Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Получение, выделение и исследование мутантных форм рибосомного белка L7/L12

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Получение, выделение и исследование мутантных форм рибосомного белка L7/L12"

ВНИИ ГЕНЕТИКИ И СЕЛЕКЦИИ ПРОМЫШЛЕННЫХ МИЕСР00РГАНИЗМ0В

ПОЛУЧЕНИЕ. ВЫДЕЛЕНИЕ И ИССЛЕДОВАНИЕ МУТАНТНЫХ ФОРМ РИБОСОМНОГО БЕЛКА I7/L12

03.00.03.-молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

На правах рукописи

ТОДОРОВА РУМЯНА ТОДОРОВА

УДК 577.112

Москва 1993

Работа выполнена в Институте Бежа РАН

Научный руководитель: доктор биологических наук Е.А.Пермяков

Официальные опоненты-. доктор биологических наук М.А.Несмеянова кандидат химических наук В.П.Вейко

Ведущая организация: Институт Молекулярной биологии РАН

Защита диссертации состоится "23" мхьрти, (993 г. в 14_часов на

заседании специализированного совета Д.098.12.01 при ВНИИ генетики и селекции промышленных микроорганизмов по адресу: 113546 Москва. I ый Дорожный проезд, д. 1.

С диссертацией можно ознакомится в библиотеке ВНИИ генетики и селкции промышленных микроорганизмов.

Автореферат разослан'993 г.

Ученый секретарь специализированного совета кандидат биологических наук

В.И.Щербакова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Разработка новых методов для ¡ведения репортерных груш в белки с целью их исследования ьи-¡ическими методами (ЯМР. ЭПР, флуоресценции, кругового дихроизма i др.) открывает новые перспективы для изучения белков. Эти ютоды должны давать возможность получения структурных аналогов 5елков, содержащих репортерные группы, в идеале не затрагивающие ix нативнул структуру.

В этом отношении большой интерес представляет введение приходных хромофоров (триптофан, тирозин и фенилаланин) генно-инже-герными методами, отбор мутантных белков с незатронутой нативной структурой и их исследование физическими методами с целью изуче--шя структуры природных белков.

В настоящей работе попробовали ввести природный хромофор Гуг в N-концевую часть белка L7/L12, чтобы исследовать его структуру методом 1Н-ЯМР, флуоресцентной спектроскопии и кругового цихроизма. Белок L7/L12 является довольно хорошо изученным белком в отношении его структуры, локализации на рибосомах и функционирования. Это маленький рибосомный белок с молекулярным весом (2200, который в растворе и на рибосомах находится в .¿химерной форме и представляет собой стержень 50S рибосомной субчастицы E.coli. Белок L7/L12, кислый рибосомный белок, представлен в четнри копия на рибосомах в виде двух димеров.

Для димера бежа L7/I12 предложены две модели - параллельная и антипараллельная укладка цепей мономеров в димере. Ы-кон-цевая часть бежа L7/L12 ответствена за димеризацию и за образование комплекса с бежом L10 (L7/L12)4.L10.

Мономер бежа L7/I12 построен из двух доменов - глобулярного С-концевого домена, включающего остатки 53-120, и неглобулярного. вытянутого N-концевого домена, состоящего из остаков 1-36. К-и С-концевые домены соединены гибким, обладающим значительной конформационной свободой участком 37-50.

Бежи L7 и 112 идентичны по аминокислотной последовательности, но в белке L7 U-концевой сериновый остаток ацилирован.

Цель и задачи исследования. Для реаения задачи по введению рпортерных групп Туг в N-концевую часть бежа L7/L12 в гене L7/L12, было решено сделать соответствующие замены методом целенаправленного мутагенеза на фаге И13тр18. Необходимо было прове-

X

рить мутантные гены на наличие нужных мутаций с помощью Dot-blot гибридизации и сиквенса, переклонирсвать в экспрессирумций вектор рКК223-3, получить экспрессию мутантных бежов в клетках E.coli и разработать методики для выделения белков L7/L12.

