаости ЕЛК б првсутствЕЕ индивидуальных компонентов нистатина. Состав кемЗранк: ф/х = 2:1: 2М KCI (рН = 6,8). Концентрация антконотяка = 10~®М. 1 - нистатитг А|, 2 - нистатин А2, 3 - нгстатея А3, 4 - нистатин В.

ТаО.шца I.

Избирательная проницаемость блсдойных лапидкых мембран, моди«цщировацгшх полиеновкми антибиотиками

Антибиотик Концентрация «locqo- Избкра-

(Ц) дяпвд: тельность

:холес-теркн

Аурецин IG"5 М tfi : I

ФлавумнцйИ А 2*10~ъ М 2 : X —24 i 2

Флавумящш В 3-IU"5 м 2 : I ♦ г

0323-ЛИА-ган-нвбалицин 2»10~7 U г : I + 2

Иимарицин 2-КГ6 Ц 2 * 4 -40 £ г

Фунгихромин ¿•иг7 а 2 : I -24 ± к .

Перимицин I.b'lQT** Ц 2 : I ♦40 + 3

Нистатин А^ 2.ЦГ8 В ■ Ii : £ -31 >2

Ьистатин 1,5*10-^ и г : I -12 * I

Нистатин А^ 4 А -10 + I

Нистатин В Л г ; I -47 + э

Фамилии 2 «КГ5 U к : I +18 + 2

селективность. Избирательная проницаемость мембран в присутствии нистатиноя А^ я А3 примерно одинакова, однако величина их мембранного потенциала намного меньше, чем у нистатинов Ад- л В ( таблица И .

. Пе^та^нн« а ) Фуяггхромин, При модификации мембран пен-таен^вым антибиотиком фунгихромяюм наб додается резкое увеличение сопротивления мембран Dpa концентрации 1»КГ5 М. Мембраны в присутствии этого антибиотика, вражтическл не чернеет, несмотря на высокое содержание в них холестерина. Мембрана, модифицированные фунгихрошном, преимущественно катион-селективны (и з 24,5шт)-. Лри создании 16-кратного градиента KCl

- и -

£ присутствии щ/нгшсромнна иаолюдается реверсия мембранного потекциа,па.

0) Другой пейтаеионий антибиотик - из^о-ЛИА.--ганн/Оалинии при концентраций 1.1 ^Бел/чанает вроьодииость ыемб-рав на несколько порядков с 10 &-10 й 1 , когда находится по обе стороны мембраны. при односторонне 11 модн^ищщии мембран этим антибиотиком не иабяадается увеличения приводимости♦ Ори симметричной модификации мембран проводимость, достигнув своего максимума, быстро ш!актшшруетея. итот аффект саяьан не с разложением антибиотика, а, по-видлыоыу, с переходом канала в менее проводящее состояние. Аналогично ганнибамицину, яентаев 0690 при концентрации 3- а увеличивает ироьодшость только в симметричных условиях. 11а; л сдается быстрая инактивация проводимости мембраны после достижения некоторого максимального значения.

в ) Лентаекошй антибиотик - ауренин увалдчиаает проводимость ыеьйракы в концентраций 10**° Ы только ври симметричной ее модификации. После достижения максимальной проводимости мембран наблюдается быстрая ее инактивация. Этот процесс также связан, по-вздимому, с перестройкой канального комплекса га время функционирования в мембране,

г) Филипик. По данным Ван Зутфена л др. < 196Г > нейтральный полиен-^илишш в концентрации 4«Ю-5 и не влияет на проводимость мембран и резко сокращает время жизни &114 при ак-вимо/шрном количестве фосфолиоида с холестерином. Однако при детальном исследовании этого антибиотика удалось показать, что в концентрациях 2*Щ"** и он эффективно увеличивает проводимость мембран ( в 105-10б раз). В его присутствии на Сислойных ли-сидкых мембранах, содержащих холестерин, в концентрация КГ^н наблюдается резкое нарастание проводимости и мембраны остаются достаточно стабильными примерно в течение I часа даже при значении мембранного потенциала £00 тч. При малых концентрациях ^лапина ( 10~" М > на мембранах с холестерином были обнаружены одиночные каналы с проводимоетьв 15-20 пС, что а 3-4 раза 'превышает проводимость амфотерицикових каналов. Экспериментальная запись одиночных филаииновах каналов приведена на рис,4. Иэ рис,4 видно, что фвдипиновые каналы имеет два основных сос—

