Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Глутаминазная и глутаминсинтетазная активностьсубклеточных фракций мозга при гипотермии и зимней спячке

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Глутаминазная и глутаминсинтетазная активностьсубклеточных фракций мозга при гипотермии и зимней спячке"

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ ПО ВЫСШЕМУ ОБРАЗОВАНИЮ

РОСТОВСКИЙ ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

Б О" ДИССЕРТАЦИОННЫЙ СОВЕТ Д 063.52.08

ПО БИОЛОГИЧЕСКИМ НАУКАМ

ДИГ

Па правах рукописи

АВШАЛУМОВ Марат Владимирович

Глутаминазная и глутаминсинтетазная активность субклеточных франций мозга ори гипотермии и зимней спячке

(03.00,04 — БИОЛОГИЧЕСКАЯ ХИМИЯ)

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Ростоп-иа-Дону 1995 г.

Работа выполнена на кафедре биохимии и в НИИ биологии Дагестанского государственного университета.

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ:

доктор биологических наук, академик ЛЕН РФ, профессор Эмирбеков Э. 3.

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

доктор биологических наук, профессор Менджерицкий А. М. (Ростовский государственный университет"), доктор медицинских наук, с. п. с. Трапезонце-ва Р. А. (ЦНИЛ Ростовского госмединститута).

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ:

Дагестанский медицинский институт (г. Махачкала).

Защита состоится «26» апреля 1995 г. в 10 часов на заседании диссертаци-•онного совета Д 063.52.08 по биологическим наукам в Ростовском государственном университете (344006, г. Ростов-на-Дону, ул. Б. Садовая, ' 105, РГУ^ 2 этаж).

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке РГУ (344066, г. Ростов-на-Дону, ул. Пушкинская, 148).

Автореферат разослан « > марта 1995 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор биологических наук В. Н. КИРОЙ.

йвцАя шшшшстт равозм

Актуальность проблемы.Актуальность сравнительного изучения' ¡иохимических механизмов влияния искусственного и естественного

жлаядения на организм основала на широком применении метода ги-____ _____

ютермии в медицинской практике (Волколаков, Лацис, 1977; Ыешал-нга, Верецагшь 19655 Марченко и соавт., 1992; Чижевский я со-шт., 1992).

Исследованиями нашей лаборатории (Эмирбеков, .1987; Эмирбе-сов и соавт., 1989; Змирбеков, Львова, 1991) показано, что как ФИ гипотэрмической патологии, так и при естественной адаптации гипотермии (зимняя спячка) наблюдается повышение в мозгу со-•ерул^ия ачадака и Ьоотвехстаукщие asusneimft содеряани* основных сомпонентов системы его освобождения и связывания -глутамата и \путамина. Предполагается , что аммиак, гдутамат и глутамин при-шмаот активное участие в нейрохимической регуляции при гипотермии и зимней спячке (Змирбеков, 198?г Демин .и со-1нт.1988). Однако, известно, что глутамат в больших концентрацией: в, мозгу, так же, как и аммиак, является токсичным при таких экстремальных состояниях,', как гипоксия, ишемия, отек мозга, ги-югликешя (Раевский, 1990; Manev st ai., 1930; Irving, Scha-*ild, 1991).

В связи-с вышеизложенны« miTspec представляет изучение клв-{овых ферментов системы обмена глутамата-глутаминазы и глутамян-зинтетазы. В нашей лаборатории изучение- этих ферментов прозеди-гась многими исследователями {Уукаидов, 1Q71; Ксиаилов, 1982; йоида» 1890). Одна:ф до сих пор нэ учитывалась мембранная лока-вгаация этих 4&рыэкюа и связанная с этим их различная функциональная влачимое?*.

Учитывая ксочевуч рогш глутзшкзяы и глут®.пгасштетаоы'в юлдвряании уровня - ашкока, rjycusdxa и глутшягаа в головном доагу (Йяфбеков, Львова, 1985; Демин и соавт., 1000; Xyxof 1880) и преимущественно мембрзлиуп локализация этих фершптоз' (Ward, «radiere, Dennis ot al./lТогсгпэг/■

1937)., m про/шрайялк попытку изучить аюшшссть z тт,шер&гурцуо ззаисямость ыш^ксатг зтгк £®г?м*ятов * еигаптосомад и ^ихоксЩ ркях больаих по^тбз?и5 .головного мозга *;рчз и суслик-ос яра принудительной и естественной гипотермии.

Пели и ва^.ачи. исследования. Пэдьо рейота ягаклось .-пзучбщэ зсобзииостей глутгшиназнрй и глугаминсинтвгавной шсгиьк^ст-й Ъ:----

яаптосом и митохондрий больших полушарий головного мозга при .гипотермии и последующем самосогревании, а также при зимней спячке.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1. Исследование глутаминазной и глутаминсинтетазной активности синаптосомальной и митохондриальной фракции больших полушарий головного мозга крыс в динамике гипотермии и последущегс самосогревания. „ . !

2. Определение активности исследуемых фермента? в синапто-сомах и митохондриях больших полушарий головного мозга сусликоЕ при принудительной гипотермии. • |

3. Исследование глутаминазной и глутаминсинтетааной активности синаптосом и митохондрий больших полушарий головного , мозга сусликов в период гибернации. |

Основные положения, выносимые на защиту. 1 Г

1. Изучено изменение активности глутаминазной и ГрЛугеааш-скнтетазной активности в синаптосомальной и митохондриально! фракциях головного мозга крыс и сусликов при гипотермии к зимне;1 спячке. ]', I

2. При гипотермии и зимней спячке доминирующими и | накболе функционально значимыми являются изменения активности исследуемых ферментов в синаптосомальной фракции больших полушарий мозге

3. Восстановление глутаминазной я глутаминсинтетазной активности синаптосом и митохондрий больших полушарий головногс мозга происходит у крыс: охлажденных до 30° 1! 25°С сразу, дс 20°С через сутки и до-15°С через 3-е суток. |

4. Обнаруженна отрицательная температурная зависимость глутаминазной активности синаптосом при гипотермии крыс и. сусликов, а также при зимней спячке,что является, по видимо:,¡у, эволяциог-шс закрепленной компенсаторной реакцией мозга на охлаждение. |! '!

