Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Структурно-функциональный анализ нейротоксинов паукообразных

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Структурно-функциональный анализ нейротоксинов паукообразных"

ОА

АКАДЕМИЯ НАУК РЕСПУБЛИКИ УЗБЕКИСТАН ИНСТИТУТ ФИЗИОЛОГИИ И БИОФИЗИКИ

На правах рукописи УДК 547.993:577.112:577.352

АТАКУЗИЕВ Бахадир Уйгунович

СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫЙ АНАЛИЗ НЕЙРОТОКСИНОВ ПАУКООБРАЗНЫХ

(03.00.02 — биофизика и 03.00.04 — биохимия)

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

ТАШКЕНТ—1996

Работа выполнена в Институте физиологии и биофизикч АН РУз.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор ТУЙЧИБАЕВ М. У., доктор химических наук, профессор САДЫКОВ А. А., доктор биологических наук МИРХОДЖАЕВ У. 3.

Ведущая организация — Институт биохимии АН РУз.

Защита состоится .» . . . 1996 г. в «. . .» ча

сов на заседании специализированного совета Д015.01.01 по за идите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук пр; Институте физиологии и биофизики АН РУз по адресу: 70009? Ташкент, ул. Ниязова, 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Институт физиологии и биофизики АН РУз.

Автореферат разослан «. . .»........ 1996 г.

Ученый секретарь специализированного совета д. б. н.

КАЛ И КУЛ ОВ

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ' Актуальность проблемы. Ядовитость - универсальное явление в »ивой природе, проявляющееся у представителей' многих таксонов растительного и животного мира. Примеры использования токсических веществ для нападения иди защиты встречается на всех ступенях эволюционного развития, и это позволяет заключить, что токсичность - функция еСкСиологпчеокая. Вместе с тем привода дает нам огромнее разнообразие проявлений токсичности, зклшая специфику химического строения и связанные с ней меха-шзмы действия, способов и мест образования ядов в организме [довитого тавотного, а тает? способов их использования. Всес-•оронее изучение биологически активных соединений, содержащихся В' различных ядах природного происхождения, позволяет не •олько детально судить об организации токсической функции, ко '¡¿кж дйет обзмрнуы информацию для понимания физико-химических ■сное фундаментальных Сиологнческих процессов-, прикладные ас-екты, заключающиеся в практическом использовании биологически ктивних соединений ядов в совокупности обусловливает научный нтерес к проблеме £ целом. Все это в значительней степени тимулирует фармакологические, физиологические и биохимические еследования различных зоотоксиноз.

Дели и задачи исследования. Выяснение основные путей воз-икновеняя и развития ядовитости в живой природе возможно поо-з подробного изучения химической природы токсинов и их оиоло-ачэской роли. К сожалению, для многих групп .тавотных, яапри-?р, паукообразных подобные сведения еще не достаточно полны .и срадаюг фрагментарностью.

На современном этапе исследования аоотоксинов развиваются двух основных направлениях: 1) изучение химического строения ютоксинов, связанно? с поиском ноеых объектов и 2) выяснение, ^ханизмоз их токсического действия. Эти два направления взаи-ювязаны, так как механизм действия любого вещества в- первую ередь определяется особенностими его структуры; с другой орокы, анализ механизма действия.дает дополнительную инфегр-цию о строении самого токсине, или его активного центра.

Основной целью настоящего исследования стали разработка тодов выделения индивидуальных нейротокспнов из новых не нс-едованных ранее природных источников и их характеристика для яснения молекулярных кехалиамов действия и кспольеокания в

изучении функционально значимых систем мембран нервной клет. "Для достижения поставленных целей решались следующие зада

- разработка методов выделения индивидуальных нейроток нов из ядов различных паукообразных;

- физико-химическая и биологическая характеристика ко

. ченкых нэйрото кс ино в;

- сравнительный анализ выделенных нейротокеинов и окре ление особенностей их строения и функции.

Новизна и практическая ценность работы. Разр&Зотаьы об подходы и специальные методы выделения токсических компонен из ядов различных паукообразных, впервые получены ноеыэ ней токсины, взаимодействующие с мембранами нервного волокна разных его участках и проведено их систематическое изучение индивидуальном состоянии Еьщелены 3? токсинов, обладающих сональным, пресинаптичэским и достсинаптическим действием: ядов скорпионов Ви^из еиреиз и ОтЬюсЬи-из зсгоЫаЛозиэ -лолилептвдов с селективным действием на млекопитающих, насе мых и ракообразных^ из ядов пауков семейств ТЬепсН 1с1ае, Аг idae и 01р1иг1с!аэ - 18 новых нейротокеинов, среди которых н дены Олокаторы холин- и глутаматэргических синапсов. В скорпиона В. еиреиз установлен новый тип инсектотоксинов с лекулой состоящей из 35-36 аминокислотных остатков, в яде п ка БЬеаьосЗа раукиШапа найдены нейротоксины, избирател взаимодействующие с пресинаптическими мембранами холинэргич ких и глутаматэргических синапсов, состоящие иа высокомоле лярного (110-75 кБа) и низкомолек$ирного (5 кОа) компонент образующих каналы в БЖ Из яда паука Егегиа тгег впервые делен индивидуальный компонент -с тфосфолипазной А1 активяоет обладающий антикоагуляктной и гемолитической активностями.

■ На основе комплексного изучения структуры и функции р личных иейротоксинов предложены новые способы их эффективн использования как инструментов анализа мембран возбудимых к ток. Полученные данные' о физико-химических свойствах и ые низме действия выделенных токсинов несомненно будут спосо твовать поиску и созданию лекарствённых препаратов нового па. Некоторые выделенные токсины уже использованы в ряде ревдуний бывшего . СССР в рамках программ "Нервный импульс "Ионный .канал".

Апробация работы. По результатам исследований опубликсва-) 23 работы. Материалы диссертации бьш доложены на: V Всесо-:ном симпозиуме "Химия и физика белков и пептидов" f Езку, '80); VI и VII Всесоюзных симпозиумах "Химия белков й пепхи-■з" (Рига, 1983; Талин, 1907); III Советско-Швейцарском сим-•зиуие "Биологические мембраны. Структура и функции"' (Тзш-нт, 1983); Советско-Западногерманском симпозиуме "Токсины' к инструменты в нейрохимии" (Западный Берлин', 1933); IV С*ъ-де физиологов Узбекистана (Тапкент, 1933); Всесоюзном еимпо-уме "Ионные каналы е биологических мембрзнах" (Пущино, 89);: Международном симпозиум® "Мембранный транспорт и хк?ха-еш его регуляции" (Тбилиси, -1989); III Международном р?.бо-м совещании "Природные соединения действующ;:' на нервную пэ~ цачу" (Буэнос-Айрес, Аргентина/.'.Ьнтовзшео, Уругвай, 1991); учной конференции1 "Структура и функции1 Отологических мемб-ч" (Таикент, 1995).

Структура и объем1 работы. Диссертация йэдожна на 243 запнцах машинописи, содержит 53 рисунков и 9 таблиц. Состоит введения, 2 глав обзора литературы, главы с описанием-мате-иов и методов исследования, ?рех глав с изложением собс-¡иных результатов и их обсуждения, краткого заключения, вн-юз и списка литературы, содержащего 302 источника.

