Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование взаимодействия нейротоксинов с синаптосомами мозга крыс

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Содержание диссертации, кандидата химических наук, Просолова, Татьяна Кирилловна

ВВЕДЕНИЕ.

ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР. ХИМИЧЕСКИЕ И ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ СВОЙСТВА СТЕРОИДНЫХ НЕЙРОТОКСИНОВ.

Список употребляемых в работе обозначений

1. Аконитин.

2. Батрахотоксин.

3. Вератридин

4. Грайянотоксины.

5. Обще структурные свойства стероидных нейро-токсинов

6. Механизм действия стероидных нейротоксинов

7. Природа рецептора стероидных нейротоксинов

Введение Диссертация по биологии, на тему "Исследование взаимодействия нейротоксинов с синаптосомами мозга крыс"

Генерация и проведение нервного импульса обусловлены работой ионных каналов. Поэтому для понимания молекулярного механизма передачи нервного возбуждения необходимо всестороннее изучение этих мембранных структур. Особое место среди природных ионных каналов занимает натриевый канал, играющий ключевую роль в функционировании электровозбудимых мембран нервных и мышечных клеток. Ценными инструментами для исследования натриевых каналов являются природные нейротоксины. Взаимодействуя с определеннымии 'участками канала (рецепторами), нейротоксины селективно изменяют ту или иную его функцию.

Среди многочисленных эффекторов натриевого канала можно выделить группу полищклических нейротоксинов-активаторов, в состав которой входят производные грайянотоксина, батрахотоксина, верат-ридина и аконитина. Все эти вещества обладают сильным фармакологическим действием и содержатся в растительных или реже животных (батрахотоксин) организмах, продуктами жизнедеятельности которых они являются. По химическому строению токсины-активаторы представляют собой полициклические азотсодержащие (за исключением грайянотоксина) органические соединения основного характера. Однако строение основного углеродно-азотного скелета этих соединений различно. Ряд представителей: вератридин, батрахотоксин и их производные, - имеет стероидный скелет с азотсодержащей гетероциклической системой, т.е. относится к стероидным алкалоидам. В связи с этим всю группу токсинов-активаторов часто называют стероидными нейротоксинами. Общим свойством токсинов-активаторов является высокое сродство к липидной фазе мембраны.

Несмотря на различия химических структур, стероидные нейротоксины оказывают сходное влияние на функциональные свойства натриевых каналов электровозбудимых мембран, Токоины этой группы изменяют селективность ионной поры канала и одновременно воздействуют на потенциалчувствительность воротного механизма, что приводит к активации натриевого канала при потенциале покоя. Следовательно, рецептор стероидных нейротоксинов функционально связан как с селективным фильтром, так ж с регуляторным воротным механизмом, Это обусловливает важность изучения рецептора токсинов-активаторов для понимания молекулярного механизма работы натриевого канала.

В настоящее время есть все основания считать, что рецептор стероидных нейротоксинов входит в состав ионной поры натриевого канала. Следовательно, использование этих соединений, как молекулярных инструментов, открывает реальные возможности для идентификации и выделения собственно натриевого канала.

Автор выражает глубокую благодарность академику Ю.А.Овчинникову за постоянное внимание к данной работе, старшему научному сотруднику Е.В.Гришину, а также младшему научному сотруднику Н.М.Солдатову за ценные советы и помощь в процессе работы и написания диссертации.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Просолова, Татьяна Кирилловна

8. Заключение

Изучение цроцессов трансмембранного ионного переноса является одним из важнейших направлений современной физико-химической биологии. Постановка данной проблемы обусловлена важностью физиологической роли и многообразием проявления этих процессов в жизнедеятельности клеток. Среди цриродных систем ионного транспорта особое место занимает быстрый натриевый канал, в значительной мере определяющий свойства электровозбудимости мембран нервных и мышечных клеток. Изучение этой мембранной структуры проводится цри комплексном использовании различных электрофизиологических, фармакологических, биофизических и биохимических методов. При этом ключевую роль играют уникальные биорегуляторы -

нейротоксины, способные селективно воздействовать на отдельные функции и, следовательно, на определенные структурные компоненты канала.

Формально работу натриевого канала обеспечивают 3 фрагмента: а/ воротная структура, регулирующая ионный транспорт. На этот участок канала селективно воздействуют белковые нейротоксины из ада скорпионов и стрекательных клеток морских анемон; б/ наружное устье канала, содержащее СООН-группу. Этерификация этой группы частично ингибирует транспорт ионов Ыа+ и цриво-дит к необратимой инактивации рецептора ТТХ /181/; в/ селективный фильтр, чувствительный к стероидным нейротоксинам, способным изменять его проницаемость для проникающих катионов.

В настоящее время наиболее достоверные результаты получены при исследовании рецептора токсинов-блокаторов (тетродотоксина и сакситоксина) мембранных препаратов из электрического органа угря, мозга крыс и сарколеммы скелетных мышц. Так, рецептор ТТХ, выделенный из электроцитов, представляет собой гликоцротеид молекулярного веса 250 кД /182,183/. Для возбудимых мембран млекопитающих характерно наличие рецепторного комплекса, состоящего из нескольких б ежовых суб ъединиц /184-186/.

В то же время ряд важных структурно-функциональных аспектов канала, связанных с наличием в его составе рецептора токсинов-активаторов, изучен лишь фрагментарно. Вместе с тем интерес к этому участку канала вполне закономерен. Действительно, стероидные нейротоксины активны в отношении главных механизмов канала -ионцроводящего и обеспечивающего потенциалчувствительность. Рецептор токсинов входит в состав селективного фильтра или его непосредственного окружения. Этот участок канала является также центром сопряжения процессов активации и инактивации и, следова-

шязетгпз

СССР /I

вэ. в. е. йвги |

тельно, должен быть расположен вблизи регуляторной (воротной) структуры. Регуляторный фрагмент натриевого канала образует рецептор для б ежовых нейротокеинов, способных замедлять инактивацию канала. Рецепторы двух групп нейротокеинов находятся, вероятно, в аллостерической взаимосвязи, характеризующейся положительной кооперативностью. Следовательно, применение стероидных нейротокеинов как инструментов исследования позволяет не только изучать те или иные процессы функционирования натриевого канала, но и анализировать взаимоотношение обеспечивающих их структур.

Появление в последние годы ряда моделей для описания работы натриевого канала поставило настоятельную задачу установления его молекулярной организации. Решение этой задачи послужит критерием для определения истинности той или иной модели, а также конкретизирует дальнейшие направления в изучении канала. Однако молекулярная организация и топография функционально-значимых участков канала могут быть достоверно установлены лишь на основании идентификации и выделения, входящих в его состав рецепторов нейротокеинов. С указанных позиций изучение рецептора токсинов-активаторов является весьма значимым и актуальным.

Следует подчеркнуть, что выделение и идентификация рецептора стероидных нейротокеинов все еще представляет собой сложную и трудоемкую задачу, требующую разработки новых методических подходов и приемов. В этом плане весьма перспективным может оказаться использование радиоактивных и фотоаффинных аналогов этих соединений.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Целью данной работы явилось изучение рецепции некоторых стероидных нейротоксинов синашгосомами мозга 1фыс, исследование химической црироды мембранного рецептора этих соединений, а также очистка рецепторных компонентов с помощью биоспецифичной хроматографии,

В настоящее время наиболее важные успехи, достигнутые в изучении рецептора стероидных нейротоксинов, связаны, в основном, с его четкой идентификацией в рамках электрофизиологических тестов, что является необходимой предпосылкой исследования рецептирующей системы на молекулярном уровне. Однако, высокая липофильность большинства стероидных нейротоксинов, а также низкое сродство к препаратам электровозбудимых мембран значительно осложняют использование этих соединений в условиях биохимических экспериментов. Применение в качестве молекулярного инструмента цриродного батра-хотоксина, обладающего наибольшей биологической активностью среди токсинов-активаторов, также не получило широкого распространения в связи с химической лабильностью и малой доступностью токсина.

Недавно опубликовано получение биологически активного 20^ [%] бензоата батрахотоксшинаА/26/. Установлены некоторые характеристики рецепции этого соединения препаратами возбудимых мембран /26,27/. В данной работе использован синтетический радиоактивный аналог батрахотоксина - 20^ рн] бензоат 7,8-дигидробатрахоток-синина а ( рн] ДВТХ, рис. I), полученный в Институте биоорганической химии им. М.М.Шемякина АН СССР /187/. Благодаря высокому уровню как биологической активности, так и удельной радиоактивности, это соединение явилось удобным молекулярным инструментом для изучения рецептора и анализа его химической природы в условиях метода радиолигандного анализа.

Батрахотоксин

7,8-дигидро5а-трахотоксинина А

н ["-ОН™3

НзСО'^^

Вератридин

НО"' Н3С0

ЛС0С6Н5

У лососн3

Аконитин

Рис.1. Структура стероидных алкалоидов.

I. Взаимодействие 20 сИ

бензоата 7,8-дигидробатрахо-токсинина А с синаптосомами мозга крыс

Радиохимическая чистота [%] ДВТХ была не ниже 95-97$, а молярная радиоактивность составляла 27 Ки/ммоль.

Изучение параметров рецепции [%] ДВТХ проводилось методом радиолигандного анализа. В качестве мембранного препарата быж выбраны синаптосомы - замкнутые мембранные образования, выделяемые из гомогената мозга млекопитающих. Синаптосомы в течение продолжительного времени сохраняют функциональные и морфологические свойства нервных окончаний, ив которых они образуются /118, 188/. Следовательно, использование этих мембранных везикул позволило проводить исследования в условиях максимально приближенных к существующим на нервной мембране in vivo.

Как видно из рис.2, при концентрации 8« 10""% специфичное связывание [*%] ДВТХ линейно возрастает с увеличением концентрации

1000 ^ £елка/мл

Рис.2. Зависимость специфичного связывания [%] мами от концентрации белка в пробе.

ДВТХ синаптосо-

более 0,5% от количества добавленной метки. Это свидетельствует о сравнительно низкой липидорастворимости соединения и, следовательно, существенно облегчает использование его в условиях метода радиблигавдного анализа. В случае вератридина /40/, аконитина /189/ и дигидрограйянотокеина II /68/ уровень сорбции токсинов мембранными препаратами настолько высок, что определение доли специфичного связывания практически невозможно.

На рис.3 приведены кривне вытеснеша [%] ДВЕ (З-КГ* М) его немеченым 20 <1 диметилпиррольным аналогом (ДВТ) и аконитином. Эти

ю"6 ю"5 ю"А ю"3 [Токсин], М

Рис.3. Ингибироваше связывания рн] ДВТХ синаптосомами под действием аконитина( -О-) и ДВТ (-Ф-Х

кривые описываются уравнением вида:

® ® шах (

где, В - величина специфичного связывания |®н] ДВТХ при концентрации ДВТ или аконитина равной С, Вшах- максимальный уровень специфичного связывания [Ц ДОТХ, К^ - концентрации ДВТ или аконитина, вызывающие 50$ ингибирование рецепции рЯ] ДВТХ, Оба токсина конкурентно ингибируют связывание [%] ДВТХ с рецептором; концентрации токсинов, при которых наблюдается полумаксимальный эффект (К^) »равны соответственно 2,5-10"% и 1,3-10"%. При концентрации ДВТ - 10"% или аконитина - 10"% общее связывание [*%] ДВТХ уменьшается на 40$ и дальнейшее увеличение концентраций этих реагентов не вызывает дополнительного вытеснения метки. Следовательно уровень специфичного связывания радиоактивного аналога ВТХ составляет приблизительно 40$. Эффекты ДВТ и аконитина характеризуются коэффициентом Хилла пн 1и, таким образом, эти соединения взаимодействуют с одним классом независимых участков связывания. В то же время оба токсина взаимодействуют с одним рецептором, так как в насыщающих концентрациях ДВТ и аконитин ингибируют общее связывание [Зн] ДВТХ до одного уровня. Анализ данных, представленных на рис.3,по Скатчарду показал, что максимальная связывающая емкость синаптосомальных мембран для меченого токсина составляет 2,5 + 0,5 пмоль/мг мембранного белка.

