Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование функциональной топографии молекулы латротоксина

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Исследование функциональной топографии молекулы латротоксина"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ФИЛИАЛ ИНСТИТУТА БИООРГАНИЧЕСКОИ ХИМИИ им. академиков М.М.ШЕМЯКИНА и Ю.А.ОВЧИННИКОВА

На правах рукописи

ЦЮРЮПА Галина Павловна

ИССЛЕДОВАНИЕ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ ТОПОГРАФИИ МОЛЕКУЛЫ ЛАТРОТОКСИНА

03.00.04 Биохимия

Автореферат диссертации на соискание- ученой степени кандидата химических наук

Пущино - 1993

Работа выполнена в лаборатории нейрохимии Филиала Института биоорганической химии им. академиков М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова Российской Академии Наук.

Научные руководители: д.х.н., проф. Е.В.Гришин к.х.н. В.Н.Пашков •

Официальные оппоненты: д.х.н. Л.М.Гинодман к.б.н. В.Л.Воейков

Ведущая организация: Институт биофизики клетки РАН

Защита диссертации состоится ¿^'- М/'гдэЗг. в "^часов на заседании Специализированного совета Д 002.35.01 при Институте биоорганической химии им. академиков'М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН по адресу: 117871, ГСП-7, Москва В-437, ул. Миклухо-Маклая, 16/10, малый конференц-зал.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биоорганической химии им. академиков М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН.

Автореферат разослан "^" 1993 г.

Ученый секретарь Специализированного совета кандидат химических наук

В.А.Несмеянов

Актуальность проблекы. Важным направлением исследования з современной нейробиологии является изучение молекулярных механизмов генерации и передачи нервного импульса в нервной системе. 3 последнее десятилетке, благодаря усилиям многих лабораторий, достигнут значительный прогресс в понимании молекулярных механизмов, лежащих в основе отдельных этапов генерации и проведения нервного импульса. Механизм высвобождения нейромедиаторов в синаптическую щель хорошо изучен в общих чертах, но до сих пор многое не ясно в отношении молекулярных структур, участвующих в процессе высвобождения нейромедиаторов, и пресинаптическая мембрана остается сравнительно малоисследованной частью нервной клетки. В решении этой проблемы несомненно важными являются подходы связанные с использованием природных нейротоксинов, незаменимых молекулярных инструментов исследования в нейрохимии и нейрофизиологии.

В Институте биоорганической химии им. академиков М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН в лаборатории нейрорецепторов и нейрорегулято-ров и в его Филиале в лаборатории нейрохимии в настоящее время в центре внимания находится изучение молекулярных механизмов действия а-латротоксина (ЛТ), высокомолекулярного белкового нейротокси-на (около 120 кД) выделяемого из яда паука каракурта Latrodectus mactans tredecimguttatus. JIT СТИМуЛИруеТ массированное высвобождение различных нейромедиаторов из нервных окончаний позвоночных животных, взаимодействуя с пресинаптической мембраной. Уникальная совокупность свойств ЛТ: наличие высокоаффинного рецептора в пресинаптической мембране, отсутствие энзиматических активностей, ярко выраженные физиологические эффекты во всех до сих пор изученных типах химических синапсов - позволяет надеяться, что с его помощью можно достигнуть значительного прогресса в понимании молекулярного механизма нейросекреции. Проводимые в Институте и его Филиале исследования охватывают три направления. Во-первых, изучение структурно-функциональной организации самого токсина. Во-вторых, использование ЛТ как инструмента для обнаружения молекулярных структур, участвующих в процессе нейросекреции. И в-третьих, идентификация и выделение других нейротоксинов пресинап-тического действия из яда паука каракурта.

Несмотря на достигнутые успехи, остаются нерешенными многие-принципиальные вопросы, касающиеся молекулярного механизма взаимодействия указанных нейротоксинов с пресинаптической мембраной.

Например непонятно, чем обусловлена специфичность действия преси-наптических токсинов, не установлена молекулярная последовательность событий, ведущая от рецепции ЛТ к развитию его эффектов, и другие.