Мутантные бежи планировали исследовать • методами ' Н-ЯМР. флуоресцентной спектроскопии, спектроскопии кругового дихроизма, микрокалориметрии, а также испробовать на функционирование в синтезе poly(Phe) на poly(U) матрице на рибосомах для того, чтобы отобрать мутантный белок, обладающий структурой, наименее искаженной по сравнению со структурой интактного белка L7/L12.

Научная новизна работы. Показана целесообразность включений продных аминокислот-хромофоров в белки генно-инженерными способами для исследования интактной структуры бежов физическими методами. Впервые исследовано окружение вставленных таким образом хромофоров в беже 17/Ы2. Обнаружены рН-индуцируемые конформационные переходы в L7/L12 и исследована тепловая стабильность мутантных бежов в широком интервале рН.

Практическая значимость работы. Разработанный метод включения природных аминокислот-хромофоров в бежах генно-инженерными методами и отбор мутантов с неискаженной нативной структурой для исследования структуры белков физическими методами является очень удачным решением для исследования структуры бежов, в которых отсуствуют природные аминокислоты-репортеры и может быть исспользован для исследования структуры других бежов.

Апробация работы. Результаты исследований докладывались на XII Научной конференции болгарских аспирантов в СССР с международном участием (Москва 1990 г.)

Публикации. По материалоь! диссертации опубликовано 3 печатных работ, одни тезисы и одна в приготовлении.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на _

страницах, включает 1 таблицу, _ рисунков и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Электрофорез ДНК для разделения, идентификации и очистки фрагментов ДНК проводили в 0,7%, 1% и 1,5% гелях агарозы.

Фрагменты ДНК выделяли методом изотахофореза (Ofverstedt et ai.1984). Одноцепочечную фаговую ДНК и плазмидную ДНК вьшеляли то стандартным методикам (Маниатис и др. 1984, Гловер 1988).

Для проведении Dot-blot гибридизации наносили го 2 мкл (0.51 мкг) фаговой одноцепочечной ДНК. Нитроцеллюлознке фильтры отмывали при четырех температурах с интервалом в 5°С до Td.

Электрофорез белков проводили в \Ь% ПААГ с 0.1% ДСН.

Клетки E.coll штамма XL1. • содержащие рекомбинантные ллазмиды рККТ1, рКХЗМ4 и рХКТ2б для выделения мутантных белков наращивали в среде LB при 37°С до °55о=1-3- а затем следовала индукция с добавлением•IPTG за 3,5 часа.

Poly(U) замисимую реакцию трансляции на рибосомах проводили согласно Gavrllova et al. 1975.

Спектры фенилаланиновой и тирозиновой флуоресценции интакт-ного белка L7/L12 и его мутантов измеряли с помощью спектрофлуо-риметра с монохроматическим возбуждением (Пермяков и др. 1977). Возбуждение флуоресценции производили светом линий ртути при 265,2 или 280,4 нм.

Калориметрические измерения производили на микрокалориметре ДАСМ-5 при скорости нагревания 1°/мин. Разложение термограмм производили согласно методу, описанному в работе Privalov et Potekhin 1986. Измерения проводили в 20мМ Na-фосфэтном буфере; концентрации составляли 0.3-1 мг/Ш.

Спектры кругового дихроизма в дальней УФ-области измеряли на спектрололяриметре Jasko J600. а термическую денатурацию на приборе Jasko J41А. Скорость нагревания 0.9°/мин. Измерения проводили в 20мМ НН400ССН3 рН 5.0 и рН 7.3 или в 20 мМ Na-фосфэтном буфере рН 7.0. Рабочие концентрации составляли 0.2 0.5 мг/мл.