В совокупности представленные выше данные позволяют сделать вывод о высокой биологической активности синтетического аналога ВТХ. Несмотря на то, что 20с/диметилпирролкарбоксилат замещен в молекуле токсина на бензоат, а в кольце В стероидного скелета отсутствует 7,8-двойная связь, рн] ДВТХ характеризуется одинаковой

о ВТХ / 27 / концентрацией рецептора, которая соответствует также числу участков связывания блокатора натриевых каналов - тетродо-токсина /163,174/. Таким образом, идентичная стехиометрия взаимодействия с натриевыми каналами характерна не только для ТТХ, токсинов скорпионов и анемон, ВТХ, но и для синтетического аналога ВТХ. Следовательно, 2Сы[%] бензоат 7,8-дигидробатрахотоксинжна-А может быть использован в качестве маркера рецептора стероидных нейро-токсинов.

Одним из путей повышения уровня рецепции ВТХ являетея модификация натриевых каналов полипептидными нейротоксинами из ядов скорпионов и морских анемон /69,70/. Эти вещества замедляют инактивацию натриевых каналов. При этом энергия связывания токсинов о наружным мембранным рецептором стабилизирует инактивационные ворота в открытом состоянии и препятствует инактивации канала /69,162/. На рис.4 представлена зависимость специфичного связывания [%]

•—•С X "О о

Рис.4. Влияние ТОКСИНа IX Апетопаа аи1са^а, и неспецифичное ( 4 ) связывание [% мозга крыс.

на специфичное (-•-) ДВТХ синаптосомами

В таблице 5 представлены результаты, полученные цри исследовании влияния на взаимодействие [^н] ДВТХ с мембранами синаптосом полипептидных нейротоксинов из яда среднеазиатского скорпиона Bu.th.us eupeus, анемоны Anemonia sulcata а также яда СКОрпиона belurus quinquéstriatus И ТОКСИШ Os-I ИЗ яда СКОрПИОШ Orthochirus scrobicuiosus • Для сравнения приведены также

значения констант диссоциации токсин-рецепторных комплексов, найденные электрофизиологическими методами /190-192/. Нетрудно видеть, что все изученные полипептидные нейротоксины усиливают рецепцию рн] ДВТХ. Так, яд скорпиона Leiurus quin que striatus увеличивает специфичное связывание [%] ДВТХ (8-Ю""8 М) в 8-раз, а нейро-токсин Os-1 из яда скорпиона Orthochirus scrobicuiosus более чем в 12 раз. Одновременно белковые нейротоксины либо незначительно увеличивают (ATX II, Mg), либо уменьшают неспецифичную сорбцию рн] ДВТХ. В то же время сравнительный анализ полученных данных показал, что при насыщающих концентрациях полипептидных токсинов связывание [%] ДВТХ не имеет одного фиксированного значения. Как правило величины Kq рассчитанные из эффектов этих токсинов на связывание [%] ДВТХ, не совпадают с соответствующими значениями констант диссоциации токсин-рецепторных комплексов.Эти результаты свидетельствуют о том, что сродство батрахотоксина к

Таблица 5

Увеличение специфичного связывания [%] ДВТХ синаптосомами мозга крыс под действием полипептидных токсинов

Токсин

Вр.5(М) Кд(М)

Ог-ЬЬосЫгиа всгоЪ1си1оаиа Ье1игиа quinquestriatus

3 ххх 3 ххх

Апетоп1а sulcata,Aa}X II 3,3+0,1 7,5

Buth.ua еиреиэ, Мд 3,4+0,5 4,5+0,5 5х106 »ю-6

% 1,1+0,2 2,5 кг5 5Х10"8

М8 1,4+0,5 2+0,1 ю-7 0,9хКГ9

Апетопаа аи1саЪа, АТХ Ш 1,7+0,5 2 г.бхю"6 »КГ5-'

Buth.ua еиреиэ, % 2,3+0,5 - - ^5х10""7

1,7+0,8 1,8 Ю"7 1,7х10"7

МЮ 1,6+0,6 - - 6x10"^

Апетопаа sulcata, АТХ I 1,3+0,5 - - 7х10"6

х В10-6 - увеличение специфичного связывания ["%] ДВТХ —Я

(8-Ю М) при концентрации белкового токсина 10 М.

Вмах - то же при насыщающих концентрациях белкового токсина

ххх мкг/мл.

каналам, модифицированным разными белковыми нейротоксинами, неодинаково. Принимая во внимание известные модели работы воротного механизма натриевого канала /156,193/, это может означать, что полипептидные токсины ограничивают смещение внутримембранного заряда, сопряженное с процессом инактивации канала, на разное расстояние, т.е. характеризуются разной величиной смещения кривой стационарной инактивации. Рассчеты, например, показывают, что смещение 1фивой стационарной инактивации под действием токсинов скорпиона всего на несколько десятков мквольт вызывает увеличение сродства ВТХ к каналу в десятки раз /156/. Таким образом, сродство

ДВТХ к рецептору зависит не только от положения ворот, но и от связанного в независимом участке канала белкового токсина. С этой точки зрения все изученные полипептидные нейротоксины можно разделить на "эффективные" (Leiurus Orthochirus ATX II) и "слабоэффективные", независимо от их сродства к натриевым каналам.

Возможно также, что отмеченные особенности эффектов белковых токсинов на рецепцию производного ВТХ обусловлены участием в их связывании дискретных, но частично перекрывающихся участков одной и той же функциональной единицы канала. В пользу такого вывода свидетельствуют данные, полученные Рохат и др. /194/. Так, различные токсины скорпионов, характеризующиеся сходным механизмом действия на натриевые каналы, но принадлежащие разным структурным группам и обладающие разной антигенной специфичностью, слабо конкурируют за связывание с рецептором. Токсины ATX I и АТХ Ш также являются "слабыми" конкурентными ингибиторами связывания меченого аналога ATX II, а токсины скорпионов вообще не способны вытеснять меченый ATX II из комплекса с рецептором синаптосомальной мембраны /195/. Более того, фоточувствительные производные токсинов скорпионов и анемон образуют ковалентную связь с разными белками нерв-

ных мембран. Так, фоточувствительный аналог нейротокеина Mjq из яда Buthus eupeus специфично взаимодействует с двумя мембранными белками синаптосом, молекулярный вес которых равен 77 и 51 кД /196/. В то же время ATX I образует ковалентный комплекс с белками молекулярного веса 86 и 53 кД /197/, а токсин из яда Leiurus с синаптоешаиъными белками 240 и 32 кД /198/,

Дальнейший анализ взаимодействия радиоактивного производного ВТХ с синаптосомаш проводили в присутствии одного из наиболее эффективных активаторов рецешщи [%] двтх - токсина ATX II (Ю*5М). г=——— - - -- ^ - ■ — - —- ^

в л <к

10"' 10 [Токсин] М

Рис.5. Ингибирование связывания

синаптосомаш под

На рис.5 приведена 1фивая вытеснения [%] ДОК (S-ET8!) его нерадиоактивным аналогом в присутствии Ю М ATX II. При этом величина Kq 5 для ДВТ снижается с 2,5*I0""6 М до 7-Ю-''' И* без

х Соответственно для аконитина наблюдается снижение Kq 5 с 1,3-10""% до 2-nr5M. V,

изменения максимальной связывающей емкости мембран (плотность рецептора [*%] ДВТХ остается равной 2,5+0,5 пмоль/мг мембранного белка). Эти результаты свидетельствуют об аллостерическом усилении связывания ["%] ДВТХ с рецептором под действием ATX II. Действительно, нейротоксины этих двух групп взаимодействуют с разными участками натриевого канала, которые, однако, находятся в аллостерической взаимосвязи, характеризующейся положительной ко-оперативностью /69,161/. Влияние полипептидных токсинов на эту связь описывается аллостерической константой перехода, определяющей равновесие мезду активированным и инактивированным состояниями канала. Таким образом, ATX II способствует созданию более оптимальных условий для радиолигандного анализа рецептора ВТХ.

Изложенные выше данные убедительно показывают, что белковые нейротоксины существенно повышают уровень рецепции радиоактивного аналога ВТХ. Этот эффект обусловлен увеличением доли неинактиви-рованных натриевых каналов и соответственно увеличением равновесной концентрации их комплекса с [%] ДВТХ.

На рецепцию [®н] ДВТХ оказывают существенное влияние ряд локальных анестетиков и их функциональных аналогов. В отличии от белковых нейротоксинов эта группа биологически активных аминов, нарушая работу воротного механизма, блокирует ионные токи натриевого канала /165/.

Как видно из таблицы 6, локальные анестетики и другие фармакологические агенты независимо от порядка добавления и от присутствия в инкубационной среде полипептидных нейротоксинов конкурентно ингибируют специфичное связывание радиоактивного аналога ВТХ. При этом изменение концентраций бензокаина, стрихнина, триме-каина, тетракаина и К-пропилаймаяина при постоянной концентрации одного из этих веществ приводит к увеличению соответствующей кон-

станты ингибирования (К^) специфичного связывания [% ДВТХ. Эти результаты свидетельствуют о взаимодействии указанных соединений с одним классом участков связывания. В связи с этим логично предположить, что эффект локальных анестетиков обусловлен их мембраноактивными свойствами. В пользу этого предположения свидетельствует анализ ингибирования рецепции [%] ДВТХ под действием некоторых мембраноактивных соединений (таблица 6).

Таблица 6

Иншбирование связывания рй] ДВТХ синаптосомами мозга крыс под действием мембраноактивных соединений .-.--.

Ингибитор

ж -Пропилаймалин 1,5 Ю7

Цианперметрин 3,3 ю-7

Тетракаин 5,7 Ю7

Стрихнин 1,0 ДГ6

Оенантотоксин 2,7 ИГ6

йохимбин 3,1 ЯП6

Луброл РХ 2,5 КГ5

Тримекаин 3,0 иг6

Бензокаин 3,1 ю-4

К,- - кажущаяся константа ингибирования.

Так, подобно локальным анестетикам, неионный детергент Луброл РХ ингибирует специфичное связывание [®н] ДВТХ с Kqj5 равной 2,5*Ю5М. Количественный анализ этого ингибирования показал, что эффект детергента характеризуется коэффициентом Хилла п£-1. Несомненный интерес представляет и влияние на взаимодействие [%] ДВТХ с синаптосомами цитотоксина II из яда кобры Над'а naja

Нарушение мембранной организации под действием этого токсина приводит к подавлению связывания аналога ВТХ (таблица 7).

Таблица 7

Влияние ряда ферментов и химических реагентов на специфичное связывание И] ДВТХ (8• Ю"*8 М) синаптосомами мозга крыс.

Специфичное связывание [%] ДВТХ, %

Фосфолипаза в 73,4 + 6,8

Фосфолипаза С 54,8 + 4,1

Пчелиная фосфолипаза 16,85 + 2,0

Трипсин 63,4' + 7,2

Проназа 43,1 + 4,2

10""% Цитотоксин II 71 + 4,5

I мМ К1-этилмалеимид 72,2 + 3,5

20 мМ Дитиотреитол 67,7 + 5,7

20 мМ Глутатион 61,2 + 4,5

Рецептор ВТХ, таким образом, обладает достаточно высокой чувствительностью к мембраноактивным веществам. Поэтому одним из факторов, играющих важную роль при инактивации рецептора, может быть нарушение гидрофобных взаимодействий в области участка связывания [Зн] ДВТХ. Как видно из результатов, представленных в таблице 7, рецептор ВТХ высоко чувствителен к действию цротеолитических ферментов. Например, обработка мембран трипсином подавляет специфичное связывание меченого токсина на 40%. -Более выраженный ингибирующий эффект оказывает проназа. Ингиби-

рование связывания [%] ДВТХ в условиях цротеолитического гидролиза мембранных белков цроназой составляет более 60$. По-видимому, белковые компоненты играют важную роль в функционировании рецептора [^н] ДВТХ. В пользу этого предположения свидетельствуют также данные, полученные при использовании селективных химических реагентов (таблица 7).

