Исследование лиганд-рецепторных взаимодействий на примере никотинового ацетилхолинового рецептора и токсинов из яда змей

Шулепко, Михаил Анатольевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Исследование лиганд-рецепторных взаимодействий на примере никотинового ацетилхолинового рецептора и токсинов из яда змей
ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Исследование лиганд-рецепторных взаимодействий на примере никотинового ацетилхолинового рецептора и токсинов из яда змей"

□03481261

На правах рукописи

--^

ШУЛЕПКО МИХАИЛ АНАТОЛЬЕВИЧ

ИССЛЕДОВАНИЕ ЛИГАНД-РЕЦЕПТОРНЫХ ВЗАИМОДЕЙСТВИЙ НА ПРИМЕРЕ НИКОТИНОВОГО АЦЕТИЛХОЛИНОВОГО РЕЦЕПТОРА И ТОКСИНОВ ИЗ ЯДА ЗМЕЙ

Специальность: 03.00.02 - Биофизика

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 .9 ОПТ 2009

Москва - 2009

003481261

Работа выполнена на кафедре биоинженерии Государственного учебно-научного учреждения Биологический факультет Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова и в лаборатории инженерии белка Учреждения российской академии наук Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН.

Научные руководители: профессор, д.б.н. Д.А.Долгих

Защита состоится "12" ноября 2009 г. в 15 ч. 30 мин. На заседании диссертационного совета Д.501.001.96 при кафедре биофизики Биологического факультета Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова по адресу: 119991, Москва, Воробьевы Горы, МГУ, биологический факультет, кафедра биофизики, Новая аудитория.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ.

Автореферат разослан « 9 » октября 2009 г.

Учёный секретарь

к.б.н. Е.Н.Люкманова

Официальные оппоненты:

профессор, д.б.н. П.Г.Свешников

доцент, д.х.н. В.В.Чупин

Ведущая организация

Учреждение Российской академии наук центр "Биоинженерия" РАН

диссертационного совета, профессор, д.б.н.

Т.Е. Кренделева

Общая характеристика работы

Актуальность темы. Изучение лиганд-рецепторных взаимодействий является одной из фундаментальных задач современной молекулярной биологии и биофизики. Эти взаимодействия играют центральную роль во многих процессах, таких как гормональная регуляция, межклеточная сигнализация, транспорт биомолекул, передача нервного импульса и др.

Никотиновый ацетилхолиновый рецептор (нАХР) представляет собой лиганд-зависимый ионный канал, встроенный в постсинаптическую мембрану нейронов, и является одним из наиболее распространенных рецепторов центральной и периферической нервных систем млекопитающих. В зависимости от локализации рецепторы семейства нАХР подразделяются на два больших класса: мышечные и нейрональные. а-Нейротоксины яда змей известны как высокоспецифичные конкурентные ингибиторы нАХР. Эти белки имеют характерную «трех-петельную» Р-структуру, стабилизированную 4-5 дисульфидными связями. Небольшие размеры и жесткая структура делают а-нейротоксины удобными инструментами для исследования свойств нАХР. Со структурной точки зрения а-нейротоксины из яда змей можно подразделить на 3 класса: короткие, длинные и «необычные» нейротоксины (Рис.1). Короткие и длинные а-нейротоксины эффективно ингибируют нАХР мышечного типа, однако только длинные а-нейротоксины с пятой дисульфидной связью в центральной петле эффективно взаимодействуют с нАХР нейронального типа. Мишенями действия «необычных» токсинов с пятой дисульфидной связью, локализованной в М-концевой петле, выступают как мышечные нАХР, так и нейрональные нАХР, а также мускариновые ацетилхолиновые рецепторы, относящиеся к семейству в-белок сопряженных рецепторов.

Изучение механизмов, лежащих в основе взаимодействия а-нейротоксин/нАХР, представляет интерес не только с фундаментальной точки зрения, но и необходимо для создания новых лекарственных препаратов, направленных на лечение заболеваний нервной системы, связанных с дисфункциями нАХР.

Цель исследования. Целью настоящей диссертационной работы являлось получение методами генной и белковой инженерии а-нейротоксинов длинного и «необычного» типов, их мутантных и изотопно-меченых вариантов, а также выявление структурных детерминант, важных для взаимодействия этих токсинов с различными подтипами нАХР.

Основные задачи исследования.

1. Получить гены химерных длинных а-нейротоксинов, созданных на основе нейротоксина II из яда Naja oxiana (NTII) путем введения в последовательность NTII дополнительных аминокислотных остатков, и «слабого» токсина из яда Naja kaoulhia (WTX, weak toxin), относящегося к классу «необычных» токсинов.

2. Разработать эффективную схему биосинтеза, выделения и очистки рекомбинантных а-нейротоксинов, их мутантных и изотопно-меченых вариантов. Наработать рекомбинантные а-нейротоксины, их мутантные и изотопно-меченые варианты в необходимых для исследования количествах. Провести физико-химический анализ рекомбинантных белков.

3. Исследовать биологические свойства химерных длинных а-нейротоксинов. Изучить специфичность химерных длинных а-нейротоксинов по отношению к нейрональным нАХР а7 и a3ß2 типов.

4. Исследовать биологическую активность рекомбинантного WTX и его мутантных вариантов по отношению к мышечному и нейрональному нАХР а7 типа. Идентифицировать аминокислотные остатки мутантных вариантов WTX, которые важны для взаимодействия с различными типами нАХР.

5. Исследовать влияние конформационной гетерогенности в молекуле WTX на функциональную активность.

Научная новизна и практическая значимость работы. Все результаты, изложенные в настоящей диссертационной работе, получены впервые. 1. На примере химерных длинных а-нейротоксинов впервые исследовано влияние точечной мутации Ala/Lys в центральной петле длинных а-нейротоксинов на взаимодействие с нейрональным нАХР a3ß2 типа.

2. Впервые разработана эффективная система продукции «слабого» токсина из яда Naja kaouíhia. Впервые разработаны протоколы выделения и очистки рекомбинантного WTX.

3. Впервые получены мутантные формы WTX, выявлены аминокислотные остатки токсина, важные для взаимодействия с нАХР мышечного и нейронального типов.

4. Впервые получен 15Ы-меченный WTX и проведено полное отнесение сигналов в ЯМР спектрах токсина.

5. Впервые изучено влияние точечных мутаций WTX на конформационную гетерогенность молекулы токсина.

Данные, полученные в ходе выполнения диссертационной работы, будут интересны не только с точки зрения фундаментальной науки, но, в перспективе, также могут быть применены для разработки лекарственных препаратов, имитирующих свойства лигандов нАХР.

Апробация работы. Результаты настоящей работы докладывались на следующих российских и международных конференциях: Симпозиуме "Нейрорецепторы: Структура, механизм действия и роль в патологиях." (Москва 2007); 37-й Ежегодной конференции общества нейробиологов, (Сан Диего, США 2007); 4-й Конференции, международном симпозиуме и летней школе "ЯМР в биологии," (Санкт-петербург 2007); 15-й Международной конференция "Новые информационные технологии в медицине, фармакологии, биологии и экологии" (Гурзуф, Украина 2007); 20-й Зимней международной молодежной научной школе "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии" (Москва 2008); 4-м Ежегодном саммите по инженерии белков (Бостон, США. 2008); 33-м Конгрессе европейских биохимических обществ "Биохимия клеточной регуляции" (Афины, Греция 2008); 4-й Конференции европейского общества нейробиологов "Успехи изучения молекулярных механизмов нейрологических заболеваний" (Лейпциг, Германия 2009), Международной научной конференции по биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии, посвященной 75-летию со дня рождения академика Ю.А. Овчинникова (Москва, 2009).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 12 печатных работ в отечественных и зарубежных изданиях, в том числе 3 статьи в реферируемых научных журналах, включенных в список ВАК и 9 тезисов конференций.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 110 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, результатов и обсуждения, выводов и списка литературы, содержит 5 таблиц и 24 рисунка. Список литературы содержит 173 наименования.

I. Исследование влияния точечной замены А1а/Ьуэ в центральной петле длинных а-нейротоксинов на взаимодействие с нейрональным нАХР «3(52 типа

Многочисленные исследования мутантных и химически модифицированных длинных и коротких а-нейротоксинов установили, что участок центральной петли, содержащий дисульфидную связь (Рис.1), необходим для взаимодействия с нейрональными нАХР. Наряду с этим было замечено, что длинные а-нейротоксины эффективно ингибируют нейрональные нАХР а7 типа, и только некоторые из них способны ингибировать нейрональные нАХР других типов. К таким токсинам

Рис. 1. Пространственные структуры а-нейротоксинов в ленточном представлении. (А). Короткий нейротоксин II из яда Naja oxiana, (Б). Длинный а-кобратоксин из яда Naja siamensis, (В). "Необычный" токсин кандоксин из яда Bungarus Candidus. Петли, образованные ß-листами, обозначены римскими цифрами. Желто-серыми линиями показаны консервативные S-S связи, красно-серыми линиями - дополнительная дисульфидная связь длинных и "необычных" нейротоксинов.

Основное содержание работы

1. Конструирование химерных длинных а-нейротоксинов

относится к-бунгаротоксин из яда Bungarus multicinctus, высокоэффективный ингибитор нАХР a3ß2 типа, также являющийся длинным а-нейротоксином. Сравнительный анализ аминокислотного состава центральной петли длинного а-кобратоксина из яда Naja siamensis (a-Cbtx) и к-бунгаротоксина показал, что концевые фрагменты центральных петлей этих двух токсинов отличаются лишь одним аминокислотным остатком в 29 положении (Рис.2). Было выдвинуто предположение, что, возможно, это различие и определяет способность к-бунгаротоксина ингибировать как нАХР а! типа, так и нАХР a3ß2 типа (Bourne et al.,EMBOJ„ 2005).

1 Г

пж

NTII/I LECHNQQSSQPPTTKTCSG-ETNt

NTII/I[A29K] LECHNQQSSQPPTTKTCSG-ETNC о-нейротоксин IlLECHNQQSSQPPTTKTCSG-ETNCYKXWi

1 10 2

Gly3<

| йг

ПГТйЛ

a-нейротоксин I ITCYKTPII---TSETCAPGQNLCYTKTWpD^iCGSRG^VIELGCAATCPTVESY-QDIKCCSTDNCNPHPKQKRP 72

a-Кобратоксин IRCFITPDI---TSKDCPNG-H"

a-ByHrapOTOKCMHlTCHTTATSP-ISAVTCPPGENLCY: K-BvHraDOTOKCMH RTCLISPSS---TPOTCPNGODICF]

CSIRqKRVDLGCAATCPTVKTG-VDIQCCSTDNCNPFPTRKHP 71 "ELGCAATCPS-KKPYEEVTCCSTDKCNPHPKQRPG 74 CSIRdPVIEOGCVATCPOFRSNYRSLLCCTTDNCNH-------66

IRfiTIIERGCG—CPKVKP-GVKLNCCRTDRCNH-------65

¡GSRGTIIERGCG—CPKVKP-GVNLMCCRTDRCNN-------65

SD----HRGTIIERGCG—CPKVKP-GVNLHCCRTDRCNN-------61

50 60

Ser33

Gly35

Phe30

Cys27

а-неиротоксин

Ala29 а-нейротоксин I

Cys27

к-бунгаротоксин

Рис. 2. (А). Сравнение аминокислотных поледовательностей a-нейротоксинов яда змей и химерных токсинов. Аминокислотные остатки, локализованные на конце центральной петли, заключены в красный прямоугольник. Остатки Cys выделены желтым цветом. Остатки Ala/Lys в положении 29 выделены зеленым/красным цветом. (Б). Сравнение фрагментов центральных петель нейротоксина II, нейротоксина I и к-бунгаротоксина.

