Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Нейрогуморальные механизмы стрессорного действия зоотоксинов и физиологические основы коррекции их повреждающих эффектов

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Нейрогуморальные механизмы стрессорного действия зоотоксинов и физиологические основы коррекции их повреждающих эффектов"

лЛ

АКАДЕМИЯ НАУК ГРУЗИНСКОЙ ССР ИНСТИТУТ ФИЗИОЛОГИИ им. И. С. БЕРИТАШВИЛИ

На ирапах рукописи

ГЕЛАШВИЛИ Давид Бежанович УДК 612.01.017:591.145.2

НЕЙРОГУМОРАЛЬНЫЕ МЕХАНИЗМЫ СТРЕССОРНОГО ДЕЙСТВИЯ ЗООТОКСИНОВ И ФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ КОРРЕКЦИИ ИХ ПОВРЕЖДАЮЩИХ ЭФФЕКТОВ

03.00.13—Физиология человека и животных

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

ТБИЛИСИ 1989

Работа выполнена на кафедре физиологии и биохимии человека и жнвотных Горьковского ордена Трудового Красного Знамени государственного университета им. Н. И. Лобачевского н в отделе биологических исследований НИИ химии при ГГУ.

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук Э. С. Моннава;

доктор биологических наук Г. В. Абуладзе;

доктор медицинских наук М. Я. Волошин.

Ведущая организация—1-й Московский ордена Ленина государственный медицинский институт им. И. М. Сеченова.

Зашита диссертации состоится «_»_______'989 г.

в__часов на заседании специализированного совета Д 007.09.01

при Институте физиологии им. И. С. Бериташвили АН ГССР (380060, г. Тбилиси, ул. Готуа, 14).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института физиологии им. И. С. Бериташвили АН ГССР.

Автореферат разослан «_»__ 1989 г.

Ученый секретарь специализированного совета кандидат биологических наук

Г, Г. Берадзе.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Среди биологически активных веществ природного происхождения одно из центральных мест занимают животные яды, или зоотоксины - уникальная по химической природе и физиологическому действия) группа соединений- Зоотоксины нашли широкое применение в качестве высокоселективных "тест"-веществ в фундаментальных исследованиях в биологии и медицине, на их основе созданы эффективные лекарственные и диагностические средства. Зоотоксины являются предметом изучения з о о -токсикологии (Б.Н.Орлов,Д.Б.Гелашвили,1985), в круг задач которой входит исследование механизмов физиологического и токсического действия животных ядов, разработка принципов и методов антидотной терапии, выяснение роли зоотонсинов в химической эволюции живых организмов, применение специфических свойств зоотоксинов для. моделирования физиологических и патологических процессов и др.

С общебиологической точки зрения зоотоксины являются химическими факторами, участвующими в межвидовых, или аллелохи-мических взаимодействиях. В то же время, являясь орудиями нападения или защиты, зоотоксины, в конечном счете, служат для поражения организма хищника или жертвы, выступая по отношению к нему в качестве мощных стресс-факторов. Острое стрессорное воздействие, оказываемое зоотоксинаыи, обусловленное внезапностью контакта и интенсивностью эффекта, является биологически целесообразным и эволюционно обоснованным. В рассматриваемом плане особую важность приобретают исследования физиологи-чесгжс механизмов формирования интегральной реакции организма на острое стрессорное воздействие, определяющей устойчивость организма к действию стресс-факторов. Несмотря на обилие экспериментальных и клинических исследований в области зоотокси-

I

гологии, выполненных как в нашей стране, так и за рубежом, до настоящего времени фактически не были изучены нейрогуморальные механизмы нарушения и поддергкания гомеостаза при действии зоо-токсинов. В то же время, изучение динамики вовлечения физиологических систем организма и их участия в формировании ответной реакции дает возможность не только раскрытия интимных механизмов возникновения стресса, адаптаций и функциональных нарушений, но и обоснования принципов коррекции повреждающих эффектов зоотоксинов.

Диссертационная работа является составной частью исследований по темам: "Сравнительно-физиологический и биохимический анализ механизмов действия ядов животного происхождения (№ гос. рег.81062913), выполняемой в рамках НТП ГКНТ СССР 0.74.05 (задание Н2, постановление ГКНТ СССР, Госплана СССР и АН СССР от 13.02.81, № 24/25/13); по плану экономического и социального развития РСФСР на 1982г. (постановление СМ РСФСР от 09.11. 81, К» 606); по комплексной НШ Минвуза РСФСР "Биосистемы"; "Управление регуляторными механизмами биосистем путем воздействия на ферментный аппарат и мембранные структуры с целью повышения урожайности сельскохозяйственных растений, получения новых биопрепаратов и защиты промышленных материалов от биокоррозии", выполняемой в рамках общесоюзной HIT1 ГКНТ СССР 0.74.05 (задание I3H2, постановление ПИТ СССР и АН СССР от 03.02.87 J," 26/13).

Цель работы. Основная цель работы - исследование общих и специфических нейрогуморальных механизмов формирования интегральной реакции организма на острое стрессорное воздействие зоотоксинов, выявление ведущих нервных и гуморальных факторов, вызывающих субклеточные и клеточные, органные и системные реакции дезинтеграции физиологических функций и меха-

г

низмы их компенсации, разработка на основе полученных данных принципов коррекции повреддавдих эффектов зоотоксинов и обоснование путей их практического использования в биологии и медицине .

Основные положения диссертации, выносимые на защиту:

- Ведущим звеном в формировании интегральной реакции организма на острое стреосорное действие зоотоксинов является гиперсекреция эндогенных физиологически активных веществ

(нейромедиатсров, кейромодуляторов, гормонов). Массивный выброс из физиологических депо нейромедиаторов и нейромодулято-роз обуславливает реализации их функций как по транс-, так и по параскнаптическо.уу механизму, обеспечивая, в последнем случае, дистантный эффект.

- Активация под влиянием зостоксинов, наряду с гипотала-мо-гипсфпгарно-надпочсчниковой и симпато-адреналовой, эндогенной опиоидной системы (ЭОС) является важным физиологическим механизмом формирования стресс-реакция организма. При этом, в зависимости от интенсивности действующего стресс-бак-тора, ЗОС обеспечивает либо компенсацию воз^цтцего эффекта, либо выступает в роли триггерного звена "порочного круга" патологических реакций.

- На внутриклеточном уровне стреосорное действие зоотоксинов реализуется с участием системы циклических нуклеотидов, выступающих в качестве звена быстрой адаптации к воздействию стресс-факторов. При использовании зоотоксинов в терапевтических дозах циклические нуклеотиды опосредуют восстановительные и регенерационные процессы в поврежденных тканях.

- Эпилептиформные свойства нейротропных зоотоксинов обусловлены особенностями их химического строения и специфичностью первичного физиологического эффекта. Полипептидные

3

нейротоксины яда скорпиона при введении в обход ГЭБ вызывают генерализованный судорожный припадок за счет тотальной модификации натриевых каналов электрогенной мембраны и ее стойкой деполяризации. В основе судорожного действия алкалоидов яда саламандры, молекула которых содержит семичленный азепиновый гетероцикл, лежит их способность взаимодействовать с бензоди-азепин-ГАМК-рецепторным комплексом.

- В развитии и поддержании эпилептиформной реакции, 'вызванной нейротропными зоотоксинами, важную роль играют нейро-гуморальные механизмы, реализующиеся через циклазцуго, бензо-диазепиновую и эндогенную опиоидную системы.

- Уровень стресс-гормонов (АКТГ и инсулина) и бета-эвдо-рфина имеет прогностическое значение в начальную фазу шокового состояния, вызванного ядом гюрзы. Опиатный антагонист на-локсон и ингибитор сериновых протеиназ контрикал (гордокс) в комбинации с моновалентной противозмеиной сывороткой потенцируют защитный эффект последней, что может служить основой для разработки эффективных методов антидотной терапии.

- В зависимости от специфичности стрессорного действия зоотоксинов, обусловленных особенностями их химического строения и физиологического механизма действия, компенсация нарушений нейрогуморальной регуляции монет цротекать по механизму стабилизации, многопараметрической компенсации, либо по комбинированному типу.

Научная новизна«Комплексный физиолого-биохимический'и фармакологический анализ нейрогуморальных механизмов стрессор-ного действия зоотоксинов позволили подучить ряд новых экспериментальных результатов и теоретических заключений.

Впервые изучены нейрогуморальные механизмы стрессорного

действия полипептидных нейротоксинов яда скорпиона. Экспери-

4

ментально доказано, что наблюдаемая в клинике неврологическая симптоматика связана с воздействием нейротоксинов на постганг-лионарные нервные терминал» вегетативной нервной системы. Установлено, что тотальная модификация натриевых каналов в пре-синаптических терминалях в периферической, вегетативной и центральной нервной системе является триггерным механизмом, ведущим к гиперсекреции нейромедиаторов, нейромодуляторов и гормонов.

Впервые доказано, что на внутриклеточном уровне действие нейротоксинов реализуется с участием циклических нуклеотидов. Установлено, что полипептидные нейротоксины яда скорпиона вызывают нарушение количественных соотношений катехоламинов(адреналин и норадреналин) и циклических нуклеотидов (цДМЗ и цГМ2). Особенностью указанных нарушений является преимущественное увеличение содержания норадреналина, а в системе циклических нуклеотидов - цШЗ.

Изучены особенности экзокринной и эндокринной функции поджелудочной железы в условиях стрессорного действия полипептидных нейротоксинов яда скорпиона. Выявлено нейрогённое звено (холинергическая активация), ведущее к развитии симптомов острого панкреатита, сопровождающегося гиперсекрецией трипсина и альфа-амилазы. Показано, что коррекция этого состояния дает оптимальные результаты при воздействии на нервное и гуморальное звено путем применения антихолинергических средств и ингибиторов протекназ. Изучены нейропуморальные механизмы регуляции глюкостаза в условиях воздействия полипептидных нейротоксинов. Показано, что развивающаяся при стрессорном действии нейротоксинов гипергликемия протекает по адреналиновому типу.

Установлено, что в генезе гипертензивных реакций, вызыва-

емых ядом скорпиона, ведущую роль играет гиперсекреция кате-холашнов из нервных окончаний и, в меньшей мере, из надпочечников. Показано, что ренин-ангиотензин-альдостероновая система также вносит свой вклад в поддержание гипертензивной реакции.

Впервые изучены нейрогуморальные механизмы развития и поддержания эпилептиформных состояний, вызванных нейротропными зоотоксинами. На модели судорожной реакции, вызываемой алкалоидными нейротоксина'ми яда саламандры, изучена взаимосвязь цик-лазной, бензодиазепиновой и эндогенной опиоидной систем в гене-зе эпилептиформных состояний. На основе структурно-функционального анализа молекулы алкалоидов, содержащих семичленный азепи-новый гетероцикл, сформулировано представление о наличии в яде саламандры природных лигандов бензодиазепин-ГАМК-рецепторных комплексов.