МАТЕРИАЛЫ й 1ЕТ0ЯЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Яд скорпионов получали электростимуляцией тельсонсв зш-ных; яд пауков - водной экстракцией ядовитых желез. Полу-ный материал лиофильно сушили и хранили при -4°С. Б работе :<® использовались коммерческие препараты ядов паукообразных упленных в Ташкентском и Алма-Атинском зоскоыбикатах.

Фракционирование ядов осуществляли с яомсияыо комбинации ь-ф'лльтраций и ионообменной хроматографии на соотЕетствую-сорбентах, которая в отдельных случаях была дополнена или знена ЕЭКХ в обращенной <$ааэ. Подготовку сорбентов проводи-зогласно рекомендации-фирм- изготовите лей. Контроль за еыхо-белка ооуизствдяди с помощь» ультрафиолетовых детекторов эв Увикорд II и S (LKB, : Швеция), а таю® Altex (США) при ш: волк 280, 254 и 214 км. Очистку и Физико-химическую ха-?еристику некоторых нейротоксинов проводили совместно о

Гришиным Е. а б ИВХ им. К И. Шемякина АН РФ. Электрофоретичее-кие исследования проводили по методу [Reisfield R. А. et al. 19623 и [Weber К. & Osborn М. , 1969] с использованием приборо и реактивов фирмы "Реанал" (ВНР) и "Фармация" (Швеция); элект рофокусирование - на аппарате "Мультифор" (LKB, Швеция) по ме тоду Карлсона CKarlson С., 19733. Мол. массу определяли по ме тоду Като CKato Т. et al. , 19753, а тагаоз методом [Weber К. Osborn U., 19693. Для определения мол. м. низкою пекулярны. нейротоксинов использовали метод масс-спектрометрии. Ашнокис лотны; состав токсинов определяли на анализаторе аминокислот 1 -500 (Durrum, США) или ЖБ 4101(LKB, ШЕеция), а количество Tri определяли спектрофотометрически [Edslhoch Н. , 19673. Сяект| абсорбции токсинов в УФ-области снимали на спектрофотометр) Дшлфорд-240 (Gilford, Сранция) или Hitachi 150-20 (Hitachi Япония). N-концевые аминокислотные остатки идентифицировали : виде их ДНО-производных по методу Грея С Gray W. , 19673. Для о; ределения свободных суль^гидрильных групп использовали што, амлерометрического титрования СТорчинский Ю. , 13713.

Токсичность исследовали в/в, в/б пли и/ц" введением материала белы;,! мышах! с последующим расчетом величины LD 50 в ж на кг веса тела животных по методу Литчфильда и Уилкоксона СБ ленький ХМ. , 19 633. Паралитическую активность для насекомы определяли на тараканах Nauphoeta cinerea; количество веьэст-ва, вызывающее устойчивый паралич у 100% животных, принимал] за Dxoo и выражали в мкг на г seed* тела насекомого. Аналогичш оценивали токсичность для мокриц Protracheoniscus oriental is.

• Яссфулипазкую активность определяли методом Салаха и др. С Sal J. «л. "il. , 19713 и по иигибировашз коагуляции. яичноп л»лтка 1Со.':оду/а IL и др., 19673, а протеолитичэскую активность со ioptf Oiiy [йортрои Д. и др., 19503 и методом [Каверзнева , lüv'i j. Определение гемолитической активности проводили пс Ы''1лху LCondrea Е. & De Vries А. , 10643. Количеств! бел!са определяли методом Лоури [Loury 0. Н. et al., 19513.

ЗлектроФизиологичеекие эксперименты и опьггы на ВЛМ проводили совместно с Каликуловш д. и Казаковым JL Выделение мемб-раишк препаратов из шиц краба и определение связывания "'лигам дои с pvuc-ntopoM проводил.! совместно с Насыровш IIЭ. 1 Тоы-'пх А. К.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

выделение токсикоз из яда скорпионов buthu3 eupeus и

ORTHOCHIRUS SCROBICULOSUS Нативный яд этих скорпионов представляет собой смесь большого числа белков и небелковых компонентов со значительным содержанием нетоксичных веществ мукопротеидной природы. Установлено, что 80% и 65% всей массы яда скорпионов a eupeus и 0. scrobiculosus, соответственно, составляют'белки £г пептиды. В процессе настоящего исследования отм&чэцо,." ®о состав, свойства л биологическая активность яда суазстгенно меняются в зависимости от сезона и еаоеоба его вэяткя, а так;® ареала обитания скорпионов.

При в/б введении белым кш&м величина яда установлена нами равной 3. мг/кг и 1 иг/кг для скорпионов В. eupeus и 0. scrobtculosus соответственно.. Близкие вел;ташц токсичности найдены при в/в инъекции, тогда как интроцеребровентрикулярное (и/ц) введение усиливает эффективность проявления токсичности яда в 4 раза. Помимо млекопитающих оба'яда вызьтают устойчивый паралич насекомых и ракообразных.

Фосфолипазная и протеолитическая активности, а также прямое гемолитическое действие в исследованных Ядах не выявлены. Это отличает яды скорпионов В. eupeus и 0. scrobiculosus от ядов других скорпионов, в которых найдены фосфолипаза А2, гемолизин, протеаза и некоторые другие ферменты CMohaimd A. et al., 1369; Bhaskaran N. & Kurup P., 1975; Yu Ztran et al. , 1990].

Для выделения индивидуальных токсинов наш разработан ые тод фракционирования. Предварительно удаляли нетоксичные муко-протеины водной экстракцией яда с последующи цеятрифугкрова-, нкем. Затем фракционировали' освобожденный от муксшюв экстракт на Сефадексе G-50. Из полученных фракций практически всей токсической активностью яда обладала фракция II, содержащая компоненты с мол. м. б пределах 17*5 kDa и обозначенная нами "Т". Виход фракции Т при разделении яда В. eupeus составил 38,5%, а яда 0. scrobiculosus - 53%; кроме того последний яд отличался меньшим содержанием высокомолекулярных компонентов - фракции I. Здедуюдай этап разделения включал гель-хроматографию с. рецик-яизацией фракции Г на Биогеле Р-10. При этом, уже на третьем ткде хроматографии достигается удовлетворительное разделение.

По результатам определения биологической активности ' и данным диск-электрофореза весь злюат, полученный при разделении фракции Т яда скорпиона В. eupeus, был разделен на семь фракций -I-V1I, из которых все, кроме шестой (VI), были токсичны для теплокровных, а V, VI и VII действовали паралитически на насекомых -и ракообразных. При такой хроматографии фракции Т яда скорпиона 0. scrobiculosus получены четыре фракции - А, В, С и D, из которых токсически на теплокровных, насекомых и ракообразных действовали только В и С, a D вызывала паралич насекомых и ракообразных. Эти данные свидетельствовали о содержании в ядах исследуемых скорпионов селективных инсектотоксинов и токсинов для теплокровных и ракообразных, многие из которых на этом этапе хроматографии еще не удается отделить друг от друга; вместе с тем отдельные фракции, например VI из яда В. eupeus и D - из яда 0. scrobiculosus оказались лишенными токсичности к теплокровным и действовали только на ннсектов и ракообразных. Данные электрофореза обнаруживают основные свойства содержащихся в этих фракциях компонентов, поэтому для дальнейшего выделения и очистки токсинов использовали ионообменную хроматографии. '^акционирование на карбоксиметилцеллюлЬзе СМ-32 оказалось завершающим для выделения ряда индивидуальных, токсинов. Так, из «да скорпиона В. eupeus при разделении на СЫ-32; получены токсина для млекопитающих 113, М4, М5, lf7, Ь0 и 12, М -для насекомых; из яда скорпиона 0. scrobiculosus - .два инсек-тотоксляа - Oslni, 0з1п2 и один ¿токсин для ракообразных -СЬч?г1. Помимо индивидуальных гоксинов с СМ-32 были также получены гетерогенные токсические фракции/ из которых гомогенные токсини извлечены хроматографией на -ДЕАЕ-сефадексе А-50, которая способствует диссоциации агрегатов токсинов до пратсмзров, a raía© позволяет разделять на составные части прочные комплексы, токсинов с другими компонентами ядов [Miranda F. et al., 1S7C; Rochat Я., , 1970], Taким путем удалось завершить окончательную очистку токсинов Ш., Й1 и ИЗ кз яда скорпиона В. eupeus и токсинов Osí.ü, 0sM2, 0sM3 и 0sln3 из яда скорпиона 0. scrobiculosus. , ,

