Индуцированные ионные каналы в искусственных и природных мембранах: структура и функции

Сабиров, Равшан Заирович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Индуцированные ионные каналы в искусственных и природных мембранах: структура и функции
ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Индуцированные ионные каналы в искусственных и природных мембранах: структура и функции"

рг6 од

17 ^ ез

лкшрмич ил ук республика институт физиологии и биофизики

на правах рукописи УДК 615.919:55 752.2 <>

сабиров Равшан Занрович

ИНДУЦИРОВАННЫЕ ИОННЫЕ КАНАЛЫ В ИСКУССТВЕННЫХ И ПРИРОДНЫХ

мембранах: структура и функции

ИМ.00.02 — Биоф'.иикл

А II I О 1> I Ф Ь 1' л I диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Ташкент — 1993

Работа,выполнена в Институте физиологии и биофизики АН РУз.

Научные консультанты: акад. Ташмухамедов Б. Л.

д. б. п. Красильаиков О .В.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, проф. Гайнутдиноп М. X. доктор химических наук, проф. Леонтьев В. Б. доктор биологических наук, Иванов В. И.

Ведущая организация — Ташкентский Государственный

Университет.

Защита состоится « ЪО» 1993 года в '(£) часов

на заседании Специализированного совета Д 015.01.21 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук при Институте физиологии и биофизики АН РУз по адресу: 700095, Ташкент, ул. Ниязова, 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Циститу га физиологии и биофизики АН РУз.

Ученый секретарь г^-т'

Специализированного сонета I. б. и. Красилини^ов О. В.

'. - 3 - .

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ГАВОТЫ.

Актуальность темы. / Асимметрия ионного состава клетки и регуляция транспорта ионов через мембраны являются одним из наиболее характерных особенностей живых организмов. Исследования последних лет по.. называют, что ионные каналы принимают непосредственное участие в регуляции трансмембранного транспорта ионов, передаче межклеточных сигналов, нервного импульса и др. Исходно представления о транспорте ионов через специфические поры в биологических мембранах сложились на основе электрофизиояогичёских ^ исследований электро- хемовозбудимых клеток и тканей. В дальнейшем было установлено, что водные поры, хотя и .с существенно иными свойствами, присутствуют и а мембранах невозбудимых клеток (анионный транспортёр эритроцитов, натриевый канал эпителиоцитов, калиевые каналы в лимфоцитах, поры щелевого контакта и др.), а также в мембранах внутриклеточных органелл (поры внешней и внутренней мембраны митохондрий, ядерная пора). Более того, было обнаружено, что межклеточные взаиш- ■ действия, а также взаимоотношения между какро- и микроорганиз-• мом также осуществляются при непосредственном, участии канало-образуших веществ (киллерные,.факторы, компоненты комплемента, бактериальные^ токсины, факторы патвгенности грлОоз и др.}.

Разнообразие биологических функций обуславливает огромное число вариаций параметров ионных каналоз, тэгах, как проводимость , избирательность, электрическая и фармакологическая регуляция. Естественно предположить, что в основе такого разнообразия функций лежит разнообразие молекулярных структур, формирующих поры. Поэтому проблема установления структурно- функциональных взаимосвязей в ионных каналах является одной наиболее актуальных в современной мембрано-гаги».

Неотъемлемым свойством каждого ионного . канала является наличие транспортного пути, по которому перекосится проникающие ионы. Сам по себе этот факт не вызывает есмяениЛ, с-дмако даже для одного и того же канала информация о размерах и архитектуре этого участка поры часто весьма разнообразна и противоречива, хотя. и совергенно необходима для построения адекватной молекулярной модели канала.

3 свяш! е этим, ссиов'лсй целью работа явилесь разработка поводов к оценке размера ионных каналов в модельных и природ-

ных мембранах и определение этого параметра для широкого класса ионных каналов разнообразного происхождения, а также изучение связи структуры и функции в индуцированных водных порах.

Основные задачи заключались в следующем:

1. Детально исследовать физико-химические свойства электролит-неэлектролитных растворов. I

2. Изучить влияние неэлектролитов разного размера на ионный ток через одиночные ионные каналы и выявить параметр, применимый для оценки размера водной поры. '

3. Определить размер водной поры для каналов различной природы и происхождения.

4. Исследовать влияние неэлектролитов на гемолитическое действие каяалоформеров с целью определения размеров индуцированных ими водных пор в эритроцитарной мембране. Изучить за. виеижюгь размера пор от различных факторов.

5. Изучить взаимодействие каналообразующих веществ с плаз-магической мембраной лимфоцитов. Исследовать влияние неэлектролитов на эти процессы и определить размер индуцированных водных пор в лимфоцитарной мембране;

6. Исследовать структурно-функциональные взаимосвязи в индуцированных ионных каналах. • '

Научная новизна работы

На основе систематического изучения физико-химических свойств электролит-незлектролитных ' растворов и соотношений между проводимостью, ионного канала и электропроводностью и вязкостью водной фазы впервые детально обоснован оригинальный подход .к определению размера'водной поры ионного канала.. Метод реализован для ионных каналов с различными ион-транспортирую- -щими свойствами. Применение метода позволило исходя из только электрических измерений адекватно определить размер водных пор, формируемых в мембранах широким набором физиологически, активных порообразующих веществ.

Исследование влияния неэлектролитов на процесс гемолиза позволило определить размер индуцированных водных пор в мембране эритроцитов для широкого круга гемолитиков разнообразной химической природы и происхождения.

Впервые обнаружгно явление формирования одним каналофор-мгрэм водных пор различного размера: три типа для стафило-

токсина и два типа для мелиттина я граиицкд-ша Б. Обнаружено явление температурной регуляции эффективного размера индуцированных пор в мембране эритроцитов Установлена крайняя сонс^р-вативность размера водных пор для полиен-индорфовакызс ¡»налов.

Исследовано взаимодействие трех кзналоформеров: амфотери-цина В, леворика и альфа-етафклотоксина с лимфоцитами. Разработан адекватный подход к оценке прон?иа»«остк гидрофилм?ы?г неэлектролитов через индуцированные поры в мембрана лимфоцитов.. Енервые определен размер водных вор, индуцированных ь / мембране лимфоцитов этими веществами.

Предложены структурные юдоли ионных км;<иов* сбраьовак-ных альфа-стафилотоксшюм к мелиттиком.