Впервые изучена нейродинамика пик-волновой пароксизмаль-ной ЭЭГ-активности в стрио-таламо-кортикаяьной системе при внутрижедудочковом введении полипептидных нейротоксинов яда скорпиона. Доказано, что экспериментально полученная модель малого эпилептического припадка близка по своим характеристикам к клиническому проявлению болезни. Новизна разработанного способа моделирования малого эпилептического припадка подтверждена авторским свидетельством (А.С.СССР №1326272).

Впервые установлена роль эндогенной опиоидной системы в развитии экзотоксинового шока, вызванного острым стрессорным действием яда гюрзы. Изучена динамика гиперсекреции бета-эн-дорфина и показал антидотный эффект опиатных антагонистов (налоксона и налорфина). Изучена роль активации гипоталамо-гипофизарного звена при остром воздействии ядом гюрзы и установлена противофазность в секреции АКТГ и его контр-гормона

инсулина, обеспечивающая гомеостатирование по механизму много-

6

параметрической компенсации. Изучена взаимосвязь рениновой активности плазмы и содержания в ней альдостерона с гемодина-шческими расстройствами в различные фазы шока, вызванного ядом гюрзы. Установлено, что ингибиторы сериновых протеиназ в виде лекарственных форм контрикала и гордокса существенно усиливают нейтрализующее действие моновалентной противозмеи-ной сыворотки "Антигюрза". На основе полученных данных разработана модифицированная сыворотка, превосходящая коммерческий препарат в два раза.

На основе полученных экспериментальных данных сформулирована концепция о роли гиперсекреции эндогенных физиологически активных веществ в формировании интегральной реакции организма на острое стрессорное действие зоотоксинов. Показано, что вызванные зоотоксинами нарушения нейрогуморальной регуляции могут носить, в зависимости от интенсивности стрессоркого воздействия, обратимый или необратимый характер. Гомеостатирова-ние физиологических функций при остром стрессорном действии зоотоксинов может протекать по механизму стабилизации, многопараметрической компенсации, либо по комбинированному тицу.

Теоретическое и практическое значение работы. Работа представляет собой комплексное исследование формирования интегральной реакции организма на действие стресс-факторов биотического происхождения. На системном, органном и клеточном уровнях установлена ведущая роль гиперсекреции эндогенных физиологически активных веществ в обеспечении нейрогуморальных механизмов стрессорного действия зоотоксинов. Экспериментально обоснованные универсальные функции эндогенной опиоидной и цик-лазной систем в механизмах стрессорного действия зоотоксинов

являются важными для понимания общих закономерностей формиро-

7

вания физиологических адаптация и создают предпосылки для поиска и разработки новых способов коррекции повреждающих эффектов биотических стресс-факторов.

Полученные результаты и положения работы включены в учебные пособия "Ядовитые беспозвоночные животные и их кды'Ч1931), "Ядовитые позвоночные животные и их яды"(1982), монографию "Зоотоксинология"(19В5), ряд обзорных работ, лекционный курс по нейрофизиологии в Горьковском университете. Методические подходы, обоснованные в работе, в том числе пакет прикладных программ автоматизированной системы статистического анализа ЭЭГ (АССА-ЭЭГ), а такке защищенные авторскими свидетельствами способы моделирования эпилептиформного состояния и получения модифицированной противозмеиной сыворотки "Антигюрза" используются в научных исследованиях в Горьковском медицинском институте, Горьковском НИИ травматологии и ортопедии, Горьков-ской специализированной клинической карциохирургической больнице, на кафедре физиологии и биохимии человека и животных ГГУ. Разработанные в ходе выполнения работы технические средства, защищенные авторскими свидетельствами (A.C. СССР М677994, 728795, 886905), использованы для обеспечения исследований, проводимых в рамках целевых комплексных программ АН СССР и ГКНТ СМ СССР "Нервный импульс" и "Ионный канал".

Публикации и апробация работы.По материалам диссертации опубликовано 38 статей, 2 учебных пособия, I монография, получено 5 авторских свидетельств СССР на изобретения. Материалы диссертации докладывались и обсуждались на: Всесоюзном симпозиуме памяти акад.П.К.Анохина "Механизмы системной деятельности мозга" (Горький,1978), Всесоюзных герпетологических конференциях (У - Ашхабад,1981; У1 - Ташкент,1985; УП - Киев,1989),

I Всесоюзном биофизическом съезде (Москва,1931), У Всесоюзном

8

совещании по целенаправленному изысканию физиологически активных веществ" (Рига,1983), УШ Всесоюзной конференции по нейро-кибернетике (Ростов, 1983), Всесоюзной конференции ''Метрологическое обеспечение измерений в биологии и медицине" (Таллинн, 1983), Всесоюзном симпозиуме "Стриарная система в норме и патология" (Ялта,1903), Всесоюзной конференции "Ферменты в биохимических анализах" (Паланга,1984), ХП Всесоюзной конференции по физиологии и патологии кортико-висцеральных взаимоотношений" (Ленинград,1986), ХП Всесоюзном совещании по транспортным ATS-азам (Иркутск,1937), П Всесоюзной конференции "Физиология, патофизиология и фармакология мозгового кровообращения" (Тбилиси, 1988), Международном симпозиуме "Центральная нервная система и постреанимационная патология организма" (Москва,1989).

Структура и объем работы.Диссертация содержит введение, б глав, заключение, выводы, приложение, рисунков, таблиц, библиография состоит из работ, изложенные на страни-

цах машинописного текста.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЩОВММЙ

Эксперименты проведены на 2222 животных, в том числе на 741 крысе, 1259 мышах, 79 морских свинках, 139 кошках и 4 кроликах. В опытах применяли яд пестрого скорпиона Butbus eupcua. , полученный разработанным нами методом элект-

ростимуляции (A.C. СССР №886905) от особей, собранных в различных районах Восточной Грузии, нейротоксическая фракция, выделенная из цельного яда в Институте биоорганической химии им.М.М.Шемякина АН СССР (Москва) и любезно предоставленная д.х.н. Е.В.Гришиным; яд пятнистой саламандры Salamandra

salamandra > полученный от особей, отловленных в пред-

горьях Карпат; яд среднеазиатской гюрзы Vipera lebetlna. ,

9

подученный из Института зоологии и паразитологии АН УзССР (Ташкент).налоксон ( "Dupont" , США), тетродото2ССИН ( "signa" США), рауседил ( "Gedeon Richter" , ВНР), контрикал ( »Arznoi-nittelwerk , ГДР), гордокс ( »Gedeon Richter" , ВНР), тра-силол ( "Behringwerke" , ФРГ), синтетический аналог лей-энкефалина, синтезированный Ы. И .Титовым (ВКНЦ АМН СССР, Москва), моновалентную противозмеиную сыворотку "Антигюрза'ЧТаш-кентский НИИВС), а также стандартные холинергические, адренер-гические, гистаминергические, курареподобные и наркотические фармакологические препараты отечественного производства.

В зависимости от целей и задач экспериментов зоотоксины вводили внутрибргаиинно, внутривенно, внутрижедудочково, внутримышечно, подкожно в терапевтических, сублетальных и летальных д<5зах. Фармакологические агенты применялись в терапевтических дозировках (В.В.Гацура, А.С.Саратиков,1977). В крови экспериментальных животных определяли содержание адреналина и норадреналина (Э.М.Матлина, 1969), гистамина ( Shore ,1963), глюкозы, с / -амилазы, мочевины, общего белка, аспартаттранс-аминазы (ACT), аланинтрансаминазы (АЛТ), холинэстеразы, количество эритроцитов, лейкоцитов, ретикулоцитов, гемоглобина, значения гематокритной величины и цветового показателя крови -унифицированными методами (В.В.Меньшиков,1987) с использованием серийного лабораторного оборудования: спектрофотометра СФ-46, микропроцессорного фотоколориметра КФК-1Ш, гемоцито-метра ГЦМК-3. С помощью коммерческих наборов для радиоиммунного анализа производства " "Becton a. Dickinson, (США); " Imauno Nuclear Incorporation, (США), "Sorin", (Франция), " Beringwarke AB, (ФРГ), " Amerehen " (Великобритания),

Института биоорганической химии АН БССР (Минск) в крови опре-

,f! ¡i

деляли содержание циклических цуклеотидов (3,Ь-цАМФ, 3,5-цГМФ)

10

инсулина, глюкагэна, трипсина, ренина, альдостерона, бета-эндорфина, соматотропного гормона (СТГ), з тканях мозга -циклических нуклеотидов, СТГ и бета-эндорфика, в перфузируемом сердце морской свинки - niffiS и цШ$. Подсчет радиоактивности проб и нахождение в них концентраций анализируемых соединений производили на автоматическом счетчике LKB V.'allao 1280

Ol trog essa (Финляндия) в комплекте с шни-ЭКМ Dato-3oxT222. Эксперименты по РКА физиологически активных соединений проводили на базе специализированной радиоизотопной лаборатории

о

Горьковской областной больницы. Высвобождение Н-дофаыина из перфузируемой головки хвостатого ядра крысы с помощью "ризЬ-

риН"- канюли изучали по О.В.Годухину и А.Д.Жариковой (1979). Ориентацию подкорковых электродов и канюль в острых и хронических опытах осуществляли с помощью стереотакскческой техники по координатам атласа Фифкова и Маршала (i960) с последующим морфологическим контролем. Регистрацию электрической активности коры и подкорковых структур осуществляли на комплексной электрофизиологической установке, включающей 8-каналькый электроэнцефалограф "im; Bioscript;" (ГДР), 8-канальный индикатор ИМ-769, 14-канальный инфразвуковой магнитограф Н-048 и вычислительный спектроанализатор СК4-72/2. Двигательную активность животных регистрировали с помощью медицинского пьезоэлектрического акселерометра ПАМ-I производства экспериментальных мастерских Института прикладной физики АН СССР, Горький. Текущую спектральную обработку ЭЭГ в ходе эксперимента производили с помощью вычислительного спектроанализатора СК4-72/2, в состав которого входит анализатор спектра последовательного типа С4-73, интегратор многоканальный Я4С-78 и блок измерительный Я4С-76. Эпоха спектрального анализа выборки ЭЭГ-реализации

в диапазоне 0,5-50 Гц составила 4с с автоматическим усреднени-

II

lew спектра мощности по 4 реализациям. Записанные в ходе эксперимента на магнитную ленту 8-канальные массивы ЭЭГ обрабатывали на КВК-2, реализованном на базе ЭВМ СМ-4 и снабженном крейтами КАНАК. Автоматическую обработку и спектрально-корреляционный анализ ЭЗГ осуществляли с помощью разработанной нами многофункциональной системы спектрально-статистического анализа ЭЭГ (АССА-ЭЭГ). Программы, входящие в состав пакета АССА-ЭЭГ, реализованы на языке Ыакро-П и йортран-4. Система позволяет вводить многоканальную аналоговую информацию (ЭЭГ) в ЭВМ и вычислять по каждому из каналов следующую информации: максимальное, минимальное значение амплитуды, абсолютный размах амплитуды, средняя и абсолютную мощность сигнала, среднеквадратичное отклонение и ошибку средней арифметической, распределение плотности спектра мощности по физиологическим диапазонам, суммарную мощность спектра, интегральный индекс, динамику изменения частотного' "окна", содержащего 85% энергии спектра мощности, вычисление коэффициента корреляции и функции кросскорреляпии, кросс-спектра, вычисление средних характеристик по эпохе анализа и вывод гистограмм распределения.