. Следовательно, • ь результате последовательной хроматографии фракций, полученных при гель-фильтрации ядов скорпионов В. (Hipeas й 0. scrobiculosus на СМ-целлюлоэе СЫ-32 и ДЕАЕ-сефа-дексе А-50 удалось обнаружить и выделить в индивидуальном виде

- е -

■Цельный Экстрак- Гельфиль- Гельфиль- Хромато- Хромато-

яд ция и цен- трация на трация на графия графия

трифугиро- Сефадексе Биогеле на СН- на ДЕАЕ-

вание 0-50 Р-Ю целлшо- сефадек-

зе см-32 се Л-50

• — I - Ш

— II - - ш

ш — Ш

— ш ;;

- КМ2 — Ш

В. ецреиз—Суперна ~ Фрак" — — IV - 7 ИЗ ..

тант ция Т - „ М5

— у :: - И2

- КШ — Ш

И1

---VI - - ш ~

из .

, МЗ

— УП

И4

— А

..В-4 — ОзШ

— в. • ^

- В-5 ' — Оз1пЗ

О. зсгоЫ —Суперна — Фрак -— . С-6 — ОбЖ

си!озиз тант ция Т — с - 0э1п1

- С-12 — ОзШ

_ Оз 1п2"

— о ''

- ОзСг!

Рис. 1. Обшая схема выделения токсинов из ядов скорпионов В.

эиреиз и 0. зсгоЫси1озиз. Нейротоксины для млекопитающих

обозначены буквой М, инсектстоксины - И или 1п, а для ракооб-

разных - Сг,

одинадцать токсинов для млекопитающих (М1-Ш и Qsf.il-ОгШ), семь токсинов для насекомых (И1-И4 и 0з1п1-0з1пЗ) ' и один токсин для ракообразных (ОзСг1), "т.е. всего 19 токсинов. Общая схема выделения токсинов из обоих ядов скорпионов представлена на рис. 1.

Результаты,. характеризующие выход индивидуальных веществ при хроматографии и их токсическую активность, суммированы в таблице 1. Данные этой таблицы свидетельствуют о весьма низком весовом выходе отдельных токсинов. Так, если судить по выходу,"

Таблица 1. Выход и детальные дозы токсинов яда скорпионов' ВиМиБ еиреиз и рг№осЬ1гиз зсгоЫсиХогцз

Исходные LD5q , Ш-/КГ Dioo > мкг/г* Выход от Виход по

яды и веса ис- ' токсич-

токсины мыши (в/б) таракан мокрица ходного ности, %

яда, X

Яд В. eupeus 3000 25 18 100 100

Ш 150 -** - 0,11 2,20

иг ' 600 - - 0,14 0,70

ш 1000 - - 1,21 3,60

щ 750 - - 0,10 0,40

ш 100 - - 0,54 1,62

ш 200 - - 0,20 3,00

М7 250 - - 0,77 9,24

Ш 300 - 0,51 .5,10

И1 3 - 2,06 17,10

И2 - 1 . - 0,58 14,50

ИЗ - 3 - 0,57 4,74

И4 - б' - 0.35 , 1,75

Яд 0. sorobí

culosus 1000 12 5 100 100

OsMl ' 210 >30 >30 3,40 " 16,20

0sm2 ' 280 >50- ¿30 0,70 2,40

ОзШ 85 - - 0,20 , 2,10

Oslrvl 0,8 >10 0,90 13,00

oslr.2 1.0- >10 1,30 15,60

Os In3 ' , - 1,7 >15 0,60 ■ . 4,10

OsCrl 0.1 0,90 42,50

* - Доза, вызывающая полний'паралич у 100% животных; ** - не токсичен; нейротоксины для млекопитающих обозначены буквой М, инсектотоксины - И или 1п, токсины для ракообрааных - Сг. .'

игнорируя возможные потери, - содергкание в яде токсинов колебалось от 0. IX до 3,4% от всей массы яда. Активность некоторых токсинов во много раз превышает токсичность цельного яда. На деда) токсинов Ы1-Ш приходится только 267. всей токсичности

цельного яда скорпиона В. eupeus для шеколктающпх, а на до.та инсектотоксинов И1-И4 - 387.. Токсины, выделенное га ада О. scroblculosus такка эффективнее действуют ка все виды животных, чем исходный яд. Однако и здесь только S1Z всей токсичности цельного яда для млекопитающих приходится на дола трех токсинов для теплокровных OsMl-OsKB, 33% на дол» инсектотоксинов 0slnl-0sln3 и 42% на долю токсина для ракообразных OsCrl. Несомненно, что часть токсической активности была гатерена нами в процессе хроматографических экспериментов. Следует таклз учитывать, что при хроматографическом разделении яда и фракций были получены токсичные компоненты в недостаточных для аналитических целей количествах. На долю этих компонентов также приходится часть общей токсичности цельного яда Если ж сюда добавить вероятность синергичного действия токсинов, терявшегося •при их разделении, то получение в виде токсинов только части всей токсичности яда получает объяснение. Наак результату, ла-.рактериаушие выход по токсичности в сравнении с данными литературы представляются удовлетворительные. В отличие от проявляющих избирательность действия токсинов яда скорпиона В. eupeus, большинство токсинов из яда скорпиона 0. scroblculosus имеют менее выравненную селективность 'и только два из них избирательны: 0sM3 - для млекопитающих и OsCrl - для ракообразных.

Гомогенность выделенных токсинов была доказана электрофорезом и рехроматогра^иеЛ, а такжэ анализом аминокислотного состава и N-концевых аминокислотных остатков, что одновременно позволило характеризовать их физико-химически. Определение молекулярных размеров по относительной подвижности токсинов при электрофорезе в ПААГе в присутствии SD3 показало, что мол. м. всех изученных нами токсинов, за исключением инсектотоксинов 111, КЗ и Й4, находятся в пределах 6-8 kDa. Мэл. м. токсинов 111, ИЗ и Й4 равна 4 kDa: токсины с такой мол. м. обшрухены нами впервые.

Результаты изучения аминокислотного состава (табл. 2 и 3), позволяет дифференцировать две структурные группы токсинов. Гокскны первой группы состоят из 60-78 аминокислотных остатков, для них характерно яадичие большого числа остатков Asp и юлное отсутствие Kfet. Обращает внимание одинаковое содержание ютатков полуцистина и висское содержание положительно зарягкен-шх аминокислотных остатков - 9-18%. от обнего числа: обнаруке-

Таблица-2. Аминокислотный состав токсинов для млекопитающих ядов скорпионов В. eupeus и 0. scrobiculosus.