Спектры 'н-ЯМР измерены на спектрометре Ш 500 ("Bruker") при температуре 27°С. Химические сдвиги измерены относительно внутреннего стандарта натриевой соли 2,2-диметил 2-силанпентан 5-сульфокислоты. Концентрация белков составляла 1-2 мглм.

Концентрации белков определяли спектрофотометрически на прлбсра Varían Сагу 219 двумя кезавпспжми способами.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Ген Ь7/Ь12 с регуляторной областью (800 н.п.) переклонировали по сайтам рестрикции HindiII-BamHI в плазмиду pBR322. С поз

мощью электрофореза в 12% ПААГ в присутствии ДЦС-Na показано, что суперзкспрессии белка L7/L12 не происходит.

Ген 17/Ы2 с регуляторной областью переклонировали в плаз-миду рКК175-6 по сайту Smal. Трансформировали клетки E.coli штамма DH5a (Brosius 1984). Единичные клоны клеток, растущие на чашках с Н-агаром до концентрации 7,5 т Tet, не содержали плазмиду с геном, а при концентрациях Tet вше 10 т рост клеток не происходил. Таким образом был сделан вывод,что регуляторная область гена L7/L12 не содержит собственного промотора.

Ген L7/L12 с регуляторной областью был переклонирован в фаг Ml3tnpl8 по сайтам рестрикции HlndlII- BamHI и был сконструирован рекомбинантный фаг М13mpl8/L7/L12.

Мутагенез для замены Serl на Туг1 проводили в гене L7/L12 на фаге M13mp18/L7/Ll2 по методам Кункеля (Kunkel,1985) и Фрица (Фриц 1988. Триплет ТСТ (Ser) заменяли на триплет TAT (Туг) в гене L7/L12.

Мутагенез для замены Metí4 на Туг14 и Met26 на Туг26 проводили по методу Екштейна (Amersham). Для мутагенеза исспользовали 22-членные мутагенные олигонуклеотиды. В гене L7/L12 триплеты ATG (Met) заменили на триплеты TAC (Туг).

Отбор фаговых клонов на нужные мутации в гене I7/L12 проводили Dot-blot гибридизацией с мутагенными олигонуклеотидами.

Последовательность гена 17/112 с заменой Ser1-»Tyr1 определяли по методу Сэнгера.

Мутантные гены L7/L12 расщепляли перед стартовым колоном по Dral сайту и переклонировали по Smal сайту в рКК223-3 под tac промотором. Сконструированы рекомбинантные плазмиды рККТ1 (содержащая ген L7/L12 с заменой Ser1-»Tym, рККТ14 (замена Met14-Туг14) и рККТ26 (замена Met26-Tyr26). Клоны, содержащие мутантные гены L7/L12, отбирали рестрюстным анализом по BamHI сайтам. При включении гена L7/L12 в правильной ориентации под tac промотором выделяется фрагмент длиной 920 н.п., а в обратной-500 н.п.

Получена экспрессия мутантных генов L7/L12 (Туп, Tyrl4. Туг26) в штаммах E.coli XI1 и JM101. Экспрессия генов L7/L12 индуцируется добавлением Iptg в среду.

Для выделения 17/Ы 2, содержащего замену Туг1, проводили ионообменную хроматографию клеточного экстракта на ДЕАЕ-сефаро-за CL-6B, затем следовало осаждение (NH4)2S04 и гель-фильтрация на Ультрагель АсА-54, а потом очистка на ДЕАЕ-сефароза СХ.-6В.

Для очистки L7/L12 (Туги и Туг26) после первого этапа хроматографии на ДЕАЕ сефарозой CL-6B, следовала хроматография на MonoQ HR10/10. Фракции белка L7/L12 (Туг14), требующие дополнительной очистки, подвергали ионообменной хроматографии на MonoQ HR5/5 в 6М мочевине. Очистку белка L7/L12 (Туг26) проводили на TSKG-3000SW в 6М мочевине.