Одним из возможных подходов к решению этих проблем может быть исследование основных приципов структурно-функциональной организации доменов латротоксин-подобных токсинов и участие их во взаимодействии с рецепторным комплексом.

Цель работы. Цель данной работы заключалась в выявлении функциональных доменов в молекуле ЛТ. Достижение цели работы было связано с проведением двух этапов исследований: I) использование полученных в лаборатории моноклональных антител к ЛТ для модифици-кации эффектов взаимодействия ЛТ с рецептором в синаптосомах из мозга крыс; 2) изучение взаимодействия ЛТ с каналоформирующей частью функционально-активного рецептора ЛТ, зкспрессированного в

МОДеЛЬНОЙ СИСТеМе - ООЦИТЭХ Xenopus laevis.

Научная новизна и практическая ценность работы. В ходе работы были последовательно решены многие проблемы, связанные с сформулированными выше этапами исследования, с помощью моноклональных антител обнаружены функциональные домены в молекуле ЛТ, получена экспрессия в ооцитах каналоформирующей функции рецептора ЛТ. Полученные результаты и их интерпретация углубляют представления о молекулярной организации нейротоксинов и пресинаптической мембраны. Обнаружение функциональных доменов у ЛТ - это важный шаг на пути к установлению его механизма действия," пространственного строения, функционального родства с другими пресинаптическими нейротоксинами из яда каракурта, к созданию новых эффективных биологически активных соединений белковой природы.

Объем диссертации. Диссертация изложена на 121 странице машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, результатов и их обсуждения, содержащих 6 таблиц и 19 рисунков, экспериментальной части и выводов. Список цитируемой литературы содержит 194 наименования.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Общая схема действия ЛТ на нервное окончание состоит в связывании ЛТ с рецептором, что вызывает открывание неспецифических ка-тионных каналов, увеличение входа ионов кальция в пресинаптическое

окончание и ускоренное массированное высвобождение нейромедиато-ров.

Высокоаффинный рецептор для ЛТ обнаружен в плазмалемме синапто-сом, клеток феохромоцитомы PCI2 и в нервно-мышечных препаратах позвоночных (равновесная константа диссоциации в пределах 0,1-1.0 нМ). На нервно-мышечном препарате лягушки было показано, что местом локализации рецептора является внешняя сторона пресинаптичес-кой мембраны в нервных окончаниях.

Связывание ЛТ с рецептором приводит к увеличению проницаемости пресинаптической мембраны (или мембраны синаптосом и клеток PCI2) для ионов кальция, т.е. к образованию катионных каналов (канало-формирукхций эффект). Эти каналы отличны от известных кальциевых каналов. Следующее проявление взаимодействия ЛТ с нервными окончаниями состоит в стимуляции нейросекреции (секретогенный эффект). На всех до сих пор исследованных объектах наблюдалось ускоренное массированное высвобождение нейромедиаторов, без видимой избирательности в отношение последних.- Необходимо отметить еще одно свойство ЛТ - способность встраиваться в бислойные липидные мембраны (БЛМ) с образованием катионселективных каналов.

Возникает вопрос, как связаны между собой основные эффекты ЛТ (связывание с высокоаффинным рецептором, увеличение проницаемости мембран для катионов, ускоренный массированный выброс нейромедиаторов, способность формировать в БЛМ катионселективные каналы)? В силу большого размера молекулы ЛТ, можно было предполагать, что все эффекты токсина не представляют собой результат взаимодействия одного участка молекулы ЛТ с рецептором, а являются результатом взаимодействия различных доменов молекулы токсина с мембранными структурами.

Один из возможных подходов для выявления этих доменов может быть связан с использованием моноклональных антител (мАт) к различным участкам молекулы ЛТ. В нашей лаборатории была получена панель мАт против ЛТ, взаимодействующих с ним в растворе. Основные характеристики мАт, используемых в данной работе приведены в таблице I.

