Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Роль системы циклического аденозинмонофосфата и синаптической активности нейромедиаторных аминокислот в механизме действия переступня белого

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Роль системы циклического аденозинмонофосфата и синаптической активности нейромедиаторных аминокислот в механизме действия переступня белого"

Р Г Б ОД

НАЦИОНАЛЬНАЯ АКАДЕМИЯ НАУК АРМЕНИИ , лги .-.-ИНСТИТУТ БИОХИМИИ им. Г.Х БУНЯТЯНА

На правах рукописи УДК 577.25:577.125.82

КОЧАРЯН НУНЕ ВЛАДИМИРОВНА

РОЛЬ СИСТЕМЫ ЦИКЛИЧЕСКОГО АДЕНОЗИНМОНОФОСФАТА И СИНАЛТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ НЕЙРОМЕДИАТОРНЫХ АМИНОКИСЛОТ В МЕХАНИЗМЕ ДЕЙСТВИЯ ПЕРЕСТУПНЯ БЕЛОГО

03.00.04 - биохимия

Авто реферат

Диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Ереван - 1994

Работа выполнена в лаборатории возрастной нейрохимии Института биохимии HAH Армении (директор - академик HAH Армении, профессор A.A. Галош)

Научные руководители; доктор биологических наук, профессор Г.В.Априкян, кандидат биолошчсских наук, старший научный сотрудник А.Г. Априкян

Официальные оппоненты: член-корреспондент HAH Армении, профессор К.Г. Карагез»!

/октор биологических наук, профессор М.М. Мелконян

Ведущее учреждение - Ереванский Государственный Зооветеринарный институт

Чащита атгщйтси" " 1994г. в ч. на

заседании специализированного совета Д 005.15.01 при институте биохимии НАМ Армении (375044, г. Ррсван -44, ул. 11. Севака 5/1). Автореферат разослан " " 1994г.

С диссертацией можно ознакомиться и библиотеке Института биохимии НАН Армении. . .

Ученый секретарь специализированного совгга, доктор биол. наук, профессор

А А. СимоняаГ:

Цель и задачи исследований. Целью насгояцего исследования жилось изучение роли системы цАМФ, синтеза белка и ДНК, синоптической активности нейромедиаторных аминокислот в молекулярно-биохимических механизмах действия переступня белого. Для выполнения этой цели перед нами были поставлены следующие задами:

1. Изучит» особенности действия переступня белого на систему цАМФ (уровень цАМФ, активность аденилатциюнзы и протсинкиназ) в мозге белых крыс.

2. Выявить возможную роль переступня белого в синтезе белка и ДНК.

3. Исследовать действие переступня белого на зысокоафинный (high affinity) зс.хват нейромедиаторных аминокислот синаптосомами головного мозга белых

крыс. *

4. Изучить особенности действия переступня белого на высвобождение нейромедиаторных аминокислот из синаптосом головного мозга белых крыс.

5. Определить аминокислотный состав корней переступня белого.

Научная новизна н практическое значение работы. В настоящей работе впервые было исследовано влияние экстракта переступня белого на систему цЛМФ, синтез белка и ДНК, на синаптическую активность нейромедиаторных

аминокислот.

Доказано, что под влиянием переступни белого значительно увеличивается уровень цАМФ, стимулируется активность аденилатциклазы, цАМФ-зависимой и цЛМФ-независимых протсинкиназ в мозге белых крыс.

Установлено, что переступень белый счимулирует синтез белка в препаратах мозга и синтез ДНК в MDCK культуре эпителиальных клеток почек собахи.

Показано, что под влиянием переступня белого значительно подавляется захват '*'С-ГК,'4С-АК и 14С-ГАМК синаптосомами головного мозга как в зрелом, так и в л;,песком возрасте.

Исследования показали, что переступень белый одновременно симулирует К+-вызванно? высвобождение 14С-ГК, 14С-ДК, 14С-ГАМК синаптосомами головного мозга белых крыс как в зрглом, так и в старческом возрасте.

Полученные результаты позволяют заключить, что в молекулярко-биохимических механизмах действия переступня большое значение имеет активация системы цАМФ, синтеза белка и ДНК, стимуляция синаптаческой активности нейромедиаторныхаминокислот.

Существенное теоретическое и практическое значение имеют результаты наших исследований относительно возможностей регуляции синаптической активности нейромедиаторных аминокислот как в зрелом, так и старческом возрасте. Открываются большие перспективы направленной коррекции, нарушений этих процессов в головном мозге, особенно при старении.

Апробация работы. Материалы диссертации представлялись на Всесоюзной конференции "Продолжительность жизни: механизмы, прогнозы, пути увеличения" (Киев, 1991), на Всесоюзной конференции "Прикладные аспекты молекулярной биологик" (Самарканд, 1991). на 1-ой Катсъкой конференции п-

проблсме геронтологии и гериатрии (Тбилиси,1992), на Всесоюзной конференции "Ускоренное старение, связь с возрастной патологией" (Киев, 1992), на конференции по современным проблемам фитотерапии и традиционной медицины (Ереван, 1993), на симпозиуме "Биологические механизмы старения" (Харьков, 1994) и на межлабораторном семинаре в институте биохимии HAH РА (1994).