Для получения белков со спектральной чистотой подходящими оказались методики выделения белков в присуствии мочевины.

Исследование бежов L7/II2 w.t. и L7/I12 (Туг1, Туг14, Туг26)

Поскольку в природном беже L7/L12 отсутствует аминокислота Туг, УФ-спектр трех тирозиновых мутантов отличается от спектра природного бежа и имеет максимум поглощения в области 276 нм для L7/L12 (Туг1) и L7/L12 (Туг26) и 280 нм для L7/L12 (Туг14).

С помощью равновесной седиментации установлено, что белок L7/L12 (Туг1) в растворе существует в виде димера, как и белок дикого типа. По сиквенсу N-концевой последовательности бежа установлено, что аминокислота Met на N-кснце не отщепляется в клетке и является первой аминокислотой в мутантном беже, а за ней следует Туг) и все последуйте аминокислоты, как в природном беже.

Рис.1. Спектр 1Н-ЯМР для бежев 1,7/1,12 ууЛ. и 1.7/112 Туп. Сравнивая спектры ^-ЯМР димера природного бежа 17/112 со

5

спектрами 1Н-ЯМР мутантных белков LY/L12 (Туг). Туп4 и Туг2б), можно сделать вывод, что мутантные бежи сохраняют форму димера в растворе и их структура аналогична структуре димера природного бежа L7/L12.

В спектре 1Н-ЯМР белка L7/L12 (Туг1) появляются резонансные сигналы при 6,8 ррга для протонов ароматической аминокислоты Tyrl. Из анализа спектральных характеристик для бежа L7/I12 (Туг!) можно судить о том, что Туг1 (Ser1) не включается в структуру N- концевой области бежа, а остается свободным и не имеет соседей (рис. 1).

В спектре 1Н-ЯМР бежа L7/I12 (Туг14) появляются резонансные сигналы при 6,7 и 6,85 ррт для протонов ароматической аминокислоты Туг14. Из анализа спектральных характеристик для бежа L7/L12 (Туг14) можно судить о том, что Туг) 4 (MetU) входит в структурированную область в Ы-концевой части бежа 17/L12. По изменению резонансного сигнала для РЬеЗО при 7,32 ррт можно предположить, что Phe30 находится вблизи Tyr14(Met14) (рис.2).

Рис.2. Спектры 1Н-ЯМР для бежов 1,7/112 (Туг14 и Туг26) и для природного бежа 1,7/112.

В спектре 1Н-ЯМР бежа 17/Ы2 (Туг26) появляются резонансные сигналы при 6.8 ррт, характерные для протонов ароматической

6

аминокислоты Туг26. Из анализа спектра белка L7/L12 (Туг2б), можно судить о том, что Туг26 (Met26) также входит в структурированную область в N-концевой части бежа L7/L12.

Сравнение резонансных сигналов для протонов ароматических аминокислот Туг14 и Туг26 и анализ спектральных характеристик для белков L7/L12 (Туг14 и Туг26) приводит к выводу, что Туг14 (Met14> находится в более структурированной области, чем Туг26 (Met26) в N-концевой области белка L7/L12.

Ионизация остатков тирозина и образование тирозината в зоне щелочных pH хорошо видны по увеличению поглощения при 250 нм. Оказалось, что для обоих мутантных белков кривая спектро-фотометрического титрования остатка тирозина однопротонная, но для Туг14 в белке I7/L12 Туг14 рК =10.51, а для Туг26 в белке L7/L12 Туг2б рка=10.29. Для свободной аминокислоты Туг в

растворе рКа=10.07. Следовательно.

Tyri4, по-видимому, менее

доступен растворителю, чем Туг26. Эти результаты согласуются с данными метода 1Н-ЯМР, согласно которш аминокислота Туг14 в белке L7/L12 Туг14 входит в более структурированную область, чем Туг26 в белке 17/1,12 Туг26 и имеет больше соседей (рис.3).

