Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Взаимосвязь между нейротоксичностью и фосфолипазной А активностью пресинаптических нейротоксинов из яда некоторых членистоногих

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Взаимосвязь между нейротоксичностью и фосфолипазной А активностью пресинаптических нейротоксинов из яда некоторых членистоногих"

^ ф'

\ АКАДЕЛШЯ НАУК РЕСПУБЛИКИ УЗБЕКИСТАН ИНСТИТУТ ФИЗИОЛОГИИ И БИОФИЗИКИ

Па правах рукописи УДК 577.353:591.145.3

НУРИТОВА Феруза Асетоона

ВЗАИЛЮСВЯЗЬ А1ЕЖДУ НЕйР©ТОКСИЧНОСТЬЮ И

ФОСФОЛППАЗНОИ А АКТИВНОСТЬЮ Г1 р Е С И И А П Т И Ч Е СI (11X К !£П? О ТО КС И И О О ИЗ ЯДА

К Е ко ТО Р Ы X Ч Л ЕIIИ С Т О Н О Г ИХ. (03.00.02 — биофизика)

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискаине ученой степени кандидата биологических наук

Ташкент — 1995

Работа выполнена в Институте физиологии и биофизики АН РУз.

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Усманов П. Б.

Официальные оппоненты: д. б. н. Салахутдинов Б. А.

к. б. н. Вагина О. Н.

Ведущая организация — Институт биохимии АН РУз.

Защита состоится « » 1995 года в « »

часов на заседании Специализированного совета Д 015.01.21 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук при Институте физиологии и биофизики АН РУз по адресу: 700095, Ташкент, ул. Ниязова, 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института физиологии и биофизики АН РУз.

Автореферат разослан «У^» 1995 г.

Ученый секретарь Специализированного Совета,

д. б. н., профессор Махмудов Э. С;

Актуальность темп. Яды амей и насекомых и их нейротоксические компоненты являотся, чрезвычайно иег.ными " инструментами" исследования особенностей функционирования ;; молекулярной организации возбудимых мембран. При изучении скнаптической передачи нашли широкое примените просинэптическче кейротсксины, выделенные' иэ ядов некоторых эней. Установлено, что если не главным, то достаточно важным условием их пресмнаптического действия является их фосфолипазная активность. В случаях проявления миотоксического, кардиотоксичес-кого, антикоагулянтного и др. действий ядов также выявлен существенный вклад фосфолипаз.

Фармакологические эффекты . болытнства фосфолипаз обусловлены их специфическим взаимодействием с помощью белковых : рецепторов с мишенью и наличием у них специфических комплементарных участков -фармакологических участков. В результате такого взаимодействия обеспечиваются Ьптнмйлыгае условия для гидролиза ""критичных" ("crT.ti.cal"} фосфолипндов мембран, что приводит к нарушению их структуры и проницаемости длк ионов.

Выяснение механизмов, лежащих в основе фармакологических эффектов ядов и их -компонентов, представляет большой интерес и будет способствсрать раскрытию Физиологических функций возбудимых и биологических мембран.

Б связи с этим особу» актуальность приобретает поиск и характеристика' токсинов, специфически взаимодействующих с биологическими мембранами. Большие перспективы в этом направлении открывают токсины пауков. Некоторые из них обнаружены нами в яде пауков Егезиз п1бег, 31е2осИрЬиз 11пеа1ип и АпешеаДа зр. , которые по предварительным данным обладают пресинаптическим эффектом и фосфо-лмпазной активностью.

Цель и задачи исследования: Основной целью данной работы являлось изучение взаимосвязи между фармакологическими аффектами и ферментативными активностями ядов пауков Егезца гПаег, 31ейос11р|-шз 11пеа^з и Апешез1а зр.

В хсдо исследований решались следующие задачи; ■

1. Изучение нейротоксичности и фосфолипазной активности ядоо пауков Ег-евиз гппег, 31ееосНрИив 1апеа1из и Апевэзга эр., а также их действие на свертывающую систему крови.

2. Выделение компонентов яда паука Егееиз п i2.ec, ответственных за Фармакологические эффекты яда.

3. Характеристика нейротоксических, физико-химических и каталитических параметров компонентов яда паука Егезиз пхйег.

4. Исследование антикоагулянтного действия фосфолипазы яда

паука Кгеоиз пгйег.

Научаан иовизиа и практическая значимость результатов иссль-доЕСччил. В результате проведанной работ установлено, что иды пауков ЕгесиБ п1йег, Stegodi^J])UL; И Лпекэг^з зр. наряду с иейротоксическими эффектами, заключающим >ся в прссушаптичосйсм блокировании нервно-ниточной передач» обладают фосфалхоагпсй Л активностью. Обнаружено, что лд паука Егеаио п!£ег обуздает сирахен-ной ангикоагулинтной активностко. С помощью ионообменной проиатог-рафии, гельфильтрацаи и високогЭДак.'ПФНбЯ жидкостной "^р-ийтчгх^'р/л'. из яда паука Егое-ие пз.*:ег сиде-лел компонент ЁпРА с юлокуллриам весом около 13000 Да, отдотствоишй »а нсЛр£токвичпозт)» и ыггикс л-гулянтноо действие. Показано, что обработка оитиьнзЯ фракции иоа-■гамм, пигибируклдими фссфолипазную активность, сопровождается потерей нейротоксического и антикоагулявтного зф>зкта. Определен нокислотний состав компонента ЕпРЛ (приблизительно 130 енмнохис-лот), в качество И-конца ипеитифициропаи- «спзрагин, На озкордони анализа экспериментальных данных, предлог:«} «екгнизм антикоаг'У-лянтного действия компонента ЕпРЛ, Согласно этому ксм-попоят ЕпРЛ специфически связывается С :!Иг.ро;:«'.5ранамл тромбоцитов,- что существенно сказывается па взоимодеЯсшгй фмэтогоо чг)г--%~ тывания и, следовательно, на образовании всего коагуляаионного комплекса. Конечным результатом такого связывания является ингиси-рование нормальной ак- -ивации фактороь свертывания, приводяцег к антикоагулянтному эффекту.