Публмсацн. По материалам диссертации опубликованы 2 статьи и 6 тезисов.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из общей характеристики работы (введение), обзора литературы, состоящего из трех разделов, описания методов исследований, результатов исследований и их обсуждения, выводов и списка литературы.

Работа изложена на 112 страницах и включает 4 таблиц и 16 рисунков. Библиографический указатель содержит 217 ссылок на работы отечественных и зарубежных авторов.

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Исследования проводились на белых крысах-самцах популяции Вистар массой 150-200г. Крыс декапитироват, извлекали головной мозг (без мозжечка), . удаляй кровеносные сосуды и готовит соответствующие препараты.

Определение уровня цАМФ

На л>ду готовит 10% гомогенат головного мозга крыс в стеклянном гомогенизаторе с тефлоновым пестиком (8 строков при 800 об/мин) в 10 мМ тряс-буфере, pH 7,4, содержащем 0,32 М сахарозы. Белок определяли по методу Лоури и соавторов (Lowry et aL, 1951) в модификации Хесс и Левина (Hess, Lewis, 1965). 1мл гомогената (1мгЛчл белка) инкубировали в водяной бане (37°С) . при непрерывном перемешивании с возрастающими концентрациями экстракта переступня белого в течение ЗОмин., или же различное время в случае изучения временной зависимости. Для фиксации уровня цАМФ аденилатциклззную и фосфоднэстеразную активности ингибироват кипячением реакционной смеси в течсаие 2 мхн. Затем образцы гомогенизировали на льду в стеклянном гомогенизаторе со сгеклшным пестиком (10 строков при 800 об/мин) и центр« фугяроваж в течение 15 мин. при 16000g. В супсрнатан те определяли содержание цАМФ используя биохимический набор ("АЛГА", Ленинград).

Опреявюс «дгяаяяцмаивпД активности

Активность адвяидпцнкдвзы определят количеством продукта рсакции-цАМФ. РаапДч.цЛМФ предотвращался добавлением к системе ингибиторов фосфодеэлеразы.

Образцы готовили следующим обраэоМ: к 1 мл гомогената мозга (2 иг/мл Оелка) добавляли АТФ-регенсрирующую систему, состоящую из равных объемов креатинфосфата и креатинкиназы, 2 мл дистиллированной воды в случае определения батальной активности или 2 мл экстракта переступня в случае определения модулируемой активности, 2 мл АТФ, и ингибитор фосфодиэстеразы циклических нуклеотидов. Реакционную смесь инкубировали в аодяюй бане (32°С) при непрерывном перемешивании в течение 15 мин. Реакцию останавливали кипячением в течение 2 мин. Содержание цАМФ определят как указано выше.

Определение цротенякнназной активности

Для определения про теин киназной активности мозг (без мозжечка) гомогенизировали в микрогомогенизаторе (сгсюю-стекло), используя 50мМ HEPES-буфер , рН 7,6, из расчета 2мл буфера на 0,1 г свежей ткани. Гомогенат центрифугировали на холоду 5мин при 10000 g и использовали супернатант.

Реакцию фосфорилирования проводили согласно методу Нестеровой и др. (Нестерова MB. и др., 1987) с некоторыми модификациями.

Определение синтеза белка

Для определения синтеза бежа использовали метод Неуперта (Neupert W., 1967). Мозг гомогенизировал! в стеклянном гомогенизаторе с тефлоиовым неетаком (8 строков при 800 об/мин) в 15 мМ К-фосфатном буфере, рН 7,6, содержащем 0,25М сахарозы, 20мМ КС1, 12мМ MgCl2 и 2мМ ЭДГА. Инкубационная смесь (1мл) содержала 15мМ КН2РО4, рН 7,6, 0,25М сахарозы, 2<ЫМ (CCI, I ОмМ MgCl2, 1мМ АДФ, 2мМЭДГА, 0,02% бычьего сывороточного альбумина, 0,188 мг/мл смеси аминокислот, 6 мг белка, 2 мкХи 358-метионииа и различные концентрации экстракта переступня белого. Образцы инкубировал! при 32°С н течение 40мин. при непрерывном перемешивании. Реакцию останавливал:, перенесением образцов на лед, К образцам добавляли охлажденную ТХУ до конечной концентрации 10%, образцы переносил! на филлры Whathman ЗММ и промывали еще 15мин. 5% ТХУ. Филлры сушилг при комнатной температуре и радиоактивность измеряли во флаконах с толуоллым сцинтиллигором на счетчике CG-40 (Intertechnique), Франция