Аминокислота I'd iß Ш М4 Ы5 Ш М7 М8 Oslü Osi.ß OsM3

Asx И 10 9 10 И 9 13 10 7 8 10

Thr 2 2 1 2 2 2 2 1 3 2 2

Ser 4 3 3 3" 3 3 4 3 3 3 3

ßlx 6 4 5 6 4 . 2 4 3 4' 3 3

Pro б 3 4 5 6 3 4 5 3 3 4

Gly 6 5 б 6 8 6 9 7 11 6 11

Ala 7 4 5 5 6 4 6 6 3 6 4

i/Z Cys 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8

Val 2 - 3 2 2 3 1 1 5 2 4

Met ' - - - - - - - - - - -

lie 4 2 2 3 4 .4 2 2 3 2 3

Leu 3 2 1 2 3 2 2 3 3 4

Туг 4 3 б 4 5 4 4 4 2 5 3

Phe - - 1 1 ■ - £ 2 -, 2 -. -

His о А* 3 -'• 4. 2 2 2 2 3 1 4

Lys, .5 5 8 5 9 5 3 5 . . 3 6 4

Arg 2 3 2 г 2 г 2 2 3 2 ' 2

Trp 3 3 4 2 4 2 5 3 1 Z - 1

Всего 75 60 68-' 70 78 64 73 64 67 .63 70

N-конец Ala Ala Val Ala AlaCAla Ala Ala Gly Asp Glu

MI - М8 - токсины яда скорпиона В. eupeus; OsMl - ОзМЗ - токсины яда скорпиона 0. scrobiculosus.

низ большого числа остатков дикарбоновых ашнокислот с учетом сильной основности шлекул токсинов позволяет заключить, что часть аспарагиновоя и глутаминовой аминокислот находится в амидной форме. . Следует отметить отсутствие или ..¿значительные количества Pte при относительно высоком содержании другой ароматической аминокислоты - Туг. Щ аминокислотному составу ток-сшм первой группы сходны с выделенными ранее токсинами из яда других скорпионов [Miranda F. et al., 1970; Babin D.R. et al., 1971; Mclnlosli M & V'att D. , 1973]. В эту группу ВХОДЯТ все

Таблица 3. Аминокислотный состав иисектотоксикбв ядов скорпионов В. еиреиз я О, зогоЫси1озцз, токсина для ракообразных яда 0. гсгсЫси1озиз и фосфолипазы А1 яда паука Е. шеег.

Аминокислота И1 112 ИЗ И4 сыт 0з1п2 0: з1пЗ ОзСг! ЕпРА

Аэх О 11 Г) 5 8 и , 9 .. 10 18

ТИт 2 2 3 2 4 2 ■ 3' 3 5

Бег - б - - . б Ь б 5 б

61х ' о о 1 2 1 3 1 1 У 8

•Рго 3 2 1 2 2 1 2- 2 ^

61у 4 7 5 4 б б ' 4 5 10

А1а 2 2 1 1 3 3 3 3 9

1/2 Суз 3 8 8 8 8 3 8 ' 8 12

Уа1 , - 1 - ■ - 1 - • 3 3 5

3 - 2 3 - - _ . - - - л.

Но - 3 - - 3 3 2 ' 2 б

Ьеи 1 3 1 1 5 3 б 8

Гут 1 4 1 - 5 4 .4 0 9

РЬа т 1 «5 А* 2 1 1 1 1 4

1113 - - 1 • 1 1 1 - 1

2 8 1 3 8 6 7 7 8

'V* к» 3 - 5 2 2 3 2 3 б

Тгр - 3 - - 1 3 .3 1 3

Всего 36 62 35 35 б 7 02 62 71 123

Я-конец М-эЪ А1а МгаЬ Ьуз Азх 01 х Ьуз Азп

И1-И4 - инсектотэксины яда скорпиона В. еиреиз; 0ь"1п1-0з1пЗ -кнсектотоксины, 0зСг1 - токсин для ракообразных яда скорпиона 0. гсгеЫ си1озиз; ЕпРА - фосфодипаза яда паука Е. Швег.

нейротскеины для теплокровных и инсектотоксдо И2 яда В. еиреиз и все неЛротоксинн яда 0. 2сгоЫси1озиз.

Имеете с тем, в яде скорпиона В. еирэиз впервые обнаруюг-на новая структурная группа токсинов, состоящих всего из 35-35 аминокислотных остатков. Б их составе пэйдеиы остатки что в цело« кэ характерно для токсинов яда скорпионов. Среди лру-

гих существенных особенностей можно отметить отсутствие остатков Trp, Ile, Val и Ser, а гакже 1сраЯне низкое содержание Туг.

Все токсины, выделенные из ядов скорпионов как правило, содержат по восемь остатков полуцистинов. Из литературы известно, что в токсинах все SH-группы замыкаются дисульфидными мостиками, а разрушение даже одной дисульфидной связи сопровоада-ется потерей токсичности [Rochat С. & Sampiery F., 1976]. Действительно, с помощью метода амперометрического титрования мы показали, что ни один из выделенных нами токсинов ае содержит свободных сульфгадрильных групп. Следовательно все обнаруженные Е их составе Q остатков полуцистина замыкаются четырьш дисульфидными мостиками.

Определение N-концевых аминокислот подтвердило гомогенность полученных нами токсиное и позволило показать, что все токсины для млекопитающих яда скорпиона В. eupeus, за исключением токсина U3, на М-конце имеют Ala; токсин МЗ содержат на N -конце Val и отличается от других токсинов для млекопитающих по клинической картине вызываемого отравления, что позволяет предполагать его более существенные структурные особенности. Токсины ОзШ, 0зИ2 и 0sM3 в качестве N-концевого остатка имеют соответственно Gly, Asp и Glu, что доказывает их структурную разницу и отличает от токсинов для теплокровных.из яда В. eupeus. "Короткие" исектотоксшы ill, ИЗ и Ш в качестве N-концевого остатка содержат Met, а токсины И2, Oslnl, OsInE и 0з1пЗ соответственно Ala, Lys, Asx и Six. Уже тот факт, что "короткие" инсектотоксдаш имеют значительно меньшие молекулярные размеры и содержат в своей-молекуле Met, что не свойственно другим токсинам ядов скорпионов, позволяет нам заключить, что они относится к новому, ранее нё известному, структурному типу токсинов. ■ • . .

' ЕЫДЕЛЕШЕ ПРЕСШАЛТЛЧЕСКИХ НЕЙРОТОКСШЮВ ИЗ ЯДА ПАУКА - STEATODA PAYKULLIANA

Паук Sue-atoda paykulllana, принадлежит к сем. Thsrldlidae. Определение количества белка показало, "что на долю последнего приходится 50-60% от всей массы яда. Злектрофоретический состав Сиглкоь яда характеризуется преобладанием высокомолекулярных компонентов (40-150 kDa). Определение фосфолипазной и про-тс-олигической активностей, а также оценка прямого гемолитического действия исследуемого яда помазало, что он лишен указан-

Цельтй яд

! С&фаяекс 0-100 ¡1

II

III

IV

I

П5/:Е-!:=усрэ:1г1 650 К

1-1 1-2 1-3

111-1 III-2 II1-3

Т5Х 6Е1-Соуореаг1 г ' |

1-3' БрТ 1-3'

Ш-ГГ Ш-2

Рис. 3. Общая схема разделения: яда- паука ЭЬеаЬосГа рауКиШапа.