Рис.3. pH-зависимости интенсивности тирози-новой флуоресценции и поглощения.

1. L7 (Туп 4) Рп ех 280.4 ил.

2.L7 (Туг26) IV,

308'

A250.3.L7 n.t. ex 265.3 HM. 4.L7 (Туг26) А

308 Р,

283

250"

300.0

200 0

100 о

0.0

"о ОрОсСЛЗъ

гоо.о

150 о

1000

1.0

5.0

рн

9 О

13.0

s о.о

На кривых спектрофлуориметрического рН-титрования белка I7/L12 Туг14 хорошо виден S-образный рост выхода тирозиновой флуоресценции белка при понижении pH от %7,5 до Этот переход описывается кривой титрования с рка=б.0б и п=1.0. Переход в этом интервале pH связан с титрованием карбоксильных групп. По первичной последовательности белка L7/L12 радом с Туг14 расположены Glu9.и G1u21. Для белка 17/112 Туг26 этот переход сдвинут в

7

г

з •

сторону более кислых рН (рКа=4.9 и п=1.5). Этот переход также связан с титрованием карбоксилов. По первичной последовательности белка L7/L12 вблизи Туг26 расположены Glu27, Glu28 и Glu21. Отметим, однако, что переход может запускаться изменением ионного состояния не обязательно ближайшего карбоксила. Аналогичный переход обнаружен и для белка L7/L12 дикого типа по фенилалани-новой флуоресценции бежа, но эффект в этом случае слишком мал, чтобы его можно было изучать количественно.

Обнаруженный рН-индуцируемый переход может быть обусловлен двумя причинами. Во-первых, он может определяться рН-индуциру-емым изменением тушащих свойств карбоксильных групп, находящихся в непосредственной близости с тирозиновым хромофором. Во-вторых, он может отражать наличие в этих белках рН-индуцируемого конфор-мационного перехода, в результате которого меняется и окружение тирозиновых хромофоров. Оказалось, что состояния белков до и после перехода существенно отличаются по термостабильности и по способности к агрегации (см. ниже), и по-видимому, регистрируемый по собственной флуоресценции переход определяется рН-инду-цируемым изменением структуры белка.

СОСОЭТу- 14 mutant of L7. рН 7.3 ■¡XXW»» l/L.12 wiid tvpe. рН 7.8 OOOOO Tyr 26 mutant of L7, pH 7.8 1.2 -------r...............

| : : :

e^-peroiure, °C

Рис.4 Температурные переходы по флуоресценции.

8

На рис.4,5 приведены температурные переходы по флуоресценции для мутантных белков и белка дикого типа. На кривых плавления для белков L7/L12 (Туг) 4 и Туг26) и дикого типа обнаружены два перехода по флуоресценции- один низкотемпературный и один высокотемпературный переход. Низкотемпературные переходы для бежа 17/112 Туг)4 при рН=5.0 и рН=7.з совпадают, а высокотемпературные расходятся. Смещение высокотемпературного перехода при рН=5.0 в сторону более низких температур свидетельствует о понижении стабильности белка при низких значениях pH.

СССООГуг 14. -latent с£ _7. ■«ХК-? Ту 14 о' „7.

1 ~

с.е

pH

7.2 3.0

| 323- I ' % СЕ /

: -О 3 => 3 с 3 о 3 о ' С о :

3 4тТ—I........ £ О ----- Л ' с О : | ...................'

emDerature, °С

Рис.5. Температурные переходы по флуоресценции для L7/L12 Туг14 при рН=5.О и рН=7.3.

Низкотемпературные переходы вероятно свидетельствуют о наличии в бежовых образцах некоторого количества "испорченного" в ходе очистки бежа, неполностью ренатурировавшего после обработки денатурантом (мочевиной). Высокотемпературные переходы соответствуют, по-видимому, плавлению полностью ренатурировавших бежов.