Для проверки этой гипотезы на основе короткого NTII было сконструировано два химерных длинных а-нейротоксина NTII/I и NTII/I[A29K]. Химерный токсин NTII/I был получен путем замены фрагмента центральной петли короткого токсина NTII на аналогичный фрагмент центральной петли длинного а-нейротоксина I из яда Naja oxiana. В химерный токсин NTII/I[A29K] была введена дополнительная замена остатка аланина в положении 29 на остаток лизина (Рис.2). Гены NTII/I и NTII/I[A29K] были получены методом сайт-направленного мутагенеза с помощью ПЦР. В качестве матрицы была использована плазмида pET22b(+)/STII/NTII.

Плазмиды, содержащие гены NTII/I и NTII/I[A29K], были названы pET22b(+)/STII/NTII/IupET22b(+)/STII/NTII/I[A29K], соответственно (Рис.3).

Экспрессионная система, разработанная ранее в лаборатории инженерии белка ИБХ РАН для бактериальной секреции NTII, была ■ адаптирована для продукции NTII/I и NTII/I[A29K], и позволила получить достаточные для структурно-функциональных исследований количества рекомбинантных токсинов. В этой системе NTII/I и NTII/I[A29K] синтезировали вместе с лидерным пептидом энтеротоксина II из E.coli, - STII. Наличие лидерного пептида определяло преимущественное накопление рекомбинантных токсинов в периплазматическом пространстве клеток Е. coli и в культуральной жидкости.

Наработку NTII/I и NTII/I[A29K] осуществляли в штамме BL21(DE3) Е. coli. Культивирование клеток, трансформированных соответствующей плазмидой, проводили в среде ТВ при 37°С до достижения плотности культуры показателя оптического поглощения 0.6 на длине волны 600 нм. Затем клетки центрифугировали в течение 15 мин при 1000 g и переносили в минимальную среду М9. Индуцировали экспрессию генов NTII/I и NTII/I[A29K] добавлением 0.05 мМ ИПТГ и продолжали культивирование в течение 15 часов при 37°С.

После культивирования клетки осаждали центрифугированием и продолжали работу с культуральной жидкостью. Очистку белков осуществляли в два этапа: с помощью хроматографии на смоле SP-Sepharose (GE Healthcare) и на смоле Ceramic

Рис. 3. Конструкция для секреции в Е. coli химерных токсинов NTII/I и NTII/I[А29К].

2. Биосинтез, выделение и очистка NTII/I и NTII/I[A29K)

hydroxiapatite (Bio-Rad). Конечные выходы химерных токсинов NTII/I и NTII/I[A29K] составили 1 мг/л и 5 мг/л, соответственно.

3. Анализ физико-химических свойств NTII/I и NTII/I[A29K]

Анализ химерных а-нейротоксинов NTII/I и NTII/I[A29K] методом деградации по Эдману показал, что полученные белки имеют Д'-концсвую последовательность идентичную последовательности NTII. Масс-спектрометрический анализ NTI, NTII, NTII/I и NTII/I[A29K] выявил соответствие экспериментальных масс теоретически рассчитанным. Чистота полученных химерных токсинов NTII/I и NTII/I[A29K] была проанализирована с помощью ВЭЖХ, и составила не менее 95% (Рис. 4). На рисунке видно, что время элюции химерных а-нейротоксинов NTII/I и NTII/I[A29K] находится в интервале между временами элюции природного NTII и природного NTI. При этом, химерный токсин NTII/I[A29K] сходил с колонки несколько раньше, что видимо, обусловлено понижением гидрофобности токсина, вызванным заменой

Рис. 4. ВЭЖХ анализ NTI, NTII, NTII/I и NTII/I[A29K]. Хроматография была выполнена на колонке Jupiter Cl8 (4.6Х250мм) в градиенте ацетонитрила 15-45% за 30 мин в присутствии 0,1% трифторуксусной кислоты. В качестве контрольных препаратов были использованы NTI и NTII, выделенные из яда Naja oxiana.

4. Исследование пространственной структуры химерных а-нейротоксинов

Все структурные исследования, описываемые в этой работе, были выполнены совместно с 3.0. Шенкаревым, научным сотрудником лаборатории биомолекулярной ЯМР спектроскопии ИБХ РАН. Фрагмент центральной петли, пересаженный в молекулу нейротоксина II из молекулы нейротоксина I, состоит из 7 остатков и содержит дополнительную дисульфидную связь. С целью установить возможные изменения в пространственной структуре химерных а-нейротоксинов,

остатка аланина на остаток лизина.

вызванные введением этой замены, было проведено исследование химерных нейротоксинов методами ЯМР-спектросконии. Анализ Ш 'Н ЯМР спектров рекомбинантных белков ЫТН/1 и ЫТШ1[А29К] выявил узкие линии сигналов и значительную дисперсию химических сдвигов ЫН-протонов. Большой сдвиг сигналов протонов некоторых алифатических боковых цепей в сильное поле свидетельствовало о пространственной сближености этих боковых цепей с ароматическими остатками, что часто наблюдается в р-структре. Сравнение 20 'Н-корреляционных ЯМР спектров рекомбинантного 15Ы-меченного N111 и химерного токсина N111/1 (Рис. 5А,Б) выявило практически полное совпадение химических сдвигов *Н и 15Ы для амидных групп общих остатков токсинов. Сравнение одномерного *Н ЯМР спектра химерного токсина ЭТП/1[А29К] с IIБОС спектром токсина N111/1 (Рис. 5В) показало, что точечная мутация А29К не приводит к изменению пространственной структуры химерного токсина. Таким образом, можно сделать вывод, что все исследуемые белки обладали жесткой пространственной структурой, схожей со структурой нейротоксина II.

110

■ 115

15М М.Д. ■120

125

■130

10 9 8 7 1Нм.д.

Рис. 5. (A). 'H-I5N HSQC спектр NTII. Сигналы NH групп соотнесены с номером остатка. Сигналы боковых цепей Тгр, Asn и Gin помечены буквой S. (Б). 'H-15N HSQC спектр NTII/I. Отнесение сигналов сделано по аналогии с панелью А. Дополнительные сигналы, возможно

соответствующие введенным в центральную петлю остаткам, заключены в кружок. (В). Область амидных сигналов 1D 'Н ЯМР спектра NTII/I[A29K],

39. ( 21. .58

41. 31

58. « „„

24» «29 .«59 S5

8- Ч 5. 45

54. 1в " " R1

4. 9 .10 J*"

60* . 7 -51 4936 27* 53 . 38 »46

в *17 47 • 2

»28 ,'37 . "26

'•27 . 35

15 34.-J >44 55*^32 J60.20 <я 3 .1в; 57 *2

5. Исследование биологической активности химерных токсинов

Исследования биологической активности, описываемые в этом разделе, были проведены совместно с сотрудниками лаборатории проф. Д. Бертрана кафедры нейробиологии медицинского факультета Центрального медицинского университета, Женева, Швейцария. Тестирование биологической активности химерных а-нейротоксинов NTII/I и NTII/I[A29K] проводили in vitro методами электрофизиологии, измеряя способность белковых препаратов ингибировать токи через ионные каналы нейрональных нАХР а7 и а3(32 типов, экспрессированных на поверхности ооцитов Xenopus laevis. Было показано, что оба химерных нейротоксина приобрели способность ингибировать нАХР а7 типа. Причем химерный токсин NTII/I оказался несколько активнее природного NTI по отношению к нейрональному нАХР а7 типа (IC50-6.1 нМ и 34 нМ, соответственно, Рис 6А,Б). Таким образом, в отличие от исходного короткого токсина NTII, химерный токсин NTII/I приобрел способность взаимодействовать с нАХР а7 типа, что подтвердило ключевую роль центральной петли длинных а-нейротоксинов в селективном взаимодействии с нейрональным нАХР а7 типа.

Многочисленные исследования указывают на то, что удлиненный С-концевой фрагмент длинных а-нейротоксинов возможно принимает участие во взаимодействии с нАХР а7 типа. Исследуемые в настоящей работе химерные а-нейротоксины были получены на основе короткого токсина NTII, не обладающего подобным фрагментом. Однако, наличие высокой активности химерного токсина NTII/I по отношению к нейрональному рецептору говорит о том, что, по крайней мере, для взаимодействия NTI с нАХР а7 типа не требуется наличия удлиненной С-концевой последовательности.

Предполагалось, что химерный токсин NTII/I[A29K] с заменой Ala/Lys приобретет способность взаимодействовать с нАХР аЗр2 типа. Однако электрофизиологические эксперименты показали, что введение вышеуказанной мутации в молекулу NTII/I не привело к возникновению активности по отношению к нАХР а3(32 типа. Кроме того, введение мутации Ala/Lys в молекулу NTII/I привело к снижению активности NTII/I[A29K] по отношению к нейрональному нАХР а.1

типа (1С50-126 нМ, Рис 6В). Полученные данные свидетельствуют о том, что во взаимодействии к-бунгаротоксина с нАХР аЗр2 типа ключевую роль играют другие аминокислотные остатки, локализованные не на конце центральной петли. Возможно, селективность действия к-бунгаротоксина на нАХР аЗр2 типа связана со склонностью этого токсина к димеризации.

Рис. 6. Ингибирование ионных токов, индуцированных добавлением ацетилхолина, в ооцитах Xenopus laevis, экспрессирующих нейрональный нАХР а7 типа препаратами NTI, NTII и химерными токсинами. (A). NTI ингибирует токи с константой ICso-34 нМ, в то время как NTII не вызывает подобного эффекта. (Б). Химерный токсин NTII/I ингибирует токи с константой IC50-6 нМ. (В). Химерный токсин NTII/I[A29K] ингибирует токи с константой ICso-126 нМ.

6. Моделирование комплексов химерных токсинов с нАХР

Молекулярное моделирование было выполнено совместно с Д.Ю. Мордвинцевым, сотрудником лаборатории рецепции нейропептидов ИБХ РАН. Модели пространственных структур химерных токсинов были построены методом моделирования по гомологии на основе трехмерных структур длинных а-нейротоксинов NTI и а-Cbtx и короткого а-нейротоксина NTII (PDB коды lntn, lctx, lnor, соответственно). Модели внеклеточных доменов нАХР а7 и аЗр2 типов были построены методом моделирования по гомологии на основе трехмерной структуры

ацетилхолин-связывающего белка (АХСБ) из моллюска Lymnaea stagnaüs (PDB код 1I9B). В экспериментах по докингу NTII и NTI с а7 и а3(32 нАХР было установлено, что стабильный комплекс образуется только в случае взаимодействия NTI с а7нАХР. Взаимодействие химерного токсина NTII/I было возможно как с а7нАХР, так и с аЗр2нАХР, но только комплекс cí7hAXP/NT1I/I был стабилен в течение молекулярно-динамического эксперимента с длиной траектории 10 не. Основные взаимодействия наблюдались между С-петлей рецептора и центральной петлей NTII/I, также как и в случае комплекса АХСБ/a-Cbtx (Bourne et al.,EMBO J., 2005). При этом между остатком Ala в положении 29 и остатками С-петли нАХР устанавливались слабые гидрофобные взаимодействия. Моделирование связывания NTII/I[A29K] с а7нАХР выявило, что остаток Lys в положении 29 не может участвовать в специфических взаимодействиях с остатками С-петли рецептора и отталкивается от положительно заряженного Lysl92 а7нАХР (Рис.7). Возможно, этот факт и объясняет уменьшение активности химерного токсина NTII/I[A29K] по отношению к а7нАХР. С другой стороны, результаты молекулярного моделирования позволяют предположить, что Lys29 способен взаимодействовать с отрицательно заряженной боковой цепью остатка Glu 190 из аЗ субъединицы нАХР а3(32 типа. Однако комплекс cc3(32hAXP/NTII/I[A29K.] был нестабилен в течение молекулярно-динамической траектории (10 не). Определенные энергии взаимодействия химерного токсина NTII/I[A29K] с нАХР а7 и а3(32 типов составили

и 340 кДж/моль/связывающий сайт,

Рис. 7. Модель взаимодействия химерных токсинов с а7 нАХР. Часть, относящаяся к молекуле NTII показана голубым цветом. Часть, относящаяся к молекуле NTI, показана розовым цветом. Одна субъединица нАХР (главная поверхность взаимодействия) показана белым цветом. Вторая субъединица нАХР (комплементарная поверхность взаимодействия) показана бежевым цветом. Показаны боковые цепи остатков NTII/I, NTII/I[A29K] и С-петли главной поверхности нАХР.