Определение синтеза ДНК

Исследования проводились на МДСК культуре эпитсл(ал>ных клеток почек собаки. В соответствующие пробирки переносили клетки (4x10* клеток на \см?) в мивимал>ной среде Игла (МСИ) (Eagle. 1959) без эмбрионал>ной сыворотки теленка и оставляли при 37°С для образования монослоя клеток. Через 48 часа в соответствующие пробирки добавляли экстракт переступня в МСИ в присутствии или отсутствие 10% эмбриональной сыворотки теленка. Через час добавлял! 3Н-тамидин (25 мкКи/мл) и инкубировали 24 часа при 37°С От субстрата

-S-

монослой клеток отделяли трипсинизацией-0,25% трипсин и 0,2% версен в фосфатно-солевом буфере (ФСБ) Дюльбекхо (Dulbecco R, 1969). Суспензию клеток переносили на фильтры Wathman ЗММ и промывали: 1) 5мл холодным ФСБ (дважды), 2) 5мл холодной 5%-ной ТХУ (4раза), 3) 5мл абсолютным этанолом (дважды), 4) 5мл ацетоном (дважры)- Фильтры сушили при комнатной температуре и радиоактивность измеряли во флаконах с толуольным сцинтилпяпором на счетчике CG-40.

Определение высокоафинного захвата нейроыеднаторных аминокислот синап то сомами головного мозга белых крыс

Очищенную фракцию синаптосом из головного мозга белых крыс получали по методу Хайоша (Hajos, 1975).

Определение высокоафинного захвата аминокислот по методу Хена и Хамбергсра(Наш, Hamberg er, 1971) проводили в инкубационной среде, содержащей 10"5М немеченой аминокислоты, 0,05мкКи/мл соответствующей аминокислоты, 10~SM аминооксиуксусиой кислоты (АОУК) в качестве ингибитора трансминирования На каждую пробу брали по 0,1мл суспензии синаптосомной фракции, содержащей ЮОмкг белка. Объем инкубационной среды доводили до 1мл средой поглощения, в качестве чего использовали модифицированный буфер Кребса-Генселайта (Wheeler, 1979).

Определение высвобождения нейромеднаторных аминокислот из синаптосом

Высвобождение нейромедиаторных аминокислот изучали супгрфузионмым методом Райтсра и сотр. (Raiten etaL, 1974). Радиоактивность 14С-аминокислот в пробах определяли методом жидкостного сцинтилляциониого счета (Bray, 1960). На каждую пробу брали по 125мкл синаптосомной суспензии, соответствующей 1,5-1,7мг белка. Общий объем инкубационной . смеси составлял 2,5мл Содержание белка выряжали в мг/мл синаптосомной суспензии. Величину' высвобаждения-f выражали как отношение радиоактивности в перфузате к общему количеству радиоактивности в данный момент в синаптосомах (Hopkin , Neal,-1971).

Обработку полученных результатов проводили методом вариационной статистики Фишера-Стьюдента (Оивин, 1960).

Определение аминокислотного состава корней переступня белого

Аминокислотный состав корней переступня белого определяли аминокислотным анализатором.

А наличие в корнях ГАМК определят флуоримсгричсским методом (Lowe I.P. etaL, 1958).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Влияние переступня белого на систему циклического аденознвмонофосфата

Для выяснения роли циклических нуклеотадов в механизме действия переступня белого, нами было исследовано «го влияние на систему цАМФ.

Проведенные нами исследования показали, что экстракт переступня белого значительно увеличивает количество цАМФ в головном мозге белых крыс (рис. 1). Как видно из рисунка, дозозависимости действия имеет колэколообразный характер с максимальным уровнем цАМФ, соответствующим концентрации экстракта 1 мг/мл. От этой концентрации экстракта количество цАМФ увеличивается на 62%. С дальнейшим увеличением концентрации экстракта в инкубационной смеси эффект постепенно снижается.

Как было указано выше, переступень содержит ряд физиологически активных соединений, в том числе и некоторые жирные кислоты (Panossian et aL, 1983). С целью выяснения участия фракции жирных кислот в наблюдаемом эффекте мы трижды экстрагировали жирные кислоты равными объемами хлороформа и этилового эфира последовательно в течении 5 минут. Результаты исследования показали, что жирные "кислоты не имеют существенной роли в указанном эффекте.

Затем мы изучили временную зависимость влияния переступня белого на уровень цАМФ. Установлено, что временная зависимость имеет 2 четко выраженных пика. Один из них соответствует 1 минуте инкубации, а другой-30 минутам инкубации, что является характерным для временной зависимости влияния рядов гормонов и нейротрансмиттеров на уровень цАМФ (Langan Т.А., ! W>; Burga! M.. 1982).