5рТ и 5р1Т - индивидуальные токслки.

линэргичесгах синапсов лягушки к- глутаматоргкческих синапсов саранчи. На синапсах обоих типов латентный период состагатж 40 -60 шш. При увеличении концентрации гтого компонента происходит соответствующее увеличение частоты миниатюрных потенциалов в цачках, сопровождающееся сокращение?* межпзчэчньис интервалов и латентного периода.

Из полученных данных следует, что низкомолекулярный компонент, взаимодействуя с пресинаптичзскоЯ мембраной, подиФпци-рует спонтанную секрецию ыэдяатора, щюлзязвдуяся я виде пачэк миниатюрных потенциалов. Тот факт, что при действии- нпзках концентраций токсинов БрТ и Бр1Т такяе отыэчэно появление пачек миниатюрных потенциалов, свидетельствует о тег.?, что обуслагли-вакняй их появление ксююнеит содержится или сходит в состав шдекул высокомолекулярных токсинов 5рТ и 5р!Т.

В экспериментах на ЯШ было показано, что оба токсина и нивкошлек/лярный компонент узегичигата проводимость Оислойиых ■тайрап, образуя каналы. Сопоставление свойств каналов, формируемых этими вещества!® и цельным я док:, показало, что они практически ке отличается и является одкотйлшйи по' большинству параметров й обладают катионседемшгестьй. На основании этого 1рэдгголагается, что во всех токошгах гласную роль играет ком-юнект с кол. м. 5 кОа, который модат формировать каналы про-юяимося! и самостоятельно действовать преешалтически, но ак- '

тивируе^ея и/или приобретает специфическую направленность в присутствии другого компонента с большой мол. м. Ка основании полученных данных сделано предположение, что структура преси-наптичеоких нейротоксиков яда паука S. paykulllana состоит ив высокомолекулярного промотора, обеспечивающего избирательное взаимодействие с прееинаптической мембраной синапсов позвоночных (токсин SpT) или насекомых (токсин SpIT), и низкомолекулярного пептидного компонента являющегося каналоформером. Эта точка зрения находится в соответствии с ныне забытой гипотезой ÍMoCrone J. & Hatala J., 19673 о низкомолекулярноы токсине паука Latrodectus ni. mactans. Подтверждением сделанного выше прёд-положения можно считать недавнюю работу CKlyatkin N. et al., 19923, которые показали, что л -LTX содержит два компонента: и "LTX (мол. м. - 130 kDa) и низкомолекулярный белок с мол. м. около 8 kDa. Авторы полагают, что обнаружение ¿-LTX и белка низкого молекулярного веса не является артефактом, так как биохимические свойства этих белков отличаются (pi oc-LTX - 5.9, а pi низкомолекуляриого бедка - 4.0). Предполагается, что низкомолекулярный белок компактно связан ' с «< -LTX л потому шлет быть обозначен как ^-субъединица иейротоксина.

ВЫДЕЛЕНИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА Ш>ЮЖПАЗЫ Al ИЗ ЯДА ПАУКА EP.ESU3 NIGER

Б отличие от ядов других исследуемых нами паукообразных яд паука Eresus niger обладал фосфолипазной и протеазной активностями, а также пресинаптически ориентированной нейроток-сичностью, прямым гемолитическим действием и способностью влиять на свертывание крови. Как показали электрофиаиологические исследования яд этого паука блокирует как спонтанную, гак а вызванную секрецию медиатора. Сравнение на¡лих и ' литературных данных [Kelly R. & Brown F. , 1974; Harris J., 1985] свидетельствует о том, что эф^кты яда этого паука сходны с эффектами нресинаптических нейротоксинов ядов змей, обладающие, фосфолипз зной активностью [Yang1 С. & Lee Ii , 1086; Boffa М. et al., 19S23.

Около 607. всей массы яда составляют белки и полкпептиды. Электрофорез в ще-лочной среде (pH 8. 3) выявил наличие в составе яда этого паута около 15 компонентов. Эксперименты по .определению токсичности яда к млекипит-дющим и насекомым показали,

что величина его LD50 при в/б введении белым шпам равна 120 мг/кг, а величина DIOO для тараканов составила 78 мкг/г. Опыты по определению фосфолипазной активности гда дали положительные результаты. Фосфолипазная активность лучке проявляется в щелочной области с максимумом при рН 8.0. В этих условиях удельная активность энзима . достигает 10 мкМ/мпн на иг белка. Анализ продуктов гидролиза фосфатидилхолина с помощью ГНХ, проведенной совместно с Исамухам»довым А. 11, показал,. что яд этого паука отщепляет преимущественно зшрккэ кислота п положим Snl, что позволяет определить содерзкалщйсл в нем энзим как фосфоли-пагу А-1. Протеолитическая активность яда была незначительной и составляла 0.0034 ед/мг при гидролизе казеина, йце одним от-■личительным свойством яда этого паука оказалась его антккоагу-яянтлая способность CUsrranov Р. & Nuri tova F., 19943, установленная при определении активированного частично тромбошксти-нового времени (АРТТ) и в протромбкновом тесте (ПВ). Гемолитическая активность цельного яда не высота и составляла (3%.

Для идентификации действующих начал, ответственных за биологические активности, яд этого паука также был подвергнут ^акционированию.' При ионообменной хроматографии- на DEAE-toyo-poarl 650 М получено девяп Фракций Г-IX. Практически всей ак-тивкостьй фосфолгатазы А цельного- яда-обладала фракция vi.II: ее удельная активность составила '17 мкМ/кин на № белка. Следух»-ВИй этап разделения включал геяь-хрокатографяю фрггашн VIII на Сефакриле S-SC0. В результате ее удалось разделить на пять фракций VIII—i - VI11-5,- среди которых фосфолипазной активностью обладали только две - VII1-3 и VII1-4, причем фракция ' YIII-4 имела большую активность, равную 38 мкИ/мщ на мг белка. Незначительная активность - фракции VII1-3, по-видимому, объясняется примэсыэ компонентов фракции VII1-4 из-за недостаточно полного отделения от фракции VII1-4, в которой-сосредоточена практически вся ферментативная активность' цельного яда. <Гршшя VII1-4, воиихо фосфолипээной активности, содержала . компоненты, ответственные за гемолитическую и антикоагулянтяуто активности цельного яда. Тестирование полученных фракций с помощью электрофизиологических методов исследования показало, что иейротоксичнсеть» такт.э обладала только фрагщия Vil 1-4. На следующем этапе очдопш, оказавшемся ааклшчтэльньм, мы подвергли в ту фракцию высокоэффективной "гздкееткой хроматографии

Рис. 4. БЭЖХ фракции УШ-4 яда паука Егезиз п1е&г на колонке и^гароге НРЗС, уравновешенной 0,1% ТРА. Эдюцшо вели в градиенте концентрации ацетонитрила (от 0 до 60%).при скорости тока 1 мл/шн; 1-4 - объединенные фракции, ЕпРА - фосфолкласа А1.

в обращенной фазе (рис. 4). Е результате было достигнуто разделение этой фракции на чотирь ко;дпонента 1-4. Тестирование, биологической активности показало, что компонент 1 обладал фас-фолипазной и антнкоагулянтной активностями. Его- удельная фосфо-липазнзя активность снизилась по сравнению с активностью фракции УШ-4 «.составила £0 мкы/шш ка «г. Остальные компоненты оказались не активными.' Ни один из полученных компонентов нэ обладал лейротоксической активность». Выход фосфолипазы А, обозначенной нами как ЕпРА (компонентою, составил около 2%. Частичную инактивацию Ферментативной активности и полную потерю ньйротоксаческой, мо?,ио,- по-видимому объяснить структурными нарушениями, происходящими в процессе последнего разделения.