Как низкотемпературный, так и высокотемпературный переход для бежа L7/L12 Туг26 смещены в области более низких температур по сравнению с переходами для других бежов и это соответствует

пониженной стабильности этого мутанта при нагревании.

Спектры кругового дихроизма в дальней УФ области для мутантных белков 1,7/1,12 (Туг1, Туг14, Туг26) при рН=5.0 и рН=7.3 существенно не отличаются от спектра бежа дикого типа. Это указывает на сохранение компактной вторичной структуры в мутантных бежах (рис.6).

пш

........ W.T. - Tyrl Туг26 —— Туг 14

Рис.6. Спектры кругового дихроизма для бежов L7/L12 w.t.. Туг1, Туг14 и Туг2б при рН=7.3.

Тепловую денатурацию мутантных бежов 17/112 (Tyrl. Туг14, Туг2б) и L7/L12 дикого типа методом кругового дихроизма изучали в интервале температур Ю-90°С. При рН=7.3 белки проявляют полную обратимость процесса денатурации при медленном охлаждении.

ю

Зелок L7/L12 Туг14 при рН=5.0 денатурирует при более низких генпературах-его денатурация начинается при 43°С, что согласуется с флуоресцентными данными.

Кризче тепловой денатурации мутантных белков показывает • что 5елки I/7/L12 Туг1 и I7/L12 Туг14 не отличаются по термостабильности вторичной структуры от белка дикого типа. Замены Ser1-Tyrl и !st14-»Туг14 не отразились существенно на вторичной структуре 5злка L7/L12. Замена Met26-.?yr26 привела к стабилизации втори-шоЗ структуры белка L7/L12 Туг26 и соответственно к повышению гемпературк полуперехода на 3-4°С (рис.7).

Рис.7. Тепловая денатурация белков L7/L12, регистрируемая етодом кругового дихроизма. 1. L7/I12 (Туг14) рН=5.0. 2. L7/L12 Туг14) рН=7.3. 3,- L7/LI2 (Туг1 ) рН=7.3. 4. L7/L12 VY.t. рН=7.3.

17/112 рН=7.0. б,- L7/L12 (Туг26) рН=7.3.

При низких температурах на кривых плавления наблюдается редплавление белков, выделенных в присуствии мочевины, которое аканчивается при 35-40°С и это вероятно связано с'неполной ре-атурации участков белка из денатурирущего агента. После этого

,и

1.0

(О Z0 Ю -10 Ь'О 60 ТО во 90 100

т/с

пр&дгслазления начинается плавление кооперативной структуры белка. На кривых плавления белков, выделенных в отсуствии денатурирующих агентов предплазление такого рода не наблюдается. Ана- . логичные низкотемпературные переходы были обнаружены и на кривых плавления по флуоресценции.

Интактный белок L7/L12 и его мутанты были исследованы методом дифференциальной сканирующей микрокалориметрии. Ниже рН=5 для белка L7/L12 дикого типа график температурной зависимости теплоемкости представлен плавной кривой без пиков теплопогло-щения. Величины Ср(Т) позволяют предположить, что белок в этих условиях находится в денатурированном состоянии (Рис 8).

В области рН от 5.0 до 7.3 для белка L7/112 характерно плавное повышение значений Ср(Т) от 0.32 кал/К-г для нативного состояния белка, до 0.59 кал/К-г для денатурированного состояния. Плавное повышение теплоемкости заканчивается к 65°-70°С, эта температура совпадает с температурой максимума денатурационного перехода белка при рН выше 7.3. При дальнейшем нагревании наблэдается интенсивное поглощение тепловой энергии с температурным максимумом около 120°С (Рис 8). Денатурация в этом диапазоне значений рН обратима лишь частично. Можно предположить, что в этом диапазоне идет плавление крупных ассоциатов/агрегатов белка, спонтанно образующихся в растворе при этих значениях рН.