Детально исследован' механизм геюаз^, индущроганного каналообразующими веществами; Показано, что параметром, определяющем гемолитические свойства канала является размер его . водной лоры. '

Научно-практическая ценность. Разработанные в работе подходы и методы к оценке размеров годных пор ионных каналов ь искусственны'/, и природных магбранах достаточ'йо просты и удс'Зчы и могут найти икпокое применение в мембранодогия. рвэудкугл определения размера пор являются необходимым усАогй«» дл? рь;-яснения архитектуры ионных каналов и построения адекгато.:-. лекулирных ' и математических моделей ионного транспог'/а. зультаты исследований механизма гемолиза позволяют прст<5кро-вать цитолилические свойства новых порообрадующих Физиал<'-т'ч-чески активных веществ по параметрами сбрэгуемь.у ими >-ано.поч. Материалы диссертационной работы исполь,зуются в учебном процессе на кафедре биофизика ТашГУ.

Апробация работа По результатам исследований сяу&гакоБ«-но 35 работ. Материалы диссертации были долояены на- 37 Конгрессе Международного Электрохимического Общества (Вильнюс, 1986); 1-$ Всесоюзной конференции по бактериальным токсинам (Москва, 1С85); 2-й Всесотоной конференции по бактерй«>.нум токсинам (Юрмала 4-и съезде физиологе и Уабекисти.-а

(Ташкент, 1888); Боееойзном симпозиуме "Одиночные ионные каналы в биологических мембранах" (Кара-Д-«г, 1Э?9); Бсбсодек&м симпозиуме "йскные кинали в бис-готических мги%гн'лУ." '.:Сч-

■ - б -

pa-Дат, 1990); 1-м Международном совещании по порообразуюшим токеийам (Кастел-Ивано, Италия, 1991); заседании Ученого Совета Института физиологии и биофизики АН Узбекистана (1993); заседании кафедры биофизики ТашГУ; межлабораторном семинаре Института бисорганической химии АН РУз.

Структура.и объем работы. Диссертация ^изложена на 326 страницах машинописи, содержит 93 рисунка и 15 таблиц. Библиография 'содержит 366 источника. Работа состоит из введения, обора литературы (б глаз), главы с описанием материалов и методов'исследования, пяти глав с изложением собственных результатов и их обсуждением, а также краткого заключения и выводов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

В работе использованы: адьфа-токсин S.aureus (CT), любезно предоставленный.доктором К. D.Hungerer (лаборатория Behringwer-ke,Marburg, FRG). а'также выделенный в нашей лаборатории по Vatanabe( 1979);альфа1 латротоксин (ЛГ) из' яда паука Latrodectus tredecimguttatus, .полученный в Институте биохимии им.' Паллади-на , Киев, Украина (Чантурия и др.- 1986); экстракты с'веже-по-. лученных, или лиофильно высушенных . ядовитых желез паука Latrodectus tredec t mguttatus; мелиттин и формилмелкттин, выделенные из яда медоносной пчелы' Apis mellífera Е. Г. Костржевской (Институт биохимии им. Паляадина, Киев, Украина); амфотерицин ' В CAB)., полученный из лаборатории Squibb France (Франция);производные амфотерицина В и леворина, любезно предоставленные проф. Касумовкм Х.М. {Институт ботаники им. В. Комарова АН Азербайджана); девория. нистатин и ыикогептий. любезно предоставленные к.б. н. Казаковым и. (Институт физиологии и биофизики АН Узбекистана); грамицидин S, полученный в лаборатории антибиотиков МГУ им. Ломоносова (Мэсква); общие фосфолипиды та мозга быка, а так же хроматографически чистые препараты фосфа-гщилхолина из яичного желтка и фосфатидилсерина из мозга, полученные по Бергельсону и др. (1981); полиэтилеигдиколи (ПЭГ) со средней молекулярной массой (Да): 300 (Koch-Light-), '400 (Schuchardt, München); 1000 (Austranal- Prepárete); 1600, 2C00, 3000,4000,'6000,20000(Loba Chemie); неэлектролиты: рибоза, та-гатоза, арабиноза, рамноза, манноза, тагатоза, тураноза, мальтоза, . мелибиоза (Institute of Chemistry, Чехо-Словакия). Остальные реактивы были отечественного производства градации

"к. ч. " и "ч. д. а. ".

Бислойние лилидные мембраны (БЛМ) формировали двумя 'способами: по методу Мюллера (Mueller et.al. 1963) йз 2%-нсго раствора липида в н-октане и по методу Монтала-Мюллера (Montal arid Mueller 1972) .Электрические параметры мембран измеряли в режиме фиксации потенциала.

Лимфоциты выделяли из тимуса белых крыс (100-150г) общепринят мм методом ()йшт 1990). Изменение объема клеток регистрировали по светонропускашпо с помощью ншгро^отоаетра ЛЕ&-СЭ при 37 С.

Определение гемолитической активности проводили в 2-% ' суспензии эритроцитов в пластиковых или стекляных.пробирках или в лунках платы микротитратора при 37°С (если особо не указано) по общепринятым методам (Tostescn et al. 1S85).

Концентрзцию'ионов калия определяли с помощью пламенного фотометра 1Ш-УХЛ 4.2 (в опытах с эритроцитами) Или с помощью ■ валиномицинового электрода-(в опытах с лимфоцитами).

Осмотическое давление растворов определяли по понижению температуры замерзания с помощью осмометра 0МКА-1Ц-03.

Математическая обработка данных. Параметризацию линейных уравнений осуществляли с помощью стандартных методов регрессионного анализа. Искомые парамЛры в нелинеичнх уравнениях находились методом нелинейных наименьших квадратов путем численной минимизации суммы квадратов отклонений экспериментальных значений от соответствующих расчетных значений. Статистическая обработка экспериментальных данных прсг^щ-лась г.о стандартным формулам и программам на микро ЭВМ "ИСКРА 226.6" и/или 1Ш PC/XT.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

I. ЭЛЕКТРИЧЕСКИЙ ПОДХОД К ОПРЕДЕЛЕНИЮ ПРОНИЦАЕМОСТИ НЕЭЛЕКТРОЛИТОВ ЧЕРЮ ИОННЫЕ КАНАЛЫ

Анализ литературных'данных по определению сечения полости ионных каналов показывает, что наиболее адекватным под.-.одом к репению проблемы является измерение проницаемости лор к незаряженным молекулам. Однако необходимость применения изотопных и других макроскопических методов во многом ограничивает использование такого подхода, ifa-чи поставлена задача поиска электрических методов к определению проницаемости неэлектролитов, что сочетало бы в себе удобство и быстроту электрических

измерений с адекватностью тестирований размера пор незаряженными пробниками, С этой целью од провели систематическое исследование физико-химических свойств электролит-неэлектпо-литиых растворов и соотношения между потоком ионов через одиночные }саналы и электропроводностью и вязкостью водной фазы, окружающей пору.