Научная новизна. В представленной работе впервые проведень исследования активности ключевых ферментов система освобоэд^нш и связывания аммиака в синаптосомальной и митохошрнальной фрак-шшх больших полушарий головного мозга при сшж?п;л (температур!

-.'в -

тела гоыойо- и гетеротермных животных.

Установлено, что наиболее лабильные изменения активности исследуемых ферментов происходят а синаптосомальной фракции больпшх полушарий головного моэга крыс и сусликов при всех изученных состояниях.

Новым, ранее никем не установленным, фактом является то, что у гилотермированных (20 и 15°С) крыс и (10°С) сусликов, и у сусликов, находящихся в состоянии глубокой зимней спячки (5-7°0) появляется отрицательная температурная зависимость глутаминазной активности в гомогенатах и синаптосомах больших полушарий головного моэга.

Теоретическая и практическая значимость работы. Полученные экспериментальные данные имеют существенное значение для обнаружения наиболее чувствительных к снижению температуры тела сторон метаболизма, отражающих как адаптивно-компенсаторные, так и патологические реакции. Представленные результаты об изменении глутаминазной и глутаминсинтетазной активности синаптосом и митохондрий больших полушарий головного моэга в динамике гипотермии и последующего самосогревания, а также при зимней спячке, позволяет углубить представления о функциональной роли системы аммиак-глутаминовая кислота и счастии ее компонентов в нейрохимической регуляции состояния пониженной температура тела, а также в процессах детоксикации аммиака.

Тема диссертации является составной частью научно-исследовательской работы НИИ биологии при Дагестанском государственном университете (01.87.0004691).

" Апробация работы.Материалы диссертации были представлены на конференции молодых ученых и преподавателей ДГУ (Махачкала,

1992),. на ".онференции молодых ученых и преподавателей ДГУ (Махачкала, 1993) на конференции "Организованный мозг" (Москва,

1993), на совместном заседании кафедры биохимии и НИИ биологии Дагестанского государственного университета (Махачкала, 1994) и на заседании кафедры биохимии Ростовского государственного университета (Ростов,1994 ). .

Публикации результатов исследования.По теме диссертации опубликовано 5 работ.

Структура работы и объем работы.. Диссертация изложена на 182 стр. машинописного текста и состоит из введения, обзора ли-

- б -

тературы, экспериментальной части, результатов собственных исс ледозаний, заключения, выводов и списка использованной литературы, который содержит 124 отечественных и 80 зарубежных источни ков.- Работа содержит 26 рисунков и 15 таблиц.

Материалы и метода исследования.

Опыты проводили на белых беспородных крысах-самцах и налу, кавказских сусликах (Citellus pygmalus Pal.), отловленных а низменной части Дагестана.

Гипотермия крыс и сусликов вызывали, помещая нивотных в солодовые камеры из органического стекла, в рубашкэ которых циркулировала вода с температурой 4-5°С. Температуру тела у крыс снижали до 30°, 25°, 20° и 15°С, а у сусликов - до 30°, 20° и 10°С

Для исследования зимней спячки ск шов, отловленных в ssз-не-няле, содержали в условиях вивария до глубокой осени.;'В кокц.: октября животных помещали в индивидуальные клетки и. переносили ¡ темную холодную комнату с те>лгэратурой Б-С°С. Для исс^едь'вади; выбрали'следующие атапы гиберпацшпдо начала спячки (, дремотно; состояние), через 7 дней и 3 месяца после начала спячки.!!.

Животных забивали методом 'дек-апитацал, извлекали голсано» мозг и отделяли большие полушария. Выделение cimanToco^antuoi фракции больших полупарщ": мозга проводили по "методу Hajcí (197Б), а шттохеллр'тзльпой фракции по штоду - VihittaHer (¿B72).

Определенно глута1.ишаэной активности (К.©. 3.5.1.2) з тканях мозга (Магарлзмов. и соавт. 1979)' проводили в среде шн^Оа-Ц1Ш, содержащей прзггетовлённькз ка физиологическом растворе сле-дуяз?:о компоненты; 0,2 ш 50 ы11 'глуташша'и 0,2 ил О,Б И фосфатного буфера, рН - 7,0.

Глутаминсинтетазнуа активность (К.55.3.0.1.2 ) ('Iípe6c,í035) определяли в среде инкубации, . содержащей следующие компоненты: 0,5 МЛ 0,1 М веронал-натриевого буфера, рН - 7,4; 0,2 0,5 I. глутамата; 0,1 ил 2,84 мЫ Ш4С1; 0,1 ш 0,1 М АТФ и 0,1 ш 1,0 I

: Инкубацию проб проводили в течение 15 минут в диапазоне температур инкубации 5-45°i\ ' .

Глуташнсинтетаенуп агсггеность определяли по количеству связывающегося, а глутаминсиатетазнуи - по количеству освобождающегося аммиака. Количество аммиака определяли прямым фенс^д-ги-

/

иохлорптнш í/етодам (Мзгарламов и иоавт., 1979).

_________¿jKijüaocTo ферментов, определенная в гонигештех большие

иол/карий идега, мфахзлагяг з "иМ-Н-мНэ-на-ЮО.м»:. дкаан_й чаи, г-. ара оп{>(»де-лс-<чш1 активности исслуду^ььт фв-р^нтоз ь сшаис-ии» И .«ПТОХОВДрШК бОДЬШИУ полушарий МО&Г'Ь Ил aiílílüaocíb 4üpci-.\¿jiff" п Miití N-NH3 из 1 мг бе.ма к «не.