Наблюдаемое действие экстракта на уровень цАМФ может быть обусловлено либо сш мутированием активности аденилатциклазы, либо ингибированием активности фосфоди эстеразы циклических нуклеотадов. Результаты этих экспериментов суммированы на табл. 1. Из представленных данных видно, что батальная активность аден и ла?циклазы составляет 14,36 пмоль цАМФ мг белка х « мин.1, что хорошо согласуется с литературными данными (Scamon P., Padgett S.. 1981;. При добавлении к инкубационной смеси экстракта переступня -в концентрации 0,5мг/мл активность аденилатциклазы составила 32,25 пмоль цАМФ/ mi' белка х мин.1. При концентрации же экстракта 1 мг/мл активность фе рмен га ока ы-к.а, равной 24,53 пмоль цАМФ/ мг белка * мин."1.

Таким обраюм экстракт переступня' белого в концентрации 0,5мг/мл и 1 .(/мг/мл стиму.ти рус г активность аденилатциклазы головного мозга белых крыс на 12 5% и 70%, соответственно.

Такое действие экстракта обусловлено, возможно, присутствием в нем тормоноподобных соединений, в частности, гликозидами кукурбитацинов, имеющими структурное сходство с глюкокортикостероидами.

К ¡несто, tri действие цАМФ в эукариотических системах опосредуется через цАМФ-ависимые протеинкиназы (KuoJ. and GreengardP., 1979) , которые

Рисунок 1.

Влияние переступня белого на уровень цАМФ в гомогенате мозга белых крыс

Таблица 1.

Влияние переступня белого на аденилатциклазную активность головного мозга белых крыс.

Условия опыта Активность аденилатциюизы пиюомоль цАМФ/мг белка х мин.-1 % активации

Контроль 14.38 ♦ 0.14

Переступень 32.25 1 1.45 1254

0.5 мг/мл р < 0.01

Переступень 24 53 4 1.55 70%

1 мг/мл р<0.01

Таблица 2.

Влияние переступня белого' на синтез белка мозга крыс по включению метки ^Б-метионина (ерт/мг белка)

Контроль Гомогенат Без ядерная фракция

2559'1139.5 6899 4 198.9 +169.6 % р < 0.001 16191 11809.0 + 533 "X р< 0.001

играют ключевую роль в регуляции клеточной активности (Nesterova М,, 1982). Исходя из этого логическим продолжением работ явилось исследование протеинкиназной активности мозга.

Нами было исследовано три вида протеинкиназной активности: общая, цАМФ-независимая (в присутствии специфического ингибитора цАМФ-зависимой протсинкиназы) и цАМФ-зави симая протеинкиназная активность (в присутствии цАМФ).

Установлено, что переступень повышает активность как. цАМФ-зависимых, так и цАМФ-независимых протеинкиназ. Экстракт в концентрации 1мг/мл стимулирует общую протсинкиназную активность на 129%, 5мг/мл-на 285%, 1 ОмгЛ<л-на 265%

Как. видно из рисунка 2, экстракт в концентрации 1мг/мл, 5мг/мл и 10мг/мл повышает активность цАМФ-зави симой протсинкиназы на 133,3%, 251%и 209%, соответственно. А его стимулирующее действие на активность цАМФ-независимых протеинкиназ более выражено и составляет 2 05%, 386% и 291 %, соответственно.

Влиявнсие экстракта переступня белого на синтез белка и ДНК

Таким образом, наши исследования показали, что экстракт переступня значительно повышает уровень цАМФ и протсинкиназную активность головного мозга белых крыс.

Имеющиеся литературные данные о том, что изменение протсинкиназной активности коррелирует с экспрессией или изменением уровня жспресси рада генов, которое фиксировалось обнаружением соответствующих изменений в спектре синтезированных белков (Nesterova М., 1982; Вопеу С., 1983) и что в бесклеточной системе цАМФ повышает включение меченых аминокислот в белки и стимулирует процесс трансляции (Schotman Р., 1980), а также полученные нами результаты дали нам основание допустить, что переступень белый > может оказать влияние на синтез белка и нуклеиновых кислот.

Поэтому представлялось целесообразным изучение влияния экстракта Bryonia alba на синтез белка мозга белых крыс.

На таблице 2 представлены результаты наших исследований. В присутствии экстракта переступня в концентрации 5мг/мл наблюдается значительное увеличение синтеза белка мозга. Включение 355-метионина в белки стимулируется на 169,6%. При этом оптимальная концентрация экстракта совпадает с максимально эффективной концентрацией в экспериментах по его стимулирующему действию на протсинкиназную активность мозга.

Поскольку синтез белка осуществляется в основном в цитог.лазматичееккх образованиях (микросомы, митохондрии), то было интересно изучить этот эффект в системе, не содсржающей ядра. С этой целью ядра осаждали центрифугированием гомогената при 1500g в течение 20 минут и полученный супернаяант исследоват в аналогичной системе синтеза белка. Концентрационная зависимость вяинмя экстракта па синтез белка дает картину, сходную с кривой зависимости синтеза белка в системе с использованием исходного гомогената.