Свойства электролит-иеэлектролитных растворов.

Установлено, что внесение молекул неэлектролитов, таких как этиленгликоль, глицерин, углеводы, нейтральные пглимеры (НЗГ различной молекулярной массы) в водные растворы электро-* литоз приводит к уменьшению их электропроводности О©. Причем, определяющим фактором при этом, как видно из рис. 1, является процентная концентрация неэлектролита, а не его молекулярная масса (или размер молекул). Омическая природа неэлектролита практически не сказывалась на зависимости удельной электропроводности 100 мМ раствора КС1 от процентной концентрации • неэлектролита Кривые отличались лишь крутизной: гидроксил-содер- • жащке вещества (зтиленгликоль, глицерин, глюкоза и сахароза) . несколько слабее уменьшали, электропроводность, чем простые эфиры - полизтилевгликоли при одной и той же процентной концентрации. ГЬлученный результат не Ьависел от концентрации ионов калия, постольку для ЙМ КС1 относительна изменения подвижности ионов-бьаи аиашогвчными.

Согласно закону Стокиа-Эйнштейна, подвижность ионов и, следовательно, электропроводность растворов должны существенно зависеть от вязкости среды, которая естественно возрастает в присутствии неэлектролитов. Однако сопоставляя экспериментальные зависимости электропроводности и вязкости растворов от концентрации неэлектролитов (рис. 1 и рис,2), можно сделать вывод о том, «ко измеряеыаяв опыте макроскопическая вязкость не является опре дела идей для подвижности ионов.

Для понимания механизма влияния неэлектролитов на элект- • ропроводноеть содесодержаадих растворов необходимы сведения о форме и состоянии исследуемых макромолекул в водной фазе, которые можно получить кз анализа вискозиметрических экспериментов. Измеренная в опыте характеристическая вязкость растворов ПЭГ росла с увеличением молекулярной массы. Зависимость была линейна - в двойных логарифмических координатах с наклоном 0,56 К),03, ' что соответствует состоянию молекул ПЭГ в растворе

„-I-.fi

Рис. 1. Елиякие раз.пич их< неэлектролитов га удельную электропроводность 100 мМ раствора Kfil. Обозначения: 1 -втиденлчтколъ; 2-глицерин; 3-глюкоза; 4-сахароза; 5-ПЭГ 300; 6-ГОГ 1000; 7-ШГ 1500; . 8-ПЭГ. 2000; У 9-ЩГ .3000;

. 10-ПЭР .4000; 11-ШГ 6000; ;.12-1ВГ-20000

1,00

0,75

0,50

J0 £0

Концентрация, %

fmc. 2 Влияние различиях

динамическую еязшэсгь 100 мМ jMCfüopa KCl. На вставке справа - зависимость харак-

TDp;-K7>n--í;-,trií СТЗ-•лестн pacl'wopoa ПЭГ от их ЫОЯйК.удярной ]Ш-л:>> в дга^Нл/ хога ритмических координата*. Обозначения, как на рис. 1.

#М(Да)

10 20 30 Концентрация, %

в виде практически идеального статистического клубка (Маршел 1981). Данные вискозиметрических измерений позволили 'нам рассчитать гидродинамические радиусы для 40 неэлектролитов (включая 2-х и 8-х атомные спирты, углеводы и полиэтиленглико-ли), а также соответствующие величины их молярного объема.

Для низкомолекулярных неэлектролитов "гидродинамический молярный объем-практически совпадал с кристаллическим объемом. В то же время для полимерных неэлектролитов гидродинамический объем молекул всегда превышал их кристаллический объем. Например, для ГОГ 4000 гто превышение составляет 5,7 раза. Это означает, что в 20%-м растворе ГОГ 4000 практически весь объем раствора будет занят полимером. Эффективная концентрация токо-переносящих ионов в присутствии неэлектролитов будет зависеть от того, весь объем гйдратированного полимера доступен растворенным в воде веществам, • или же его незначительная часть. Реальную ситуацию можно оценить, .измеряя концентрацию ионов в объеме, свободном от неэлектролита. Соответствующие измерения, проведенные нами с использованием трёх типов' определений (с помочью валиномицинового электрода, потенциометрическое определение с помощью модифицированной БЛЫ и ультрафильтрация растворов ГОГ) дали сходимыэ результаты, "свидетельствующие о том, что в растворах,' содержащих 20% ГОГ- (с М. м. 2000 - • £0000Да) концентрация ионов примерно на 30% выше, чем концепт-рация ионов, рассчитанная на весь объем. Это очевидно,- связано с тем, что часть объема раствора занята растворенными молекулами неэлектролита По-видимому,, практически вся водная фаза молекул ПЭГ в растворе доступна для ионов, а сами молекулы ПЭГ ■ в этом состоянии являются пористыми шарами, пропитанными солевым раствором.

Шарообразность формы молекул ПЭГ в растворах, а также независимость подвижности ионов от размера исследованных неэлектролитов позволяют использовать их в качестве удобных молекулярных инструментов для изучения механизма движения ионов в кси:але, а также для определения эффективного радиуса водных пор.

Влияние неэлектролитов на ионный ток через одиночные каналы.

Установлено, что внесение в омывающий бислой раствор этиленгликоля (10-30%)' приводило к уменьшению проводимости одиночных ионных каналов (G), индуцированных стафилококковым

0,3;

о,г

С.ПЭГ 4000

4 0,1-

25 50 75 ЮОпСм

В. Этилен, глигол:

а 25 50 75 100 пСм

ш р 0,3

о.г

.25 50 75 100 Проводрасстт,. пСм

г'ис. 0г,1ШОЧ!Г>» СТафмЛОТОйКЧНаЕ«» ;!ЗННЛЫ И ля

Р^.тгоделэямя по проводимости в отеутегиш (А) и ятст налоги!! 2 >,;рэ?>! Ш,с) 20 X неэлектролитв. •

альфа-токсином (рис.3). .При использовании др/г.чу. нияга.юлеку-лярных неэлектролитов с небольшими гияродиьадачеекдаи радиусами, таких как глицерин, глюкоза и сахароза, были тяуче-л-л .-аналогичные данные. Зависимость проводимое!« ¡англа, от электропроводности водной фазы быяз линейна (рис.4).