Результаты данной работы позволят углубить знании о механизме фармакологических, эффектов ядов и их компонентов и будут способствовать установлению особенностей функционирования и молекулярной организации возбудимых мембран. Компонент ЕпРЛ, специфически действующий на систему гемостаза, найдет применение при диагностике, а возможно, и для лечения геморрагических и тромбозмболическнх эабо-. леваний.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались па Ученых советах VI семинарах Института физиологии и биофизики АН РУз.

Публикация результатов исследс за ът. Основные положения диссертации изложены'в 3 'печатных раготах. .

Объем работы; Диссертация -галоже т на 104 страницах машинописного текста и состоит из введг.шя, обзора.литературы, описания методов исследования, изложения результатов экспериментов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитированной литературы (180 источников).* Диссертация содержит 7 таблиц и 22 рисунка.

МАТЕРИАЛЫ И КВГОЯЦ НССЛИДОТШ1НП

В работе использовались цольние ЯЕМ пауке®, полученное и» Среднеазиатского зоокомбината.

Токсичность ядов (ЛД50) определялась методом пробит-эная) <•:>.-. (Голенький Л.М., 1S63) на Соли:-, мивах весом 20.г-н методом Проэо-lxpcKoro (Прозоровский В.Б., 13C3),' используя самцц американски:! ■мр'м'анов (P«riplan«ta am fr i osnii) .

В электрофиэнологическлгл ьксперииептах использовали погл-акг-пуо к.адцу лягушки Raviü tetii-osar i а и дорзовантралъную мыщцу 120 по ш/меиклатуро Саодграссй (5iio«J¿rao£i, 1923) саранчи Locust» üißr:- loriu raißratotiöides.

Регистрацию синэптичг-ски:: кото-нциэлов и нем бранный потенциал [МП)- нишечных волокон осуществляли вкутриклеточно с помощью стек-ивнних нилроэлектродо'«, 3avonu-_-.i>ntr.'. о М KCl,' с сопротивлением S-i'.C« Юн, При регистрации потенциала концепой пластинки (ПКП ) vi воэбу*--закмего постсинаптическо! о поте нциала (ВПСП) моторные нервы разд-накались через изолирумче« устройство с помощью всасывающего ьлектрода прямоугольники импульсами длительностью 0.1-0.2 мс и ¡.иплитудой 1-10 В. Все экспсрим'.ити проводили при комнатной темпе- . >атуре. Электро1">пзио.погмческно ^эксперименты проводились совместно : с.м.с. Каликулоши' Д.

Белок определяли" по метолу Лоури (J.oviry О.Н., 1051).

Фоа1юлипазну» актишюсть определяли методом потенциометричес-ого титрования, описанным Dt- Haas.СЛ. (De Haas G.Ii., 1368).

При определении стереоспецифичвости фосфолипази в качество убстрата использовали (1оа5>атмдил"холяп, виделешшй из хлопчатника Исамухамедов A.ÍU. и др., 107В). Анализ продуктов гидролиза прово-или с помощью газо-жидкостной хроматографии (ГЖХ) с сотрудниками иститута химии растительных веществ АН РУз.

Протеолитическую активность определяли стандартным методой по азеину (Каверзнева У.Д., 1971), при pH 7.0.

Гемолитическую активность определяли методом Е. Condги& Andrea, 1964). '

Время ренальцификации плазмы определялось методом, описэнним .SUP П. (Bigas R.-, 1362). Активированное частично тромбопластино-зе время (АЧТВ)-определялось методои ПвЬаоп A.L. (Bubson ft.L., 174). Протромбиповое времл (ПВ) определялось по методу Quick itjiou, юза).

Фракционирование яда осущостш.или, н<люли»ун хрснатографичс-с-I© оборудование фирма "ЬЯЗ" <!"ш.-цш1) . ГисокоэЭДнгктивную жкдкост-

- е -

ную хроматографи» (ВЭХХ> на хроматографе "АНех"- (США), а также определение аминокислотного состава проводили в Институте биоорга-нич'гской химии Российской АН совместно с р.н.с. Атакузиевьш Б.У.

Необратимая инактивация фосфолипазной активности осуществлялась методом Р1е1ег50п (РхсДегзол Н.А., 1374>.

Диск-электрофорез на полиакриламидном геле проводили по иото-ду Рейсфилда (ВеЗеГ1е1с1 Л.А. егь!., 1962> с использованием оборудования и реактивов фирмы "Яеапа!" {Венгрия) и " РЬатио1ь'* (Швеция) .

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИИ

О&цш! характеристика яда ааукол Егезиа п!йог, 5(ево<ЛрЬив iineat.ua И Апевепжа вр.

Диофнлиэованный яд паука Егезиа пхгег представляет собой, белый порощо» с делтоэатым оттенком. Раствор яда в дистиллирова1 шой вод.э имеет реакций, ' близкую к нейтральной, рВ 6.5. Яд содержит 60-652 белка. Результаты электрофоретичаских исследований яда показали,, что. лучшее разделение С1& компонентов.) достигается в трис-глициновом буфера с рН 0.2При использовании Ь-аланинового буфера с рН 4.3 отмечено только 6 компонентов- Токсичность (ЛДЬО) цельного яда у белих мышей, при внутрибрющинноы введении оказалась 160 не/кг. У насекомых яд вызывал паралич в дозе 7-8 мкг/г с характерной картиной отравления-, в. первые- минуты наблюдается некоторая заторможенность с последующим. через 2-3 минуты возбуждением, насекомые стаповяте« более подвижными» череЭг 30-40 минут после введения яда. отмечается нарушение координации и в конечном итога --обездвиживание насекомых.

Яд цаук^ ИаЩв® до внешнему виду идентичен яду

паука Ее es.ua пДае*- Содержание белка в> цельном яде: составляет 5£>~60£., Пр. злекгрофоретическим. данви» в- трио-глициновом. буфере отмечена Ц-13 компонентов яда* в, Ь~ алаыиновем % компонентов, токсичность, яда. (ЛД50Х у белых- мвдей тарй вмутрибрюшминок введении составляла 180, мг/г», для. насекомых - мкг/гч.