1400 кДж/моль/связывающий сайт соответственно.

II. Структурно-функциональные исследования «слабого» токсина и его мутантных форм

7. Экспрессирующие конструкции для продукции «слабого» токсина

Ранее в лаборатории инженерии белка ИБХ РАН были разработаны и успешно

применены две системы бактериальной продукции NTII и его изотопно-меченных

вариантов. В одной из этих систем нейротоксин нарабатывали в виде слитной

полипептидной цепи с тиоредоксином. Между последовательностями нейротоксина

и тиоредоксина был предусмотрен специальный линкер, содержащий сайты для

специфического гидролиза энтеропептидазой. Вторая система, более успешная с

точки зрения конечного выхода целевого белка, была предназначена для

бактериальной секреции нейротоксина. Именно эта система позволила получить

химерные нейротоксины NTII/I и NTIW[A29K],

В ходе работы обе системы (Рис. 8А,Б) были опробованы для бактериальной

продукции WTX. В первой системе гибридный белок WTX-тиоредоксин

накапливался в растворимой форме в цитоплазме. Был подобран протокол очистки

гибридного белка с помощью металл-аффинной хроматографии. Однако найти

условия специфического гидролиза слитного белка энтеропептидазой не удалось.

Возможно, это связано с тем, что молекула «слабого» токсина содержит

дисульфидную связь, образованную третьим и двадцать четвертым остатками

цистеина, что, видимо, создает стерические затруднения для работы

энтеропептидазы. Использование второй системы, разработанной для

бактериальной секреции, оказалось еще менее удачным, так как в этом случае выход

целевого белка был ничтожно мал (~ 50 мкг с 1 л бактериальной культуры).

Рис. 8. Схематическое изображение гена WTX в составе различных конструкций для бактериальной продукции «слабого» токсина. (А). Конструкция для продукции «слабого» токсина в виде слитной полипептидной цепи с тиоредоксином. (Б). Конструкция для секреции «слабого» токсина. В качестве лидерного пептида был использован пептид STII. (В). Конструкция для прямой экспрессии гена «слабого» токсина.

pET22b(*)/STII/WD<

В NAI Mal ИТХ StmH

-' 1Г

рЕтггь(*)/тх

В связи с этим на основе коммерческого вектора рЕТ22Ь(+) была разработана система для «прямой» экспрессии гена WTX (Рис. 8В), в результате которой рекомбинантный токсин накапливался в цитоплазме бактериальной клетки в виде телец включения. Все мутантные гены WTX были получены методами сайт-направленного мутагенеза с помощью ПЦР.

8. Биосинтез «слабого» токсина и его мутантных форм

Была разработана система продукции «слабого» токсина и его изотопно-меченого и мутантных вариантов в штамме BL21(DE3) Е. coli. С целью подбора оптимальных условий продукции WTX были опробованы различные концентрации ИПТГ в диапазоне 0,01-1 мМ и разные сроки культивирования клеток на среде ТВ после индукции (3, 9, 18, 24 и 36 ч). В качестве оптимальных параметров выбраны: концентрация ИПТГ 0.025 мМ (по достижении культурой плотности клеток, соответствующей значению оптической плотности 1.0 на длине волны 600 нм) и время культивирования клеток после добавления ИПТГ 18 ч. Проведенный с помощью SDS-ПААГ электрофореза анализ показал, что рекомбинантный WTX накапливался исключительно в тельцах включения.

Для продукции 15М-меченого «слабого» токсина клеточную культуру, предварительно выращенную на среде ТВ в колбах до оптической плотности 1.0 при 600 нм, осаждали в мягких условиях (1000 g). Клеточный осадок стерильно ресуспендировали в 1 л минимальной среды М9, содержащей в качестве источника азота [15И]хлорид аммония («CIL», США). Индукцию и дальнейшее выращивание проводили аналогично культивированию на среде ТВ.

9. Ренатурация «слабого» токсина из телец включения

Были опробованы различные подходы ренатурации «слабого» токсина из телец включения. (Рис. 9.) Варьировались следующие параметры: соотношение восстановленного глутатиона (GSH) и окисленного глутатиона (GSSG), pH среды, в которой происходит ренатурация и природа буферного состава среды. Также было исследовано влияние мочевины на ренатурацию токсина. В результате в качестве оптимальной среды для ренатурации был найден буфер следующего состава: 50 мМ

Тш/НСЛ, рН 8.5, содержащий 1.5 М мочевину и смесь 0511/0880 (3/0,3 мМ). Конечный выход ренатурированного токсина составил ~5 мг с литра бактериальной

Рис.9. Ренатурация \УТХ в различных условиях. Контроль осуществляли с помощью ВЭЖХ. Хроматографический профиль природного \УТХ везде обозначен звездочкой. (А). Анализ влияния концентрации С5Н/0550 на эффективность ренатурации WTX в фосфатном буфере, содержащем 05Н, ОЗБСЗ в молярных соотношениях 2:1, 4:1 и 10:1, рН 7.4, при 4°С (хроматографические профили 1-3, соответственно). (Б). Анализ влияния различных значений рН на эффективность ренатурации (хроматографические профили 1-5 соответствуют значениям рН 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5, соответственно). (В). Анализ влияния буферного состава среды на ренатурацию (хроматографические профили 1,2 соответствуют буферным системам на основе ЫаР1 и Тов/НСЛ, соответственно; хроматографический профиль 3 соответствует буферной системе Тпз/НО с добавлением 1.5 М мочевины, 4 - хроматографический профиль рекомбинантного \\ТХ после ренатурации и финальной рехроматографии с помощью ВЭЖХ).

Ренатурированный рекомбинантный «слабый» токсин был проанализирован с помощью масс-спектрометрии (Рис. 10.). Было показано, что экспериментальная масса рекомбинантного \¥ТХ (7750 Да) в пределах ошибки измерения совпадает с теоретически расчитанной массой, при этом экспериментальная масса природного токсина, выступавшего в качестве контроля, составила 7619 Да. Разница в значениях масс рекомбинантного и природного токсинов объясняется наличием у рекомбинантного токсина дополнительного остатка метионина на Л^-конце молекулы. Данные ВЭЖХ, БОБ-электрофореза в полиакриламидном геле, а также данные КД- и ЯМР-спектроскопии свидетельствуют о схожих свойствах рекомбинантного и природного \VTX- Полное замыкание всех дисульфидных связей в молекуле \УТХ после ренатурации было подтверждено с помощью реактива Элмана (5,5-дитио-бис(2-нитробензойная кислота).

культуры,

20 30 40 50 60 время алюции, мин

20 30 40 50 60 время элюции, мин

10. Анализ рекомбинантного «слабого» токсина

£ о

рекомбинантный 'слабый" "слабый" токсин токсин дикого типа

Рис. 10. Масс-спектрометрический анализ смеси природного и рекомбинантного «слабого» токсина. Вставка: электрофоретический анализ препаратов природного (/) и рекомбинантного (2) \\'ТХ, 3 -белки-маркеры молекулярных масс (116, 66, 45, 35, 25, 18,14 кДа).

—1---1-'-1---Г* ■ " ' I ' --1—--

7000 7200 7400 7600 7800 8000 т/г

11. Анализ пространственной структуры рекомбинантного «слабого»

токсина

Вторичная структура ренатурированного токсина была исследована методом КД-спектроскопии. Спектр рекомбинантного ренатурированного токсина был идентичен в пределах погрешности спектру природного токсина (рис.11А., точечная и пунктирная линии, соответственно) и указывал на преимущественно (3-структурную организацию молекулы токсина. Полученные оценки содержания различных элементов вторичной структуры рекомбинантного токсина (50% |3-структура, 40% неупорядоченная структура), примерно соответствовали данным, полученным для природного токсина (45% Р-структура, 50% неупорядоченная структура). При этом анализ вторичной структуры токсина с восстановленными дисульфидными связями показал наличие только неупорядоченной структуры (рис.11 А., точечно-пунктирная линия). Вероятно, формирование вторичной структуры «слабого» токсина происходит одновременно с замыканием дисульфидных связей. Возможно, именно это свойство нейротоксинов затрудняет бактериальную продукцию и последующую ренатурацию этих белков.

Качественный анализ пространственной структуры рекомбинантного токсина был проведен также с помощью метода 'Н ЯМР-спектроскопии. Полученный спектр рекомбинантного токсина (Рис. 11 Б,В) был практически идентичен спектру природного токсина. Наблюдаемые минорные изменения, возможно, связаны с различиями в протоколах очистки природного и рекомбинантного белков, приводящими к отличиям в солевом составе препаратов. Значительная дисперсия

химических сдвигов НЫ-протонов и сдвиг многих из этих сигналов в область слабого поля подтверждают преимущественно р-структурную организацию молекулы токсина. В то же время, расщепление НЫ сигнала боковой цепи единственного аминокислотного остатка триптофана в 36-ом положении, наблюдаемого в районе 10 м.д., на две линии с соотношением интегральных интенсивностей 1:1 указывает на наличие процесса конформационного обмена в молекуле токсина. Этот обменный процесс, наблюдаемый также и в природном токсине, происходит медленно по шкале времен ЯМР с характерным временем более 100 мс.

На основании полученных данных можно сделать вывод, что рекомбинантный токсин имеет не только пространственную организацию аналогичную организации природного «слабого» токсина, но и обладает молекулярно-динамическими свойствами природного токсина.

5 г

-10

Л А

'•«Л

,'А —'

\_ У

\ /

190 200

220

длина волны, ни

240 250

10 0 9 5 9 0 8 5 8 0 7.5 7 0 6 5 в.О 1Н м.д.

Рис. 11. (А). Анализ вторичной структуры рекомбинантного и природного \УТХ с помощью КД-спектроскопии. Пунктирной линией изображен спектр природного \УТХ, точечной линией изображен спектр ренатурированного рекомбинантного \УТХ, точечно-пунктирной линией изображен спектр рекомбинантного \УТХ с восстановленными дисульфидными связями. (Б), (В), 'Н ЯМР спектры природного и рекомбинантного \\П"Х, соответственно.

12. Исследование биологической активности «слабого» токсина

Исследования биологической активности, описываемые в этом разделе, были проведены совместно с И.Е. Кашеверовым, ведущим научным сотрудником лаборатории рецепции нейропептидов ИБХ РАН. Способность рекомбинантного токсина специфически взаимодействовать с мышечным нАХР и нейрональным а7нАХР была оценена по конкуренции с 1251-меченным а-бунгаротоксином за

связывание с мембранами из электрического органа Torpedo californica и клетками GH4C1, трансфецированными а7нАХР человека, соответственно (Рис. 12). В качестве сравнения использовали природный «слабый» токсин, выделенный из яда N. kaouthia. Анализ кривых ингибирования позволил определить значения IC50 для рекомбинантного «слабого» токсина и природного «слабого» токсина на мышечном рецепторе (рис.бА, 1С50 4.3±0.3 мкМ и 3.0±0.5 мкМ, соответственно) и нейрональном а7нАХР (рис.бБ, IC50 31±5 мкМ и 14.8±1.3 мкМ, соответственно). Активность рекомбинантного продукта оказалась несколько меньшей, чем у природного токсина, что возможно обусловлено наличием на N-конце молекулы рекомбинантного токсина дополнительного остатка метионина.

8 40 X

I 20 ф

5 о

ад, м

г? 100

i 80

1 60

^ 40

4 20

® 5 0

-ДО], М

Рис. 12. Кривые конкурентного ингибирования связывания I-a-бунгаротоксина с мембранами из электрического органа Torpedo californica, содержащими мышечный нАХР (А), и линией клеток GH4C1 содержащими а7нАХР человека (Б), построенные для рекомбинантного и природного «слабого» токсина.