Влияние мАт на связывание ЛТ с рецептором в синаптосомах из мозга крысы

В качестве источника функционально-активного рецептора были выбраны синаптосомы из мозга крысы. Синаптосомы являются весьма

Таблица I. Основные характеристики моноклональных антител к латротоксину.

МАТ Изотип Взаимо- Адашность, Взаимо- Мигриро- Вестерн

действие Ка х 10е, действие вание свя- блот

с нативным (М) с денату- зывания ЛТ

ЛТ в раст- рирован- с синапто-

Еоре ным ЛТ в сомами

растворе

А4 1д01(X) + 30 - - +

А6 1дм (¿1) + 3 - - -

А15 1д01(X) + 8 - - -

А19 1д02Ь(х) + 7 - - +

А24 Тдв!(х) + 3 - +

удобным и традиционным объектом для функционального исследования белков пресинаптической мембраны. Большое количество работ по исследованию механизма действия ЛТ было выполнено на синаптосомах млекопитающих.

В предварительных экспериментах было найдено, что 2-4-х кратного молярного избытка мАт по отношению к ЛТ достаточно для изменения его функциональных свойств. При этом модификация ЛТ антителами в молярном избытке до 1:20 существенно не влияла на связывание [125г]ЛТ с синаптосомами.

Результаты детального изучения влияния этих антител на характеристики связывания [,251]ЛТ с синаптосомами из мозга крыс представлены в таблице 2.

Таблица 2. Характеристики взаимодействия нативного ЛТ и ЛТ, модифицированного мАт, с синаптосомами из мозга крыс

*ЛТ/мАт К, В ,

4 мах

(нМ) (пмоль/мг белка)

ЛТ 0,14 ± 0,04 1,5 ± 0,5

ЛТ/А4 0,14 ± 0,03 1,8 ± 0,4

ЛТ/А6 0,24 ± 0,10 1,7 ± 0,7

ЛТ/А15 0,21 ± 0,08 1,2 ± 0,5

ЛТ/А19 0,24 ± 0,09 1,4 ± 0,4

ЛТ/А24 0,19 ± 0,09 1,7 ± 0,8

« Молярное соотношение ЛТ:МАТ (1:2)

Очевидно, что модификация ЛТ данными антителами не изменяет характеристик связывания ЛТ (К , В ) со своим высокоаффинным рецептором в синаптосомах из мозга крыс.

Влияние мАт на каналоформирувдий и секретогенный эффекты ЛХ в синаптосомах Несмотря на отсутствие влияния мАт на связывание ЛТ с синапто-сомами, модификация ЛТ антителами оказывала различное действие на каналоформирумцую (вход ,5Саи секретогенную (высвобождение [14С]ГАМК) функции-ЛТ.

ВРЕМЯ (мин)

Рис.1 Индукция входа ,5Са в синаптосомы ЛТ ( о ) и ЛТ, модифицированным антителами А4 (а ), А6 ( х ), AI5 ( д ), AI9 ( □ ) и А24 (а ); контрольные синаптосомы - ( о ).

Эксперименты проводшш в нормальном солевом растворе Рингера. Потенциалзависимые кальциевые каналы ингибировали блокатором D600. Как видно из рисунка I антитела AI5 и AI9 не оказывали никакого влияния на каналоформирувдую функцию ЛТ, а антитела А4, А6 и А24 полностью ее ингибировали.

При исследовании влияния мАт на высвобождение [14С]ГАМК, индуцируемое ЛТ (см. рис. 2) было обнаружено, что антитела AI5 и AI9 не влияли на способность ЛТ вызывать ускоренный выброс нейромедиа-тора, антитело А6 и А24 полностью ингибировали эту способность токсина, а после взаимодействия с антителами А4 ЛТ частично сохранял способность стимулировать высвобождение нейромедиатора.

Рис.2 Высвобождение [ С]ГАМК из синаптосом под влиянием ЛТ ( о ) и ЛТ, модифицированного антителами А4 ( д ), А6 ( х ), AI5 ( ▲ ), AI9 ( □ ) и А24 ( ■ ); контрольные синаптосомы - ( • ).