В диапазоне значений рН выше 7.3 белок L7/L12 проявляет себя как обычный глобулярный белок, его денатурационная кривая имеет ярко выраженный пик теплопоглощения с максимумом при температуре 68°С. Положение максимума пика теплопоглощения всех форм L7/L12 не зависит от рН в этой области. Денатурация белка полностью обратима; величины Ср белка дикого типа и его мутантных форм, совпадают. Это означает, что введение данных мутаций не отразилось на величине денатурационного инкремента теплоемкости, и, следовательно, на организации гидрофобного кластера молекулы белка.

Значения экспериментально измеренных энтальпий денатурации белка дикого типа и мутантных белков практически не отличаются, следовательно, данные мутации не повлияли на энергетический баланс- молекулы. Однако, калориметрическая энтальпия каждого из белков более чем в два раза превышает энтальпию Вант-Гоффа, рассчитанную для простого перехода между двумя состояниями

12

(В.=2.4). Такое соотношение единым кооперативным блоком, организацию.

означает, что молекула не является а имеет достаточно сложную доменную

Рис.8. Температурная зависимость теплоемкости для белков Х7/Ы2 и мутантов А. 5 интервале рН 5.0- 7.3. Б.При рН ниже 5.0. В. В интервале рН 7.з-9.2.КомпыотернкП анализ функции избыточной теплоемкости АС ехс.

Компьютерный анализ функции избыточной теплоемкости. ¿С®*0, показывает, что эта экспериментально определяемая функция разлагается на три аналитических, каждая из которых описывает простой two-state переход.

Возможны две крайние интерпретации такого денатурационного перехода. Либо в белке существует достаточно большой участок полипептидной цепи, не задействованный в формировании третичной структуры, либо она действительно организована в три термодинамических домена.

Кооперативная структура мутантных белков и белка дикого типа практически идентична. Сущестьуют три разных диапазона рН, в каждом из которых белок имеет качественно разный характер температурной зависимости теплоемкости.

Предсказание вторичной структуры белков 17/112 дикого типа и мутантов 17/112 (Tyrl, Туг14 и Туг2б) проводили по. програме Globula (Finkelstein 1975. Ptitsyn and Fihkelstein 1983);

Предсказание вторичной структуры указывает на то. что в области Туг1 в белее 17/112 Туг1 появляется 25-30% -вероятность появления р-структуры и 0-изгиба (остатки 4 6). .

В ыутантном белке 17/112 Туг14 окружение Туг14 почти не не отличается от окружения Met14 в интактном беже и вероятность его вхождения в а-спираль уменьшается с 32% в диком беже . до 2630% в мутантном, а вероятность вхождения в p-структуру увеличивается с 20% до 25%. Исследования мутантного белка L7/L12 Туг14. проведенные наш, показали, что замена Met14-.Туг14 действительно не повлияла существено на структуру бежа и он сохраняет ■ харак-ристики бежа 17/112 природного типа.

В мутантным беже 17/112 Туг26 предсказания вторичной структуры показали, что а-спиральность молекулы в области замены сильно нарушается вследствии мутации. Вероятность а-спиральности в положении Туг26 уменьшается от 92% в диком беже до 70% в мутантном, а также нарушается сам характер кривой вероятности вхождения в а-спираль и она сильно деформируется в области мутации. Это согласуется с результатами, полученными нами, а именно-, замена Met26-/Eyr26 нарушает нативную структуру бежа в области мутации.

Обнаружено, что мутантные бежи 17/112 включаются в рибосомы клеток. E.coli, суперпродуцентов мутантных бежов 17/112.