В»яок определяли исходы).; ли^'ра е- л\., 1851). Ьлсп«

г. к. -к;.с. ъаннке по;! - - ог-¡V; ■. íjc."" г^г^пт:"3 по ме-

тоду малой ьыоорки (£0»3,'НИН. • ■* ■

. лэточниа Фрагадой воля сиз колзшаучп «¿«гг. при гйпотораш! и яоследл".дзц садосопдеааккя

Полученные нами данные (рис. 1, müa. 1, 2. 3, 4) показывают, что в митохондриапышй фракции больших полушарий головного нС'Эга крыс- и сусликоз активность г;:утамшшзи и глутаминсшгтетаэы íís¿=í5, ч • '"«аптсззиел?-. Кооые того, по мэре снижения

•H.'iriiáj. - ' . ; .-лГ".' 1 i-i'

al., 19Ш; KvBitefc, —, г •. •

Г—•г«« =<■••» >-п нвс5?:одшо сп-отг^ть, тг.! нппраплепие иам^ввт.«

—„ iratcr,

Е1Я.Ш- в сшаитск-'и^чл г. ....----------i .

мезга как крыс, vmí и сусмлот /у пг. ишеубпцип tffby.

• .-.т-.г-'-ги*? wwn,vn»jr ираводгст ¡s иьмгпешзз a¡«~ ------ „ „ ivT.„-rfií;axaí:, ¡i ü j<:"."•-

... чыииа; ЯКТШЗииихо г«*.»--------

cp-O!', , а ггутггчЕскнтзтк*» - ----------••

ссогоянт'Л гипогэрмни и я, к глухгккпейктетазнэк EJÍ-

А I

Б I

И

2»-

1510,

23,

гл

15

;э го зо « м

2 ИШ!., С

м

13 20

Рас. 1. Температурная зависимость глутамипазпой (¡) и глутамнпепптетазяо! ектвепости сппапхосом {С, мкмоль М-гМНува 100 мг ткали) и пито* рай (М, ккмоль на 1 мг белка) больших полушарий головиоп

га крыс (А) и сусликэа (£) при мормотермяк.

о

, asTfîuocrn (» %'ы ч контролю) я г«»ог»:чат8х (cu), cresntoccww '¡ÍES! я уятогсодрязг fssaï Coaskks аад^/п^гй мозга крис g¡í-< tu-потермш« а - отатермиа 3ûeC с

-С» - ишо»ркия 25'*С п ~ гкшдармия 20°с г - шпотормпя 15 С

тивность гомогенатов, синаптосом и митохондрий больших полупарш головного мозга крыс понижается. Однако степень изменений активности в исследуемых ферментах в синаптосомальной и митохондри-альной фракциях, различается на разных этапах охлаждения (рис.1).

При гипотермии 30°С большим изменениям подвергается активность ферментов, локализованных в синаптосомальной фракции, npj гипотермии 25° и 20°С наибольшие изменения активности ферментов проявляются во фракции митохондрий; при гипотермии 15°С и в си-нзптосомах, и в митохондриях больших полушарий головного мозг; крыс активность глутаминазы и глутамгашсинтетазы изменяется одинаково.

• В наших опытах наблюдается повышение глутаминазной и снижение глутаминсинтетазной активности з мозгу на начальных стадилз 'снижения температуры тела (гипотермия 30°С). В подобных экспериментах (Змирбеков, 1989; Абдуллаэв, 1982) установлено новышенш уровня "аммиака и глутамата в мезгу (&,..,,беков, 1969; Абдуллаев,

1582).Воаможйо, повышение концентрации аммиака влияет на активность исследуемых ферментов при гипотермиии (Dennis et al.,1980; Svenneby, Тогепэг,1937; Пушкин, 1990). j.

Повышение глуташназней и падение глутаминсинтетазной активности в синаптосомах и ттохонцриях больших полукарий головного мозга гнпотармировапкщ: (£0°С) крыс мелет быть едкой и; причин поддержания высокой концентрации глутамата и ашшака, которые в условиях низюи-; температур тела могут выполнять нейрсыо-дуляторнуа фущ,1ЦЛ0 (Ссорог, Plum, 1SS7; Кркчевская и соавт.,

1583).

При глубокой гипотермии наиболее четко проявляются различи; в- активности фермеров, локализованных в синаптосомах и митохондриях больших полушарий головного мозга крыс. Наибодшз$ уг-иэтэнко активности глуха&шааы и глутаминсинтетазы проислодих i митохондриях, тогда run: в синаптосомах эти изменения менее'эна-•-'л?алыш-(рис. 2). Кромэ того, глутамкнаэная шшшность гомогенатов и синаптосом больших полушарий головного мозга охлаждении: до 20°С и 10°С крыс проявляет отрицательную температурную . зависимость в диапазонах ч 5мдератур инкубации 20-30°С и 15-30°С со-отвзтетвенно (рис.5). В митохондриях такое явление не обнаружено.

Одинаковое угнетение гктивности глутаминазы и глутамннсин-

тетазы в синаптосомах и митохондриях больших полушарий головного мозга крыс обнаружено только при гипотермии 15°С. Вероятно, на этом этапе происходит окончательная "ломка" всех резервных механизмов"," ответственных за развитие резистентной реакции, под пролонгированным действием стрессового фактора (низкая температура тела), и срабатывают экстренные механизмы температурной компенсации, не характерные для предыдущих' этапов охлаждения.