Было исследовано влияние одновременно двух антител на функциональные эффекты ЛТ. ЛТ, модифицированный вначале мАт AI5 или AI9, а затем мАт А4 не вызывал ускоренный вход 45Са2* в синаптосомы, т.е. полностью воспроизводилось действие мАт А4. В эксперимен-

тах по высвобождению ГАМК было обнаружено, что ЛТ последовательно модифицированный мАт А4 и А24 воспроизводит действие токсина, модифицированного мАт А24. Из этих экспериментов следует заключение, что в молекуле JIT эпитоп антител А4 пространственно разнесен с зпитопами антител AI5, AI9 и А24. Нативный ЛТ не вытесняет комплекс ЛТ/мАт после его взаимодействия с синаптосомами и не изменяет его действия (рис, 3).

ВРЕМЯ 1НИ8)

Рис.3 Необратимое связывание комплекса ЛТ/А4 с синаптосомами из мозга крысы. Высвобождение [С]ГАМК измеряли в отсутствии ЛТ ( п ) или в присутствии ЛТ ( а ), комплекса ЛТ/А4 ( д ). Через 6 мин после добавления к синаптосомам комплекса ЛТ/А4 был добавлен немодифицированный ЛТ ( е ) (момент добавления указан стрелкой). Приведены усредненные данные трех экспериментов.

¡Сак известно, ЛТ встраивается в ЕЩ и образует в ней катион-ныз каналы, преимущественно селективные к Са2+. Существует гипотеза о том, что катионный канал в пресинаптической мембране образует собственно ЛТ (по механизму подобному в БЛМ), а связывание с рецептором только значительно облегчает образование канала и его правильную ориентации.

В экспериментах по встраиванию ЛТ, модифицированного антитела-

ми, в БЛМ не было отмечено случаев, когда бы JIT полностью утрачивал способность увеличивать проводимость БЛМ (за исключением антитела А6, с ним не удалось провести эксперименты, т.к. при добавлении к БЛМ латротоксина, модифицированного этим антителом, происходило быстрое разрушение мембраны). Некоторые различия касались лишь частоты встраивания каналов, причем только в одном случае -антитело AI5 - отмечалось выраженное снижение частоты встраивания. При этом было отмечено также уменьшение амплитуды образующихся каналов и приобретение каналами способности переходить в закрытое состояние при положительном потенциале, чего никогда не наблюдалось после инкубации с другими типами мАт.

Эти данные не находят объяснения в рамках высказанных ранее предположений, о том, что одна и та же часть молекулы токсина образует катионспецифический канал в искусственном липидном бислое и в пресинаптической мембране. По-видимому, формирование токсин-зависимого катионного канала в пресинаптической мембране и в липидном бислое происходит принципиально различным образом с вовлечением разных частей молекулы Ж.

Итак, в молекуле ЛТ можно выделить несколько функциональных (а возможно и структурных) доменов, ответственных за: I)высокоаффин-ное токсин-рецепторное взаимодействие; 2)каналоформирунций и, связанный с ним, кальций-зависимый секретогенный эффекты,-3)калыдий-независимый секретогенный эффект; 4)образование ионных каналов в БЛМ.

Способность ЛТ, с одной стороны, после связывания с рецептором, вызывать в нервном окончании несколько независимых биологических эффектов, а, с другой стороны, обнаружение в молекуле ЛТ нескольких функциональных доменов, значительно усложняет понимание молекулярного механизма действия ЛТ.

Анализ литературных данных и собственные исследования (не приведенные в диссертации) свидетельствуют в пользу того, что ЛТ различными своими доменами может одновременно или последовательно взаимодействовать с различными мембранными компонентами нервного окончания, возможно даже не имеющими прямого отношения к процессу нейросекреции. В то же время пока не удалось достоверно идентифицировать мембранные белки, связанные с каналоформируюцими свойствами рецептора ЛТ. Не исключена вероятность того', что при солюби-лизации мембран и в ходе дальнейшего аффинного выделения рецептора

ЛТ определенше белки могут быть утеряны (во всех работах прослеживалось только связывание ЛТ с препаратами с Ка порядка 0,1-1 нМ).