При изучении действия зоотоксинов на системное и регионарное кровообращение регистрацию системного артериального давления в бедренной артерии кошек и крыс осуществляли с помощью электроманометра " EFT Barover п. С помощью 4-ка-нального реографа РГ4-01 регистрировали реоэнцефалограм.му (РЭГ), интегральную реограмму тела (ИРГТ), реограмму сосудов задней конечности, ЭКГ и дьосание регистрировали цифровым полианализатором ПАЗ-01.

Изучение влияния полипептидных нейротоксинов яда скорпиона на процесс регенерации периферического нерва осуществляли

на модели первичной травмы большеберцового нерва крысы путем

12

его перерезки и последующего наложения микрохирургических шво^. Динамику восстановления чувствительности в зоне анестезии на подошве лапы изучали методом электрокожного раздражения с автоматической регистрацией латентного периода двигательной реакции на установке, состоящей из электростимулятора ЭСЛ-2, частотомера $-5034 и согласующего устройства. Электромиограм-му икроножной мышы в динамике регенерации поврежденного боль-шеберцового нерва регистрировали на полиграфе " Bioscript " и осциллографе C-I7 с последующим фотографированием с помощью фотоприставки ФОР-2. Для накопления базы данных ЭМГ записывали на магнитную ленту магнитографа Н-048 с последующей обработкой на. вычислительном спектроанализаторе СК4-72/2, С помощью быстродействующего тепловизора ТВ-03 по изотермам проводили измерение температурной разности подошвы лапы оперированной и здоровой конечностей. Гистологическое изучение процесса регенерации нервных волокон проводили общепринятыми методами на

импрегнированных серебром и окрашенных гематоксилин-эозином

125

препаратах. Фармакокинетику меченого I-токсина Мд яда скорпиона изучали при внутривенном, внутримышечном и внутринервном введениях. Подсчет радиоактивности осуществляли с помощью комплекта РПС-2-03А, снабженного счетчиком Т-25-БФЛ. Расчет фарма-

4

кокинетических констант времени полураспределения С и '/г. ) И времени полуЕыведения ( t^f/г. ) проводили в рамках двухчасте-вой открытой модели графическим анализом данных фармакокинетики по биоэкспоненциальному уравнению:

(В.Н.Соловьев, А.А.Фирсов ,

В.А.Филов,1980).

Изучение нейтрализующего действия разработанной нами модифицированной противозмеиной сыворотки "Антигюрза" проводили в соответствии с требованиями Комитета по вакцинам и сы-

13

Еороткам МЗ СССР, включающими испытания апирогенности, безвредности, стерильности, специфической (антилетальной) активности, а также по рекомендациям ВОЗ-антигеморрагической активности и противоотечного действия.

Математическая обработка экспериментальных результатов проводилась с использованием параметрических и непараметрических методов, выбираемых в соответствии со статистическим распределением исходных данных. При проведении корреляционного анализа вычислялись линейные, частные коэффициенты корреляции, а такие показатель мощности корреляции. Обработку данных проводили на ПЭВМ Искра-1256 и ЭВМ СМ-4.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУВДЕНИЕ

I. Особенности нейрогуморальной регуляции физиологических функций при остром действии полипептидных нейротоксинов яда скорпиона

Наблюдаемые при остром действии яда скорпиона и его нейротоксинов гипертензия, тахикардия, гипергликемия, истощение тканевых депо катехоламинов связаны с активацией симпато-адре-наловой системы. После кратковременного периода ьозбувдения, во время которого могут наблюдаться клонико-тонические судороги, животные становились вялыми и депрессивными. Однако они бурно реагировали на тактильные раздражения, резко возрастало число неспровоцированных драк при их групп о в о:.; содержании, что указывает на повышенную агрессивность животных. Клинические симптомы острого действия нейротоксинов характеризуются также экзофтальмом, саливацией, лакримацией, повышением ректальной температуры.

В крови возрастает содержание катехоламинов, при этом обращает на себя внимание ■тот факт, что концентрация норадре-

14

ьидпка увеличивается в большей степени, чем адреналина. Предварительная резерпинизация хшвотных, не влияя существенно на динамику содержания адреналина, значительна сникает уровень норадренаяина в периферической крови после введения нейроток-с::;ка (табл.1).

Таблица I

Изменение содержания натехолашнов (».«г/л) в крови иитактных и резерпинизированных крыс под влиянием нейротоксина яда скорпиона (500 мкг/кг)

Варианты йнтактные кдасы Резерпинизированные

опыта " крысы

Адреналин Норадреналин Адреналин Норадреналин

Кот рроль 5,5^,68 2,9±0,93 4,5^0,36 3,2±0,25

В г е.' .;я после

вве,; ;ения,

мин 10 II,1^0,79й 18,3±1,3* 8,5*1,6* 5,36±0,42.

15 10,7±1,1ЗЕ 14,6±0,955 Ю.З^.б5 5,£>¿0,46

30 12,8±0,97х 18,5±1,6* Ю,8±1,4* 6,2±0,49

60 12,2±0,885 10,0±0,74* 9,9±1,55 5,5^0,44

* Е 0,05_________________________; _ _

Острое стрессорное действие полипептидных нейротоксинов приводит уже в первые кинуты после введения к резкому возрастанию содержания в крови АКТГ, с последующим восстановлением его концентрации до исходного уровня через 30 мин.(табл.2). Известно, что участие катехоламинов и АКТГ в регуляции метаболических процессов в организме опосредуется через циклазцую систему, использующую в качестве управляющих сигналов внутриклеточные концентрации тШ> и бГШ>. Проведенные наш исследования на различных тест-объектах показали, что гиперсекреция физиологически

Таблица 2

Изменение содержания АКТГ, альдостерона и рениновой активности плазмы крови крыс под влиянием нейротоксина яда скорпиона (500 мкг/кг)

Варианты ЖГГ, Альдостерон Ренин

опыта пгДм пг/мл н г/мл/ч

Контроль

Время после введения, мин.

5

15

30

60

90

120

х"р 0,05

299,7±70,5

2466,5-11,6* 2892,2±29,2* 273,8-29,2 306,8-16,4 331,3±8,4 204,6^33,2

980,0-90

1342,0±28,0Х 1217,0^68,0 1323,0-27,0* Ш0,0±31,0х 1315,0±59,0х 1559,0±76,0*

2,58^0,25

2,15±0,09

3,41±0,05к

4,Н±0,3&*

1,52^0,19*

3,6 ±0,11*

2,88±0,38

активных веществ, вызываемая нейротоксином яда скорпиона,закономерно сопровождается изменением уровня циклических нуклеоти-дов в тканях и крови. Установлено, что динамика изменений в содержании циклических нуклеотидов в плазме крови крыс характеризуется наличием временного максимума, наступающего на 30 мин. после введения нейротоксина. Следует отметить, что количество цГМФ нарастает быстрее, чем цАЫФ, что.находит свое отражение в снижении индекса цА]»1Ф/цГМФ (табл.3).

В литературе имеются сведения о гипергликемическом эффекте яда скорпиона ( МоЪатей et в1. , 1972). Известно, что у высших животных концентрация глюкозы в крови поддерживается чрезвычайно точным гомеостатическим механизмом. Глюкостаз зависит от многих гормональных реакций, из которых одной из наибо-

16

Таблица 3

Изменение содержания циклических куклеотидов, катехоламинов, глюкозы и НЭЙК в крови крыс под влиянием нейротоксина яда скорпиона (500 мкг/кг)

Варианты опыта ' 3',5'- цАШ" пмоль/л зУ- цД!Ф, пмоль/л цШ/иЩ& ■ ' Адреналин, мкг/л Глюкоза, НЭйК, ммоль/л мэкв/л

Контроль 26,4*3,03 ' 15,0-3,5 1,76 5,5*0,68 5,57*0,15 0,19*0,01

¡3 Время после введения, мин. 5 22,4-1,6 42,5*5,7* 0,52 не опред. 10,56*0,15й 0,28*0,01

10 30,8*1,8* 68,4*1,6* 0,45 II,1*0,79я не опред. 0,41*0,2*

15 32,8*3,6* 67,3*1,59* 0,48 10,7*1, Iх 10,83*0,19® 0,56*0,1*

30 46,8*1,56* 149,0*14,9* 0,31 12,8*0,97* 11,49*0,15® 0,57*0,1*

60 16,4*0,6* 46,0*1,02* 0,35 12,2*0,88х* 7,05*0,11* 0,59*0,1*

* р ^ 0,05

Лее важных является снижение уровня глюкозы в крови инсулином. Наши эксперименты показали, что гипергликемический эффект нейротоксина скорпиона развивается по механизму катехоламинер-гической гипергликемии, в которой принимают участие адреналин, норадреналин и цАМФ (тао'л.З). Глакоза является наиболее сильным инсулиногеном, поэтому наблюдаемую в наших опытах гипер-инсулинемию можно считать результатом физиологической реакции р -клеточного островкового аппарата поджелудочной железы на повышение уровня глюкозы в крови. На изолированных срезах поджелудочной келезы яд скорпиона вызывает секрецию по холи-нергическому атропиночувствительноыу механизму ( Бапкагаа е«.а1 1983). Однако в наших экспериментах атропин не блокировал ги-перинсулинемкю, что подтверждает высказанное предположение о преимущественно глюкозазависимом механизме увеличения секреции инсулина в целостном организме при стрессорном действии нейротоксина. На фоне гипергликемии, повышенного содержания адреналина и инсулина и активации липолиза наблюдается отсроченная реакция увеличения уровня глюкагона, с максимумом на 90 мин.(табл.4). Эти данные позволяют рассматривать действие инсулина и адреналина на секрецию глюкагона как отрицательную обратную связь, реализуемую при стрессовых состояниях организма.