При воздействии на синаптосомальную мембрану I мМ й-этил-малеимида связывание [*%] ДВТХ снижается на 25-30$. Увеличение концентрации реагента до 10 мМ не приводит к усилению эффекта. 20 мГЛ дитиотреитол и восстановленный глутатион более эффективно ингибируют рецепцию токсина, снижая специфичное связывание N ДВТХ на 30-40$. Следовательно, модификация возможных БН- и б-б-групп вызывает частичную инактивацию рецептора [%] ДВТХ. Полученные результаты согласуются с данными электрофизиологических исследований. Так, БН-специфичные реагенты ингибируют эффекты ВТХ на аксоны омара /179/. В то же время, поскольку и цротеоли-тический гидролиз, и воздействие селективных химических реагентов не приводит к полному подавлению специфичного связывания радиоактивного производного ВТХ, можно предположить, что функциональные группы рецептора надежно экранированы мембраной и расположены, по-видимому, в липидной фазе.

Рецепция радиоактивного аналога ВТХ значительно изменяется и под действием фосфолипаз. Обработка синаптосом фосфолипазой в вызывает уменьшение специфичного связывания [%] ДВТХ на 25-30$ и одновременно в пределах 5-10$ снижается неспецифичная сорбция токсина. Расщепление в полярной части фоефолипидных молекул под действием фосфолипазы С оказывает более существенное влияние на рецепцию [%] ДВТХ: специфичное связывание токсина снижается при этом на 45$. Наконец, при воздействии пчелиной фосфолипазы

Ад наблкщается практически полная инактивация рецептора £%] ДВТХ. Синаптосомы, обработанные этим ферментом, сохраняют менее 20% специфичных участков связывания токсина. На основании этих данных можно сделать вывод, что связывание ДВТХ в существенной мере зависит от целостности липидного окружения рецептора. При этом, по-видимому, критическим для рецепции токсина является отщепление ацильных цепей глицерофосфолипидов.

Таким образом, результаты исследования рецепцш синтетического производного батрохотоксина - ДВТХ свидетельствуют о важной роли как белковых, так и лшшдных компонентов в связывании этого токсина с натриевыми каналами синаптосом. Можно предположить, что рецептор [Зн] ДВТХ образован белковой макромолекулой, которая находится в непосредственном контакте с мембранными ли-пидами. Последние, вероятно, способствуют стабилизации рецептора в состоянии с максимальной связывающей активностью. Поэтому нарушение лищд-белкового взаимодействия сопровождается снижением уровня связывания радиоактивного производного ВТХ.

Дальнейшим этапом настоящей работы явилось изучение рецепции природного стероидного алкалоида - аконитина методом принципиально отличным от радиолигандного анализа. Проведение такого исследования представляло как самостоятельный интерес, заключающийся в определении параметров и свойств рецепции аконитина, так и давало возможность сравнить молекулярную природу рецепторов различных токсинов-активаторов.

2. Исследование взаимодействия аконитина с синапто-сомами мозга крыс

Растительный алкалоид аконитин является наиболее доступным и широко применяемым стероидным нейротоксином. Обширная информация о взаимодействии этого токсина с возбудимыми мембранами разной

природы внесла существенный вклад в понимание механизма действия токсинов-активаторов /88,124,129,130-132/. Это полициклическое соединение имеет уникальную структуру (рис.1) во многом отличную от структуры батрахотоксина, но обладает практически одинаковым с ВТХ действием на систему транспорта ионов натрия мембран нервных и мышечных клеток. Последнее обусловлено взаимодействием обоих токсинов с одним общим рецептором в составе натриевого канала /152/. В связи с тем, что описанное выше исследование рецептора этих соединений цроведено с помощью искусственного, никогда ранее не использовавшегося эффектора, представляло интерес сравнить полученные результаты со свойствами рецепции аконитина.

Алкалоид аконитин в концентрациях - г/мл вызывает деполяризацию электровозбудимых мембран за счет селективной активации натриевых каналов /74,91,155/. Однако предпринятые в данной работе попытки прямого исследования рецепции аконитина методом радиолига,ндного анализа столкнулись со значительными трудностями, обусловленными высоким сродством этого соединения к ли-пидной фазе мембраны. Так, меченый в газовом разряде тритием

аконитин в концентрациях до 10 М способен лишь к ненасыщае-мому связыванию синаптосомальными мембранами. При этом общее количество связанного токсина достигает сотен пмоль/мг мембранного белка.В то же время известно, что активация натриевых каналов под действием стероидных нейротоксинов непосредственно влияет на процесс секреции нейромедиаторов /163/. Это обстоятельство открывает возможности изучения взаимодействия аконитина с натриевыми каналами посредством анализа его эффектов на транспорт одного из нейромедиаторов центральной нервной системы - ^-амино-масляной кислоты ( [Зн| ГАМК) через мембрану синаптосом.

Как видно из рис.6, аконитин в диапазоне концентраций

10""® М ингибирует аккумуляцию и увеличивает секрецию

[%] ГАМК.

ю"7 ю6 ю'5 ю"4 ю3 ю2

[Аконитин 1, М

Рис.6. Зависимость аккумуляции (-о-) и секреции (-•-) [%] ГАМК синаптосомами от концентрации аконитина в инкубационной среде.

Концентрации токсина, при которых наблвдается полумаксимальный эффект, составляют: 2• 10"*^ М » для процесса аккумуляции, 7,5-10""^ М - для процесса секреции.

Наблюдаемые эффекты аконитина связаны, по-видимому, с усилением входа ионов натрия внутрь синаптосом и последующей деполяризацией синаптосомальной мембраны. В пользу этого предположения свидетельствует тот факт, что специфичный блокатор натриевых каналов - тетродотоксин ингибирует эффект аконитина (рис.7). Следовательно, изменения транспорта [%] ГАМК под действием аконитина обусловлеш взаимодействием этого токсина с рецептором в составе натриевого канала, а концентрации, вызывающие 50% эффект, характеризуют сродство токсина к рецептору. Полученные результаты согласуются с описанными ранее данными по действию аконитина.

Рис.7. Ингибирование тетродотоксином эффекта аконитина (1СГ® М) на аккумуляцию [%] ГАМК синалтосомами мозга крыс.

Так, этот нейротоксин в интервале концентраций Ю М - 5-10 М стимулирует входящий ток ионов натрия в клетки культуры нейро-бластомы, причем 50% эффект аконитина наблкщается при концентрации 8-Ю"6 М /152/. Таким образом, на основе анажзаэффектов аконитина на транспорт [%] ГАМК можно исследовать взаимодействие этого токсина с рецептором.

Существенная информация о химической природе рецептора аконитина и его локализации в мембране была получена при изучении эффектов ряда ферментов и химических реагентов (таблица 8).

Согласно полученным данным обработка синалтосом реагентами, специфичными к мембранным гликопротеидам, не влияет на рецептор аконитина. Действительно, ни нейраминидаза, ни конканавалин не вызывают изменения параметров аккумуляции [%] ГАМК под действием аконитина. Следовательно, углеводные цепи гликопротеидов не принимают непосредственное участие в рецепции токсина.

С другой стороны, исследование эффекта аконитина в условиях цротеолитического гидролиза показало, что цри этом ингибирующее влияние токсина на аккумуляцию медиатора значительно снижается. Так, если максимальное ингибирование аккумуляции рн] ГАМК на-тивными синаптосомами в присутствии насыщающих концентраций аконитина принять за 100$, то после обработки трипсином и проназой оно снизилось соответственно до 80$ и 55$. При этом, как и в случае нативных синаптосом, эффект аконитина подавляется ТТХ. Таким образом, расщепление мембранных белков ингибщ>ует рецепцию аконитина. В то же время необходимо отметить, что снижение чувствительности транспорта рН ГАМК к действию аконитина после протеолити-ческого гидролиза обусловлено, по-видимому, уменьшением концентрации рецептора аконитина, так как сродство токсина к рецептору практически не изменяется (см.значения К^ в таблице 8).

В отличие от ферментативного гидролиза, вызывающего ингибирование рецепции аконитина без изменения сродства токсина к рецептору, N -этижалеимид, снижая ингибирующий эффект аконитина на аккумуляцию рн] ГАМК, существенно изменяет константу диссоциации токсин-рецепторного комплекса. Так, ингибирование аккумуляции рн] ГАМК под действием аконитина после обработки синаптосом 0,1 мМ и -этилмалеимидом составляет 60$, а концентрация токсина, при которой наблюдается полумаксимальный эффект, увеличивается до 10"%. По-видимому, 3 Н-грушш входят в состав связывающего центра рецептора аконитина. Вместе с тем, рецептор нечувствителен к воздействию Ш^-специфичных реагентов.

Изучение влияния фосфолипаз (таблица 8) показало, что эти ферменты ингибщэуют эффект аконитина на транспорт медиатора за счет снижения рецептирующей емкости мембран. При воздействии

Таблица 8

Влияние аконитина на аккумуляцию [%] ГАМК синаптосомами

агенты

Ингибирование аккумуляции [%]ешС под действием насыщающих концентраций ако-

• 100 2-Ю""5

Нейраминидаза 102,0 + 3,2 2-Ю"5

Конканавалин А 100,3 + 4,8 2-Ю""5

Трипсин 81,8 + 7,2 2-ДГ5

Проназа 54,3 + 4,3 Ю"5

Фосфолипаза в 87,1 + 4,3 2-Ю-5

Фосфолипаза С 65,0 + 5,6 2.10-5

Проназа + фосфолипаза С 32,8 + 5,6 2-Ю"4

0,1 мМ Ы-Этилмалеимид 59,4 + 1,2 юг4

0,025 М Метилацетимидат 98,9 + 3,2 2-Ю"5

Ингибирование аккумуляции рн] ГАЖ под действием насыщающих концентраций аконитина нативными синаптосомами принято за 100$.

фосфолипазы б максимальное ингибирование аккумуляции £%] ГАЖ под действием аконитина уменьшается на 10-15$. Более выраженный эффект оказывает фосфолипаза С: аконитин подавляет цри этом аккумуляцию медиатора на 60-70$. В обоих случаях, однако, величины Ко 5 совпадают с соответствующими значениями, полученными на нативных синаптосомах. Таким образом, расщепление фосфолипидных молекул существенно влияет на связывание аконитина с рецептором. Использование фосфолипаз А оказалось невозможным в силу их лизи-рующего действия на мембраны. Наконец, наиболее эффективное инги-

бирование рецепции аконитина наблюдалось в условиях жесткой ферментативной обработки, сочетающей цротеолитический гидролиз с последующим расщеплением фосфолипидов фосфолипазой С: для аконитина снижается при этом до 2,0'10""%. Следовательно, как и в случае батрахотоксина, целостность липидной фазы является необходимым условием эффективного связывания аконитина с рецептором.

В общем, сопоставление результатов анализа прямого связывания синтетического радиоактивного производного ВТХ с данными рецепции цриродного стероидного нейротоксина - аконитина, полученными на основе анализа эффектов этого токсина на транспорт [%] ГАЖ, позволяет отметить сходство характеристик рецептора этих соединений. Высокая чувствительность рецептора аконитина к воздействию N -этилмалеимида и цротеолитических ферментов позволяет предположить, что в состав рецептора входят белковые компоненты. В то же время тот факт, что расщепление фосфолипидов под действием фосфолипаз вызывает снижение рецептирующей емкости синаптосомальных мембран для аконитина, прямо указывает на важную роль мембранных липидов в формировании участка связывания токсина. По-видимому, последний расположен внутри мембраны и экспонирован в липидный матрикс. Этот вывод вполне согласуется с известными в литературе данными. Так, анионный центр селективного фильтра, кислотные свойства которого изменяются под действием аконитина, расположен почти в середине натриевого канала (на 2/5 его глубины снаружи) /140/. Взаимодействие с гидрофобным участком натриевого канала становится возможным благодаря высокой липидорастворимости аконитина. При этом с повышением концентрации токсина происходит постепенное насыщение липидной фазы, необходимое для взаимодействия с рецептором. Об этом свидетельствует, например, широкий диапазон действующих концентраций аконитина, а также необычайно высокая

величина насыщающей концентрации. Действительно, такой маркер натриевых каналов, как TTI, имеющий низкое сродство к липидам, характеризуется низкой плотностью участков связывания -2-3 пмоль/мг мембранного белка /163,174/. Токсины скорпионов и

анемон также проявляют свое действие в концентрациях до 10 'М /163/. В то же время в опытах по связыванию меченого тритием вератридина /40/, являющегося функциональным аналогом аконитина, не удалось обнаружить насыщаемого уровня связывания при повышении концентрации токсина до 10""%.