/2 H H

ЛН

9

2 6

s

I 5

o-> о

î-N!

1 1 кчтнмулированпая ж'тиностъ

2. ' 11срсстуткнь 1 мг/мл

3 - Переступень 5мг/мл

/

4. ^Переступень 10мг/мл

/ г з ь

ЙиТие переступня белого на цАМФ-завио-мук, „ротгинкиназную «оивносп, в головном мозге белых крыс.

7

2

Интересно, что в этом случае максимальное включение ^S-мсшонина в белки, наблодаемос при концентрации экстракта 5мг/мл, значительно превышает уровень включения метки в белки, синтезированные в гомогенатс мозга, и составляет 530%.

Обнаруженный эффект переступня белого может являться следствием активации таких процессов, как репликация и/или транскрипция

По данным литературы переступень белый вызывает ярко выраженную активацию клеток соединительной ткани, что проявляется увеличением функции фибробласгов в репаративкых процессах и стимуляцией репликации ДНК (Hahn G., Patt F.,1963). Для выяснения возможного влияния на генетическую активность, мы исследовали его влияние на синтез ДНК в MDCK культуре эпителиальных клеток почек собаки (рис.3). Результаты исследований показали, что переступень в концентрации 2,5x10"5мг/мл стимулирует включение ЗН-тимидина в ДНК на 192,5%, а в концентрации 2,5x10-^мг/мл-на 117,9%. Данные рисунка показывают, что сыворотка зародыша крупного рогатого скота (FCS) стимулирует включение 3Н-тимидина в ДНК На этом фоне экстракт переступня в концентрации 2,5x10"5мг/мл стимулирует этот процесс на 82,3%, а в концентрации 2,5x10"4мг/мл-на 59,8%. Таким образом, наибольшее стимулирующее действие переступня на синтез ДНК проявляется в отсутствие FCS.

Влияние переступня белого на высокоаффинный захват нейромедиаториых аминокислот сииаптосомами головного мозга белых крыс при старении

Известно, что после высвобождения' нейромедиаториых аминокислот из синаптических окончаний, их взаимодействия с соответствующими рецепторами, происходит обезвреживание нейромедиаторов посредством высокоафинного захвата.

Важнейшим звеном в механизме действия НМЛ является высокоаффинный захват НМЛ. из синаптической щели нервными окончаниями-наиболее эффективное средство терминации синаптической активности медиа-горных аминокислот. Высокоаффинкый захват НМЛ является точкой приложения многих фармакологических и физиологически активных веществ, что в свою очередь, открывает широкие перспективы в поиске соединений, направленно регулирующих активность НМЛ.

Представляет значительный интерес выявление особенностей высокоаффинного захвата НМЛ в терминации их синаптического действия при старении. ,

Так как корни переступня белого содержат ряд физиологически активных веществ, то представлял большой интерес изучение действия переступня белого на эахвэтгНМЛ сииаптосомами головного мозга белых крыс при старении.

Известно, что при старении значительно снижается обратный захват НМЛ сииаптосомами головного мозга (Априкж и др., 1984), а также снижается способность постсияаптичеасЕХ рецепторов к взаимодействию с НМЛ (Govani et .<W 1980). Известно также, что под действием переступня захват 3Н-норадрсна-

^ 30

30

•

оГ

О!

^ г з

Ос

1 .Контроль

о-Г 2 - Переступень 2,5х 10"5 мг/мл

Переступень 2,5» 1(И мг/мл

4.10% ЯСЯ

У10% РС5 + переступень

2,5* 10-5 мг/мл

6.10% РС5 + переступень

2,5* 10"4 мг/мл.

Ч 5 В

Рисунок 3.

Влияние переступня белого на синтез ДНК в МОСК культуре эпителиальных клеток почек собаки по включению метки ЗН-тамидина.

- н-

ли на нервными окончаниями в старческом возрасте ослабевает на 63%. Было

показано, что при старении снижается также и захват 3Н-серо тонина (Арменян и др., 1993), а обратный захват 14С-ГК и 14С-АК синаптосомами снижается при старении соответственно на 24,7% и 32,1 % (Априкян Г.В. и др., 1987).

Наши исследования показали, что захват 14С-ГК синаптосомами в присутствии ' разных концентраций переступня белого снижается как в зрелом, так и в старческом возрасте (рис.4). Оказалось, что этанольный экстракт в концентрации 5мг/мл подавляет захват 14С-ГК зрелых и старых животных соответственно на 86,7% и 85,7%, в концентрации 10мг/мл-на 93,3% и 91,4%, а в концентрации 15мг/мл-на 95,6% и 94,3%, соответственно. Экстракт переступня в концентрации 5мг/мл подавляет захват *4С-АК синаптосомами в зрелом и старческом возрасте на 83,1% и 87,5%, в концентрации 10мг/мл-на 93,9% и 87,5%, а в концентрации 15мг/мл-на 93,9% и 89,3%, соответственно (рис.5).