- и -

11 р™

Г"

_Г

Ряс.4. Одиночные ионные каналы филяпина в фосфо-липидных бислоОных мембранах. Состав мембраны - фосфоливид/ходестерин - 20 : 3. Температура « ¡¿2°С, и « ¡¿00 тУ. 2ИКС1, • Коыцентрадия антибиотика - 2*10""® Ц.

тояния: проводящее в непроводящее. За время жизни канала в мембране наблюдаются редкие переходы в непроводящее состояние.

Согласно молекулярной модели амфотержушового канала, предложенной Се КгиуГГ ( 1973), мокно предположить, что фялвпя-новый канал также, как л амфотерицвновыИ, собирается из двух иолупор, находящихся по разные стороны мембраны* Наблпдалось такке нарастание проводимости при добавлении филвшша по одну сторону мембраны, а по другую'сторону - нистатина А^ едя аыфо-тернцина В. Были получены комбинированные ионные каналы*, аавись которых представлена на рис.5, 1

Фялапин при введении его с одной стороны мембраны не приводит 1С увеличению проводимости в концентрации И, однако■

J

S

ip ypM' 1 цу ^ff _

4 "^iwffiT

Рас.5. Комбинированные ионные каналы из филипина с внешней стороны мембраны и из амфотерЬ-лина В - с внутренней..

при добавлении его с прогивоподожной^ее стороны в той же концентрации, наОдцдается резкое увеличение проводимости мембран. £ ответ faa создание IO-кратного градиента KCl мембрана становится избирательно проницаемой для ионов К* ( таблица !), Б присутствии фиаивина не. наблюдается реверсии мембранного потенциала. "

Гентаены. а ) ФлавуыицаныАи В. Для тептаеновых антибиотиков - флавумицина А н £ было обнаружено, что при концентрации 2,5*КГ6 11 они увеличивает проводимость мембран только при ее симметричной модификации* После достижения максимальной проводимости наблюдается быстрая ее инактивация. Если на %оне сташо-нар*о* проводимости ввести тот «в антибиотик с любой сторона мембраны, то наблюдается реакоеварастание проводимости без инактивации. В ответ на создание десятикратного градиента в растворе KCl наблюдается реверсия знака потенциала с положительного ( +30 т7). ' на отрицательное < -40 mV) ( таблица I).

б ) Перямиция. В присутствии другого гептаенового ПА. -' аеримицина происходит слабое увеличение проводимости при сим-

матричной модификации мембраны. Деримицин, как и некоторые другие UA, ивдуиирует немонотонную кинетику проводимости мембран. При создании десятикратного градиента в растворах с перимицином набладается реверсия мембранного потенциала с отрицательное его значения к положительному. Значение мембранного потенциала и в +48 mV.

в } Леворик и его компоненты. Макролидаш гептаеновый антибиотик леворин относится к подгруппе ароматических гептаннов. Как и нистатин, он представляет собой смесь нескольких компонентов - яеворинов Aj, A¿, Ау, А^. Изучена физико-химические и биологические свойства компонентов. Показано, что биологическая активность компонентов уменьшается в ряду A^>A^>A^>

>w

Установлена структура основного компонента антибиотического комплекса леаорина А2, которая показана на ркс.1 (Zioiin-s1ci et al., 197И), установлена частичная структура других компонентов (Zieliiialci et al., 1979). Как видно на рмс,1, компоненты отличаются друг от друга числом гидроксяльннх групп в молекуле.

На рис.6 показана зависимость проводимости мембран от концентрации исследуемых компонентов леаорина.