3. Биоспецифичная хроматография рецептора стероидных нейротоксинов

Представленные выше результаты изучения связывания стероидных нейротоксинов синаптосомальными мембранами позволили в значительной мере охарактеризовать рецептор этих соединений, а также оценить в общих чертах его химическую природу. Следовательно, дальнейший этап исследования ставил задачу очистки и выделения этой мембранной структуры.

Известно, что начальным этапом любого подхода к выделению мембранного рецептора является солюбилизация мембранного препарата. Однако, согласно полученным данным, воздействие детергентов, а также других химических реагентов, нарушающих лшшд-белковое взаимодействие, сопровождается существенным ингибирова-нием рецепции стероидных нейротоксинов возбудимыми мембранами. Так, один из наиболее "мягких" детергентов - Луброл РХ подавляет связывание [*%] ДВТХ с К± равной 2,5-Ю"5 (таблица 6). В то же время для солюбилизации хотя бы 50% мембранных белков синапто-сом концентрация Луброла РХ должна составлять не менее I%, В таких условиях, естественно, нельзя ожидать детектируемого уров-

ня специфичного связывания солюбилизированным рецептором меченого токсина. Поэтому традиционные подходы, основанные на солюбили-зации и последующем фракционировании мембранных компонентов, связывающих стероидные нейротоксины, не могли обеспечить успешное выделение рецептора этих соединений.

С другой стороны, взаимодействие с электровозбудимыми мембранами токсинов-блокаторов (тетродотоксина и сакситоксина) гораздо менее чувствительно к влиянию солюбилизирующих агентов. Например, обработка синаптосомальных мембран 1% Лубролом РХ приводит к экстракции приблизительно 60$ рецепторов ТТХ, которые после частичной очистки могут быть реконструированы в липидные везикулы, сохранив 37-43$ исходной ТТХ-связывающей активности.

Поскольку наружное устье натриевого канала - рецептор токси-нов-блокаторов, а также селективный фильтр, чувствительный к воздействию стероидных нейротоксинов, входят в состав одной и той же структуры канала - ионной поры, можно предположить, что участки связывания токсинов-блокаторов и токсинов-активаторов принадлежат одной каналобразующей макромолекуле, которая не диссоциирует в неионных детергентах. При этом задача очистки рецептора стероидных нейротоксинов может быть решена методом биоспецифичной хроматографии реконструированного в липидные везикулы ТТХ-связы-вающего компонента.

Предлагаемый в данной работе способ очистки рецептора токсинов-активаторов включает следующие стадии: I) очистка рецептора ТТХ; 2) реконструкция его в липидные везикулы; 3) биоспецифичная хроматография реконструированного рецептора ТТХ на сорбенте, содержащем ковалентно связанный стероидный нейротоксин.

Биоспецифичный сорбент был получен иммобилизацией вератриди-на по гидроксильным группам на эпоксиактивированной Сефарозе 6В.

Так, инкубация эпоксиактивированной Сефарозы 6В с токсином при рН 9,5-10 позволила получить вератридин-Сефарозу, содержащую 5 мкмоль вератридина/мл геля. Поскольку из шести ОН-групп вера-тридина алкилирование трех не приводит к потере биологической активности, можно было ожидать, что такой сорбент будет специфично взаимодействовать с соответствующим рецептором.

Очистку и реконструкцию рецептора ТТХ цроводили по схеме, представленной на рис.8.

Синаптосомальная мембрана является достаточно удобным источником выделения рецептора ТТХ. Концентрация рецептора в такой мембране находится приблизительно на том же уровне, что и в плазматических мембранах электрических органов рыб или сарколеммы мышц - 2-3 пмоль/мг белка /163,174/, но в отличие от этих препаратов выделяется более просто. Так, получение 300 мг белка си-наптосомальных мембран в нашей практике занимает 4-5 часов.

Рис.8. Схема очистки и реконструкции рецептора ТТХ.

лизительно за 2 часа. Снижение концентрации Луброла РХ до 0,1%» а также введение экзогенного липида в молярном соотношении к детергенту равном 1:5 позволяет существенно повысить стабильность рецептора (Тд-Д) увеличивается при этом до 24 часов).

Тот факт, что рецептор ТТХ в возбудимых мембранах млекопитающих имеет гликопротеидную природу /200/, позволяет осуществить его очистку биоспецифичной хроматографией на иммобилизованных лектинах.

Рецепторная фракция 1,1 сорбированная на ДЕАЕ-Сефарозе, была элюирована буфером высокой ионной силы и пропущена через колонку с иммобилизованным на Сефарозе лектином из зародышей пшеницы ( ИОА-Сефароза). Затем фракция гликопротеидов элюиро-валась раствором н'-ацетилглюкозамина. При этом достигалась 45-кратная очистка рецепторов ТТХ.

В ряде работ с использованием градиентного центрифугирования или гель-фильтрации было показано, что в неденатурирующих

условиях рецептор ТТХ характеризуется стоксовым радиусом около о

80 А /201, 202/. Таким образом, концентрирование ТТХ-связывающей фракции может быть эффективно осуществлено ультрафильтрацией через мембрану ХМ 300. Использование такой стадии позволило не только сконцентрировать фракцию р2 5 10-15 раз, но и провести дополнительное обогащение рецептора приблизительно в 2-3 раза.

Согласно данным, полученным в нашей лаборатории /207/, удаление детергента при помощи хроматографии на Амберлите ХАД-4 позволяет одновременно существенно повысить стабильность рецептора ТТХ. Для удаления Луброла РХ фракция подвергалась 2-кратной хроматографии на Амберлите ХАД-4. При этом, по-видимому, за счет необратимой сорбции мембранных белков наблюдалась потеря около 20% ТТХ-связывающей активности.

Реконструкцию очищенного рецептора проводили методом гель-фильтрации, используя 2% суспензию лецитина в 2% холате натрия. Введение рецептора в такую суспензию сопровождается инактивацией 95$ ТТХ-связывающей активности, которая, однако, восстанавливалась на 37-45$ после отделения холата натрия на Сефадексе (3-50г.

Как видно из рис.9, рецептор ТТХ, включенный в лецитиновые везикулы, обладает сродством к вератридин-Сефарозе. Сорбированный рецептор можно элюировать раствором аконитина или вератрщщна

Рис.9. Хроматография реконструированного в лецитиновые везикулы частично очищенного рецептора ТТХ на вератридин-Сефаро-

(7,35 мМ). В то же время отмывкабгоспецифичного сорбента буферным раствором высокой ионной силы (0,2 М) не приводит к элщии рецептора. За одну стадию хроматографии осуществляется очистка рецептора ТТХ в 10-15 раз. Сорбент, полученный инактивацией эпок-сиактивированной Сефарозы 6В этаноламином, сродством к рецептору ТТХ не обладал. Таким образом, иммобилизованный на вератридин-Сефарозе рецептор ТТХ связан с сорбентом специфично.

Полученные экспериментальные данные свидетельствуют о том, что способность вератридин-Сефарозы специфично связывать рецептор ТТХ обусловлена взаимодействием иммобилизованного лиганда (вератридина) с рецептором стероидных нейротоксинов. Отсада следует, что оба рецептора входят в состав одной макромолекулы, которая не диссоциирует в присутствии неионных детергентов.

Тот факт, что наряду с вератридином и другой стероидный нейротоксин - аконитин эффективно вытесняет связанный биоспецифичным сорбентом рецептор, подтверждает полученный ранее вывод о прямой конкуренции стероидных токсинов за один участок связывания, входящий в состав натриевого канала.

Поскольку стероидные токсины равноэффективны цри взаимодействии как с внешней, так и с аксоплазматической поверхностями нервных мембран, связывание вератридина с натриевым каналом осуществляется из липидной фазы. Возможная глубина погружения иммобилизованного токсина в белковую макромолекулу канала ограничена длиной "цространственной ножки", связывающей гранулу Сефарозы с молекулой вератридина. Она образована цепочкой из 13 атомов, и, таким образом, участок связывания вератридина расположен вблизи границы с липидной фазой. Отсвда, например, становится понятна

высокая чувствительность связывания стероидных нейротоксинов к состоянию лищцной фазы. Вполне вероятно, что одной из причин инактивации рецептора является нарушение специфичных взаимодействий рецепторного белка с ближайшим липидным окружением.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

1. Получение синаптосом. Выделение и очистку синаптосом проводили методом, описанным в /163/. После декапитации взрослых крыс (150-200 гр.) мозг немедленно извлекали и гомогенизировали в 10-кратном объеме 0,32 M сахарозы (х.ч., Союзреактив), 5 мМ трис-HCI (Sigma США), pH 7,4 в стеклянном гомогенизаторе (В. Braun Melsungen ФРГ), снабженном тефлоновым пестиком. Скорость вращения 700 об/мин, 10 полных погружений пестика. Гомогенат центрифугировали 5 минут при 1200 g в роторе J-20 на центрифуге

2. Измерение аккумуляции у-аминомасляной кислоты. Аккумуляцию ГАМК измеряли методом миллипоровой фильтрации на стеклофильтрах GF/F ( Whatman Англия). В условиях опыта фильтры этого типа пропускали не более 10$ общего мембранного белка. Для снижения сорбции [%] ГАМК фильтры предварительно инкубировали в 1% растворе бычьего сывороточного альбумина ( sigma сша)

промежутки времени аликвоты суспензии (70-100 мкг мембранного белка) переносили на фильтр для отделения свободной и связанной с синаптосомами рн] ГАМК.

4. Приготовление гидрохлорида аконитина. 20-30 мг основания аконитина (Институт химии растительных веществ АН УзССР) растворяли в 1,5-2 мл метанола. К раствору добавляли метанол подкисленный НС1 (3-4 капли 5,7 н. НС1 на 20 мл метанола). Снижение

рН раствора до 3-2 свидетельствовало об окончании реакции. Избыток НС1 удаляли при повторном упаривании метанольного раствора на роторном испарителе до нейтрального рН. Остаток растворяли в деионизованной воде и лиофильно высушивали на приборе 10-010 ( , США).

5. Радиолигандный анализ репешии радиоактивного аналога

батрахотокоина - 20 d. бензоата 7.8-дигидробатрахотоксинина А.

Исследование рецепции [Зн] ДВТХ проводили при концентрации ток-—ft

сина 8-10 М в инкубационном буфере, содержащем I мкМ тетродо-токсина ( Calbiochem США), 130 мМ холинхлорид ( Serva ФРГ), 50 мМ ХЕПЕС х) -трис ( Pierce США), pH 7,4, 5,5 Ш глюкозу, 0,8 мМ MSCI2, 5,4 мМ KCl (все реактивы марки о.с.ч., Союзреактив) и 0,1% бычий сывороточный альбумин. Для анализа конкуренции между радиоактивным производным ВТХ и его немеченым 20¿ диметил-пиррольным аналогом /187/, а также аконитином 0,5 мл суспензии синаптосом в инкубационном буфере (концентрация общего белка I мг/мл) инкубировали 30 минут при перемешивании на микровстряхи-вателе с возрастающими концентрациями немеченых токсинов. После

ХЕПЕС - N-2-оксиэтилпиперазин-Ы -2-этансульфоновая кислота.

20о( [%] бензоат 7,8-дигидробатрахотоксинина А был получен в Институте биоорганической химии им. М.М.Шемякина АН СССР /187/. Радиохимическая чистота меченого црепарата была не ниже 95-97%, а молярная радиоактивность составляла 27 Ки/ммоль.

Для анализа влияния на рецепцию [^н] ДВТХ локальных анестетиков и их функциональных аналогов, а также мембраноактивных соединений, суспензию синаптосом в инкубационном буфере, содержащем 8-1СГ^ М рн] ДВТХ инкубировали: I) с возрастающими концентрациями бензокаина, тримекаина, тетракаина, н-пропилайма-лина, иохимбина, оенантотоксина, (получены в дар от профессора Б.И.Ходорова, Институт хирургии им. А.В.Вишневского АН СССР), стрихнина ( Serva ФРГ), цианперметрина (ИБХ им. М.М.Шемякина АН СССР), Луброла РХ (Sigma США), а также цитотоксина II из яда кобры jjaja ^а oxiana №х им. М.М.Шемякина АН СССР); 2) с возрастающими концентрациями бензокаина, стрихнина, тримекаина, тетракаина, и -пропилаймалина в присутствии постоянной концентрации одного из этих веществ. Для изучения влияния белковых нейротоксинов на эффекты локальных анестетиков последние добавлялись к суспензии синаптосом, содержащей помимо [%] ДВТХ, также ATX II (КГ5М).