Высокоаффинный захват 14С-ГАМК синаптосомами головного мозга белых крыс также снижается в присутствии разных концентраций переступня белого (рис.6). Этанольный экстракт в концентрации 5мг/мл подавляет этот процесс у зрелых и старых животных на 83% и 85,1%, в концентрации 10мг/мл на 93,7% и У2,9%, а в концентрации 15мг/мл-ооответственно на 95,7% и 97,6%.

Для выявления роли этанола в действии зганольного экстракта переступня на захват НМА, мы исследовали действие "водного" экстракта переступня на захват ,4С'-АК и ^С-ГАМК синаптосомами головного мозга крыс.

Исследования показали, что "водный" экстракт переступня в концентрации ^мг/мл подавляет захват 14С-АК на 83,6%, в концентрации 10мг/мл-на 91,8%, а в концентрации 15мг/мл, на 94,5% Подавляющее действие разных концентраций переступня на захват 14С-ГАМК составляет 87,5%, 95% и 97,7%.

Полученные данные показывают, что по своему действию этанольный и "йодный" экстракты переступня отличаются незначительно, тоесть этанол не оказывает особого действия на затеат НМА синаптосомами головного мозга белых крыс.

Для выявления роли жиров и жирных кислот в действии "водного" экстракта переступня белого, мы их экстрагировали из экстракта.

Исследования показали, что этот экстракт в меньшей степени подавляет захват 14С-АК синаптосомами, для которого величины захвата для 5; 10 и 15 мг/мл составляют 67,9%, 77,4% и 87,7%, соответственно.

Таким образом, жиры и жирные кислоты имеют некоторую роль в подавляющем действии переступня белого на захват НМА синаптосомами мозга <рыс, однако одной этой фракцией непьзя объяснить влияние переступня на этот процесс.

Как видно из полученных, данных, ингибирующее действие переступня белого на захват 14С-ГК, 14С-АК, 14С-ГАМК синаптосомами проявляется одинаково у животные обеих возрастных групп, что открывает перспективу ее использования в качество регулятора захвата НМА в старческом возрасте.

08-

0£-

ё

гы

о

X 0Л

I—

ы

лрслые

/ 2 3

г*- оЧ

<-о ГГ)

ГО~

СГ) V,-

(

3 5

Контроль

2. Этанол

3. Переступень 5 мг/мл

4. Переступень ЮмгЛчл

5. I [ереступень 15 мг/мл

старые

к-

I

<оГ

I

-а-

5>

СП

СП I

1 г з ч 5

РисДОок -1

Влипши« персаупия белого на пысоюоаффннный захват 14С-ГК »«»аптйсомами головного мозга белах крыс при старении.

- и-

а-

1,0'

, оМ

£ ое-

0

1

оМ

зрелые

ао

«■Г

£

У Ъ 3 Ч 5

1. Контроль

2. Этанол

3. I [ерсступснь 5 мг/мл

4. Переступень 10 мг'мл 1 1срс ступень 1 5 мг/мл

старые

£ I

¡я

"О

°о С»о

I

I

/ 2 3 * 5

переступня белого на высокоаффинный синаптооокшш головного мозга белых крыс при старении.

а

- о,?

5

•рс.п.ц-

-Г г-

| ' СП

1 I 3 Ь . 5

1. Контроль

2. Г>пшол

3. 11ереступень 5 мгАм

4 Переступень 10 мг/мл

5 1 'ереступень 15 мг/мл

старые

<о>

Оо

I

113*5

Ри^умск. 6,

Нлиьлис переступня белого на высокоаффинный захват МС-ГАМК -ина.1пн<,мами головного мозга белых крыс при старении.

V«

- и

Влияние перс ступая белого на высвобождение нейромедиаторных аминокислот из синаптосом головного мозга белых крыс при ста ренин

В основе возрастных изменений синоптической функции головного мозга лежат снижение количества нейромедиаторов в нервной ткани, уменьшение количества синап то сом, дисбаланс между активностями разных медиаторных систем, а также нарушения отдельных звеньев синаптической нейротрансмиссии (Govani ct aL, 1980; Rajeswari, Radha,1984; Бурчинский, Фролькнс, 1987).

Согласно концепции химической передачи нервного импульса одним из важных звеньев синаптической нейротрансмиссии является высвобождение нейромедиаторов из нервных окончаний. В основе ряда заболевании ЦНС, таких, как эпилепсия и связанные с ним судорожно-пароксизмальные состояния, лежат нарушения процесса высвобождения НМА из нервных окончаний.

В литературе имеют сообщения о возрастных изменениях высвобождения рада нейромедиаторов. Так, показано возрастное снижение интенсивности К+-вызванного высвобождения .дофамина, норадрензлина и ссротонина (Rose el aL,I986; Арменян А и др., 1993).

