Получение и исследование генно-инженерного нейротоксина II и его мутантных форм

Люкманова, Екатерина Назымовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Получение и исследование генно-инженерного нейротоксина II и его мутантных форм
ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Получение и исследование генно-инженерного нейротоксина II и его мутантных форм"

На правахрукописи

ЛЮКМАНОВА ЕКАТЕРИНА НАЗЫМОВНА

ПОЛУЧЕНИЕ И ИССЛЕДОВАНИЕ ГЕННО-ИНЖЕНЕРНОГО НЕЙРОТОКСИНА II И ЕГО МУТАНТНЫХ ФОРМ

Специальность: 03.00.03 - Молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва-2005 г

Работа выполнена в лаборатории инженерии белка Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и ЮА Овчинникова Российской

академии наук.

Научные руководители:

академик РАН, д.б.н. М.П.Кирпичников,

профессор, д.б.н., Д.А. Долгих

Официальные оппоненты:

профессор, д.б.н., СВ. Машко,

доцент, д.х.н., В.В. Чупин

Ведущая организация:

Центр "Биоинженерия" РАН

Защита состоится "29" марта 2005 г. в 14 ч. на заседании диссертационного совета Д.217.013.01 при Государственном научно-исследовательском институте генетики и селекции промышленных микроорганизмов по адресу: 117545, Москва, 1-й Дорожный проезд, д.1

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Государственного научно-исследовательского института генетики и селекции промышленных микроорганизмов.

Автореферат разослан

2005 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета,

кандидат биологических наук

В. И. Щербакова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. а-Нейротоксины - наиболее сильнодействующие компоненты яда змей семейства Elapidae, к которому относятся и кобры (Tsetlin et. al. ,2004). Эти токсины являются высокоспецифичными конкурентными ингибиторами никотинового ацетилхолинового рецептора (нАХР), который представляет собой лиганд-зависимый ионный канал, встроенный в постсинаптическую мембрану нейронов (Hucho et. al, 2001). Высокая специфичность связывания, небольшие размеры и жесткая структура нейротоксинов делают их удобным инструментом для изучения свойств нАХР. Кроме того, наличие большого числа гомологичных аминокислотных последовательностей а-нейротоксинов делает возможным анализ структурно-функциональных взаимосвязей в их молекулах.

Существует два типа а-нейротоксинов: короткие (4 дисульфидных связи, 60-62 а.о.) и длинные (5 дисульфидных связей, 66-75 а.о.). Причем, только длинные а-нейротоксины эффективно связываются с нАХР нейронального типа, которые расположены в нейронах нервной системы, в то время как с нАХР мускульного типа, локализованными в нервно-мышечных соединениях, эффективно взаимодействуют а-нейротоксины обоих типов. Это различие объясняется разным строением центральной петли коротких и длинных а-нейротоксинов (Tsetlin et. al., 1999). Нейротоксин II из яда кобры Naja oxiana принадлежит семейству коротких а-нейротоксинов (Tsetlin et ah, 1982) и является высокоспецифичным конкурентным ингибитором мускульного нАХР. Получение и исследование различных мутантных вариантов нейротоксина II позволит не только понять принципиальные различия между короткими и длинными нейротоксинами, но и выявить механизмы, лежащие в основе взаимодействия молекул нейротоксинов с нАХР.

Данные о структуре и свойствах а-нейротоксинов, понимание механизмов их действия на молекулярном уровне важны не только с точки зрения фундаментальной науки, но и для разработки новых биомедицинских препаратов для лечения ряда заболеваний нервной системы, обусловленных дисфункцией тех или иных нАХР, таких как, аутизм (Martin-Ruiz et al, 2004), эпилепсия (Bertrand, 2002), депрессия, никотиновая (Hogg, et. al., 2004) и алкогольная зависимости (Cardoso et al., 1999), болезнь Альцгеймера (Martin-Ruiz et ah, 1999), паркинсонизм (Martin-Ruiz et al., 2002), мышечная дистрофия (Shen et al, 2003).

Цель исследования. Целью настоящей диссертационной работы являлось конструирование, получение и исследование физико-химических и биологических свойств генно-инженерного нейротоксина II и его мутантных вариантов.

Основные задачи исследования.

1. Получить ген нейротоксина II и вектора для экспрессии в прокариотической системе (Escherichia coli), а также разработать эффективную схему биосинтеза, выделения и очистки рекомбинантного нейротоксина. Наработать генно-инженерный нейротоксин II в необходимых для исследований количествах.

2. Изучить физико-химические и биологические свойства нейротоксина И.

3. Осуществить теоретический дизайн мутантных вариантов нейротоксина II из яда кобры Naja oxiana с модифицированной центральной петлей.

4. Получить гены мутантных вариантов нейротоксина II. Наработать мутантные варианты нейротоксина II в необходимых для исследований количествах.

5. Исследовать физико-химические и биологические свойства полученных рекомбинантных нейротоксинов и выявить роли конкретных аминокислотных остатков в распознавании мускульного и нейрональных нАХР различных подтипов (а7, аЗр2).

Научная новизна и практическая значимость работы. Все результаты, изложенные в настоящей диссертационной работе, получены впервые.

1. Разработаны высокопродуктивные экспрессионные системы, позволяющие получать нейротоксины, белки со значительным содержанием дисульфидных связей, в препаративных количествах.

2. Впервые проведено генно-инженерное конструирование химерного нейротоксина с заданной специфичностью.

3. Впервые получен 13С-15М-меченый нейротоксин, и проведено полное отнесение его ЯМР сигналов.

4. Впервые изучено взаимодействие коротких а-нейротоксинов с окружением, моделирующим липидный бислой.

Наличие биологической активности полученных рекомбинантных нейротоксинов позволяет использовать эти белки как инструменты в дальнейших детальных исследованиях механизмов взаимодействия различных типов нАХР со своими лигандами, что, несомненно, представляет большой интерес с точки зрения создания эффективных терапевтических средств для лечения заболеваний нервной системы, обусловленных дисфункцией нАХР.

Апробация работы. Основные материалы диссертационной работы докладывались и обсуждались на следующих российских и международных конференциях: XLI Научная конференция МФТИ (Москва, 1998); 13th Symposium of The Protein Society (Boston, USA, 1999);

Open Russian-Swedish Conference "NMR in Protein-Protein and Protein-DNA Recognition" (Moscow, Russia 2000); VI International Workshop on Magnetic Resonance (Spectroscopy, Tomography and Ecology) (Rostov-on-Don, Russia, 2002); X International Conference on New Information Technology in Medicine and Ecology (Gurzuf, Ukraine, 2002); XIV Winter International Young Scientist's School "Perspective Directions in Physical-Chemical Biology and Biotechnology", (Moscow, Russia, 2002); XI International Conference on New Information Technology in Medicine, Biology, Pharmacology and Ecology (Gurzuf, Ukraine, 2003); 11 Evropean Congress on Biotechnology, (Basel, Switzerland; 2003); XII International Conference on New Information Technology in Medicine and Ecology (Gurzuf, Ukraine, 2004). Апробация диссертации была проведена на заседании научного семинара лаборатории инженерии белка Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и ЮА. Овчинникова Российской Академии Наук 7 декабря 2004 г.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 11 печатных работ в отечественных и зарубежных научных изданиях.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 117 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, результатов и обсуждения, выводов и списка литературы, содержит 7 таблиц и 32 рисунка. Список литературы содержит 172 наименования.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Экспрессирующие вектора и биосинтез в прокариотической системе

СKcoli).

Для наработки в Е. coli рекомбинантного нейротоксина II, его мутантных вариантов и изотопно-меченых форм нами были разработаны две экспрессирующие конструкции. Было опробовано два подхода для получения водорастворимого гено-инженерного нейротоксина II: 1) продукция нейротоксина II в составе слитной конструкции с бактериальным белком тиоредоксином, способствующим замыканию дисульфидных связей в молекуле нейротоксина И, и 2) секреция нейротоксина II в периплазматическое пространство бактериальной клетки и культуральную жидкость.

Конструкция для продукции нейротоксина Ив составе слитной конструкции с тиоредоксином. Для сборки гена, кодирующего нейротоксин II, были синтезированы десять олигонуклеотидов. Олигонуклеотиды nnol-nno5 в сумме представляли собой последовательность, кодирующую ген нейротоксина П. Олигонуклеотид nnol (5'-конец) содержал сайт рестрикции Xbdl, а ппо5 (З'-конец) -стоп-кодон ТАА, непосредственно за которым следовал сайт рестрикции Sacl. Выбор кодонов, использованных для последовательностей олигонуклеотидов, основывался на частоте их встречаемости в хорошо экспрессирующихся генах Е. coli. Олигонуклеотиды ппоб- ппо9 использовались в качестве подложки в реакции лигирования для специфического сближения концов олигонуклеотидов кодирующей цепи (рис.1).

Рис 1. Схемы клонирования гена тиоредоксина (а) и гена нейротоксина II (б) в плазмидный векторpBluescnpt II ЗХ(-)

Клонирование гена тиоредоксина Е. coli проводили при помощи метода ПЦР на основании известной нуклеотидной последовательности. Источником хромосомной ДНК служил штамм Е. coli TGI. Для амплификации гена использовали два праймера ptr5 и ptr3, фланкирующих кодирующую часть гена белка с 5'- и 3'-концов соответственно. Нуклеотидная последовательность праймеров включала сайты рестрикции, необходимые для последующего клонирования в экспрессирующем векторе: олигонуклеотид ptr5 содержал сайт рестрикции Ndel, a ptr3-Nael (рис.1).

В результате был получен экспрессирующий вектор pGEMEX-1/tnx/SpH/SpH2/nt2, в котором для последующего отделения нейротоксина II от белка-носителя был предусмотрен специальный линкер (Gly-Ser)5-Gly-(Asp)4-Lys, получивший название SpHl/SpH2. Его аминокислотная последовательность содержит сайт (Asp)4-Lys, узнаваемый высокоспецифичной протеиназой -энтеропептидазой, которая селективно гидролизует пептидную связь, находящуюся непосредственно после остатка лизина.

Введение в линкер аминокислотных остатков Leu-Met. Были получены аналитические количества гибридного белка с линкером SpHl/SpH2, однако расщепить энтеропептидазой такой гибридный белок не удалось. Вероятно, причиной этому является дисульфидная связь между 3-м и 23-м остатками нейротоксина II, которая может создавать стерические затруднения при работе энтеропептидазы. Для решения этой проблемы линкер был удлинен еще на две аминокислоты: Leu-Met. Использование гибридного белка с таким линкером могло позволить, во-первых, получить нейротоксин II с нативным концом при расщеплении связи Leu-Met бромцианом, а, во-вторых, в этом случае "мешающая" дисульфидная связь отодвигалась на два аминокислотных остатка, что могло ослабить стерические затруднения для работы энтеропептидазы.

Сборку экспрессирующего вектора проводили в три этапа (рис.2). Результирующий вектор получил названиеpGEMEX-l/trx/SpHl/SpH2/Leu-Met/ntII, в котором линкер, соединяющий последовательности нейротоксина и тиоредоксина, в результате двух достроек фрагментом Кленова был удлинен на участок, кодирующий два аминокислотных остатка лейцина и метионина.

Биосинтез нейротоксина II в составе слитного белка с тиоредоксином. Наработку рекомбинантного белка осуществляли в штамме Е. coli BL21(DE3)(pLysS). Культивирование клеток BL21(DE3)(pLysS), несущих плазмиду pGEMEX-l/trx/SpHI/SpH2/Leu-Met/ntII, проводили при температуре 12°С в среде ТВ с добавлением фосфатов в течение суток после добавления индуктора IPTG. Индукцию осуществляли при достижении показателя оптического поглощения клеток 1.0. Выход гибридного белка при концентрации индуктора 0.025 мМ составил примерно 50 мг с литра культуры. Конечный выход рекомбинантного нейротоксина II в этой системе составил 6 мг с литра бактериальной культуры.