Считается (Змирбеков, Львова, 1385), что "следы" гипотерми-ческой патологии в метаболизме мозга сохраняются в течение месяца после самосогревания. Однако по нашим данным нормализация активности исследуемых ферментов метаболизма глутамина наблюдается у гипотермированных (30 2Е°С) крыс сразу после самосогревания до 37°С, у охлажденных до 20°С крыс - через сутки после самосогревания, и у крыс, перенесших сверхглубокую гипотермию (1б°С) -через 3-е суток после самосогревания (рис. 2, ). Показано (Сим-малавонг Сантисук, 1992; Абдуллаев, 1982), что через 3-е суток после самосогревания происходит нормализация содержания в мозгу почти всех нейромедиаторных аминокислот и процессов перекисного оксдения липидов. Возможно, эти системы имеют более мощные компенсаторные механизмы.

Надо отметить тот факт, что сразу после самосогревания до 37 °С после перенесенной гипотермии £0 и 15°С глутаминазная активность 'синаптосом и митохондрий больших полушарий головного мозга крыс повышается, а глуташнсинтетазная падает.

Сравнительный анализ наших данных по исследовании активности ферментов распада и синтеза глутамина в синаптосомах и митохондриях больших полушарий головного мозга крыс и результатов изменений содержания глутамата, глутамина, аммиака и ГАМК (Эмир-беков, 1969; Абдуллаев, 19S2; Змирбеков, Львова, 1S85) при гипотермии и последующем самосогревании» позволяет сделать вывод с том, что обнаруженная динамика активности ферментов направлена на обеспечение синапсов необходимым количеством нейромедиаторных аминокислот (Shank, Campbell, 1983; Dennis et al., 1390; Cooper., Plum, 1987). ОС этом свидетельствует и большая амплитуда изменений активности исследуемых ферментов в митохондриях и относительно меньшая б синаптосомах при гипотермии и самоосгреяаmm. Это позволяет заключить,что изменения активности иследуеыыж ферментов в синаптосомах мозга крыс при гипотермии и самосогревании

имеют наибольшее функциональное значение

£2. Глуташшааная н вдуташшоштетааная шшшиость больших полушарий головного моага сусликов щш гипоторшш

Ив табл: . 1 ¡а. 2 видно, что у летних бодрствующих сусликов при снижении температуры инкубации тканей мозга активность исследуемых ферментов снижается, и наиболее резкие изменения наблюдаются в гомогенатах больших полушарий головного мозга.

У гетеротершшх животных, подвергнутых принудительной гипотермии, наблюдается иная, чем у крыс, картина изменений активности ключевых ферментов обмена глутамина в гомогенатах, синап-тосомах и митохондриях больших полушарий головного мозга.

Глутаминагная и глутаминсинтетазная активность гомогенатоз, синаптссом и митохондрий больших полушарий головного мозга гипо-термироваяных сусликов изменяются различно (табл.1, 2 и рис.3).

Причем степень и направленность обнаруженных изменений у сусликов отличается от таковых у крыс (рис. 2, 3). Надо отметить, что в отличие от крыс, у сусликов глутаминсинтетазная активность гомогенатоз, синаптосом и митохондрий больших полушарий головного мозга увеличивается на всех этапах охлаждения. Глутаминазная активность при гипотермии 30°С в гомогенатах возрастает, но не меняется в обеих наследуемых фракциях мозга: а при гипотермии 20 и 10°С - снижается, как в гомогенатах, так ив синаптосомах и митохондриях.

В наших экспериментах степень изменений' активности исследуемых ферментов в митохондриях и синаптосомах различна. Так, глутаминазная активность претерпевает большие изменения в синаптосомах при гипотермии 20°С, тогда как в митохондриях наибольшие-

изыэяения наблюдаются при гипотермии 10°С. Глутаминсинтетазная

активность претерпевает наибольшие изменения з синаптосомах при гипотермии 30 С, в митохондриях при гипотермии 20°С. При гипотермии 10°С наблюдается примерно одинаковая динамика изменил активности глутаминсинтетазы в исследуемых фракциях"мозга.

ТАБ.1ИЦА 1.

Глутаминазная активность (в мкмцль М-КНз па 1 мг белк^/ч) синал-тосом (С) и митохондрий (М) больших полушарии головного мозга сусликов' при гшотермии (п=6-7; Шда)

Состояние животных Глутаминазная активность

Температура инкубации, °С

3? - . 30 20 1С 5

Контроль (бодрствование летом) с 22.40 * ± 0.01 19.09 ± ± 0.18 15.71 + ± 0.21 12.44 + + 0.02 6.00 ± + 0.01

ы 24.49 ± + 0.37 4 21.69 I ± 0.03 17.94 ± + 0.15 15.65 ± -Ь 0.21 6.50 * 0.18

Гипотермия :30°С с 23.00 ± ±.0.10 20.12 ± + 0.01 16.22 ± ±.0.23 12.00 ± + 0.25 5.85*±* ± 0.13

м 24.70 * ± 0.30 22.00 % + 0.18 18.22 1 + 0.15 16.00 ± +0.31 6.25 ±* ± 0.02

ш°п с 18.27 £ + 0.17 15.22 £ + 0.12 12.75 ± ± 0.42 10.45 ± ± 0.11 5.00 ±* + 0.10

а 20.47 | 1 0.02 17.24 ± + 0.41 13.37 ± ± 0.17 11.95 ± + 0.01 5.25 ± 0.15

II10 с 19.72 / + 0.11 16.17 £ + 0.21 11.00 £ ± 0.01 15.75 £ ± 0.10 7.50 ± 0.12

м 18.21 + 0.02 15.75 + + 0.03 и.оо Л ± 0.12 5.50 + ± 0.21 3.21 А ± 0.31

Примечание-.здесь и далее * означает достоверные *.Р<0,06) относительно контроля (бодрствование летом, температура инкубации 37иС) различия.