По этому, представлял большой интерес изучение действия переступня белого на высвобождение НМА из синаптосом головного мозга белых крыс как в зрелом, так и в старческом возрасте.

Исследования показали, что ионы К+ в концентрации 40мМ у зрелых Животных являются сильным стимулятором высвобождения 14С-ГАМК. На этом фоне переступень стимулирует этот процесс на 50,9%.

Представлял большой интерес изучение высвобождения НМА из синаптосом при старении. Исследования показали, что независимо от возраста, переступень является сильным стимулятором высвобождения 14С-ГАМК из синаптосом головнэго мозга белых крыс (рис.7).

Так, переступень стимулирует К+-вызванное высвобождение 14С-ГАМК у зрелых и старых животных на 58% и-2 03%, соответственно.

Было исследовано влияние переступня белого на К+-вызванное высвобождение возбуждающих нейромедиаторных аминокислот-ГК и АК из синаптооом головного мозга крыс. Переступень стимулирует К+-вызванное высвобождение 14С-ГК из синаптосом в зрелом и старческом возрасте на 28,6% и 83.3%, соответственно (рис.8).

Переступень стимулирует К+-вызванное высвобождение 14С-АК из синаптосом обеих возрастных групп животных на 20% и 30%, соответственно (рис.9). * Следовательно, возрастное изменение высвобождения 14С-АК из синаптосом в меньшей степени подвергается стимулирующему действию переступня белого.

Таким образом, переступень белый является эффективным стимулятором К+-вызванного высвобождения НМА из синаптосом мозга крыс.' Это стимулируют«-действие наиболее выряжено в случае 14С-ГАМК

Порченные результаты позволяют заключить, что переступень . стимулируя высвобождение НМА из синаптосом и подавляя их обратный захват синшпосомами при старений, увеличивает синаптическую активность НМА.

1- Контроль

2- Переступень 10мг/мл

64 5£

К

I ад

о <0

I

16-

"И3

зрелые старые

1 \ *т %

1 \ \А /V \г

У V

к' к*

, . 1шшщ/щ , , 1 ушшшл ,

1 а з ц 5 б

/ А 3 4 5 £

Рисунок 7.

Влияние переступня белого на К+-сгамулиро ванное высвобождение, 14С-ГАМК из скнаптосом головного мозга белых крыс при старении.

время ( мин.)

]. Контроль

2. Переступень 10 мг/мл

ы-»

ии с

у«?

зрелые м старые

+ф %

* К*

___ржш___—___ . _, „ щтщ—,—,-».

1X3*5 е / I 3 к 5 с

Рисунок 8.

ВжшяЙ! оереступня белого на К+-стамудированное высвобождение 14СГК аз сшнптооом головного мозга белых крыс при старении.

время ( мин. )

г

1. Контроль

2. Пере ступень 10 не/мл

{-'Ю3

I г<1

о

I

/б

старые

1 г 3 Ь 5 6 1 г 3 Ь 5 £ 7

время ( мин.;

1'исунок9.

Влияние переступня белого на К+-стимулированное высвобождение '•'( -АК из синаптосом головного мозга белых крыс при старении.

и

Ослабление процесса захвата и усиление высвобождения при старении частично носит компенсаторный характер с целью получения того же эффекта с меньшим количеством медиатора в синаптической щели.

В связи с полученными результатами представлял значительный интерес и изучение аминокислотного состава корней переступня белого. Ранние исследования показали наличие в корнях переступня ГК, АК, ГАМК, цитрулина, аланина, аргинина, лизина, холина, а также пептида, содержащего глицин, треонин, алаиин, лейцин, цистеии, серии, ГК, АК (Типшапп <Л а1, 1958).'Наши исследования, проведенные на аминокислотном анализаторе, показали наличие 14. аминокислот в высушенных и свежих корнях переступня . В наибольшем количестве (в 100г высушенных корнях) содержится аргинин-340,9мг, серин-238,9мг, ГК-188,5мг, тирозин-163,3мг, треонин-162,06мг. Количество АК составляет 37,2мг, что в 5 раза меньше, чем количество ГК Флусриметричским методом определяли количество ГАМК в высушенных корнях переступня Оно составляет 27,5 мг %, Предстоит выяснить роль эндогенных аминокислот переступня в механизме его действия на синалтическую активность НМА.

Таким образом можно заключить, что переступень белый значительно стимулирует систему цАМФ (повышает уровень цАМФ, активность аденигатциклаза и протеинкиназ), синтез белка и ДНК, а также регулирует синалтическую активность нейромедиаторных аминокислот.

ВЫВОДЫ

1.Экстракт из корней переступня белого в значительной степени увеличивает уровень цАМФ в головном мозге белых крыс.

2.Выяснилось, что одним из 'главных причин увеличения уровня цАМФ является стимуляция активности аденилатциклазы..