Рибосомы, содержащие мутантные белки 17/112, исследованы на

14

функциональную активность в трансляции poly(U). Установлено, что эибосомы, выделеные из клеток суперпродуцентов мутантных белков сохраняют до 30% от активности нативных рибосом E.coli. Уровень трансляции для рибосом, выделенных из клеток суперпродуцентов Зелка L7/L12 Туг14, выше по сравнению с рибосомами, выделенными га клеток суперпродуцентов L7/L12 Туг26. Рибосомы, восстановлен--ше мутантными белками L7/L12 Туг1, Туг14 и Туг26 проявляют более низкую активность в ро1уШ)-трансляции, чем рибосомы, полу-тенные из клеток суперпродуцентов. Активность рибосом, восстано-зленных бежом L7/L12 Туг14, выше по сравнении с активностью, толученной для L7/L12 Туг2б. Наиболее низкая активность получена аяя рибосом, востановленных с бежом L7/L12 Туг1.

ВЫВОДЫ

I. Получены три мутантные Форш рибосомного белка L7/L12, в которых аминокислоты Ser1, Metí 4 и Met26 заменены на Туг.

I. Установлено, что мутантные бежи L7/L12 (Туг1, Туг14 и Туг2б) сохраняют димернуга форму в растворе.

3. Показано, что Туг1 в беже I7/X12 Туг1 не включается в структуру N-кокцевой части молекулы, а остается■свободным и не имеет соседей. Стартовая аминокислота Met не отщепляется в клетке и становится первой аминокислотой в мутантным беже. а за ней следует Туг1 и все последующие аминокислоты, как в диком беже.

4. Обнаружено, что Туг14 и Туг2б включаются в Я-концевую часть 5ежа L7/L12 (Туг14 и Туг26). Туг14 входит в более структурированный участок молекулы, чем Туг26. Рядом с Туг14 вероятно расположен Phe30.

5. Замена Met26-.Tyr26 стабилизирует вторичную структуру бежа L7/L12 Туг26, а также увеличторет его склонность к ассоциации/ агрегации после ренатурации бежа из денатурирующих агентов, ве-эоятно из-за локального жменения третичной структуры в области чутацки.

5. В беже L7/L12 Туг14 обнаружен рН-индуцируеьшй конформацион-

15

ный переход в зоне pH от *П. 5 до «.5, запускаемый изменением ионного состояния карбоксильных груш. Состояния белка до и после перехода отличаются термостабильностью и окружением остатка тирозина. Аналогичный переход обнаружен и у других мутантных белков, а также в белке дикого типа. Положение перехода в шкале pH зависиит от положения остатка тирозина в Н-концевой области молекулы.

7. Анализ микрокалориметрических кривых плавления бежов позволил обнаружить три перехода, вероятно отражающих независимое плавление трех структурных кооперативных участков молекулы.

8. В функциональным отношении мутантный белок L7/L12 Туг14 является наиболее близким к бежу дикого типа. Белки 17/112 (Туг1 и Туг26) проявляют меньшую способность восстанавливать функциональную активность рибосом после отмывания бежа дикого типа от нативных рибосом E.coli.

9. По своим характеристикам мутантный белок I7/L12 Туг14 является наиболее близким к природному бежу 17/L12 и таким образом он мог бы быть подходящим объектом для дальнейшего исследования бежа методом двухмерной 1Н-ЯМР спектроскопии.

Список публикации по теме диссертации.

1. Тодорова Р. Т. Получение мутантных форм рибосомного бежа L7/L12. Сборник научных работ XII Конференции болгарских аспирантов в СССР. Москва. 1990 г.

2. Тодорова Р.Т. Получение, выделение и исследование мутантных форм рибосомного бежа L7/L12. -Биоорганическая химия, 1993, Т0М19, НЗ, стр.286-292.

3. Тодорова Р.Т. Три мутантные формы рибосомного бежа 17/ыг. Молекулярная биология. Том 27, вып.2. стр. 441-447. 1993.

4. Тодорова Р.Т.. Пермяков Е.А.. Рогов В.В., Василенко К. Исследование мутантных бежов 17/112. В подготовке.

16