Рис. 2. Схема сборки экспрессирующего вектора рСЕМЕХ-1/1гх/8рН1/8рН2/Ьеи-Ме1/ШП.

Конструкция для секреции нейротоксина //. Еще более эффективной оказалась другая конструкция, в которой ген нейротоксина II находится под контролем терморегулируемого рЯ-промотора, полученная А.А. Шульгой, ИБХ РАН (рис.3). В этой системе полипептидная последовательность нейротоксина II экспрессируется вместе с лидерным пептидом, расположенным на ¡У-конце молекулы нейротоксина II, который затем при секреции в периплазматическое пространство отщепляется специфической протеазой. Эта система кроме высокого уровня экспрессии имеет еще ряд преимуществ перед системой для экспрессии нейротоксина II в составе слитного белка с тиоредоксином. В этой системе белок не подвергается никаким химическим воздействиям, способным приводить к некоторым нежелательным модификациям аминокислотных остатков. Кроме того, так как белок секретируется в периплазматическое пространство и затем, видимо в результате лизиса внешней мембраны бактериальной клетки, накапливается в культуральной жидкости, проблем с образованием правильно замкнутых дисульфидных связей не возникает.

Секреция нейротоксина //. Наработку рекомбинантного белка осуществляли в штамме К coli БЬ21 под контролем терморегулируемого промотора рЯ. Культивирование клеток БЬ21, несущих плазмиду рОЕМЕХ-1/р№пШ, до индукции проводили при температуре 28°С на минимальной среде М9. Затем клеточную культуру осаждали, клеточный осадок ресуспендировали в свежей минимальной среде М9, разводили до оптической плотности 0.5, и индуцировали транскрипцию гена ^ повышением температуры культивирования до 37°С, и продолжали культивирование клеточной культуры в среде М9 при 37°С в течение 48 часов. После индукции процессированный нейротоксин II секретировался в

периплазматическое пространство, а затем накапливался в больших количествах в культуральной жидкости. Конечный выход нейротоксина II в такой системе достигает около 30 мг с литра бактериальной культуры на минимальной среде.

Рис.3. Конструкция для секреции нейротоксина II в Е. coh

Биосинтез изотопно-меченых вариантов нейротоксина II. В нашем протоколе изотопно-меченый нейротоксин II секретировался в периплазму и затем накапливался в культуральной жидкости. Ночную клеточную культуру, несущую плазмиду pGEKfEX-1/pR/ntII и выращенную на минимальной среде М9 при температуре 28°С, ресуспендировали в минимальной среде М9, содержащей в качестве источника 15N и 13С атомов 15NH4C1 ( l5N, >98%; Cambridge Isotope Laboratories, Androver, MA, США) и глицерин-1,2,3,-пСз (BC, 99%; Cambridge Isotope Laboratories, Androver, MA, США) соответственно. Экспрессию гена нейротоксина II индуцировали повышением температуры культивирования клеток до 37°С. Конечный выход изотопно-меченого нейротоксина II составил 15 мг/л бактериальной культуры.

2. Выделение и очистка рекомбинантных белков.

Выделение и очистка гибридного белка тиоредоксин-нейротоксин //. Очистку гибридного белка тиоредоксин-нейротоксин II проводили в два этапа. На первой стадии растворимые клеточные белки разделяли на металлохелат-аффинной смоле. На этой стадии удавалось почти полностью избавиться от низкомолекулярных примесных белков и нуклеиновых кислот (рис.4, дорожка 3). На втором этапе полученный гибридный белок дочищали при помощи хроматографии на анионообменной смоле Mono-Q HR (рис. 4, дорожка 4).

Расщепление гибридного белка TRX/SpHl/SpH2/Leu-Met/NTH. В результате гидролиза выделенного и очищенного гибридного белка тиоредоксин-нейротоксин II с линкером ((Gly-Ser)5-Gly-(Asp)4-Lys-Leu-Met) малой субъединицей энтеропептидазы были получены продукты расщепления с молекулярными массами около 12 и 7 кДа, что соответствует молекулам тиоредоксина и нейротоксина II (рис.4). Таким образом, удлинение линкера позволило повысить эффективность гидролиза гибридного белка энтеропептидазой, однако ферментативный способ отделения целевого белка от белка-носителя не является оптимальным, поскольку предполагает использование больших количеств дорогостоящего коммерческого препарата энтеропептидазы ЕКМах™. Для расщепления 8.5 мкг гибридного белка понадобилось 0.5 ед. акт. энтеропептидазы, при этом эффективность реакции

составила около 50%. Поэтому основным способом для получения нейротоксина II стало обработка гибридного белка бромцианом. Эффективность такого расщепления составила около 30%.

Рис 4 Электрофоретический анализ в 12% SDS-ПААГ в Трис-трициновой буферной системе стадий очистки гибридного белка и гидролиза гибридного белка малой субъединицей энтеропептидазы и бромцианом / - Смесь маркерных белков (BioRad, США), слева от рисунка указаны молекулярные массы,

2 - общий клеточный белок,

3 - препарат после очистки на металлохелатной аффинной смоле,

4 - препарат после очистки на MonoQ (Pharmacia, Швеция),

5 - расщепление гибридного белка энтеропептидазой,

6- гидролиз гибридного белка бромцианом,

7- рекомбинантный нейротоксин II после очистки на MonoS (Pharmacia, Швеция)

Замена остатка метионина в аминокислотной последовательности тиоредоксина Для того чтобы повысить выход целевого белка на стадии гидролиза гибрида бромцианом, аминокислотный остаток метионина в 37 положении тиоредоксина был заменен на остаток аланина сайт-направленным мутагенезом с помощью пары праймеров ptr5M37A Иptr3M37A. Известно, что остаток метионина в молекуле тиоредоксина не участвует в катализе окислительно-восстановительных реакций, а аланин является аминокислотой, встречающейся как внутри, так и снаружи белковых глобул. Поэтому можно было бы ожидать, что такая замена не приведет к каким-либо существенным структурным и функциональным изменениям. В результате такой замены эффективность расщепления гибридного белка бромцианом повысилась примерно до 50%, при этом замена остатка метионина на остаток аланина в молекуле тиоредоксина не повлияла на уровень биосинтеза гибридного белка.

Очистка рекомбинантного нейротоксина II Продукты реакции химического гидролиза гибридного белка бромцианом фракционировали на катионообменной колонке Mono-S HR 10/10 (Amerscham Pharmacia, Швеция). Элюцию белков проводили восходящим градиентом концентрации NaCl (от 0.01 до 1 М). Фракция, содержащая рекомбинантный нейротоксин II и соответствующая наибольшему пику, выходила с колонки при концентрации соли 0.14 М. Выход конечного продукта нейротоксина II составил около 6 мг с литра бактериальной культуры.

Выделение и очистка нейротоксина II, полученного в результате секреции Клеточную культуру центрифугировали при 4250 об/мин и 4 С в течение 45 минут. Затем подкисляли культуральную жидкость до рН 4.5 и производили

температурный прогрев на водяной бане при 70 С в течение 20 минут. На этом этапе удавалось избавиться от большинства примесных бактериальных белков, не выдерживающих температурный прогрев. Кроме того, процедуру температурного прогрева можно считать своеобразным тестом на корректность пространственной структуры нейротоксина II, так как известно, что нейротоксин является термостабильным белком при условии, что все его дисульфидные связи правильно замкнуты. Далее прогретую культуральную жидкость разводили в 3 раза водой MilliQ и наносили на ионообменную смолу SP-Sepharose (Amersham Pharmacia, Швеция), уравновешенную в 10 мМ NaAc, pH 5.0. Фракцию, содержащую нейротоксин II, элюировали при концентрации соли NaCl 0,25 М. Затем эту фракцию дочищали на смоле MonoS (Amersham Pharmacia, Швеция), уравновешенной в 10 мМ NaAc, pH 5.0 (рис.5). Фракцию, содержащую нейротоксин II, элюировали при концентрации соли NaCl 0,4 М. После этой стадии очистки получали чистый препарат нейротоксина II. Выход белка составил около 30 мг с литра бактериальной культуры.

Рис 5 Электрофоретический анализ очистки рекомбинантного нейротоксина II / - культуральная жидкость,

2 - культуральная жидкость после подкисления,

3 - культуральная жидкость после подкисления и прогрева при 70°С,

4 - белковый препарат после очистки на смоле ЗР-ЗерИагтее,

5 - препарат рекомбинантного нейротоксина II

Анализ полученных белковых препаратов с использованием электрофореза в ПААГ в присутствии и масс-спектрометрии показал гомогенность исследуемых препаратов, а также их соответствие рассчитанным молекулярным весам. Данные анализа Л'-концевых последовательностей также свидетельствовали о достаточной степени очистки полученных препаратов и о соответствии Л'-концевых последовательностей заданным.

Выделение и очистка изотопно-меченого нейротоксина 11 Выделение и очистку изотопно-меченого нейротоксина II производили по протоколу, разработанному для нейротоксина II, полученного в результате секреции. Методом ЯМР-спектроскопии было обнаружено наличие в препарате минорных фракций молекул, похожих на молекулы нейротоксина II с дополнительными аминокислотными остатками на К-конце, что было подтверждено методом деградации по Эдману. Дополнительная очистка изотопно-меченого белка с

помощью высокоэффективной хроматографии высокого давления (HPLC) показала, что содержание минорных фракций составило примерно 25% от общего количества изотопно-меченого белка, Наличие этих фракций, видимо, можно объяснить неспецифическим отщеплением лидерного пептида бактериальной протеазой.

3. Конструирование генов мутантных вариантов нейротоксина II

а-Нейротоксины из яда змей содержат 60-75 аминокислотных остатков и 4-5 дисульфидных связей. При этом выделяют так называемые короткие а-нейротоксины (60-62 аминокислотных остатка, 4 дисульфидных связи) и длинные а-нейротоксины (66-75 аминокислотных остатка, 5 дисульфидных связей) (Tsetlin et. al., 1999). Длинные нейротоксины, в отличие от коротких, имеют дополнительную дисульфидную связь на кончике центральной петли (рис. 4). Было замечено, что короткие и длинные а-нейротоксины проявляют различные биологические свойства по отношению к нАХР. Так, в работе (Servent et al., 1997) было показано, что нейротоксины обоих типов одинаково эффективно ингибируют мускульный нАХР, тогда как к нейрональным нАХР высоко специфичны лишь токсины длинного типа. Кроме того, результаты сравнительных исследований пространственной структуры а-нейротоксинов и а-конотоксинов из ядов моллюсков (Maslennikov et al., 1999) показали, что псевдоспиральная структура активного центра сс-конотоксинов очень похожа на строение центральной петли длинных а-нейротоксинов: а-бунгаротоксина, а-кобротоксина, нейротоксина I из Naja oxiana, и к-бунгаротоксина (рис.6).

При общей гомологии пространственных структур а-конотоксины отличаются функционально важными аминокислотными остатками в положениях 7 и 10. Сравнительный анализ показал, что у а-конотоксина Iml из яда моллюска Conus imperialis, высокоспецифичного ингибитора нейронального а7 нАХР, в этих положениях находятся аминокислотные остатки триптофана и аргинина, в то время как у а-конотоксина МП из яда моллюска Conus magus, эффективно взаимодействующего с нейрональным а302 нАХР, эти положения занимают остатки лейцина и валина, соответственно. Возможно, нахождение в этих положениях различных аминокислотных остатков и определяет специфичность взаимодействия различных а-конотоксинов с различными типами нейрональных нАХР.