Видно, что наибольшей эффективноетыэ обладает леворин Ад а наименьшей - Ад. По степени изменения проводимости мембран компоненты левориыа мокко расположить в следующий рлд с возрастающей эффективностью aq>Aj>, что согласуется с литературными данными по биологической активности компонентов. Таким образом, существует корреляция между действием антибиотика на клеточные мембраны и на бислойние лип шиш е мембраны.

В отличпе от неароматвческих геятаенов компоненты левори-на увеличивают проводимость мембран, когда они находятся с одной стороны мембраны. При этом они обладают важными свойствами Э^ект антибиотиков на проводимость зависит не только от их концентрации, но и от величины и направления приложенного к мембране потенциала. Если иа мембрану подается до 200 мВ с минусом со стороны антибиотика, то в ¿том случае не наблюдается увеличения проводимости мембраны.

При обратном направлении пола аффект одностороннего дей-

^ом'см"*)

л

С1М]

м"' 10* ю7

ю6

Ряс,6. Зависимость проводимости бимолекулярных мембран от концентрации компонентов леворина С А1; А3* а растворе 2Ы КС1 При рН = Ь,7, 1=° » 25°С, и = 100 пЛГ.

ствия леворина А^ эавясит от величины электрического потенциала. При йалранении до 75 мВ не наблюдается изменения проводя-мости мембраны» однако при более высоких потенциалах {выше 75 мВ) наблюдается резкое нарастание проводимости мембрана, изменение потенциала вдвое (101>200 мВ.) при постоянной концентрации антибиотика приводит к росту проводимости в 16 раз. Удвоение же концентрации антибиотика приводит к росту проводимости в 4 раза. В отличие ох яеароматических антибиотиков сборка каналов компонентами леворина зависит от величины и направления электрического поля. Этот,процесс необратим*

Для компонентов леворина наблюдается два вида сборки ионных накаляв; потенциал-зависимый« концентрационный. Первый тип сборки осуществляется за счет величины приложенного электрического поля при концентрациях леворина от 10-3 до При концентрациях больших, чем 5*ИГ? М появляется второй тки сборки, зависящий от концентрации антибиотика.

Молекула леворина, в отличие от других полиенов* содар-

ш в своем составе ароматическую группировку, благодаря кото-рои молекула приобретает дополнительный положительный заряд: один расположен у входа в канал, другой - с гидрофобного конца молекулы. Следовало ожидать, что компоненты леаорина будут создавать в мембране анионную избирательность. Однако в эксперименте мы наблюдали катиоинув селективность. Этот факт подтверждает предположение, что система селективности локализована на гидрофильной части лактонного кольца молекулы.

При исследовании взаимодействия двух разных по структуре антибиотиков - амфотерицина В и леьорина и избирательной проницаемости, обнаружено, что при введении с одной стороаы мембраны анион-специфичных молекул амфотерицина В ( аибо нистатина), а с другой сторона катион-специфичных молекул леворина А, наблюдается их взаимодействие и образование проводящих каналов, селективность которых определяется молекулами амфотерицина В. Проводимость комбинированного канала'составляет ¿-3 пС, что вдвое меньше проводимости индивидуальных амфотерициновых каналов. Предполагается, что при взаимодействия разных по селективности двух полувор, происходит изменение потенциала внутри канала и в зоне контакта даух полупор.

И. Э|Иект одностороннего действия ам+отерицина В. Взаимодействие двух разных по селективности полиежовых антибиотиков -амДдтдрицина В и леворина.

Амфотерицин В увеличивает проницаемость биологических и модельных мембран для ионов и неэлектролитов. Каблтдаемая ка-тионная селективность на клетках и анионная на бимолекулярных пипидвых мембранах (£ЛЦ), а также односторонний эффект на плазматических мембранах и только двусторонний - на КШ заставили более детально изучить на бислойшх иипидннх мембранах механизм одностороннего действия амфотерицина В.

Введение амфотерицина В в- концентрации 2«ЦТ8 и с одной мембраны приводит к появлении на мембране долгоживущих ионных каналов.