В такой ситуации дополнительные возможности в исследовании молекулярной организации рецептора ЛТ и его взаимодействия с ЛТ может предоставить метод функциональной экспрессии в ооцитах хепо-

риэ 1аеУ1з,

Функциональная экспрессия рецептора ЛТ в ооцитах хепориэ

1аеу1з

Для получения функциональной экспрессии рецептора ЛТ важно было использовать такие методы выделения РНК, которые приводили бы к минимальным нарушениям нативности молекул РНК больших размеров, так как из литературных данных было известно, что в состав рецептора могут входить высокомолекулярные субъединицы. Был использован наиболее приемлемый на сегодняшний день метод - экстракция РНК гуанидинтиоционатом при низких температурах. Для получения поли (А) *-РНК использовали аффинную хроматографию на олиго(ат)-целлюлозе без использования ДСН.

Полученную активную мРНК из мозга крыс инъецировали в ооциты хепориэ 1аеу1э \f-vi стадий созревания. В среднем в один ооцит инъецировали около 50 нг поли(А)*-РНК в 50 нл воды, обработанной ДЭП и автоклавированной. Ооциты инкубировали в физиологическом растворе (N0-96) при 20°С.

Функциональную экспрессию рецепторов и ионных каналов в ооцитах тестировали электрофизиологически, методом двухмикроэлектродной фиксации потенциала.

На 3-4 день после инъекций в ооцитах наблюдалась экспрессия специфических мозговых рецепторов и ионных каналов, а именно, рецепторов ГАМК, глютамата, вещества Р, потенциалзависимых натриевых каналов и др. Это свидетельствовало о сохранении высокого уровня нативности полученных препаратов поли(А)'-РНК.

Исследование канала, индуцируемого ЛТ в ооцитах, инъецированных поли(А)*-РНК из мозга крыс

На 5-6 день после инъекций поли(А)*-РНК в ооцитах, в ответ на добавление в омывающую среду ЛТ (10 нМ), регистрировали медленный входящий мембраный ток при фиксированном потенциале -60 мВ (рис.

-104). Этот ток появлялся через 1,5-2 мин после аппликации ЛТ, медленно увеличивался и достигал плато через 3-5 мин. Потенциал реверсии тока, индуцируемого ЛГ, составлял около 0 мВ и не изменялся в ответ на варьирование концентрации ионов хлора в омывающем ооцит наружном растворе. Удаление ЛТ из омывающего физиологического раствора приводило к медленному уменьшению тока примерно за такой же интервал времени. Ответы на ЛТ можно было наблюдать и при I нМ концентрации токсина, однако они были значительно меньше по ампли-

лт

Рис.4 Ток, регистрируемый В ооците Xenopus laevis, инъецированном поли(А) -РНК из мозга крыс, после аппликации лт. Горизонтальные линии указывают продолжительность аппликации. Фиксированный потенциал -60 mv.

тудэ, чем при 10 нМ. Поэтому концентрация ЛТ - 10 нМ использовалась в большинстве экспериментов. Повторная аппликация ЛТ после восстановления тока покоя вызывала уменьшенный в два-четыре раза ответ на ЛТ. Для восстановления ответа полной амплитуды необходимо было 2-3 часовое отмывание ооцита.

При увеличении концентрации Са2* во внешнем растворз 5 раз, ответ на ЛТ не увеличивался. Инъекция ЕГТА б ооцкт нз уменьшала существенно эффект ЛТ. Кобальт, блокатор Са2* каналоо, в концентрации 3 (¿1 ке влиял на вызываемый ЛГ ток, ко в тоа'з время кадаий,

известный блокатор кальциевых путей в клетках, в концентрации 2 мМ частично блокировал ответ ЛТ.