На основании вышеизложенного можно предположить, что именно участок центральной петли, содержащий пятую дисульфидную связь длинных а-нейротоксинов играет ключевую роль в распознавании нейрональных нАХР. Для подтверждения этой гипотезы были получены новые нейротоксины путем введения дополнительной дисульфидной связи в центральную петлю короткого нейротоксина И.

Рис.6. Сравнение пространственной структуры а-нейротоксинов и а-конотоксинов. Структуры а-нейротоксинов и а-конотоксинов представлены ленточными моделями на основании данных Майепшкоу е1. а1., 1999; Shon й. а1., 1997; Оо1оуапоу й. а1., 1993; МИДаЛоу й. а1., 1991. Изогнутыми линиями показаны дисульфидные связи, функционально важные аминокислотные остатки выделены цветом.

Для более "гармоничной" пересадки в молекулу нейротоксина II участка центральной петли из длинного нейротоксина с помощью методов молекулярного моделирования был проведен анализ гомологии между пространственной структурой короткого нейротоксина II и структурами длинных а-нейротоксинов, представленных в базе данных PDB DATA BANK (http://www.rcsb.org'). Был осуществлен сравнительный анализ известных структур пяти длинных нейротоксинов (нейротоксина I, нейронального бунгаротоксина, токсина В, а-бунгаротоксина, а-кобратоксина) со структурой нейротоксина II путем наложения структур и вычисления средне-квадратичного отклонения (СКО). Минимальное значение СКО было получено между структурами нейротоксина II и нейротоксина I из яда кобры Naja oxiana, что явилось определяющим в выборе "донора" фрагмента центральной петли для нейротоксина II (рис.7).

Ожидалось, что при пересадке участка центральной петли нейротоксина I с дополнительной дисульфидной связью в молекулу нейротоксина И новый мутантный токсин (MutI) приобретет способность ингибировать нейрональный нАХР 0.1 типа. Второй мутантный токсин (Mutll) был получен аналогично с дополнительными заменами Trp30Leu, Arg34Val в центральной петле химерного

белка по аналогии с а-конотоксином МП из яда моллюска Conus magus (рис.8). В этом случае предполагалось, что новый нейротокспн Mutll приобретет способность связываться с нейрональным нАХР a3ß2 типа.

(1) ( 2ДС8—NQOSSOffPTTmce-CITHCYlCKIfWeD-H-RGTIIERGC—OCPXVKWVMUl-CCÄTDRa«

(2) I IT'-T---КТРИГЗГТ--

11) иштожмаяотмя вооладоааэааьноотъ мАротокамла XX и» Кл1ш ю1ава

12) амшоююломаа поолалоаамлыюофъ иаЯфотокамка X на Naja ож1ааа

Рис.7. Сравнение пространственной структуры нейротоксина II и нейротоксина I из яда кобры Naja oxiana. Молекулярные модели были построены на основании данных Ооктапоу е! а1., 1993; МИДаПоу е! а1., 1991. (а)- пространственная структура нейротоксина II. (б)-пространственная структура нейротоксина I. (в)- сравнение пространственной структуры нейротоксина II и нейротоксина I.

Гены мутантных вариантов нейротоксина II были получены с помощью сайт-направленного мутагенеза с использованием в качестве матрицы плазмиды pGEMEX-1/pR/ntII. В качестве прямого праймера был использован праймер тип, кодирующий фрагмент центральной петли длинного нейротоксина I. Обратным праймером служил праймер mutll, кодирующий тот же фрагмент центральной петли длинного нейротоксина I с заменой W30L, Я34У. Таким образом, в результате реакции амплификации была получена смесь молекул ДНК, содержащих гены обоих мутантов. Секвенирование полученных клонов позволило нам выделить плазмиды, содержащие гены мутантных вариантов нейротоксина II, которые были названы pGEMEX-1/pR/mutIиpGEMEX- 1/pR/mutП, соответсвенно.

W M

с:

♦

центральная петля нейротоксина I с заменой W30L.R34V

по аналогии с а-конотоксином Mil

центральная петля нейротоксина!

нейротоксин II

мутант I, предполагаемый

мутант II, предполагаемый

высокоэффективный ингибитор высокоэффективный ингибитор а7 нейронального нАХР аЗр2 нейронального нАХР

Рис.8. Схема получения двух мутантных вариантов нейротоксина II.

Биосинтез и очистку мутантных вариантов нейротоксина II осуществляли в соответствии с протоколом, разработанным для секреции нейротоксина II.

Результаты структурных исследований, описываемые в этом разделе, были получены совместно с Э.В. Бочаровым и 3.0. Шенкаревым, сотрудниками лаборатории структурной биологии ИБХ РАН.

Одномерные Н ЯМР-спектры. Для анализа пространственной структуры гибридного белка тиоредоксин-нейротоксин II был снят одномерный 'Й ЯМР-спектр. Как показано на рис.9а, NH-протоны гибридного белка имеют значительную дисперсию химических сдвигов, что указывает на наличие пространственной структуры. Узкие линии сигналов ЯМР-спектра говорят о стабильности этой структуры, а большой сдвиг сигналов протонов некоторых алифатических боковых цепей свидетельствует о пространственной сближенности этих боковых цепей с ароматическими остатками, что часто наблюдается в Р-структуре.

На основе всего этого можно сделать вывод, что гибридный белок тиоредоксин-нейротоксин II обладает жесткой пространственой структурой, и, видимо, нейротоксин II, присоединенный к тиоредоксину также имеет определенную пространственную структуру.

Анализ пространственной структуры рекомбинантного нейротоксина II и мутантных вариантов нейротоксина II также был проведен с помощью метода Н ЯМР-спектроскопии (рис.9,б,в,г). На основе полученных спектров можно сделать вывод о наличии жесткой пространственной структуры у этих пептидов.

4. Структурные исследования рекомбинантных токсинов

Рис.9. Одномерные спектры 'Н-ЯМР (а) гибридного белка тиоредоксин-нейротоксин II, (б) рекомбинантного нейротоксина II, ИМ- области 'Н-ЯМР-спектров мутанта МиН (в), (г) мутанта МиШ.

ЯМР-анализ чистоты и степени мечения препаратов изотопно-меченых вариантов нейротоксина II. Гетероядерная спектроскопия ЯМР позволяет количественно определить чистоту и степень меченья для белков и пептидов, меченных стабильными изотопами "С и 15Ы. Анализ одномерных 'Н ЯМР спектров нейротоксина II, накопленных с развязкой и без развязки от ядер 13С И 15Ы, позволил установить, что молекула изотопно-меченого рекомбинантного нейротоксина II содержит 94 ± 4 % меток 13С И 15И. Гетероядерные двумерные ШС^С спектры, демонстрирующие наличие в рекомбинантном белке 15Ы И 13С меток, показаны на рис. 10.

Отнесение ЯМР-спектров. Отнесение 'Ч 'ны, ,3с\ ,3С' и 'на резонансов для основной цепи белка нейротоксин II бьшо проведено с помощью 15К-Н8(}С (рис. 10а), 'н-"с-15ы НИСА и 'н-13с-15ы шсо спектров. Впоследствии с помощью С-ЖрС (рис. 106) и 'Н-|3С НССН-ТОСБУ спектров было получено отнесение резонансов для боковых цепей белка. В результате было получено отнесение химических сдвигов почти для всех 'Н, ,3С и 15Ы ядер белка нейротоксин II.

Рис.10, (а) 'Н-,5Ы спектр ,|3С/|5М-меченого белка нейротоксин II, показано отнесение

сигналов ЫН и МНг групп белка, (б) алифатическая ч а с ^Нт^Св О С спект^А'кЗеченого белка нейротоксин II.

Отнесение не было получено для 15К резонансов остатков пролина и 13СО резонансов от карбонильных групп остатков 10, И, 42, 46 и 61, предшествующих остаткам пролина; для боковых карбонильных групп; для ароматических четвертичных углеродов; для протонов боковых гидроксильных групп; боковых КН2 и >Ш3 групп остатков аргинина и лизина, соответственно. Отнесенные химические сдвиги для 'Н, ,3С И ,5Ы ядер рекомбинантного белка нейротоксин II депонированы в международной базе данных BioMagResBank; (http://www.bmib.wisc.edu') под номером 5690.

Полное соответствие химических сдвигов ядер рекомбинантного

нейротоксина II и природного пептида, изученного ранее (Оо1оуапоу et. а1., 1993), говорит в пользу правильной пространственной структуры рекомбинантного нейротоксина П.

5. Исследование взаимодействия нейротоксина II с липидными бицеллами (анизотропной средой, моделирующей биологическую мембрану)

Полученное отнесение резонансов было использовано для

исследования взаимодействия нейротоксина II с липидными бицеллами. С помощью *Н-15Ы НБОС экспериментов и варьирования концентрации соли в ЯМ? образцах белка было обнаружено, что первая р-шпилька и последующая за ней подвижная петля нейротоксина II взаимодействуют с поверхностью липидных бицелл, состоящих из смеси БНРС/БМРС (рис.11). А именно, как видно из спектров ЯМР (рис.11,а,б) при добавлении липидов и ионной силе, соответствующей 100 мМ КС1, сигналы белка сильно уширены, что указывает на взаимодействие молекулы токсина с липидами. Более того, тот факт, что сигналы видны только от подвижных боковых цепей токсина, говорит о том, что молекула белка полностью связана с бицеллами.

Н,0 ШРС/ОНРС бицеллы ОМРС/ОНРС бицеллы

100 тМ КС1, рН 6.5 100 тМ КС1, рН 6.5 250 шМ КС1, рН 6.5

'Н|и»1 'Н(и-1 1Н1Р0-1

Рис.11. 'Н-15Н ШрС спектры нейротоксина II в различных условиях, (а) Спектр в водном растворе (100 мМ КС1, рН 6.5, 30°С). (б) Спектр в водном растворе ЭИРС/ОМРС бицелл (100 мМ КС1, рН 6.5,30°С). (в) Спектр в водном растворе ЭИРС/ОМРС бицелл (250 мМ КС1, рН 6.5, 30°С).

Последущее увеличение концентрации соли привело к постепенной диссоциации молекулы нейротоксина II с поверхности бицелл, о чем говорит появление большинства сигналов от амидных групп основной цепи токсина в ШрС спектре (рис.11 в). На основании этих экспериментов можно сделать вывод, что природа токсин-липидного взаимодействия в основном электростатическая, а сила взаимодействия моделируется ионной силой раствора и, видимо, составом липидного бислоя. Более того, сравнение ШрС спектров (рис. 12а) токсина в воде и в растворе с липидами при повышении концентрации соли до 250 мМ КС1 выявило амидные группы белка, которые, видимо, наиболее пространственно сближены с площадкой взаимодействия токсина с липидным бислоем. Сигналы от этих КИ групп остаются уширенными при высокой концентрации соли из-за обмена между свободным и связанным (с липидами) состояниями токсина.

Пространственное расположение амидных групп в молекуле токсина, сигналы которых уширяются при взаимодействии нейротоксина II с бицеллами, показано на рис.126. Видно, что основная доля уширенных аминогрупп (остатки 01у39, Л8п60, Ив4, Лвп5, ТИг13, Ьув15, Л8р57, 01и2, ТИг21) расположена в первой Р-шпильке и последующей за ней подвижной петле нейротоксина II и образует некую площадку на поверхности белка. Уширение сигналов трех аминогрупп (остатки Лвп50, 01и37, Бегв),расположенных между первым и вторым «пальцами» нейротоксина II, можно объяснить конформационным обменом в части молекулы токсина, обусловленным взаимодействием токсина с липидами и подвижностью Р-шпилек относительно друг друга.