6. Обработка синаптосом ферментами и химическими реагентами.

Трипсин (Worthington США) и проназу (Calbiochem США) добавляли к суспензии синаптосом в фермент-субстратном соотношении 5:100. Фосфолипазу С, выделенную из Bacillus cereus ( Boeh-ringer Mannhem ФРГ, 1600 ед/мг) »добавляли в соотноше-

нии 10 ед/мг синаптосомального белка, фосфолипазу í> ( Sigma США, 17,1 ед/мг) - 30 ед/мг синаптосомального белка,пчелиную фосфолипазу А2 (ИБХ им. М.М.Шемякина АН СССР) в фермент-субстратном соотношении 1:10. При обработке синаптосом химическими реагентами, концентрации последних в инкубационной среде составляли: N -этилмалеимид (serva ФРГ) - 1-10 мМ, метилацетимидат (Pierce, США) - 25 мМ, дитиотреитол (Sigma США) - 20 мМ, восстановлен-

8. Хроматография солюбилизированных синаптосомальных мембран на wga -СеФарозе. Солюбилизированные синаптосоматаше мембраны разбавляли в соотношении 1:10 раствором 0,4 М холинхлорида, содержащим 20 мМ трис-HCI рН 7,4, 0,1$ Луброл РХ и 0,0265$ лецитин соевых бобов ( Sigma США). В дальнейшем для этого буфера принято сокращение - 0,4 М Холин-ТРХЛ. Смесь наносили на колонку

(1,5 х 9,0 см) с wga -Сефарозой 6 MB, уравновешенной в 0,4 М Холин-ТРХЛ, цри скорости 45 мл/час. Объем отбираемых фракций составлял 15 мл. Контроль за выходом белка осуществляли на проточном спектрофотометре ( üvicord и, ьКВ, Швеция) при 280 нм. Колонку промывали 0,4 М Холин-ТРХЛ до снижения элюата к фоновому значению. Фракцию гликопротеидов элшровали 20 мл 50 мМ раствора

Ы -ацетилглюкозамина ( Sigma США) в 0,4 М Холин-ТРХЛ.

10. Реконструкция солюбилизшзованного рецептора ТТХ в леци-тиновые везикулы. Фракцию, содержащую частично очищенный рецептор ТТХ, концентрировали до 2 мл ультрафильтрацией через мембрану ХМ 300 ( Amicone t сж) при давлении К2 0,7-1,0 атмосфера. Для удаления Луброла РХ эту фракцию дважды пропускали через колонку РД-2, содержащую Амберлит ХАД-4 ( Serva ФРГ). Смолу предварительно промывали изоцропанолом, затем водой и уравновешивали в 20 Ш трис-HCI, рН 7,4. В результате такой хроматогра-

фии копцентрацш Луброла РХ в суспензии уменьшалась приблизительно в 50 раз /207 /. Реконструкцию рецептора ТТХ проводили методом гель-фильтрации, используя суспензию лецитина в холате натрия. К 2 мл раствора, содержащего рецептор ТТХ, добавляли суспензию 2% лецитина в 2% холате натрия ( Sigma США). Смесь перемешивали в течение 20 минут и наносили на колонку (1,5 х 16 см) с Сефадексом G-50f (Pharmacia Швеция), уравновешенным в 0,1 М холинхло-риде, 20 мМ трис-HCI, рН 7,4. Хроматографию проводили цри скорости 7 мл/час.

II. Препаративная очистка рецептора ТТХ. Солюбилизированные мембраны, полученные согласно описанной выше методике, разбавляли в соотношении 1:1 0,4 М Холин-ТРХЛ. К смеси добавляли 10 мл ДЕАЕ-Сефарозы CL-6B ( Pharmacia Швеция), уравновешенной в 0,2 М Холин-ТРХЯ и перемешивали с помощью подвесной мешалки в течение I часа. Суспензию переносили в колонку (2,5 х 20 см) и промывали приблизительно 100 мл 0,2 М Холин-ТРХЯ до снижения поглощения элюата к базовой линии (2 часа). Рецептор ТТХ элюировали при скорости 45 мл/час 90 мл 0,5 М Холин-ТРХЛ и пропускали через колонку с wga -Сефарозой (1,5 х 9,0 см). Колонку промывали 10 мл того же буфера и рецептор ТТХ элюировали раствором Ж-ацетилглюкозами-на, как описано выше. Весь этап Очистки и концентрирования рецептора занимал 7 часов.

Смесь лецитина с Лубролом РХ в молярном отношении 1:5 приготовляли растворением лецитина в 20$ растворе детергента при перемешивании в течение 10-12 часов в сосуде с магнитной мешалкой.

20$ Раствор Луброла РХ деионизовали на смоле Ag 501 х 8 в (Bio-Rad США). Деионизованный детергент хранили в замороженном виде и перед использованием подвергали повторной деионизации.

Проводимость 20$ Луброла РХ составляла обычно 3-8 мкСм. Очищенный даионизацией раствор Луброла РХ содержал около 20$ исходного количества примесей, окисляющих сулъфгидрильные группы /205/. Дальнейшая очистка Луброла РХ на силикагеле приводила к практически полному удалению этих примесей /205/.

13. Хроматография рецептора ТТХ на веттршшн-СеФатюзе. Фракцию реконструированного в лецитиновые везикулы частично очищенного рецептора ТТХ наносили на колонку (I х 5,7 см) с ве-ратридин-Сефарозой, уравновешенной в 0,1 М холинхлориде, 20 мМ трис-НС1, рН 7,4, цри скорости 7 мл/час. Колонку промывали 0,1 М холинхлоридом, 20 мМ трис-НС1, рН 7,4. Сорбированный рецептор элюировали раствором аконитина или вератридина (7,35 мМ) в 0,1 М холинхлориде, 20 мМ трис-НС1, рН 7,4.

Оцределение концентрации белка цроводили по методу Лоури /206/, используя в качестве стандарта бычий сывороточный альбумин.

ВЫВОДЫ

1. Установлены параметры рецепции 20 Л [*%] бензоата 7,8-дигидробатрахотоксинина А синаптосомальными мембранами мозга крыс. Исследовано влияние на связывание этого токсина ряда полипептидных нейротоксинов, местных анестетиков и других мембранО-активных веществ.

2. Изучено взаимодействие растительного алкалоида аконитина с синапт ос омами мозга крыс. С помощью методов химической модификации, а также энзиматического гидролиза мембранных препаратов исследована природа рецептора стероидных нейротоксинов. Найдено, что связывание стероидных токсинов в существенной мере зависит от состояния липидного окружения.

3. Методом биоспецифичной хроматографии осуществлена частичная очистка реконструированного рецептора стероидных нейротоксинов. Показано, что этот рецептор и рецептор ТТХ не диссоциируют

в присутствии неионных детергентов и, по-видимому, входят в состав одной макромолекулы.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата химических наук, Просолова, Татьяна Кирилловна, Москва

1. Бобков Ю. Г. Роль узловатых ганглиев блуждающего нерва в ре-зорбтивном действии аконитина и вератрина: Автореф. канд.дисс., 1., 1964.

2. Закусов В.В. Рефлексы на дыхание при действии ядов на различные сосудистые области. - Фармакология и токсикология, 1939 № 2, с. 55-63.

3. Bachelor F.W., Brown R.F.C., Buchi G. The constitution of ring

4. A in aconitine.- Tetrahedron Lett., 1960, N 10, p.1-9.

5. Wiesner K., Gotz M., Simmons D.L., Fowler L.R., Bachelor F.W.,

6. Brown R.F.C., Buchi G. The structure of aconitine.- Tetrahedron Lett., 1959, N 2, p. 15-24.

7. Codding P.W. Structure and conformation of aconitine.- Acta

8. Cryst., 1982, B38, p.2522-2525.

9. Aiyar V.H., Codding P.W., Kerr K.A., Benn M.H., Jones A.J. Thestructure of delphinofoline, a diterpenoid alkaloid from Aconitum delphini folium.- Tetrahedron Lett., 1981, 22, N 6, p.483-484.

10. Туляганов Н., Джазангиров Ф.Н., Садритдщнов Ф.С., Хавдамов И. К фармакологии некоторых аконитовых алкалоидов. - В сб. Фармакология растительных веществ. Ташкент: ФАН, 1976, с. 76-91.

11. Dong Y.L., Chen W.Z., Ding G.S. Comparison of arrythmic effectof aconitine and its 5 analogs.-Chung-kuo Yao Li. Hsuch Pao, 1981, N 3, p.173-176.

12. Sato H., Yamada C., Konno C., Ohizumi Y., Endo K. and Hikino

13. H. Pharmacological actions of aconitine alkaloids.- Tohoku J. exp. Med., 1979, 128, H 2, p.175-187.

14. Hikino H., Itо Т., Yamada С., Sato H., Konno C., Ohizumi Y.

15. Marki P., Witkop В. The venom of the Colombian arrow poisonfrog Phyllobates bicolor.- Experientia, 1963, 19, U 7, p.329-338.

16. Daly J.W., Myers C.W., Wamick J.E., Albuquerque E.X. Levelsof batrachotoxin and lack of sensitivity to its action in poisondart frogs (Phyllobates).- Science, 1980, 208, H 4450, p.1383-1385.

17. Daly J.W., Witkop В., Bommer P., Biemann K. Batrachotoxin.

18. The active principle of the Colombian arrow poison frog. Phyllobates bicolor.- J.Am;Ohem*Soc.,1965,§7, H 1,p.124-126«

19. Revista de la facultad de farmacia de la Universidad de de Los Andes, 1970, И 7, p.51-100.

20. Albuguerque E.X., Warnick J.E. The pharmacology of batrachotoxin. IV. Interaction with tetrodotoxin on innervated and chronically denervated rat skeletal muscle.- J. Pharm. Exp. Ther., 1972, 180, И 3, p.683-697.

21. Karle I.L., Karle J, The structural formula and crystal structure of the O-p-bromobenzoate derivative of batrachotoxinin A, C^-jH^q NQgBr, a frog venom and steroidal alkaloid.-Acta cryst., 1969, B25, pt 3. p.428-434.

22. Albuguergue E.X., Daly J.W., Witkop B. Batrachotoxin: chemistry and pharmacology.- Science, 1971, Ц2, II 3987, p.995--1002.

23. Warnick J.-E,, Albuquerque E.X., Onur R., Jansson S.-E.,

24. Daly J., Tokuyama T., Witkop B. The pharmacology of batrachotoxin. VII. Structure-activity relationships and theeffects of pH.- J. Pharmacol. Exp. Ther., 1975, 193, N 1, p.232-245«

25. Brown G.B., Tieszen S.C., Daly J.W., Warnick J.E., Albuquerque E.X. Batrachotoxiiiin - A 20 - ot - benzoate: a new radioactive ligand for voltage sensitive sodium channels.- Cell mol. Neurobiol., 1981, N 1, p.19-40.

26. Catteral W.A., Morrow G.S., Daly J.W., Brown G.B. Binding of

27. BTX-B tp a receptor site associated with sodium channels in synaptic nerve ending particles.- J. Biol. Chem., 1981,256, p.8922-8927.

28. Brown G.B., Daly J.W. Interaction of "batrachotoxinin-A benzoate with voltage-sensitive sodium channels: the effect of pH.- Cell. Mol. Neurobiol., 1981, Jj. N 4, p.361-371.

29. Imhof R., Gossinger E., Graf W., Berner-Fenz L., Berner H.,

30. Schaufelberger R., Wehrli H. Steroide und Sexualhormone. Die Partialsynthese von Batrachotoxinin A.- Helv. Chim. Acta, 1973,56, N 5-6, p.139-162.

31. Kupchan S.M. Hypotensive veratrum ester alkaloids.- J. Pharm.

32. Sci., 1961, 50, N 4, p.273-287.

33. Benforado J.M. The veratrum alkaloids.- In: Physiologicalpharmacology. Eds. W.S.Root, F.G.Hofmann. New York: Acad. Press, 1967, vol.IV, part D, p.331-398.