13. Конструирование и исследование биологической активности мутантных вариантов «слабого» токсина

С целью исследования влияния основных структурных особенностей «слабого» токсина на функциональную активность с помощью сайт-направленного мутагенеза было сконструировано И мутантных вариантов \УТХ (Рис. 13). Основная структурная особенность «необычных» токсинов и в частности \УТХ, отличающая их от других а-нейротоксинов, - наличие дополнительной, пятой дисульфидной связи, расположенной в А'-концевой петле молекулы. С целью исследовать функциональную значимость наличия дисульфидной связи в А'-концевой петле

1 10 20 30 40 50 60

"слабый ■токсин" MLTCLNCPEMFC—GKFQICRNGEKICFKKLHQRRPLSWRYIRGCADTCPVG-KPYEMIECCSTDKCNR 66 c6s/c115 MLTCLNgpEMFg—GKFQICRNGEKICFKKLHQRRPLSWRYIRGCADTCPV-GKPYEMIECCSTDKCNR 66

w36a MLTCLNCPEMFC—GKFQICRNGEKICFKKLHQRRPLS§RYIRGCADTCPV-GKPYEMIECCSTDKCNR 66

p7a MLTCLNCjEMFC—GKFQICRNGEKXCFKKLHQRRPLSWRYIRGCADTCPVrGKPYEMIECCSTDKCNR 66

P33A MLTCLNCPEMFC—GKFQICRNGEKICFKKLHQRRÍLSWRYIRGCADTCPV-GKPYEMIECCSTDKCNR 66

p7a/p33a mltclncjemfc—gkfqicrngekicfkklhqrrJlswryirgcadtcpv-gkpyemieccstdkcnr 66

r31a mltclncpemfc—gkfqicrngekicfkklhqirplswryirgcadtcpvg-kpyemieccstdkcnr 66

r32a MLTCLNCPEMFC—GKFQICRNGEKICFKKLHQRlPLSWRYIRGCADTCPVG-KPYEMIECCSTDKCNR 66

r31a/r32a MLTCLNCPEMFC—GKFQICRNGEKICFKKLHOBPLSWRYIRGCADTCPVG-KPYEMIECCSTDKCNR 66

r31a/r32e mltclncpemfc—gkfqicrngekicfkklhqHplswryirgcadtcpvg-kpyemieccstdkcnr 66 r31e/r32a MLTCLNCPEMFC—GKFQICRNGEKICFKKLHQBPLSWRYIRGCADTCPVG-KPYEMIECCSTDKCNR 66

qrrplsw/reargt MLTCLNCPEMFC—GKFQICRNGEKICFKKLHggARG^-RYIRGCADTCPV-GKPYEMIECCSTDKCNR 65 кандоксин MKCKICNFDTCRAGELKVCASGEKYCFKESWREARGT-RIERGCAATCPKGSVYGLYVLCCTTDDCN 66

Рис. 13. Сравнение аминокислотных последовательностей «слабого» токсина, его мутантных форм и кандоксина (Bungarus Candidus). Введенные мутации выделены красным цветом. Желтым цветом обозначены остатки Cys.

WTX был сконструирован мутант C6S/C11S, в котором остатки Cys в N-концевой петле были заменены на остатки Ser. Ранее для коротких и длинных а-нейротоксинов было показано, что аминокислотные остатки, ответственные за взаимодействие с рецептором, расположены на конце центральной петли. Было выдвинуто предположение, что остаток ТгрЗб, расположенный на конце центральной петли WTX, может играть важную роль при взаимодействии с нАХР. Для проверки функциональной значимости этого остатка был сконструирован мутант W36A. Для исследования значимости заряженных аминокислотных остатков Arg31 и Arg32, также расположенных в центральной петле, были сконструированы следующие мутантные формы: R31A, R32A, R31A/R32A, R31A/R32E, R31E/R32A. Известно, что «слабый» токсин в растворе обладает конформационной гетерогенностью вследствие cis-trans изомерии пептидных связей Ххх-Pro. Для выяснения влияния этого свойства «слабого» токсина на биологическую активность были получены мутанты Р7А, РЗЗА и Р7А/РЗЗА. «Необычные» токсины, как правило, обладают слабой афинностью по отношению к нАХР мышечного типа. Однако для «необычного» токсина кандоксина из яда Bungarus Candidus значение 1С5о для нАХР из Torpedo californica составляет 50 нМ, что сопоставимо со значениями констант ингибирования, определяемых для коротких и длинных а-нейротоксинов. По аналогии с короткими и длинными а-нейротоксинами было выдвинуто предположение, что остатки, расположенные на конце центральной петли кандоксина, ответственны за высокое сродство токсина к рецептору. Для

проверки этого предположения, был получен химерный токсин, в котором участок центральной петли «слабого» токсина (Q30-W36) был заменен на аналогичный фрагмент кандоксина (REARGT). Предполагалось, что в случае истинности этого предположения мутант Q30RRPLSW36/REARGT будет обладать повышенным сродством к нАХР из Torpedo californica.

Способность мутантов «слабого» токсина специфически взаимодействовать с мышечным и нейрональным а7нАХР была оценена по конкуренции с 1251-меченным а-бунгаротоксином за связывание с мембранами из электрического органа Torpedo californica и клетками GH4C1, трансфецированными а7нАХР человека, соответственно (Табл. 1.). Анализ активности полученных мутантов выявил, что: 1) наличие дополнительной дисульфидной связи в первой петле снижает сродство WTX к обоим типам рецептора; 2) конформационная гетерогенность WTX не оказывает значительного влияния на активность токсина; 3) остаток ТгрЗб, находящийся на конце центральной петли токсина, важен только для взаимодействия с мышечным нАХР; 4) замена положительно заряженных остатков Arg в положениях 31 и 32 на нейтральные или отрицательно заряженные остатки негативно сказывается на активности «слабого» токсина по отношению к обоим типам рецептора, при этом одновременная замена обоих остатков Arg приводит к селективному исчезновению активности WTX по отношению к а7нАХР. Замена

Таблица. 1. Значения IC50, характеризующие взаимодействие «слабого» токсина и его мутантов с мышечным и нейрональным а7 нАХР, оцененные по конкуренции с 1251-меченным а-бунгаротоксином.

Мутанты «слабого» токсина ic50 мкМ Torpedo californica ICso мкМ п-7нАХР

Дикий тип 5.1+0.2 52+3

C6VC11S 1.8+0.1 18+1

QJ"RRPLS\V"7 REARGT 23.0+0.2 200+40

W36A 16.0+1.0 49+2

Р7А 7.9+0.3 30+1

РЗЗА 7.3+0.6 48+1

Р7А/РЗЗА 5.8+0.1 30+1

R31A 15.1+0.1 66+9

R32A 14.4+OJ 89+4

R31A/R32A 19.4+0 J »220

R31E/R32A 19.4+0.6 »125

R31A/R32E 15.8+0.2 »165

фрагмента центральной петли WTX на фрагмент центральной петли кандоксина также приводит к значительному уменьшению активности химерного токсина. Вероятно, за высокое сродство кандоксина с рецептором отвечают другие остатки.

14. ЯМР анализ влияния точечных мутаций «слабого» токсина на конформационную гетерогенность

Анализ спектров ЯМР ,5N -меченого аналога «слабого» токсина показал, что степень введения метки составляет не менее 97%. Полученный двумерный спектр этого препарата (Рис. 14) подтвердил наличие двух конформационных состояний в молекуле WTX. Методами ЯМР спектроскопии, используя 3D спектры 'H-15N-NOESY-HSQC и 'H-15N-T0CSY-HSQC, было получено практически полное отнесение сигналов токсина в воде при рН 5.5 (Рис. 14). Наибольшие различия химических сдвигов сигналов HN групп основной цепи между двумя формами пептида наблюдались для остатков, сближенных с остатками Рго7 и РгоЗЗ, в последовательности токсина.

Анализ 2D 'H-NOESY спектров «слабого» токсина

105

110

115

120

- 125 Ч

X г"

10.0 95 9.0 8.5 8.0 7.5 7.0 6.5

1н, М.Д.

Рис. 14. 'Н-'5М-П5С>С-спектр ЯМР '^-меченого «слабого» токсина (рН 5.5, 40°С). Сигналы формы токсина соответствующей ?га*к-конфигурации пептидной связи А^32-Рго33 показаны красным цветом. Сигналы ш-формы обозначены звездочками и показаны синим цветом. Сигналы NN и H2N групп боковых цепей обозначены знаком "в". Сигнал Н№| боковой цепи ТгрЗб обведен. Сигналы НИ групп основной цепи, для которых наблюдаются наибольшие различия в химических сдвигах между двумя формами пептида, соединены зелеными стрелками.

»NS

, »Я37

JÉ» „У!' Ü ' ' ^

"i -"А" .rJPe"

"J™ л

i'm"

"«¿сз ' ' f> -«rrfa

« b O HI в ,«>" ES 0 0F!,

R37 "E53

А4Э 139 -139 C87,

подтвердил, что наблюдаемая конформационная гетерогенность WTX обусловлена сг'.5-/гаи.$ изомерией пептидной связи А^32-Рго33.

Рис. 15. Фрагменты Ю 'Н-ЯМР спектров природного «слабого» токсина,

рекомбинантного «слабого» токсина и его мутантных форм. Показана область с сигналами Н™ боковой цепи ТгрЗб. Показано содержание конформационной формы токсина, соответствующей Гга/м-конфигурации

пептидной связи Ххх32-Ргс>33. Названия мутантных форм «слабого» токсина, не демонстрирующих конформационной

гетерогенности, подчеркнуты. В качестве контроля показан фрагмент спектра мутанта с заменой ТгрЗб/А1а.

Для изучения влияния точечных мутаций на процессы конформационного обмена в молекуле WTX были проанализированы 1D 'Н-ЯМР спектры мутантных форм токсина. Для оценки относительного содержания различных конформеров токсина в растворе, использовали сигналы протона HNd боковой цепи ТгрЗб, который демонстрировал разные химические сдвиги в двух конформациях WTX, содержащих пептидную связь Arg32-Pro33 в eis- и iraws-конфигурации (Рис. 15). Несмотря на меньшую полуширину сигнала H№1 ТгрЗб в /ra/w-конформере, интегральная интенсивность обоих сигналов была примерно одинакова, что указывало на приблизительно одинаковое содержание обеих конформационных форм. Как и ожидалось, при введении замены РгоЗЗ/Ala, сигнал, соответствующий cis-конфигурации пептидной связи Arg32-Pro33, переставал детектироваться в спектрах ЯМР. Размыкание дисульфидной связи в первой петле токсина путем

ТгрЗб н'1

WTX, дикий тип

Irans- с

WTX, рекомбинантный

WTX, R31E, R32A

»Avl

_/Va/\_

_/Aaa_

введения двойной замены Cys6/Ser и Cysl 1/Ser или введение мутации Рго7/А1а вело к изменению заселенноетей конформеров (рис. 15). При этом содержание формы токсина, имеющей ггага-конфигурацию пептидной связи Arg32-Pro33, возрастало до 60 и 65%, соответственно. Видимо, изменения в конформации первого петлевого участка токсина влияют на конформацию второй петли, содержащей остатки РгоЗЗ и ТгрЗб, что, возможно, указывает на пространственную сближенность фрагментов первой и второй петель токсина. Заметное увеличение заселенности trans-конформационной формы токсина (до 75%) также наблюдалось при введении замены Arg32/Ala. При этом, введение в положение 31 остатка Ala, равно как и замена Arg32/Glu не приводили к перераспределению заселенностей. Полученные результаты указывают на важность заряженного остатка в 32 положении (Arg или Glu) для стабилизации см-конфигурации пептидной связи Xxx32-Pro33.

Выводы

1. Получены гены химерных длинных а-нейротоксинов, созданных на основе нейротоксина II из яда Naja oxiana (NTII), путем введения в центральную петлю NTII дополнительных аминокислотных остатков, а также гены «слабого» токсина из яда Naja kaouthia (WTX), относящегося к классу «необычных» токсинов, и его мутантных вариантов. Разработанные эффективные схемы биосинтеза, выделения и очистки позволили наработать рекомбинантные а-нейротоксины, их мутантные и изотопно-меченные варианты в необходимых для исследования количествах.