На рис.в показана запись работы одиночных каналов, фор-

J .^vWv^14,

Рис,7. Дискретные мэывнеикя проводимости мембраны в

присутствии антибиотиков ароматической и неароматической группировок.

I - аыфотерицин В в симметричных условиях, концентрация 2*ДО~8М в растворе Ш KOI; рН - 7,0; te> 24°С; ф/х >2:1* 2 - амфотерицин Во одной стороны мембраны, концентрация 2'НГ8 Ы в растворе 2 II KCI; рН ■= 3,0; t»s iS°C; ф/х > « X : I. 3 - яеворин Л£У с одной стороны мембраны, концентрация 5«10-8 Ы в растворе 211 KCI; рН =. 7,£J; t° > 25°С; ф/х « 2 : I. 4 - вомбиниро- • ванные каналы, состоящие из амфотерицина В с внешней стороны мембраны, концентраций 5*10~э М в леворина Лзд с внутренней стороны мембраны, концентрация 2»10"° U в растворе 2И KCI; рИ > 7,0; t"c 25°с. Потенциал на мембране 200 мВ.

Рис.8. Запись работы одиночна* каналов аыфотери-цика В о одной стороны ыембраны в концентрации 2* II при мембранном потенциале +гШ пт (+ со стороны антибиотика). Состав водного раствора: 5М КС1;,рИ "» 3,0;

Состав мембранного раствора: 10 мр фос$олшидов + 4 мг холестерина в , I мл гептана. "

мируекых амфотерицином В с одной стороны мембраны. Среднее время мани канала в активном состояния Т0 « сев., а в открытом и закрытом состояниях соответственно Т0 « 2,9 сек., Тэ » 0,08 сек. .

,11а рис.Э приведена гистограмма распределения проводимости одиночных каналов. На ней видна большая дисперсия проводимости каналов, от 2 до 20 пСм; С наибольшей вероятности) появляются каналы от 7 до ЮнС. Бремя сборки каналов т зависит от величины и направления электрического, поля. ■.

Избирательная проницаемость мембран при односторонней введении аыфотерицина В преимущв'ственяо анионная в не зависит от концентрации холестерина в мембрана. Втабяице приведены ввачекая разности потенциалов, возникающих на мембране ври соадалин 10-аратного градиента проникающего иона кал со сторо-

N

N

20

го

ю

ю

Ли!

ИЛд-ПС

Ю

ао

Л

Л

• Л п пс

11 " 1 I 111 - г1 ч

ю

ао

Рве,9. ЗДстограмка распределения проводимости (,пС) одиночных каналов при одностороннем действен ; а^теридаяа В ^'ХО""3 « ) дрв мембранной потенавале ЙОО мВ. Иемб|ины формировалл до общего ддпидного раствора , содержащего 10 мг холестерина й;10 мг фосфояипида в I мл гептана в растворах 2М КСХ; рН 3,0; И-I - соответствует в растворе: с анибио-

ТВК0Ы. 2 - соответствует ^ антибиотиком*. •

Ч* в растворе о

вы антибиотика, так я с оротнвоводохноа ехо стороны»

Из проведенных данных видно, что наибольшая ье личина ■ потенциала достигается в тем случае, когда градиент проникай- ; щего вена создается со стороны антгбиотика, При обратном вап-равленив1 градиента величина мембранного потенпдаиа вдвое ыекь-

- ¡¿о -

Эффект одностороннего действия амфотермцина В зависит от концентрации фосфолипидо» в липидном Сисдое. Если мембраны формируются из липидного раствора, содержащего 10 мг/мл гептана, то всегда наблюдается односторонний аффект амфотерицина В я он полностью воспроизводим. При более высоких концентрациях фосфюлипидов аффект одностороннего действия не воспроизводится. Сборка одиночных ионных каналов происходит, при концентрациях амфотерицина В, позволяющих получить симметричные каналы (2*10"® Ы).. В отличие от симметричных канадоЕ, число асимметричных каналов при фиксированное концентрации амфотерицина А не зависит от концентрации холестерина в диапазоне 2 * г 10 иг/ ил ыембраноформирущего раствора*

Ьа рис.10 приведена зависимость проводимости мембран от концентрации амфотерицина В с одной стороны мембраны. Эта зависимость степенная и ори разных концентрациях холестерина в мембране имеет одинаковый показатель степени « 4. Достиже- -ние стационарной проводимости при действии амфотерицина В с одной стороны мембраны происходит в интервале времени.25-35 мин. За время порядка 20 мин. амфотерицин В практически не отмывается из мембраны.