34. Kupchan S.M., By A.W. Steroid alkaloids: the veratrum group.1.: Alkaloids. Ed, R.H.P.Manske. New York: Acad. Press, 1968, vol.10, p.193-283.

35. HJPAC-IUB revisedt tentative rules for nomenclature of steroids.» J. Org. Chem. 1969, vol.34, p.1517-1518.

36. Шакиров P., Юнусов C.IQi Алкалоиды veratrum, Pet ilium u

37. Koroikowia.- Химия природных соединений АН СССР - АН УзССР, 1980, & I, 0.1-22.

38. Godding P.W. Structural studies of sodium channel neurotoxins. 2. Crystal structure and absolute configuration of veratridine perchlorate.- J.Am.Chem.Soc., 105» И 10, p.3172-3176.

39. Honerj'ager P. Electrophysiological effects of various ceveratrum alkaloids on single axons.- Uaunyn-Schraiebergfs Arch. Pharmacol., 1973, 280, К 4-, p.391-416.

40. Ohta M., Narahashi T., Keeler R.P. Effects of veratrum alkaloids on membrane potential and conductance of squid and crayfish giant axons.- J. Pharm. Exp. Ther., 1973, 184, И 1, p.143-154.

41. Gola M., Chagneux H., Argemi J. An asymmetrical kinetic modelfor veratridine interactions with sodium channels in mollus-can neurons.- Bull. Math. Biol., 1982, 44a. N 2» Р.231-258.

42. Kupchan, S.M., Weaver, L.C., Hensler, R.H., and Ayres, C.I.

43. Veratrum alkaloids XLV. Structure-activity relationships in a series of protoverine derivatives.- J. Pharmaceutical sciences, 1961, ¿0, H 1, p.52-55.

44. Balerna M., Posset M., Chicheportiche R., Romey G., Lazduaski

45. M. Constitution and properties of axonal membranes of crustacean nerves.- Biochemistry, 1975, 14;, N 25, p. 5500-5511

46. Tripathi H.L., Yost G.A. Synthesis of tritium labeled veratridine with high specific activity.- J. Labelled Сотр. Radiopharm. 1978, 15, p.619-624.

47. Jawad F.H., Kinghorn A.D., Doorenbos N.J., Billets S. Characterization and mass spectral analysis of some grayanotoxin derivatives.- Biomed. Mass Spectrometry, 1977, 4, H 6, p.331-336.

48. Itinghorn A.D., Jawad F.H., Doorenbos N.J. Thin-layer chromatographic and spectroscopic characterization of some diter-penes of the grayanotoxin type.- J. Chromatography, 1978, 147, p.299-308.

49. Takemoto Т., Nishimoto Y., Meguri H. and Katayama K. On theidentity of rhodotoxin, andromedotoxin, and grayanotoxin X. J. Pharm. Soc. Japan., 1975, 15, p.1441-1442.

50. Wood H.B., Jr., Stromberg V.L., Keresztesy J.C. and Horning

51. E.C. Andromedotoxin. A potent hypotensive agent from Rhododendron maximum.- J. Amer. Chem. Soc., 1954» 76, p. 5689-5692.

52. Carey P.M., Zev/is J.J., MacGregor J.L. and Martin-Smith M.

53. Pharmacological and chemical observations on some toxic nectars.- J. Pharm. Pharmacol., 1959, JJ., p.269T-274T.

54. Yasue M., Sakakibara J., Kato T. Stereostructure of lyoniol-A (lyoniatoxin) and grayanötoxin-II. Chem. Pharm. Bull. 1970, 18, N 12, p.2586-2588.

55. Kakisawa H., Kurcmo M., Tarahashi S., Hirata Y. Structureof grayanotoxin-I and -III.- Tetrahedron Lett., 1961, N 2, p.59-67.

56. Kakisawa H., Koafima T., Yanai M. and Hakanishi K. Stereochemistry of grayanotoxins.- Tetrohedron, 1965, И 21, p.3091-3104.

57. Hikino H., Shoji N., Koriyama S., Ohta T., Hikinô Y., Takemoto T. Stereostructure of rhodojaponin IV, toxin of Rhododendron japonicum, and of grayanotoxin V, VI and VII, toxins of Leucothoe grayana.- Chem. Pharm. Bull., 1970, J8, И 11, p.2357-2359.

58. Narayanan P., Rohrl M., Zechmeister К., Hoppe W. Crystaland molecular structure of grayanotoxin-I» - Tetrahedron Lett., 1970, N 45, p.3943-3944.53. von Kürten S., Pachaly P., Zymalkowski P., Snatzke G. Heue

59. Grayanotoxine in Blattextrakten von Rhododendron ponticum. Ein Beitrag zur Stereochemie der Grayanotoxine.- Liehigs Ann. Chem., 1970, 741, N 11, p.142-152.

60. Kametani T., Tsubuki M., Hemoto H., Fukumoto K. Syntheticapproach to the grayanotoxins and asebotoxins: a new construction of A,B, and С ring system of grayanotin.-Chem. Pharm. Bull., 1979, 27, N 1, p.152-157.

61. Kametani T., Matsumoto H., Honda T., Fukumoto K. Syntheticapproach to grayanotoxins: a new method for the construction of the A-homograyanotoxane ring system.- Tetrahedron Lett., 1981, 22, N 25, p.2379-2380.

62. Gasa S., Hamanaka N., Matsunaga S., Okuno T., Takeda N.,

63. Matsumoto T. Relay total synthesis of grayanotoxin II.-Tetrahedron Lett., 1976, N 7, p.553-556.

64. Terai T., Katai M., Hamanaka N., Matsumoto T., Meguri H.

65. Conversion of grayanotoxin III to grayanotoxin V, rhodo-japonin III and rhodojaponin IV.- Chem. Pharm. Bull., 1978, 26, N 5» p. 1615-1619.

66. Masutani T., Ivvasa J., Ichimoto I., Ueda H. Preparation ofnew derivatives from 0dehydrograyanotoxin -II.-Agric. Biol. Chem., 1981, 45, K 11, p.2483-2489.

67. Hikino H., Ohta T., Ogura M., Ohizumi Y., IConno C., Takemoto'

68. T. Structure-activity relationship of ericaceous toxins on acute toxicity in mice.- Toxicol. Appl. Pharmacol., 1967, 35, N 2, p.303-310.

69. Hotta Y., Takeya K., Kobayashi S., Harada N., Sakakibara J.,

70. Shirai N. Relationship between structure, positive inotropic potency and lethal dose of grayanotoxins in guinea pig.-Arch. Toxicol., 1980, 44, N 4, p.259-267.

71. Scott P.M., Coldwell B.B., Wiberg G.S. Grayanotoxins. Occurence and analysis in honey and a comparison to toxicities in mice.- Pood Cosmet. Toxicol., 1971,9, H 2, p.179-184.

72. Masutani T., Seyama I., Narahashi T. and Iwasa J. Structure-activity relationship for grayanotoxin derivatives in frog skeletal muscle.- J. Pharmacol. Exp. Ther., 217, N 3, 1981, p.812-819.

73. Fukuda H., Kudo Y., Ono H., Yasue M,, Sakakibara J. and

74. Kato T.• Structure-activity relationship of lyoniol-A and related compounds in association with the excitatory effect on muscle spindle afferents.- Chem. Pharm. Bull., 1974, 22j p. 884-888.

75. Seyama L., Narahashi T. Increase in sodium permeability ofsquid axon membranes by ^-dihydrograyanotoxin II.- J. Pharm. Exp.Ther., 1973, 184, N 2, p.299-307.

76. Narahashi T. Modulation of nerve membrane sodium channelsby neurotoxins.- Adv. Cytopharmacol., 1979, 3, p.293-303.

77. Kinghorn A.D., Jawad F.H., Doorenbos N.J. Structure-activity relationship of gravanotoxin derivatives using a tetrodotoxin-antagonized spasmodic response of brine shrimp larvae (Artemia salina).- Toxicon, 1978, 16, II 3, p.227-234.

78. Narahashi T., Seyama I. Mechanism of nerve membrane depolarization caused by grayanotoxin I.- J. Physiol. (London), 1974, 242, N 2, p.471-487.

79. Soeda Y. Preparation of tritium-labelled öL-dihydrograyanotoxin II.- J. Labelled Comp., 1974, 10, H 1, p.165-169.

80. Catterall W.A. Activation of the action potential Na+ ionophore by neurotoxins. An allesteric model.- J. Biol.Chem., 1977, 252, N 23, p.8669-8676.

81. Catterall W.A, Neurotoxins that act on voltage-sensitivesodium channels in excitable membranes,- Ann. Rev, Pharmacol, Toxicol,, 1980, 20, p,15-43.

82. Catterall W.A., Hartshorne R.P., Beneski D.A. Molecular properties of neurotoxin receptor sites associated with sodium channels from mammalian brain.- Toxicon, 1982, 20, p.27-40,

83. Heistracher P,, Pillat B. Electrophysiological investigations on the effect of quinidiae on aconitine poisoning of the cardiac muscle fibers.- Naunyn-Schmiedeberg1s Arch. exp.Path.Pharmak., 1962, 244, N 1, p.48-62.

84. Schmidt R.P. Versuche mit Aconitin zym Problem der spontanen Erregungsbildung im Hersen.- Pflüg. Arch., 1960, 271, N 5, p.526-536.

85. Wellhöner H.H. Effect of aconitine on the slowly adaptingstretch receptor neuron of the crayfish.- Pflüg. Arch.,1968 304, N 1, p.104-117.

86. Hironaka T., Narahashi T. Cation permeability ratios of sodiumchannels in normal and grayanotoxin-treated squid axon membranes.- J. Membrane Biol., 1977, 31., N 1, p.359-381.

87. Seyama I. Effect of grayanotoxin I on the electrical properties of rat skeletal muscle fibers.- Jap. J, Physiol.,1970, 20, N 4, p.381-393.

88. Seyama I. Effect of grayanotoxin I on SA node and might atrialmyocardia of the rabbit.- Am. J. Physiol., 1978, 235» N 3, Р.С136-С142.

89. Ulbricht W. Voltage clamp studies of veratrinized frog nodes.

90. J. Cell. Comp. Physiol., 1965, j56, suppl. 2, p.91-98.

91. Harahashi T., Deguchi T., Albuguerque E.X. Effects of batiachotoxin on nerve membrane potential and conductances.- Nature New Biol., 1971, 229, N 7, p.221-222.

92. Catterall W.A., Nirenberg M. Sodium uptake associated withactivation of action potential ionophores of cultured neuroblastoma and muscle cells.- Proc. Natl.Acad.Sei. USA,1973, 70, N 12, pt. 2, p.3759-3763.

93. Akera T., Ku D.D., Prank M., Brody T.M., Iwasa J. Effects ofgrayanotoxin I on cardiac Na+, K+ - adenosine triphosphatase activity, transmembrane potential and on myocardial contractile force.- J. Pharm. Exp. Ther., 1976, J99, N 1, p.247-254.

94. Soeda Y., O'Brien R.D., Yeh J.Z., Narahashi T. Evidence that

95. JL-dihydrograyanotoxin II does not bind to the sodium gate.- J. Membrane Biol., 1975, 23, H 1, p.91-101.

96. Matthews J.С., Albuquerque Е.Х., Eldefrawi М.Е. Influenceof batrachotoxin, veratridine, grayanotoxin I and tetro-dotoxin on uptake of Na-22 by rat brain membrane preparations.- Life Sei., 1979, 25l N p.1651-1658.

97. Portius H.J.,' Repke К. Versuch einer Analyse der Beziehmgenzwischen chemischer Struktur und Digitalis - ahnlicher Wirksamkeit auf der Rezeptorebene.- Arzneim.-Forsch., 1964, 14, H 10, S. Ю73-Ю77.

98. Catterall W.A. Activation of the action potential Na+ ionophore of cultured neuroblastoma cells by veratridine and batrachotoxin.- J. Biol, Chem., 1975, 250, И 11, p.4053--4059.

99. Tang C.M., Strichartz G.R., Orkand R.K. Sodium channels inaxons and glial cells of the optic nerve of Necturus maculosa.- J. Gen. Physiol., 1979, 74, N 5, p.629-642.