Рис У? Построение модели взаимодействия нейротоксина II с липидным бислоем. (а) Наложение Н- HSQC спектров ЯМР, показанных на рисунках 9а (желтым цветом) и 9в (голубым цветом). Остатки, взаимодействующие с поверхностью бицеллы, не дают сигналов в спектре, показанном голубым цветом, и могут быть легко идентифицированы, (б) Карта расположения уширенных ИМ групп (желтые цилиндры) на пространственной структуре токсина выявляет интерфейс взаимодействия. Основная цепь токсина показана голубым цветом, а боковые цепи заряженных остатков красным и синим цветами.

Рис 13 Модель участия липидного окружения рецептора в токсин-рецепторном взаимодействии Токсин, возможно, присоединяясь к мембране клетки-мишени, изменяет трехмерную диффузию в растворе на двумерную диффузию по поверхности мембраны, что значительно ускоряет поиск рецептора.

Как видно из рис. 126, мембранно-активная площадка токсина «насыщена» не гидрофобными аминокислотными остатками, а положительно и отрицательно заряженными остатками. Так как взаимодействие токсина с бицеллами моделируется ионной силой раствора, то можно предположить, что токсин взаимодействует с цвиттерионными головками липидов за счет электростатических взаимодействий, и не углубляется в липидный бислой. При этом взаимодействие токсина с липидами не затрагивает функционально важные участки белка, т.е. мембранно- и рецепторно-активные участки молекулы пространственно разделены.

Вероятно, что нейротоксин II аналогичным образом взаимодействует и с биологическими мембранами, возможно, этот тип взаимодействия сохраняется и при связывании токсина с никотиновым ацетилхолиновым рецептором (рис.13). На это указывает работа (Young et. al., 2003), в которой методом рентгеноструктурного анализа с низким разрешением было показано, что другой змеиный а-нейротоксин длинного типа-а-бунгаротоксин при связывании с никотиновым ацетилхолиновым рецептором также поверхностно взаимодействует и с липидным окружением рецептора, не углубляясь в мембрану. Эти данные согласуются с гипотезой о том, что лиганды рецепторов клеточных мембран перед связыванием с белком-мишенью сначала взаимодействуют с мембраной клетки, изменяя тип диффузии с трехмерной на более быструю латеральную, что значительно ускоряет поиск рецептора (Schwyzer et. al., 1994) (рис.13).

6. Биологические свойства рекомбинантных белков

Биологические свойства гибридного белка тиоредоксин-нейротоксин II. Совместно с Ю.Н. Уткиным, сотрудником лаборатории рецепции нейроиептидов ИБХ РАН, был проведен эксперимент по ингибированию связывания 1251-меченн0Г0 а-бунгаротоксина с нАХР из Torpedo californica гибридным белком (тиоредоксин-нейротоксин II). Кривая ингибирования имела характерную S-образную форму и константа ингибирования (IC50) равнялась 2,46*10' М (рис.14), что на два порядка больше константы ингибирования нАХР природным нейротоксином II. Исходя из подтвержденного методом ЯМР-спектроскопии наличия жесткой пространственной структуры гибридного белка, и, видимо, нейротоксина II, находящегося в составе этого белка, можно сделать вывод, что увеличение константы ингибирования гибридного белка по отношению к константе ингибирования природного токсина обусловлено наличием на N-конце молекулы нейротоксина II большого "довеска" в виде тиоредоксина и возможно, связанными с этим стерическими затруднениями.

Рис.14. Конкурентное ингибирование связывания ацетилхолинового рецептора из Torpedo

califomica 1 -а-бунгаротоксином в присутствии гибридного белка (Ггх-нейротоксин II).

Анализ токсичности рекомбинантного нейротоксина II, полученного в результате секреции. Токсичность нейротоксина II проверяли на мышах линии БАЬБ/С совместно с К.А. Плужниковым, сотрудником лаборатории нейрорецепторов и нейрорегуляторов ИБХ РАН. После инъекции мышам препарата, содержащего рекомбинантный нейротоксин II, наблюдался эффект, схожий с эффектом от инъекции природного нейротоксина II. Инъекция дозы рекомбинантного токсина, соответствующей 65 мкг/кг веса мыши, приводила к смерти животного по истечении 2,5 часа, что согласуется с другими данными по токсичности природного нейротоксина II.

Анализ биологической активности рекомбинантных белков MutI и Mutll. Результаты получены совместно с А. С. Курятовым (Department of Neuroscience, University of Pennsylvania, Medical School, Philadelphia, Pennsylvania, США). Тестирование биологической активности мутантных вариантов нейротоксина II MutI и Mutll проводили in vitro, измеряя способность белковых препаратов ингибировать нАХР, экспрессированные на поверхности ооцитов X. Laevis. В качестве отрицательного контроля был использован препарат рекомбинантного нейротоксина II, не обладающий способностью эффективно ингибировать нейрональные нАХР. Были проведены две серии экспериментов. В одной из них тестировалась способность мутантного токсина MutI ингибировать нейрональные нАХР различного типа: а7, аЗр2, Ct4¡}2, а6|}4. Как видно из табл. 1, рекомбинантный белок MutI приобрел способность взаимодействовать с нАХР типа. Активность MutI близка к активности длинного нейротоксина I, донора центральной петли в экспериментах по конструированию мутантных вариантов нейротоксина П. Также видно, что специфичность модифицированного нейротоксина II по отношению к другим нейрональным нАХР не изменилась.

Пептид Значения IC50, nM, полученные для различных рецепторов

а! осЗр2 а4р2 а6р4

Нейротоксин 11, рекомбинантный 1000±160 1100±150 н/д н/д

Мутант I 8.6±1.3 110±16 101±12 96±12

Мутант И 84±15 27.6±3.9 130±20 98±10

Нейротоксин I, Servent et. al., 1997 12 ±2 н/д н/д н/д

k-бунгаротоксин, Grant et. al, 199S, Servent et. al., 1997 5±0.8 1.16±0.14 н/д н/д

(Х-КОНОТОКСИН Mil, Cartier et. al., 1996 н/д 0.5±0.1 н/д н/д

Табл.1. Взаимодействие нейротоксина II и мутантных белков МиА и МиШ с нейрональными нАХР различных подтипов. Приведены средние значения трех независимых экспериментов ± стандартные отклонения от среднего. Для сравнения показаны опубликованные значения константы ингибирования Ю50 для нейротоксина I, к-бунгаротоксина и а-конотоксинаМП.

Вторая серия экспериментов была посвящена изучению биологической активности белка МиШ. Здесь также тестировалась способность этого мутантного варианта ингибировать нейрональные нАХР различных типов. Из табл. 1 видно, что пептид МиШ обладает некоторой способностью ингибировать нАХР а302 типа, отличной от таковой в случае нАХР типов, однако природные

ингибиторы нАХР а3|32 типа к-бунгаротоксин и сс-конотоксин МП имеют более высокую ингибиторную активность по сравнению с белком МиШ. С другой стороны, модифицированный токсин МиШ обнаружил более высокую активность в отношении нейронального нАХР аЗр2 типа по сравнению с рекомбинантным нейротоксином II и мутантным токсином МиН.

Результаты этих экспериментов также можно изобразить в виде диаграммы (рис. 15). Полученные данные свидетельствуют о важной роли центральной петли длинных СС-нейротоксинов в распознавании нАХР нейронального типа. Однако, видимо, избирательность распознавания нейротоксинами различных подтипов нейрональных нАХР определяется не только двумя аминокислотными остатками, расположенными на кончике центральной петли длинных а-нейротоксинов (см. рис.6), которые гомологичны функционально важным остаткам а-конотоксинов. Вероятно, немаловажное значение имеет весь участок центральной петли, содержащий дополнительную дисульфидную связь. В случае мутантного белка МиН нам удалось получить рекомбинантный белок, селективно взаимодействующий с нейрональным нАХР типа, и, таким образом, выявить структурную

детерминанту молекулы длинных нейротоксинов, важную для взаимодействия с нейрональными нАХР этого типа. Однако, в случае второго мутантного белка селективность взаимодействия оказалась ниже ожидаемой, подчеркивая роль других структурных детерминант. Возможно, дополнительного увеличения активности второго мутанта можно добиться путем введения в молекулу нейротоксина II всего участка молекулы а-конотоксина МП, расположенного между двумя остатками цистеина в положениях 3 и 12.

Рис 15 Взаимодействие рекомбинантных токсинов с нейрональными нАХР различных подтипов По оси ординат приведена величина ^[МСзоЛЧ. где ГСзо - константа ингибирования

выводы

1. Впервые получен синтетический ген нейротоксина II и разработаны высокопродуктивные экспрессионные системы, позволяющие получать нейротоксины, белки со значительным содержанием дисульфидных связей, в препаративных количествах.

2. Впервые сконструированы два новых нейротоксина путем пересадки в молекулу нейротоксина II фрагмента центральной петли нейротоксина I.

3. Разработаны эффективные схемы биосинтеза, выделения и очистки рекомбинантных белков.

4. Нейротоксин II, его мутантные варианты и -меченый нейротоксин II получены в препаративных количествах, достаточных для проведения исследований физико-химических и биологических свойств.

5. Впервые получен 13С-15М-меченый а-нейротоксин и сделано отнесение химических сдвигов

ядер белка нейротоксин II.

6. Структурные свойства рекомбинантных белков исследованы методами ядерного магнитного резонанса. Показано, что

а) все полученные в работе белки обладают жесткой пространственной структурой,

б) пространственная структура рекомбинантного нейротоксина II идентична структуре природного токсина,

в) нейротоксин II способен взаимодействовать с бицеллами, моделирующими липидный бислой.

7. В ходе исследования биологических свойств полученных белков было показано, что:

а) гибридный белок тиоредоксин-нейротоксин И обладает активностью по отношению к нАХР мускульного типа, сопоставимой с активностью природного нейротоксина II,

б) рекомбинантный нейротоксин II практически воспроизводит активность природного токсина,

в) полученные мутантные варианты нейротоксина II приобрели способность взаимодействовать с нейрональными нАХР, причем, мутантный вариант нейротоксина II с модифицированной центральной петлей, соответствующей петле нейротоксина I, обладает селективной активностью по отношению к нейрональному нАХР а7 типа, близкой к активности нейротоксина I.

ОСНОВНЫЕ НАУЧНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ДИССЕРТАЦИИ ОПУБЛИКОВАНЫ В СЛЕДУЮЩИХ РАБОТАХ:

1. Е.Н. Люкманова, Э.В. Бочаров, Л.И. Васильева, Е.Н. Ткач, А.В. Щукин, А.В. Журавлева, А.А. Шульга, Д.А Долгих. Взаимодействие нейротоксина II с липидным бислоем. XII International Conference on New Information Technology in Medicine, Biology, Pharmacology and Ecology, Gurzuf, Ukraine, 2004. Успехи современного естествознания. 2004,6(2), прил.1: стр. 82.

2. Е.Н. Люкманова, А.А. Шульга, Д.А. Арсеньева, К.А Плужников, Д.А Долгих, А.С. Арсеньев, М.П. Кирпичников. Экспрессирующая конструкция для наработки в Е. coli нейротоксина II из яда кобры Naja oxiana в виде гибрида с тиоредоксином. Биоорг. хим. 2004,30(1): 30-40.

3. E.V.Bocharov, E.N.Lyukmanova.. Ya.S.Ermolyuk, A.A.Shulga, K.A.Pluzhnikov, D.ADolgikh, M.P.Kirpichnikov, A.S.Arseniev. Resonance assignment of13C-15N-labeled snake neurotoxin II from Naja oxiana. Applied Magnetic Resonance. 2003,24:247-254.