Яд паука Ап.епез!», ср.. представляет собой; порошок с сероватым оттенком;., В цельном, яда паукас.од<эр)г,11ТСЛ. СЬ-7,0Х белка.. Элоктрофо-ретические исследования тя№ сяедувдаие: результат:!« разделение: яда в трис-глициновом; буфере, с. рН 16,- компонентов^ Ь,~алаиивавом -

8 компонентов.. Токсичность, яда пй проявлялась, у мышей, при, внутри6-ркшинном внутривенно«: введениях; дак«; пр». относительно, высокие концентрациях. С 2.00,мг/ «Г>.. Однако,, при введении раствора этого, ядг

непосредственно внутрь черепа (лобный гребень-субдур&льное пространство моэга) мышей токсичность резко возрастала и ЛД50 составляла 1,25 мг/'кг. Очень высокая токсичность яда паука Anenesia зр. при внутричерепном введении наводит на мысль, что токсические компоненты, содержащиеся в яде, действуют непосредственно на нейроны

центральной нервной системы. Яд пзука Anenesia зр. вызывает устой' ®

чивыи паралич при инутриполостном введении у -насекомых (тараканы) в дозе 10 мкг/г.

Действие Н/F» пауч'рв Eresur, rjiger, Stegodiphus linpsfctis И Anenenln sp.. rm ринвдтотеску» передачу

Как показали электрофизиологические исследования яд блокирует как спонтанную так и вызванную секрецию медиатора. В норме в области нервно-мышечного синапса лягушки регистрируется миниатюрные потенциалы концевой пластинки (МПКП) Частотой около 1с-1. Добавление яда паука Eresus riiger в концентрации 150 мкг/мл в перфузирую-щий раствор приводит к изменениям частоты МПКП, носящим трехфазный характер (рис.1а). В первую фазу (длительностью 30-50 мин) частота снижается до 0,2-0,4 с-1. Во вторую Фазу наблюдается постепенное увеличение частоты ИШф, максимум которой составляет около 240, с-1. Длительность этой фазы около 30 мин. В заключительную фазу происходит вторичное снижение частоты МПКП, и х 150-й минуте действия яда частота составляет-около 0,5 с-1. При использовании более высоких концентраций яда частота МПКП изменяется в большей степени. При этом резко сокращается длительность всех трех фаз незаметно снижается МП мышечных волокон.

Добавление в конце третьей фазы таких соединений как кальциевый ионофор дибутирилдибенэо-18-краун-6 и. разобщитель окислительного фосфорйлирования тетрахлортриФторметилбензимидаэол, а также увеличение концентрации КС1 в среде.до 20 мМ или повышения осмотического давления раствора путем добавления сахарозы в концентрации 300 мМ (факторы увеличивающие частоту МПКП за счет повышения Концентрации Са2+ в аксоплазме нервного окончания) не вшивали существенного изменения частоты МПКП. Эти результаты указывают на то, что яд паука вызывает истощение запасов медиатора или на существенные нарушения•механизма нейросекреции.

Наряду с -действием йа частоту МПКП, т.е. иа спонтанную секрецию медиатора, яд оказывает заметное влияние и на вызванные ответы, т.е. на ПКП, в основном на их амплитуду. Изменение амплитуды ПКП также происходит трехфаэно (рис>16). В первую фазу наблюдается снижение, во вторую - увеличение, третью - вторичное снижение и

- О - '

iirvuion подавленно 1113 J.- Одновременное наблюдение за nsMC'WtiHfii; •юс-! очы НПКП и амплитуды ПКП поигрывает, что порвоначглмо пропс ходит Подавление выэваииях ответов н затем - спонтанной гюткгл;огя I-.«л-t.Ho-мышечного препарата. Анализ полученных данных сипд^тг пъс; г-ует о том, что эффекты, ензиваамне рдои ?мукэ E.niicr, ряс/уы

!\

I !. , ! 1 ! \

(«.¿I,SJ \

~ г*-- •.■УСТ*'"'******

•ZI''

¿i) I"0«"

Рнс.1. Изноненне частоты НПКП (а) и адзлт-у;;'-! ППП С<5> ;.нгуг при /i'-vicTniiu яда паука Eresua nicer. Концентрация яда 150 мкг/н. «> 1 - контроль, 2 - через <50 мин., 3-00 мин., 4 - 140 ми действии n/yi; 6) 1 - контроль, 2 - 40 мин. , 3 - во май. , 4

100 тип;. дсПстбин яда.

Действие яда аука Stegodiphus linonLuc н;\ ст'аптичссяу» п ¡сдачу иерпао-мыш чных препаратов портняжной мышцы лягушки анэл гично действию яда паука Eresu?; niger. Яд паука Stcgodiph lineatun также блокирует K'-xi: спонтанную т¿¡ic а шэначную секроц медиатора в три фазы.. Добавление нда паука Stegodiphuc lirieatus перфузирующий раствор первоначально приводит к снижению часто НПКП до 0.3-0.5 с-1. Во вторую фазу наблюдается постепенное увел чг-ние ШКП, максимум которой составляет 50 с-1. относительно не мы. Третья фаза характеризуется вторичным снижением частоты НПКП к 240 минуте дгйствия яда частота составляет 1.0 с-1. Замети влияние яд паука Stegodiphuc lineatnE оказывает и на вызванные с воты, то есть на ПКП. Изменение амплитуды ПКП также трехфазн первоначальное снижение, затем /вгличение и вторичное снижение последующим подавлением ПКП. ,

Таким образом, яд паука ;tegociphus lineatus оказывает де( тние на синаптическую перелачу подобно пду паука Eresus n ige имея трехфазный характер. Единственное отличие» в действиях эт ядов заключается в различной длительности фаз снижения и увели1 ния частоты НПКП, а также - амплитуды ПКП.