2. Показано, что химерные а-нейротоксины, полученные на основе NTII, приобрели способность взаимодействовать с нАХР а7 типа, что подтвердило ключевую роль центральной петли длинных а-нейротоксинов в селективном взаимодействии с этим рецептором. Показано, что замена Ala/Lys в центральной петле длинных а-нейротоксинов не приводит к возникновению активности по отношению к нАХР a3ß2 типа.

3. Исследована биологическая активность рекомбинантного WTX и его мутантных вариантов по отношению к мышечному нАХР и нейрональному нАХР а7 типа.

Показано, что:

- удаление дополнительной дисульфидной связи в /У-концевой петле WTX увеличивает его сродство к рецепторам обоих типов;

- остаток ТгрЗб важен только для взаимодействия с нАХР мышечного типа;

- cis-trans изомерия пептидной связи Arg32-Pro33 в молекуле WTX, как и наличие остатка Рго7, не оказывает значительного влияния на биологическую активность токсина;

- заряженные остатки Arg31 и Arg32 центральной петли токсина важны для взаимодействия с нАХР мышечного и нейронального а7 типа, при этом замена обоих остатков аргинина приводит к селективной потере активности по отношению к нейрональному нАХР а 7 типа.

4. Методами спектроскопии ЯМР проведено полное отнесение сигналов в ЯМР спектрах 15Ы-меченого аналога WTX. Изучено влияние точечных мутаций WTX на конформационную гетерогенность токсина, обусловленную cis-trans изомерией пептидной связи Arg32-Pro33.

Основные научные результаты диссертации опубликованы в следующих

работах:

1. Dmitry Lesovoy, Eduard Bocharov, Ekaterina Lyukmanova, Yurij Kosinsky, Mikhail Shulepko, Dmitiy Dolgikh, Mikhail Kirpichnikov, Roman Efremov, and Alexander Arseniev. Specific membrane binding of neurotoxin II can facilitate its delivery to acetylcholine receptor. Biophys. J., 2009, 97, 2089-2097.

2. E.H. Лнжманова, M.A. Шулепко. P.B. Тихонов, 3.0. Шенкарев, A.H. Вульфсон, И.Е. Кашеверов, T.J1. Устич, Ю.Н. Уткин, А.С. Арсеньев, В.И. Цетлин, Д.А. Долгих, М.П. Кирпичников. Бактериальная продукция и ренатурация из телец включения «слабого» токсина, белка с высоким содержанием дисульфидных связей. Биохимия, 2009, 74(10), 1142-1149.

3. Е.Н. Люкманова, М.А. Шулепко. И.Е. Кашеверов, З.О. Шенкарев, К.С. Минаев, А.С. Парамонов, А.С. Арсеньев, Д.А. Долгих, В.И. Цетлин, М.П. Кирпичников. Структурно-функциональные исследования механизмов молекулярного действия эндогенных нейромодуляторов никотинового ацетилхолинового рецептора. Международная научная конференция по биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии, посвященная 75-летию со дня рождения академика Ю.А. Овчинникова. Москва-Пущино. 2009,130.

4. E.N. Lyukmanova, М.А. Shulepko. Z.O. Shenkarev, I. Kasheverov, Yu.N. Utkin, V.I. Tsetlin, D.A. Dolgikh, M.P. Kirpichnikov. Structure-functional investigation of 'weak' toxin from Naja kaouthia: bacterial production, refolding, mutagenesis and NMR study. J. Neurochem. 2009,1 lO(suppl.l), 81.

5. M.A. Shulepko. E.N. Lyukmanova, Z.O. Shenkarev, D.A. Dolgikh, M.P. Kirpichnikov. Effective bacterial expression of three-finger neurotoxins from snake venom. FEBS J. 2008, 275(suppl.l), 412.

6. E.H. Люкманова, З.О. Шенкарев, M.A. Шулепко. Г.С. Копеина, И.Е. Кашеверов, Д.М. Лесовой, Э.В. Бочаров, Ю. Косинский, В.И. Цетлин, Д.А. Долгих, А.С. Арсеньев, М.П. Кирпичников, Нейротоксины яда змей и никотиновый ацетилхолиновый рецептор: исследование лиганд-рецепторных взаимодействий. XX Зимняя международная молодежная научная школа "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии". Москва. 2008, 21.

7. E.N. Lyukmanova, М.А. Shoulepko. D.A. Dolgikh, M.P. Kirpichnikov. Bacterial Expression of Disulfide-Rich Snake Neurotoxins. Essential Protein Enginering Summit. Boston, USA. 2008, 219.

8. Ekaterina N. Lyukmanova, Zakhar O. Shenkarev, Alexey A. Schulga, Yaroslav S. Ermolyuk, Dmitry Yu. Mordvintsev, Yurii N. Utkin, Mikhail A. Shoulepko. Ron C.

Hogg, Daniel Bertran, Dmitry A. Dolgikh, Victor I. Tsetlin, and Mikhail P. Kirpichnikov. Bacterial Expression, NMR, and Electrophysiology Analysis of Chimeric Short/Long-chain a-Neurotoxins Acting on Neuronal Nicotinic Receptors. J. Biol. Chem., 2007,282(34), 24784-24791.

9. R.C. Hogg, E.N. Lyukmanova, Z.O. Shenkarev, A.A. Schulga, Y.S. Ermolyuk, D.Y. Mordvintsev, Y.N. Utkin, M.A. Shoulepko. D.Bertrand, D.A. Dolgikh, V.I. Tsetlin, M.P. Kirpichnikov. Investigation of the structural determinants underlying the receptor selectivity of short- and long-chain alpha-neurotoxins. 37th annual meeting of the Society for Neuroscience. USA. 2007.

10. Ekaterina N. Lyukmanova, Zakhar O. Shenkarev, Alexey A. Schulga, Yaroslav S. Ermolyuk, Dmitry Yu. Mordvintsev, Yurii N. Utkin, Mikhail A. Shulepko. Ron C. Hogg, Daniel Bertrand, Alexander S. Arseniev, Dmitry A. Dolgikh, Victor I. Tsetlin, and Mikhail A. Kirpichnikov. Heterologously expressed three-finger toxins for analysis of ligand-receptor interactions. Symposium, "Neuroreceptors: structure, mechanism of action and role in pathologies ". Moscow. 2007, 19.

11. Ekaterina N. Lyukmanova, Dmitry M Lesovoy, Mikhail A. Shulepko. Eduard V. Bocharov Yuri Kosinsky, Igor E. Kasheverov, Victor I. Tsetlin, Dmitry A. Dolgikh, Alexander S. Arseniev, Mikhail A. Kirpichnikov. Structural determinants of neurotoxin II binding to nicotincic acetylcholine receptor. NMR and mutagenesis study. International Symposium and Summer school, "4th Meeting NMR in life Sciences". Saint Petersburg. 2007, 89-90.

12. E.H. Люкманова, M.A. Шулепко. E.B. Крюкова, Ю.Н. Уткин, З.О. Шенкарев, В.И. Цетлин, Д.А. Долгих, М.П. Кирпичников. Бактериальная продукция слабого токсина из яда кобры Naja knaouthia. Международная конференция, "Новые информационные технологии в медицине, фармакологии, биологии и экологии ". Украина. 2007, 294.

Принято к исполнению 8.10.09 Исполнено 9.10.09 Заказ № 945 Тираж 100 экз. Рекламно-производственная компания "Дип-Грин" Москва, Миклухо-маклая 16/10.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Шулепко, Михаил Анатольевич

ОГЛАВЛЕНИЕ.

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ЧАСТЬ I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Глава 1. СТРУКТУРЫ И ФУНКЦИИ ТОКСИНОВ И НИКОТИНОВОГО АЦЕТИЛХОЛИНОВОГО РЕЦЕПТОРА.

1.1. Никотиновый ацетилхолиновый рецептор.

1.2. Механизм активации канала нАХР.

1.3. Структура никотинового ацетилхолинового рецептора.

1.4. Нейротоксины из яда змей.

1.5. Взаимодействие лигандов нАХР с рецептором и ацетилхолин-связывающим белком.

1.5.1. Структура лиганд-связывающего сайта ацетилхолин-связывающего белка.

1.5.2. Взаимодействие агонистов нАХР с ацетилхолин-связывающим белком.

1.5.3. Взаимодействие антагонистов с нАХР и с ацетилхолин-связывающим белком.

Глава 2. ПОЛУЧЕНИЕ а-НЕЙРОТОКСИНОВ IN VITRO.

2.1. Введение.

2.2. Продукция нейротоксинов в виде гибридных белков в E.coli.

2.3. «Прямая» экспрессия генов нейротоксинов в E.coli.

2.4. Секреция неротоксинов в E.coli.

ЧАСТЬ II. ЭСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Глава 3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

3.1 Материалы.

3.1.1. Реактивы и ферментные препараты.

3.1.2. Штаммы.

3.1.3. Плазмидные вектора.

3.1.4. Питательные .среды для роста бактериальных культур.

3.1.5. Синтетические олигонуклеотиды.

3.2. Методы.

3.2.1.Общие молекулярно-генетические методы.

3.2.2. Конструирование химерных длинных а-нейротоксинов.

3.2.3. Экспрессия генов химерных токсинов в секретирующей конструкции.

3.2.4. Выделение и очистка секретируемых нейротоксинов.

3.2.5. Анализ локализации рекомбинантных белков.

3.2.6. Получение конструкций для бактериальной продукции «слабого» токсина WTX

3.2.7. Секреция «слабого» токсина.

3.2.8. Продукция «слабого» токсина в виде слитной полипептидной цепи с тиоредоксином.

3.2.9. Выделение и очистка гибридного белка.

3.2.10. Продукция «слабого» токсина в виде тел включения в клетках Е. coli.

3.2.11. Отмывание телец включения.

3.2.12. Очистка «слабого» токсина из тел включения.

3.2.13. Ренатурация*«слабого» токсина.

3.2.14. ВЭЖХ нейротоксинов.

3.2.15. Методы структурных исследований.

3.2.15.1. Спектры 'Н-ЯМР.

3.2.15.2. Получение двумерных и трехмерных гетероядерных ЯМР-спектров.

3.2.16. Методы биологических исследований. f 3.2.16.1. Ингибирование химерными а-нейротоксинами ионных токов в ооцитах

Xenopus laevis.

3.2.16.2. Взаимодействие рекомбинантного \¥ТХ с мембранами из электрического органа ската Т-огрес1о саНАэгшса.

3.2.16.3. Взаимодействие рекомбинантного \\ГГХ с клетками СТ^Сь трансфецированными а7нАХР человека.

3.2.17. Моделирование химерных нейротоксинов и их комплексов с нАХР.

Глава 4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

4.1. Исследование влияния точечной замены АЫЬуэ в центральной петле длинных анейротоксинов на взаимодействие с нейрональным нАХР аЗр2 типа.

4.1.1. Конструирование химерных длинных а-нейротоксинов.

4.1.2. Биосинтез, выделение и очистка ]МТП/1 и 1МТП/1[А29К].

4.1.3. Анализ физико-химических свойств 1чГГП/1 и НТПЯ[А29К].

4.1.4. Исследование пространственной структуры химерных а-нейротоксинов.

4.1.5. Исследование биологической активности химерных токсинов.

4.1.6. Моделирование комплексов химерных токсинов с нАХР.

4.2. Структурно-функциональные исследования «слабого» токсина и его мутантных форм.

4.2.1. Экспрессирующие конструкции для продукции «слабого» токсина.

4.2.2. Биосинтез «слабого» токсина и его мутантных форм.

4.2.3. Ренатурация «слабого» токсина из телец включения.

4.2.4. Анализ рекомбинантного «слабого» токсина.

4.2.5. Анализ пространственной структуры рекомбинантного «слабого» токсина.

4.2.6. Исследование биологической активности «слабого» токсина.

4.2.7. Конструирование и исследование биологической активности мутантных вариантов «слабого» токсина.