4. E. Lyukmanova, Z. Shenkarev, K. Pluzhnikov, D. Dolgikh. Engineering and production of long chain neurotoxins with predicted function. ll'h Evropean Congress on Biotechnology, Basel, Switzerland, 2003, book ofabstracts, p.l 16

5. E.N. Lyukmanova. A.A. Schulga, Ya.S. Ermolyuk, E.V. Bocharov, K.A Pluzhnikov, DA Dolgikh, A.S. Arseniev. Production of 13CISN-labeled neurotoxin II from Naja oxiana venom. XI International Conference on New Information Technology in Medicine, Biology, Pharmacology and Ecology. Gurzuf, Ukraine, 2003, book ofabstracts, p.: 345-346.

6. E.N. Lyukmanova. Ya.S. Ermolyuk, A.A. Schulga, D.A. Dolgikh. Directional variation of neurotoxins II binding properties. XIV Winter International Young Scientist's School "Perspective Directions in Physical-Chemical Biology and Biotechnology", Moscow, Russia 2002, book ofabstracts, p.: 38.

7. E.N. Lyukmanova. Ya.S. Ermolyuk, A.A. Schulga, D.A Dolgikh. Modification of neurotoxin II interaction with acetylcholine receptor by site-directed mutagenesis. X International Conference on New Information Technology in Medicine and Ecology. Gurzuf, Ukraine, 2002, book ofabstracts, p.: 349-350.

8. E.N. Lvukmanova, Ya.S. Ermolyuk, DA Dolgikh, A.A. Shulga, A.S. Arseniev. High level expression of 15N-labeled toxins in E. coli. VI International Workshop on Magnetic Resonance (Spectroscopy, Tomography and Ecology). Rostov-on-Don, Russia, 2002, book ofabstracts, p.: 262.

9. E.N. Lvukmanova. D.A. Arsenieva, A.A. Schulga Bacterial synthesis of

neurotoxin II from Naja naja oxiana. Open Russian-Swedish Conference "NMR in Protein-Protein and Protein-DNA Recognition". Moscow, Russia, 2000, book ofabstracts, p.: 40-41.

10. D.A Arsenieva, E.N. Lvukmanova. A.A. Schulga. Expression of snake toxin in E.coli. 13th Symposium ofThe Protein Society. Boston, USA, 1999, book of abstracts, p.: 257.

И. Е.Н. Люкманова, Д.А. Арсеньева, А.А Шульга.'Ъакгериальный синтез нейротоксина II из яда кобры Naja naja oxiana". Тезисы докладов XLI Научной конференции МФТИ. Москва, 1998, стр.: 210.

Отпечатано на полиграфическом участке Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и ЮА Овчинникова Российской академии наук Печать офсетная. Усл.пх 1,5. Тираж 100 экз. Заказ № 692.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Люкманова, Екатерина Назымовна

ОГЛАВЛЕНИЕ.

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ЧАСТЬ I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Глава 1. СТРУКТУРЫ И ФУНКЦИИ ТОКСИНОВ - ВЫСОКОСПЕЦИФИЧНЫХ ИНГИБИТОРОВ НИКОТИНОВОГО АЦЕТИЛХОЛИНОВОГО РЕЦЕПТОРА.

1.1. Никотиновый ацетилхолиновый рецептор.

1.2. Механизм активации канала.

1.3. Структура никотинового ацетилхолинового рецептора.

1.4. Конотоксины.

1.5. Нейротоксины из яда змей.

1.6. Взаимодействие нейротоксинов с никотиновым ацетилхолиновым рецептором.

Глава 2. ПОЛУЧЕНИЕ а-НЕЙРОТОКСИНОВ IN VITRO.

2.1. Введение.

2.2. Экспрессия эукариотических полипептидов в Е. coli.

2.3. Прямая экспрессия генов нейротоксинов в E.coli.

2.4. Продукция нейротоксинов в виде гибридов с другими белками в E.coli.

2.5. Секреция нейротоксинов в E.coli.

2.6. Твердофазный химический синтез.

ЧАСТЬ И. ЭСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Глава 3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

3.1 Материалы.

3.1.1. Реактивы и ферментные препараты.

3.1.2. Штаммы.

3.1.3. Плазмидные вектора.

3.1.4. Питательные среды для роста бактериальных культур.

3.1.5. Синтетические олигонуклеотиды.

3.2. Методы.

3.2.1. Трансформация клеток Е. coli плазмидной ДНК.

3.2.1.1. Приготовление компетентных клеток.

3.2.1.2. Трансформация плазмидной ДНК.

3.2.2. Выделение плазмидной ДНК.

3.2.3. Электрофоретический анализ ДНК в агарозном геле.

3.2.4. Количественные определения препаратов ДНК и примесей РНК.

3.2.5. Выделение ДНК из агарозного геля.

3.2.6. Олигонуклеотид-направленный мутагенез.

3.2.7. Полимеразная цепная реакция.

3.2.8. Экспрессия гена нейротоксина II в виде слитной полипептидной цепи с геном тиоредоксина.

3.2.9. Анализ локализации гибридного белка тиоредоксин-нейротоксин И в клетках

Е. coli.

3.2.10. Выделение и очистка гибридного белка.

3.2.11. Выделение и очистка рекомбинантного нейротоксина II.

3.2.12. Экспрессия гена нейротоксина II в секретирующей конструкции.

3.2.13. Анализ локализации секретируемых нейротоксинов в клетках Е. coli.

3.2.14. Выделение и очистка секретируемых нейротоксинов.

3.2.15. Аналитические методы.

3.2.15.1. Электрофоретический анализ белков в SDS-ПААГ.

3.2.15.2. Количественный анализ белковых препаратов.

3.2.15.3. Определение //-концевой последовательности полипептидов.

3.2.15.4. Масс-спектрометрический анализ белковых препаратов.

3.2.16. Методы структурных исследований.

3.2.16.1. Спектры 'Н-ЯМР.

3.2.16.2. Получение двумерных и трехмерных гетроядерных ЯМР-спектров.

3.2.17. Методы биологических исследований.

3.2.17.1. Анализ взаимодействия гибридного белка тиоредоксин-нейротоксин II с никотиновым ацетилхолиновым рецептором из Torpedo californica.

3.2.17.2. Определение токсичности рекомбинантных токсинов.

3.2.17.3. Определение константы ингибирования нейрональных нАХР рекомбинантным нейротоксином II и мутантными нейротоксинами.

3.2.18. Построение молекулярных моделей.

Глава 4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

ВВЕДЕНИЕ.

4.1. Конструирование гена нейротоксина II.

4.2. Конструирование гена тиоредоксина.

4.3. Экспрессирующие вектора и биосинтез рекомбинантных токсинов в прокариотической системе (Е. colí).

4.3.1.1. Сборка экспрессирующей конструкции для наработки слитного белка тиоредоксин-нейротоксин II.

4.3.1.2. Биосинтез нейротоксина II в составе слитного белка с тиоредоксином.

4.3.1.3. Выделение и очистка гибридного белка тиоредоксин-нейротоксин II.

4.3.1.4. ЯМР-спектроскопия гибридного белка тиоредоксин-нейротоксин II.

4.3.1.5. Биологические свойства гибридного белка тиоредоксин-нейротоксин II.

4.3.1.6. Выделение и очистка рекомбинантного нейротоксина II.

4.3.1.7. Анализ рекомбинантного нейротоксина II.

4.3.2.1. Экспрессирующая конструкция для секреции рекомбинантного нейротоксина II.

4.3.2.2. Секреция рекомбинантного нейротоксина II.

4.3.2.3. Выделение и очистка рекомбинантного нейротоксина II.

4.3.2.4. Анализ рекомбинантного нейротоксина II.

4.3.2.5. ЯМР-анализ рекомбинантного нейротоксина II.

4.3.2.6. Анализ токсичности рекомбинантного нейротоксина II.

4.3.3.1. Биосинтез изотопно-меченых вариантов нейротоксина II.

4.3.3.2. Выделение и очистка изотопно-меченых вариантов нейротоксина II.

4.3.3.3. ЯМР-анализ чистоты и степени мечения препаратов изотопно-меченых вариантов нейротоксина II.

4.3.3.4. Отнесение ЯМР спектров.

4.3.3.5. Исследование взаимодействия нейротоксина II с липидными бицеллами (анизотропной средой, моделирующей биологическую мембрану).

4.3.4.1. Конструирование мутантных вариантов нейротоксина II.

4.3.4.2. Получение генов мутантных вариантов нейротоксина II mutl и mutll.

4.3.4.3. Биосинтез мутантных вариантов нейротоксина II Mutl и Mutll.

4.3.4.4. Выделение и очистка мутантных вариантов нейротоксина II Mutl и Mutll.

4.3.4.5. Анализ рекомбинантных белков Mutl и Mutll.

4.3.4.6. ЯМР-анализ рекомбинантных белков Mutl и Mutll.

4.3.4.7. Анализ биологической активности рекомбинантных белков Mutl и Mutll.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Получение и исследование генно-инженерного нейротоксина II и его мутантных форм"

Актуальность темы. а-Нейротоксины - наиболее сильнодействующие компоненты яда змей семейства Elapidae, к которому относятся и кобры /1 / . Эти токсины являются высокоспецифичными конкурентными ингибиторами никотинового ацетилхолинового рецептора (нАХР), который представляет собой лиганд-зависимый ионный канал, встроенный в постсинаптическую мембрану нейронов /2/. Высокая специфичность связывания, небольшие размеры и жесткая структура нейротоксинов делают их удобным инструментом для изучения свойств нАХР. Кроме того, наличие большого числа гомологичных аминокислотных последовательностей а-нейротоксинов делает возможным анализ структурно-функциональных взаимосвязей в их молекулах.

Существует два типа а-нейротоксинов: короткие (4 дисульфидных связи, 60-62 а.о.) и длинные (5 дисульфидных связей, 66-75 а.о.). Причем, только длинные а-нейротоксины эффективно связываются с нАХР нейронального типа, которые расположены в нейронах нервной системы, в то время как с нАХР мускульного типа, локализованными в нервно-мышечных соединениях, эффективно взаимодействуют а-нейротоксины обоих типов. Это различие объясняется разным строением центральной петли коротких и длинных а-нейротоксинов /3/. Нейротоксин II из яда кобры Naja oxiana принадлежит семейству коротких а-нейротоксинов /4/ и является высокоспецифичным конкурентным ингибитором мускульного нАХР. Получение и исследование различных мутантных вариантов нейротоксина II позволит не только понять принципиальные различия между короткими и длинными нейротоксинами, но и выявить механизмы, лежащие в основе взаимодействия молекул нейротоксинов с нАХР.

Данные о структуре и свойствах а-нейротоксинов, понимание механизмов их действия на молекулярном уровне важны не только с точки 5 i 1

• зрения фундаментальной науки, но и для разработки новых биомедицинских препаратов для лечения ряда заболеваний нервной системы, обусловленных дисфункцией тех или иных нАХР, таких как, аутизм /5/, эпилепсия /6/, депрессия, никотиновая /7/ и алкогольная зависимости /8,9/, болезнь Альцгеймера /10/, паркинсонизм /11,12/, мышечная дистрофия /13/.

Основные задачи исследования.

1. Получить ген нейротоксина II, а также вектора для экспрессии в прокариотической системе (Escherichia coli), и разработать эффективную схему биосинтеза, выделения и очистки рекомбинантного нейротоксина. Наработать генно-инженерный нейротоксин II в необходимых для исследований количествах.

2. Изучить физико-химические и биологические свойства нейротоксина II.