Тот факт, что проводимость канала я присутствии ьизкомо-декулярных неэлектролитов менялась в полном соответствии с иа-иганением электропроводности водной фазы, а значит, й подвид-гости ионов, означает, что гокопереносящие ионы в полости поры движутся по тому те механизму, что и в объеме водного раствора, то есть свободной диффузией. Согласно полученным нр.ми дзн-нм, диффузионный механизм транспорта ионов характерен для большинства исследованных канатов. ' 1

С увеличением молекулярной массы неэлектролитов (ПЭГ), а значит и их гидродинамического радиуса, наклон зависимости в от & начинает уменьшаться, становился нулевым для ПЭГ 2000 и

Рис. 4. Зависимость проводимости оди-иочньк СТ-каналов от удельной электропроводности водного раствора, содержащего различные неэлектролиты. Обозначения неэлектролитов как на рис. 1.

100

т-г

0,6 '

Рис. 5. Зависимость параметра проницаемости для стафшугоксмиовых каналов (1-рН 7.5; 2-рН 6,0) м латро-токсиновьи 'каналов (3; тип В в табл. 1) от гидродинамического радиуса неэлектролитов.

16 А

Гидродинамический радиус,А

- 13 -'

слабо отрицательным- в случае ГОР 3000 -6000 (рис.4). Пример

записи одиночных СТ-каналов в 20% растворе По? З.ОСО, а такда гистограмма распределения их ло проводимости в этой сред«-ведены на рис.3. &!дно, что ток через одиночный какая ке только достиг, но и несколько превысил свое исходное вначение. Отметим, что электропроводность водного раствора при этом находится на достаточно низком уровне (см. рис. i). Аналогичный результат получен и с каткоккым каналом, образованным альфа-токсином паука Latrodectus tredtcimguttatus (JIT). Зто свидетельствует о том, что влияни» неэлектролитов на проводимость канала не зависит от ионной избирательности лоры.

Критерий проницаемости каналов для неэлектролитов.

Определение размера поры.

' Объяснение наблюдаемых эффектов может ¡заключаться н следующем. С приближением размера неэлектролита к размеру сечения поры начинает сказываться трение поверхности проходящей молекулы о ее стенки. • Зто будет приводить к уменьшению концентрации неэлектролита в полости канала и к пропорциональному росту подвижности ионов в канаае. Как только гидродинамический pav-ус молекул неэлектролита превысит радиус водной поры, соста,-, водной фазы в ней будет таким же, как и в с^ободйом от полю»-ра растворе в силу наличия аффекта "фильтрации", когдр. k.hh&¿ "отсеигаег" молекулы с радиусом, большим, чем развус чю ссче-ния. При атом, естественно, ситуация в канала приближаемся <<. той, что была в отсутствии молекул неэлектролита. Однако, концентрация ионов в поре (а значит и проводимость наказа) ^удс-т несколько выше исходной в силу наличия кристаллического объема неэлектролита, а также неидеальной проницаемости гияр»тмт>овчк-кых клубков в отношении воды и растворенных в ней иоаов. .s ум зультате этого аакдоа зависшосги G ах дли непронаэд;. ионов может стать отрицательным, что и наблюдается в действительности. Таким образом, величина наклона зависимости проводимости канала от электропроводности водного раствора уок?г сложить критерием проницаемости канала для данного неэлектролита. . Для оценки влияния неэлектролита на проводимость канала удобно пользоваться параметром проницаемости {??), определенным как-.

РР^ dS/dX : Go/Ho ., где dG/c!Jf - наклон зависимости 6 от электропроводности

. - 14 -

водно-солевого раствора в присутствии различных концентраций каидого конкретного неэлектролита, 6о и ЯЬ - соответствующие величины в отсутствии неэлектролита.

Величина РР для растворов ниэкоыолекулярных неэлектролитов близка к 1 (соответствующие значения представлены на -рис.5), т.е. проводимость канала меняется практически в полном соответствии с электропроводностью водного раствора Это указывает на хорошую проницаемость этих неэлектролитов через СТ-канал. С ростом гидродинамического радиуса неэлектролитов РР уменьшается до нуля (или даже до небольших отрицательных величин) и далее не меняется, формируя нижнее плато.

Исходя из выаеизложенного, три. выявляемых участка на ' кривой зависимости параметра проницаемости от гидродинамического радиуса неэлектролитов (первый с РР~1, второй, с 0< РР<1 и третий, с РР<0 - нижнее плато) соответствуют областям: хорошей проницаемости молекул неэлектролитов через канал, ограниченной проницаемости.молекул'неэлектролитов через канал и отсутствию проницаемости*соответственно, фи этом, область перехода к нижнему плато кокет служить оценкой эффективного размера сечения водной лоры канала (рис.'б). Радиус СТ-канала, он-'

ределенный данным методом оказался равным 13,6+0,5 А. Отметим, что эта Ееличина близка к оценке эффективного радиуса водных пор, индуцированных ОТ в эритроцитах человека (14-15 А, см. далее) и хороша согласуется с .электронна.-микроскопическими данными (10-15 А по- Гизз1е е^ а1.1981 и 12.5'А по 01оГзбоп а1.1988). - • '.

х В случае латрбток^иновых каналов зависимость РР от гидродинамического радиуса неэлектролитов (рис.5) в основном подобна наблюдаемой на СТ-каналах^ При этом радиус каналов с проводимостью 169 пСм определяется равным 9,8+0,9 А.

. Приложения метода Его достоинства и недостатки.

Одной ка проблем в изучении латротоксиновых каналов является многообразие их амплитуд проводимости. Используя разработанный нами подход к определению размера ионных каналов в БЛМ, можно найти ответ на главный вопрос: являются ли латротоксино-вые каналы, кластерами, или это - унитарная пора, а разная проводимость обусловлена разным зарядовым составом или разным аффективным размером полости поры? Отметим, что решение этой дилеммы актуально для многих, если не для всех ионных каналов

V -V ' , ' -

(Гед'Г-тю!'., йа?пчеяко 1990).