. • Динашкз изменений активности ферментов метаболизма глута-мина в мозгу гипотермирсзанных сусликов совпадает с изменениями содержания аммиака, глутамата и гдутамина (Змирбеков, 1363; Эмирбеков, Абдуллаэв, 1987). Для глутвминазной активности синап-тосом мозга сусликов при гипотермии 10°С обнаружен участок отри-

-

30 20

30"

1 п , 1

■ и , < М11Н11 1 » г 1

Рас.3. Диаграмма изменений глутамииазиой (I) в глутаминспнтетазпой (II) активности (в %% к контролю) в гомотеиатах (СП), синаптосомах (е) и митохондриях (ей) больших полушарий мозга сусликов при гипотермия: а - пшстеомия 30*С б - гипотермия 20'С в - гипотермия 10сС

ТАБЛИЦА г.

Глутаминсинтетаэная активность (в мкмоль Ы-Шз на 1 мг белка/ч) синаптосом (С)._и_ митохондрий (Ы) больших полушарий головного мозга сусликов при гипотермии (п=б--7; М+т)-----------------------------------------------

Состояние животных Глутаминсинтетаэная активность

Температура инкубации, °С

37 30 20 10 5

Контроль (бодрствование летом) С 12.84 + + 0.11 11.02 ± * о.оз 7.69 + ± 0.04 4.854 ? ± 0.02 2.50 + ±0.02

м 13.67 + + 0.04 11.27 1 + 0.02" 7.70 ± ± 0.19 4.84 ± + 0.21 2.49 + ± 0.02

Гипотермия :30°С с 15.31*$; ± 0.21 13.95 % ± 0.02 10.12 + + 0.03 7.45 ? * 0.01 3.00 1 £ 0.02

ы 16.41 + 0.12 15.00*+ + 0.12 12.85 1 ± 0.03 8.21 + ± 0.01 4.00 ± ± 0.02

20°С с 18.52 ± + 0.13 14.92 ± ± 0.05 11.90*+ ± 0.10 9.42 £ 1 0.11 4.92 1 ± 0.02

м 17.61 % + 0.15 14.001 ± 0.11 11.00 ± 0.13 7.50 ? ± 0.12 3.001-± 0.04

10°С с 19.72 % + 0.15 17.21 £ ± 0.03 13 .-50'А ± 0.11 10.10% 1 0.12 5.00 ** ± 0.06

ы 20.57 + 0.17' 18.00 ± ±0.10 15.00 % ± 0.12 11.50-1 + 0.17 б.00 £ 1 0.12

цательной температурной зависимости (рис. 5) в диапазоне температур инкубации 10-20 С, так же, как и у гипотермированных (20 и 15°С) крыс. При температуре инкубации 10°С активность глутамина-аы гомогенатов и синаптосом мозга гипотермированных (10 С) полного превьппает контрольные значения при той же температуре инкубации.

Поэтому, возможно, при гипотермии зимоспящих животных не выделяются ни медпаторная, ни метаболическая функции обоих ферментов .

-le-

ss. Глутаюшашшя и глуташшсинтетааная активность субклеточных фракций боль пси полушарий мозга в период гибериацни.

Результаты наших исследований (табл. 3, 4, рис. 4) по опр делению глутаминазной и глутаминсинтетазной активности в сина тосомах и митохондриях больших полушарий головного мозга гибе; нируювдх сусликов свидетельствует о том, что направленность и; менений активности исследуемых ферментов в динамике зимней спя' ки, в основном, имеет сходный характер. Разнонаправленные изм! нения обнаружены только в дремотном состоянии перед впадением вимнюга спячку (температура тела 19 - 23°C)j глутаминавная акти ность снижается, а глутаминсинтетазная увеличивается. На ос тал ных этапах , гибернации наблюдаются одинаковые изменения активно тей исследуемых ферментов в обеих фри. :;лях (табл. 3, 4, рис. 4 Оказывается, Что амплитуда колебания активности исследуем ферментов б окнаптосомах больше, чем в митохондриях больших п лушарий головного мозга спящих сусликов. ' !;:

Рагнонзправленкость изменений активности глутаминазЫ и гд хаминсинтетазы в мозгу сусликов, находящихся в дремотном; СОСТО: нии, возможно, является частью нервно-гуморального механизма р гулирования. температурного диапазона функционирования систем о ганиэма при вхождении .теплокровных .животных в тормозные состо ния. Этот мехак^ом включает в себя критические периоды "раска ки" и "пробных погружений" (Пастухов, Афанасьев, 1990), позвол ющие организму гетеротермов более плавно входить в состоян глубокой гипотермии (Wang, 1985; Пастухов, Афанасьев, 199D; Па тухов, Невритдинова, 1991). Эти состояния характеризуются пери дической сменой повышеьия и понижения общего метаболизма, в' т числе и метаболизма медиаторов различной природы (Heller et al 1978; Mangus, Henderson, 1988).Повышение глутаминсинтетазной снижение глутаминазной активности в синаптосомах коррелирует повышением уровня глухамина и ГАМК в синаптосомах, а такие акт вацией глутаматдекарбоксилазы в мозгу дремлюцих сусликов (Абду лаев, 1982; . Демин и сопвт., . 1988; Хочачка', Сомеро, 1988).' И вестш, что ГАМК и глутам^н выполняют функции тормозных медиат ■ ров и тлеют большое значение .в. регуляции процессов торможен при зимней спячте (Прохорова, 1979; Демин и соавт., 1984; JCyx . 1990).- ..- • '

Таким образом, совпадение изменений активности исследуемых фс) ентов и ГАМК, глутамата н глутамина в синаптосомах указывает на дгми ировавие медиаторной роли этих ферментов,которые регулируя содеяли ■ казаняых медиаторов в синаптосомах, участвуют в нейрохимических мели измах погружения сусликов в аимнш спячку._______________________

Таблица 3.