3. Осуществить теоретический дизайн мутантных вариантов нейротоксина II из яда кобры Naja oxiana.

2. Впервые проведено генно-инженерное конструирование химерного нейротоксина с заданной специфичностью.

3. Впервые получен ,3С-15М-меченый нейротоксин, и проведено полное отнесение его ЯМР сигналов.

4. Впервые изучено взаимодействие коротких а-нейротоксинов с окружением, моделирующим липидный бислой.

5. Исследованы биологические свойства рекомбинантных белков. Показано, что гибридный белок тиоредоксин-нейротоксин II обладает активностью по отношению к нАХР мускульного типа, сопоставимой с активностью природного нейротоксина II. Рекомбинантный нейротоксин II практически полностью воспроизводит активность природного токсина. Полученные генно-инженерным путем мутантные варианты нейротоксина II с модифицированной центральной петлей, соответствующей петле нейротоксина I с некоторыми заменами, обладают способностью взаимодействовать с нейрональными нАХР. Причем, активность одного из мутантных вариантов по отношению к нейрональному нАХР а7 типа близка к активности нейротоксина I. Наличие биологической активности полученных рекомбинантных нейротоксинов позволяет использовать эти белки как инструменты в дальнейших детальных исследованиях механизмов взаимодействия различных типов нАХР со своими лигандами, что, несомненно, представляет большой интерес с точки зрения создания эффективных терапевтических средств для лечения заболеваний нервной системы, обусловленных дисфункцией нАХР.

ЧАСТЬ I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Люкманова, Екатерина Назымовна

выводы

3. Разработаны эффективные схемы биосинтеза, выделения и очистки рекомбинантных белков.

4. Нейротоксин II, его мутантные варианты и 15Ы-меченый нейротоксин II получены в препаративных количествах, достаточных для проведения исследований физико-химических и биологических свойств.

5. Впервые получен 13С-15Ы-меченый а-нейротоксин и сделано отнесение химических сдвигов ]Н, 13С и 15Ы ядер белка нейротоксин II.

6. Структурные свойства рекомбинантных белков исследованы методами ядерного магнитного резонанса. Показано, что а) все полученные в работе белки обладают жесткой пространственной структурой, б) пространственная структура рекомбинантного нейротоксина II идентична структуре природного токсина, в) нейротоксин II способен взаимодействовать с бицеллами, моделирующими липидный бислой.

7. В ходе исследования биологических свойств полученных белков было показано, что: а) гибридный белок тиоредоксин-нейротоксин II обладает активностью по отношению к нАХР мускульного типа, сопоставимой с активностью природного нейротоксина II, б) рекомбинантный нейротоксин II практически воспроизводит активность природного токсина, в) полученные мутантные варианты нейротоксина II приобрели способность взаимодействовать с нейрональными нАХР, причем, мутантный вариант нейротоксина II с модифицированной центральной петлей, соответствующей петле нейротоксина I, обладает селективной активностью по отношению к нейрональному нАХР а7 типа, близкой к активности нейротоксина I.

БЛАГОДАРНОСТИ

Мне хотелось бы выразить глубокую благодарность и искреннюю признательность своим научным руководителям академику РАН, д.б.н. Михаилу Петровичу Кирпичникову и профессору д.б.н. Дмитрию Александровичу Долгих, которые обеспечили возможность выполнения настоящей диссертационной работы, оказывали своевременную помощь и поддержку и проявляли неустанное благожелательное внимание на протяжении всего времени моей работы в лаборатории.

Приношу свою глубокую благодарность руководителю лаборатории структурной биологии ИБХ РАН проф. A.C. Арсеньеву и сотрудникам этой лаборатории И.В. Масленникову и 3.0. Шенкареву, чьи идеи легли в основу создания мутантных вариантов нейротоксина П. Также хочу поблагодарить сотрудников этой лаборатории Э.В. Бочарова за неоценимую помощь в исследовании полученных пептидов методами ЯМР-спектроскопии и П.Е. Волынского за помощь в построении молекулярных моделей пространственных структур нейротоксинов.

Выражаю свою искреннюю признательность сотруднику лаборатории инженерии белка ИБХ РАН А. А. Шульге, чьи разработки в области высокоэффективных систем для экспрессии рекомбинантных белков в Е. coli позволили выполнить основную часть представленной работы. Также хочу поблагодарить Д.А. Арсеньеву (University of Chicago, Illinois, США) за совместную работу по созданию экспрессирующих систем для нейротоксина П.

Особую благодарность выражаю сотрудникам лаборатории рецепции нейропептидов ИБХ РАН Ю.Н. Уткину и И.Е. Кашеверову, сотруднику лаборатории нейрорецепторов и нейрорегуляторов ИБХ РАН К.А. Плужникову и A.C. Курятову (Department of Neuroscience, University of Pennsylvania, Medical School, Philadelphia, Pennsylvania, США) за огромную помощь в исследовании биологических свойств и тестировании активностей полученных пептидов.

Отдельную благодарность хочу выразить всем сотрудникам лабораторий инженерии белка и структурной биологии ИБХ РАН за высокий профессионализм и дружелюбие, неизменно помогавшее мне на всем пути выполнения диссертационной работы.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Полученные в диссертационной работе результаты выявляют основные принципы, использованные природой при конструировании высокоселективных лигандов, действующих на никотиновые ацетилхолиновые рецепторы. В рамках работы, на примере созданного рекомбинантного токсина (МиЙ), селективно действующего на нейрональный нАХР а7 типа, показано, что различие в специфичности действия "трехпальцевых" нейротоксинов из ядов змей на различные нАХР в основном обусловлено строением кончика центральной пептли токсинов. В то же время, как показывают данные по другому нейротоксину (МиШ), действующему на нейрональный нАХР а3|32 типа, строение центральной петли - не единственная структурная детерминанта, ответственная за взаимодействие а-нейротоксинов с нАХР. Одной из возможных дополнительных детерминант может служить участок молекулы нейротоксина, взаимодействующий с мембраной клетки, окружающей нАХР.

Результаты диссертационной работы указывают на возможность создания новых пептидных молекул, селективно действующих на отдельные подтипы мембранных рецепторов, что имеет фундаментальное и практическое значение для современной медицины и фармакологии. Вероятно, в будущем, конструирование методами белковой инженерии белков, пептидов и пептидомиметиков позволит создавать новые поколения высокоселективных лекарственных препаратов и откроет путь для излечения многих болезней центральной нервной системы, связанных с дисфункцией нАХР.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Люкманова, Екатерина Назымовна, Москва

1. Tsetlin VI, Hucho F. Snake and snail toxins acting on nicotinic acetylcholine receptors: fundamental aspects and medical applications.// FEBS Lett (2004); 557(l-3):9-13.

2. Hucho F., Weise C. Ligand-Gated Ion Chanells.// Angew Chem (2001); 40:3100-3116.

3. Tsetlin V. Snake venom alpha-neurotoxins and other 'three-finger' proteins.// Eur J Biochem (1999); 264(2):281-286.

4. Tsetlin VI, Karlsson E, Utkin Y, Pluzhnikov KA, Arseniev AS, Surin AM, Kondakov VV, Bystrov VF, Ivanov VT, Ovchinnikov Y. Interaction surfaces of neurotoxins and acetylcholine receptor.// Toxicon (1982); 20(l):83-93.

5. Martin-Ruiz CM, Lee M, Perry RH, Baumann M, Court J A, Perry EK. Molecular analysis of nicotinic receptor expression in autism.// Brain Res Mol Brain Res (2004); 123(1-2):81-90.

6. Bertrand D. Neuronal Nicotinic Acetylcholine Receptors and Epilepsy.// Epilepsy Curr (2002); 2(6): 191-193.

7. Hogg RC, Bertrand D. Neuroscience. What genes tell us about nicotine addiction.// Science (2004); 306(5698):983-985.

8. Cardoso RA, Brozowski SJ, Chavez-Noriega LE, Harpold M, Valenzuela CF, Harris RA. Effects of ethanol on recombinant human neuronal nicotinic acetylcholine receptors expressed in Xenopus oocytes.// J Pharmacol Exp Ther (1999); 289(2):774-780.

9. Dohrman DP, Reiter CK. Ethanol modulates nicotine-induced upregulation of nAChRs.// Brain Res (2003); 975(l-2):90-98.

10. Shen XM, Ohno K, Tsujino A, Brengman JM, Gingold M, Sine SM, Engel AG. Mutation causing severe myasthenia reveals functional asymmetry of AChR signature cystine loops in agonist binding and gating.// J Clin Invest (2003); 111(4):497-505.

11. Martin-Ruiz CM, Haroutunian VH, Long P, Young AH, Davis KL, Perry EK, Court JA. Dementia rating and nicotinic receptor expression in the prefrontal cortex in schizophrenia.// Biol Psychiatry (2003); 54(11):1222-1233.

12. Bertrand D, Picard F, Le Hellard S, Weiland S, Favre I, Phillips H, Bertrand S, Berkovic SF, Malafosse A, Mulley J. How mutations in the nAChRs can cause ADNFLE epilepsy.// Epilepsia (2002); 43 Suppl 5:112-122.

13. Hogg RC, Bertrand D. Regulating the regulators: the role of nicotinic acetylcholine receptors in human epilepsy.// Drug News Perspect (2003); 16(5):261-266.

14. Moulard B, Picard F, Le Hellard S, Agulhon C, Weiland S, Favre I, Bertrand S, Malafosse A, Bertrand D. Ion channel variation causes epilepsies.// Brain Res Brain Res Rev (2001); 36(2-3):275-284.

15. Hogg RC, Bertrand D. Neuronal nicotinic receptors and epilepsy, from genes to possible therapeutic compounds.// Bioorg Med Chem Lett (2004); 14(8):1859-1861.

16. Sine SM, Ohno K, Bouzat C, Auerbach A, Milone M, Pruitt JN, Engel AG. Mutation of the acetylcholine receptor alpha subunit causes a slow-channel myasthenic syndrome by enhancing agonist binding affinity.// Neuron (1995); 15(l):229-239.

17. Hogg RC, Raggenbass M, Bertrand D. Nicotinic acetylcholine receptors: from structure to brain function.// Rev Physiol Biochem Pharmacol (2003); 147:1-46.

18. Weiland S, Bertrand D, Leonard S. Neuronal nicotinic acetylcholine receptors: from the gene to the disease.// Behav Brain Res (2000); 113(l-2):43-56.

19. Wang H, Yu M, Ochani M, Amelia CA, Tanovic M, Susarla S, Li JH, Wang H, Yang H, Ulloa L, A1 Abed Y, Czura CJ, Tracey KJ. Nicotinic acetylcholine receptor alpha7 subunit is an essential regulator of inflammation.// Nature (2003); 421(6921):384-388.

20. Рубин А.Б. Биофизика клеточных процессов. Том 2. (2004).

21. Wilson G, Karlin A. Acetylcholine receptor channel structure in the resting, open, and desensitized states probed with the substituted-cysteine-accessibility method.// Proc Natl Acad Sci U S A (2001); 98(3):1241-1248.

22. Eisenman G., Dani JA. An introduction to molecular architecture and permeability of ion channels. (1987).

23. Б.Альбертс, Д.Брей, Дж.Льюис, М.Рефф, К.Робертс, Дж.Уотсон. Молекулярная биология клетки. ТЗ, п. 19. (2004).

24. Unwin N. The nicotinic acetylcholine receptor of the Torpedo electric ray.// J Struct Biol (1998); 121(2):181-190.

25. Unwin N. Structure of the acetylcholine-gated channel.// Novartis Found Symp (2002); 245; discussion 15-21,165-8.:5-15.

26. Unwin N. Structure and action of the nicotinic acetylcholine receptor explored by electron microscopy.// FEBS Lett (2003); 555(l):91-95.