100. Starkus J.G., Harahashl T. Sensitivity of excitable and inexcitable membranes to -dihydrograyanotoxin II.- Am.J. Physiol., 1978, 235, li 5, p.C204-C211.

101. Можаева Г.Н., Наумов А.П., Негуляев Ю.А. Влияние аконитина на некоторые свойства натриевых каналов мембраны перехвата Ранвье. - Нейрофизиология, 1976, 8, № 2, с. 152-160.

102. Albuquerque Е.Х., Seyama I., Narahashi Т. Characterizationof batrachotoxin-induced depolarization of the squid giant axons.- J. Pharm. Exp. Ther., 1973, 184» N 2, p.308--314.

103. Cuervo L.A., Adelman W.J., or. Equilibrium and kinetic properties of the interaction between tetrodotoxin and the excitable membrane of the squid giant axon.-J. Gen.Physiol. 1970, 55, H 3, p.309-335.

104. Peper К., Trautwein W. The effect of aconitine on the membrane current in cardiac muscle.- Pflug. Arch., 1967, 296, N 4, p.328-336.

105. Ulbricht W., Flacke V/. After-potentials and large depolarizations of single nodes of Kanvier treated with veratridine.-J. Gen.Physiol., 1965, 48^ N 6, p.1035-1046.

106. Sperelakis N., Pappano A.J. Increase in Р^а and PK of cultured heart cells produced by veratridine.- J, Gen. Physiol.,1969, 5b. и 1, p.97-114.

107. Moore J.W., Narahashi T. Tetrodotoxin1s highly selectiveblockage of an ionic channel.-Fed. Proc., 1967» 26» N 6, p. 1655-1663.

108. Tasaki Т., Singer I. Membrane macromolecules and nerve excitability: a physicochemical interpretation of excitation in giant squid axons.- Ann. N.Y. Acad. Sci. USA, 1966, 137, N 2, p.792-806.

109. Moore J.W., Blaustein M.P., Anderson N.C., Narahashi T. Basisof tetrodotoxin's selectivity in blockage of squid axons.-J. Gen. Physiol., 1967, 50, N 7, p.1401-1411.

110. Metuzals J., Tasaki I. Subaxolemmal filamentous network.in the giant nerve fiber of the squid (Loligo pealei L.) and its possible role in excitability.- J. Cell Biol., 1978, 78, И 2, p.697-621.

111. Inoue I., Pant H.C., Tasaki I., Gainer H. Release of proteinsfrom the inner surface of squid axon membrane labeled with tritiated N-ethylmaleiraide.- J. Gen. Physiol., 1976, 68, N 4, p.385-395.

112. Pant H.G., Shecket G., Gainer H., Lasek R.J. Neurofilamentprotein in phosphorylated in the squid giant axon.- J. Cell.Biol.,. : 1978, 78, N 1, p.R23-R27.

113. Pant H.C., Terakawa S.t Yoshioka T., Tasaki I., Gainer H.

114. Evidence for utilization of extracellular '¿f-'^p. ATP for the phosphorilation of intracellular proteins in the squid giant axon,- Bioehem. Biophys. Acta, 1979» 582. IT 1, p.107-114*

115. Pant H.C., Pollard H.B., Pappas C.D., Gainer H. Phosphorylation of specific, distinct proteins in synaptosomes and axons from squid nervous system,- Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1979, N 12, p.6071-6075.

116. Boegman R.J., Albuquerque E.X. Axonal transport in ratsrendered paraplegic following a single subarachnoid injection of either batrachotoxin or 6-aminonicotinamide into spinal cord.- J. Neurobiol., 1980, 11, N 3, p.283-290.

117. Boegman R.J., Riopelle R.J. Batrachotoxin block slow andretrograde axonal transport in vivo.- Keurosci. Lett., 1980, 18, N 2, p.143-147«

118. Ochs S., Worth R. Batrachotoxin block of fast axoplasmictransport in mammalian nerve fibers.- Science, 1975» 187. N 4181, p.1087-1089•

119. Boegman R.J., Deshpande S.S.f Albuquerque E.X. Consequences of axonal transport blockage induced by batrachotoxin on mammalian neuromuscular junction. I. Early pre- and postsynaptic changes.- Brain Res., 181Z. N 1, p.186-196.

120. Boegman R.J., Scarth B. Neurotoxin-induced hydrolase activity in peripheral nerve.- Neurosci. Lett., 1981, 24. H 3, p.261-265.

121. Max S.R., Deshpande S.S., Albuquerque E.X. Neural regulationof muscle glucose 6-phosphate dehydrogenase: effect of batrachotoxin and tetrodotoxin.- J. Neurochem., 1982,38, N 2, p.386-391.

122. Schoffeniels E., Dandrifosse G. Protein phosphorylation andsodium conductance in nerve membrane.- Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 1980, 77, N 2, p.812-816.

123. Dandrifosse G., Schoffeniels E. Effect of various compoundson the on the phosphorylation of nerve proteins.- Neurochem. Int., 1980, N 2, p.95-100.

124. Schoffeniels E. The biochemical cycle of impedance variation in axonal membranes.- Neurochem. Int. 1980, N 2, p.81-93.

125. Schoffeniels E. Identification of Na+ gating proteins inconducting membranes.- In: membranes and Transport. Ed. A.N. Martonosi, Plenum Press., N.Y.-L. 1982, vol.2, p.379--383.

126. Bontemps J., Dandrifosse G., Schoffeniels E. Protein phosphorylation in nerve and electric organ: isolation and partial characterization of a high affinity system for ATP.- Neuro-sci. Int., 1980, N 2, p.101-110.

127. Krueger B.K., Pom J., Greengard P. Depolarization-inducedphosphorylation of specific proteins, mediated by calcium ion influx, in rat brain „synaptosomes.- J. Biol. Chem., 1977, 252, N 8, p.2764-2773.2+

128. Sieghart W., Porn J., Greengard P. Ca and cyclic AMP regulate phosphorylation of some two membrane-associated proteins specific to nerve tissue.- Proc. Natl.Acad.Sci.USA, 1979, 76, N 5, p.2475-2479.

129. Ueda Т., Greengard P. Adenosine 3':5'-monophosphate-regulated phosphoprotein system of neuronal membranes. I. Solubilization, purification, and some properties of an endogenous phosphoprotein.- J. Biol. Chem., 1977, 252, N 14, p.5155-5163.

130. Ueda Т., Maeno H., Greengard P. Regulation of endogenousphosphorylation of specific proteins in synaptic membrane fractions from rat brain by adenosine 3* s5*— monophosphate.-J. Biol. Chem., 1973, 248, N 23, p.8295-8305.

131. Kakiuchi S. Short history and overview of cyclic AMP research.- Asian Med. J., 1979, 22, N 7, p.426-439.

132. Blaustein M.P., King A.C. Influence of membrane potential onthe sodium-dependent uptake of gamma-aminobutyric acid by presynaptic nerve terminals: experimental observations and theoretical considerations.- J. Membrane Biol.,1976, 30, N 2, p.153-173.

133. Pollard H.B., Pappas C.D. Veratridine-activated release ofadenosine-5'-triphosphate from synaptosomes: evidence for calcium dependence and blockage by tetrodotoxin.- Biochem. Biophys. Res. Commun., 1979, 88, H 1, p.1315-1321.

134. Patrick R.L., Barchas J.D. Stimulation of synaptosomal dopamine synthesis by veratridine.- Nature (L.), 1974, 250, N 5469, p.737-739.

135. Крутецкая З.И., Лонский A.B., Можаева Г.Н., Наумов А.П.

136. Двухкомпонентность токов смещения в мембране нервного волокна: кинетический и фармакологический анализ. - Цитология, 1978, 20. № II, с. 1269-1277.

137. Khodorov В.I., Peganov E.M., Revenko S.V., Shishkova L.D.

138. Sodium currents in voltage clamped nerve fiber of frog under the combined action of batrachotoxin and procaine.-Brain Res., 1975,8£, N 3, p.541-546.

139. Ulbricht W. The effect of veratridine on excitable membranes of nerve and muscle.- Ergeb. Physiol. Pharmakol., 1969,6l, p.18-71.

140. Albuquerque E. The mode of action of batrachotoxin.- Ped.

141. Proc., 1972, 31j. N 3, p. 1133-1138.

142. Пеганов Э.М., Ходоров Б.И., Шишкова Л. Д. Медленная натриевая инактивация в мембране перехвата Ранвье. Роль наружного калия. - Бюлл. эксп. биол. мед., 1973, 76, 9, с.15-19.

143. Mozhayeva G.N., Naumov A.P., Negulyaev Yu.A., Nosyreva E.D.

144. The permeability of aconitine-modified sodium channels to univalent cations in myelinated nerve.- Biochem. Biophys. Acta, 1977, 466, N 3, p.461-473.

145. Ходоров Б.И., Пеганов Э.М., Шишкова Л.Д. Медленная инактивация в мембране перехвата Ранвье. - В кн. Биофизика мембран. Каунас, 1973, с. 620-626.

146. Наумов А.П., Негуляев Ю.А., Носырева Е.Д. Изменение селективности натриевых каналов мембраны нервного волокна цри действии вератрина. - Цитология, 1979, 21, № 6, с.692-696.

147. Hille В. Ionic selectivity, saturation and block in sodiumchannels. A four-barrier model.- J. Gen. Physiol.,1975» 66» P.535-560.

148. Chizmadzev Yu.A., Khodorov B.I., Aityan S. Kh. Analysisof the independence principle for the sodium channels of biological membranes.- Bioelectrochem. Bioenerg.,1974, 1, p.301-312.

149. Эйзенман Д. Катионселективные стеклянные электроды и методы их применения. - В кн. : Вопросы биофизики. 1964, с.215-265.

150. Huang L.-Y.M., Catterall W.A., Ehrenstein G. Comparison of ionic selectivity of batrachotoxin-activated channels with different tetrodotoxin dissociation constants.

151. J. Gen. Physiol., 1979, 73, N 6, p.839-854.

152. Cseri J., Varga E. Effect of veratrine on v/ater, sodiumand potassium transport in the frog sartorius muscle.-Acta Physiol. Acad. Sci. Hung., 1978, 51^ N 1-2, p. 1-12.

153. И0. Наумов А.П., Негуляев Ю.А., Носырева Е.Д. Изменение сродства кислотной группы натриевого канала к ионам водорода цри действии аконитина. - ДАН СССР, 1979, 244, № I, с.229-232.

154. Mozhayeva G.N., Haumov А.P., Negulyaev Yu.A. Interactionof H+ ions with acid groups in aconitine-modified sodium channels.- Gen. Physiol. Biophys., 1982, I^H 1, p.21-35.

155. Mozhayeva G.N., Naumov A.P., Negulyaev Yu.A. Interactionof H+ions with acid groups in normal sodium channels.-Gen. Physiol. Biophys., 1982, N 1, p.5-19.

156. Jacgues Y., Romey G., Laadunski M. Toxin-induced K+ effluxthrough the Ha+ channel of neuroblastoma cells.- Eur. J. Biochem., 1980, 111, N 1, p.265-273.

157. Palfrey C., Littauer U.Z. Sodium-dependent efflux of K+ and

158. Rb+ through the activated sodium channel of neuroblastoma cells.- Biochem. Biophys. Res. Commun., 1976, 72, N 1, p.209-215.

159. Ponzio G., Jacques Y., Frelin C., Chicheportiche R., Lazdunski M. An in vitro system to study the action potential sodium channel.- FEBS Lett., 1980, 121, N 2, p.265--268.

160. Jacques Y., Fosset M., Lazdunski M. Molecular propertiesof the action potential Na+ ionophore in neuroblastoma cells. Interactions with neurotoxins.- J. Biol. Chem., 1978, 253, N 20, p. 7383-7392.

161. Ulbricht V/. Kinetics of tetrodotoxin and saxitoxin actionat the node of Ranvier.- Adv. Cytopharmacol., 1979, 3, p.363-371.

162. Albuquerque E.X., Brookes N., Onur R., Warnick J.E. Kineticsof interaction of batrachotoxin and tetrodotoxin on rat diaphragm muscle.- Mol. Pharmacol., 1976, 12, N 1, p.82-91.