лутаминааная активность (в мкмоль И-Шз на 1 мг белка/ч,,) сн аптосом и митохондрий больших полушарий головного мозга сусли-ов при зимней спячке (п г 6-7; Мш)

Состояние •тавотного t тела, С Фр ак ЦИ Температура инкубации, °С

37 30 ... 20 j 10 5

Дремотное ^еред зпа цениам б :пячку „ 18-20 0 С М 18,32 t 0,0? 21,26 +* ± 0,14" 16,73 + GtG2 12,56 i \ 10,61 ±* к C,C3 J ± 0,15 4,87 ±* + 0,01 ..... ± 0,01

19,33 + * t 0,02 15,00 ± 0,03 11,38 +'" ± 0,17

1е дельная спячка! 10-11°С с 27,46 -г* * 0,27 22,26 + t 0,18 17,30 + 0,12 15,70 ±*~ ± 0,01 14,04 ± 0,01

м 27,43 + 0,24 24,90 +* + 0,01 19,80 ±* ± 0,17 18,23 ±* at 0,02 16,80 ±* £ 0,02

Желчная спячка 6-7°С о 15,65 1* ± 0,01 14,50 ±* ± 0,02 10x94 i¥ ± u, l2 8,70 ±* ± 0,01 3,21 ±* ± 0,02

и 17,56 ± 0,02 16.7b ±-\ 17,72 t* ± 0,01 j + 0,01 11,40 ±* ± 0,01 5,60 ±" i 0,17

3-х ме-. сачная спячка 5-В°С с 14,80 у" ± 0,0.1 13,73 ±' ± 0,01 10,40 .+ ± 0,07 8,76 ±4 9,89 ±'V ¿0,02 j ¿0,05

м 16,60 t 0,01 - 0,01 J 12,90 i i 0,02 10, ЬО i'M 5,00 ±* ±0,01 j ± 0,03

Повышение активности обоих исследуема ферментов как в си-ютсссжах, тая м з ».этгохоялпиру «плътих полушарий головного юга сусликов через ? дней после начала зимней спячки, по каким тныа,совпаг.аег - Сэ/ха. ьр- отмечено

)& Повышение активности обоих ферментов в исследуома* 13га.

Повышение глутаминазнои активности в синаптосомах, види-объясняется с точки зрения.необходимости большого количества утамата ¡иш " прил^птвенника

М (Демйи и сса?т. , 1588). р то ле вромл Бозресгани« г-гутг^--Н -ятехагвсй активности к атст г.зрнсл б еиваизосолззс, дег к Нсйтролпгггд!!* глутамата в сшшшдоснзд ц^ла

адский, 1990).

Рост акюавяоотя сйоих '^срмеа-сов я упгохоздчт /"-•-

шарий головного мозга спяших (7 дней) иус^ысса, вш»кур, участ»;ем продуктов реакций, катализируемых этюда ферментами, в ддерманки электрохимического потенциала мембран митохондрии Нз) и утилизацией глутамата в цикле Кребса.

- ..'гё-

Рис.4. Диаграмма изменений глутаыкяазвой (1) и глутамицсиитстазиой (II) актив! (в %% к контролю) в гомогепагах (сп), синаптосомаг (вз) & митохондривг больших полушарий мозга сусликов в пераод габернацин: а - дремотное состояние сзред

впадепнем и счячку 6-7 дией спячки в - 1 месяц спячки 1 г - 3 месяца спячки

1 оугамикс;:;;а^лнлосхь ¡,3 .-:'-!) си^-.гсеоы н у;:голсщрж б .. моэга_сус.тиксз яри спячю» 'п

¡А»яотного1ак ] перед ±5йа|

< I |

| ТТл пм и* «Ггч/ч 1 П

< ^ПП^Кск . ^

37 14, +"'

' ^ / VI:

йо

I 4,05 + ! 1;,59 : X 0;0л 1 + и,03

Таблица 4

гянэлт, "-КНз на ■;>.'■ лол^зриЛ - 6 -7; МСТ) 1 мг Аел- Г СЛОЙ Ч'-.Г о

НИгГ^О-''!^''!, °0 ------------!

-.........|

! <и | ¿и к : _______"_______I

3,12 + '1 '-',93 У,17" 1 +0,03 •1 75 Л 0.0Й | —-ж?

17 П? +

< . ^ ш I

1, |

58 ±

П П?

•-">,ис> У ! О.'ЗО > ± 'О А I ±0,01

10.03 ± | 7,80 ±

II » ш * Т II. '(/ ,

•"V

4,84

АО - 1X и ч 16,04 ± 0,07 14,13У .Ь 0,01 9,36 +" + 0,02 7,50 ¿Г ±. 0,10 5,00 ±. 0,02

Месячная спячка 6-7°С г; 8,96 +*" + 0,024ч 7,92 ±п Л 0,01 5,90 ± ± 0,01 3,К4 + + 0,01 2,31 + ± 0,01

И 11,79 +* + 0,02 8,88 ±* + 0,01 6,88 ± ± 0,01 3,90 ±* ± 0,01 2,25 ± Л 0,10

! ; ■ ' Ь " М _ _ _ О 0( ( л. 7 Я1 + г 6~П2 п.гл ** 3.57 ±" .!■ 0,01 ■ 2,00 ±

1 ••> -I 1 0,01*

". ГО ■ 0, и 2

••'•'•с5.;' »»таболягма глутамина ч пииоптисомзу н

ГаЧ .л и уичгляции ;т8теох£Ч*й«оскпх ц ^ •">•*

Обнаруженное наш поншепие

Г-

тааной активности в исследуемых фракциях больших полушарий го-

■ .- Юс'Н СуСл'.'ь-.Од \jpii Г-йУиОКОа ЛИ^'.ч к.ил~

осьл айиспьих ср^дессоа а эта ¡"кнюлы гк^оном^и V '<»>.*р>->т1*1>1. животных (Кадабухов, 1985-, Демин и соавт., 1988-, Хочачка, Соме-ро, 1988). В эти сроки гибернации у сусликов обнаруживается отрицательная температурная зависимость глутамйнаэной активности д яичнаяпне темпе сатур инкубации 5- Ю°С.