ЗОЗ-электрофорез компонента ЕпРА выявил наличие одной полосы, расположенной в районе мол. ы 14 кОа (12865 Ба на основе аминокислотного состава) , что.соответствует мох м. фосфо-лияоз из других ядов животного происхождения [Теп2 с. et а1., 1084; ОиЬаэигсИиэ С. а1., 1987; Кипге Н. еЪ а1., 1988; Пэ-В. еь а1., 1989]. Анализ продуктов гидролиза фосфатидилхо-лша с известным жирнокислотным составом показал, что выделенная нами фосфолипааа отщепляет жирные кислоты в положении 1 (5п-1) «олекулы фосфолипида и, следовательно является фосфоля-

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Исследованные в настоящей работе токсины различных ядовитых паукообразных направленно поражают механизмы интеграции, базирующиеся на передаче сигнала в нервной системе. Предложенные наш методы выделения этих токсинов основаны на использовании ряда xpoiiai ¿графических операций, позволяющих осуществлять как аналитическое, так и препаративное разделение исследуемых ядов, показано, что применение комбинации методов аминокислотного анализа, идентификации N-концевых аминокислотных остатков, электрофореза и масс-спектрометрии является необходимым условием надежной оценки степени гомогенности выделенных токсинов и одновременно снабжает информацией, характеризующей основные физико-химические параметры полученных веществ.

Таким образом, с помощью предложенных в настоящей работ« методов фракционирования природных ядов получено 37 индивидуальных токсинов (табл. 6), обладающих аксональным, пресинапти-ческим и постсинаптическим действием, а также фосфолипаза Al. Многие из этих нейротоксинов, тщательно охарактеризованных в процессе нашей работы, смогут найти применение в исследованиях структуры я функции физиологически ?начимых мембранных образований. Данные о физико-химических и биологических свойствах токсинов станут основой для создания лекарственных препаратов нового типа с помощью современных биотехнологий. Существенным предетавляётся и тот факт, что некоторые выделенные нами индивидуальные токсины уже успешно использованы в ряде учреждений бывшего СССР в рамках программ "Нервный импульс" и "Ионный канал".

ВЫВОДЫ

1. Яды скорпионов В.' eupeus и 0. scrobiculosus, пауков S. saykulliana, Е. nlger, пяти видов Araneidae, а также вжно-аме-зиканского паука Linothsle sp. охарактеризованы по содержанию 5элково-пептиднсй части (в X) и ее компонентному составу. Показано, что в ядах скорпионов преобладают низкомолекулярные юновные белки и полипептиды, нарушающие проведение нервного мл улье а. В отличие от них яды пауков нарушает синаптическую ер'едачу, а соответствующие иейротоксины найдены среди выооко-олекулярных и нивкомолекулярных компонентов этих ядов.

2. Для получения индивидуальных токсинов разработан общий

подход к фракционированию ядов скорпионов, включающий экстракцию яда, выделение фракций низкомолекулярных компонентов с помощью гельфильтрашга и хроматографическое извлечение токсических полипептидов в ■ гомогенном виде. В соответствии с этими принципами из ядов В, eupeus и 0. scrobiculosus - получены 19 полипептчдных токсинов с избирательным действием на млекопитающих, насекомых и ракообразных:

а) из яда В. eupeus - 8 токсинов для млекопитающих и 4 -для насекомых (инсектогоксина) ;

б) из яда 0. scrobiculosus - 3 токсина для млекопитающих, 3 инсектотокеина к 1 токсин для ракообразных (крустатоксин).

3. Исследованы физико-химические свойства (спектры абсор! ции, молекулярные размеры, злектрофоретическая подвижность) элементы молекулярного строения (аминокислотный состав» конце вые аминокислотные остатки, число дисудъфмдных связей) выде ленных в гомогенной ввдэ токсических полипеятидов яда скортм нов. Установлено:

а) подавдяшй$ большинство токсинов представление t "длинной4 формой, предполагакдай органийааи» молекулы из 60-' ймииокнслоткых остатков и соответствующую молекулярную массу пределах 6-8 kDa;

б) среди инсектотоксинов установлена новая "коротка: форма, представленная полипепгидами из 35-36 аминокислот» остатков и молекулярной массой около 4 kDa;.

в) в качестве М-кокцевьгс аминокислотных остатков ндект филированы Ala (токсины Mi, М2, Ш, МГ>, Ш, L-Î7, Щ к V.2), V (КЗ), mi (111, ИЗ и Щ, Gly ( Os Ml ). Asp (Os КЗ), Glu (0sM3 Lys (Oslnl и OsCrl), Asx Î0sîn2) и 61x (0sln3);

г) шяеку^ы токсинов не содержат свободных сульфгидрш ных групп, acó обнаруженные в .их составе яолуцистины участщ в образовании сульфгидрильных связей: структуру сбоих ф< токсинов стабилизируют 4 дасульфидных мостика;

4. Оценена токсичность * выделенных поятштадоз из i скорпионов для животных из разных сгютештичзсквд групп: мл< питахщх. насекомых, ракообразных; сравнение рассчитанных : личин летального до&пшн обнаруживает относительный харак еелгшдатти у ряда »ыделеяпых токсинов.

5. Установлен пресинаптический характер нарушения син удаеской передачи, вызываемого ядами пауков S. paykullian

E. niger.

а) Из яда S. paykul1}апа выделены в чистом виде нейроток-синь селективно действующ© на млекопитающие (SpT) и насекомых (SpIT).' Оба токсина - высокомолекулярные белки (110 и 75 kDa соответственно) вызывают массированный выброс медиатора с пос- • дедукции блоком'сшаптической передачи из-за истощения вапасов медиатора. Показаны каналоформерные свойства SpT' и SpIT, а также обнаруженного в их составе низкомолекулярного (5 kDa) пептида Предложена модель организации молекулы токсинов из высокомолекулярного носителя и низкомолекулярного каналоформера и об-суздены причини селективности токсинов.

б) Из яда -паука Е. niger выделен в чистом виде белок с ыол. м. 14 kDa, содержащий остаток Asn на N-кокце молекулы и обладающий фосфолипазной активностью-(уд. активность 30 мкМ освобожденных жирных кхслот/мин на мг белка). Выделенный энзим идентифицирован в качестве фосфолипазы Al; он обладает гемолитической и антикоагулянтной активностями.

6. Установлен постеинаптический характер нарушения скнап-тической передачи, вызываемого ядами пауков сем. Arañe tdae: A. lobata, A. tartar Jcus, A. ccrnutus, A. mongol leus и A. angu-latus. Кз перечисленных ядов выделены а чистом виде 14 нейро-токсинов, идентифицированных как низкомолекулярные (600-800 Da) производные аминокислоты, полиамина и хромофора. Анализ строения и функциональной активности позволяет дифференцировать две группы токсинов Arañe id:

а) первая включает производные Glu, полнамика и неизвестного хромофора, которые обратимо и избирательно блокируют передачу в глутаматэргических синапсах насекомых и конкурируют с медиатором за глутамат-связьшаюшлй участок рецептора;

б) структура токсинов второй группы описывается как связанный с остатком Arg сперминподобный полиамин с 4-гидроксиин-долилуксусной кислотой в качестве хромофора; эти менее избирательные вещества необратима блокируют глутаматэргические синапсы насекомых и обратимо - холинэргические синапсы позвоночных*, показано, что токсины этой группы взаимодействуют с каинат-СЕЯЗывающим участком рецептора.