Для сравиктолыюго аяазизо мч выорази агедуидое аееть г>-

Т!.;1" !в.«о газ;'е;;ит!! г-, три п-'т.'.ьк 1 каналы В- т!«г , инлгатоуемыз экстрактом диофилыю выеуакмишх ¿¿лгг г

Г Ч и» cv.cc« ДсУротили^холин;; с хол-сте|>га.-;-м; г - ^лс/ч Г-:•:!-I ;!:!;;;.'и;;ровачшт' угстрактсм сгдагаполу^шт ' .'ои'п : «•Л"^ Л,'1; , г - . ' " ' ; ПССЛ-" V Р- ^ипя {1Ш71УКПИЯ

встроенные в ВЛМ ИЗ фОСфатИДйлСеркпа,. О

г^мпгрнннм алыЬа-латротоксинон в. БЛМ из фосфати-

•ч.т.^^ии-, ,< иимннлак кллиип ГШ Г^

Есгеиия эксперимента были близка.

Тсбл751Д 1. Седапчпзроеть, ган-связиз&ия® агэтгйггпа н растер латрото!«зогаг1гс штатов раздздкоЛ прсЕодтадста

---р--!----г---^---,-,--

|Ы|Тип - |Состав| .| | | I в I

н-

М'л^лЛ |

I КДР+О ! С7П+2 18.8+0.8!

'• Ч 1

I I

| ! 1 | ' '

Г: I -111;+!?(.' io9.GtT.0l ; '

I ! I ; I

■ТО I 1:-'5 ! 1 :;;.!> I ! Л.ч-:; 5 —*

| >38.3+1.31 11 ;

м^п^г» | | ея+1 11500+3 |9.5+0.3|

|6 - средняя приводимисхь IV - потенциал нулевого-тока в биионнсй системе: Югг.М СгУ20яМ К| 1КсНсаяуцаяся константа диссоциации комплекса "калий-канал", мМI : '.>г:л-7канала. (параметры уравнения!

о.- I: -л -!и псарей« ':г»!5;-сйгеонгстзг клавов, ??-ррс.Л|-\--,!.Т0".И от кгяцсстрэдки ПрСИ«Ка»«ЯХ КОНОВ, .4

так же влияния неэлектролитов на одиночные каналы (таблица 1) показало, что для объяснения существования ЛТ-каналов с' сильно р&зличамсцмися величинами проводимости, по крайней мере в пределах каждой из групп, остается только одна возможность: ЛГ-каналы являются кластерами унитарных субъединиц, поскольку при сильной вариации величины проводимости, они имеют практически одинаковый размер поры, идентичную ионную избирательность (при постоянстве липидного окружения) и аналогичные ион-связыва«цие свойства

Каналы В-типа вероятно состоят из 3 субъединиц, подобных » каналам л-тлла, поскольку йгах для В-каналов в три раза больше, чем для А-каналов. Аналогично, 0-каналы могут состоять из 3-4 каналов С-типа, а Р-каналы - из 2-х субъединиц Е-типа. Поскольку известно, что ЛТ способен образовывать агрегаты в водных растворах (Салихов и др. 1982), можно допустить, что процесс агрегации происходит так же и в плоскости мембраны,

приводя к образованию олигомерных каналов - кластеров. ь

Разработанный нами метод был. использован для определения размера ионных каналов различного происхождения. При этом было установлено, что форма зависимости Р? от гидродинамического радиуса неэлектролитов оставалась такой же, как на рис/5, а точка пересечения наклонного участка кривой с. нижним плато давала следящие значения радиусов: для пор; образованных М-кон-цевым фрагментом стафилококкового альфа-токсина Я-13,1+0,7 А, В-субъединицей холерного токсина ¡?-10,5+0,5 А, холерным цитолизином 1?=10,0-К),9 А, токсином Раз1е_иге11а тиНоскЗа ^10,5+0,7 Л и К-10,3+0,3 А (дая двух типов амплитуд соот- / ветственно). Использование предлагаемого метода определения размера пор показало его-высокую надежность и информативность,

Несмотря на сделанные допущения, радиус поры, определяемый предложенным способом, по-видимому, соответствует радиусу . водной поры реальных ионных каналов, о чем свидетельствуют как злектрошюмикроскопические данные, так и сходимость этих значений с результатами, полученными с применением других методов (осмотических, изотопных и др). Основным достоинством изложен--ного метода является то, что оценка радиуса пор основана на использовании незаряженных молекул-пробников, позволяющем в илгееткоЛ мере пренебречь их электростатическим Езаимодействи-

ем со структурой канала В то та время, базовые дауэрани;? являются чисто электрическим»1,. что является яедопбкнь!'-'. удобством при работе на уровне одиночных каналов.

Определенные трудности в интерпретации данных могут еов-никать при исследовании узких пор. 3 качестве прибора ;.<ы исследовали одиночные ионные каналы, образуемое яолиеновим антибиотиком амфотерицином 3. 3 данном случае было нрда.„о сильное взаимодействие неэлектролитов с полостью канала, что проявлялось в блокировании ионного тока (что соответствует кмегаумся литературным д?шшм; йоМзоуч еЪ а1. 1979;' Зильб^р"!-тейн 1989). Хотя при наличии блокирования уте нельзя ^воздать о "параметре проницаемости", однако и для амфотерициковсто га-нала зона перехода к области РРО соответствовала известным данным о размере этой поры. ■

Можно надеяться, что изложенные подходи к изучению механизма, транспорта ионов и определению радиуса водной поры будут полезными б исследовании "широкого круга, конных каналов.

И. 1П8ВЩЙРОВАШ5Е ЙОШЙ $?АИШ Е ЗРИТРО^ЧТСн.

БОЛЬШИНСТВО ВЫВОДОВ О струюурно-фуккг.-чональвых Пар;1У'.'" рах ионякг каналов, образованных экаогеяяша к-адалоформеоои,-, осковакн на результатах, полученных в эксперт/ей?« с ксг.-ль-аованчем искусственных систем - липоеом и биелойч«! ли/.'гг-*«. • мембран (Вз1М). Однако априори не исключено, что структура таких индуцированных в БЛМ каналов отлична от таконюс в пспрод-ных мембранах. Следовательно, для детального понимания ¿-кз'.'о-.логичаских и Фармакологических эф&ектов экзогенных какалофср-меров необходим анализ структуры канаков, в частности, размеров кх водных пор и клеточных мембранах.