'■¡'¡¡7<.тг,--,'.; ч глутпмчтр. р г тг-'п г>' • •<■ *••

ахсшах огшасп ОИйЧкй ВЛОЛИТ И Ни Ш&Ы'^Х ЛКЧ'ИВИОСТЬ С1К;Г"г<м ОТ!" •ЮСг-'Д1 '•'•. !1 СЙЧ^НЬЧИ-'а ЬЧМВЗГЛ. ""-■"-"Г! Т!,?'"!^."; Я.З. Рммр^виплл и ?, А. •'•'•дуллаевп (1987), исжс прнватУить, что гдутямтз* и в иссдздуемых фракциях мозга учьствуэт а регуляции соотношения медиаторного и метаболического пулов нейроак-тлвннх аминокислот в мозгу сусликов в этот пэоиод гиберяэдки.

и • о*.

В4. Тошшратурная зависимость гдухашишиаД ь.;тшногси то-иогенахоа к шшапхосан Солышх полушарой головного мозга прИ гипотермии и зииной снячко

Особое значение в представленных данных, на наш взгляд, имеет отрицательная температурная зависимость глутанинааной ак-тиьности синаптосом больших полушарий головного мозга, обнаруженная при гипотермии у крыс и сусликов, и при зимней спячке (рис. 5 ). Подобное явление впервые обнаружено в нашей лаборатории (Эмирбекоа, Мейдзнов, 1982). Исследования проводились на го-ыогенатах, а аномальный участок глутаминаэной активности проявлялся у гипотерыирозашшх (20°С) крыс в диапазоне температур инкубации ш-ао°о. Автора пришли к еокдсачешво* о том, что при гипотермии происходит изменение физико-химических свойств молекулы глутаминазы. При этом изменение активности фермента происходит вследствие конформацисшиаго перехода субъедшшц при и:: олигоме-рПоаЦИИ, так К2К И Б ПрнСуТСТБПи СираХНОГи буфера (З'у'бГЛиЬу,

1972). предполагают, что »шекно температура является фактором,

надуиуфукщУйл кокформзхцюь'ный переход ¿ерые-нта, к увзлпченш ак-тканоетк гдуташказы обеспечивает синапс достаточным количеством медиатора.

Исследования, проведенные нами, нодхьбркдавт эта предполо-Во-первых, б опытах по определенна глутаыиип.жой активности ь динамике гипотермии от 30° до 10°С обнарулишиотся проявление участка отрицательной температурной вависвности при гипотермии 20 и 1б°С у крыс, 10°С у бодрствуют оуел;:;;оь, п 7-Б°С прк йимаен спичке. При атом наблюдается сиез;-зние участка отрицательной 'температурной зависимости в сторону более ьизкю: темпи-ратур,соотЕотствуюпйх температуре тела кпйотисго.

Во-вторых, проявление указанного здагаа только в гомогвна-гнх и синаптосомах, но не ь митохондриях, свидетельствует, Еоа-могко, о преобладании в экса рема/а пых условиях гл-'-итгаесной ¡{.ункшш глутаминазы, направленной на поддержание филологической актпьностк сиьанссв.

Тог факт, что в матокондриальной фракции больших полушарий головногр мозга и крыс, и сусликов не обнаруживается аномальный участок глутаминаэной активности, возможно, свидетельствует в

- 2 4 -

/

/ //

i Л/ * » 0

S у

W

-i-«-1—

10 70 43

. t инк., С

10 >1 л" Î0

гтш t инк., С

/

А

I

25-

:Э 30

. ¡-Í и

> ... T.ívrw.wT*. 11 о г 1 ¡I п гомогена-

:.;-,•,! № im i г,-m?".) r->r'- 1

тпптгряия КР'Г',' I Ij И суСЛИЛир (¡1* II niMl ¿HJ<ib¿ñ Aiiiút

1 ~ ПШОГЕрНПЯ 29° С

2 - гипотермия 1S°C

3 - тпотсрмия 10° С t

" : ■ г : - 'í MÍ: H Т-.-лм il™ tî'CÏ

пользу имеющихся различий штохондрнг^.пс!. 1 '.хсс-ггльноп формами глутамикааы. Различия в кинетичесч. • и рогудяторнц}: свойствах сиааптосошлькой и митохондрнадъьой глутамздаз отмечали и другие авторы (Оганесян и созвт., 1934; Мартыи-гика, 1987; Ward, Bradford, 1973; К1мо, Tipton, 1979; Kva№,e, Olsen, 1381; Koser et al., 1985; Cooper, Plum, 1987). Возмодно, sw связано со спецификой бело:-:-липидных взаимодействий -мембр^огшпзанной Форш фермента в иссхэдуемь-х фракциях (V/ohlhueter el г-,., 1973; tUimo, Tipton, 1979; Кз/й:ше, Olsen, 1981; Bradford el al., 1984; Hoser et al., 1985; Kvairflie et al., 1991).