Известно, что лектины, такие как конканавалин А, ингибируют действие ЛТ путем неспецифического уменьшения его • связывания с рецептором. Это наблюдалось и в наших экспериментах. Конканавалин А в концентрации I мкМ необратимо ингибировал эффект ЛТ. Ответ на ЛТ не восстанавливался даже после 15 часов отмывки раствором без конканавалина А.

Инъекции ЛТ внутрь ооцитов, инъецированных поли(А)*-РНК из мозга крыс, не приводили к возникновению ионного тока через плазматическую мембрану ооцита. Это говорит о том, что акцепторная часть молекулы экспрессированного рецептора ЛТ находится на наружной стороне мембраны ооцита, как и в нервных мембранах.

Экспрессированный рецептор специфичен по отношению к ЛТ, так как аппликация а-латроинсектотоксина, токсина, также выделенного из яда паука каракурта и имеющего сходные с ЛТ физико-химические, структурные и физиологические свойства, но специфичного в отношении насекомых, не индуцировала никаких ионных токов через мембрану ооцитов.

В общем, можно заключить, что электрофизиологические ответы получаемые в инъецированных ооцитах при аппликации ЛТ во многом схожи с ответами, получаемыми на нервной ткани. Так, входящий ток деполяризует мембрану, временные характеристики и потенциал реверсии (около О мВ) очень схожи с полученными на клетках РС12. В обоих случаях потенциал реверсии не зависел от ионов хлора в омывающем растворе. Все это говорит о том, что именно катионы, а не анионы в обоих случаях ответственны за индуцируемый ЛТ ток. Известно, что ЛТ в нервных окончаниях вызывает появление неспецифических катионных каналов. Наши данные о независимости величины тока от концентрации ионов кальция в присутствии других двухвалентных катионов и от блокаторов кальциевых каналов говорят за то, что и в ооцитах, инъецированных мРНК из мозга крыс, ЛТ вызывает появление неспецифических катионных каналов.

Обращает на себя внимание факт быстрой диссоциации ЛТ с поверхности ооцита при удалении ЛТ из раствора, омывающего ооцит. Подобного не наблюдалось в экспериментах с нервной тканью. Объяснение этому факту мы постараемся дать ниже при обсуждении данных экспериментов по связыванию [,251]ЛТ с ооцитами.

Определение фракций РНК, ответственных за каналоформи-руюцую и акцепторную функции рецептора ЛТ Фракционирование поли(А)*-РНК в градиенте плотности сахарозы позволило нам решить несколько проблем. Во-первых, обогатить препарат РНК специфической РНК, тем самым получить более воспроизводимое детектируемое связывание [,25цЛТ с ооцитами. Во-вторых, определить область молекулярных размеров РНК, кодирующих канало-формирущую и связывающую функции рецептора. И, в-третьих, выяснить, являются ли каналоформируицая и связывапцая функции рецептора результатом трансляции мРНК, существенно отличакщихся молекулярными размерами или нет.

На рис. 5 представлен профиль поглощения препарата поли(А)*-РНК при 260 нм после центрифугирования и указаны фракции, инъекция которых в ооциты приводит к экспрессии неспецифического катионного

Рис.5 Экспрессия катионного канала, индуцируемого ЛТ в ооцитах хепориз 1аеу1з после' инъекций различных фракций мРНК из мозга крысы. Непрерывная линия - профиль поглощения при 260 нм фракций мРНК, полученных после центрифуги-

Рования в градиенте плотности сахарозы. Положения маркеров НК (28э и 18з рибосомальная РНК) на идентичном градиенте сахарозы указаны стрелками. Гистограмма указывает индуцируемые ЛТ в ооцитах токи после инъекции соответствующих фракций мРНК.

4

в 12 16 20 24 28 ВОИХР ФРАКЦИИ

канала, индуцируемого JIT. Эти фракции (фр.5-10) содержат РНК с молекулярными размерами от 1,9 х 103кД до 2,8 х Ю3кД.