4.2.8. ЯМР-анализ влияния точечных мутаций «слабого» токсина на конформационную гетерогенность.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Исследование лиганд-рецепторных взаимодействий на примере никотинового ацетилхолинового рецептора и токсинов из яда змей"

Никотиновый ацетилхолиновый рецептор (нАХР) представляет собой лиганд-зависимый ионный канал, встроенный в постсинаптическую мембрану нейронов, и является одним из наиболее распространенных рецепторов центральной и периферической нервных систем млекопитающих. В зависимости от локализации рецепторы семейства нАХР подразделяются на два больших класса: мышечные и нейрональные. а-Нейротоксины яда змей известны как высокоспецифичные конкурентные ингибиторы нАХР. Эти белки имеют характерную «трехпетельную» Р-структуру, стабилизированную 4-5 дисульфидными связями. Небольшие размеры и жесткая структура делают а-нейротоксины удобными инструментами для исследования свойств нАХР. Со структурной точки зрения а-нейротоксины из яда змей можно подразделить на 3 класса: короткие, длинные и «необычные» нейротоксины. Короткие и длинные а-нейротоксины эффективно ингибируют нАХР мышечного типа, однако только длинные а-нейротоксины с пятой дисульфидной связью в центральной петле эффективно взаимодействуют с нАХР нейронального типа. Мишенями действия «необычных» токсинов с пятой дисульфидной связью, локализованной в 1\[-концевой петле, выступают как мышечные нАХР, так и нейрональные нАХР, а также мускариновые ацетилхолиновые рецепторы, относящиеся к семейству в-белок сопряженных рецепторов.

1. Получить гены химерных длинных а-нейротоксинов, созданных на основе нейротоксина II из яда Naja oxiana (NTII) путем введения в последовательность NTII дополнительных аминокислотных остатков, и «слабого» токсина из яда Naja kaouthia (WTX, weak toxin), относящегося к классу «необычных» токсинов.

5. Исследовать влияние конформационной гетерогенности в молекуле WTX на функциональную активность.

Научная новизна и практическая значимость работы. Все результаты, изложенные в настоящей диссертационной работе, получены впервые.

1. На примере химерных длинных а-нейротоксинов впервые исследовано влияние точечной мутации Ala/Lys в центральной петле длинных а-нейротоксинов на взаимодействие с нейрональным нАХР a3ß2 типа.

2. Впервые разр'аботана эффективная система продукции «слабого» токсина из яда Naja kaouthia. Впервые разработаны протоколы выделения и очистки рекомбинантного WTX.

4. Впервые получен 15М-меченный WTX и проведено полное отнесение сигналов в ЯМР спектрах токсина.

5. Впервые изучено влияние точечных мутаций WTX на конформационную гетерогенность молекулы токсина.

ЧАСТЬ I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Шулепко, Михаил Анатольевич

выводы

Показано, что:

- удаление дополнительной дисульфидной связи в N-концевой петле WTX увеличивает его сродство к рецепторам обоих типов;

- остаток ТфЗб важен только для взаимодействия с нАХР мышечного типа;

- заряженные остатки А^31 и А^32 центральной петли токсина важны для взаимодействия с нАХР мышечного и нейронального а7 типа, при этом замена обоих остатков аргинина приводит к селективной потере активности по отношению к нейрональному нАХР а7 типа.

4. Методами спектроскопии ЯМР проведено полное отнесение сигналов в ЯМР спектрах 15М-меченого аналога \¥ТХ. Изучено влияние точечных мутаций \\ТХ на конформационную гетерогенность токсина, обусловленную ш-Кат изомерией пептидной связи А^32-Рго33.

БЛАГОДАРНОСТИ

Мне хотелось бы выразить глубокую благодарность и искреннюю признательность своим научным руководителям к.б.н. Екатерине Назымовне Люкмановой и профессору д.б.н. Дмитрию Александровичу Долгих, а также декану Биологического факультета МГУ академику Михаилу Петровичу Кирпичникову, которые обеспечили возможность выполнения настоящей диссертационной работы, оказывали всевозможную помощь и поддержку и проявляли неустанное благожелательное внимание на протяжении всего времени моей работы в лаборатории.

Приношу свою глубокую благодарность сотрудникам лаборатории биомолекулярной ЯМР спектроскопии ИБХ РАН к.ф-м.н. Захару Олеговичу Шенкареву и к.ф-м.н. Александру Сергеевичу Парамонову, а также руководителю лаборатории профессору, д.х.н. Александру Сергеевичу Арсеньеву за неоценимую помощь в исследовании полученных белков методами ЯМР-спектроскопии.

Выражаю свою искреннюю признательность руководителю лаборатории рецепции нейропептидов ИБХ РАН, член-корреспонденту РАН Виктору Ионовичу Цетлину, а также сотрудникам лаборатории д.х.н. Игорю Евгеньевичу Кашеверову и д.б.н. Юрию Николаевичу Уткину за огромную помощь в исследовании биологических свойств и тестировании активностей полученных белков.

Приношу свою глубокую благодарность Даниэлю Бертрану, профессору кафедры нейробиологии медицинского факультета Центрального медицинского университета, Женева, Швейцария.

Хочу поблагодарить всех сотрудников лаборатории инженерии белка ИБХ РАН за поддержку и дружелюбие, неизменно помогавшее мне на всем пути выполнения диссертационной работы.

Отдельную благодарность хочу выразить сотрудникам кафедры биоинженерии биологического факультета МГУ и ее руководителю д.ф-м.н. Константину Вольдемаровичу Шайтану за своевременную помощь и внимание, оказываемое во время выполнения диссертационной работы.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Полученные в диссертационной работе результаты демонстрируют важное значение аминокислотных остатков, расположенных в петлевых участках а-нейротоксинов для селективного взаимодействия с никотиновыми ацетилхолиновыми рецептороми. В рамках работы на примере полученных химерных а-нейротоксинов было подтверждено, что различие в специфичности действия а-нейротоксинов из ядов змей на нАХР а7 типа обусловлено аминокислотными остатками, расположенными на конце центральной петли токсинов. В то же время за взаимодействие а-нейротоксинов с другими типами нАХР могут быть ответственны и другие участки молекул токсинов. Так химерный токсин, >Ш1/1[А29К], полученный с целью проверить теорию [134] о том, что замена А1а/ЬуБ в центральной петле длинных а-нейротоксинов приводит к возникновению активности по отношению к нАХР а3|32 типа, не приобрел способности к специфическому взаимодействию с этим рецептором. На основе данных, полученных в результате работы по сайт-направленному мутагенезу "слабого" нейротоксина \¥ТХ, было показано, что кроме остатков центральной петли, другие аминокислотные остатки, также могут иметь важное значение для взаимодействия как с нейрональным, так и с мышечным нАХР.

Результаты диссертационной работы указывают на возможность создания новых пептидных молекул, селективно действующих на отдельные подтипы мембранных рецепторов, что имеет фундаментальное и практическое значение для современной медицины и фармакологии.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Шулепко, Михаил Анатольевич, Москва

1. Hucho F., Weise C., Ligand-Gated Ion Charm ells. Angew Chem, 2001. 40: p. 3100-3116.

2. Gotti C., Moretti M., Gaimarri A., Zanardi A., Clementi F., Zoli M., Heterogeneity and complexity of native brain nicotinic receptors. Biochem Pharmacol, 2007. 74(8): p. 1102-11.

3. Nashmi R., Lester .H., CNS localization of neuronal nicotinic receptors. J Mol Neurosci, 2006. 30(1-2): p. 181-4.

4. McKay B.E., Placzek A.N., Dani J. A., Regulation of synaptic transmission and plasticity by neuronal nicotinic acetylcholine receptors. Biochem Pharmacol, 2007. 74(8): p. 1120-33.

5. Martin-Ruiz C.M., Haroutunian V.H., Long P., Young A.H., Davis K.L., Perry E.K., Court J.A., Dementia rating and nicotinic receptor expression in the prefrontal cortex in schizophrenia. Biol Psychiatry, 2003. 54(11): p. 1222-33. '

6. Scheffer LE., Bhatia K.P., Lopes-Cendes I., Fish D.R., Marsden C.D., Andermann F., Andermann E., Desbiens R., Cendes F., Manson J.I., Autosomal dominant frontal epilepsy misdiagnosed as sleep disorder. Lancet, 1994. 343(8896): p. 515-7.

7. Hogg R.C. and Bertrand D., Regulating the regulators: the role of nicotinic acetylcholine receptors in human epilepsy. Drug News Perspect, 2003. 16(5): p. 261-6.

8. Moulard B., Picard F., Hellard S., Agulhon C,.Weiland S., Favre I., Bertrand S., Malafosse A., Bertrand D., Ion channel variation causes epilepsies. Brain Res Brain Res Rev, 2001. 36(2-3): p. 275-84.

9. Hogg R.C. and Bertrand D., Neuronal nicotinic receptors and epilepsy, from genes to possible therapeutic compounds. Bioorg Med Chem Lett, 2004. 14(8): p. 18.59-61.

10. Hogg R.C. and Bertrand D., Neuroscience. What genes tell us about nicotine addiction. Science, 2004. 306(5698): p. 983-5.

11. Changeux, J.P., Nicotinic receptors and nicotine addiction. C R Biol, 2009. 332(5): p. 421-5.

12. Dohrman D.P. and Reiter C.K., Ethanol modulates nicotine-induced upregulation ofnAChRs. Brain Res, 2003. 975(1-2): p. 90-8.

13. Shen X.M., Ohno K., Tsujino A., Brengman J.M., Gingold M., Sine S.M., Engel A.G., Mutation causing severe myasthenia reveals functional asymmetry of AChR signature cystine loops in agonist binding and gating. J Clin Invest, 2003. 111(4): p. 497-505.

14. Sine S.M., Ohno K., Bouzat C., Auerbach A., Milone M., Pruitt J.N., Engel A.G., Mutation of the acetylcholine receptor alpha subunit causes a slow-channel myasthenic syndrome by enhancing agonist binding affinity. NEURON, 1995. 15(1): p. 229-39.

15. Weiland S., Bertrand D. and Leonard S., Neuronal nicotinic acetylcholine receptors: from the gene to the disease. Behav Brain Res, 2000. 113(1-2): p. 43-56.

16. Martin-Ruiz C.M., Lee M., Perry R.H., Baumann M., Court J.A., Perry E.K., Molecular analysis of nicotinic receptor expression in autism. Brain Res Mol Brain Res, 2004.' 123(1 -2): p. 81-90.

17. Hogg R.C., Raggenbass M., Bertrand D., Nicotinic acetylcholine receptors: from structure to brain function. Rev Physiol Biochem Pharmacol, 2003. 147: p. 1-46.

18. Egleton R.D., Brown K.C., Dasgupta P., Angiogenic activity of nicotinic acetylcholine receptors: implications in tobacco-related vascular diseases. Pharmacol Ther, 2009. 121(2): p. 205-23.

19. Changeux J.P. and Taly A., Nicotinic receptors, allosteric proteins and medicine. Trends Mol Med, 2008.14(3): p. 93-102.

20. Changeux J.P. and Edelstein S.J., Allosteric mechanisms of signal transduction. Science, 2005. 308(5727): p. 1424-8.

21. Tsetlin VI., Hucho F., Snake and snail toxins acting on nicotinic acetylcholine receptors: fundamental aspects and medical applications FEBS lett, 2004. 557 p. 9-13

22. Lai R. and Yu L., Atomic force microscopy of cloned nicotinic acetylcholine receptor expressed in Xenopus oocytes. Proc Natl Acad Sci USA, 1993. 90(15): p. 7280-4.

23. Rigler P., Ulrich W.P., Hovius R., Downscaling Fourier transform infrared spectroscopy to the micrometer and nanogram scale: secondary stmcture of serotonin and acetylcholine receptors. Biochemistry, 2003. 42(47): p. 14017-22. "

24. Schapira M., Abagyan R. and Totrov M., Structural model of nicotinic acetylcholine receptor isotypes bound to acetylcholine and nicotine. BMC Struct Biol, 2002. 2: p. 1.