Цельный яд паука Anenesiu sp. в диапазоне концентраций 1

1

- ь -

500 мкг/мл практически не оказывал влияния на нервно-мышечную передачу у лягушки.

1

'"И Ы.И.Ы <т

I

2

0.5 кВ 2

г

4. и I

сек

3

5 »3

40. ■ мсек

3)

Рис.2. Действие яда паука Апе»ез1а ар..па №1100 (а), ВПСП (&> и гл-утаматные ответы (в) саранчи, а) 1 - контроль, 2 - через £> мин., 3-15 мин. действия яда; концентрация яда 1 мкг/мл; б) 1 -контроль, 2 - через 5 мин., 3-20 мин. действия-яда; концентрация яда 1 мкг/мл; в) 1 - контроль глутамат - 1 х 10-5 М, 2 - через 5 мин.,3-12 мин. действий яда; концентрация яда 50 мкг/мл.

Однако, на нервно--мышечных синапсах саранчи, где медиатором служит глутамат, яд паука уже в концентрации 1 ькг/мл вызывал существенное нарушение механизмов как спонтанной, так и вызванной секреции медиатора. Вначале, через 5-10 мин контакта с ядом паука, наблюдалось увеличение' частоты (миниатюрных возбуждающих постси-наптически/. потенциалов (МВПСП), затем-через некоторое время появлялись серии спонтанных гигантских МВПСП С рис.2а). Частота гигантских МВПСП в серии составляла 5-7 с-1, а частота нормальных МВПСП составляла 10-15 с-1. Средняя амплитуда гигантских МВПСП составляла 5-7 мВ ( в норме средняя амплитуда МВПСП составляет 0.4±0.1 мВ). Гигантские МВПСП наблюдались в течение 180-200 мин., затем частота МВПСП начинала постепенно снижаться и через 300-350 мин. наступал полный блок нервно-мышечной передачи. С увеличением концентрации яда наблюдалось снижение латентного периода и времени наступления полного блока нервно-мышечной передачи. Одновременно с увеличением спонтанного освобождения медиатора наблюдалось существенное изменение и в процессе вызванного освобождения медиатора. Тац, после 10-15 мин. контакта с яд--! в ответ на один стимул возникали серии ВПСП.'( рис. 26). Наблюдаемые эффекты были необратимыми, то есть отмывание Ь течение -30 мин. . не восстанавливало исходный уровень как спонтанного так и вызванного ответа. Полученные экспериментальные данные свидетельствуют о том, что в яде паука Апееез1а ар. содержится компонент(и), обладающий пресинаптическим действием.

' ' * М *

ш ттттм ттиШ ттттт ($0 «кг/т> вт тшт

далось постейен.Чое. снижение амплитуды к«Я ЩЙСИ И На 10

иин контакта с. здон садщгсичео&и». деетеняиалй нервно^ мышечного синапса полностью исчезали.. Яд паука в зтой концентрации аналогичным образом подавлял, глутаматиндуцируемые- Срис.2в> ответ« нервно-мышечного синапса саранчи... Следовательно;., яд. паук» в этой концентрации и вше обладает поотсинапдаческим действием.. Эффект носит обратимый ха^ктер,, т.е. отмывание в, те,ч.ение. 2.0л 2.& мин. приводило, к восстановлению, ответов на, аппликацию глутамата.

Таким обра.зом,, эк.сперимеитальнн©. Данные показывают, что в яде, паука, АпеюзБДа Чр». Содержался ФЫСЗД&^ОДДООДЬНЫА. нейротоксины, взаимодействующие с пресинадтичеоким. и, востсииаитическим участком глз^а^тергически* смн.ан.Ссе,.

как ий^^т:»?, С%М»к Й.Д.,« Ш),«. » вресинапти-

ческом. .тодсийев; змей. феСфоДОМОДЮ. активность, играеят

важную роль,. язяэд Р; интерес.; изучение; фермент

тативны^ акяивнортчзй пачкав».

Фе!)м^1татие»ая активность яда пауков пг&ек.,

К' АпевезДа. чр..

Наши, исследой^нИ1Я; 1)Р.КЭЭ9ЯИ>, ндаь па2£»Ш- Вхаднв; п1врг обладает «Л ^¡(ВД&аф&Ш&бйк активностями». Фосфолипазная, активность. 4 |целйчнрйг обрасти», С максимумом; при. рН, 4Щ^мн^^ш»; * №);-. Прог^олитинес.каяг активность.-0 .0034 ед/мг,, рН; 7/.0>. . .

«¡осфрлйпйзнш?; а, адширст^ бмяе. и в, яде. пауков;

зъеач^Др^ив; и, Очиаке». эди: ад» уступают яду

паука Егеви.в, г^д^ед. по, катздихической: активности.. Удельная, активг-«Щг ЧЙУ^1А«1)ииа»Яг --• Нкмол^мин, х: мг белка., ял?, ПЩ>?а,. Щ*. -- «М»»-. Протеолити-

ческа»». адтяедо^ть, яда^ ЦледЦ?; составляла; 0.002&

ед/И£-. % еде, падщ, Аоевдн^.^ ч^,. пдояаддоч^до, дооЦдость. «л нг^Э^.ена,. гцму^нй^ан^ ЧКТИВЯОСТ«, ф 11осявдх~

Анад^ пвд^ОД одбомгя» ^¡жйзшшл^инл темоямь ж^ск^ой хряма^пц^н, вдкегяв«,. ЧТРЬ яда: ОМДОВ» ореит-

чтщят? чида» «йюкр» % одпдомцдо и,.

Действие яда пазд^ Вг.ездв, п1£ег.. иа^ свортмвэемость крови

ИЗДЙЙТИЙ». нтдч *Ш9ХНЫЗЦ вдидотг н«ц процесс:

едйв ЧШ1УШ5%Щ-. определенных фер?-

; ч» •

нентов (Ten N.-H. fit »1., 1991), Была показана Ъзаимбсйяэь Коагулирующего действия пдой эмей С их протеолитической активностью {Орлов Б. н., 1976). Антикоагулянтный эффект некоторых ядов эмей объясняется действием содержащихся ь йх составе фосфолйпаз (Boffа Н.С. et al., 1982).