Если особенностью эндокринной панкреатической секреции при действии нейротоксина является выраженный гуморальный механизм ее регуляции, то экзокринная панкреатическая секреция в этих условиях находится под холинергическим нейрогенным контролем и характеризуется усилением секреции трипсина и

-амилазы (табл.4). В наших экспериментах было установлено, что' предварительное введение животным атропина, а также ингибиторов протеиназ (контрикала или трасилола) блокирует сти-

18

Таблица 4

Гипергликемический эффект нейротоксина яда скорпиона (500 ыкг/кг) и его влияние на содержание в крови крыс гормонов и ферментов подже дудочной железы

Варианты Глюкоза, Инсулин, С-пептид, Глюкагон, "^-Амилаза, Трипсин,

опыта ммоль/л мкЕ/мл нг/мл пг/мл Ед/мл нг/мл

Контроль 5,57*0,15 29,33*2,3 0,65*0,06 245,05*41,0 739,3*62,2 8,58*0,95

Время после введения,

5 10,56*0,15* 32,5*2,69 не опред. не опред. не опред. не опред

15 10,83*0,19* 48,25*6,15* 0,46*0,06* 259,7*25,4 1176,2*83,2* 13,2*1,97

30 11,49*0,15* 47,5*1,28* 0,27*0,07 373,8*10,7* 1294,0*83,2* 23,4*3,4*

60 7,05*0,11* 30,4820,56 1,19*0,21* . 456,5*53,3я 1480,0*29,3* 20,1*3,5

90 6,75*0,14* 35,0*1,35 0,83*0,15 521,17*23,б3 1060,5*126,3 16,0*3,8

120 6,21*0,14 24,27*0,94 0,73*0,01 400,32*51,4* не опред. 5,4*0,13

* р^0,05

У

мулирущее действие нейротоксина на секрецию панкреатических, ферментов. Следует подчеркнуть, что в отличие от пролонгированного блокирующего действия атропина, эффект ингибиторов при их однократном введении является кратковременным, в результате чего после прекращения их фармакодинамического эффекта наблюдается вторичное резкое увеличение содержание в крови трипсина и »¿-амилазы. Резкое усиление экскреторной функции поджелудочной железы лежит в основе симптоматики острого панкреатита, 'наблюдаемого при отравлениях ядом скорпиона. В этой связи, особый интерес представляет изучение динамики содержания трипсииа на фоне действия ингибитора, как основного инициатора биохимических реакций, характерных для острого панкреатита. При прекращении действия ингибиторов трипсин вновь запускает автокаталитическую реакцию перехода трипсиногена в трипсин, что в итоге ведет к возрастанию активности панкреатических энзимов и возобновлению патологического процесса. Ингибиторы, блокируя положительную обратную связь в системе трипсиноген-трипсин, ликвидируют лишь следствие эффекта нейротоксина, тогда как ведущим звеном в развитии острого панкреатита является пролонгированная холинергическая активация секреторной деятельности поджелудочной железы. Эти данные могут быть полезными при оптимизации так-гуня патогенетической терапии острого панкреатита, вызванного ядом скорпиона.

Бри рассмотрении физиологических механизмов стрессорного действия зоотоксинов следует учитывать, что симпато-адренало-вая система не только стимулирует гипоталамо-гипофизарное звено, но и вызывает целый ряд срочных физиологических реакций, в том числе и со стороны сердечно-сосудистой системы. Отсутствие достоверного увеличения уровня норадреналина в крови при

истощении запасов медиатора резерпином, подученное в наших

20

экспериментах, свидетельствует о гиперсекреции медиатора из симпатических нервных окончаний. Анализ механизмов изменения артериального давления при действии нейротоксина подтверждает и дополняет это предположение. Известно, что в качестве основных факторов, участвующих в формировании гипертензии, могут рассматриваться катехоламины периферических депо эфферентных симпатических нервных волокон, а также надпочечники. Однако, адреналэктомия у кошек не приводила к статистически достоверному снижению уровня гипертензии, вызванной ядом скорпиона и его нейротоксином, тогда как угнетение медиаторной функции ад-ренергических окончаний резерпином полностью снимает гипертен-зивннй эффект (табл.5). Блокада ганглионарной трансмиссии гек-сометонием не влияет на величину и характер сдвигов артериального давления. Результаты этих экспериментов доказывают, что гипертенэия развивается в результате воздействия нейротоксина на постганглионарные симпатические нервные окончания, что, в свою очередь, приводит к гиперсекреции норадреналина. Как показали наши эксперименты, проведенные на крысах с применением радиоиммунного анализа, гипертензивный эффект нейротоксина мо-яет реализоваться не только через гиперсекрецию катехоламинов, но и путем активации системы ренин-ангиотензин-альдостерон (табл.2), что является дополнительным гуморальным механизмом стре^сорного действия яда скорпиона.

Начальная кратковременная гипотензия, развивающаяся в ответ на внутривенное введение яда и нейротоксина, имеет холинер-гическую природу и эффективно купируется атропином. Холинерги-ческая вазодилатация является мощным фактором, влияющим на гемодинамику в различных сосудистых регионах. Мы полагаем, что нейротоксин при системном введении воздействует на периферическое (постганглионарное) звено системы холинергической вазодила-

21

Таблица 5

Влияние фармакологических агентов и адреналэктомии на величину гипертензивного эффекта у кошекг вызванного внутривенным введением яда скорпиона

Варианты опыта

Дозы фар- Доза макологи- яда ческкх агентов

величина гипертензивного эффекта,

мкг/кг им_рт.ст. 2 ____

контроль опыт

Количество

опытов

Гексометоний 4 200 50,7±7,8 37,4±8,8 7

рл 0,05

Дигидроэрготамин 1.5 200 49,0-3,6 6,5±1,5 10

р -¿10,001

Адреналэктомия 100 33,0-5,9 21,8±6,1 7

р ^ 0,05

Резерпин* 0,5х 200 49,7±3,7 5,4*1,67 9

р У- 0,05

Е Резерпинизацию проводили за 72 ,48,24 часа до начала опыта

в дозе 0,5 мг/кг

тации, что приводит к установленному в наших опытах значительному падению сосудистого тонуса и увеличению пульсового кровенаполнения сосудов мозга и конечности.

■ Выводы о гиперактивности постганглионарных нервных окончаний под действием полипептидных нейротоксинов яда скорпиона находят свое подтверждение и в экспериментах на изолированных органах. На модели изолированного перфузируемого сердца морской свинки было установлено, что нейротоксин вызывает отчетливый двухфазный эффект - начальную брадикардию, сменяющуюся фазой увеличения частоты и амплитуды сердечных сокращений. Первая фаза блокировалась атропином, вторая - предупреждалась пропра-нололом и отсутствовала у резерпинизированных животных. Изменение содержания циклических нуклеотидов в миокарде зависело

22

от концентрации нейротоксина и фазы его действия на сердце. Во время брадикардии происходит доза-зависимое увеличение содержания цГШ>, без существенных изменений в уровне цШФ. Напротив, в фазе тахикардии концентрация цШБ резко возрастает, тогда как уровень цГМФ снижается (табл.6).

Таблица 6

Изменение содержания циклических нуклеотидов (пмоль/мг) в миокарде изолированного сердца морской свинки под влиянием нейротоксина яда скорпиона

Варианты опыта

Контроль

Нейротоксин, г/мл

МО""3

1x10' 1x10* 1x10"

,-4

3,5 - цАМФ 3,5 - цГШ

Брадикардия Тахикардия Брадикардия Тахикардия

0,54*0,13 0,35*0,03

0,31 - 0,09 1,32*0,09* 0,9 ±0,16" 0,12*0,024я 0,34 1 0,016 1,09*0,153 0,76*0,07* 0,15*0,095

0,45 ± 0,13 0,94*0,0435 0,58*0,04* 0,23*0,03

0,48*0,08гз 0,42*0,Об52

0,05

г'~ Физиологический эффект отсутствует

Полученные данные во многом объясняют физиологические эффекты кардиотропного действия нейротоксинов. Известно, что повышение внутриклеточной концентрации пДА® во всех случаях приводит к росту числа каналов тока, способных активироваться в ответ на соответствующую деполяризацию клеточной мембраны. Одновременно рост концентрации ц/ШФ приводит к повышении активности системы /^+-К+-трансмембранного насоса. Повышение внутриклеточной концентрации цГМФ оказывает противоположное действие (В.И.Поротиков и соавт.,1984).

23

Подводя итог рассмотрению приведенных в данном разделе работы экспериментальных материалов, следует подчеркнуть, что по современным представлениям в основе нейротропного действия иолипептидиых нейротоксиков яда скорпиона лежит их высокоспецифическое взаимодействие с "воротным" механизмом натриевого канала возбудимой мембраны, ведущее к замедлению инактивации натриевой проводимости и развитию деполяризации (Е.В.Гришин ( Сг1аМп ),1984; Г.Н.Можаева и соавт.,1979; В.В.Егоров, 1983; Сайога! ,1982 и др.). При резорбтивном действии нейротокси-ны вызывают тотальную модификацию доступных натриевых каналов, преимущественно, постганглионарных нервных окончаний. Замедление натриевой инактивации влечет за собой появление пролонгированных потенциалов действия и приводит к возникновению ритмической активности как спонтанной, так и вызванной одиночным стимулом. Это, в свою очередь, вызывает увеличение высвобождения нейромедиаторов из пресинаптических окончаний и обеспечивает развитие соответствующих шстешаптических эффектов как по транс так и по парасиналтическому механизму (миоклонии, изменений сосудистого тонуса, кардиотропных эффектов, гумо-рально-гормонального дисбаланса и т.д.). Следствием гиперсекреции нейромедиаторов является изменение баэального уровня циклических нуклеотидов, что следует рассматривать как внутриклеточный механизм срочной адаптации к стрессорнозд воздействию нейротоксинов яда скорпиона.

2. Физиологический и фармакологический анализ нейро-гуморальных механизмов острого действия полипептидних нейротоксинов скорпиона на центральную нервную систему

В настоящее время у большинства исследователей не вызывает сомнения определяющая роль центральной нервной системы

в развитии стресса. В рассматриваемом плане представлялось

24

целесообразным и ва-шым изучить физиологические механизмы действия нейротоксинов скорпиона на ЦНС и оценить их вклад в развитие стрессорной реакции. Отметим также, что в клинической симптоматике интоксикации ядом скорпионов, особенно у детей, отмечается судорожные состояния ( Ав1Ьа1 ,1981), механизмы которых остаются не изученными.