7. Из яда паука Linothele sp. впервые выделено два низкомолекулярных токсина Lsl и Ls2. Оба токсина высоко детальны только при интроцеребровентрикулярном введении белым мышам

(величина LD токсина Lsl - 24, а токсина Ls2 - 19 мкг /кг). Установлено структурное сходство этих веществ с токсинами ядов пауков Araneidas: мол. м. токсина Lsl равна 337 Da, а токсина Ls2 - 605 Da, в качестве хромофоров идентифицированы индоли-лукеусная кислота ' и 4-гкдроксишдолилуксусная кислота соответственно.

Еыражаю искреннюю благодарность научным консультантам -академику Ташмухамедову Б. А., профессору Ккельсону Л. Я., профессору Усманову П. Б. за всестороннюю помощь в обсуждении и анализе полученных экспериментальных данных и ценные советы в процессе выполнения работы, а также сотрудникам Института физиологии и биофизики АЛ РУ и ИБХ им. М. М. Шемякина АН РФ за оказанное содействие в проведении некоторых экспериментов.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Юкзльсон ЛЯ, Атакузиев Б. У. Яд скорпиона. Физиологически активные компоненты и механизм их действия. // В сб.: Транспорт ионов через биологические мембраны и механизм действия физиологически активных веществ (ред. Б. А. Ташмухамедов). - Ташкент. ФАЕ : 1982.-С. 163-185.

2. Усманов IL Б. , Казаков И., Каликулов Д. , Атакузиев Б. У. Юкельсон Л Я., Ташмухамедов Б. А. Низкомолекулярный каналофор-мерный компонент нейротоксиноз ядов пауков семейства Theridi-idae. // Химия природн. соед.-1983.-М 3.-С. 400-401.

3. Tashmukhamedov В.A., Usmanov Р.В., Kazakov I., Kali-kulov D., Yukelson L. Ya , Atakusiev B. U. Effects of different spider venoms on artificial and biological membranes. // in "Toxins as Tools in Neurochemistry". V,'alter de Gruyter, Berlin -New York. -1983. -P. 311-323. .

4. Ташмухамедов Б. A., Махмудова Э., Усманов FL Б., Казаков И. , Атакузиев Б. У. Выделение и реконструкция на бислойных мембранах глутаматных рецепторов насекомых. // Узб. биол. журнал. -1983. -N 6.-С. 57-58.

5. Ташмухамедов Б. А., Махмудова Э., Усманов IL Б., Казаков PL , Атакуэиез Б. У. Выделение и реконструкция глутаматных рецепторов на бислойных липидных мембранах. // До/спады АН СССР. -1984. -Т. 275. -N 4. -С. 977-980.

6. Usmanov P. В., Kazakov I., Kalikulov D., Atakuziev B. U., Yukelson L. Ya., Tashmukhamedov B. A. The Channel -Forming Component of the Theridiidae Spider Venom Neurotoxins. // fen. Physiol. Biophys. -1985, - V. 4. -N 2. -P. 185-193.

7. Ккельсон Я , Атакузиев Б. У., Сахибов Д. Н. <1осфодап.азг ная активность яда Echis multisquamatus. // Химия природ, со?Д, -1985. -П 2. -С. 261-264.

8. Атакузиев Б. У., Насыров К. Э., Каликулов Д., Усманов П, Б. Блокаторы глутаматных рецепторов из яда пауков Argiope loba-ta и Araneus tartaricus. // Химия природ, соед, -1990, -N 4.- С. 532-537.

9. Атакуаиев Б. У., Нуритова Ф., Усманов П. Б. Фосфолипаза А яда паука Eresus niger. //Химия црирод. соед.-1991.-N-4. -С. 557-560. .

10. Atakuziev В. U. , Tastoukhamedov В. А. , Yukelson L. Ya. Isolation and characterization of toxins from Central-Asian black scorpion Orthochirus scrobiculosus venom. // Journal of Natural Toxins. -1995.-V. 4. -N 2. -P.115-128.

11. Атакузиев Б.У., Ккельеон ЛЯ. Исследование токсинов яда паука Linothele sp. // Хймия природн. соед. -1996. -N 2.-С.

.12. Атакузиев Б. У., Юкельсон Л.Е, Ташмухамедов Б. А. Виде- . ление токсических компонентов из яда скорпиона Orthochirus scrobiculosus. // Тез. докл. V Всесоюзн. симп. "Химия и физйка белков и пептидов"- Баку.-1980.

13. Atakuziev В. U., Usmanov р. В., Yukelson L. Ya Isolation of membrane-active toxins from the venom of the scorpion Orthochirus scrobiculosus. //The III Soviet-Swiss sytnp. "Biological membrane. Structure and Function" Abstr. Tashkent. -1983. -P. 164.

. 14, Usmanov P. B., Kasakov I., Kalikulov D., Atakuziev B. U The low-molecular weight channel forming component of neuroto-, tins from the Latrodectus mactans and Steatoda (Lltyphantus)/:' iaykulliana spider venoms. // The III Soviet-Swiss symp. "Bto-i -logical itembrane. Strcture and Function" Abstr. Tashkent.-1983., •P. 209-210. ' ' '

15. Атакузиев Б. У., Усманов П. Е , Насиров К. Э., Юкельсон Л. L, Ташухамедов В. А. Выделение ниакомолекулярных бе.ШЬЫХ ток- , «нов из ядов пауков Argiope lobata и Segestria florenlifta. //,; . ез. докл. VI Есесоюзн. симп. "Химия белков и пептидов".-Рига. •

-1983.-0,87-88..

16. Усманов П. Б., Казаков И. , Каликулов Д. , Атакузиев Б. У Юкельсон JL Я. , Ташмухамедов Б. А. Каналоформерный .белок нейро токсинов ядов пауков сем. Therldiidae. // Тез. докл. VI Есесо тан. сиш. "Химия белков , и пептидов".-Рига.-1983.-С. 88-89.

17.- Атакузиев Б. У., Насыров Н.Э., Каликулов Д., Усманов I Б., Ташмухамедов R А. Аргилобатин из яда паука Areiope lobat* // Тез. докл. VII Всесоюзн. сиш. "Химия белков и пептидов". Талин:-1987. -С. 249.

13. Насыров К.Э., Шадыева Е , Атакузиев Б. У., Каликулов J Выделение и биологическая активность токсического компонент иа яда паука Aranous cornutus. // Тез. научн. сообщ. IV съез; физиол. Узбекистана. - Ташкент: -1988. -С. 179.

19. Нуртаев X С., Атакузиев Б. У., Зорькин А. С., Казаков ; Сравнительная характеристика нейротоксянов ядов пауков Stoat< da paykul 11 ana. tatrodectus pallldus. // Тез. научн. сообш, съезда Физиол. Уабекистана. - Ташкент:-1938. -С. 181.

20. Усманов R Б,, Каликулов Д., Шадыева К , Насыров К. Э Атакузиев Б. У. Модификаторы глутаматного рецептора из яда па ка Argriope lobata. // Тез. докл. Всесоюзн. сиш. "Одиночя ионные каналы в биологических мембранах". -Пущино: -1989. -С. а

21. Усманов П.Б., Каликулов Д., Насыров К.Э., Атакуаиев У. Модификация электро- и хемовозбудишх ионных каналов прир ныш неАротоксинамн. // Тез. докл. Меадунар. симп. "Мекбранн транспорт и механизмы его регуляции". -Тбилиси;-1989. -С. 247.