Как показали наши исследования, яд паука Siesus riiger, обла-дахжаий фосфолипаэной А активность» и очень низкой претоолитиЧесКой активностью, проявлял антикоагупянтный при определении АЧТВ

и слабее в тесте ПВ. Какое-либо действие еда пауков, St/egodiphua lineetus vi Anemeala sp. на свертываемость крови не обнаружено.

Таким образом, из исследуемых нами ядов пауков яд паука Eresus niger, обладающий наибольшей фосфолипаэной активностью, проявляет пресинаптический эффект и ингибирует свертываемость плазмы. Для выделения компонентов яда, ответственных за нейроток-сичность и антикоагулянтное действие яд паука Eresus niger был подвергнут фракционированию,

Фракционирование яда паука Krecus nififef

На первом этапе разделения 0.5 г яда в 0,05 М аммоний-бикар-бонатном буфере наносили на колонку с DEAE-Toyopfear1 В50, уравновешенной этим же буфером. Часть яда не адсорбировалась п этих условиях и выходила в свободном объема. Дальнейшую деесорбцию белковых компонентов осуществляли линейным градиентом молярности (0.05-0.5 м, рИ 8,2) аммоний-бикарбонатного буфера. В результате этого разделения было получено пять фракций (IV-VII1).

Рис.3. Ионообменная хроматография яда паука ЕгевиБ п!ввг на колонке 0ЕАЕ-Тоуореаг! 650 в градиенте £ концентрации аммоний-би-| карбонатного буфера (ко-| лонка 2 х 10 см ^скорость | элюции 50 мл/час, 1-1Х -| объединенные фракции.

¿00 .•««.. *

* При пропускании через колонку 1М аммоний-бикарбонатного буфера с рН 8.2 удалось получить еще одну фракцию IX. Таким образом, с помощью ионообменной хроматографии на ОЕАЕ-Тоуореаг1 650 цельный

hso

- 12 -.

яд был разделен на девять фракций (I-IX) (рис.3).

Определение фосфолипазной активности показало, что фракция VIII содержала практически всю активность фосфолипазы А цельного яда (22+6 мкМ/мин х мг). Результаты сравнительных злектрофорети-ческих исследований фракции VIII и других фракций, полученных после ионообменной хроматографии, выявили-их гетерогенность.

Следующий этап разделения включал гель-фильтрацию фракции VIII на колонке с оефакрилом S-300 (рис.4). В результате этого разделения было получено шесть фракций (VIII-1 - VIII-6). Определение ферментативной активности показало, что фосфолипазной активностью обладают только фракции VlII-З и VIII-4, причем наибольшей активностью обладала фракция VIII-4 (40+6 мкмоль/мин.х мг).

Рис,4. Гель-фильтрация фра! ции VIII через колонку с сефокрилом S-300 (колонка 1 х 120 см, 0.05 М аммоний-бикарбонатный буфер, рН 8,4, скорость элюции 5 мл/час) VItI-1 - VIII-5 -объединенные фракции. Пунктирная линия - профиль кривой элю-ции маркеров: 1 - голубой декстран (2000000), 2 - альбумин (67000), 3 - миоглобин (17000),4 - цитохром С (12300).

Для оценки молекулярной массы фракции VIII-4 провели ее хроматографию на колонке с сефакрилом 3-300, откалиброванной такими белками, как альбуми i (67000 Да), миоглобин (17000 Да), цитохром С (12300 Да), а такге голубым декстраном (2000000 Да). Фракция VIII-4 выходила с колонки в объеме элюата, расположенного мевду объемами выхода миоглобина и цитохрома (рис.4). На основании этих данных можно заключить, что молекулярные веса компонентов фракции VTII-4 находятся в промежутке 17000-12300.

Тестирование на нервно-мышечных препаратах полученных фракций показало, что нейротоксичностью обладала только фракция VIII-4, проявляющая одновременно и наибольшую фосфолипазную и антикоагу-лянтную активности. Остальные фракции не влияли на синаптическу» пе1<=дачу. Эксперименты на нервно-мышечных синапсах лягушки показали, что фракция VHI-4 в концентрации 40 мкг/мл'через 45 мин приводит к существенному изменению чгст-угы МПКП (рис.5). В начале действия фракции происходит постепенное увеличение частоты МПКП, максимум которой составляет окол j 240 o-l. Затем происходит снижение частоты МПКП и к 120 мин» ге действия яда она составляет 1-3 с-1. Максимальное значение частоты МПКП и скорость ее нарастания прямо зависят от концентрации фракции. Наряду с изменением частоты

МПКП франция VIII-4 также вызывает некоторое снижение величины МП мышечных волокон. Пресмнаптический эффект фракции существенно зависал от концентрации СаС12 в среде.

га-

Рис. 5. Изменение МПКП лягушки при действий фракции VI11-4 яда паука Егевив гибег. Концентрация фракции VI11-4 - 40 мкг/мл.

¡33

Как известно из литературных данных (Kini H.R. and Evans H.J, 1989) большинство фосфолияаэ теряют свою активность в результате обработки р-бромфенацилброммдом, связывающимся с гистидином, ответственным за каталитическую активность фермента. Было интересным изучить влияние такой модификации на фармакологические эффекты, фракции VIII-4^ ___

Рис.G. Высокоэффективная жидкостная хроматография фракции VIII-4 в обращенной фазе на колонке Ultrapore RPSC, уравнове-шанной 0.1* TFA. Элюцию вели в градиенте концентрации ацетонитрила (от 0 до 60 X) за 60 мин при скорости 1 мл/ч; 1-4- объединенные фракции, ЕпРА -Ер*».»» фосфолипаза А1.

В связи с этим фракция VII1-4 была обработана р-бромфенацилб-ромидом ранее описанным методом (Pieterson W.A. et al., 1374). В результате такой обработки фракция VIII-4 не проявляла не только каталитической, ио и нресинаптической и антикоагулянтной активности.