Асимметричные амфотерициновые каналы блокируются тетра-этиламмоиием ( ТУА) только' со стороны антибиотика. Эффект уменьшения интегральной проводимости мембран вдвое наблюдается при концентрации ТЭА 3*10""^ и. Ута концентрация в 10 раз больше, чем та, которая необходима для блокирования симметричных каналов.

Приведенные результаты показывают, что в основе одностороннего действия амфотерицина В лежит увеличение проницаемости мембран по канальному типу. Проводшций канал, яо-вядилюму, представляет .собой полу пору. В пользу этого предположения говорят данные по измерению величины разности потенциалов на градиент проникающего иона, блокированию тетраэтиламмонвен асимметричных каналов только со стороны антибиотика, а также несимметричная вольт-амперная характеристика ма'мбран при односторонне 4 модификации амфотерицином В.

Независимость чаола каналов от концентрации холестерина, в мембране при фиксированной концентрации.амфотерицина В пока-

Рис.10, Зависимость проводимости мембран от концентрации аыфотерицина В с одной стороны мембраны в растворе 2М КС1; рН » 3,0; г» ш Х2°с. Состав мембранного раствора: 10 мг фосфоляпидов + 4 мг холестерина в' I мл геотана*

зывает, что молекула холестерина по-видимому, не формируют проводящие каналы в комплексе с антибиотиком, а создают необходимые условия для сборки каналов из нескольких молекул амфо-терицина В.

Роль фосфояяпида и рН в одностороннем еффекте амфотери-цива В не совсем лена. Изменение концентрации фосфолвпидов и величины рЫ «окат влиять на физическое состояние липидного бн-слоя я тем самым на пространственную ориентацию в упаковку молекул антибиотика относительно плоскости мембраны.

- г* -

выводи.

1. На молекулярной уровне проведено исследование большой группы пошаеноьцх антибиотиков: тетраены, пектаены, геп таены, от мчащиеся по структуре. Все изученные соединения увеличивают ионную проницаемость ллпидных мембран, содержащих в своем составе холестерин. Впервые показано, что нейтральный ПА - фияипин индуцирует в мембранах шнцую проводимость но канавному механизму, Обнаружеш.одиночно-функционирующие филипиновые каналы с проводимостью 15-20 пС. Проводимость комбинированных каналов ¿и ли пина и аыфотерицина В при введении их по разные стороны мембраны составляет ¿&-30 пО.

2. Впервые показано, что в присутствии флавумицинов А и В, пи-иарицина, нистатина и А3 наблюдается ньмонотонная кинетика с нарастанием проводимости и последущей быстрой ее инактивацией до .проводимости немодифвцированной мембраны.'При создании десятикратного градиента по проникающему иону на мембранах наблвдается- реверсия мембранного потенциала с положительного ее значения к отрицательному. Предполагается, что такое изменение мембранного потенциала связано с перестройкой канальных комплексов в процессе их функционирования в мембране.

3. Впервые обнаружено, что индивидуальные компоненты нистатина А^, А^, А3 и В увеличивают проводимость КиМ по канальному механизм. Определены времена жизни в проводящем а непроводящем состоянии, В присутствии нистатина А3 обнаружено обратимое потенциал-зависимое включение короткоживущих каналов. Несмотря на различия структур молекул нистатина А^ и А3 со стороны гидрофобной части молекулы, наблюдается их взаимодействие по разные стороны.