22. Atakuziev В. U., Arbaiza Е,, Plushnikov К. , Tashmukh jnedov Е А, , Grishin Е. V. Isolation and properties of the tox from a Peruvian funnel-web spider venom (Linothele sp. , Dlpl ridas). // In: Illrd International Workshop "Naturally occu ring compounds that affect neurotransmission". Buenos Aire Argentina / Montevideo, Uruguay. : 11-15 march 1991.-P. A2.'

23. Атакузиев Б. У. Природные нейротоксины как перспекту ные инструменты в мембранологии. // Структура и функции био; гических мембран. Тез. научн. конф. -Ташкент: -1995. -С. 54. •

. УРГШШСИШНЛАР НЕ©ОТОКСИШ1АРИШШГ СТРУКТУРАВЩ-ФУНКЦИОНАЛ ТАХЖЛИ Турли хил ургимчаксимонларнинг захарларидан биологии ф< Оирикмаларни ажратиб олшшинг умумий ендашувлари ва махсус ;

лублари ишлаб чикилдн. Гомогеи куриншида аисональ, пресинап-тик ва постсшаптик таъеир килувчи 37 та янги токсин акратил-ди: Buthus eupeus Ea'Orthochirus scroblculosus чаенлари заха-ридан сут змизувчилар, хашоротлар ва'кискичбакасимонларга тан- . лаб таъеир килувч." 19 та полииептид, хамда 13 та нейротоксия TherldiIdas, Araneidae ва Dlplurldae оиласига мансуб ургимчак-ларнинг захаридан ажратилган нейротоксинлар ичида холин- ва глутаматэргик синапсларнннг блокаторлари топилди.

В. eupeus ва 0. scroblculosus чаенларидан олинган токсинла-рнинг аксарияти и. ог. 6-8 kD, молекуласи 60-78 аминокислота колдигидан иборат "узун" формада курсатилган; инсектотоксинлар ичида оса м. ог. 4 kD атрофида, 35-36 та аминокислота колдигидан иборат булган полипептид "киска".формада курсатилган. Ток-синларнинг бу иккала формасияи 4 та дисульфид боги муътадил-лаштиради.

Steatoda paykulliana ургимчаги захаридан холинэргик (SpT токсини) ва глутаматэргик (SpIT инсектотоксини) синапслардаги мэмбраналар билан танлаб узаро таъеир килувчи нейротоксинлар топилди. Бу нейротоксинлар юкоримолекуляр-(НО ва 75 kD) ва пастшдекуляр (5 kD) кошонентлардан таикил топган булиб, ВЛМ да канал хосил килади. Бу икки токсин медиаторнинг оммавий чи-кариб талланишни келтириб чикзради. Бунинг натижасида, яъни ждиатор зэхирасининг тугагш билан синаптик узатии блокланади.

Eresus luger ургимчаги захаридан биринчи марта антикоагу-еянт ва гемолитик фаолликка эга булган фосфолипаза AI (ЕпРА) «Чратиади ва унинг м. ог. 14 kD, 123 та аминокислота колдигидан гаркиб топган, N-охирида Asn булган полипептид эканлиги аник-нанди. • ■ •

Araneidae оиласига мансуб ургимчаклар: Areriоре lobata, Araneus tartaricus, Araneus cornutus, Araneus mongollcus ва' . Vransus angulatus захарлари келтириб чикарадиган синаптик уза-■ишнинг бузилишини синаптик характери аникланди. Еу Захарлар- -¡ан ажратилган и. ог. 600-800 Da булган нейротоксинлар узининг' У8идиши ва фаодлигига кура 2 гурухга булинадн: 1) Glu, полиа-ин ва номаълум хромофорнинг хосилалари. Булар хашротларнинг ', лутаматэргик синапсларидаги узатишни кайтар холда ва танлаб'' локлайди, хамда рецепторкинг глутаттбогловчи кисмидаги меди-тор Силам ракобатлаыади. 2} Таркибада 4-гвдроксииндолилацетат' улган Arg билан богланган сперминга ухшаш хромофор сифатидаги, •

полиамин. Б1/ бирикмалар хашоротларда глутаматэргик синапсларни кайтмас холда, умурткалиларнинг синапсини эса кайтмас холда блоклайди. Аникланишича, 2-гурух токсинлари рецепторнинг каи-натбогловчи кисми билан узаро таъсир этади.

Linothele sp. ургимчаги захаридан эса биринчи марта Ага~ neidae ургимчаклари захарига тузилиши жяхатидач ухшая булган 2 та паетмолекуляр токсин ажратиб олинди.

STRUCTURE-FUNCTIONAL AfJALYSIS OF ARACHNIDAS NEUROTOXINS

General approaches and special methods of isolation of biologically active compounds from different Arachnldas venoms have been worked out. 37 new toxins having axonal, presynaptic and postsynaptic action : 19 polypeptides with a selective action on mnrnals, insects and crustaseas from scorpions Buthus " eupeus and Orthochlrus scrobiculosus venom; and 18 new neurotoxins, among which blockers of choline- and glutamterglc synapses from spiders of Theridiidae, Araneidae and Dipluridae families • venoms are found, have been Isolated In a homogeneous form.

Most toxins of scorpions B. eupeus and 0. scrobiculosus venom are presented by a "long" form, vhen a molecule of 60-78 amino acid residues has mol. m. 6-8 kD; among insectotoxins a new "short" form presented by polypeptides of 35-36 amino acid residues and mol, m. about 4 kD, has been determined; the structure of both molecular forms of the toxins is stabilized by 4 disulfide bridges.

Neurotoxins selectively interacting: with presynaptic membranes of cholinergic (tnxin SpT) and glutamtergic (lnseoto-toxin SpIT) synapses, consisting of high molecular (110 and 75 kD) and low molecular (5 kD) 'weight components forming channels in BLM, have been found, in spider Steatoda paykulliana ve-■nom. The both toxins cause a massive release of transmitters with a subsequent block of synaptic transmission.

Phospholipase A1 (EnPA) having anticoagulant and hemolytic activities-have been isolated from the spider Eresus niger' venom. The EnPA IS a polypeptide with a mol. m. of 14 kD consisting of 123 amino acid residues on the N-terminal of which Asn is.

A postsynaptic disturbance of the synaptic transmission caused by the wenomsof spiders of the Aranetdae family: Argio-pe lobata, Araneus tartarí cus, Araneus cornutus, Araneus irongo-licus and Araneus angulatus has been determined. The neurotoxins with the mol. m. 600-800 Da isolated from these venoms have been deferentlated into two groups, by their structure and functional activity: 1 - derivatives of Glu, polyamine and an unknown chromophore which reversibly and selectively block the transmission in glutamaterglc synapses of insects and compete with the transmitter for the glutamate-linking site of receptor and 2 - is connected with Arg spermine-like polyamine with 4-hydroxyindoleacetio acid as chromophore irreversibly blocking glutamatergic synapses of insects and reversibly - cholinergic synapses of the vertebrates. It is shown that the toxins of the second group interact with a kainate-linking site of the receptor.

For the first time two low molecular mass toxins structural like the toxins from spiders Araneidae venoms have been isolated from the spider Linothele sp. venom.