25. Unwin, N., The nicotinic acetylcholine receptor of the Torpedo electric ray. J Struct Biol, 1998.121(2): p. 181-90.

26. Unwin, N.,. Structure and action of the nicotinic acetylcholine receptor explored by electron microscopy. FEBS lett, 2003. 555(1): p. 91-5.

27. Unwin N., Miyazawa A., Li J., Fujiyoshi Y., Activation of the nicotinic acetylcholine receptor involves a switch in conformation of the alpha subunits. J Mol Biol, 2002. 319(5): p. 1165-76.

28. Wise D.S., Schoenborn B.P. and Karlin A., Structure of acetylcholine receptor dimer determined by neutron scattering and electron microscopy. J Biol Chem; 1981. 256(8): p. 4124-6.

29. Wise D.S., Wall J. and Karlin A., Relative locations of the beta and delta chains of the acetylcholine receptor determined by electron microscopy of isolated receptor (rimer. J Biol Chem, 1981. 256(24): p. 12624-7.

30. Yao Y., Wang J., Viroonchatapan N., Samson A., Chill J., Rothe E., Anglister J., Wang Z.Z., Yeast expression and NMR analysis of the extracellular domain of muscle nicotinic acetylcholine receptor alpha subunit. J Biol Chem, 2002. 277(15): p. 12613-21.

31. Fischer M.^Corringer P.J., Schott K., Bâcher A., Changeux J. P., A method for soluble overexpression of the alpha7 nicotinic acetylcholine receptor extracellular domain. Proc Natl Acad Sci U S A, 2001. 98(6): p. 3567-70.

32. Mishina M., Structure and function of the nicotinic acetylcholine receptor. Seikagaku, 1986. 58(10): p. 1275-91.

33. Tank D.W., Huganir R.L., Greengard P., Webb W.W., Patch-recorded single-channel currents of the purified and reconstituted Torpedo acetylcholine receptor. Proc Natl Acad Sci USA, 1983. 80(16): p. 5129-33.

34. Unwin N., Refined structure of the nicotinic acetylcholine receptor at 4A resolution J Mol Biol, 2005. 346(4): p. 967-8

35. Anand R., Conroy, Schoepfer W.G., Whiting R., Lindstrom P., J. Neuronal nicotinic acetylcholine receptors expressed in Xenopus oocytes have a pentameric quaternary structure. J Biol Chem, 1991. 266(17): p. 11192-8.

36. Boorman J.P., Groot-Kormelink P.J. and Sivilotti L.G., Stoichiometry of human recombinant neuronal nicotinic receptors containing the b3 subunit expressed in Xenopus oocytes. J Physiol, 2000. 529 Pt 3: p. 565-77.

37. Groot-Kormelink P.J., Boorman J.P. and Sivilotti L.G., Formation of functional alpha3beta4alpha5 human neuronal nicotinic receptors in Xenopus oocytes: a reporter mutation approach. Br J Pharmacol, 2001. 134(4): p. 789-96.

38. Groot-Kormelink P.J., Luyten W., Colquhoun H., Sivilotti L.G., A reporter mutation approach shows incorporation of the "orphan " subunit beta3 into a functional nicotinic receptor. J Biol Chem, 1998. 273(25): p. 15317-20.

39. Ramirez-Latorre J., Yu C.R., Qu X., Perin F., Karlin A., Role L., Functional contributions of alpha5 subunit to neuronal acetylcholine receptor channels. Nature, 1996. 380(6572): p. 347-51.

40. Corringer, P.J., Le Novere N. and Changeux J.P., Nicotinic receptors at the amino acid level. Annu Rev Pharmacol Toxicol, 2000. 40: p. 431-58.

41. McGehee D.S. and Role L.W., Physiological diversity of nicotinic acetylcholine receptors expressed by vertebrate neurons. Annu Rev Physiol, 1995. 57: p. 521-46.

42. Galzi J.L. and Changeux J.P., Neuronal nicotinic receptors: molecular organization and regulations. Neuropharmacology, 1995. 34(6): p. 563-82.

43. Huganir R.L. and Greengard P., Regulation of neurotransmitter receptor desensitization by protein phosphorylation. NEURON, 1990. 5(5): p. 55567.

44. Beroukhim R. and Unwin N., Three-dimensional location of the main immunogenic region of the acetylcholine receptor. NEURON, 1995. 15(2): p. 323-31.

45. Unwin, N., Acetylcholine receptor channel imaged in the open state. Nature, 1995. 373(6509): p. 37-43.

46. Miyazawa A., Fujiyoshi Y., Stowell M., Unwin N., Nicotinic acetylcholine receptor at'4.6 A resolution: transverse tunnels in the channel wall. J Mol Biol, 1999. 288(4): p. 765-86.

47. Miyazawa A., Fujiyoshi Y. and Unwin N., Structure and gating mechanism of the acetylcholine receptor pore. Nature, 2003. 423(6943): p. 949-55.

48. West A.P., Bjorkman P.J., Dougherty D.A., Lester H.A., Expression and circular dichroism studies of the extracellular domain of the alpha submit of the nicotinic acetylcholine receptor. J Biol Chem, 1997. 272(41): p. 25468-73. "

49. Brejc K., van Dijk W.J., Klaassen R.V., Schuurmans M., van Der Oost J., Smit A.B., Sixma T.K., Crystal structure of an ACh-binding protein reveals the ligand-binding domain of nicotinic receptors. Nature, 2001. 411(6835): p. 269-76.

50. Celie P.H., van Rossum-Fikkert S.E., van Dijk W.J., Brejc K., Smit A.B., Sixma T.K., Nicotine and carbamylcholine binding to nicotinic acetylcholine receptors as studied in AChBP crystal structures. NEURON, 2004. 41(6): p. 907-14.

51. Ulens C., Hogg R.C., Celie P.H., Bertrand D., Tsetlin V., Smit A.B., Sixma T.K., Structural determinants of selective alpha-conotoxin binding to a nicotinic acetylcholine receptor homolog AChBP. Proc Natl Acad Sci U S A, 2006. 103(10): p. 3615-20.

52. Costa V., Nistri A., Cavalli A., Carloni P., A structural model of agonist binding to the alpha3beta4 neuronal nicotinic receptor. Br J Pharmacol, 2003.140(5): p. 921-31.

53. Tasneem A., Iyer L.M., Jakobsson E., Aravind L., Identification of the prokaryotic ligand-gated ion channels and their implications for the mechanisms and origins of animal Cys-loop ion channels. Genome Biol, 2005. 6(1):.p. R4.

54. Kasai M., Changeux J.P., Monnerie L., In vitro interaction of 1-anilino 8 naphthalene sulfonate with excitable membranes isolated from the electric organ of Electrophorus electricus. Biochem Biophys Res Commun, 1969. 36(3): p. 420-7.

55. Miledi R., Molinoff P, Potter L.T., Isolation of the cholinergic receptor protein of Torpedo electric tissue. Nature, 1971. 229(5286): p. 554-7.

56. Lindstrom J., Nicotinic acetylcholine receptors in health and disease. Mol Neurobiol, 1997. 15(2): p. 193-222.

57. Chang C.C., Looking back on the discovery of alpha-bungarotoxin. J Biomed Sci, 1999. 6(6): p. 368-75.

58. Lee C.Y., Chemistry and pharmacology of polypeptide toxins in snake venoms. Annu Rev Pharmacol, 1972. 12: p. 265-86.

59. Chang., The action of snake venoms on nerve and muscle Snake venoms, Handbook vf experimental pharmacology 1979.Vol. 52 Berlin: SpringerVerlag; p. 309-376.

60. Karlsson., Chemistry of protein toxins in snake venom Snake venoms, Handbook of experimental pharmacology 1979. Vol. 52159-212.

61. Rowan E.G., What does beta-bungarotoxin do at the neuromuscidar junction? Toxicon, 2001. 39(1): p. 107-18.

62. Yang, Structure-function relationship of phospholipase A2 from snake venoms. J Toxicol Toxin Rev., 1994.

63. Cervenansky C, Harvey D.F., Karlsson A.L., Fasciculins,anticholinesterase toxins from mamba venoms: biochemistry and pharmacology. Harvey AL, editor. Snake toxins., 1991: p. p. 303-321.

64. Chiappinelli V.A., Weaver W.R., McLane K.E., Conti-Fine B.M., Fiordalisi J.J., Grant G.A., Binding of native kappa-neurotoxins and site-directed mutants to nicotinic acetylcholine receptors. Toxicon, 1996. 34(11-12): p. 1243-56.

65. Bradley K.N., Muscarinic toxins from the green mamba. Pharmacol Ther, 2000. 85(2): p. 87-109.

66. Jerusalinsky D., Kornisiuk E., Alfaro P., Quillfeldt J., Ferreira A., Rial V.E., Duran R.C, Ervenansky C., Muscarinic toxins: novel pharmacological tools for the muscarinic cholinergic system. Toxicon, 2000. 38(6): p. 747-61.

67. Dutton J.L. and Craik D.J., alpha-Conotoxins: nicotinic acetylcholine receptor antagonists as pharmacological tools and potential drag leads. Curr Med Chem, 2001. 8(4): p. 327-44.

68. Mcintosh J.M., Gardner S., Luo S., Garrett J.E., Yoshikami D., Conns peptides: novel probes for nicotinic acetylcholine receptor structure and function. Eur J Pharmacol, 2000. 393(1-3): p. 205-8.

69. Mcintosh J.M., Santos A.D, Olivera B.M., Conus peptides targeted to specific nicotinic acetylcholine receptor subtypes. Annu Rev Biochem, 1999. 68: p: 59-88.

70. Kini R.M., Molecular moulds with multiple missions: functional sites in three-finger toxins. Clin Exp Pharmacol Physiol, 2002. 29(9): p. 815-22.

71. Menez A., Functional architectures of animal toxins: a clue to drug design? Toxicon, 1998. 36(11): p. 1557-72.

72. Servent D., Menez. A., Snake neurotoxins that interact with nicotinic acetylcholine receptors. 2001. Vol. 1.: p. p. 385-425.

73. Tsetlin V., 'Snake venom alpha-neurotoxins and other 'three-finger'proteins. Eur J Biochem, 1999. 264(2): p. 281-6.

74. Hodgson W.C., Wickramaratna J.C., In vitro neuromuscidar activity of snake venoms. Clin Exp Pharmacol Physiol, 2002. 29(9): p. 807-14.

75. Menez A., Servent D., Gasparini S., The binding sites of animal toxins involve two components: a clue for selectivity, evolution and design of proteins? Menez A, editor. Perspectives in molecular toxinology, 2002: p. 175-200.

76. Endo T, Tamiya N., Structure-function relationships of postsynaptic neurotoxins from snake venoms. In: Harvey AL, editor. Snake toxins., 1991: p. 165-222.

77. Nirthanan S., Gopalakrishnakone P., Gwee M.C., Khoo H.E., Kini R.M., Non-conventional toxins from Elapid venoms. Toxicon, 2003. 41(4): p. 397407.

78. Fruchart-Gaillard C., Mourier G., Marquer C., Menez A., Servent D., How three-finger-fold toxins interact with various cholinergic receptors. J Mol Neurosci, 2006. 30(1-2): p. 7-8.

79. Chicheportiche R., Vincent J.P., Kopeyan C., Schweitz H., Lazdunski M., Structure-function relationship in the binding of snake neurotoxins to the torpedo membrane receptor. Biochemistry, 1975. 14(10): p. 2081-91.

80. Mebs D. and Claus I., Amino acid sequences and toxicities of snake venom components, in Shake toxins, A.L. Harvey, Editor. 1991, Pergamon Press: New York. p. 425-447.

81. Kim, H.S. and N. Tamiya, Amino acid sequences of two novel long-chain neurotoxins from the venom of the sea snake Laticaudci colubrina. Biochem J, 1982. 207(2): p. 215-23.

82. Fleming T.J., O'HUigin C. and Malek T.R., Characterization of two novel Ly-6 genes. Protein sequence and potential structural similarity to alpha-bungarotoxin and other neurotoxins. J Immunol, 1993. 150(12): p. 5379-90.