Электрофизиологические характеристики ответов на ЛТ, в случае инъекций фракций, содержащих РНК для рецептора ЛТ, были аналогичны результатам при инъекции поли(А)*-РНК . Однако, электрофизиологические ответы для этих фракций были значительно больше по амплитуде, что, по-видимому, в первую очередь обусловлено концентрированием и обогащением специфической РНК. Сходство электрофизиологических характеристик каналов, зкспрессированных в ооцитах после инъекции поли(А)*-РНК или высокомолекулярных фракций РНК (фр.5-10) говорит о том, что каналоформирущая функция рецептора кодируется исключительно mFHK больших молекулярных размеров, причем, максимальная амплитуда тока возникает после инъекции ооцитов фракциями РНК с молекулярными весами от 2,3 х ЮэкД до 2,7 х 103кД (фр.6-8).

HOMIP ФРАКЦИИ

Рис.6 Экспрессия специфического акцептора для ['ЦЛТ в ооцитах хепориз 1аеу1з после инъекций различных фракций мРНК из мозга крысы. Непрерывная линия - профиль поглощения при 260 нм фракций мРНК, полученных после центрифугирования в градиенте плотности сахарозы. Положения маркеров РНК (28з и шэ рибосомальная РНК) на идентичном градиенте сахарозы указаны стрелками. Гистограмма указывает специфическое связывание с ИЛГ с ооцитами после инъекций со-ответствупцих фракций мРНК.

На рис. 6 указаны фракции поли(А)*-РНК, инъекции которых в ооциты приводят к появлению на поверхностной мембране ооцитов специфического акцептора для [12Si]ЛТ. Максимальное специфическое связывание приходится на фракции РНК 2,5 х Ю3кД - 2,7 х Ю3кД и корреллирует с максимальными амплитудами ионных токов через мембрану ооцитов, индуцируемых JIT. Необходимо отметить, что специфическое связывание [125цЛТ имеет место и в ооцитах, в которых ЛТ не способен индуцировать ионные токи. Возможно, это связано с тем, что экспрессированный с теми или иными дефектами рецептор JIT при наличии акцепторной способности, не обладает каналоформирующими свойствами.

Полученные экспериментальные данные позволяют предположить, что акцепторная и каналоформирущая функции рецептора ЛТ являются, вероятнее всего, продуктами экспрессии одной РНК, молекулярные размеры которой соответствуют области 2,5 - 2,7 х Ю3кД, либо близких по размерам молекул РНК из указанной области.

Специфическое связывание [1Z5i]JIT с поверхностной мембраной ооцитов составляло в среднем 0,95 ± 0,55 фмоль/ооцит для фракции РНК размером (2,5 - 2,7) х ЮэкД. Однако следует отметить, что [,251]ЛТ быстро отмывался от поверхностной мембраны инъецированного ооцита в отличие от нервных клеток, где ЛТ практически необратимо связывается с мембраной. К сожалению, из-за возникших экспериментальных трудностей, нам не удалось достоверно измерить равновесную константу диссоциации связывания [,Z5i]JTT с ооцитами, но из наших данных следует, что она должна быть в несколько раз больше, чём при взаимодействии [,25цЛТ с синаптосомами из мозга крысы. Принимая во внимание также электрофизиологические эксперименты, в которых действие ЛТ быстро прекращалось по мере удаления ЛТ из омывающего ооцит раствора (см. выше), можно заключить, что акцепторная функция экспрессированного бежа имеет отличие от таковой для рецептора JTT в мозге крыс. Эти различия прежде всего можно объяснить экспрессией в мембране ооцита видоизмененной структуры акцепторной части рецептора.

Наличие специфического связывания ЛТ с поверхностной мембраной ооцитов, сходство исследованных электрофизиологических характеристик каналов, индуцируемых ЛТ в ооцитах, и существупцих в нервной ткани, говорят о получении функциональной экспрессии каналоформи-рупцей части рецептора Ж в ооцитах xenopus laevis, инъецированных

мРНК из мозга крыс. Каналоформиругацая структура экспрессированного рецептора близка к нативной.