163. Catterall W.A., Ray R. Interaction of neurotoxins with the actiorpotential Na+ ionophore.- J.Supramol. Structure, 1976, N 3, p.397-407.

164. Khodorov В., Revenko S. Further analysis of the mechanisms ofaction of batrachotoxin on membrane of myelinated nerve.-Neurosci., 1979, ^ H 9, p.1315-1330.

165. Meves H. The effect of veratridine on internally perfused giantaxons.- Pflüg. Arch., 1966, 290, N 3, p.211-217.

166. Gatterall W.A. Cooperative activation of action potential Na+ionophore by neurotoxins.- Proc. Natl* Acad. Sei. USA, 1975, 72, N 5, p.1782-1786.

167. Ревенко G.B. Влияние электрической стимуляции перехвата Ранвье на скорость модификации натриевых каналов батрахоток-сином в условиях фиксации потенциала. - Нейрофизиология, 1977, 9, Л 5, с.546-549.

168. Bartels-Bernal Е., Rosenberry T.L. Effect of batrachotoxin onthe electroplax of electric eel; evidence for voltage-dependent interaction with sodium channels.- Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1977, lit N 3, p.951-955.

169. Herzog W.H., Feibel R.M., Bryant S.H. The effect of aconitineon the giant axon of the squid.- J. Gen. Physiol., 1964, £7, N 4, p.719-733.

170. Наумов А.П. О природе потенциал-зависимости связывания токсина скорпиона с натриевыми каналами возбудимых мембран. - Механизмы действия зоотоксинов (Горький), 1980, $ 8, с 80-89.

171. Bernard P., Gouraud P., Lissitzky S. Effects of a scorpiontoxin from Androctonus australis venom on action potential of neuroblastoma cells in culture.- Biochem. Biophys. Res. Commun., 1977, 77» N 2> P.782-788.

172. Catterall W.A. Purification of a toxic protein from scorpionvenom which activates the action potential Na+ ionophore.-J. Biol. Chem., 1976, 251, II 18, p. 5528-5536.

173. Krueger B.K., Blaustein M.P., Ratzlaff P.W. Sodium channelsin presynaptic nerve terminals. Regulation by neurotoxins.-J. Gen. Physiol., 1980, 76, N 2, p.287-313.

174. Lazdunski M., Balerna M., Barhanin J., Chicheportiche R.,

175. Tamkun M.M., Catterall W.A. Ion flux studies of voltagesensitive sodium channels in synaptic nerve-ending particles.- Mol. Pharmacol., 1981, Ij^. N 1, p.78-86.

176. Можаева Т.Н., Наумов А.П., Носырева Е.Д. Взаимодействие токсинов скорпиона с натриевыми каналами мембраны перехвата Ранвье. Эксперименты в методике фиксации потенциала. - Механизмы действия з.оотоксинов (Горький), 1978, № 6, с.9-27.

177. Abita J.-P., Chicheportiche R., Schweitz H., Lazdunski M.

178. Effects of neurotoxins (veratridine, sea anemone toxin, tetrodotoxin) on transmitter accumulation and release by nerve terminals in vitro,- Biochemistry, 1977, 16, N 9, p.1838-1844.

179. Ray R., Morrow C.S., Catterall W.A. Binding of scorpiontoxin to receptor sites associated with voltage-sensitive sodium channels in synaptic nerve ending particles,- J. Biol. Chem., 1978, 253, H 20, p. 7307-7313.

180. Khodorov B.I. Sodium inactivation and drug-induced immobilization of the gating charge in nerve membrane.- Progr. Biophys. Mol. Biol., 1981, J37, N 2, p.49-89.

181. Willow M., Catterall W.A. Inhibition of binding of 3h.batrachotoxinin A 20-cH-benzoate to sodium channels by the anticonvulsant drugs dephenylhydantion and carbarao-zepine.- Mol. Pharmacol., 1982, 22^ N 3, p. 627-635.

182. Huang L.-Y.M., Ehrenstein G., Catterall W.A. Interactionbetween batrachotoxin and yohimbine.- Biophys, J,, 1978, 23, N 2, p.219-231.

183. Ulbricht W. The effect of veratridine on excitable membranes of nerve and muscle.- Ergeb, Physiol, Pharmakol., 1969, 6lj p. 18-71.

184. Posset M., De Barry J., Lenoir M.-C., Lazdunski M. Analysis+ 2+of molecular aspects of Na and Ca uptakes by embryonic cardiac cells in culture.- J. Biol. Chem., 1977,252, H 17, p.6112-6117.

185. D'Arrigo J.S., Chanfour B. Modulation of veratridine actionon crustacean nerve by different divalent cations.-Toxicon, 1980, 18^ II 3, p. 395-398.

186. Можаева Г.Н., Наумов А.П., Нооырева Е.Д. Некоторые особенности кинетических и стационарных характеристик натриевых каналов, модифицированных аконитином. - Нейрофизиология, 1980, 12, В 6, с. 612-618.

187. Пеганов Э.М. Инактивация натриевой проницаемости мембраны нервного волокна посредством формамида. - ДАН СССР, 1980, 250. № I, с. 229-232.

188. Коваленко В.А., Пашков В.Н., Гришин Е.В., Овчинников Ю.А., Шевченко В.П., Мясоедов М.Ф. Получение биологически активного производного тетродотоксина, содержащего тритиевую метку. - Биоорган, химия, 1982, 8, $ 5, с.710-712.

189. Varga Е., Danko М., Domouxos J., Gesztelyi I. Mechanism ofmuscle membrane potential oscillation induced by veratrine.- Acta Physiol. Acad. Sci. Hung., 1977, 50^ И 4, p.457-468.

190. Wright E.B., Tomita T. A study of the crustacean axon repetitive response. III. A comparison of the effect of veratrine sulfate solution and potassium-rich solutions.- J. Cell Physiol., 1966, 67^ N 1, p.181-196.

191. Romey G., Chicheportiche P., Lazdunski M. Transition temperatures of the electrical activity of ion channels in the nerve membrane.- Biochem. Biophys. Acta, 1980, 602« N 3, p.610-620.

192. Shanes A.M., Gershfeld N.L. Interactions of veratrum alkaУloids, procaine, and calcium with monolayers of stearic acid and their implications for pharmacological action.-J. Gen. Physiol., 1960, 41, ij 3, p.345-363.

193. Albuquerque S.X., Sasa M., Avner B.P., Daly J.W. Possible«site of action of batrachotoxin.- Nature New Biol., 1971, 234, N 46, p.93-95.

194. Taylor R.F. Isolation and purification of a veratridinebinding proteoglycolipid from rat gastrocnemius tissue.-J. Neurochem., 1978, 21» N 5, p.1199-1207.

195. Reed J.K., Raftery M.A. Properties of the tetrodotoxinbinding component in plasma membranes isolated from Electrophorus electricus.- Biochemistry, 1976, J5, N 5, p. 944-953.

196. Hartshorne R.P., Catterall N.A. Purification of the saxitoxin receptor from rat brain.- Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1981, 78, N 7, p.4620-4624.

197. Catterall N.A., Hartshorne R.P., Beneski D.A. Molecularproperties of neurotoxin receptor sites associated with sodium channels from mammalian brain.- Toxicon, 1982, 20, N 1, p.27-40.

198. Hartshorne R.P., Messner D.J., Coppersmith J.C., Catterall

199. W.A. The saxitoxin receptor of the sodium channel fromrat brain: Evidence for two non-identical |2> subunits. -J« Biol. Ohem.t 1982, 257, К 23, p. 13888-13891.

200. Yelin E.A., Leonov V.H., Tikhomirova O.C., Torgov I.V.Synthesis of steroid alkaloids active on sodium channels. - In: Toxins as Tools in Neurochemistry. Eds. F. Hucho, Yu.A. Ovchinnikov, W. de Gruyter, Berlin-N.Y. 1983, p. 25-33.

201. Escueta A.V., Appel S.H. Biochemical studies of synaptosomes in vitro. II. Potassium transport. - Biochemistry, 1969,1. N 8, p. 725-732.

202. Коваленко В.А. Исследование рецепторов тетродотоксина и аконитина. Автореф. канд.дис., Москва, ИБХ АН СССР, 1983,

203. Schweitz Н., Vincent J.-P., Barhanin J., Frelin С.,Linden G.,

204. Hugues M., Lazdunski M. Purification and pharmacological properties of eight sea anemone toxins from Anemonia sulcata, Anthopleura xanthogrammica, Stoichactis giganteus and Actino-dendron plumosum.- Biochemistry, 1981, 20, p. 5245-5259.

205. Можаева Г.Н., Наумов А.П., Солдатов H.M., Гришин Е.В. Действие токсинов скорпиона Buthus eupeus на натриевые каналы мембраны перехвата Ранвье. - Биофизика, 1979, 24, № 2,с.235-241.

206. Можаева Г.Н., Наумов А.П. Кинетика взаимодействия токсина скорпиона с натриевым каналом мембраны перехвата Ранвье. -Нейрофизиология, 1980, 12, Л 6, с. 619-626.

207. Gouraud F., Rochat H., Lissitzky S. Binding of scorpionneurotoxins to chick embryonic heart cells in culture and relationship to calcium uptake and membrane potential.-Biochemistry, 1980, 19, N 3, p.457-462.

208. Vincent J.P., Balerna M., Barhanin J., Posset M., Lazdunski

209. M. Binding of sea anemone toxin to receptor sites associated with gating system of sodium channel in synaptic nerve endings in vitro.- Proc. Natl. Acad.Sci. USA, 1980, JJt N 3, p.1646-1650.

210. Soldatov N.M., Kovalenko V.A., Grishin E.V. Studies of thescorpion neurotoxin membrane receptor.- Abstracts of the III USSR-FRG Symposium on chemystry of Peptides and Proteins. Makhachkala, Nauka, Moscow, 1980, p.28.

211. Beneski D.A., Catterall W.A. Covalent labeling of proteincomponents of the sodium channel with a photoactivable derivative of scorpion toxin.- Proc. Natl. Acad.Sci. USA, 1980, 77^ N 1» P.639-643.

212. Agnew W.S., Levinson S.R., Brabson J.S., Raftery M.A.

213. Purification of the tetrpdotoxin-binding components associated with the voltage-sensitive sodium channel from Electrophorus electricus electroplax membranes.- Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1978, 75, N 6, p.2606-26l1.

214. Barchi R.L., Colien S.A., Murphy L.E. Purification from ratsarcolemma of the saxitoxin-binding component of the excitable membrane sodium channel.- Proc. Natl.Acad.Sci. USA, 1980, 77, N 3, p.1306-1310.

215. Barchi R.L., Murphy L.E. Size characteristics of the solubilized sodium channel saxitoxin binding site from mammalian sarcolemma. Biochem. Biophys. Acta, 1980, 597, N 2, p.391-398.

216. Barchi R.L., Weigele J.B. Characteristics of saxitoxinbinding to the sodium channel of sarcolemma isolated from rat skeletal muscle.- J. Physiol. (London), 1979, 295, p.383-396.

217. Гришин E.B., Солдатов H.M., Талмухамедов Б.А., Атакузи-ев Б.У. Выделение, свойства и аминокислотный состав токсинов яда среднеазиатского скорпиона Bu thus eupeus.- Биоорган, химия, 1978, 4, 14, с.450-460.

218. Levinson S.R., Curatalo C.J., Reed J., Raftery M.A. A rapidand precise assay for tetrodotoxin binding to detergent extracts of excitable tissues.- Anal. Biochem., 1979, 99, N 1, p. 72-84.

219. Chang H.W., Bock E. 1980. Pitfalls in the use of commercialnonionic detergents for the solubilization of integral membrane proteins: sulfhydryl oxidizing contaminants and their elimination. Anal.-Biochem., v.104, N 1, p.112-117.

220. Lowry O.H., Rosenbrough N.J., Parr A.L., Randall R.J. Protein measurement with the Polin phenol reagent.- J. Biol. Chem., 1951, 193, N 1, p.265-275.

221. Коваленко В.А., Пашков В.Н., Гришин Е.В. Молекулярная организация электровозбудимой мембраны. II. Солюбилиза-ция и частичная очистка рецепторов тетродотоксина из аксо-нальной мембраны краба. - Биоорган.химия, 1981, 2 » #12, с. 1828-1837.