3.Переступень белый стимулирует активность как цАМФ зависимой, так и цАМФ-не зависимых протсинкиназ в головном мозге белых крыс

4.Как показали исследования включении ^^-метионина в белок, жстракт переступня значительно .стимулирует синтез белка в препаратах головного мозга белых крыс.

5.Переступень также стимулирует включение 'Н-тимидина и ДНК в М.ПС'К куя>туре эпителиальных клеток почек собаки.

6.Под действием переступня белого в высокой степени подан лисчеи высокоафинный захват нейромедиаторных аминокислот (|4('-ГК, 14С-ЛК. 14С-ГАМК) синаптасомами трловного мозга белых крыс как V зрелых, так и у старых животных.

7.Переступень является эффективным стимулятором высвобождении нейромедиаторных аминокислот (14С'-ГК, '4Г-АК, 14<".-ГАМК1 из оинаптосом головного мозга белых крыс в зрелом и старческом возрасте. 15 старческом возрасте стимулирующее действие переступня на высвобождение 14С-Г/\МК и ,4С-ГК больше выражено, чем на высвобождение ,4С-АК. Следует отметить, что стимулирование высвобождения нейромедиаторных аминокислот из синаптосом головного мозга белых крыс и подавление их обратеого захвата синалтосомами

под действием переступня, особенно в старческом возрасте, способствует получению того же эффекта при пониженном уровне нейромедиатора.

8. Результаты исследований свидетельствуют о том, что система цАМФ (уровень цАМФ, активность аденилатциклазы и протеинкиназ), синтез белка и ДНК, а также синаптнческая активность нейромедиаторных аминокислот (их высвобождение из синаптосом и обратный захват нервными окончаниями) имеют большую роль в молекулярно-биохимических механизмах действия переступня белого.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЗЕ ДИССЕРТАЦИИ

(.Лприкян АГ., Кочарян Н.В. Влияние экстракта Bryonia alba на синтез белка моэт крыс.-Тезисы III Всесоюзной конференции "Прикладные аспекты молекулярной био.,югии". Тезисы докладов, г.Самарканд, 1991, с.11 -12.

2. Лприкян А.Г., Кочарян Н.В. К межшизму действия растительного препарата "П" пролонгирующего продолжительность жизни в эксперименте. -Всесоюзная конференция "Прочолжктельностъ жизни: механизмы, прогнозы, пути увеличения". Тезисы докладов, Киев, 1991, с.7-8

3.Лприкян Г.В., Лприкяк АГ., Манукян Ш.Р., Кочарян Н.В., Алрикян С.В., Паронян Ж. А, Мкртчян Г. А, АдунцЭ.Г. От регуляции метаболтческих процессов к профилактике ускоренного старения.-Всесоюзная конференция "Ускоренное старение. сся^ь с возрастной патологией". Тезисы докладов, Киев, 1992, с.11.

4.Априкян АГ., Кочарян Н.В. К механизму действия препарата "П", увеличивающего продолжительность жизни экспериментальных животных. I Кавказская конференция по проблеуе геронтологии и гериатрии. Тезисы докладов., Тбилиси, 1992. с.5.

5.Априкян АГ., Кочарян Н.В. Влияние экстракта Bryonia alba на уровень циклического АМФ и активность аденилатциклазы головного мозга белых крыс,-Журнал экспериментальной и клинической медицины, 1992, т.32, N1 (в печати).

6.Априкян АГ., Кочарян Н.В. Влияние экстракта Bryonia alba на протеишсина;нук> активность и синтез белка головного мозга и печени крыс.-Нейро химия, 1992, т.И. N3-4, с.6-8.

7.Кочарян Н.В.; Лприкян АГ. Действие Переступня Белого на уровень циклического АМФ, активность аденилатциклазы, протеинкиназы и синтез белка в моту, белых крыс.- Конференция "Современные вопросы фитотерапии и тр:л;зш,иошюй медицины". Тезисы докладов, Ереван, 1993, с. 127.

?.Апр',1кян Г.В., Кочарян Н.В., Ли Донг Bvk, Манукян Ш.Р. К механизму дсйс.яия препарата "П" растительной природы, пролонгирующего продолязпелыюсть жизни в эксперименте. Сравнительные данные с южнокорейским красным женьшенем. Материалы симпозиума: "Биологические механизмы старения", Харьков, 1994, с. 7.

щи/^^^/шЪо^иД (¿шит. ^: З^шршЪшЦ ^00 : '1ш1Л1[Ь ?

375025, &р11шЪ, Орт^шЪ 52

йрЬ.«к1ф шЪлЬипи^¿шЪ ^Ъцифшпци»

£риилиршЦ{ к о^Ьршиф^ «("Ц^Р"^"1^

375025 ¿¿реван 25 ул.АЗовяна.З?

Отдел издательства и.оперативной полиграфик йр/НХ-а