Наши эксперименты показали, что выраженность нёйротроп-ного эффекта нейротоксинов яда скорпиона, скорость его развития и динамика протекания определяются способом введения токсина в организм и функциональным состоянием животного. Так, внутривенное введение яда скорпиона в дозе 100мкг/кг наркоти-зированнъм уретаном кошкам приводит к угнетению ЭЭГ-активнос-ти в низкочастотной области спектра (0,5-8,0 Гц), существенно не отражаясь на спектральных характеристиках ЭЭГ в диапазоне 13-20 Гц. У кураризированных животных, находящихся на управляемом дыхании, внутривенное введение яда в дозах 100-250 мкг/кг приводит к кратковременному перераспределению мощности спектра ЭЭГ за счет увеличения амплитуды спектральных составляющих в диапазоне 8-12 Гц и снижению их в низкочастотной области. С целью уточнения точек приложения нейротоксинов яда скорпиона и изучения механизмов их центрального действия в последующих экспериментах были использованы введения токсинов в желудочки мозга. Типичным эффектом внутрижедудочкового введения нейро-токсина яда скорпиона (20 мкг) кураризированнъм кошкам было развитие электрографического эпилептиформного приступа, характеризующегося комплексами множественных пиков, комплексов-пик-волна и полиморфных пиков и волн высокой амплитуды. Увеличение дозы до 75 мкг вызывает значительное сокращение латентного периода появления первого пароксизмального приступа и возрастание интенсивности судорожных разрядов, длящихся в течение не-

25

скольких часов.

Доминирование в эпилептиформных эпизодах пик-волновой активности с частотой 3/с указывает на сходство с протеканием малого эпилептического припадка типа ро^ шаХ . Однако методические ограничения (эксперименты на обездвиженных животных) не позволяют идентифицировать эту реакцию с малым припадком. Для решения этого вопроса были проведены опыты на свободно передвигающихся крысах с электродами, вживленными в различные отделы стрио-таламо-кортикальной системы: головку хвостатого ядра (ХЯ), парафасцикулярный комплекс таламуса (П5?К), фронтальный (Ж), теменной и затылочный отдел коры больших полушарий.

Корреляционный анализ ЭЭГ интактных животных показал наличие умеренно выраженной связи ( 0,5 < К-г < 0,7) мевду структурами стрио-таламо-кортикальной системы с преобладанием корти-ко-фугальной направленности динамики нервных процессов в парах 52К-ХЯ, ФК-1Ж и каудатофугальной направленности в . паре ХЯ-ШК 0).

Через 30-40 мин.после внутрижедудочкового введения нейро-токсина или целого яда скорпиона (1-5 мкг в 5 мкл) в ЭЭГ появляются комплексы пик-волна с частотой 2-3 Гц, которые постепенно группируются в пароксизмальные эпизоды длительностью 10-60с. Такие пик-волновые паттерны наблюдаются в течение 3-5 часов с частотой 5-16 в час. Во время развития пик-волнового эпизода возрастает корреляционная связь мевду структурами стрио-таламо-кортикальной системы по доминирующему ритму 2-3 Гц. При этом сохраняется кортикофугальная направленность нейродинамических процессов в парах ФК-ХЯ, ФК-ШК и каудатофугальная в паре ХЯ-ШК. Отметим, что на фоне развившегося пик-волнового эпизода наблюдается акинезия животных.

Фармакологический анализ эпилептиформной реакции, вызван-

26

ной нейротоксином у мышей, крыс и кошек, показал, что холинер-гические, эдренергические и дофаминергические блокаторы (атропин, тропацин, аминазин, галоперидол) существенно ускоряли развитие судорожной реакции, тогда как миметики (ареколин и апо-морфин) увеличивали ее латентный период, а тетродотоксин, три-метин и седуксен препятствовали развитию судорог. Отметим также, что способностью потенцировать судорожное действие нейро-токсина обладал синтетический аналог лей-энкефалина ( D - Ala2 -beu^- Arg6 - энкефалин). Феноменология развития судорожной реакции, вызванной нейротоксином (пик-волновые паттерны на фоне акинезии животного) и ее чувствительность я триыетицу и седуксену, применяемым в клинике для купирования припадков типа petit mal » позволили предложить способ моделирования малого эпилептического припадка с помощью внутрижедудочкового введения нейротоксина бодрствующим животным (А.С.СССР К» 1326272).

С целью дальнейшего анализа механизмов судорожного действия нейротоксина скорпиона была изучена динамика изменения содержания циклических нуклеотидов, бета-эндорфина, соматотроп-ного гормона и дофамина в ткани мозга в опытах in vitro и in vivos

В экспериментах на инкубируемых срезах мозга мышей было установлено, что нейротоксин (10"^г/мл) при 10 мин.экспозиции в значительной степени увеличивает содержание цГМФ и, в меньшей степени, цАМЕ. При этом стимулирующее действие нейротоксина сопоставимо с эффектом 100 мМ KCl, что позволяет предположить существенный вклад деполяризующего механизма в активацию циклаз-ной системы. При внутрижелудочковом введении нейротоксина крысам отмечено достоверное увеличение уровня циклических нуклеотидов в гомогенатах переднего мозга и мозжечка (табл.7). Отметим, что концентрация цАШ увеличивается в перше минуты толь-

27

Таблица 7

Изменение содержания циклических нуклеотидов, бета-эндорфина и соматотропного гормона в мозге крыс при внутрижелудочковом введении нейротоксина яда скорпиона (10 мкг)

Варианты опыта 3,V- -ц4МФ,пыоль/мг 3,5 -цП,1Ф,пмоль/мг бета-эндорфин пмоль/мг Соматотропный гормон, нг/кг

передний мозг мозжечок передний мозг моз;::ечок передний мозг передний мозг

Контроль 1,92*0,15 3,20*0,45 0,037*0,01 0,062*0,01 188,2*31,2 0,27*0,05

Время после введения, мин. 5 3,32*0,5х 1,64*0,22х 0,030*0,007 0,113*0,02х" 189,12*33,04 0,85*0,31

10 2,32*0,4 3,02*0,57 0,022*0,001 0,057*0,003 285,44*55,69 1,55*0,19х

15 1,7* 0,33 0,75*0,25* 0,043*0,009 0,221*0,017*202,15*29,13 0,14*0,06

30 1,48*0,15 1,69*0,23х 0,038*0,005 0,035*0,009*341,61*57,03* 0,41*0,08

60 1,46*0,10* I,67*0,02* 0,031*0,01 0,083*0,013 266,04*14,26 0,08*0,03

* р^0,05

ко в переднем мозге, тогда как в мозжечке преимущественно нарастает содержание цП.Э. В стрессорных ситуациях наряду с активацией циклазной системы важное значение приобретает и вовлечете ЭХ, регулирующая роль которой в протекании широкого круга физиологических процессов является общепризнанной. Наш исследования показали, что судорожное состояние, вызываемое у лабораторных животных внутрижелудочковым введением нейротокси-на, обусловлено не только их прямым деполяризующим действием на нервные мембраны, но и гиперсекрецией нейромедиатэров и ней-ромодуляторов. Было установлено, что под действием нейротокси-нов в мозге крысы увеличивается содержание бета-эндорфина,СТГ, а также возрастает высвобождение Н-дофамина из перфузируемой головки хвостатого ядра.

Механизмы возникновения судорожной реакции под влиянием нейротоксина скорпиона представляются достаточно сложными. Учитывая деполяризацию нейрональной мембраны при действии нейротоксина за счет замедления натриевой инактивации, полученные результаты могут быть интерпретированы следующим образом: по-видимому, избыточная клеточная деполяризация при судорогах является начальным событием в цепи, ведущей к повышению уровня циклических нуклеотидов. Высвобождение нейромедиаторов ведет к активации мембраносвязанной аденилатциклазы и, тем аамым, увеличению уровня ц.У'3. В свою очередь, повышение концентрации цГМФ отражает процесс деполяризации нервных клеток. Следует учитывать, что не только приступы судорог изменяют уровни циклических нуклеотидов, но и они сами моцут запускать и/или модифицировать судорожную активность в ЦНС позвоночных (Феррен-делли и соавт.,1982). Процесс гиперсекреции физиологически активных веществ, вызываемый нейротоксином, охватывает и эндо-пиоиды, что доказывается увеличением уровня бета-эндорфина.

29

Последний может обеспечивать поддержание судорожного припадка, провоцированного нейротоксиноы, так как по данным Блюма и со-авт.(1981) внутрижедудочковое введение крысам бета-эндорфина вызывает развитие эпилептиформного состояния. Дополнительным аргументом в пользу высказываемой точки зрения об участии эн-допиоидов в реализации судорожной реакции, вызываемой нейро-токсином, служат наш эксперименты, в которых было показано потенцирующее действие синтетического аналога лей-энкефалина. Таким образом, ЭОС наряду с другими физиологическими системами вовлекается в осуществление нейротропньк эффектов яда скорпиона и его токсинов.

Способность нейротокеинэв яда скорпиона селективно взаимодействовать с нервной мембраной и вызывать ее деполяризацию явилась предпосылкой для изучения его влияния на регенерацию нервной ткани. Известно, что процесс регенерации сопровождается усилением биосиктетичееких процессов и возрастанием мощности аксотока в регенерирующем аксоне. Б свою очередь, деполяризация аксональных мембран ведет к увеличению скорости быстрого аксотока (Р.Н.Глебов, Г.Н.Крыжановский,1978), Эксперименты показали, что применение нейротоксина в терапевтических дозах (50 мкг/кг через день в течение 20 суток) в сочетании с витаминотерапией (витамины и В^) и введением прозерина в 1,5 раза сокращает сроки восстановления нервной проводимости и функционального состояния, предварительно травмированного большебер-цового нерва крысы» оцениваемые по порогу двигательной активности, ее латентному периоду, тепловизионным и ЭМГ показателям. Гистологическое исследование препаратов большеберцового нерва выявило, что при комплексной терапии с использованием нейротоксина наблюдается увеличение объема регенерирующих нервных волокон и улучшение васкуляризации области рубца.

30

Подводя итог представленным в данном разделе работы экспериментальным материала.4, следует отметить, что нейротропное действие токсинов яда скорпиона является сложной результирующей его специфического взаимодействия с нервными мембранами и неспецифического нейро ^морального компонента, включающего гиперсекрецига н ейрбмедиаторов и нейромодуляторов, а также активацию шклазной системы. Варьируя способом введения нейро-токсина в организм, а также его дозой, принципиально возможно как моделирование патологического процесса (судорожного состояния), так и стимуляция физиологических механизмов (процесс регенерации).