Так как по данным электрофореза исследуемая фракция VIII-4 была негомогенной, в дальнейшем мы подвергли ещ очистке методом

- 14 -■

высокоэффективной жидкостной хроматографии.

В результате высокоэффективной жидкостной хроматографии фрау ции VIII-4 в обращенной фазе на колонке Ultrapore BPSC в градиею концентрации ацетонитрила (от О до 602) было получено четыре ко» понента <1-4) < рис.6). Тестирование показало, что первый компс нент, десорбируемый с колонки при ЗЗг-ной концентрации ацетонитр!* ла, Обладает фосфолипазвой <30+6 мкмоль/мин х мг) и антикоагулят ной пктивноетями, остальные компоненты оказались неактивными. Слс дует отметить, что нейротоксичностыо не обладал ни один из пол! ченных.компонентов.

Так как в результате очистки фракции компонента ЕпРА наблидг лась некоторая инактивация.его фосфолипазной активности (снизилас удельная активность фермента), можно предположить, что потеря Heî ротоксичности данным компонентом могла быть связана с нарушением структуре его молекулы..

Характеристика компонента ЕпРА яда паука Егавиз niger

При использовании в качестве субстрата яичного фосфатидилхс лина (фХ) удельная активность ЕпРА составляла 30*6 .мкмоль/мин х у при скорости гидролиза 0.92 мкмоль/мин. При определении рН завис» мости активности фосфолипазы, найдено, что оптимальное рН сре/ для гидролиза ФХ/8.С. ■ Кривая зависимости эффективности гидроли: от концентрации cytстрата имела вид гиперболы И описывалась ypai нением Михаэлиса-Ментена. Кажущаяся константа Михаэлиса (Км) максимальная скорость реакции (Уюах), вычисленные на основан» графика Лайнуивера-Рерка были равны 2,55 мМ и 74,0 мкмоль/мин на мг белка соответственно. Эффективность гидролиза фосфатидилхоли» зависела от наличия в среде ионов кальция и при 10 мМ Са2» скс •рость гидролиза увеличивалась в 2 раза по сравнению с контроле» не содержащим кальций. Ионы Sr2+, Ий2+, Ва2», Со2+ практически» влияли на эффективность гидролиза..

Электрофорез компонента ЕпРА в ПААГ в присутствии 0, ! ДДС-Ма, СМ мочев» ны и белков-маркеров выявил наличие одной полос» расположенной в районе, молекулпри к гчасс 12200-14000 Да.

Для определения поэиционней cri' цифичности фосфолипазы Enf проводили анализ продуктов гидр «лиэа фосфатидилхолина с помощ1 ГЖХ. Было определено, что гидроли i при действии компонента Erit проходит по Sr> -1-положению молекулы фосфолипида. Исследован амине кислотный состав компонента ЕпРА, представленный в таблице 1. кач^стго I!-глицевого аминокислотного остатка идентифицирован аспг рагин.

• - i.fi * Табшца 1. Акишкшуйтиий «sera» коипопспт» ЕпРА,

: ш Рмткжжлат» моя. г Я Штс/кясяопт Иол. X

1 ТЬт Ф ЗЫ 6,2

' г Se г 5.2 10 tyr 12,5

а GlU! 12. S II F h» 6,9

; 4 Pra ®.3S 12 1 Bis t.tt

' 5. Gly 7.Э 13 Lys 4.4

S А1а 4.5 14 tir g, a; в

; т Val 3.® 15 te» е.з

в Met 4.0 16 ; fiSI» 8>.7

Исследования действия компоисатг^ КпРД яда* паука' Eresua niger- на свертываемость крогаг.

- Как известно'«, свертывание' крови - это1 превращение* жидкой' крови; в, эластичный; сгусток: в- результате* перехода, растворенного' в плазме, фибриногена» в нерастворимый; фибрин!.. Взаимодействие и*- активация! факторов; осуществляются» на мембранах' (СтромбоцитарвыЙР фактор 3i>,. на которая фиксируются; (с: помсяцыев ионов; кальция); белковые' факторы; свертывания; кровт (Баркаган; 3'. С. „ 19B8-.)i..

Kait показали! эксперименты!,, АЧТВ? значительно удлинилось й' присутствии, 40J мкс- компонента! ЁпР№„ но при! добавлении' »систему яда Echis; с а г in a t ив, или! Viper a; ruesellEijii,, содержащий- актиааторй-' протромбина И! фактора X". соответственно-,, антикоагулянтное; действие' ком1--понента: EW®, неь проявляется!., значение; АЧТВ присутствии'- яд® Ebtiis; cnrlnatus (25. мкг/мл)) или; яда< Viper! a, russoliïiiii ((23> МКС/НЛ)} при' наличии! или! В' отсутствии! компонента' ЕпЕШ ((4003 нкг/мл)' былб' равно' 30i2- сек-.. Тромбин' также- сохраняет,1 свои) коагулятивные; свойства," при' наличии bj системе. En РА».. Тромбиновое'вреия; в> присутствии, и? б"> отсутствии; компонента: ЕлРА\ ((4DQÎ мкг/'мл)) 6iino5 равное ЗО^'г7. сек..

Эти. данные- свидетельствуют1 а> том», что- ÎhPft'' не> затрагивает превращения,, протромбина! ш тромбин! ш фибриногена! fls <tà46pHHv. ВерояТ1-но,, антикоагудянтяое: действие компонента' Énfitf» заключается'' в- йНГИ*-бировании прокоагулянтной'. активности'. <$зе<$ЭЛЙПИД|0В1 , йг^-

ракяцих: роль матриц: активацит белковых. факторов; сввртыванияь

Для; сравнения-, антикоагулянтной! активности^ компонента^ ЁпРА\ <Р другими- антикоаг.уляитами;, в частности",, с фЬсфЬлипазанй' А"' других ядов,, била! выделена, фрсфрлипаза; А2' из> яда» Véepw ov-iwt'atlîiWs ранее' описанными методом-, (ТуйчибавВ; Б", А\. и!дрэ.,, 19845)?,. таква иснолиэо--валасы. фосфолипаза: Aï: яда. Hàjai naja> C<îinpMtiJSiafi'a>)!.. H ¿ИИ' исследопа*-ния показали •,, что:, ЕпРА\ не; уступает' псо своти антипоагулянтнын"

свойствам использованием наНи фосфолипазам ядов Наja naja и Veapa orientalie, ферментативная активность которых значительно выше. То есть, корреляция между антикоагулянтным действием и ферментативной активностью фосфолипаэ не наблюдалась (табл.2).