27. Wise DS, Schoenborn BP, Karlin A. Structure of acetylcholine receptor dimer determined by neutron scattering and electron microscopy.// J Biol Chem (1981); 256(8):4124-4126.

28. Schapira M, Abagyan R, Totrov M. Structural model of nicotinic acetylcholine receptor isotypes bound to acetylcholine and nicotine.// BMC Struct Biol (2002); 2(1): 1.

29. Grant MA, Gentile LN, Shi QL, Pellegrini M, Hawrot E. Expression and spectroscopic analysis of soluble nicotinic acetylcholine receptor fragments derived from the extracellular domain of the alpha-subunit.// Biochemistry (1999); 38(33):10730-10742.

30. Lai R, Yu L. Atomic force microscopy of cloned nicotinic acetylcholine receptor expressed in Xenopus oocytes.// Proc Natl Acad Sci U S A (1993); 90(15):7280-7284.

31. Yao Y, Wang J, Viroonchatapan N, Samson A, Chill J, Rothe E, Anglister J, Wang ZZ. Yeast expression and NMR analysis of the extracellular domain of muscle nicotinic acetylcholine receptor alpha subunit.// J Biol Chem (2002); 277(15):12613-12621.

32. Fischer M, Corringer PJ, Schott K, Bacher A, Changeux JP. A method for soluble overexpression of the alpha7 nicotinic acetylcholine receptor extracellular domain.// Proc Natl Acad Sci U S A (2001); 98(6):3567-3570.

33. Court JA, Martin-Ruiz C, Graham A, Perry E. Nicotinic receptors in human brain: topography and pathology.// J Chem Neuroanat (2000); 20(3-4):281-298.

34. Le NN, Corringer PJ, Changeux JP. The diversity of subunit composition in nAChRs: evolutionary origins, physiologic and pharmacologic consequences.// J Neurobiol (2002); 53(4):447-456.

35. Lindstrom JM. Nicotinic acetylcholine receptors of muscles and nerves: comparison of their structures, functional roles, and vulnerability to pathology.// Ann N Y Acad Sci (2003); 998:41-52.:41-52.

36. Цетлин В.И., Плужников К.А., Карелин А.А., Карлссон E., Иванов B.T. Взаимное расположение субъединиц ацетилхолинового рецептора и связанного с ним нейротоксина.// Биоорг.Химия (1984); 10(2): 176-187.

37. Unwin N, Toyoshima С, Kubalek Е. Arrangement of the acetylcholine receptor subunits in the resting and desensitized states, determined by cryoelectron microscopy of crystallized Torpedo postsynaptic membranes.// J Cell Biol (1988); 107(3):1123-1138.

38. Unwin N. Nicotinic acetylcholine receptor at 9 A resolution.// J Mol Biol (1993); %20;229(4):1101-1124.

39. Unwin N. Acetylcholine receptor channel imaged in the open state.// Nature (1995); 373(6509):37-43.

40. Akabas MH, Kaufmann C, Archdeacon P, Karlin A. Identification of acetylcholine receptor channel-lining residues in the entire M2 segment of the alpha subunit.// Neuron (1994); 13(4):919-927.

41. Anand R, Nelson ME, Gerzanich V, Wells GB, Lindstrom J. Determinants of channel gating located in the N-terminal extracellular domain of nicotinic alpha7 receptor.// J Pharmacol Exp Ther (1998); 287(2):469-479.

42. Sine SM. The nicotinic receptor ligand binding domain.// J Neurobiol (2002); 53(4):431-446.

43. Brejc K, van Dijk WJ, Klaassen RV, Schuurmans M, van Der О J, Smit AB, Sixma TK. Crystal structure of an ACh-binding protein reveals the ligand-binding domain of nicotinic receptors.// Nature (2001); 411(6835) :269-276.

44. Sixma TK, Smit AB. Acetylcholine binding protein (AChBP): a secreted glial protein that provides a high-resolution model for the extracellular domain of pentameric ligand-gated ion channels.// Annu Rev Biophys Biomol Struct (2003); 32:311-334.

45. Smit AB, Brejc K, Syed N, Sixma TK. Structure and function of AChBP, homologue of the ligand-binding domain of the nicotinic acetylcholine receptor.// Ann N Y Acad Sci (2003); 998:81-92.:81-92.

46. Tierney ML, Unwin N. Electron microscopic evidence for the assembly of soluble pentameric extracellular domains of the nicotinic acetylcholine receptor.// J Mol Biol (2000); 303(2): 185-196.

47. Wells GB, Anand R, Wang F, Lindstrom J. Water-soluble nicotinic acetylcholine receptor formed by alpha7 subunit extracellular domains.// J Biol Chem (1998); 273(2):964-973.

48. Craik D.J. Applications of NMR in drug design: structure-activity relationships in disulfide-rich peptides.// Protein and Peptide Letters (1999); 6(5):341-350.

49. Basus VJ, Nadasdi L, Ramachandran J, Miljanich GP. Solution structure of omega-Conotoxin MVIIA using 2D NMR spectroscopy.// FEBS Lett (1995); 370(3): 163-169.

50. Gehrmann J, Daly NL, Alewood PF, Craik DJ. Solution structure of alpha-conotoxin Iml by 1H nuclear magnetic resonance.// J Med Chem (1999); 42(13):2364-2372.

51. Hill JM, Alewood PF, Craik DJ. Three-dimensional solution structure of mu-conotoxin GIIIB, a specific blocker of skeletal muscle sodium channels.// Biochemistry (1996); 35(27):8824-8835.

52. Hill JM, Alewood PF, Craik DJ. Solution structure of the sodium channel antagonist conotoxin GS: a new molecular caliper for probing sodium channel geometry.// Structure (1997); 5(4):571-583.

53. Hill JM, Oomen CJ, Miranda LP, Bingham JP, Alewood PF, Craik DJ. Three-dimensional solution structure of alpha-conotoxin Mil by NMR spectroscopy: effects of solution environment on helicity.// Biochemistry (1998); 37(45):15621-15630.

54. Hill JM, Alewood PF, Craik DJ. Conotoxin TVIIA, a novel peptide from the venom of Conus tulipa 2. Three-dimensional solution structure.// Eur J Biochem (2000); 267(15):4649-4657.

55. Hu SH, Gehrmann J, Alewood PF, Craik DJ, Martin JL. Crystal structure at 1.1 A resolution of alpha-conotoxin PnIB: comparison with alpha-conotoxins PnIA and GUI Biochemistry (1997); 36(38):11323-11330.

56. Kobayashi Y, Ohkubo T, Kyogoku Y, Nishiuchi Y, Sakakibara S, Braun W, Go N. Solution conformation of conotoxin GI determined by 1H nuclear magnetic resonance spectroscopy and distance geometry calculations.// Biochemistry (1989); 28(11):4853-4860.

57. Maslennikov IV, Sobol AG, Gladky KV, Lugovskoy AA, Ostrovsky AG, Tsetlin VI, Ivanov VT, Arseniev AS. Two distinct structures of alpha-conotoxin GI in aqueous solution.// Eur J Biochem (1998); 254(2):238-247.

58. Shon KJ, Koerber SC, Rivier JE, Olivera BM, Mcintosh JM. Three-dimensional solution structure of alpha-conotoxin Mil, an alpha3beta2 neuronal nicotinic acetylcholine receptor-targeted ligand.// Biochemistry (1997); 36(50):15693-15700.

59. Millard EL, Daly NL, Craik DJ. Structure-activity relationships of alpha-conotoxins targeting neuronal nicotinic acetylcholine receptors.// Eur J Biochem (2004); 271(12):2320-2326.

60. Mcintosh JM, Yoshikami D, Mahe E, Nielsen DB, Rivier JE, Gray WR, Olivera BM. A nicotinic acetylcholine receptor ligand of unique specificity, alpha-conotoxin Iml.// J Biol Chem (1994); 269(24): 16733-16739.

61. Quiram PA, Sine SM. Identification of residues in the neuronal alpha7 acetylcholine receptor that confer selectivity for conotoxin Iml.// J Biol Chem (1998); 273(18):11001-11006.

62. Cartier GE, Yoshikami D, Gray WR, Luo S, Olivera BM, Mcintosh JM. A new alpha-conotoxin which targets alpha3beta2 nicotinic acetylcholine receptors.// J Biol Chem (1996); 271(13):7522-7528.

63. Harvey SC, Mcintosh JM, Cartier GE, Maddox FN, Luetje CW. Determinants of specificity for alpha-conotoxin Mil on alpha3beta2 neuronal nicotinic receptors.// Mol Pharmacol (1997); 51(2):336-342.

64. Hider RC. A proposal for the structure of conotoxin~a potent antagonist of the nicotinic acetylcholine receptor.// FEBS Lett (1985); 184(2):181-184.

65. Hodgson WC, Wickramaratna JC. In vitro neuromuscular activity of snake venoms.// Clin Exp Pharmacol Physiol (2002); 29(9):807-814.

66. Tsernoglou D, Petsko GA. The crystal structure of a post-synaptic neurotoxin from sea snake at A resolution.// FEBS Lett (1976); 68(1): 1-4.

67. Михайлов A.M., Никитенко A.B., Четверина E.B., Траханов С.Д., Вайнштейн Б.К. Пространственное строение основной цепи молекулы нейротоксина I из яда кобры Naja naja oxiana и ее укладка в кристаллической ячейке. // Биоорг.Химия (1991); 17(3):372-378.

68. Inagaki F, Tamiya N, Miyazawa T, Williams RJ. Structural differences between erabutoxins in aqueous solution and in crystalline states.// Eur J Biochem (1981); 118(3):621-625.

69. Golovanov AP, Lomize AL, Arseniev AS, Utkin YN, Tsetlin VI. Two-dimensional 1H-NMR study of the spatial structure of neurotoxin II from Naja naja oxiana.// Eur J Biochem (1993); 213(3):1213-1223.

70. Tsernoglou D, Petsko GA. Three-dimensional structure of neurotoxin a from venom of the Philippines sea snake.// Proc Natl Acad Sci U S A (1977); 74(3):971-974.

71. Lauterwein J, Wuthrich K, Schweitz H, Vincent JP, Lazdunski M. 1H n.m.r. studies of a neurotoxin and a cardiotoxin from Naja mossambica mossambica: amide proton resonances.// Biochem Biophys Res Commun (1977); 76(4):1071-1078.

72. Lauterwein J, Lazdunski M, Wuthrich K. The 1H nuclear-magnetic-resonance spectra of Neurotoxin I and cardiotoxin Vii4 from Naja mossambica mossambica.// Eur J Biochem (1978); 92(2):361-371.

73. Low BW. Three-dimensional structure of erabutoxin b, prototype structure of the snake venom postsynaptic neurotoxins: consideration of structure and function; description of the reactive site.// Adv Cytopharmacol (1979); 3:141-147.

74. Arseniev AS, Pashkov VS, Pluzhnikov KA, Rochat H, Bystrov VF. The 1H nuclear-magnetic-resonance spectra and spatial structure of the Naja mossambica mossambica neurotoxin III.// Eur J Biochem (1981); 118(3):453-462.

75. Corfield PW, Lee TJ, Low BW. The crystal structure of erabutoxin a at 2.0-A resolution.// J Biol Chem (1989); 264(16):9239-9242.

76. Le Goas R, LaPlante SR, Mikou A, Delsuc MA, Guittet E, Robin M, Charpentier I, Lallemand JY. Alpha-cobratoxin: proton NMR assignments and solution structure.// Biochemistry (1992); 31(20):4867-4875.