3. Физиологический и фармакологический анализ нейрогуморальных механизмов острого действия алкалоидных нейротоксинов яда саламандры

Яд саламандры содержит стероидные алкалоиды, семичленный азепиновый гетероцикл которых образован расширением циклогек-санового кольца А за счет включения аминогруппы. Комплексный физиолого-биохимический и фармакологический анализ нейротроп-ных эффектов алкалоидов яда саламандры выявил специфические механизмы их действия и дал возможность оценить вклад в формирование интегральной реакции на острое стрессорное воздействие.

Введение яда саламандры мышам и крысам вызывало беспокойство, пилоэрекцию, повышение тонуса мышц-экстензоров, саливацию, миоклонические подергивания головы и конечностей. Реакция развивалась через 5-15 мин после введения яда, протекала приступообразно, чередуясь с периодами относительного покоя и длилась в течение 60-90 мин. При введении животным летальной дозы уже на 2-3 мин развивался бурный клонико-тонический припадок, заканчивающийся гибелью животных от асфиксии через 10-15 мин.

Предварительное, за 30 мин введение фармакологических

31

агентов позволило выявить особенности нейротропного действия алкалоидов яда. Опыты показали, что антиэпилептические средства дифенин и триметин, агонист и антагонист ЭОС морфин и налоксон, серотонин, дофаминергический агонист апоморфин и ГОШ оказались не эффективными. Тольк<? седуксен доза-зависимым образом предупреждал судорожное действие алкалоидов и снижал летальность. Так, в дозе 5 мг/кг седуксен на снизил судорожный эффект и обеспечил 100% выживание животных при введении им летальной дозы яда.

В дальнейших экспериментах был проведен электроэнцефалографический анализ судорожного действия алкалоидов яда саламандры. Было установлено, что уже на первых минутах после введения яда в судорожной дозе в ХЯ и гиппокампе появлялись вспышки веретенообразной активности. По мере развития судорожного действия яда в ЭЭГ регистрируются пароксизмальные разряды, группирующиеся в комплексы острых пиков и волн. Обращает на себя внимание, что комплексы острых волн хорошо выражены в ПФЯ и регистрируются, как правило, между вспышками миоклоний. Отдельные миоклонические вздрагивания постепенно трансформировались в генерализованный клонико-тонический припадок, на фоне которого в ЭЭГ регистрируются высокоаыплитудные, полиморфные пароксизмальные разряды, сменяющиеся в тонической фазе резким угнетением амплитуды ЭЭГ. В спектрограмме основная мощность спектра сосредоточена в диапазоне 0,8-5,0 Гц. При этом обращает на себя внимание выраженный эффект трансформации ритма с делением частоты вдвое и одновременным увеличением амплитуды эпиразрядов.

Полученные в этом разделе работы экспериментальные материалы свидетельствуют, что алкалоиды яда саламандры обладают

выраженным действием на ЦНС. Характер изменений ЭЭГ-активности

32

под влиянием алкалоидов позволяет сделать вывод о их воздействии на подкорковые структуры (гиппокамп, ХЯ, РФ, неспецифические ядра таламуса), участвующие, по современным представлениям, в генезе судорожной активности.

При анализе нейрогуморальных механизмов острого стрессор-ного действия алкалоидов яда саламандры мы исходили из установленной нами высокой чувствительности судорожной реакции, вызываемой ядом,к препаратам бензодиазепинового ряда и наличия в молекуле алкалоидов семичленного азепинового гетеропгкла, обеспечивающего принципиальную возможность взаимодействия с бензо-диазепиновкми рецепторами ЦНС,

Изучение динамики содержания АКТГ, бета-эвдорфина и цАМФ в плазме крови крыс при введении яда саламандры в дозе 10 мг/кг выявило закономерные изменения исследуемых показателей (табл.8). Концентрация цАМ$ претерпевает монотонное увеличение с максимумом на 15 мин. после введения яда и восстановление к 60 мин. наблюдения. Изменение уровня бета-эндорфина характеризуется наличием двух максимумом на 5 и 30 мин., что в определенной степени отражает приступообразное течение интоксикации. Содержание АКТГ достоверно увеличивается, начиная с 15 мин., на которую приходится пик концентрации, с последующим снижением. Уровень глюкозы, инсулина, альдостерона и рениновая активность плазмы увеличиваются в первые 30 мин. острого стрессорного действия алкалоидов с последующей стабилизацией в пределах исходного уровня (табл.8).

Для оценки центрального действия алкалоидов в следующих экспериментах изучалась динамика содержания цАМФ в гомогенате мозга у интактных крыс и под влиянием предварительного введения седуксена. Было установлено, что алкалоиды яда саламандры вызывают увеличение содержания цАШ в ткани мозга. Седуксен, увели-

33

Таблица 8

Изменение содержания АКТГ, бета-эндорфина, инсулина, цАМ®, альдостерона, глюкозы и рениновой активности плазмы крови крыс при действии алкалоидов яда саламандры (10 мг/кг)

Варианты опыта АКТГ, пг/мл Бета-эндор- .фин, пмоль/л 3',5-цАМФ, пмоль/л Глюкоза, ммоль.л Инсулин, мкЕ/мл Альдосте- рон, пг/мл Ренин, нг/мл/ч

Контроль 299,7*70,5 12,03*2,67 32,28*3,2 6,29*0,46 ^ 33-2^3 980*90 2,58*0,25

Время после введения,мин: 5 287,6*64,3 36,55*3,94е 34,07*1,16 не опред. 42,62*10,0 1526*149* 4,23*0,31*

15 780,2*22,22е 17,42*2,8 47,88*3,92* 8,26*0,61* 29,75*3,27 1540*33* 3,87*0,39?

и ■<=• 30 676,3*89,I* 59,75*8,7* 44,05*1,9* 7,99*0,6я 25,37*2,09 2219*231* 2,78*0,04

60 457,6*16,0* 44,55*7,7* 36,53*1,55 6,32*0,17 26,09*3,50 1889*418 3,04*0,09

90 703,2*23,9* не опред. не опред. 7,52*0,5 14',37*0,28к 1152*55 3,03*0,15

120 не опред. не опред. не опред. 6,98*0,57 25,25*0,25 785*25 1,64*0,15й

* р^ 0,05

чивая базальный уровень цАЖг, за счет ингибирования фосфоди-эстеразы, предупреждал стимулирующий эффект алкалоидов яда на циклазную систему.

Проведенные эксперименты позволили выявить кроме нейро-генного механизма накопления цШ6, в результате гиперсекреции нейромедкаторов и нейромодуляторов во время судорожного припадка, наличие гуморального звена стимуляции циклазной системы. Установленное двухфазное нарастание уровня бета-эндорфина на фоне монотонного изменения содержания АКТГ связано, по-видимому, с включением гипоталамо-гипофизарного звена. В свою очередь, АКТГ также стимулирует образование цАМФ. Предварительное введение седуксена (диазепама) не только полностью купирует судорожные припадки, но и достоверно снижает образование цАМФ. Увеличение-уровня цАМФ и АКТГ под влиянием алкалоидов яда саламандры следует рассматривать не только как ответную реакцию на стрессорный стимул, но и как компонент компенсаторной ауторегуляторной реакции. Известно, что цШ6 оказывает ингибирующее действие на нейронную активность (Ферренделли и соав'т. ,1982), тогда как АКТГ и его фрагменты являются пептидными антагонистами опкоидных рецепторов и способны ингибиро-вать эффекты бета-эндорфина (В.Ы.Булаев,1982).

Структурное сходство алкалоидов яда саламандры с бензо-диазепинами и карбамазепином, обусловленное наличием азепино-вого гетероцикла, а также чувствительность судорожной реакции к седуксену (диазепаму) дает основание предположить, что эффекты алкалоидов обусловлены их взаимодействием с бензодиазе-пиновыми рецепторами.

4. Нейрогуморальные механизмы острого действия яда гюрзы и физиологические основы коррекции его повреждающих эффектов

Яд гюрзы является одним из наиболее мощных природных стресс-факторов, повреждающее действие которого обусловлено особенностями его химического состава. В настоящее время в яде обнаружены протеиназы, оксидаза Ь -аминокислот, фосфолипаза А2, фосфодиэстераза, 5-нуклеотидаза, гиалуронидаза и др.ферменты, а таете фактор роста нервов. Практически вся геморрагическая активность яда обусловлена сериновыми протеиназами, на долю которых приходится до 85% всей протеолитической активности. Вызываемый ядом тотальный протеолиз обуславливает развитие нарушений в системе свертывания крови вплоть до развития ДВС-синдро-ма, кровоточивость, геморрагические отеки, деструктивные поражения жизненно важных органов (З.С.Баркаган,1985; А.Т.Бердыева, 1985; И.К.Кадыров и соавт.,1935 и др.).

В первой серии экспериментов изучалось влияние острого действия яда гюрзы на содержание стресс-гормонов (АКГГ, инсулина) и бета-эндорфина в плазме крови крыс и функциональное состояние системы ренин-ангиотензин-альдостерон, оцениваемое по рениновой активности плазмы и содержанию в ней альдостерона. Установлено, что яд вызывает резкое увеличение содержания в плазме АКТГ и бета-эндорфина, тогда как содержание контр-гормона инсулина значительно снижено в начальный период интоксикации. Однако к 90 мин. наблюдается резкое (почти в 3 раза) увеличение уровня инсулина в плазме, коррелирующее с развитием терминального состояния (табл.9). По современным представлениям поджелудочная железа, так же, как симпато-адреналовая, гипоталамо-гипофизар-но-надпочечниковая и эндогенная опиоидная системы являются необходимым звеном эндокринной регуляции адаптивных реакций ор-

36

Таблица 9

Изменение содержания АКТГ, бета-эндорфина, инсулина, альдостерона и рениновой активности плазмы крови крыс под влиянием яда гюрзы (5 мг/кг)

Варианты опыта АКТГ, пг/мл Бета-эндорйин, пмоль/л Инсулин, мкЕ/мл Альдостерон, пг/мл Ренин, нг/мл/ч

Контроль 300,0*71 30,15*2,7 29,33*2,3 980,0*90 2,58*0,25

Время после введения, мин: 5 3366,0*984* 70,3*7,56* 30,05*0,76 922,0*27 5,07*0,16

15 2679,0*512* 57,8*8,72* 15,02*0,65* 2082 ±468* 4,61*0,15*

Ь! -0 30 2282,0*334* 61,17*12,39й 19,58*1,25* 2553,0*54* 4,33*0,47*

60 3686,0*246* 69,58*8,78* " 46,05*0,72* 3766,0*140* 0,54*0,11*

90 3794,0*120* не опред. 106,5 ±8,41Х 4764,0*129* 0,11*0,02*

* р < 0,05

ганизма при стрессе (Л.Е.Панин,1583). Снижение продукции контргормона инсулина минимизирует энергозатраты, стимулируемые АКТГ, однако при избыточной интенсивности действия стресс-фактора происходит срыв регуляторных механизмов, отражающийся, в частности, в гиперсекреции в терминальную фазу инсулина. Важным гормональным звеном, обеспечивающим адаптацию организма к экстремальным факторам среды, является также система ренин-ангио-тензии-альдостерон. В наших опытах было установлено, что под влиянием летальной дозы яда наступает быстрое увеличение рени-новой активности плазмы, длящееся в течение первых 30 мин.с последующим катастрофическим падением рениновой активности до неопределяемых значений. Содержание альдостерона монотонно увеличивается, начиная с 15 мин. после введения яда (табл.9).

Внутривенное введение яда гюрзы в дозе 10 мг/кг бодрствующим и наркотизированным крысам вызывало острую гипотензию и коррелирующие с ней нарушения сердечной деятельности, дыхания и депрессию фоновой ритмики ЭЭГ. Смерть экспериментальных животных наступала через 30-40 мин. после введения яда. При введении опиатного антагониста налоксона (I мг/кг) на пятой минуте после инъекции яда наблюдается повышение артериального давления, учащение дыхания, стабилизация сердечного ритма, увеличение амплитуды ЭЭГ. Несмотря на то, что артериальное давление стабилизировалось на довольно низком уровне (45-55% от исходного), общая продолжительность жизни экспериментальных животных была увеличена более, чем в 2 раза. Защитный эффект налоксона (I мг/кг) был подтвержден и в экспериментах на мышах, затравленных абсолютно смертельной дозой яда (10 мг/кг). Следует отметить, что эффективность налоксона существенно снижалась при увеличении интервала времени между введением яда и препарата более, чем на 15 мин. Комбинация налоксона с моновалентной противозмеиной сыво-

38

роткой "Антигюрза" не только увеличивала продолжительность жизни экспериментальных животных, по сравнению с эффектом введения одной сыворотки, но и позволила получить положительный результат при увеличении интервала времени до 30 мин.

Принимая во внимание, что основным действующим началом яда гюряц являются сериновые протеиназы, в следующих сериях экспериментов было изучено влияние ингибиторов протеиназ (контрикала или гордокса) на течение интоксикации, вызванной ядом. Было установлено, что ингибиторы, не оказывая г.нтилеталь-ного действия, снижают на 25-30% геморрагический эффект яда. Однако комбинированное применение ингибиторов и сыворотки "Ан-типорза" выявило наличие потенцирующего эффекта. Специальное изучение этого вопроса позволило установить оптимальное соотношение между ингибитором и иммуноглобулинами сыворотки, обеспечивающее сохранение ее нейтрализующих свойств при снижении в 2 раза эффективной дозы. Доклинические испытания модифицированной сыворотки показали ее апирогенность, стерильность, безвредность. По специфической (аптилетальной) активности, антигеморрагическому и противоотечному действию модифицированная сыворотка не уступает коммерческим препаратам. Таким образом, разработанная модифицированная сыворотка имеет следующие преимущества перед коммерческой: усиленное нейтрализующее действие, что дает возможность снизить в 2 раза лечебную дозу без потери защитного эффекта; снижение риска развития аллергических реакций; повышенную устойчивость к аутопротеолизу за счет ингибирования сывороточных протеаз ингибитором-модификатором.

Проведенные эксперименты показали, что острое воздействие

яда гюрзы приводит к гиперактиваиии гипоталамо-гипофизарного

звена ЭОС, ваго-инсулярных механизмов и системы ренин-ангио-

тензин-альдостерон, играющих ключевую роль в адаптивных реак-

39

циях к стрессорным воздействиям. Анализ нейрогуморальных механизмов стрессорного действия яда позволил теоретически обосновать и экспериментально подтвердить эффективность применения опиатных антагонистов (налоксона) и ингибиторов протеиназ (контрикала) для коррекции его повреждающих эффектов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Анализ полученных экспериментальных материалов свидетельствует, что рассмотрение зоотоксинов в качестве биотических стресс-факторов является плодотворным методологическим подходом, позволяющим диалектически увязать биологическую роль зоотоксинов, как алломонов, участвующих в аллелохимических взаимодействиях, с физиологическими механизмами формирования интегральной реакции на стрессорное воздействие. Специфический компонент в действии зоотоксинов, определяемый особенностями его химического состава и лимитирующий взаимодействие токсина с соответствующими рецепторами в органах- и тканях-мишенях, лежит в основе формирования первичного физиологического ответа. В случае полипептидных нейротоксинов яда скорпиона таким триг-герным механизмом является взаимодействие с молекулярными компонентами "воротного" механизма натриевого канала с их последующей тотальной модификацией, преимущественно, в пресинапти-ческих структурах. Напротив, точкой приложения действия нейротоксинов яда саламандры являются постсинаптические структуры, вероятнее всего,-компоненты ЕД-ГАМК-рецепторного комплекса. Наконец, компоненты яда гюрзы вызывают тотальный протеолиз доступного им в организме биологического субстрата, что, в итоге, определяет выраженность симптомов и тяжесть поражения. Несмотря на то, что пусковой этап во взаимодействии зоотоксинов с организмом обусловливается в достаточной степени селективным механизмом (взаимодействием нейротоксинов с пре- или постсинап-

ед

¡тическими рецепторами, гидролизом пептидных связей при протео-лизе), на стадии формирования интегральной адаптивной реакции организм использует универсальный набор соматовегетативных компонентов (вовлечение симпато-адреналовой, гипоталаыо-гипофизар-но-надпочечниковой, ваго-инсулярной, эндогенной опиоидной, циклазной и др. систем). В зависимости от биологических характеристик действующего стресс-фактора (зоотоксина) может меняться не только количество и последовательность вовлекаемых в формирование стрессорной реакции физиологических систем, но и их качественная реализация. Так, например, ЭОС, являющаяся чутким физиологическим прибором формирования адаптивных реакций в стрессорных ситуациях, инициирует и поддерживает "порочный 2сруг" патологических реакций при повреждающих интенсивностях действия стресс-фактора, приводящих к "полому" регуляции.

Таким образом, в формировании интегральной реакции организма на острое стрессорное воздействие зоотоксинов следует выделить специфический компонент, обусловленный лиганд-ре-цепторным взаимодействием токсинов-ксенобиотиков с соответствующими тканями- и органами-мишенями и неспецифический - направленный на гомеостатирование физиологических функций.

Изучение нейрогуморальных механизмов стрессорного действия зоотоксинов должно внести свой вклад как в решение современных проблем зоотоксинологии, так и общих вопросов физиологии экстремальных состояний, а также обеспечить разработку физиологически обоснованных принципов коррекции повреждающего действия зоотоксинов.

вывода

I. Гиперсекреция эндогенных физиологически активных веществ, вызываемая зоотоксинами, является ведущим звеном в формировании интегральной реакции организма на острое стрессор-

41

ное действие зоотоксинов, как биотических стресс-факторов. Массивный выброс из физиологических депо нейромедиаторов, ней-ромодуляторов и гормонов обуславливает реализацию их функций по транс-, парасинаптическому и гуморальному механизму.

2. Под влиянием острого стрессорного действия зоотоксинов в реализацию адаптивных физиологических механизмов, кроме сим-лато-адреналовой, ваго-инсулярной и гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой, активно вовлекается эндогенная опиоидная система. В зависимости от интенсивности действующего стресс-фактора и его биологических особенностей (нейротропное или гема-тотропное действие) ЭОС обеспечивает либо компенсацию возмущающего эффекта, либо выступает в роли триггерного звена "порочного круга" патологических реакций.

3. Активация системы циклических нуклеотидов являете^ универсальным внутриклеточным звеном быстрой адаптации к стрес-сорному воздействию зоотоксинов. В зависимости от интенсивности воздействия (введения зоотоксинов в летальных, сублетальных или терапевтических дозах) циклические нуклеотиды опосредуют как гомеостатирование физиологических функций, так и восстано -вительные и регенерационные процессы в поврежденных тканях.

4. Механизмы судорожного действия нейротропных зоотоксинов обусловлены особенностями их химического строения и специфичностью первичного физиологического эффекта. Полипептидные нейротоксины яда скорпиона вызывают генерализованный судорожный припадок за счет тотальной модификации натриевых каналов электрогенной мембраны и ее стойкой деполяризации. Нейротокси-ческие алкалоиды яда саламандры, имеющие в составе молекулы семичленный азепиновый гетерощкл, взаимодействуют, преимущественно, с компонентами БД-ГАМК-рецепторного комплекса. В развитии и поддержании эпилептиформной реакции, вызванной зоотокси-

42

¡нами, важное значение имеют нейрогуморальные механизмы вовлечения циклазной, бензодиазепиновой и эндогенной опиоидной систем.

5. Острое стрессорное действие яда гюрзы обусловлено тотальным протеолизом доступного в организме биосубстрата. Массивное повреждающее действие компонентов яда определяет чрезмерную активацию гипоталамо-гипофизарного звена эндогенной опиоидной системы и вовлечение в компенсаторные реакции ваго-инсулярной и ренин-ангиотензин-альдостероновой систем. Оглат-ные антагонисты (налоксон, налорфин) и ингибитор сериновых протеиназ контрикал в комбинации с моновалентной противозмеи-ной сывороткой "Антигюрза" потенцируют нейтрализующее действие последней. На основе полученных данных разработана модифицированная сыворотка "Антигюрза", превосходящая по активности в два раза коммерческий препарат.

Список работ, опубликованных по материалам диссертации

1. Гелашвили Д.В.,Орлов Б.Н.Нейротоксины животных ядов как "инструменты" в биологических исследованиях.//Сб.¡Механизмы действия зоотоксинов.-Горький,1977.-С.105-123.

2. Орлов Б.Н..Гелашвили Д.Б.,Омаров Ш.М.Дорнева Н.В.Физиологические механизмы нейротропного действия змеиных ядов.//Успехи физиол.наук.-1979.-Т ДО.-$2.-С.24-44.

3. Орлов Б.Н.,Бердыева А.Т..Гелашвили Д.Б.Яды змей и патофизиологические механизмы их токсического действия.//Здравоохранение Туркменистана.-1979.-.'да.-С.37-41.

4. Орлов Б.Н.,Гелашвили Д.В.,Омаров Ш.М.,Корнева Н.В.Химия и фармакология змеиных ядов.//Фармакол.и токсикол.-1979.-)?2.-С.182-190.

5. Орлов Б.Н.,Гелашвили Д.Б.,Егоров В.В.Влияние яда скорпиона

на системное и регионарное кровообращение.//Биологические науки . 1980 . -№2 . -С . 54-58.

6. Орлов Б.Н..Гелашвили Д.Б.,Егоров В.В.,Омаров Ш.М.К фармакологии яда пестрого скорпиона.//Фармакол.и токсикол.-1980.-!?6.-С. 730-733.

't

7. Орлов Б.Н.,Гелашвили Д.Б..Кузнецова М.А.Ядовитые оеспозво-ночные животные и их яды.Горький.Изд-во Горьк.ун-та.1931.

8. Орлов Б.Н.,Гелашвили Д.Б..Егоров В.В.Биологические основы действия яда скорпионов на организм.//Биологические науки,-1981.-}Г-2.-С. 45-56.

9. Орлов Б.Н..Гелашвили Д.Б. .Егоров В.В.,Сиднев Б.Н.Изменение уровня 3,5-цАМФ и 3,5-цГМФ в тканях мозга и сердца при действии токсинов яда скорпиона.//Балл.экспер.биол.и медиц,-1931 .-,¥9.-С.290-292.

10. Гелашвили Д.В.,Егоров В.В.,Савинов Г.М.Сравнительный анализ действия апамина и токсинов скорпиона на ЦНС.//Сб.¡Механизмы действия зоотоксинов.-Горький,1982.-С.17-24.

11. Гелашвили Д.Б.,Бубунин А.В.,Егоров В.В.,Бабаев В.К..Масет-кин А.И.Электроэнцефалографический и фармакологический анализ судорожной активности, вызванной ядом скорпиона.// Сб.¡Механизмы действия зоотоксинов.-Горький,1982.-С.76-83.

12. Орлов Б.Н..Гелашвили Д.Б.,Ушаков В.А.Дцовитые позвоночные животные и их яды.Горький.Иэд-во Горыс.ун-та.1982.

13. Орлов Б.Н..Гелашвили Д.Б.,Хургин Ю.И..Филатова Т.Н.,Гюки-на А.А.,Савинов Г.М.Изучение влияния ингибиторов протеи-наз на антигеморрагическое действие противозмеиной сыворотки .//Химико-фармацевт.«урн.-1982.-№10.-С.18-23.

14. Лерман Л.М., Гелашвили Д.Б.,Бабаев В.К..Масеткин А.И.,Орлов Б.Н.Математическая модель нейромедиаторных взаимоотношений в стриатуме в условиях действия нейротоксина скорпиона и других фармакологических агентов.//Сб.¡Динамика биологических поцуляшй. -Горький, 1982. -С .37-47.

15. Масеткин А'.И.,Бабаев В.К.,Гелашвили Д.В.,Орлов Б.Н. Гибридное моделирование и автоматизация эксперимента средствами АЦВТ.//Вопросы "радиоэлектроники.-1982.-В.2.-С.71-78.

16. Гелашвили Д.В.,Бубунин А.В., Егоров В.В.,Крюков М.А.Сравнительный анализ действия яда скорпиона при внутрижелудоч-ковом и вцутрикаудатном введении крысам.//Сб.Механизм действия зоотоксинов.-Горький,1983.-С.56-61.

17. Орлов Б.Н..Гелашвили Д.Б.,Егоров В.В.,Сиднев Б.Н.,Потемкина Т.Е.Нарушения нейрогуморальной регуляции у крыс при воздействии яда скорпиона.//Биологические науки.-1983.-№4.-С. 16-19.

18. Гелашвили Д.В.,Сиднев Б.Н..Крюков М.А.Нейрофизиологические механизмы судорожного действия яда скорпиона и синте-

ЧЧ

тичесного аналога лей-энкефалина.//Сб.:Механизмы действия , зоотоксинов.-Горький,I984.-C.24-32.

19. Гелашвили Д.Б.Реакции физиологических систем в условиях воздействия на организм нейротоксинов яда пестрого скорпиона. //Сб. ¡Механизмы действия зоотоксинов.-Горышй,1985.-С.48-61.

20. Орлов Б.Н..Гелашвили Д.Б.Зоотоксинология.М.гВысшая школа. 1985.

21. Гелашвили Д.Б.,Силкин А.А.,Сиднев Б.Н.К нейрофизиологической характеристике судорожного действия яда саламандры.// Сб.¡Механизмы действия зоотоксинов.-Горький,1986.-С.16-29.

22. Бабаев В.К.,Вышкинд С.Я.,Гелашвили Д.Б..Орлов В.й.О некоторых математических моделях автоколебаний в мозге при возникновении эпилептиформной активности.//Сб.¡Динамика биологических популяций.-Горький,1986.-С.I34-I4I.

23. Гелашвили Д.Б.,Силкин А.А.,Сиднев Б.Н.Нейрогуморальные механизмы судорожного действия яда саламандры на организм.// Сб.¡Механизмы действия зоотоксинов.-Горький,1987.-С.30-38,

24. Гелашвили Д.Б..Бердыева А.Т..Орлов Б.Н.К патогенезу острого отравления ядом гюрзы.//Здравоохранение Туркменистана.-I988.-M0.-C.10-18.

25. Орлов Б.Н.,Омаров Ш.М.,Корнева Н.В.,Асафова H.H..Егоров В.В.,Гелашвили Д.Б.Системный анализ центральных механизмов дезинтегрирующего действия нейротропных зоотоксинов.// Всесоюзный симпозиум "Механизмы системной деятельности мозга"//Тезисы докладов.-Горький,I978.-C.100-102.

26. Гелашвили Д.Б..Потемкина Т.Ю.Комбинированное применение противозмеиной сыворотки и неспецифических лекарственных средств при экспериментальном отравлении змеиными ядами.// У Всесоюзная герпетологическая конференция//Тезисы докладов . -Ашхабад , I 981 . -С . 36 .

27. Орлов Б.Н.,Гелашвили Д.Б..Егоров В.В.,Сиднев Б.Н.Актива-ция циклазной системы нейротропными полипептидами.//I Всесоюзный биофизический съеэд//Тезисы докладов.-Москва,1982. -T.2.-C.I09.

28. Филатова Т.Н.,Хургин Б.И.,Гелашвили Д.Б..Орлов Б.Н.Усиле-ние антигеморрагического действия иммуноглобулинов противозмеиной сыворотки ингибиторами протеиназ.//У Всесоюзное совещание по целенаправленному изысканию физиологически активных веществ//Тезисы докладов.-Рига,1983.-С.31.

45

29. Орлов Б.Н.,Гелашвили Д.Б..Бабаев В.К.Нейродинамика функциональной связи лобной коры и не остритаума по данным кросс-корреляционного анализа.//УШ Всесоюзная конференция по' нейрокибернетике//Тезисы докладов.-Ростов,1933.-С.27.

30. Бабаев В.К..Гелашвили Д.В.,Ыасеткин А.И.,Орлов Б.Н.Автоматизированная система измерения статистических характеристик электроэнцефалограммы//Всесоюзная конференция "Метрологическое обеспечение измерений в биологии и медицине"// Тезисы докладов.-Таллинн,1983.-С.III.

31. Орлов Б.Н.,Гелашвили Д.Б.,Егоров В.В.,Бубунин A.B.Механизмы вовлечения хвостатого ядра в эпилептифорыную активность при тотальной модификации натриевых каналов//Всесоюзный симпозиум "Стриарная система в норме и патологии"//Тезисы докладов.-Ленинград,1984.-С.132-138.

32. Филатова Т.Н.,Хургин Ю.И.,Гелашвили Д.Б.,Орлов Б.Н.Анализ противозмеиной сыворстки на содержание протеолитических ферментов.//Всесоюзная конференция "Ферменты в биохимических исследованиях"//Тезисы докладов.-Вильнюс,1984.-4Л.-С.49-50.

33. Гелашвили Д.Б.,Силкин A.A.K нейрофармакологическсй характеристике яда саламандры.//У1 Всесоюзная герпетологическая конференция//Тезисы докладов.-Ташкент,1985.-С.53-54.

34. Орлов Б.Н.,Гелашвили Д.Б.,Сиднев Б.Н.Особенности регуляции гомеостаза в условиях воздействия на организм природных токсинов.//ХХП Всесоюзная конференция по физиологии и патологии кортико-висцеральных взаимоотношенпй//Тезисы докладов.-Ленинград,1985.-С.227-228.

35. Гелашвили Д.Б.,Силкин А.А.,Сиднев Б.Н.Роль циклических нуклеотидов и эндопиоидов в развитии судорожной реакции, вызванной алкалоидами яда саламандры//Х Всесоюзная конференция по биохимии нервной системы "Фундаментальные достижения нейрохимии - медицине"//Тезисы докладов.-Горький,1987.-С.I80-I8I.

36. Орлов Б.Н.,Гелашвили Д.Б.Роль цАМФ и бета-эндорфина в регуляции гомеостаза в условиях модификации биоыембран природными токсинами.//ХП Всесоюзное совещание "Ионный гомео-стаз и влияние факторов внешней среды на жизнедеятельность клеток"//Тезисы докладов.-Иркутск,1987.-С.97.

37. Гелашвили Д.Б.,Орлов E.H.Фармакологический анализ действия биотоксинов на мозговое кровообращение//П Всесоюзная кон-

ференция по физиологии, патофизиологии и фармакологии мозгового кровообращения/Аезисы докладов.-Тбилиси,1988.-С.51.

38. Гелашвили Д.Б.,Парин С.Б.Коррекция "виперинового шока" налоксоном и сывороткой "Антигюрза"//Мендународный симпозиум "Центральная нервная система и постреанимационная патология организма"//Тезисы докладов.-Москва,I989.-C.209.

39. Гелашвили Д.Б.,Силкин*А.А.Особенности биологического действия алкалоидов яда саламандры//УП Всесоюзная герпетологическая конференция//Тезисы докладов.-Киев,1989.-С.25-.

40. A.C.!?677994(СССР) .Контейнер для транспортировки беспозвоночных животных//0рлов Б.Н.,Гелашвили Д.Б.,Егоров В.В., Корягин A.C., Балакина И.Н.//В.И.-I979.-Ji29.

41. А.С.F728795CCCCP) .Устройство для содержания ядовитых беспозвоночных животных/Орлов Б.Н..Гелашвили Д.Б.,Егоров В.В., Корягин A.C.,Балакина И.Н.//Б.И.-1980.-И5.

42. A.C.Jf886905(CCCP).Устройство для отбора яда у жалоносных беспозвоночных животных/Орлов Б.Н..Гелашвили Д.В.,Егоров В.В.,Корягин А.С.,Корнева Н.В..Конькова Л.Г.//Б.И.-1981.-JM5.

43. А.С.ГО26272(СССР).Способ моделирования эпилептиформного состояния./Орлов Б.Н.,Гелашвили Д.Б..Егоров В.В. .Бубунин A.B.,Савинов Г.М.//Б.И.-1987.-№28.