Мембраны клеток крови часто становятся первой ммше,«ь.ь экзогенных ¡галалообразувида веществ при их попадании в кровяное русло. В большинстве случаев взаимодействие экзогенных ка-кадообраэумцда веществ с эритроцитами призодит к их лизису, в предыдущих разделах было показано, что исследование влияния неэлектролитов на ион-транспортируют свойства конных каналов позволяет получить детальные сведения как 6 механизме движения ионов в поре, так и о размере их водных пор. Исследование ьли яш:а неэлектролитов на процесс гомзлиза иоэволяы устаямах;. механизм зтого явления, а также найти подходы к ревеня» клкче-

вой проблемы - определения размера индуцированных водных пор в эцитроцитарной мембране.

Коллоидно-осмотический механизм лизиса. Осмотический подход к определению размера индуцированных водных- пор

в мембране эритроцитов. Одним из критериев коллоидно-осмотичесКЬго механизма гемолиза является его предотвращение инертными веществами, выравнивающими онкотическиЯ градиент через эригроцитарную мембрану (Veiner et al. 1985; Katsu et al. 1988). В наших экспериментах добавление во внеклеточную среду инертных- дисахарлдов приводило к замедлению гемолиза, индуцированного амфотерицином В (АБ). При концентрации сахарозы >40. мМ гемолиз даже при больших концентрациях .АВ (>14 мкМ) практически не наблюдался вплоть до 2 часов, хотя в его отсутствии он заканчивался ' за несколько минут. Перенос эритроцитов в среду без неэлектролита после 2-х часовой инкубации в присутствии АВ и 40 >iM сахарозы приводит к быстрому лизису клеток, что указывает на осмотический механизм проте.чци»»'. Уровень гемолиза становился нулевым при концентрации сахарозы 40 Ш (рис.6). Среда с таким содержанием сахарозы имеет' избыточное осмотическое давление (по' сравнению с нормальным'физиологическим раствором) примерно 40 мОсм. Эта величина, по-видимому,. может быть принята в качестве, оценки градиента ошсстичеекого давления через эритроцктарйую мембрану. Она близка к литературным.данным:, онкотическое давление гемоглобина .внутри эритроцитов близко к 33-34 мОсм (Aider 1928; Freedman & Hoffman, 1979).' .

В аналогичных 'опытах со стафилотоксином бцло установлено, что введение в среду инкубации 10 мМ поГ/i'aтяленгликоля с м. м. 4000 было достаточно для эффекти«::;>т-о предотвращения СТ-индуцированного лизиса эритроцитов (рис.7). Перенос эритроцитов, обозбг^Гпыд йгЖёсккш концентрациями СТ в присутствии защищающих концентраций ПЭГ 4000, в среду без неэлектролита приводит к быстрому лизису клеток (рис.7), что подтверждает предполагаемый осмотический механизм протекции.

Исходя из результатов осмометрических измерений, можно заключить, что 10 мМ раствор ПЭГ4000 создает давление 21 мОсы, а 15 мМ раствор - 38 мОсм. Таким образом, в случае стафило-токсинового гемолиза градиент онкотического давления составляет в среднем около 30 мОсм, что близко к оценке, полученной в

Рис. 6. Зависимость

уровня ам^отегк-'у«;! В-ЮЦ^ШфОЙШШСГО ГЬ*Я>-

от со,чзрга;ша з с родя caxajxjau Концентрация AB 14 мкМ

( ') и 'Ю мк>.1 (2). ttmübi" оимролм - уровень гемолиза после

ahOMjlk>WMq rimjo-

¿мчьост-и средь1 до исходного уровня.

Рно. 7. Влияние сахарозы ш, ПЭГ1000 (2) , и ЯЗГ-1Ш0 (3) та уровень лнзпса эритроцитов '^елоге-та псд ло i-T т i сгафиао-

тгя

Ori

'«'< t.

/¿О С I'-'.'-'.

MdO.

даенг чго и

Гемолиз,$ 100sä-

% .

1 r' Л

50- VXf

N. --Q ■

Л(\ ■ С.Г.

ГемолизД' 100

o-I Д-2 О-З

Д.

' 20

50 -

Гемолиз S 100 -fs—о-

Рмо. 8.

•ГЛГ;'. .¡Г"

гемолиза oi гидродигамичэс-кого радиуса

неэлектролит»

Обозначения: 1 - AB i.14 УКМ); 2-ОТ (0, 03 мкЧ), кроличьи эритроциты, 4 С; 3 -ст (0,03

мкМ), кро-ичьи .эритроциты, 37 С; 4 -CT (3 мкМ), кроличьи ярит-pcumu, ('■; ь -ОТ (3 мкМ), человеческие эритроциты; 37 С.

"г

Гидродииамицесгий радиус, А

- 20 -

случае ждотерицж-индуцированного лизиса пленок.

Варьирование размера неэлектролитов во внеклеточной среде позволяет оценить размер водных пор, индуцированных в эритро-цитарной мембране каналообраэующнми гемолктиками, так как про-шмакщсе неэлектролиты будут осмотически неактивными и не смогут выравнивать онкотическиЛ градиент и предотвращать лизис клеток (¡гак зто ввдко на примере хорошо проникающей через СТ-каьад сахарозы и частично проникающего ПЭГ 1000, рис.7), тогда как пепронякающиэ неэлектролита будут предохранять клетки от осмотического лкзкса Зависимость уровня гемолиза, индуцированного исследованными в работе каналоформерами, от гидродинамического радиуса неэлектролитов имела обычно сигмоидную форму. 11а рис.8 в качестве примера приведены такие кривые для гемолиза, индуцированного амфотерицином В и стафилококковым альфа-токсином. Радиус неэлектролита, при котором происходит 50%-й лизис шшток, был принят в качестве меры эффективного радиуса индуцированной водной пора "

Три типа пор, образуемых альфа-стафилотоксином .

Ь в зритроцитарной мембране.

Установлено (рис.8),что радиус стафилотоксиновой поры при концентрации токсина 3 мкМ раиея примерно 14 А как на кроличьих, так и на человеческих эритроцитах. На этом же рисунке показано, что иэмепэние условий проведения эксперимента не' меняло форму завксишсти уровня гемолиза от гидродинамического радиуса неэлектролитов, которая, оставалась оигмоидной, но сдвигало всю кривую в область 'меньших гидродинамических радиусов. Очевидно, это южно трактовать как иаменение эффективного размера токсин-индуцированной поры в зритроцитарной мембране.