Таким образом, на основании наших и литературных данных (Абдуллаов, 1982; Эмироеков, Львова, 1985; Дзмин п соавт., 1933; Хочачка, Соыеро, 1233; Ху;;:о, 199Q; Кулинский, Ольхоеский, 1992; Ward, Bradford, 10?9; Cooper, Plum, 198?; Svenneby, Torgner, 193?) можно заключит!., что в организме гомойо- и готеротершшх аивотных при искусственном охлаздошш склздц^аэтеа различные со отношения в системе &'.:млак-глутаминозйя кислота. Эю проявляется us только в различии* изиэнениях уровня аы.мшча, глутг.мата, гду-ташша и ГАИК, но и к различной динамке активности ключ&вых форис-ктов метабол$5з::а медиаториых аквкокиедот - глутамины-ы и гсутаминсинтетазы - i. митохондриях и сньйзтосомах болызих полу-ьары"! голоыюго иозге. В атом, возмешге, проявляете?; различно адаптивных реакций гоиойо- и гетеротершого органик...:;:: аа дэйс-тЕие холода. -В то с время сходство (нашш-э отри«'. ;.-.ной температурной зависимости гдутаминазиой шшшколуи ь wicrekutsx и синаптосомах), проквл;аа1г;оегп при охлаэде ш:п opi опи&г:.,. мщотвль-ствует со эволюционной преемственности гс-мпературиой

компенсации на уровк« клачевих фермэитол с«.згсш ос.юбо;::донкл и связывания аммиака.

Что касас-тся различия: ^ушещюаировлип;.: 1<мутш.ги1..ж в глуче мшюпнтетазы в зависимойш от их лскшц:ззц-и;, - vo шз

взгляд,при пшегеруш: к эй'шей спичка пса;Зод&у С.' ¡¿жьъуо &зз;гх!Ы'Л1 «йлязлгег; дем-здэииз здиикнос-ш {гсеадучизд .-• ггол i-ешэдгосснгшшй Оохлъкх полушъркИ гасогког"

еьйода

- -----1. Определены активность и температурная зависимость азс;ив-

•ности глутаминавы и глуташнсинтетазы синаптссом и митохондрии больших полушарий головного мозга крыс в динамике гипотермии и последующего самосогревания.

На иачалььых этапах охлаждения'(30°С) в исследуемых фракциях иовгь крыс' яаблвдэлтся разяопаправгокт» ий'сггстп'л гдутамя-пазной и глуташшскятетазнрй активности: глутшлипазнзя ¿ошва*? • • ся, а глутаыинсинтетазвая снижается. На Солее поздних этапах ги-

пт'йпиИй сл!. '¿ГС, .аКХжЫНмиХЬ СС^и^ .

2. Бссстаноаление глутаминавкой и г^иы^шс^июгсспс::: пп тивности сшаптосом и митохондрий больших полушарий головного мозга после самосогревания происходит у крысюхлглденных до 30°С И 25°С сразу, до 20°С через сутки й до 15°С через 3-е суток.

3. Обнаружено, что4глутвмипсинтотазная активность з скнапто-сомах и митохондриях больших полушарий головного мозга сусликов в динамика гипотермии повышается. Глутаминазная активность в

йбО!{Х МСЗГО ПИ ¿ТМИ! ОлЛЗ.гДгНПЯ ГС°С ЯЭ ЯС~

мэняотся, <1 при 'пптсзтериии 20 и 10°С поштааотся .

-1, 7с Г2ЛОПЛСНО, что "с время зпгаей о'-ичкн направленность -з!"/;;г>коС'г;: ^сслэдуемых £рг«~.нтов аготлсхсго '"¿¿зСзл^г->дг, козга еусзшп кисзт, з основном, сходный характер. Гаггъоайл-•.;шлеипн-' з'еттопостп глуташшааы к глутаминсиях*газа

г-Звару&т. • .ь,тся тодако. в дремотном состозпли перед ¿падением в гкшя спяч\т/ (температура тела 19-23°0): гдухаминаэная ^ктихз-иссть спивается, а глутаяшсинтетазная активность увеличивается. т-7*?п'?я нгдсж' госл'; ;чг^ла слячш! С^мператт^а тслз, а:-

тганссть оЗоих ферментов превышает контрольный значения, п а 1-л п 3-шслчннэ сроки-гйберпации (температура тела 5-7аС) активность исследуемых ферментов падает.

■-". 1 я» У 1фыс при гипотермии 20 и 15°С, у сусликов при гклотер-. шш 10°С п в период 1-й а 3-месячный срс-ет зшлней спячки в гсмо-гэкахах а сшшптоссщх больших полушарий головного мозга обнару-якзЕзтст отрицательная температурная эавне1240СТ5 глуташназной шккеиости при температуре гшкубацпи соот^егствухщей температуре тела подопытного дивотного.

- 24 -СШЗС8К ПУБЛИКАЦИЙ

1. Авшалумов 11. В. Глутаминсинтетазная и гдутаыиназная активность

иоага при искусственной и естественной охлаждении организма.// Тезисы науч.конф. "Организованный мозг". -Ы,: НИИ мозга РАМН. - 1993. - С. 38.

2. Авшалуыов М. В., Эмирбеков Э.З. Активность ферментов метабо-

лизма глутамина в больших полушариях головного мозга крыс и сусликов в динамике гипотермии и после самосогревания.// Центр научно-технич. информации РД. -Махачкала. - 1994. - 21 с.

3. Авшалумов и.В., Эмирбеков Э.З. Глуташшааная и глутаминсинте-

тазная активность больших полушарий иоага сусликов в динамике зимней спячки.// Центр научно-технич.информации РД. - Махачкала. —1994. ~ 7 с.

4. Авшалумов К.В., Эмирбеков Э.З. Влияние гипотермии и последую-

щего самосогревания иа глутаминазнуп и глутаминсинте-тазную активность моага крыс и ^сусликов. - Деп. в ВИНИТИ 20.06.94. № 1261 - В 94. Б, Авшалумов Ы.В., Эмирбеков Э.З. Глуташшааная и глутаминсинте-тааная активность тканей головного моага при гипотермии и зимней спячке.// Известия вузов. Северо-Кавказский регион. [Естественные науки] . - 1994. - N1-2.; 7 С. 112-116.

Формат 60x90 I/I6, Заказ .4 55. Т1фаа 175.

Типография Дагестанского научного центра РАН .367016;.г.Махачкала, 5-Й поселок, корпус, 10