Таблица 2. Фериента-пшнаи активность и антикоагулянпюе действие фосфолипаз ядов Егеыио nifior. Maja naja И Vecpu orientulia.

Фосфолипаза Концентрация мкг/мл Протромби-новое время (ПВ), сек Активированное частично тромбопласти-новое время (АЧТВ), сек Фосфоли-пазная активность, мкмоль/мин х мг белка

Контроль 20 50

яд паука Eresus niger 2000 45+2 80 i 3 10 i 3

EriPA 400 60 + 2 170 + 3 30+6

фосфолипаза А2 яда Maja naja 400 120 ± 3 171 i 5 210 + 8

фосфолипаза А2 яда Vespa orientalis 400 V S5 t 4 169 + 4 430 ¿ 10

Из литературных данных известно, что антикоагулянткая активность фосфолипаэ А2 обусловлена как ферментативной, так и фосфоли-пид-связывающей активностью (Kini R.H. and Evans l!.J.,. 1087).-Согласно модели (Kini И.К. ; and Evans И .J .,1988) сильное антикоагу-- лянтное действие 'фосфолипаэ, характеризующихся низкой каталитической активностью, объясняется их высоким сродством к неидэнтифици-рованному фактору свертывания.

На основе литературных и полученных нами данных можно предположить, что антикоагулянтное действие компонента ЕпРА, обладающего относительно низкой фосфолипазной А активностью, обусловлено инактивацией прокоагулянтной активности, i • фосфолипидов ■ за счет специфического связывания с ними.

ЗАКЛОЧЕШВ

В процессе исследования яда пауков Егевиа nifier, Stegodiphuo lineatus и Anenesia sp. было обнаружено) что все они блокируют нервно-мышечные-синапсы, действуя на уровне пресинаптической мембраны. Действие ядов пауков Eresu-J niger и Stefiodlphus lineatua

протс-г-з^т vpn г.гаиа иодсс-ио п^еипайтичеспим токсинам нокот.г^ гчк.а c!«íí, cOran-vw.»«^ Зос^-емчетзпоА активность». Кэк нока-vi.-ni ЯЭ.11 Ией'.Шй НССЛС'ЛОПг-iHI!:! фер>№iгг атмпшх активностой »ад ПГ/'С в Егчтп гН f.fcei'.M'f'fcnu 1 intf.tnn и АпоюеаЛп «¡р. с-'.члд'-чст

«)',T)»i"HCC?t r>. Лнхчиз поолукто» гидролиза itioc ^тидилхоинча О ГС-иС!;;;) Г"'; !'■■: '.: ¡".'.¡ь ''"¡о " дптии яД'>'-'< tskojhit ¡s-c-

л'-.

¡;. ! сп.- пня r.¡ícs>;í;(;". па паухп Arivru^; is

С-)'.;ПР» , М-.Ч --i; 7, f, F ;*'.•::>»!.: ¡i i.-Обладает ьнт:-!-

t;c.^ryj!ii!i ;;;¡-'i t. 7¡;>-/>li : ■ •p-.4.ir-,:¡!íí! r-fi-ííflLuv'íüL'ii-V^' "jKÍ»"• гs ¡ ! ; tív; '','. .•.

Лна.т.:-;- r" и:.У . 4,'t У -rp-íV.

Y-.:Y>'. I¡-V;>:-;..;;: ;;;!■; ;'пг с;!;!:1"Т!;>лс!;>г. ;I1 г :тд пгу' .

Г.гMI,:! i !>.-.':':'■.• vtn ; J. OC/. AJÍ. У"

ixon¡-У; • CBÍ'ÜI С J

jjsí .'-.r,;:vti-.Г;-..":: i:c;.v;c p }-/--.¡ir ."i vií'yKri

-4,

С ' : "fv/r-ua ucifn^KGiiToy, сгвкгстяонних on r-cr¡".iccni:4U'-.'

i>y: :rn 4, hjí Zri-rnr, nijc-r сил '-.c-.'ivc p гпут •ipaiwoufp jí;")K!:;-". с

понева» n-oooOnc-i!H<;rt xr^aTorpafr«« л гслъфнльтрзцни. В результат* /РУПСТупоНЧи'ГОЙ фИЛЬТрйЦИИ ПОЯУЧС.КЧ Фр£.>:ция VI11 —4, блокирук-

кап сипзптичоскую псрс-.цачу и с^ладо-.-щпя фзсф&яшазиоК экт»лпсст1Г>. Прс-си|?лпт(1Ч€сксо дейст&ие и фосфслипазная активность данной фракции занмсяг от концентрации ионсх» Са2+ и среде, отсу.чггвио последних приводит к cmmciiMw как пресинаптичесКого действия так и фоо-фолипазной актисности. Вмэсто с тем обработка фракции р-бронфгна-цилбронидом, агентом, инактисируюцим фосфолипазную активность, приводила к утере прэсинаптической активности.

В связи с тем, что фракция viII-4 по данным электрофореза оказалось нетсмогенной, дальнейшую ее счистку проводили с использованием ВЭЖХ в обращенной'фазе на колонке Ultrspore RPSC'в градиенте концентрации ацетонитрила. В этих условиях фракцию VIII-4 удалось разделить на 4 компонента, из которых лишь компонент' 1, . * получивший название ЕпРЛ, обладал выраженной фосфолипаэной активностью. При тестировании полученных компонентов на нервно-мышечных препаратах ни ,один из компонентов не проявлял пресинаптического действия. Возможно в процессе последнего этапа очистки в структуре молекулы компонента ЕпРЛ произошли некоторые изменения, приведите к утере пресинзптической активности. Па вероятность таких изменений в структуре молекулы компонента ЕпРЛ может указывать некоторое

- 18 -снижение его удельной фосфолипазной активности.