Как на кроличьих, • так и,на человеческих эритроцитах' эффективный радиус стафилотоксиновой поры зависел от концентрации уоксияа. Общая форма концентрационной кривой (рис. 9) свидетельствует о том, что существуют две формы канала, отличающееся по размеру. При низкой концентрации токсина формируется пора с меньшим радиусом, близким к 9А, а увеличение содержания токсина в среде создает условия для формирования большей поры с радиусом 141 Можно полагать, что переходная зона, расположенная в области 0,1-1 мкЫ соответствует одновременному существованию обоих типов С7-пор. .

При понижении температуры инкубации определяемый радиус

го радиуса стафшй-окскковой вой поры, в аависимос-ги от

поры в м-эмбраие эршронитсв ютгцентрзщэт акпйзготша И,

¡{ротг-гла от концаз1трш?!1;>; СГ звгксп в«ала), гемпорл-гурц и

(1) и тсипор-атуры (2- СТ 3 . рН среды (2 я 3, всрхкг?

МШ1; 3- СГ О.ОЗмГЙ.!). лы).

Рис. 11.5ав*лгй.5осхо э&йкдаагаго уадиуса йодных пор, индуцированных 3 эритроцитариой кедраче грамкцадиноч Б (1,2) и кэ.пп.' типом (3) от концентрации гаюлигика. Условия -гермсс :-А'П'Г.о:-а иия: 1-водяной ?-еу."я:овя*вчкй ге.»чо»тг<г.

О' в

СТ-пор закономерно уменьшался с 14 А до 8-9 А (рис.9). Температура половинного изменения радиуса была блиака для обоих типов клеток и равна 14-15°С. При низкой концентрации СТ,"когда при температуре 3?"С на мембранах эритроцитов ^кролика токсин Исходно образует поры с радиусом 9А, понижение температуры инкубации 'Приводило к дополнительному уменьшению определяемого радиуса пор до 7.5А (рис. 9).

Т.о. альфа-токсин способен образовывать водные поры как минимум трех фазличных размеров (структур).-. Одна из них имеет . радиус 14-15 А, вторая - 8-9 А и третья - 7,6 А. Отношение квадратных корней из площадей геометрических фигур, ограниченных шестью, пятью й четырьмя кругами равного диаметра, равно 1:0,7:0,5 тогда как отношение экспериментально определенных значений радиусов было равно 1:0,6: 0,6. На этом основании можно. предположить, что три.типа пор соответствуют гексамерной, - пенгамерной и тетрамерной' формам стафилотоксинового канала. Отметим, что.структура;с тетрагональной симметрией была обнаружена при ыодофгжации стафилотоксином мембран тромбоцитов при низкой температуре (ОХоГззоп е1 а1. 1990), что является независимым свидетельством существования тетрамарных пор и СТ-содержа®» мембранах.. ...-'■- ;

Лоры, образуемые иодиеновыми антибиотиками . -• ' • в аритроцитарной мембране" /

Используя описанный выше подход,-нами обнаружено, что аффективный радиус АВ-индувдровадной водной-поры в эритроцитар- ' ной мембране близок к 4.Ч0А . (Рис. 10). Размер амфотерициновой поры не менялся при вариации как концентрации полнена (от 2 до СО кки), так и температуры (от 4 до 37°С) (рис.10). В работе МагегзЮ еЪ а1., (1890) показано, что изменение рН среды приводит к изменению агрегатного состояния амфотерицина в водных растворах. Однако, в наших экспериментах размер амфотерициновой поры был неизменен на всем исследованном диапазоне вариации величины рН среды (от рН-4,5 до рН»9,1; рис.10). ;

Следует отметить, что при очень-высоких концентрациях ге-излитгаса (больше .60 мкМ) наблюдался резкий рост определяемого таким способом раамера пор. Подобный эффект, по-видимому, является результатом детергентоподобного действия полиска на ли-пидный остов аритроцитарной мембраны.

^ Определенное нами значение радиуса амфотерициновой лот;:.' ь

мембране эритроцитов близко к оценкам, полученным в экспериментах на • БЛМ (&5А. Борисова И дг. f 1978; 4А, НоЗт & finkelsteín, 1970) и молекулярной модели (4Д, Хуторский и др., 1988; Хуторский, Каменчук, 19SS).

Антибиотики нистатин, микогептин и леворин по химическому строению очень близки к амфотерицину В и могут рассматривался как производные АВ со структурными изменениями преимущественно в области макролидного кольца. Используя описааиый аыяз подход, - было обнаружено, что размер водных пор, образуемых а эритроиитарной мембране этими полиенами, был неотличимым от размера амфотериция В-икдупироваяиоЯ по™!.

Нами изучен ряд производных АВ и леворина с общей формулой: ОООМ.-П-Н(И.)3 где R1- метил, этил, пропил, бутил, амил; R- дактонное ядро молекулы полиена. Все эти вещества имели р ■ зличный обдай заряд и различную 'гидрофобность и ■ обладали способностью лизировать эритроциты, которая уменьшалась с рос той длины алкильной цепи заместителя. Однако размер индуцируемых ■ этими веществами • пор в мембране эритроцитов был по прежнему близок к 4 Á.

Таким образом, ключевой параметр яолиеиовой сори ■ размер ее водкой поры - оказался крайне"устойчивым. Его яе «юоди ни изменения температуры и рН среды, ни глубокие структур«** изменения б самых различных частях йакролкгного мтоза, ни я»рг<-ацин конъентраииЛ полиеноь. В то л* зре.чч, мон-тганенор-мрук*-циё свойства поры, в частности ее кзт^'н-зниеснал селективность, оыяи более зависимы от структурных- юдафинаиип потопов, 'Так, леворнновые каналы обладал' кагяоаной изОкратель-uqctüio, тогда кал амфотерлцшюЕыг, ¿хстатиетгие ц шг:шгептилс- _ вые - неидеальной анионной селективностью^ которая- существенно' уиеличпьыссх при алкиляровании полярной голо*ки молекулы (s случае производьмх цуфотерицина В).

Поры, образуемые в мембранах грамицидином S.

Грамицидин S (ГрЭ) -цйклодекалептидный антибиотик, продуцируемый бактериями В! brevis и облздаювдей биологической активное! ->ю кирокого круга действия, Имешиеся сведения о молекулярных механиэ.чах действия грающидияа S на избраны крайне фрагментарны.