77. Brown LR, Wuthrich K. Nuclear magnetic resonance solution structure of the alpha-neurotoxin from the black mamba (Dendroaspis polylepis polylepis).// J Mol Biol (1992); 227(4):1118-1135.

78. Zinn-Justin S, Roumestand C, Gilquin B, Bontems F, Menez A, Toma F. Three-dimensional solution structure of a curaremimetic toxin from Naja nigricollis venom: a proton NMR and molecular modeling study.//Biochemistry (1992); 31(46):11335-11347.

79. Juan HF, Hung CC, Wang KT, Chiou SH. Comparison of three classes of snake neurotoxins by homology modeling and computer simulation graphics.// Biochem Biophys Res Commun (1999); 257(2):500-510.

80. Уткин Ю.Н., Кашеверов И.Е., Цетлин В.И. а-Нейротоксины и а-конотоксины -блокаторы никотиновых холинорецепторов.// Биоорг.Химия (1999); 25(11):805-810.

81. Servent D, Winckler-Dietrich V, Hu HY, Kessler P, Drevet P, Bertrand D, Menez A. Only snake curaremimetic toxins with a fifth disulfide bond have high affinity for the neuronal alpha7 nicotinic receptor.// J Biol Chem (1997); 272(39):24279-24286.

82. Antil S, Servent D, Menez A. Variability among the sites by which curaremimetic toxins bind to torpedo acetylcholine receptor, as revealed by identification of the functional residues of alpha-cobratoxin.//J Biol Chem (1999); 274(49):34851-34858.

83. Teixeira-Clerc F, Menez A, Kessler P. How do short neurotoxins bind to a muscular-type nicotinic acetylcholine receptor?// J Biol Chem (2002); 277(28):25741-25747.

84. Kreienkamp HJ, Utkin YN, Weise C, Machold J, Tsetlin VI, Hucho F. Investigation of ligand-binding sites of the acetylcholine receptor using photoactivatable derivatives of neurotoxin II from Naja naja oxiana.// Biochemistry (1992); 31(35):8239-8244.

85. Hucho F, Tsetlin VI, Machold J. The emerging three-dimensional structure of a receptor. The nicotinic acetylcholine receptor.// Eur J Biochem (1996); 239(3):539-557.

86. Уткин Ю.Н., Мунд М., Хухо Ф., Цетлин В.И. Эффективное связывание а-бунгаротоксина солюбилированной а-субъединицей ацетилхолинового рецептора.// Биоорг.Химия (1996); 22(5):387-389.

87. Mulac-Jericevic В, Atassi MZ. Profile of the alpha-bungarotoxin-binding regions on the extracellular part of the alpha-chain of Torpedo californica acetylcholine receptor.// Biochem J (1987); 248(3):847-852.

88. Ruan KH, Stiles BG, Atassi MZ. The short-neurotoxin-binding regions on the alpha-chain of human and Torpedo californica acetylcholine receptors.// Biochem J (1991); 274(Pt 3):849-854.

89. Conti-Tronconi BM, Tang F, Diethelm BM, Spencer SR, Reinhardt-Maelicke S, Maelicke A. Mapping of a cholinergic binding site by means of synthetic peptides, monoclonal antibodies, and alpha-bungarotoxin.// Biochemistry (1990); 29(26):6221-6230.

90. Takamori M, Okumura S, Nagata M, Yoshikawa H. Myasthenogenic significance of synthetic alpha-subunit peptide 183-200 of Torpedo californica and human acetylcholine receptor.// J Neurol Sci (1988); 85(2): 121-129.

91. Griesmann GE, McCormick DJ, De Aizpurua HJ, Lennon VA. Alpha-bungarotoxin binds to human acetylcholine receptor alpha-subunit peptide 185-199 in solution and solid phase but not to peptides 125-147 and 389-409.// J Neurochem (1990); 54(5):1541-1547.

92. Wilson PT, Hawrot E, Lentz TL. Distribution of alpha-bungarotoxin binding sites over residues 173-204 of the alpha subunit of the acetylcholine receptor.// Mol Pharmacol (1988); 34(5):643-650.

93. Samson A, Scherf T, Eisenstein M, Chill J, Anglister J. The mechanism for acetylcholine receptor inhibition by alpha-neurotoxins and species-specific resistance to alpha-bungarotoxin revealed by NMR.// Neuron (2002); 35(2):319-332.

94. Samson AO, Chill JH, Rodriguez E, Scherf T, Anglister J. NMR mapping and secondary structure determination of the major acetylcholine receptor alpha-subunit determinant interacting with alpha-bungarotoxin.// Biochemistry (2001); 40(18):5464-5473.

95. Bouzat C, Gumilar F, Spitzmaul G, Wang HL, Rayes D, Hansen SB, Taylor P, Sine SM. Coupling of agonist binding to channel gating in an ACh-binding protein linked to an ion channel.//Nature (2004); 430(7002):896-900.

96. Henchman RH, Wang HL, Sine SM, Taylor P, McCammon JA. Asymmetric structural motions of the homomeric alpha7 nicotinic receptor ligand binding domain revealed by molecular dynamics simulation.// Biophys J (2003); 85(5):3007-3018.

97. Chakrapani S, Bailey TD, Auerbach A. Gating dynamics of the acetylcholine receptor extracellular domain.// J Gen Physiol (2004); 123(4):341-356.

98. Young HS, Herbette LG, Skita V. Alpha-bungarotoxin binding to acetylcholine receptor membranes studied by low angle X-ray diffraction.// Biophys J (2003); 85(2):943-953.

99. Хечинашвили H.H., Цетлин В.И. Калориметрическое исследование тепловой денатурации токсинов.// Мол. Биол (Москва) (1984); 18(3):786-791.

100. Marston FA. The purification of eukaryotic polypeptides synthesized in Escherichia coli.// Biochem J (1986); 240(1):1-12.

101. LaVallie ER, DiBlasio EA, Kovacic S, Grant KL, Schendel PF, McCoy JM. A thioredoxin gene fusion expression system that circumvents inclusion body formation in the E. coli cytoplasm.// Biotechnology (N Y) (1993); 11(2):187-193.

102. LaVallie ER, Lu Z, Blasio-Smith EA, Collins-Racie LA, McCoy JM. Thioredoxin as a fusion partner for production of soluble recombinant proteins in Escherichia coli.// Methods Enzymol (2000); 326:322-40.:322-340.

103. LaVallie ER, Blasio-Smith EA, Collins-Racie LA, Lu Z, McCoy JM. Thioredoxin and related proteins as multifunctional fusion tags for soluble expression in E. coli.// Methods Mol Biol (2003); 205:119-40.: 119-140.

104. Takahashi N, Creighton TE. On the reactivity and ionization of the active site cysteine residues of Escherichia coli thioredoxin.// Biochemistry (1996); 35(25):8342-8353.

105. Wang Y, Jing L, Xu K. A unique approach for high level expression and production of a recombinant cobra neurotoxin in Escherichia coli.// J Biotechnol (2002); 94(3):235-244.

106. Economou A. Following the leader: bacterial protein export through the Sec pathway.// Trends Microbiol (1999); 7(8):315-320.

107. Ghrayeb J, Kimura H, Takahara M, Hsiung H, Masui Y, Inouye M. Secretion cloning vectors in Escherichia coli.// EMBO J (1984); 3(10):2437-2442.

108. Tan S, Wu W, Liu J, Kong Y, Pu Y, Yuan R. Efficient expression and secretion of recombinant hirudin III in E. coli using the L-asparaginase II signal sequence.// Protein Expr Purif (2002); 25(3):430-436.

109. Kebir MO, Kendall DA. SecA specificity for different signal peptides.// Biochemistry2002); 41(17):5573-5580.

110. Bardwell JC, McGovern K, Beckwith J. Identification of a protein required for disulfide bond formation in vivo.// Cell (1991); 67(3):581-589.

111. Maskos K, Huber-Wunderlich M, Glockshuber R. DsbA and DsbC-catalyzed oxidative folding of proteins with complex disulfide bridge patterns in vitro and in vivo.// J Mol Biol2003); 325(3):495-513.

112. Bowden GA, Georgiou G. Folding and aggregation of beta-lactamase in the periplasmic space of Escherichia coli.// J Biol Chem (1990); 265(28): 16760-16766.

113. Mourier G, Servent D, Zinn-Justin S, Menez A. Chemical engineering of a three-fingered toxin with anti-alpha7 neuronal acetylcholine receptor activity.// Protein Eng (2000); 13(3):217-225.

114. Studier FW, Moffatt BA. Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes.// J Mol Biol (1986); 189(1):113-130.

115. Маниатис Т., Фрич Э., Сембрук Д. Молекулярное клонирование. (1984).

116. Hanahan D. Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids.// J Mol Biol (1983); 166(4):557-580.

117. Laemmli UK. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.//Nature (1970); 227(5259):680-685.

118. Schagger H, von JG. Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1 to 100 kDa.// Anal Biochem (1987); 166(2):368-379.

119. Cavanagh J., Fairbrother W.J., Palmer A.G., Skelton N.J. Protein NMR spectroscopy: principles and practice. (1996).

120. Shaka A.J., Keeler J., Frenkiel Т., Freeman R. Computer optimized decoupling scheme for wideband application and low-level operation.// J Magn Reson (1985); 64:547-552.

121. Shaka A.J., Keeler J., Frenkiel Т., Freeman R. An improved sequence for broadband decoupling: WALTZ-16.// J Magn Reson (1983); 52:335-338.

122. States D.J., Habercorn R.A., Ruben DJ. 2D NOE with pure absorption phase in four quadrants.// J Magn Reson (1982); 48:286-292.

123. Bartels С., Xia T.-H., Billeter M„ Guntert P., Wuthrich K. The program XEASY for computer-supported NMR spectral analysis of biological macromolecules. // J Biomol NMR (1995); 6:1-10.

124. Koradi R, Billeter M, Wuthrich K. MOLMOL: a program for display and analysis of macromolecular structures.// J Mol Graph (1996); 14(l):51-55.

125. Hoog JO, von Bahr-Lindstrom H, Josephson S, Wallace BJ, Kushner SR, Jornvall H, Holmgren A. Nucleotide sequence of the thioredoxin gene from Escherichia coli.// Biosci Rep (1984); 4(ll):917-923.

126. Schein C.H., Noteborn M.H.M. formation of soluble recombinant proteins in Escherichia coli is favored by lower growth temperature.// Biotechnology (1988); 6:291-295.

127. Wishart D.S., Sykes B.D. Chemical shifts as a tool for structure determination.// Methods Enzymol (1994); 239:363-392.

128. Schwyzer R. 100 years lock-and-key concept: are peptide keys shaped and guided to their receptors by the target cell membrane?// Biopolymers (1995); 37(1):5-16.

129. Schiebler W., Lauffer L., Hucho F. Acetylcholine receptor enriched membranes: acetylcholine binding and excitability after reduction in vitro. // FEBS Lett. (1977); 81:39-42.

130. Carrier G.E., Yoshikami D., Gray W.R., Luo S., Olivera B.M., Mcintosh J.M. A new a-conotoxin which targets a3p2 nicotinic acetylcholine receptors. // J.Biol.Chem. (1996); 271:7522-7528.

131. Mcintosh J.M., Azam L., Staheli S., Dowell C., Lindstrom J.M., Kuryatov A., Garret J.E., Maries M.J., Whiteaker P. Analogs of a-conotoxin Mil are selective for a6-containing nicotinic acetylcholine receptors. // Mol. Pharmacol (2004); 65(4):944-952.

Информация о работе

Люкманова, Екатерина Назымовна
кандидата биологических наук
Москва, 2005
ВАК 03.00.03

Диссертация

Получение и исследование генно-инженерного нейротоксина II и его мутантных форм - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы