Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Механизмы взаимодействия различных нейротоксинов и биологически активных соединений с электро- и хемовозбудимыми мембранами

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Механизмы взаимодействия различных нейротоксинов и биологически активных соединений с электро- и хемовозбудимыми мембранами"

ГЛ^ , -

1 3 ®

ИНСТИТУТ ФИЗИОЛОГИИ И БИОФИЗИКИ АКАДЕМИИ НАУК РЕСПУБЛИКИ УЗБЕКИСТАН

На правах рукописи УДК 577.353:591.145.3 КАЛ И КУЛ О В ДЖАНЕНХОДЖА

МЕХАНИЗМЫ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ РАЗЛИЧНЫХ НЕЙРОТОКСИНОВ И БИОЛОГИЧЕСКИ-АКТИВНЫХ СОЕДИНЕНИЙ С ЭЛЕКТРО-И ХЕМОВОЗБУДИМЫМИ МЕМБРАНАМИ

(03.00.02 — биофизика)

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

ТАШКЕНТ - 1995 г.

1 1

Работа выполнена в Институте физиологии и биофизики АН РУз.

Официальные оппоненты — доктор биологических наук,

профессор Туйчибаев М. У.

доктор биологических наук

Салахутдинов Б. А.

доктор биологических наук

Иванов В. И-

Ведущая организация — кафедра биотехнологии биологического факультета ТашГУ.

Защита состоится « I- » К/й-с 1995 г. в {0 часов на заседании специализированного совета Д 015.01.21 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук при Институте физиологии и биофизики АН РУз (700095, г. Ташкент ул. Ниязова, 1).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института физиологии и биофизики АН РУз.

Автореферат разослан « » апреля 1995 г.

Ученый секретарь специализированного совета доктор биологических наук,

профессор » МАХМУДОВ Э. С.

В В. Е Д Е н ц г

Актуальность кщ. Одним кз Еачшебщшс направлений в исследовании фундаментальных вопросов нейрофизиологии ц биофизики является изучение принципов функционирования н молекулярной организации ионных каналов и нейрорецепгсров, ответственных за генерации к передачу нервного импульса. Использование методов электрофизиологии, биофизики, биохимии , генной инженерии и математического моделирования привело к впечатляющим успехам в изучении гтих мембранных образований. Однако, несмотря йа все эти успехи, егце до конца не ясны физико-химические основы функционирования ионных каналов и нейрорецептсров, окончательно не установлены принципы их молекулярной организации и способы регуляции их функционального состояния.

Вместе с тем, изучение принципов функционирования и организации ионных каналов п нейрорецепторов представляет не только теоретический интерес, но важно и для решения практических задач по изысканию новых фармакологических'средств, а также инсектицидов избирательного действия.

Широкие возможности для решения этих проблем представляют нейротоксины животного и растительного происхождения, обладавшие уникальным свойством специфически взаимодействовать с ионными каналами и нейрорецепторами. Б настоящее время извеетйо довольно большее число нейротоксинов, установлена их структуру, охарактеризован механизм действия. По характеру действия эти нейротоксины подразделяют на аксональные^ пре- и постсинаптические. С помощью аксональных нейротоксинов, таких как тетродотоксин, сакситок-син.батрахотокеин, вератридин, аконитин и полилептидных нейротоксинов скорпионов, удалось представить функциональную организации натриевого канала. Благодаря пресинаптическим нейротокоинам ядов змей,, ботулиновоыу, столбнячному токсинам и латрото?ссину получе» ны ваяные сведения о тонких механизмах синтеза, накопления и секреции медиаторов. Нейротоксины из ядов асподовых змей, обладающие постспнаптическим действием, -оказались уникальными аффинными ли~ гандами, с помощью которых удалось выделить никотиновый холинора--цептор и установить его химическую природу.

Б целом, с помотаю нейротоксинов получена ценная информация об отдельных деталях организации и принципов функционирования некоторых ионных каналов и нейрорецепторов.

В последние годы особое внимание уделяется исследованию принципов функционирования кальциевых каналов и глутаыатергических синапсов. Это обусловлено тем, что эти мембранные образования играют ключевую роль в деятельности нервной и сердечно-сосудистой систем. Вместе с тем нарушение работы Са2+-каналов и глутаматер-гических синапсов лежит в основе патогенеза таких широко распространенных заболеваний нервной и сердечно-сосудистой систем,как эпилепсия, слабоумие, гипертония, ишемическая болезнь сердца, сердечная недостаточность и аритмия. Поэтому исследование особенностей функционирования кальциевых каналов и глутшлатергических синапсов, установление возможных подходов регуляции их функционального состояния является актуальнейшими задачами современной нейрофизиологии и биофизики.

Цель и задачи исследовании. В связи с вышеизложенным,' целью настоящей работы был поиск ноеых специфических нейротоксинов и биологически-активных соединении, исследование механизма их действия на различные типы ионных каналов и нейрорецептороз.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Исследовать действие нейротоксиче-ских компонентов ядов пауков и биологически-активных соединений на механизм секреции медиатора. ,

2. Исследовать взаимодействие нейротоксических компонентов ядов пауков с нейрорецептораыи синапсов позвоночных, насекомых и моллюсков.

3.Изучить действие нейротоксических компонентов ядов пауков на Са^-каналы.

Новизна полученных результатов. Установлено, что диацшшроиз-водные-ДБ18К6 и структурные изомеры ди-втор-бутил-ДБ18Кб (см.материалы -и методы) увеличивают частоту МПКП за счет индуцирования поступления Сзг+ и М&2+ из внеклеточной среды в аксоплазму нервного окончания, . Обнаружено, что 4 ,4 (Б • Ьдиыетиламиноэта-нол-ДЕиБКЗ (псеЕд^циклический аяалог-ДЕ18К6) и пептид (мол.масса 5 кДа), выделенный из бурой водоросли. Суз1с-зе1гг ЬагЬа!а,вызывают дискретное увеличение частоты МПКП в виде пачек благодаря их спо-с:5костн ;орм::розать каналы проводимости для Сз""" и Зг'*~ в преси-наптпческгй уекбране. Получена данные, подтвержденное способность : ¿х"*и ¿г"" ге-.-гНлгь Сз':+" в процессе секреции медиатора.

-первые п::-:аг£.но,чт:' 2-м~т;:л-1 .¿-кафтахинг'н (менадпсн) и 2,5-

дибромо-1-гидрокси-4-оксо-циклогексадиен-1-ацетамид (диенон В), выделенный из организма морской губки Verongula regida,усиливают секрецию медиатора в результате мобилизации Са2+ митохондрий нервного окончания.

Показано,что компонент ,уп 1-4 яда паука Eresus ni ge г, обладающий фосфолипазной Ai активностью,блокирует синаптическую передачу;пре-. синаптически взаимодействуя с мембранами нервных окончаний лягушки, гидролизуя их фосфолипиды и нарушая процесс секреции медиатора.

Обнаружено, что низкомолекулярные . нейротоксины-аргцолобатин и компонент A-V-2 яда паука Arglope lobata специфически взаимодействуют, первый- с ионным каналом,а второй- с узнающим участком глутаматных рецепторов идентифицированных нейронов виноградной улитки.

Впервые установлено,что аргиолобатин, наряду со снижением времени полуспада синаптических и глутамат-активируемых токов,вызывает также усиление степени десенситиэации глутаматных рецепторов нервно-мышечных синапсов саранчи. Показано, что взаимодействие аргиоло-батина с глутаматным рецептором может одновременно сказываться на функциональном состоянии участков рецептора, управляющих ионным каналом и его десенситизацией. .".•.В яде паука Anemesia sp. впервые выявлены компоненты (Ап4, Ап5, Ап7).избирательно и специфически взаимодействующие с различными участками глутаматергических синапсов. Показано, что компонент Ап4, обладающий фосфрлипазой Ai активностью, нарушает'процесс секреции медиатора, взаимодействуя с мембранами нервных окончаний саранчи и гидролизуя их фосфолипиды. Установлено, что модификация'Са2+-каналов пресинаптической мембраны компонентом Ап5 приводит к генерации гигантских МВПСП. Обнаружено, что компонент Ап7 действует на уровне постсинаптической мембраны и подавляет синаптическиа. и глутаматные потенциалы,взаимодействуя с узнающим участком глутаматных рецепторов нервно-мышечных синапсов саранчи.

Показано,что яд паука Agelena labirintica блокирует нервно-мышечные синапсы лягушки,взаимодействуя с Са2+-каналами пресинаптиче-ских мембран.Установлено,что блокатором пресинаптических Са2+-кана-дрв является компонент яда- Agí-1,имеющий молекулярную массу~1 кДа.

Теоретическое и практическое значение работы. Полученные данные представляют,прежде всего,фундаментальный интерес,поскольку позволяют существенно расширить наши представление о механизме секреции медиатора,а также об особенностях функционирования и организации глутаматных рецепторов и кальциевых каналов.

.Обнаруженные, индукторы и блокаторы процесса секреции медиатора, а также выявленные новые нейротоксические компоненты пополнят арсенал инструментов исследования механизма секреции медиатора,глутаматных рецепторов и потенциалеависимых кальциевых каналов и найдут широкое применение в медико-биологических исследованиях при поиске путей'их Фармакологической регуляции.

Структура и объём работы.. Диссертация состоит из введения, десяти глав, заключения и выводов. Работа изложена на 229 страницах, -.-иллюстрирована "62 .рисунками и 6 таблицами. Библиография включает 369 источников.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались, на Ш Советско-Швейцарском симпозиуме "Биологические мембраны. Структура и функции" (Ташкент,1983); на Всесоюзных симпозиумах "Химия белков и пептидов" (Рига, 1983; Таллин, 19S7); на XV Всесоюзном физиологическом обществе им,И.П.Павлова -(Кишинев, 1987); на Всесоюзном симпозиуме "Лонные каналы в биологических ме.ибрзнах" (Пущи-но,1989); на Международном симпозиуме "Мембранный транспарт и механизмы его' регуляции" (Тбилиси,1989);на Международном симпозиуме "Химия природных соединении" (Ташкент, 1994)..

Публикация результатов исследования. • По материалам диссертат ции 'опубликованы 21 статья И 9 тезисов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ При выполнении настоящей работы использованы краун-эфиры, предоставленные А.К.Ташмухамедовой ( Химический 'факультет, ТашГУ ), менадион ( 2-метил-1,4-нэфтахинон ), диенон Б (3,5-дибро-мо-1-пздрокси-4-01.со-циклогексаДиен-1-ацетамид), выделенный из организма морской губки Verongula rígida и предоставленный Б.А.Горшковым ( ТЙБОХ ДВЦ FÁH ), пептидный каналсформер, -выделен-• ный из бурой водоросли Cystoselra barbata / Махмудова и др. ,1985/' и яды пауков Argiops lobata, Anemesia зр., Eresiis níger и Agelena labirlntlca. >

В работе использовались нерЕно-мышечные препараты портнялшой мышцы лягушки Rana temporaria, терго-коксальнол мышцы. саранчи Locusta migratoria migratorioides и идентифицированные нейроны ППа4. ir ППа1 ' псдглотачнога ганглия виноградной улитки Не Их pomatla. .- -

Регистрацию мембранного потенциала и синаптичесгсих поте'нциа-. . дов осуществляли' стандартной микрозлектродной -'техникой /Пёр-Biie.lSSS /. В качестве усилителя- потенциалов использовался усилитель псетояннсгй тока /Макс-имен, К'умладее, 1973/. лшйптпчеекие-и глутам2т-акти2;ц:уек.ке токи регистрировали г условил:-: фиксации потенциала. Регистрацию токов произведет с пепел? к усилителя "rai'ah" S-rD? xCZÁ). ' ' ■ "

Izsizésze аыггакккх гкгнзло* сг кервн;го ококч/кгн н-зрьно-ш-

шечного препарата лягушки производили внеклеточно при поыощи ыик-роэлектродоа с оплавленными кончиками.

Фиксацию мембранного потенциала и регистрацию глугамат-активируемых токов нейронов НеИк рош^а осуществляли с помощью усилителя "Оагап" 3 500 (США).

Проведена математическая и статистическая обработка экспериментальных данных.

«

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ ИНДУКТОРЫ СЕКРЕЦИИ МЕДИАТОРА Согласно литературным данным, секреция медиатора определяется концентрацией ионизированного кальция в аксоплазме нервного окончания / МПесН, 1973/. По данным Либермана и еоавт. / ВНосЬ ас а1.,19б8/, ионьг Саг+ могут заменять и другие катионы, в частности Ме2"1", однако лимитирующим фактором при этом является проницаемость, их через пресинаптическую мембрану. В последнее время обнаружены селективные ионофоры для Саг+ и -производные дибен-зо-18-краун-6, псевдоциклический аналог дибензо-13-краун-6 и пептид, выделенный из бурой водоросли Суз1:озе1га Ьarbata, способные индуцировать проводимость биологических и искусственных мембран для этих ионов, в связи с чем было интересно изучить влияние этих соединений на процесс секреции медиатора.

Добавление диацилпроиаводных ДБ18К6 (диоктаноил-,. дигептано-ил-, дипропионил-, двдеканоил- и дибутирил-ДБ18К6 - Са2+-ионофа-ры) в раствор, смывающий нервно-мышечный препарат лягушки, черев определенный латентный перисд приводило к.значительному увеличению частоты МГЖП (табл.1). Скорость развития эффекта и максимальное значение частоты ЫШШ находились в прямой, а латентный период - в обратной зависимости от концентрации диацилпроизводних Д&18К6. Эффекты диацилпроизводных ДБ18К6 прямо зависели от концентрации Са21" в среде.

Структурные изомеры ди-втор-бутил-ДБ18К6 (Мз2+-ионофоры) также вйзывали увеличение частоты ШКП: Увеличение частоты МПКП прямо зависело от концентрации Мае2"*' в среде и нэ наблюдалось при отсутствии Мд2+ в среде ( табл. 2 ).

В обоих случаях увеличение частоты ШКП находилось в прямой зависимости от ионофорной активности диацилпроизводных ДО18К6 и структурных изомеров ди-втор-бутил-ДШ£КЗ. Увеличение частота ШКП при действии последуешх крзун-зфяров свидетельствует С тем,

Таблица 1

Влияние диацилпроивводных ДБ18К6 на спонтанную активность нервно-мышечных синапсов лягушки

Исследуемое соединение1

Добавление в физиологический раствор

частоту ШКП,

1

Амплитуда МПКЛ, мВ

Относительное иамене-ние Не проводимости БЛМ (Ыирходжаев и др.,1984)

Б

N 1 1 1 ММ EGTA

Бев добавок

Б мМ Caz+

10 ыМ Са2+

Без Саг+ 1 141 EGTA

4 Ш Mgz+ M 2 1 мМ EQTA

Без добавок

5 Ш Са2+

10 Ш.Саг+

1 Ш ESTA +• + 4 f.ivl

N 3 il f.iJ EGTA I I

i Бее добавок I

I

! 5 кМ Саг+

0.85+0,20 (4) 0,86±0,13

l,40t0,51 (4)

92,0±17,0 1,52±0,43 (3)

135,0+0,20 1,74+0,55 (3)

191,5+33,4 0.90+0.35 (4)

3,00±0,Б4 0)41iQ,16 (2)

0,35+0,12 (3) 0,37+0,16

0,47+0,14 (4) 0,45+0,24

0,38+0,10 (3) 0,40+0,21

0,41+0,11 (3) 0,43+0,19

0,34+0,13 (2) 0,32+0,22

0,43+0,25 0,75+0,24 (5)

40,20±10,80 1.10±0,40 (3)

0,48+0,15 43) 0,46+0,29

73,50+16,20 1,15+0,33 (2)

112,0±17,50 0,65*0,23 (5)

2,80±1,10 0.б4±0,15 (3)

0,42+0,10 (1) 0,40+0,11

0,35+0,11 (3) 0,35+0,23"

0,66±0,1S 0,53^0,15 (1)

10,45+3,30

il.24+0.40 (2) ¡33,60*5,75

0,48+0,17 (2) 0,4?t0,£0

10

1

2

4

Продолжение табл.1

(.....— 1 1 1 1 2 I 1 з 4 " 1 5 1

10 мМ Caz+ 11,5010,37 0,40+0,16 (2)

157,00+3,50 0/33+0,25

1 Ш EGTA 4 мМ Ug''^ !0,68±0^37 (3)

12,20+0,55 -

| N 4 I 1M.U ESTA Без добавок 10,50+0,14 (2) (0,49+0,20 10,72+0,21 (3) 0,33+0,14

5 мМ Са2'*" ¡35,50+7,50 0,39±0,23 6

10 \&А Са2+ 11,41+0,29 (3) 0,52+0,13 (3)

178,45+13,56 0,50+0,21

1 1<4Д EQIA 4 мМ Mg*+ |0,7Е+0,18 (2) (2,56+0,95 •

| N 5 I Без добавок ! 1,01+0,20 --- 20

¡300,00+67,50

|/Калику-|лов,Ус-| |мансв, I 11983/'. | 1 1 л 1 .

В скобках указано число опытов,в числителе-значение'в контроле, в знаменателе - в присутствии диацшшроиз'водных ДБ18КВ в концентрации 5*10 'и. В знаменателе (3 столбик) приведены максимальные значения.частоты МШШ4 ,,

N 1, 2, 3, 4 и 5 - 4 ,5 -диоктаноил-, 4',4"(5")-диг°птанош1-,

^'^"(б'^-дтропионйл-^'^'Чв'^-дидеюноил- и 4',4"(б")-дибутирил-ДБ18Е6 соответственно.

Таблица 2

Влияние структурных изомеров ди-втор-бутил-ДБ1ВК6 на спонтанную активность нервно-мышечных синапссв лягушки

Т

Температура плавления изомеров,^

Добавление в физиологический раствор

частоту МПКП,

Амплитуда МПКП, мВ

Относитель нее изменение

проводимости ЕЛИ (Мирхсджаев и др.,1984)

90-93 N I1

04-90 N 2

81-88 N 3

79-87 N 4

1 ММ ЕДТА Б мМ Mgz+ 10 мМ Mgz+ 1 Ш ЕДТА Б мМ Mg2'1' 10 мМ Mgz+ 1 мМ ЕДТА Б мМ Mgz+ 10 мМ Mgz+ 1 мМ ЕДТА S мМ Mgz+ 10 мН. Mgz+

0,33+0,09

0,33+0,13 0,57+0,14

9,20±1,75 0,59+0,11

14,5+5,64 0,20+0,05

Ö,22±0,09 0,36i0,12

1,20Ю,29 0,55+0,15

2,84±1,20 0,55±0,24

0,б2±0,19 0,54+0,15

1,71+0,45

0,86+0,23 3,70+0,98

0,70+0,24

0,72+0,35 0,82+0,19

2,50+1,02

0,59+0,14 3,73±1,11

(3)

(4) (2) (3) (6)

(3)

(4) (3) (2)

(3) (2)

0.36+0,10 (3)

0,35+0,13

0,38+0,13 СЗ) 0,39+0,20

0,40+0,11 (6) 0,40+0,14

0,45+0,14 (4) 0,44±0,17

0,38+0,12 (2} 0,33±0,10

0,41+0,15 (3)

0,40+0,17 0.35+0,12 (2)

0,38±0,25

2,5

2,4

2,7

Б сксС:-ал рэзано число опытов, в числителе - значения в к;нтролг,в знаменателе - б -прпсутсташугтруктурных кзомеров ди-в—р-Сутпл Д213К5 в концентрации 1a10~-u.b гкамена^ле (3 9т097

кзг^амальнь:- гкг-гещгя.^асу^ты МПКП. АК1 - 4 ,4 --;::£Г1р-5ут:1Л-ДБ18К5; N 2,3,4 - 4 4 (5 )-гл-вюр-бутил-ЦБ18К8.

что эти вещества действуй? ка уровне пресинаптическок мембраны.

Таким образом, получвнныб данные свидетельствуют о тсы, что исследованные краун-эфиры, взаимодействуя с пресикаптическсй мембраной, индуцируют потоки ионеь' Саг~ и Щг+ в аксоплазму нервного скончания, которые е равной мере стимулируют секреции медиатора.

При исследовании псеЕдсциклического аналога ДБ18К6 также наблюдалось увеличение частоты МПКП, однако а данном случае ¿то увеличение заключалось в появлении пачек МПКП (рис. 1). При этом частота МПКП в пачках составляла 50 с-1, длительность пачек-от доли секунды до десятков секунд, а межпачечный интервал -от 2-Б сек до 1-2 мин. Увеличение концентрации агента приводило к уменьшению латентного периода, увеличению длительности пачек и снижению* меялачечных интервалов. Аналогичные эффекты наблюдались при

Рис.1.Изменение частоты ЫПНП лягушки при действии 4* ,4" (б")-Д1шетилашшоэтанол - ДЕ18КВ ( 2*10~5Ц ). Среда,мМ: НаС1-115, 03012-1,8, КС1-2.5, НаНгР04-0,3, НаоНРО^-й.рН 7,4.А-контроль, Б,В

и Г-череэ 70, ВО ц 100 щр$ соот-0,5 ^ветственно после доб.авления псе-

2 С0К вдоциклического аналога ДБ18КБ.

увеличении концентрации Саг+ в среде.

Принимая во внимание то, что псевдоциклический аналог ДБ18КЗ способен формировать на БЛМ каналы проводимости для Са2+ /'Мирход-жаев и др.,1358/, наблюдаемое дискретное увеличение частоты МПКП в'виде пачек, по-видимому;, объясняется аналогичной модификацией этим агентом пресинапгических мембран, а-именно формированием им каналов проводимости для Са2т, функционирование которых отражается секрецией медиатора в виде пачек.

Таким образом, обнаруженные нами эффекты производных ДЕ15К6 и его псевдоциклического аналога свидетельствуют о том, что эти вещества являются модификаторами процесса секреции медиатора и могут быть использованы для его регуляции в различных экспериментальных условиях.

Аналогичное увеличение частоты МПКП в виде пачек (рис.2) вызы-

вал компонент (мол. масса - 5 кДа), выделенный ив бурой водоросли СузЪозе1га ЬагЬаЪа, который на ЕЛМ формирует каналы проводимости для /Махмудова и др.; 1955/. При этом частота в пачках

составляла 2-8 с-1, длительность пачек 0,5-2 сек, а интервал между ними- от нескольких сек до десятков минут. 0 увеличением концентрации каналоформера наблюдалось заметное увеличение частоты МПКП в пачках ( 10-20 с-1 ) и длительности пачек С 1-5 сек ).По-

Г) .

вышение концентрации Зг'- в среде от 2,5 мМ до 7,5 мЗЛ в присутствии каналоформера (1*10_бМ) таете привалило к значительному уве. . - — - - Бис.2. Действие каналоформера из

■ 1 __бурой Еодоросли Суз1озе1га Ьаг-

Ьа1а на спонтанную активность нервно-мышечного синапса лягушки. Среда, мМ:МаС1-11Б,БгС12-1,8, КС 1-2,5, Ь'аЧ2Р04-0,5, На2НР04-г, рН 7,4. А-контроль. Б, В и Г-че-рез 40,50 и 80 мин соответственно после добавления каналоформера (ДлЮ'6].!).

,1:и

Ц&_ÚL

-¿Jo.sc

личению частоты МПКП в пачках(10-15 с"1) и длительности пачек.При замене Згг+на Саг+ каналоформер также увеличивал частоту МПКП,однако в этих условиях эффект каналоформера был менее выражен. Эти результаты хорошо- согласуются с .данными, полученными на ЕЛМ, где было показано, что данный каналоформер формирует'каналы, преимущественно проницаемые для ионов Srz+ / Махмудова и др., 193Б /.

. Можно заметить', что эффекты каналоформера из бурой водоросли аналогичны эффектам . низкомолекулярного компонента из яда паука Steatoda paykulllana и Са^-каналоформера (поевдоцишшчес-кии аналог ДБ18К5), которые формируют на ЕЛМ каналы проводимости для Caz+ и вызывают дискретное увеличение частоты ШКП / Усманов и др., 1983/. Во всех случаях наблюдаемые пачки -№21 появляются в ответ на дискретное поступление двухвалентных катннов е нервное скончание по каналам, формируемым этими агентами. Вместе с тем, результаты этих экспериментов свидетельствую? о Том, что иены 5гг+ могут эффективно заменять ионы Ca¿+ в процессе секреции медиатора.

Ранее было показано, что разебдител:: окислительного фо^форили--;;:гакил, в частности, . гетрахлертрпфторметилб:нэп.лздагол (ИЕБ)

значительно увеличивают частоту ШКП путем повышения концентрации Са2+ в аксоплазме нервных окончаний за счет выброса Са'*+ иа митохондрий / Глаголева и др., 1970 /. Еместе с тем показано, что менадион и диенон 3 также способны увеличивать в несколько раз выброс са2+ из митохондрий. Однако, в отличие от разобщителей окислительного фосфоршшрования , менадион и диенон В не действуют на мембранный потенциал митохондрий и на функции клеточных '.мембран /Асраров, 1938 /.В связи с этим было интересно исследовать эффект этих соединений на секрецию медиаторов.

Как показали эксперименты, менадион значительно увеличивал частоту ШЖП. Эффект этого агента начинал проявляться на 20-35 мин, а к 50 мин частота МПКП в 2Е раз превышала исходный уровень. В дальнейшем наблюдалось постепенное снижение частоты МПКП и на 1Б0 мин она составляла 0,2-0,3 с-1. Скорость развития эффекта и максимальное значение частоты МПКП находились в прямой зависимости от концентрации менадиона. Так, при концентрации менадпсна 5*10"ЭМ первые признаки увеличения частоты ШКП наблюдались уже через 3-4 мин, и к 10 мин частота ШКП составляла бодее чем 800 с-1. Аналогичным характером действия обладал и диенон В. Эффекты менадиона и дненона В носили необратимый характер, а также не зависели от внеклеточного кальция. Независимость эффектов менадиона и диенона В от Са£+ в среде может указывать на то, что усиление секреции медиатора реализуется только за счет увеличения концентрации ионов кальция в аксоплазме нервного окончания в результате его выхода из митохондрий / Асраров, 1989 /. Необратимость действия менадиона и диенона В на процесс секреции медиатора , ' по-видимому, объясняется прочным связыванием этих веществ с мембранами митохондрий.

^ Таким образом, результаты, полученные с мзнадионш и диенонсы В - агентами, мобилизующими внутршитохондриалышй кальций, однозначна подтверждают важную роль митохондрий в регуляции различных кальций-зависимых процессов, . одним из которых является процесс секреции медиаторов.

ДЕЙСТВИЕ ЯДА ПАУКА Eresus niger НА HEFEHU-МШЕЧНЫЕ СИНАПСЫ ЛЯГУЩИ Яд паука Eresus niger также является эффективным модификатором процесса секреции медиатора. В присутствии лда (150 мет/мл) первоначально частота МПКП снижается от 1 с-1 в корма до 0,2-0,-4 с-1 (длительность этой первой фазы 30-50 мин). Во второй фазе действия яда наблюдается постепенное увеличение частоты МПКП, максимум которой составляет около 200 с-1 (длительность этой фазы около 30 мин). В заключительной фазе действия яда происходит вторичное снижение частоты МПКП. и к 150 мин она составляет около 0,5 с-1. При использовании более высоких концентраций яда частота МПКП изменяется в большей степени. При этом резко сокращается длительность всех трех фаз и заметно снижается ЫП мышечных волокон.

' Добавление в конце третьей фазы действия яда таких соединений, как кальциевый ионофор (дибутирил-ДБ18К6) и ТТФБ , а также увеличение концентрации калия в среде до 20 мМ (факторы, увеличивающие частоту МПКП за счет повышения концентрации кальция в ак-соплазме нервного окончания) не вызывают дальнейшего изменения частоты МПКП. Это может указывать на истощение запасов медиатора или на существенные нарушения механизма секреции медиатора. Полученные экспериментальные данные показывают, что эффекты, вызываемые ядом паука Eresus niger, сходны с эффектами пресиналтических нейротоксинов ядов змей,обладающих фосфолипазной активностью. При исследовании ферментативной активности было обнаружено, что яд паука действительно обладает фосфолипазной At активностью /Атаку-зиев и др., 1991/. Следовательно, эффекты, вызываемые ядом паука Eresus niger, могут быть обусловлены • его фосфолипазной активностью.

С целью выявления компонента, ответственного.за вышеописанные аффекты, цельный яд паука Eresus niger был подвергнут фракционированию с помощью ионообменной хроматографии "и гельфильтрации. При этом было получено несколько фракций, из которых лишь фракция VII1-4, содер.чащая компоненты с молекулярной массой 13 кДа, обладала исковой активностью.

В экспериментах на Кервно-мыщечных синапсах лягушки фракция VI11-4 u,5*1j~5M) вызывала существенное изменение частоты МПКП. Г.;.;: этсм г.ер£::-:зчально наблюдалась незначительное снижение часто-!СКП е псгледующцм постепенным увеличением частоты МПКП до

240 с"1. Б заключительной стадии действия происходило вторичное снижение частоты МПКП и к 120 мин ока составляла 1-3 с"1. Возможно, что компонент 7111-4 яда паука Егезиз п1£ег, обладающий фосфо-липазной А1 активностью нарушает процесс секреции медиатора,взаимодействуя с мембранами нервных окончаний и гпдролиэируя их фос-фолипиды. Действительно, обработка фракций VII1-4 р-бромфенацИк-бромидсм,который ингибирует каталитическую активность большинства фосфолипаз ,К1п1, Еуэпз, 1939/, приьела к потере не только каталитической, но и пресинаптпческол активности.

Таким образом, результаты экспериментов,полученные при исследовании компонента яда паука Егезиг п1дег, обладающего пресинап-тическим действием и фосфодипазнси активностью, в сравнительном аспекте с пресинаптичэскими токсинами змей будут способствовать разработке новых подходов в изучении особенностей секреции медиатора.

ДЕЙСТВИЕ КОМПОНЕНТОВ ЯДА ПАУКА Аг^Юре 1оЬа1а НА ГЛУТАМАТ-АКТИЕИРУЕШЕ ТОКИ 'ИДЕНТИФИЦИРОВАННЫХ НЕЙРОНОВ ВИНОГРАДНОЙ УЛИТКИ

Ранее было показано," что яд паука Аг^.оре 1оЬа1а содержит ряд компонентов, которые специфически взаимодействуют с глутаматными рецепторами нервно-мышечных синапсов саранчи / Насиров,1991 /. В настоящей работе изучено влияние этих компонентов на глутаматчув-ствительные идентифицированные нейроны виноградной улитки.

В норме аппликация глутамата на сому нейронов ППа4 и Ш1а1 индуцирует входящие и выходящие токи соответственно. Амплитуда этих токов прямо зависит от концентрации апплицируеыого глутамата. Ар-гполобатин, один из компонентов яда паука Агй1адз 1еЬа1а (мол.масса 657 Да), вызывал снижение амплитуды активируемых глу-таматом входящих (ППа4) и выходящих"(ППа1) токов. Степень подавления этих токов прямо зависела от концентрации аргиолобатина. Экстраполяция линейного участка вольт-амперных характеристик (БАХ ) глутамат-активируемых токов ( рис.3) к сси потенциалов показала, что потенциал реверсии, который в норме находится в пределах ?8,0±1,5 мВ (ЛПа1) и 20,0+1,0 (Ш1з4), в присутствии аргиолобатина смещается к - 63,0±1,3 мВ и 30,0+1,0 мВ соответственно. Кривые доза-эффект глутамат-активируемы:-: токов в присутствии аргиолобатина смещаются вправо вдоль оси абсцисс, причем увеличение концентрации апплицируеыого глутамата не приводило к вссста-

новленив максимума глутамат-актиЕнруемых токов (рис.4).

ш

Т.ыВ

Рис.3.Воль т-ампе рные характеристики глутамат-активируемых токов нейронов Ш1а4 ( 1 ) и ППа1 (2) виноградной улитки. А. - контроль, Б - в присутствии аргнолобагина ( 1.10_7М ).По оси ординат- глутамат-активируе-мые токи в нА,по оси абсцисс -мембранный потенциал в мВ. Среда, мМ: ЫаС 1-100, КС 1-4, СаС12 -10, М^С1е - 4, трис НС1 (рН - 7,3-7,5)-10.

Другой компонент яда паука Аге1оре 1оЬа1а А-У-2 (мол.масса 637 Да)' также вызывал снижение амплитуды глутамат-активируемых входящих и выходящих токов'нейронов ППа4 и ППа1. Степень подавления этих токов прямо зависела от концентрации компонента А-V-2.Эффекты компонента А-У-2 не сопровождались'смещением потенциала реверсии глутамат-активируемых токов. Кривые доза-эффект глутамат-активируемых токов в присутствии этого компонента параллельно смещались вправо вдоль оси абсцисс, а увеличение концентрации апплицируемого глутамата приводило к полному восстановлению первоначальной величины этих токов ( рис.4 ). Следует отметить, что аргиэлобатпн и компонент А-\'-2 даже при высоких концентрациях не вызывали полного подавления глутамат-активируемых таков нейронов Ша4 к ППз1. Это может объясняться тем, что на соме исследуемых неIIIсков имеются различные типы глутаыатных рецепторов, 'часть из. котсгы;: нечувствительна к действии эргиолсбатпна и компонента А- ','-£. к настоящему времени достаточно хорошо охарактеризовано два оонснных гипг. 'глутаматных рецепторов М.ЕА и не КМПА Т1ша Гсзгег, гогг.. :б84; Данилова. 1983/. Такг.я классификация глута-

ю-'

Ж

/

. /

/

/

ю -ч

Рис.4. Влияние аргиоло-батина (1) и компонента А-У-2 на "зависимость доза-эффект глутамат-активируемых токов нейрона ППа4 виноградной улитки. А-контроль; Б-в лрисутс-твии аргиолобаЛша ( 1 ) в концентрации 1*10~7М и

10-.4 компонента А-У-2 ( 2 ) в

. концентрации 1*10~бМ. Поддерживаемый потенциал на мембране нейрона -60 мВ. По оси ординат -глутамат - активируемые токи в НА, по оси абсцисс- количество электричества (в кулонах) протекающего через микроэлектрод. Среда: см.подпись к рис.3, -

' ' ' "1

матных рецепторов базируется на возбуждающих эффектах трех структурных аналогов Ь-глуташновой кислоты-канната, квисквалага и Н-метил-Д-аспартата (ШЭА),. Рецепторы ' МША-типа активируются Ь-аспартатом, а рецепторы не №/ОА-типа активируптся каинатом и квисквалатом. При этом оба типа рецепторов способны активироваться глутаматоы.

Учитывая то, что яды пауков семейства Агапе1с1ав и выделенные из них низкомолекулярные нейротоксины не действуют на рецепторы ШОА-типа' / Kawal а1., 1982; Антонов и др., 1988 /, можно предположить, что на соме нейронов ППа1 и ППа4 содержатся рецепторы как не МША, так и ШЛА-типов, а регистрируемые глутаматные ответы являются суммой ответов обоих типов рецепторов. Исходя из этого, возможно," что яд паука Аг?1сре 1еЬ^а и его компоненты действуют в основном на рецепторы не Ю>ЮА-типа и на действуют на рецепторы ШОА-типа, в результате чего наблюдается неполное подавление глутаматных ответов.

Как уже отмечалось, аргиолобатпн примерно на 10 - 16 мВ смз-

шзл потенциал реверсий глутамат-активируемых токов нейронов Ша4 и ППа1. Эти данные свидетельствуют о том, что эффекты аргиолоба-тина обусловлены его влиянием на канальную часть глутаматного рецептора исследованных нейронов.

Эффекты компонента A-V-2 обусловлены совершенно иным механизмом действия. В частности, анализ зависимости доза-эффект глута-мат-активируемых токов в присутствии этого компонента свидетельствует о его конкуренции с глутаматом. Эти данные однозначно ука-вывагат на взаимодействие компонента A-V-2 непосредственно с узнающим участком глутаматного рецептора.Дополнительным подтверждением такого взаимодействия являются данные, где показано, что компонент A-V-E снижает специфическое связывание L-^H-глутамата с синаптическими мембранами из мышц краба / Насиров, 19Э1 /.

Следует отметить, что локальная аппликации компонента A-V-2 на сому нейронов Ша4 и ППа1 индуцирует входящие и выходящие токи соответственно. Этот эффект компонента A-V-2 может объясняться тем, что наряду со свойствами антагониста ему присущи свойства агониста.Такое двойственное действие ряда агонистов хорошо объясняется теорией взаимодействия веществ с рецептором /Patón,1961/. Согласно этой теории, способность вещества ингибировать, активировать или одновременно проявлять и то и другое действие определяется константой скорости распада комплекса лиганд-рецеп-тор (я-i). При высоких значениях K-i вещество является агонистом, при средних к-1-обладает смешанным действием, а при низких k_i антагонистом /Paton,1961/. Основываясь на этой теории, можно заключить, что компонент A-V-2 обладает Свойством антагониста смешанного типа.

Таким образом, вызываемое аргиолобатином изменение, потенциала реверсии, смещение кривой доза-еффект глуташт-активируемых токов и отсутствие восстановления максимума токов при увеличении концентрации ашшщируемого глутамата указывают на взаимодействие с канальной частью' глутаматных рецепторов исследуемых"нейронов виноградной улитки. Отсутствие влияния компонента A-V-2 на потенциал реверсии глутамат-активируемых токов, параллельное смещение кривой доза-эффект и восстановление максимумов токов при увеличении концентрации апллицнруе.;.:ого глутамата указывают на то, • что компонент A-Y-2 взаимодействует непосредственно с узнающим участком глуп-уагкого рецептора исс :едуемых нейронов виноградной улитки.

Таким образом, анализ полученных и литературных данных позволяет- заключить, что в функциональной организации глутамзтных рецепторов нервно-мышечных синапсов насекомых, ракообразных, центральной нервной системы позвоночных и моллюсков имеются общие закономерности.

. .ДЕЙСТВИЕ НИЗКОМОЛЕКУЛЯРНЫХ КОМПОНЕНТОВ ЯДА ПАУКА ■ 'АГ£1оре 1оЬа1а НА НЕРВНО-МЫШЕЧНЫЕ СИНАПСЫ САРАНЧИ

*

В экспериментах на нервно-Мышечных синапсах саранчи компонент А-У-2 вызывал снижение амплитуды МВПСТ, ВПСТ и глутамат-активиру-емых токов, скорость развития этих эффектов и степень.подавления МВПСТ, ВПСТ и глутамат-активируемых токов прямо зависели от концентрации компонента А-У-2..' При добавлении компонента А-У-2 в концентрации -6*10"% наблюдалось полное подавление синаптических и глутамат-активируемых токов. Эффекты компонента А-У-2 не сопровождались изменением временных параметров синаптических и' глутамат-активируемых токов, и.квантового состава ВПСТ. Отмывание-препаратов-Приводило-к восстановлен™ амплитуды синаптических и глутамат-активируемых- токов. Кривые зависимости доза-эффект глута-мат-активируемых -токов в присутствии компонента А-У-2 параллельно 'смещались вправо по оси абсцисс, а увеличение концентрации яппли-цируемого' глутамата приводило к восстановлению-максимума-^лута-ма?'-активируемых токов. ' ■ '

Из анализа-зависимости доза-эффект глутамат-активируемых токов в отсутствии и в присутствии компонента А-У-2 следует, что действие этого компонента имеет конкурентный характер. Вместе с тем компонент А-У-2 при его локальной аппликации в область синапсов, мышц саранчи индуцировал входящий ток. Следовательно, .как уже . бьро показано на нейронах виноградной улитки, и в данном случае компонент А-У-2 проявляет свойства как агойиста, так И антагониста.

Аргиолобатин на нервно-мышечных препаратах саранчи также вызывал снижение амплитуды МВПСТ, ВПСТ и глутамат-активируемых токов. Скорость развития эффекта и степень подавления синаптичесих и глутамат.-активируемых токов, прямо зависели от концентрации ар-гиолобатина. Бри действии аргиолобатина в. . концентрации - 6*10"7М наблюдалось -полное ■ подавление как синаптических, -так и глута-мат-активируемых токов. При эта.-.! обнаружено, что наряду со снижением амплитуды синаптических .и глугамат-акишируемых токсе-наОлю-

дается существнное уменьшение времени их полуспада. Вместе с тем аргиолобатин не оказывал влияния на квантовый состав ЕПСТ.

При исследовании зависимости доза-эффект глутамат-активируемых токов обнаружено, что кривые этой зависимости в присутствии аргиолобатина смещаются вправо вдоль' оси абсцисс. Увеличение концентрации апплицируемого глутамата не.приводило к восстановлению максимума глутамат-активируемых токов. Такой характер действия типичен для неконкурентных антагонистов.

Ранее было показано, что аргиолобатин способен увеличивать связывание L-3H - глутамата с синаптическимц мембранами из мышц краба на фоне максимального насыщения глутшлат-связывающих участков /Усманов и др., 1991; 1992 /. Эти данные однозначно свидетельствуют о том,■ что аргиолобатин увеличивает сродство глута-мат-связывающих участков с Ь-3Н-глутаматом, т.е. обладает потен-циирующим действием. Вместе с тем показано, что аргиолобатин ин-гибирует связывание Зн-каината, агониста глутаматных рецепторов, возбуждающее или активирующее действие которого, в отличие от глутамата, не сопровождается десенситизацией глутаматного рецептора / Daoud, Usherwood, 197*5 /. Считают, что. каинат взаимодействует как с узнающим участком, так и с " центром десенситизации " глутаматного рецептора. В связи с.тем, что агенты,' углубляющие •десенситизации' глутаматного рецептора, одновременно усиливают его сродство к медиатору, вызываемое аргиолобатином увеличение связывания меченого глутамата объяснялось его влиянием на так называемый участок десенситизации рецептора.'. Для проверки этого предположения нами были проведены .эксперименты с конканавалином А ( Con А ), агентом, обладающим способностью устранять десенситизацию глутаматных рецепторов . • •

В норме периодическая аппликация глутамата с частотой 4,0 имд/мин индуцирует глутамат-активируемые токи, начальная амплитуда которых составляет около 10 нА, а'к 5 мин снижается до 0,8 нА в результате развития десенситизации глутаматных рецепторов. В этих условиях Con А (1*Ю-6М) предотвращал снижение амплитуды токов при периодической аппликации глутамата (рис.5). В другой серии опытов было изучено действие аргиолобатина на десенситизацию при пери зг ячее кой аппликации глутамата. Опыты показали, что. при действии аргихсобатина,. когда амплитуда глутамат-актпвирубмых to-íc-j пгдаэляехгя не 50?.," степени десенситигащп: заметно усиливзет-С,.' На препаратах, прв^варгтелко обраБотгннкгс .Со» а,аргиолобатин

также эффективно подавлял глутамат-активируемые токи (рис.5).

Рис.5. Действие аргиолобатина на глу-тамат-активируемые токи мышц саранчи: А - развитие десенситизации глутамат-

А Б

у активируемых токов при ритмическои

I / аппликации глутамата' (5*10~3Ю ;Б-бло-

У , кирование десенситизации глутамат-ак-

| тивируейых токов конканавалином А В Г (1*1СГбМ); В-подавление глутамат-ак -

"и*"" ' активируемых . токов аргиолобатином

__ .(1*10~7М); Г- подавление глутамат-ак-

_]4 нА тивируемых токов аргиолобатином I мин ( 1*10~7М ) на фоне блокирования десенситизации конканавалином А. Поддерживаемый потенциал -55 мВ. Среда в мМ:. N301-150, СаС12-1,8, М£С12-1,б, КНСО3-4,КН2РО4-6,при рН- 6,8-7,0.

Таким образом; увеличение связывания Ь-3Н-глутамата синапти-ческими мембранами мышц краба и обнаруженное нами усиление степени десенситизации глутаматных рецепторов мышц саранчи, вызываемое аргиолобатином, свидетельствуют о том, что его взаимодействие с глутаматным рецептором.оказывает влияние и на состояние центра, управляющего десенситиэацией глутаматного рецептора. Однако, ар-гиолобатин наряду со снижением амплитуды синаптических и глута-мат-активируемых токов" на нервно-мышечных препаратах саранчи также .уменьшал время их полуспада, что является характерным признаком блокады канала глутаматного рецептора.

'.В целом полученные экспериментальные Данные свидетельствуют о том, что .взаимодействие' аргиолобатина с глутаматным рецептором одновременно сказывается на функциональном состоянии различных участков рецептора,-управляющих ионным каналом и его десенситиэацией. ....':'.."'.-.'■•

ВЛИЯНИЕ ЭДА ПАУКА Anemesla sp. II ЕГО КОМПОНЕНТОВ НА !

НЕРВНО-ЫЬЕЕЧНЬЕ СИНАПСЫ САРАНЧИ '

Предварительные исследования яда паука Anemesla зр.' на различных типах синапсов показали, что данный яд избирательно действует только на глутамат^ргичеекие нервно-мышечные синапсы'насекомых. Добавление яда паука Anernesia sp. в раствор,омывающий нервно-мышечный препарат саранчи,. вызывал существенное изменение частоты МБПСП с появлением высокоамплитудных МВПСП. При атом-разряды гигантских МВПСП происходили периодически в виде'пачек. Амплитуда МВПСП в пачках была в 15-20 раз больде нормальных МВПСП. Частота гигантских ШТСП была 3-5 с-1, длительность пачек— 0,7. сек, межпачечный интервал 15 сек, а амплитуда МВПСП 7-Э мВ.При увеличении концентрации яда наблюдалось увеличение длительности пачек и снижение -межпачечного интервала,, 'однако достоверного изменения частоты МВПСП в пачках и их амплитуды не наблюдалось. ' При этом в большинстве случаев визуально наблюдалась фибрилляция мышечных волокон.-"Действие-яда паука было необратимым, т.е. отмывание препаратов после первых признаков действия яда в течение ■30-50 мин -нормальным раствором не приводило к.восстановлению.частоты и амплитуды МВПСП. . ' * ,

В присутствии* яда (1 мкг/мл) одиночное раздражение моторного : нерва приводило к генерации серии ВПСП с изменением их амплитуды. Первоначально наблюдалось некоторое увеличение амплитуды ВПСП с последующим их постепенным рнижением до 0,5 мВ, -почти до уровня МВПСП. Эти эффекты яда не сопровождались.изменением временных па- " раметров ВПСП. Расчеты, проведенные прямым способом '(т-среднее значение ашлитуды ШСП/среднее значение МВПСП), показали, что снижение амплитуды вызванных ответов происходит в основном за . счет снижения квантового числа ВПСП. Отмывание' препаратор* после-'■ действия-яда нормальным раствором в течение 2-0-50 мин не приводило, к восстановлению исходного уровня.ВПСП.' ч - -• ' '

"При действии относительно в'ыеоких концентраций. -(> 20, мкг/мл) ■ яда паука также'наблюдались- гигантские МЕПСП, однако амплитуда их с течен;::-м времени снижалась. При концентрации 50. мкг/мл лд паука • к ZD ши псднссгью подавлял' гигантски* '¿БПСЯ. Яд Пс-ука в ■ этих .. кгкцэнхр&хях так>;е эффективн: пола£::.~л ответы (.--'вечных волокон на ' аппликата глутамата.

'Таким полученные д::.чные показываю':, -что лд • паука в

диапазоне концентрации 1-20 мкг/мл вызывает .уве.игаение частоты, МВПСП и снижение квантового состава ВПСП. Эти данные, а также отсутствие влияния яда на временные параметры синап'?ических потенциалов свидетельствуют о том, что яд паука действует на уровне прескналтической мембраны нервно-мышечных синапсов саранчи. При отмывании эти.аффекты не исчезали, следовательно пресинаптическое действие яда носиг необратимый характер. Особого внимания заслуживает генерация гигантских МВПСП в присутствии яда, по амплитуде сравнимых с- ВПСЯ. ^

' Ранее нами было .. показано, что в ' присутствии яда паукк Segsstrla florentina-одиночное раздражение'моторного нерва приводит к генерации серии, ПНЛ- / Каликулов, 1Э85/. Этот эффект объяснялся способностью яда замедлять, инактивацию натриевых каналов и ' тем. самым увеличивать длительность ЦЦ, которая определяет число активированных Са2+-каналов пресинаптической мембраны. Учитывая эти данные, можно предположить, что генерация гигантских МВПСП в присутствии.яда паука Anemesiasp." является результатом его-взаимодействия с Caz+-каналами. пресиНаптиче'ской мембраны и их активацией.- Подтверждением такого предположения являются эксперименты, где показано, что амплитуда гигантских МВПСП прямо загасит, от концентрации ,Сз2'к в среде и обратно зависит от концентрации Mgz+.

Снижение амплитуды гигантских МВПСП и глутаматных ответов в присутствии яда в концентращях выше 20 мкг/мл свидетельствует о <постсинаптическом действии яда паука Anemesia sp.

В. целом, / полученные данные указывают на то, что в яде паука Anemesia sp. содержится, покрайней мере, два компонента, обладающих пресинаптическим и постсинаптическим действием.

С• помощью гельфильтращш и ионообменной хроматографии из яда паука Anemesia sp. выделено три нейротсксиче.ских компонента: Ап4 (мол. масса ЛО кДа)', ' АпБ (мол.масса -v5 кДа) и Ап7 (мол. масса «.1 кДа) / Каликулов и др., 1S95 /. Яри исследовании ферментативной ..активности этих компонентов было, обнаружено, что компонент Ап4 обладает "фосфолшазной Ai активностью ( неопубликованные данные Ф.А.ЕуритоЕой ). '

Компонент Ап4 вызыеэл массированный выброс медиатора, т.е. регко увеличивал-частоту МВПСП саранчи. Скорость развития эффекта и максимальное значение частоты ШПСЛ находились в прямой зависимости от концатрацпи компонента-Ап4. Эти данные свидетельствуют о том, что действие компонента Ап4 -происходит на уровне пресннапти-

. _ г4 - ' ческой мембраны.Возможно,что компонент Ап4,обладающий фосфолипаз-ной к\ активностью нарушает процесс секреции медиатора,взаимодействуя с мембранами нервных окончаний и гидроливуя их фосфолипиды. Действительно, обработка этого компонента р-бромфенацилбромидом, который, как уже отмечалось, ингибирует каталитическую активность больш!шства фосфолшлаз, приводила к потере, не только каталитической, но и пресинаптической активности.

Компонент Ап5 вызывал генерацию гигантских МВПСП, ■ сгруппированных в "пачки" (рис.6.). При-этом частота МЕПСП в пачках составляла 7 с-1, длительность пачек - 1 сек, а межпачечный интервал -2 сек. Амплитуда гигантских МЕПСП, индуцируемых компонентом Ап5,

концентрации Caz+ в. среде;

Ионы Mg' »2+

.21-

снижали

прямо зависела• ог

амплитуду гигантских МВПСП. При концентрации Ма2+ 5 Ш амплитуда гигантских Ш1СП снижалась в 1, Б раза относительно исходной величины (рис.7). Все эти данные дополнительно свидетельствуют.о том, что компонент Ап5 активирует Са2^-канзлы пресинаптической мембраны, в результате чего генерируются гигантские 'МВПСП.

в

щ

lóele -

Рис.6.. Индуцирование'.компонентом Ап5 яда. паука Апетез1а '-эр., гигантских МВПСП на нервно-мышечных ' 6иВ синапсах саранчи. А,Б и Б~ через 10,80 и 60 мин после -добавления ■ компонента Ап5 (1*10"7М).Среда - см. подпись к рис.5. При'добавлении компонента Ап7.в среду, омывающую препарат, наблюдалось прогрессирующее снижение амплитуды МВПСЦ и БПСП и последующее их полное исчезновение. Снижение амплитуды синапти-чееких потенциалов не сопровождалось изменениями частоты МЕПСП, квантового числа ВПСП и их формы.' Кррые того,. компонент Ап7 не вызывал изменений Щ мышечных волокон.Этот компонент также эффективно подавлял и отЕеты мышц саранчи на аппликацию глутамата. '. ■ Учитывая то, что компонент Ап7 подавляет МВПСП и ВПСП без видимого влияния на Ш мышечных- волокон, частоту МВПСП и квантовый состав ЬПСП, можно заключить, что данный компонент реализует свои эффекты на уровне постсинаптичес-кой мембраны, .

При исследовании влияния компонента Ап7 на вависимссть доза-эффект глутш,атных- потенциалов обнаружено, что данный комп>

нент смещает кривые доза-эффект вправо вдоль оси абсцисс. При этом 'увеличение концентрации апплицируемого глутамата приводило к мв Тис.7.Влияние ионов Са2+

15 и Ме£+ на амплитуду ги-

гантских МВПСП,индуцированных компонентом АпБ яда паука Апешез!а зр. А- в присутствии-Сз2+;Б-в присутствии Мд21". По оси ординат - амплитуда гигантских МВПСП в мВ,по оси абсцисс-концентрация Са2+и в ММ. Среда -см. подпись к рис.5.

что указывает на

10-

6-

1

г—т,—)-1

1.8 б 7£ 10 МЫ

восстановлению максимумов глутаматкых ответов

конкуренцию компонента Ап?' с глутаматом. Полученные данные свидетельствуют, что компонент Ап7 действует на уровне постсинаптичес-кой мембраны, взаимодействуя непосредственно с узнающим участком глутаматного рецептора.

Таким образом,- ' высокая избирательность и специфичность действия компонентов яда паука Апетез1а эр. позволяет рассматривать их как перспективные инструменты исследования функционирования глутаматергических синапсов.

ВЛИЯНИЕ ЯДА ПАУКА Аее1епа 1аЬ1г1пМса НА НЕРВНО-.МШЕЧНЫЕ- СИНАПСЬГ ЛЯГУШКИ . Добавление яда паука Аё;е1'епа 1аЬ1г1пИоа в среду, омывающую нервно-¡мышечный препарат, - обычно приводит к снижению частоты МПКП. При этом эффективность действия яда находилась в прямой зависимости, от; его концентрации (табл.3). Так,, при концентрации яда 160 мкг/мл частота МПКП. к 20 мин снижалась в 5-6 раз относительно исходного уровня. При этсм МП' мышечных волокон и амплитуда МПКД существенно не изменялись. ' .

Для выяснения механизма действия яда были выполнены эксперименты с использованием таких веществ, как ТТФБ,- менадион, и методических приемов,которые индуцируют процесс секреции медиатора / Глаголева и др., 1970; СооКэ, (5и^е1,1973;Наликулов и др., 1352 /. Так ТТФЗ и менадион обычно стимулируют секрецию медиатора, увеличивая частоту 2«ШШ.При использовании ТТ5Б (2*10_бМ) час-

ТАБЛИЦА. 3

Влияние' яда паута Аге1епа-1аМг1гЛ1са на параметры синалтических ' потенциалов нервно-мышечных синапсов лягушки

(Концен- Мембранный Амплитуда ■ Частота Амплитуда . .1 Амплитуда

трация потенциал МПШ1,мВ МШШ,с~1 ПКП,мВ 1 ШШ.мВ ■

Гада ■ ■ мышечного • в среде,содерж.!в среде,содерж.

¡паука волокна, мВ. МеИа I тубокурарин.

!мкг/мл 6 мМ 1 10"6 М .

| 10 . 1 89,5+1,1 (5) 0,395+0,061 (4) 0,95±0,21 (5) 1 7.855+0,514- (7)|6.305±0Л04 (6)

88,6+1,2 0,333+0,060 ■ 0,54±0,21 7,204±0,495 • 15,361±0,093

! 50; ББ.0±0,9 (4) 0,423+0,092.(3) 1,21+0,31 (4) 1. 9,056±0,794 (Б)|6,244±0.143 (6)

85,3+1,2 0,415+0^085 ' 1,16±0,28 5,41В±0,583 |2,481±0,084

1 ! 100 1 1 I. 90,6+0.8 (7) 0,415+0,103 (5) 1-,15±0,18 (7) 1 . 8,450±0.541 (7)|6,109±0,165 (Б)

90,2±0,7 0,410+0,030 0,22+0,05 2,008±0,122 ' ¡1,094±0,065 '

{'. 150-'. 88,7+1,2 (?) 0,405+0.046 (5) Р.7Б±0.14 (7) . . , 1 . , 8,733±0.649 (7)|6.417±0,149 (7)

87,2±1,3 0,399+0,035 ; 0,18+0,08. |0,638±0,095 •. ¡0,356±0,049

1____!_'' ' ' ' ' -I_„__I

В'скобках указано число, опытов,в■числителе дроби-значения в контроле,в знаменателе- среднее значение на 30 мин действия. яда паука.Аее1епа-labiri.nt.ica.

тота МПКП увеличивается до -Л60 с-1 (п -4), а в присутствии мена-диона (5*10~4М)- до ^230 с-1 (п -6). .После предварительной обработки препарата ядом паука (100 мкг/мл) эти агенты сохраняли способность увеличивать частоту МПКП. Так, ТТФБ в этих условиях увеличивал частоту МПКП до -Л56 с-1 ( п-3 ), а менадион до -.221 с-1 ( п-5 ). Эти данные однозначно свидетельствуют о том,что яд паука не влияет на индукцию выхода кальция из внутриклеточных систем нервного окончания. Вторая серия экспериментов была проведена в условиях калиевой деполяризации. В контроле, при концентрации KCl 2 мМ, средняя частота МПКП составляла 0,9S±0,1 с~а (п-5). С увеличением концентрации ионов калия ■ частота МПКП увеличивалась. Так, при 15 ММ KCl, частота ШКП составляла 88±5,0с-1 (п-5). В присутствии яда паука увеличение концентрации KCl также приводило к увеличению частоты МПКП, однако в значительно меньшей степени (рис.8).

В средах без ионов кальция с ЭГТА (2,0 мМ) ( для дополнительного удаления следов ионов кальция) яд паука не оказывал какого-либо влияния на частоту МПКП.

Для дальнейшей характеристики механизмов действия яда изучено его влияние на параметры ПКП. Эти эксперименты проводились на фоне частичной блокады холинорецепторов тубокурарином или на фоне частичного угнетения секреции медиатора ионами магния. Эти приемы позволяют исключить генерацию ПД мышечных волокон и тем самым предотвратить их сокращение. Вместе с тем, применение этих блока-

г

Рис.8.Влияние яда паука Agelena lablrintica на зависимость частоты МПКП от концентрации KCl. А-контроль;Б-В врисутст-ствии яда (ЮОмкг/мл) .По оси ординат-частота МПКП сек-1, по оси абсцисс,-концентрация KCl,мМ.Сре-да-см.подпись к рис.1.

торов, характеризующихся различным- механизмом действия, позволяет получить дополнительную информацию о механизме действия яда.

В этих 4 экспериментах яд паука (50 мкг/мл) уменьшал амплитуду ПКП на фоле ионов магния на 40,£, на фоне тубокурармка на 30%

100 г

15 ¡»Ы

• - 28 - ' (табл.3 ). При этом снижение амплитуды ПКЛ в присутствии ионов магния•зависело от исходного значения квантового состава ПКП и былл более вырзжено при его высоких значениях. Зто может указывать на антагонизм яда с ионами магния. На фоне- различных концентраций тубокурарина яд снижал амплитуду ПКП, при этом величина его не зависела от исходной амплитуды ПКП. Это может указывать на то, что в действии яда на ПКП нет синергизма с тубокурарином. Следовательно, яд паука не взаимодействует .с холинорецепторами постсинаптичеокой мембраны. Анализ квантового числа ПКП до и после действия яда показал, что снижение амплитуды ПКП происходит в основном за счет снижения квантового состава ПКП.

Как уже отмечалось, частота ШШП и квантовый состав ПКП прямо зависят от концентрации кальция в аксоплазме нервного окончания, которая, б свою очередь, определяется активностью внутриклеточных кальций-транспортирутоцих систем нервного скончания и состоянием потенциалэависишх кальциевых каналов пресинаптической мембраны. Выше уже было показано, что яд паука не влияет на,секрецию медиатора, индуцируемую агентами, которые увеличивают концентрацию 'кальция в аксоплазме нервного, окончания за счет его выхода из внутриклеточных депо. Поэтому учитывая то, что в условиях калиевой деполяризации яд паука снижает частоту ШКП, можно .предпЬлог жить, что подавление амплитуды ПКП, вызываемое ядом, происходит в результате снижения потока ионов кальция из внеклеточной среды в нервное окончание вследствие его взаимодействия с потенциалзави-симш.ш Са2+-каналаыи пресинаптической мембраны.,

Действие яда паука Age lena lablrlntlea на Са^-токи пресинаптической мембраны Известно,что нервный импульс, достигая нервного окончания, активирует потекциалзависимые Саг+-каналы, а'поток Са2+ в аксо-плазму нергного окончания запускает механизм секреции медиатора /Экклс,1956Л 3 предьщздеы разделе было показано, что-яд паука A.-lablrir.tiea снижает частоту 1ШКП и квантовый состав ПКП нерв-но-мыгечных синапсов лягушки, и было предположено, что это обусловлено, взаимодействием яда с потенциэлгзЕЗКИмыын Са2т-каналами пресинаптической мембраны. Для проверки этого предпсуюж?ния в настсяцеы разделе изучено влияние яда паука на Саг+-канзлы преси-нштиес-кой мембраны.

При раздражении моторного нерва б области нервного окончания

регистрируется сигнал, который является суммой Ыа+ и К+-токов, участвующих в генерации пресинаптического ПД, Са2+-тока пресинап-тической мембраны, активируемого в ответ на деполяризацию нервного скончания и тока-концевой пластинки (ТКИ), .возникающего в результате взаимодействия медиатора с холинорецептором псстсинапти-ческой мембраны. Как видно из рис.9 А, в нормальном растворе на фоне частичной блокады холинс-рецепторов тубокурарином (10~5М) для предотвращения генерации ПД мышечных волокон, регистрируется сигнал, состоящий из трех компонентов. Начальный компонент сигнала, имеющий входящее направление, отражает Иа*- ток и подавляется тетродотоксином, второй компонент, имеющий выходящее направление, соответствует К+- току и подавляется ТЭА, а третий компонент, имеющий также выходящее направление-ТКП, подавляется тубокурарином.

Как показали эксперименты, яд паука ( 50 мкг/мл ) не оказывает влияния на первый и второй компоненты сигнала, т.е. на Мз+-и К+-токи, но подавляет третий компонент сигнала (рис.9 В ). Полностью заблокировав холинорецепторы тубокурарином (10~3М) и добавив в перфузирующий раствор ТЭА (1*10~'-М), можно регистрировать медленный компонент ( рис.9 В ), который подавляется ионами кобальта ( 4 мМ ), блокаторами Са2+-каналов и отражает Саг+-ток нервного окончания.

Рис.9.- Влияние яда паука А. 1аЬ1-г1п11са на токи нервного окончания нервно-мышечного препарата лягушки. А- контроль; Стрелками указэны: 1-Ыа+-компонент, 2 - К+-компонент, 3 - ток концевой пластинки. Б -через 30 мин после добавления яда (50 мкг/мл).

В- контроль; Г- -через 30 мин после добавления яда (50 мкг/мл).Стрелкой указан кальциевый компонент тока. Подробности в тексте.

В этих условиях добавление -яда паука приводит к существенному снижешпо этого компонента сигнала, т.е. Са2+-тска почти на 757. от исходного уровня ( рис. 9 Г ). Степень подавления Са2т-токов зависела от концентрации яда паую и при его концент-

• - 30 -

рации 150 мкг/мл Са2+-ток подавлялся на 90 -95%. Отмывание препарата нормальным раствором.Рингера приводило к частичному восстановлению амплитуды Саг1"-тока. Полученные данные однозначно свидетельствуют о том, что яд паука содержит компонент, специфически блокирующий потенциадзависимые Са2+-каналы пресинаптической мембраны. I

С помощью гельфильтрации и ионообменной хроматографии из яда паука Азе1епа 1аЫг1пИса был выделен компонент Ав1-1 с молекулярной массой -.1,0 кДа / Насиров и др., 1995 /, который эффективно подзелял Са£+-токи пресинаптической мембраны в зависимости от его концентрации.

Таким образом, из яда паука А^е1епа 1аМг1писа нами впервые выделен компонент ( А£?1-1), который блокирует потенциадзависимые Са2т-каналы пресинаптической мембраны нервно-мышечных синапсов лягушки и который, несомненно, будет чрезвычайно полезным инструментом при установлении структурно - функциональной организации' СаЕ1"-каналов пресинаптических мембран и механизмов их регуляции.

? ■ ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В процессе исследования действия различных ядов пауков, ' их, компонентов и биологически-активных соединений различной природы на электро- и хеыовозбудимые мембраны,были обнаружены соединения, обладающие пресинаптическим и постсинаптическим действием, а также модифицирующие Са2+-каналы пресинаптической мембраны.

В частности показано, что диацилпроизводные ДБ1еК6 (Са^-ио-нофоры ), структурные изомеры ди-втор-бутил-ДБ18К6 ионсфо-

ры), псевдоцикдический аналог ДБ18К6 (Са2"*"- каналоформер), мена-дион и диене« В в разной степени модифицируют процесс секреции медиатора и обладают различным механизмом действия.' Так, диацилпроизводные ДЕ1ВК6 и структурные изомеры ди-втор-бутил-ДБ18Кб стимулируют секрецию медиатора, индуцируя поступление Са'2+и М^из внеклеточной среды в аксоплазму нервных окончаний. При этом эффективность стимуляции секреции медиатора хорошо, коррелировала с их юнофорной активностью на ЕЛМ. ' Усиление секреции медиатора, вызываемое ыенадионом и диеноном Б, полностью обусловлено увеличением концентрации Са2+ в аксоплззме за счет мобилизации мито-хондриального Са£+. Псевдоциклический аналог ДБ18К6 и лептидкыи каналоформер из водоросли Суз1озе1га ЬагЬа1а также усиливают сек-

рецию медиатора, однако, в отличие от вьше отмеченных соединений, они вызывали дискретное увеличение частоты ШШП в виде пачек. Принимая во внимание то, что эти соединения формируют на БЛМ каналы проводимости для Caz+ и Srz% (Махмудова и др., 1985; Мирход-каев и др.,1988), наблюдаемые пачки МПКП, по-видимому, являются ответом на дискретное поступление Саг+и Srz+B аксоплазму по каналам, формируемым этими соединениями в пресшаптичеекой мембране.

Результаты, полученные со структурными изомерами ди-втср-бу-тил-ДБ18К6 и пептидом ■ бурой водоросли являются дополнительным подтверждением того, что Mg2+ и Srz+ могут эффективно заменять Caz+ в процессе секреции медиатора.

Эксперименты, выполненные наш с краун-эфирами,пептидом бурой водоросли, менадионом и диеноном'В показали , что эти вещества являются модификаторами процесса секреции медиатора и могут быть использованы для его регуляции в различных экспериментальных условиях.

При исследовании действия яда паука Eresus niger было обнаружено, что он эффективно блокирует нервно-мышечные синапсы лягушки подобно пресинаптическим нейрстоксинам змей, обладающих фосфоли-пазной активностью.

С помощью гельфильтрации и ионообменной хроматографии из яда паука Eresus nlger была выделена фракция VII1-4, блокирующая си-наптическум передачу и обладающая фосфолипазной активностью. Обработка фракции р-бромфенацилбромидом, агентом, ингибируюшим фос-фолипаэнуга активность , приводила к утере пресинаптической активности.

Результаты этих экспериментов в сравнительном аспекте с пре-синапймескими токсинами змей, несомненно, будут способствовать разработке новых подходов к изучению особенностей секреции медиатора.

■ В эксперйлнтах на идентифицированных нейронах ГШа4 и ППа! виноградной улитки Helix pomstia показано, что яд паука Arglope lobata и его низкомолекулярные компоненты - аргиолобатин ( мол. масс 657 Да) и компонент A-V-2 ( мол. масса 637 Да) подавляют токи, индуцируемые глутаматом, действуя на уровне рецептор-канального комплекса глутаматного рецептора.

Аргиолобатин, наряду с подавлением глутамат-активируемых токов, смещает их потенциал реверсии и кривые доза-эффект глута-мат-активируемых токов вдоль оси абсцисс. Увеличение концентрации

• - 32 - •

алшшцируемого глутамата в присутствии аргиояобатина не приводило к восстановлению максимумов токов. Все эти данные свидетельствуют о том, что аргиолобатин неконкурентно действует на уровне ионного канала глутаматного рецептора нейронов Ща4 и Ша1 виноградной улитки.

В отличие от аргиодобаиш^ компонент А-У-2 не вызывал .смещения потенциала реверсии, но в его присутствии наблюдалось параллельное смещение кривых зависимости доза-эффект глутамат-активи-руеыых токов вдоль оси абсцисс, при этом увеличение концентрации апплицируемого глутамата приводило к восстановлению максимумов токов. Более того, компонент А-У-2 проявлял свойства агониста и индуцировал входящие (Ша4) и выходящие (ППа1) токи при его локальной аппликации на сому нейронов. Эти данные указывают на го, что компонент А-У-2 конкурентно взаимодействует непосредственно с узнающим участком глутаматных рецепторов нейронов Ша4 и Ша1 виноградной улитки.

. Яд паука Аг^1оре 1оЬа1а и его компоненты- аргиолобатин и А-У-2 также эффективно подавляют синадтические и глутамат-активируемые токи нервно-мышечных синапсов саранчи. Аргиолобатин. наряду с подавлением синаптических и глутамат-активируемых токов, существенно сокращает время их полуспада. Анализ зависимости доза-эффект глутамаг-активируемых токов показал, что действие арги-олобатина носит неконкурентный характер. Все эти данные свидетельствуют о том, что аргиолобатин взаимодействует с ионным каналом глутаматного рецептора. Вместе с тем показано, что аргиолобатин увеличивает связывание Ь-^Н-глутамата с синаптическими мемб-,' ранами иа мышц краба подобно агентам, углубляющим десенситизацию глутаматных рецепторов. Действительно, как показали эксперименты с конканавалином А, агентом, устраняющим десенситивацию глутаматных рецепторов, аргиолобатин обладает способностью углублять десенситизацию глутаматного рецептора. Следовательно, взаимодействие аргиодобатща-с глутаматным рецептором оказывает влияние на участок десекситиэации глутаматного рецептора.

Таким образом, на основании полученных экспериментальных данных можно заключить,что взаимодействие аргиолобатина с глутаматным рецептором одновременно сказывается на функциональном состоянии участков рецептара, управляющих ионным каналом и его десенси-тизацией.

При исследовании действия яда паука Апетез1а зр. на различные

типы синапсов обнаружено, что данный яд избирательно взаимодействует только с глутаматергичесгаши синапсами саранчи. С помощью гельфшгьтрации и ионообменной хроматографии из данного яда выделено три нейротоксических компонента - Ап4 (мол. масса -Л0 кДа ), Ап5 ( мол. масса кДа ) и Ап7 (мол.масса Л кДа).

Компонент Ап4, резко увеличивал частоту МВПСП саранчп. Предполагается, что этот компонент, обладающий фосфолллааной А* активностью, нарушает процесс секреции медиатора, взаимодействуя с мембранами нервных окончаний и гадролизуя их фосфслипиды. Поскольку компонент Ап4 не эффективен на нервно-мышечных синапсах лягушки, а компонент VII1-4 яда паука Егезиз п^ег, обладающий аналогичной активностью на "-напсах лягушки, не влияет на нервно-мышечные синапсы саранчи, можно заключить, что эти нейротокси-ческие-фосфолшззы имеют особые участки, , обеспечивающие их высокоизбирательнее связывание с пресинаптическими мембранами.

Компонент Ап5 вызывал генерацию гигантских МВПСП, сгруппированных в пачки, амплитуда которых зависела от концентрации Са2+ и Ма2+ в среде. Анализ экспериментальных данных показал, т:то компонент Ап5 модифицирует Са2+-каналы пресинаптической мембраны, в результате чего генерируются гигантские МВПСП.

Компонент Ап7 подавлял как синаптические потенциалы, так и глутаматные ответы мышц саранчи. В присутствии компонента Ап7 кривые зависимости доза-эффект глутаматных ответов смешались вправо вдоль оси абсцисс, а увеличение концентрации апплицируемо-го глутамата приводило к восстанавяеншо максимумов . ответов. Все эти данные однозначно указывают на взаимодействие компонента Ап7 с узнающим участком глутаматного рецептора.

При исследовании яда паука Аве1епа 1аМг1Ш;1са было обнаружено, что он снижает частоту МШД, квэнтоеый состав ПКП и подавляет Са2+-токи пресинаптической мембраны. С помощью методов препара-тиеной биохимии из яда паука Аее1епа 1аЪ1г1п1:1са был выделен компонент Ае1-1 с молекулярной массой Л кДа, который дозазависимым образом подавлял Са2+-токи нервного окончания.

Ранее из яда паука Аге1епорз1з арегЬа был выделен- токсин -Ава-В1, пресинаптически блокирущий нервно-мышечные синапсы насекомых и не действующий на синапсы лягушки /Рососк, ШсГю11з, 1992; Рососк еЪ а1., 1992 /. Другой токсин этого яда оше&а-А?^-1А ( мол. масса 6 кДа ) вызывал стойкую блокаду кальциевых каналов большинства нейронов центральной нервной системы позвоночных, но

■ - 34 -

не действовал на нервно-мышечные синапсы лягушки / Scott et al., 1390/.

Обнаруженный нами компонент Agl-1 яда паука A.labirintlaa, блокирует пресинаптические кальциевые каналы нервно-мышечных . синапсов лягушки. Зта особенность компонента Agl-1, несомненно, заслуживает более тщательного исследования и, безусловно, позволит охарактеризовать новый нейротоксин, который найдет применение в качестве специфического инструмента исследования кальциевых каналов.

Выражаю искреннюю благодарность научным консультантам- академику Б.А.Ташмухамедону и профессору П.Б.Усманову аа всесторонний помощь в обсуждении и анализе полученных экспериментальных данных и ценные советы в процессе выполнения работы.

ВЫВОДЫ

1. В процессе исследования ядов пауков, их компонентов и биологически-активных соединений различного происхождения выявлены соединения, обладающие пре- и постсинаптическим действием.

2. Показано, что диацилпроизвсдные ДЕ18К6 и структурные изомеры ди-втор-бутил ДБ18К6 усиливают секрецию медиатора благодаря их ионофорным свойствам и индуцированию поступления Са2+ и в аксоплазму нервного окончания. Усиление секреции медиатора, вызываемое менадионом и диеноном В, обусловлено их способностью мобилизовать, митохондриальный Са2+.. •

; 3. Установлено, что 4',4" (5")-димет1ша.миноэтанол-ДБ18Н5 (псевдоциклический аналог ДБ18К6) и пептид (мол. масса Б кДа) из бурой водоросли.CystoseIra barbata, характеризующиеся каналофор-мерной активностью на БЛМ, вызывают усиление секреции медиатора в виде пачек в результате формирования этими агентами ионных каналов в преспнаптической мембране, проницаемых для ионов СаЕ+ и Sr?<+.

4. Показано, что яд паука Eresu.3 niger содержит компонент (мол. масса „13 кДа), блокирующий нервно-мышечные синапсы лягушки пресиналтически и обладающий фосфолилазной активностью, наличие которой является необходимым условием для проявления его токсического действия.

5. Установлено, что компоненты яда паука Argiope lobata - ар-

гиолобатин ( мол.масса 657 Да ) и A-V-2 (мол. масса 637 Да) подавляют глутамат-активируемые токи, взаимодействуй первый- с ионным каналом, а второй- с узнающим участком глутаматных рецепторов идентифицированных нейронов Ша4 и Ша1 виноградной улитки Helix pomatia.

6. На нервно-мышечных синапсах саранчи аргиолобатин подавляет синаптические и глутамат-активируемые токи, сокращает время их полуспада и усиливает десенситизацгао глутаматных рецепторов.

Полученные данные свидетельствуют о том, что взаимодействие аргиолобатина с глутаматными рецепторами нервно-мышечных синапсов саранчи одновременно влияет на функциональное состояние участка десенситизации и ионного канала рецептора.

7. Из яда паука Anemesia зр. впервые выделены три нейротокси-ческих компонента, взаимодействующих с функционально различными участками нервно-мышечных синапсов саранчи. ■ Один из них, компонент Ап4 ( мол.масса -10 кДа ), блокирует синаптическую передачу пресинаптически и обладает фосфолипазной активностью, наличие которой является необходимым условием для проявления его токсического действия. Компонент Ап5 ( мол.масса S кДа ) вызывает генерации гигантских МВПСП, сгруппированных в пачки, в результате модификации Caz+-каналов пресинаптической мембраны. Компонент Ап7 (мол.ма:са Л кДа) подавляет синаптические потенциалы и глутамат-ные ответы, взаимодействуя непосредственно с узнающим участком глутаматных рецепторов нервно-мышечных синапсов саранчи.

8. Обнаружено, что яд паука Agelena labirintica снижает частоту МПКП, уменьшает квантовый состав ПКП И подавляет Са2+-токи нервного окончания нервно-мыкечньгх синапсов лягушки.

Установлено, что эти аффекты яда обусловлены наличием в его составе компонента Agl-1 ( мол.масса -1 кДа ), подавляющего поступление Са2+ в нервное окончание в результате блокады потенциал-зависимых Са?+-каналов пресинаптической мембраны.

Список основных работ по теме диссертации

1.Усманов П.Б., Казаков И.', Каликулов Д., Атакузиев В.У., Юкельсон Л.Я., Ташмухамедов Б.А. Низкомолекулярный каналоформер-ный компонент нейротоксинов ядов пауков сем. Therídíldae //Хшия природ.соед.-1983.-N 3.-С.400-401.

2.Tashmukhaniedov В.A., Usmanov Р.В.,Kazakov I., Kalikulov D. Effects of different spider venoms on artificial and biological

• - 36 -

membranes //"Hopps-Seylers.Z.Physiol.Chem."-1933.-V 6. -P. 621.

3.Усманоа П.Б..Каликулов Д.,Шадыева H.Г.,Ташмух&медов Б.А. Действие яда паука Argiope lobata на глутаматергические и холи-нергические' синапсы //ДАН СССР.-1983.-Т.273.-N4.-C.1017-1018.

4.Tashmukhair,edov В.А..Usmanov Р.В. .Kazakov К, Kalikuloy D., Yukelson L.Ya..Atakuzlev B.U. |Effects of different spider venoms on artificial and biological membranes // In "Toxins as Tools in Neurocheniistry".Berlin-New York.-1983.-P.311-323.

5.Каликулов Д.,Усманов П.Б. Действие кальцивых ионофоров ди-бутирил-дибе.нзо-18-краун-б и теноилтрифторацетона на спотанное выделение медиатора //ДАН УзССР.-1983.-N4.-С.51-52.

6.Усманов П.Б..Каликулов Д. Дашмухамедов Б.А. Действие яда паука Arçicpe lobata на холинорецепторные синапсы лягушки //ДАН УзССР.-1984.-ÎIS.-С. 50-51.

7.Usnanov Р.В., Kazakov I., Kalikulov D..Atakuzlev B.U. The channel-forming component of the Theridiidae spider- venom neurotoxins // Gen.Physiol.Bicphys.-1985.-V.4. -N 2.-P.625-630.

8.Usmanov P. B., Kalikulov D., Shadieva N.,Nenilin A.B..Tashmu-fchamedov В.А. Postsynaptic blocking of glutamatergic and cholinergic synapsesls Is a common property of the Araneldae spider venoms // Toxicon.-1985.-V.23.-N 3.-P. 528-531.

9. Атакуэиев Б.У. .Насиров К.Э. .Каликулов Д. .Усманов П.Б. Дашмухамедов Б.А. Аргиолобатин из яда паука Argiope lobata //Тез.научи.сообщ. VII Бсесоюзн.симп."Химия белков и пептидов" Дал-лин:1987.-С.249.

- 10.Каликулов Д..Насиров К.Э., -Усманов П.Б. Дашмухамедов Б. А. Действие яда паука Eresus niger на нервно-мышечные синапсы лягуш-,-ки // Тез. докл.XV съезд Всесоюан.физиол.общества им.И.П.Павлова, КишпнеЕ:1937.-Т. 2.-С.198.

И.Ыирходкаев У.3. .Каликулов Д. ^Усманов 'П.Б. Дашмухамедова А.К. Индукция'краун-эфирэми спонтанного выделения медиатора //Би-ол.мембраны.-1988.-t.6.-Мб.-С.643-647. ' .

12.Усманов П.Б., Каликулов Д., Ненилин А.Б.. Насиров К.Э., Ахмедов. К. Действие яда паука Eresus nlger на нервно-мывечные синапсы лягушки // Биол.науки.-1S88.-N 11.-С.20-23.

13. Ахмедов Т.Р., Мирходжаев У.З., Каликулов д., Усманов П.Б.. Стемпневская И. А. Дашмухамедова А.К. Индукция спонтанного выделения медиатора структурными изомерами дивтор-бутил-ДВ18К6 // Узб. биол. журк. -1988. -N 4.-С. 10-12.

14.Насиров К.Э..Шадыева Н.Г.,Атакуэиев Б.У..Каликулов Д.-Выделение и биологическая активность токсического компонента из яда наука Аге1оре 1оЬа1а //Тез. докл.IV съезда физиол.Узб.Тап-

, кент:-1983.-С.179.

15.Каликулов Д..Ахмедов Т.Р..Мирходжаев У.3..Усманов П.Б.,Таш-мухамедова А.К. Влияние структурных особенностей молекулы кра-ун-эфиров на процесс секреции медиатора // Теэ.дскл.IV съезда фиэиол.Узб. Ташкент:-1988.-С.170.

16.Мирходжаев У.3.. Каликулов Д.. Усманов П.Б., Ташмухамедов Б.А. Действие синтетического Са2+-каналсформера на спонтануи активность нервно-!,млечного синапса /7 Еиол. мембраны. -1989. -Т.6. -М 4. -С.424-427.

17.Усманов П.Б.,Каликулов Д.,Шадыева Н.Г.,Насиров К.Э..Атаку-зиев Б.У. Модификаторы глутаматного рецептора из яда паука Аг®1оре 1оЬа1а //Тез.докл.Всесоозн.симп. "Одиночные ионные каналы в биологических мембранах".Пущино:-1989.-С.97.

13.Атакузиев Б.У.,Насправ К.Э..Каликулов Д.,Усманов П.Б. Бло-каторы глутаматных рецепторов из яда пауков Аг?1оре 1оЬа1а и Агапеиз 1агЬаг1сиз //Xимия природ.соед.-1990.-М 4.-С.532-537.

19.Усманов'П.Б..Каликулов Д..Насиров К.Э.,Ахмедов К.Д..Нуртаев Х.С. Новые нейротоксические компоненты яда паука Агг1оре 1оЬа1а // Биол. мембраны. -1991.-Т.8.-И И.-С.1135-1136.

20."Каликулов Д.. Асраров М.И. Менадион м Диенон В индуцируют выход •Са2'*" из митохондрий и стимулируют секрецию медиатора из нервных окончаний //тез.научн.сообщ.I съезда физиол.Средней Азии и Казахстана. Душанбе:-1991.-С.48.

21.Каликулов Д. .Веспалько Н.В..Махмудова Э.М. Индукция пептидным каналоформером спонтанного выделения медиатора/7 Узб.биол.журн. -1991. -Н 5.-С.6-9.

22.Каликулов Д..Усманов П.Б. Действие яда паука Аее1епа 1аЬ1г1п1;1са на Саг-,"-каналы пресинаптической мембраны нервно-мышечных синапсов лягушки //тез.научн.сообщ.I съезда физиол.Средней Азии и Казахстана.Душанбе:-1991.-С.49.

23.Усманов П.Б. ,■ Каликулов Д., Ахмедов К.Д.. Насиров К.Э.. Нуртаев Х.С. Влияние компонента А-У-2 яда паука Аг^1оре 1оЬа1а на глутаматергические синапсы //Тез.'докл. I съезда физиол. Средней Азии и Казахстана. Душанбе:-1991.-С.147.

24.Ахмедов К.Д..Каликулсв Д..Усманов П.Б. Действие яда паука Агй1оре 1оЬа1а на глутаматные ответы идентифицированного нейрона (ППа4) виноградной улитки //ДАН ТУ.-1991.-Н 11.-С.13-20.

•' - 38 -

25.Каликулов Д.,Асраров М.И., Гагельганс А.И..Усманов П.Б. Индукция менадисном выхода -Са2+иэ митохондрий и секреции медиатора иа нервных окончании //Биол.науки.-1992.-И 12.-СЛ02-10В.

26.Ахмедов К.Д..Каликулов Д. .Усманов П.Б. Влияние яда паука Аг£1орэ lobata на глутаматные ответы идентифицированного нейрона (Ша1) виноградной улитки //'Узб.биол.журн.-1992.-М 1.-С.77-У8.

27.Усманов П.Б.,Каликулов Д..Насиров Н.Э..Ахмедов Н.Д. Действие аргиолобатина на 1_-глутатт - активируемые токи мышц саранчи // Биол.мембраны.-13Э2. -Т. 9. -К 10.-С. 1142-1143.

28.Каликулов Д. Действие яда паука Апешез1а эр. на глутаматер-гические синапсы // ■ Тез.дои. конф. посвященной 50-летию . АН РУ "Современные проблемы физиол.и биофизики". Ташкент:-1993.-С.69.

29.Насиров К.Э., Ахмедов К.Д., Каликулов Д., Усманов П.Б. Выделение блокатора Са-каналов из яда паука Аде1епа laЫrlntloa // Химия природ. соед.-1995. ^ 3. -С.

30.Каликулов Д., Ахмедов К.Д., Насиров К.Э., Усманов П.Б. выделение и характеристика нейротоксинов яда паука Апеиез1а эр. // Химия природ, соед. -1995. -Ы 3. -С.

фгсчача маемун

Турли хил ургимчак захарлари ва уларнинг ксмпонентларининг ва биологик-актив моддаларнинг злектр- ва хемоьузралувчан мембрана-ларга таъсирини тад^и^ кшхиш жараензда,медиатор секрециясини индукция килувчи, глутамат рецептор-канал комплексиниг турли ^исм-лари билан уваро таъсир этувчи, х,эмда Са^-каналларини модификация фмувчи бирикмалар ани^ланди. '

Краун-эфирлар (ДВ18К6 нинг диацил цосилалари, ди-втор-бутил 'ДВ18К6 нинг изомерлари ва ДБ18К6 нинг псевдоцикяик аналоги),мена-, дион ва диенон В, ^амда }уунрир сув утидан ажратилган пептид нерв термина™ аксоплазмасида Са2+, Маг+ ва 5гг+ концентрациясини оши-риши наткжасида.ба.чанинг нерв-мускул синапсларида медиатор секре-циясшшнг кучайшга Ълиб келиши курсатилди.

... • Тажрибалзрда Егезиз п!еег ургимчаги захаридан • ажратилган УШ-4 компонента (мол.массаси 13 кДа) ба^анинг нерв -мускул уза-тилшини блок ^шшши ва унинг фосфолипаза А1 активлигига эга эканлиги курсатилди

Аг^1оре 1оЬа1а ургимчак захаридан ажратиб олингзн кошонент-лар - арх'иолобатин ( мол. массаси 657 Да ) ва А-У-2 (мол. мае с ас и

* - 39 -

637 Да ) уеум шиллик,курти нейронларининг глутамат-активловчи ток-лзрни сусайтиради. Бунда аргиолобагиннинг ион каналига таъсир ки-лиши, A-V-2 аса глутамат рецепторининг медиатор билан борланувчи ipicMH билан уваро таъсир атиши курсатилди: '

. Аргиолобатин чигирткаларнинг нерв-мускул синапсларида синап-тик ва глутамат -активловчи токларни сусайтиради. Бу шароитда аргиолобатин синаптик ва глутамат-активловчи токларшшг. ярим пасай-.ши ва^тини к^с!рртиради ва глутамат рецепторининг десенситиаацип-сини кучайтиради. Олинган натидалар, аргиолобатин таъсири глутамат рецепторининг десенситизация ва ион каналининг функционал ^о-латида акс этишидан далолат беради.'

Биринчи бор Аг,emesia sp. у pringar и захаридан чигиртка нерв-мускул синапсининг функционал жихатдан фар)-; !;илувчи турли 1?исмлари билан ysapo таъсирланувчи учта иейротоксик компонент (Ап4,Ап5 ,Ап7) ажратилди: а) Ап4 компонента (мол.массаси 10 кДа) синаптик узатилишни пресинаптик блок к^шиши вг\ унинг бундам ток-сик таъсир этишига фосфолипаза активлиги сабаб эканлиги курсатил-ди; б). АпБ компонента (мол.массаси 5 кДа) пресинаптик мембрана-ларнинг Са2+-каналини модификация ^илиши натижзсида гигант МВПОП генерациясини келтирадл; в) Ап7 компонента (мол.массаси 1 кДа) глутамат рецепторининг медиатор билан борланувчи цпсип билан уза-ро таъсир кгилкш натижасида синаптик ва глутамат потенциапларини сусайтиради.

Agelena lablrlntlca ургимчаги захарвдан ба^нинг нерв-мускул' синапсининг пресинаптик мембраналарининг Са2'1"-каналларики блок 1рлувчи Ag-1-l (мол.массаси 1 кДа) компсненти ажратилди.

Summary

In our research there were discovered the compound?,*that: 1) Induce the transmitter release, 2) Interact with different sites of, receptor-channel complex of glutamate receptors and 3) modifícate the Ca-channel.

It was shown, that the crown-ethers (dlacylderivatlves DB18K6, structural 1someres diftorbutll DB18K6 and pseudocyclio analogue of DB38K6), peptide from Cystoseira barbata, menadicn and dlenon В Increase the Caz+,Mgz+ and Srg+-concentratlon In nerve terminal a;-:op 1 asm with following intensification of transmitter release.

The component from Eresus niger spider venom presyno.ptj cal ly blocks the synspse trsr¡s¡i»lsstoii ¿vid possesses phospnollpase

-i, -T. !(/• f ■ - ' . * — -.40 activity.

•It was established, that the arglolobatln (657 Da) and A-V-2 (637 Da) isolated from Argiope lobatà spider venom inhibit the glutamate induced currents of neuron of vine snail Helix pomatia interacting (arglolobatln) with glutanate receptor channel and (A-V-2) recognizing site of, receptor.

Arglolobatln inhibits the synaptic potentials and glutamate activated currents on neuro-muscular synapses, decreases their falling time and increases the desenslti2atiori of glutamate receptors. These results give evidence that arglolobatln simultaneously affects on the functional state of deslnsitlzation center" and ion chamel of glutamate receptor.

From Anemesia sp. spider venom 3 neurotoxic components acting on different functional sites of locust neuro-muscular. synapses were Isolated. One of them An4 (10 kDa) blocks transmission presynaptically and possesses phospholipase activity, . that, is necessary for toxic effect. Commponent An5 (5 kDa) evokes the generation of glgant MEPSP due to modification ' presynaptic rchannel. Component An7 (1 kDa) inhibits the synaptic and glutamate potentials . interacting with glutamate receptor recognizing site of locust neuro-muscular synapses. . '

.It was discovered, that . Agelena labirintlca spider venom .blocks the nerve terminal Caz+-current of frog neuro-muscular synapses. It was established, that the effect of this venom is • du? to Its component Agl-1 (1 kDa), which inhibits the entering of Ca2+ ions Into nerve terminal as a result of the block of presynaptic potential-depended Ca^-channels.