4. Показано, что в отличие от неароматических антибиотиков нистатина и амфотерацина В, индивидуальные компоненты левбрина увеличивают проводимость, находясь по одну сторону мембраны. По степени изменения проводимости мембран, компоненты лево-рина располагаются в рлевдкщий ряд с возрастающей аффектив-

ностью: А0 А^ А2 А3. что согласуется с данными во бяояоги-ческой активности компонентов лаворина.

5. Обнаружено, что амфотерицин В, добавленный с одной стороны мембраны, в водно-солевых растворах ( рН а 3,0) резко увеличивает проводимость мембран. При концентрации 2*10 Н обнаружены долго живущие ионные каналы ("20 о ) о большой дисперсией проводимости 2-20 пС. Эффект одностороннего действия амфотерицина В зависит от концентрации фосфолипццов в лиоид-ном бкслое < № иг/т). При более высоких концентрациях эффект одностороннего действия не воспроизводится, В отлячие от симметричных каналов, число асимметричных каналов при фиксированной концентрации амфотерицина В не зависят от концентрации холестерина в диапазоне 2 + Ш мг/мл «ембраноформи-рующего раствора.

Впервые обнаружено взаимодействие двух разных по Структуре я избирательной проницаемости антибиотиков - амфотерицина В я лепорина А, При введении с одной стороны мембраны аняон-специфичных молекул ( амфотерицин В), а в другой стороны -катион-специфичных молекул (леворин А ) наблвдается их взаимодействие я образование проводящих каналов, селективность которых определяется молекулами амфотерицина В. Проводимость комбинированного канала составляет 2-3 пС,' что вдвое меньше проводимости индивидуальных амфотерициновых каналов*

СПИСОК ТРУДОВ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО так ДИССЕРТАЦИИ

I» Касумов Х.М,, Каракозов С.Д., Самедова А.А», Шеняа Ю.Д. "Взаимосвязь структуры и функции полленовых макролидных антибиотиков", Москва,.1982, X Всесоюзный биофизический съеад, тез.докл,, стрЛЭй.

2. Касумов Х.Ы., Малафриев О.К., Самедова А.А. "Способ идентификация стерпна". Йаявка на авторское изобретение ( 1983 Г.). Авторское свидетельство Ш 1097952.

3, Самедова А.А,, БагироВс! И.Н. "Действие полленовых антибиотиков на проводимость бислойных липцшых мембран". 2-ая

научно-практическая конференция молодых ученых по проблемам социально-экономического развития г.Баку в II пятилетке и в перспективе, Баку, 1983, теэ.докл., стр.93.

4. Касумов Х.М., Каракозов С.Д., Самедова A.A. "Оборка каналов из разных по селективности полупор". 16-я конференция .фВБО (Федерация Европейского Биохимического Общества), Москва, 1934, мат.теэ., ХУ-066, стр.347.

5. Касумов X.U., Каракозов С.Д., Самедова A.A., Багирова H.H., Шенвн И.Д. "Исследование механизма взаимодействии! различных по струхтуре подиеновых антибиотиков о липидными мембранами", Ж-л "Биофизика", Дап,, 1984, стр.31.

6* Самедова A.A. "Действие филипива и индивидуальных компонентов нистатина на проводимость бисдойных мембран". *-л "Известия Ah Азерб.ССР"* » 6, 1934, II8-I2I.

7. Касумов Х.М., Самедова A.A., Шенвн Ю.Д. "Исследование механизма взаимодействия индивидуальных компонентов препаратов -леворина и нистатина с лнпидншн мембранами", ü-л "Антибиотики", 1907, II, cip,Ö24-Ö28, '

в. Самедова'А.А., Касумов X.U., "Спектральный анализ поли еновых антибиотиков в клеточных культурах". "Азербайджанский • медицинский куриал", Л 5, 1990,

9. Касумов X.U.. Седедова A.A. "Дейогвие а^фотерицина Ь с одной стороны мембраны."Биофизика".ДШ ЬИНИТИ (в печати).

Подписано к печати 05.03.91. Заказ 74. Тираж 100, Типография АН Азербайджана

Бесплатно.