83. Gumley T.P., McKenzie I.F. and Sandrin M.S., Tissue expression, structure and function of the murine Ly-6 family of molecules. Immunol Cell Biol, 1995. 73(4); p." 277-96.

84. Hanninen A., Jaakkola I., Salmi M., Simell O., Jalkanen S., Ly-6C regulates endothelial adhesion and homing of CD8(+) T cells by activating integrin-dependent adhesion pathways. Proc Natl Acad Sci USA, 1997. 94(13): p. 6898-903.

85. Miwa J.M., Ibanez-Tallon I., Crabtree G.W., Sanchez R., Sali A., Role L.W., Heintz N., lynxl, an endogenous toxin-like modulator of nicotinic acetylcholine receptors in the mammalian CNS. NEURON, 1999. 23(1): p. 105-14.

86. Ibanez-Tallon I., Miwa J.M., Wang H.L., Adams N.C., Crabtree G. W., Sine S.M., Heintz N., Novel modulation of neuronal nicotinic acetylcholine receptors by association with the endogenous pro to toxin lynxl. NEURON, 2002.33(6): p. 893-903.

87. Choo Y.M., Lee B.H., Lee K.S., Kim B.Y., Li J., Kim J.G., Lee J.H., Sohn H.D., Nah S.Y., Jin B.R., Pr-lynxl, a modidator of nicotinic acetylcholine receptors in the insect. Mol Cell Neurosci, 2008. 38(2): p. 224-35.

88. Bouadjar B., Benmazouzia S., Prud'homme J.F., Cure S., Fischer J., Clinical and genetic studies of 3 large, consanguineous, Algerian families with Mai de Meleda. "Arch Dermatol, 2000. 136(10): p. 1247-52.

89. Arredondo' J., Chernyavsky A.I., Webber R.J., Grando S.A., Biological effects of SLURP-1 on human keratinocytes. J Invest Dermatol, 2005. 125(6): p. 1236-41.

90. Tsuji H., Okamoto K., Matsuzaka Y., Iizuka H., Tamiya G., Inoko H., SLURP-2, a novel member of the human Ly-6 superfamily that is up-regulated in psoriasis vulgaris. Genomics, 2003. 81(1): p. 26-33.

91. Arredondo J., Chernyavsky A.I., Jolkovsky D.L., Webber R.J., Grando S.A., SLURP-2: A novel cholinergic signaling peptide in human mucocutaneous epithelium. J Cell Physiol, 2006. 208(1): p. 238-45.

92. Patrick H.N., Celie P.H., van Rossum-Fikkert S.E., Willem J., van Dijk, Brejc K., Smit A.B. and Sixma T.K., Nicotine and Carbamylcholine Binding to Nicotinic Acetylcholine Receptors as Studied in AChBP Crystal Structures NEURON, 2004. 41: p. 907-914.

93. Hansen S.B., Huxford T., Marchot P., Taylor P. and^Bourne Y., Structures of Aplysia AChBP complexes with nicotinic agonists and antagonists reveal distinctive binding interfaces and conformations. The EMBO Journal, 2005 24(20) p. 3635-3646.

94. Tsetlin V.I.", Hucho F., Nicotinic acetylcholine recptor at atomic resolution. Curr opin Pharmacol 2009. 9(3): p. 306-10.

95. Marinou M. and Tzartos S.J., Identification of regions involved in the binding of alpha-bungarotoxin to the human alpha7 neuronal nicotinic acetylcholine receptor using synthetic peptides. Biochem J, 2003. 372(Pt 2): p. 543-54.

96. Neumann £)., Barchan D., Safran A., Gershoni J.M., Fuchs S., Mapping of the alpha-bungarotoxin binding site within the alpha subunit of the acetylcholine receptor. Proc Natl Acad Sci USA, 1986. 83(9): p. 3008-11.

97. Gotti C., Frigerio F., Bolognesi M., Longhi R., Racchetti G., Clementi F., Nicotinic acetylcholine receptor: a structural model for alpha-subunitpeptide 188-201, the putative binding site for cholinergic agents. FEBS lett, 1988. 228(1): p. 118-22.

98. Bourne Y., Talley T.T., Hansen S.B., Taylor P., Marchot P., Crystal structure of a Cbtx-AChBP complex reveals essential interactions between snake alpha-neurotoxins and nicotinic receptors. EMBO J, 2005. 24(8): p. 1512-22.

99. Jacobsen R.B., DelaCruz R.G., Grose J.H., Mcintosh J.M., Yoshikami D., Olivera B.M., Critical residues influence the affinity and selectivity of alpha-conotoxin MI for nicotinic acetylcholine receptors. Biochemistry, 1999. 38(40): p. 13310-5.

100. Luo S., Nguyen T.A., Cartier G.E., Olivera B.M., Yoshikami D., Mcintosh J.M., Single-residue alteration in alpha-conotoxin PnIA switches its nAChR subtype selectivity. Biochemistiy, 1999. 38(44): p. 14542-8.

101. Hogg R.C.; Hopping G., Alewood P.F., Adams D.J., Bertrand D., Alpha-conotoxins PnIA and AlOLJPnIA stabilize different states of the alpha7-L247T nicotinic acetylcholine receptor. J Biol Chem, 2003. 278(29): p. 26908-14.

102. Dellisanti C.D., Yao Y., Stroud J.C., Wang Z.Z., Chen L., Crystal structure of the extracellular domain of nAChR alpha 1 bound to alpha-bungarotoxin at 1.94 A resolution. NatNeurosci, 2007. 10(8): p. 953-62.

103. Mordvintsev D.Y., Polyak Y.L., Kuzmin D.A., Levtsova O.V., Tourleigh Y.V., Utkin Y., Shaitan K.V., Tsetlin V.I., Computer modeling of binding of diverse weak toxins to nicotinic acetylcholine receptors. Comput Biol Chem, 2007. 31(2): p. 72-81.

104. Sorensen H.P. and Mortensen K.K., Advanced genetic strategies for recombinant protein expression in Escherichia coli. J Biotechnol, 2005. 115(2): p. 113-28.

105. Berndt C., Lillig C.H. and Holmgren A., Thioredoxins and glutaredoxins as facilitators of protein folding. Biochim Biophys Acta, 2008. 1783(4): p. 64150.

106. McCoy J. and La Ville E., Expression and purification of thioredoxin fusion proteins. CurrProtoc Protein Sci, 2001. Chapter 6: p. Unit 6 7.

107. Sheehan D., Meade G., Foley V.M., Dowd C.A., Structure, function and evolution of glutathione transferases: implications for classification of non-mammalian members of an ancient enzyme superfamily. Biochem J, 2001. 360(1): p. 1-16.

108. Inouye S. and Sahara Y., Expression and purification of the calcium binding photoprotein mitrocomin using ZZ-domain as a soluble partner in E. coli cells. Protein Expr Purif, 2009.

109. Marston F.A., The purification of eukaryotic polypeptides synthesized in Escherichia coli. Biochem J, 1986. 240(1): p. 1-12.

110. LaVallie E.R., DiBlasio E.A., Kovacic S., Grant K.L., Schendel P.F., McCoy J.M., A thioredoxin gene fusion expression system that circumvents inclusion body formation in the E. coli cytoplasm. Biotechnology (N Y), 1993. 11(2): p. 187-93.

111. Kapust R.B., Tozser J., Copeland T.D., Waugh D.S., The PГ specificity of tobacco etch virus protease. Biochem Biophys Res Commun, 2002. 294(5): p. 949-55.

112. Tan S., Wu W., Liu J., Kong Y., Pu Y., Yuan R., Efficient expression and secretion of recombinant hirudin III in E. coli using the L-asparaginase II signal sequence. Protein Expr Purif, 2002. 25(3): p. 430-6.

113. Messens J. and Collet J.F., Pathways of disulfide bond formation in Escherichia coli. Int J Biochem Cell Biol, 2006. 38(7): p. 1050-62.

114. Bowden G.A., and Georgiou G., Folding and aggregation of beta-lactamase in the periplasmic space of Escherichia coli. J Biol Chem, 1990. 265(28): p. 16760-6. >

115. Rosenthal J.A., Hsu S.H., Schneider D., Gentile L.N., Messier N.J., Vaslet C.A., Hawrot E., Functional expression and site-directed mutagenesis of a synthetic gene for alpha-bungarotoxin. J Biol Chem, 1994. 269(15): p. 11178-85.

116. Li J., Zhang H., Liu J., Xu K., Novel genes encoding six kinds of three-finger toxins in Ophiophagus hannah (king cobra) and function characterization of two recombinant long-chain neurotoxins. Biochem J, 2006. 398(2): p. 23342.

117. Gong N., Armugam A. and Jeyaseelan K., Postsynaptic short-chain neurotoxins from Pseudonaja textilis. cDNA cloning, expression and protein characterization. Eur J Biochem, 1999. 265(3): p. 982-9.

118. Hsieh H.C., Kumar Т.К. and Yu C., Cloning, over expression, and characterization of cobrotoxin. Biochem Biophys Res Commun, 2004. 320(4): p. 1374-81.

119. Antil S., Servent D. and Menez A., Variability among the sites by which curaremimetic toxins bind to torpedo acetylcholine receptor, as revealed byidentification of the functional residues of alpha-cobratoxin. J Biol Chem, 1999. 274(49): p. 34851-8.

120. Wang Y., Jing L. and Xu K., A unique approach for high level expression and production of a recombinant cobra neurotoxin in Escherichia coli. J Biotechnol, 2002. 94(3): p. 235-44.

121. Chang L., Lin J., Wu P., Chang C., Hong E., cDNA sequence analysis and expression • of kappa-bungarotoxin from Taiwan banded krait. Biochem Biophys Res Commun, 1997. 230(1): p. 192-5.

122. Schein C.H., Noteborn M.H., Biotechnology (N Y), 1988. 6(3): p. 291-295.

123. Young H.S., Herbette L.G. and Skita V., Alpha-bungarotoxin binding to acetylcholine receptor membranes studied by low angle X-ray diffraction. Biophys J, 2003. 85(2): p. 943-53.

124. Chang L.S., Chen K.C., Wu B.N., Lin S.K., Wu P.F., Hong Y.R., Yang C. C., Expression and mutagenesis studies of cobrotoxin from Taiwan cobra. Biochem Biophys Res Commun, 1999. 263(3): p. 652-6.

125. Fiordalisi J. J., al-Rabiee R., Chiappinelli V.A., Grant G.A., Affinity of native kappa-bungarotoxin and site-directed mutants for the muscle nicotinic acetylcholine receptor. Biochemistry, 1994. 33(44): p. 12962-7.

126. Bocharov E.V., Lyukmanova E.N., Ermolyuk Ya.S., Shulga A.A., Pluzhnikov K.A., Dolgikh DA., Kirpichnikov M.P., Arseniev A.S., Resonance Assignment ofljC 15N-Labeled Snake Neurotoxin II from Naja oxiana. Appl. Magn. Res., 2003. 24: p. 247-254.

127. Bullock W.O., Fernande. J.M., Sort J.M., XLI-Blue: a high efficiency plasmid transforming recA Escherichia coli strain with beta-galactosidase selection Biotechniques, 1987. 5: p. 376-378.

128. Studier F.W. and Moffatt B.A., Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes. J Mol Biol, 1986. 189(1): p. 113-30.174.175.176.177.178. 179

129. Hanahan D., Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids. J Mol Biol, 1983. 166(4): p. 557-80.

Информация о работе

Шулепко, Михаил Анатольевич
кандидата биологических наук
Москва, 2009
ВАК 03.00.02

Диссертация

Исследование лиганд-рецепторных взаимодействий на примере никотинового ацетилхолинового рецептора и токсинов из яда змей - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Исследование лиганд-рецепторных взаимодействий на примере никотинового ацетилхолинового рецептора и токсинов из яда змей - тема автореферата по биологии, скачайте бесплатно автореферат диссертации

Похожие работы