Несмотря на утерю пресинаптической активности компонент ЕпРА сохранял, хотя несколько и сниженное антикоагулянтное действие. При этом, несмотря на сниженную фосфолипазяую активность, компонент ЕпРА вызывал такой ке антикоагулянтный эффект, как и фосфоли-паэы из яда Haja nujа и Vespa or ieri.talis, обладающие высокой ферментативной активностью. Эти данные могут указывать на то, чтс компонент ЕпРА, специфически связываясь с фосфолипидамн, препятствует нормальному взаимодействию факторов свертывания, что сказывается на образование всего коагуляционного комплекса. Результатов такого связывания компонента ЕпРА с важными фосфолипидамн являете* прекращение нормальной активации факторов свертывания, приводящее к антикоагулянтному эффекту.

ОСНОВНЫЕ ВЫВОДЫ

1. Обнаружено, что яды пауков Eresus niger, Stegodiphus lineatus и Anemesia ир. наряду с нейротоксическим эффектом, заключающимся в пресинаптическом блокировании нервно-мышечной передачи обладают фосфолипазной активность».

2. Показано, что фосфолипаэная активность ядов пауков Eresus riiger, ¿tegodiphus lineatus и Anemesia sp. может быть обусловлена »ходящей в их состав фосфолипазой AI, так как продуктами гидролиза фосфатидилхолина являются преимущественно жирные кислоты, отщепляющиеся в положении Sn-1.

3. Обнаружено, что яд паука Eresus niger обладает выраженной анти-коагулянтной акт! .вНостью и замедляет время свертывания плазмы.

4. Обработка фракции VIXX-4 яда паука Eresus niger р-бромфенацилб-ромидом, ингибирующим фосфоличазную активность, сопровождается потерей нейротоксической, фосфолипазной и антикоагулянтной активностей

Ь. С помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии из яда паука.Eresus niger выделен компонент ЕпРА, обладающий фосфолипазной активностью и ответственный.за антикоагулянтное действие. ЕпРА имеет молекулярную массу 13000'Да, в качестве Н-концг идентифицирован аспарагин. ■ • ■

G. Компонент ЕпРА (0.4 мг/мл) удлиняет время свертывания плазмы £ тесте АЧТВ до 170±3 сек (при кэнероле 50 сек), в тесте ПВ - дс 60i2 сек (при контроле 20 сек). 7. Прздпожен механизм антикоагу ikhthc -q действия ЕпРА, заключающийся в инактивации.прокоаг/лянчной активности мембран за'csei

- 19 -

специфического связывания с ними.

Сансок опубликованных работ

1Атакузиев Б.У., Нуритова Ф., Усмавов П.Б. Фосфолипаза А яда паука Eresus niger // Химия-природных соединений. - Т.: "ФАН". -1991. - Н4.- С. 557-560

2. Фосфолипаэная активность.яда паука Eresus niger // Химия природных соединений,- Т.: "ФАН" . - 1993, - Н4.- С. б/3-à/i/

3. The anticoagulant action of phospholipase A fron Eresua niger spider venon // Toxicon. - 1994.- 32.- Н5,- P. 625-628.*

ХУЛ0СА.

Ф.А.Нуритова.

Визнинг олиб бог"~ан тажрибаларимиэдан, Eresus niger, Stego-dipHus lineatus ва Anvnesia sp. каби ургимчак.эахарларни нервмус-кул утказувчавлигини пресинаптик мембрана кисмига таъсир этиб уви блок килйши ва фосфолипаза А фаоллигига зга эканлиги авикланди.

Eresus niger ургимчак захари авгикоагулявтлик хусуСиятига эта зканлиг» аникланди. Eresus niger захарининг актив кисми р-броифе-нацилбромид била» ишлов берилганда, унда фосфолипаэа ахтивлигининг йуколиши нейротоксик ва антикоагуляитлик хусусиятининг йуколиши билан бирга бориии кузатилди. .

Kresus niger зачаридан ЕпРА но»»» билан аталувчи фосфолипаза А ажратиб олиндм.. ЕпРА-нинг молекуляр огирлиги 13000 Da эканлиги аникланди.

ЕГпРА ДЧТВ ни аниклгщ у сули билаи текширилгапда, унинг паст ферментатив фаолликка эга эканлигига карамай, антикоагуляитлик таъсирни'курсатди.

ЕпРА, АЧТВ усулнда текшириш натижасида, унивг юкорм антикоа- ■ гулянт- сифатида намоё» булиши курсатиб- берилда. ЕпРй пинг антикоагуляитлик таъсири фосфолипид прокоагулянтлик фаоллигининг пасайнши натижасида руй бериши унииг узига хос усулда. бирикиши билан бог-ликлиги курсатилди.

SUHHARY

FîA .Uoutïitova.

Гп. our research it was, estubïished' that Ere-sas- niger, Stegod'iphus ïiriearus and Anemeaia sp. . spider Tenons which- block preaypaptically the nerve-muscular transmission* posses® the phospholipase- Д! activity-. AIso> the Eresus nigeir spide« venon shows the anticoagulant activity. It. was: deternined that the treatnent af active fraction froa Eresus; niger spider venon by p-bromphenacylbronid. which inhibits' the phospl'wlipase activity vss ac.conpanied. with loss: of neurotoxic- and; anticoagulant activities..

Phospholipasa-, named component EnPA„ was isolated; from. Eresus niger spider venom... It «as determined; to be a? single peptide chainwith ool.wt 13000-.. Component ÈhPfi. showed! high anticoagulant activity when, the ДРТТ was measured! in. spite of its; low enzymatic activity. It was concluded: that, anticoagulant action off conpound1 EnPft is', due- to> inactivai ion o£ the- procoegulanfc activity of phospholipids" because of its high: binding with them.-