Итак, данные, представленные в настоящей работе, позволяют предполагать наличие нескольких функциональных (возможно и структурных) доменов в молекуле ЛТ, углубляют представление о механизме его взаимодействия с рецепторным комплексом в пресинаптической мембране. Возможность разобщения непосредственно высокоаффинного связывания токсина и дальнейшего проявления его физиологического действия позволяет заключить, что все эффекты ЛТ являются результатом взаимодействия различных доменов молекулы токсина с мембранными структурами. Эти свойства ЛТ в какой-то мере позволяют объяснить трудности, имеющиеся в настоящий момент в интерпретации данных по молекулярному составу рецепторного комплекса для.ЛТ.

Эксперименты по экспрессии каналоформирующей функции рецептора ЛТ позволяют отдельно изучать одно из проявлений действия ЛТ. Каналы, образующиеся в мембране ооцитов в ответ на аппликацию ЛТ, по своим свойствам оказались весьма сходны с каналами, образуемыми ЛТ в других ЛТ-чувствительных клетках. Эти исследования заложили надежные предпосылки для идентификации структурных генов, кодирующих зкспрессированные белки.

Выводы

1. В молекуле латротоксина выявлены функциональные домены, отвественные за: I)высокоаффинное токсин-рецепторное взаимодействие,- 2)каналоформирупций и связанный с ним кальций-зависимый секретогенный эффект; 3)кальций-независимый секретогенный эффект; 4Образование катионных каналов в бислойной липидной мембране.

2. осуществлена функциональная экспрессия рецептора латротоксина из мозга крыс В ооцитах Хепориэ 1аеу1з.

3. Найдено, что каналоформирующая часть рецептора латротоксина кодируется молекулами РНК, размеры которых соответствуют области 2,5 х Ю3 - 2,7 х Ю3 кД.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Филиппов А.К., Кобринский Е.М., Цюрюпа Г.П., Пажов В.Н., Кукушкин Н.И., Экспрессия рецепторов и ионных каналов мозга крыс в ооцитах лягушек xenopus laevis - Тезисы докладов II Всесоюзной'конференции по нейронаукам, 1988, Киев, с.71

2. Филиппов А.К., Кобринский Е.М., Цюрюпа Г.П., Пашков В.Н., Гришин Е.В., Экспрессия латротоксинового рецептора в ооцитах xenopus, инъецированных мРНК из мозга крыс - Тезисы докладов Всесоюзного симпозиума "Ионные каналы в биологических мембранах", 24-27 апреля, 1990, Кара-дат, с.95

3. Filippov A., Kobrinsky Е., Tsurupa G., Pashkov V., Grishin Е., Expression of receptor lor a-latrotoxin in Xenopus oocytes injected with brain mRNA - Abstracts 10th International Biophysics Congress, July 29- August 3, 1990, Canada, p.386

4. Tsurupa G., Kovalevskaya G., Pashkov V-, Filippov A., Kobrinsky E., Grishin E., Effect of antibodies on the function of receptor to a-latrotoxin expressed in Xenopus oocytes - Abstracts 10th International Biophysics Congress, July 29- August 3, 1990, Canada, p.386

5. Filippov A., Kobrinsky E., Tsurupa G., Pashkov V., Grishin E., Expression of receptor for a-latrotoxin in Xenopus oocytes after injection of mRNA from rat brain - Neuroscience,

1990, v.39, n.3, p.809-814

6. Tsurupa G., Pashkov V., Filippov A., Kovalevskaya G., Griko N.. Tertishnikova S., Himmelreich N., Storchak L-, Grishin E., Latrotoxin-receptor interaction studied by antibodies and mRNA expression in Xenopus oocytes - Abstracts 4 Soviet-FRG symposium "Receptors and ion channels", September 16-21

1991, Moscow, p.57

9.04.93 г. Зак. 5559P. Тир. 100 экз. Уч.-изд.я. 1.0 Отпечатано на ротапринте в ОНТИ ПНЦ РАН