В наших опытах Гр S вызывал заметный лизис эритроцитов человека И крошка начиная с концентрации 2-4 юсК , что близко

к минимальным антимикробным дозам препарата (Егоров,1986)1 Установлено, что иачиная от наименьших литических и вплоть до 30 мкЫ концентраций ГрЗ размер образуемых им пор относительно стабилен и равен 6+1 А (рис.11). При дальнейшем увеличении концентрации антибиотика эффективный радиус закономерно увеличивался и достигал 13+1 Á (250-500 мкМ ГрЗ). Следовательно ГрЗ-поры существуют по крайней мере в двух устойчивых состояниях с радиусами 6 и 13 А соответственно. Область на этой кривой с промежуточными значениями эффективных радиусов может соответствовать как одновременному существованию обоих ' типов, пор, так и присутствию на мембране пор с промежуточным размером. К сожалению, на основании наших данных нельзя сделать выбор между этими двумя возможностями.

Как и в случае СТ-каналов, при понижении температуры инкубации определяемый радиус ГрЗ-пор уменьшался с 12,7 до 7,7А. Температура половинного изменения радиуса была равна 19"С. Эта . величина несколько выше, чем температура перехода для стафило-ToikuKOKoro канала (14-15*С, ■ см. выше), однако лежит в пределах зоны температурного перехода липидного матрикса зритроци-тарной мембраны (17-20*0, Черницкий, . Воробей 1981). Поэтому, модно полагать, что для формирования стафилотоксиновой и гра-мицидиновой пор важной значение имеет состояние липидного окружения молекул каналоформера.'

Ита :, ГрЗ образует в мембранах водонаполненные поры двух • * , «

типов с радиусами 6+1 А и'13+1 А. Эти поры обладают при рН 7,5 слабой анионной селективностью. Зависимости типа "доза-ответ", полученные- как на эритроцитах, так и на ВЛМ показали, Что они (поры) образованы не менее чем двумя молекулами антибиотика (п-2,2+0,2' для гемолиза и п-2,58+0,16 для скорости роста проводимости БЛМ). В построении поры могут участво; ¿ть так же и молекулы липида. Формирование таких пор в плазматических мембранах эритроцитов повышает кх проницаемость для воды и ионов к-приводит в последующем к осмотическому лизису клеток. Вероятно, антибиотическая активность I'pS также связана с его способностью увеличивать проницаемость бактериальных мембран.

Поры, формируемые в мембранах мелиттином.

Мглиттии - один из основных цитотоксических компонентов яг.п медоносной пчелы Apis mellifera. Несмотря на большое число жя\1ед:ч-анкЛ. голрее о структуре мелитгиновой поры остается

- 25 - "

открытым. Используя описанный выше подход, установлено, что эффективный радиус мелиттия-индуцированной водкой пори т> эрит-роцитарной мембране не является лсстоянноЛ величиной и савиоит от концентрации полипептида С рис. 11). Анализируя фо^му этой зависимости, можно предположить, чго в данном случае гак существует дЕе устойчивые формы мелиттиновой поры с радиусами

• о

12 А и 26 А. Размер мелиттиновых пор был стабильным в диапазоне температуры от 4 до 37°С.

Заключение.

Таким образом, исследовано взаимодействие с зритрощп?ми большой группы геыолитмсов (пептиды, бе.^ки, полиенс-вие антибиотики и их алкил-производные), относящихся к различным классам физиологически активных соединений. Усгаксь^еао, «iо вс» ok.s обраэуот в эритроцитарной мембране поры, размер коi'opat определяется как химической природой каналоформера, так и условиями среды. Размер пор, образуемых гемолитиками пептидной и белковой природы, зависел как от концентрации вэщзства, так и от температуры. Варьирований условий эксперимента приводит к вза-имоперехоцам между состояниями поры с различным размером.

В то же время, структура, формируемая пелиеновши антибиотиками, оказалась крайне консервативной и сохраняла свой размер в широком д-,апазоне вариаций как структурных парамйхго?. молекулы гемолитика, tsk и условий среди (кэпиентра'лия акткы-откка, температура и pH среды).

III. ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ КДШКИОРМЕГСЗ С JSßiiOOMTAIK.

• Известно, что лимфоциты играют ключевую рель в формировании иммунного статуса организма. В настоящее врем хорошо известно, что начальной фазой индукции пролиферации имсунокомпе-тентных клеток митогенами является изменение потока одновалентных ионов через плазматическую мембрану (Эшмен 1987). Поэтому можно надеяться, что вещества, специфически nobbiß'-ucviv; ионную проницаемость мембран, будут оказывать модулируйте действие in иммунную систему. Действительно, в литературе такие сведения известны для ам^терицина В (Eolard 1986) и стафилококкового альфа-токсина (Vadstrom 1983). 0д;1а;со имеющая лунные сесьмз фрагментарны, а молекул^ряив м^'.а-.т/.гмы зьм«.*;-действия этих поресбразукиас веществ с мембранами клеток иммунной системы практически че исыкдовзчы. В наз»Я рЛ-.?»

- 26 - • поставлена 8адача изучить взаимодействие каналосбразуюдах ве-деств о мембранами иммунокомпетентных клеток, в качестве которых мы использовали лимфоциты из тимуса крыс. Этот тип клеток весьма удобен с экспериментальной точки зрения и уже использовался ранее в качестве клеточной модела для изучения иммуномо-дулирующих свойств амфотерицина В (Непгу-Той 1гао еЬ а1. 1589 а.Ь).

. Действие каналоформеров на проницаемость мембраны лимфоцитов. Установлено, что внесение в среду, содержащую суспензию лтфцитов тимуса (1,5 млн. клеток на мл) амфотерицина В (АВ) ■ в микромалярных концентрациях вызывало увеличение коэффициента пропускания суспензии, .что согласно общепринятым представлениям, отражает увеличение объема клеток. Набухание тимоцитов под действием амфотерицина В вызвано, по-видимому, изменением проницаемости плазматической мембраны клетки в. отношении осмотически активных веществ) • о чем свидетельствует тот факт, что антибиотик уже в концентрации порядка 0,25 мкМ вызывает ин-. тенсивкув потерю клеткой' внутриклеточного калия. Сравнивая • константы скоростей набухания и выхода калия, а также анализируя их зависимости от концентрации амфотерицина Б, можно сделать вывод о том, что изменение' ионной проницаемости плазматической мембраны тимоцитов предшествует изменению объема клеток.—Это подтверждает осмотический механизм- изменения объема' тиюцйтов, индуцированного амфотерицинои В.

Аналогичные результаты, хотя и с несколько иными количественными соотношениями (которые нами подробно проанализированы), получены для лёворина (который в отличие от АВ формирует катионо-селективные поры) и альфа-стафалотоксина (формирующего в мембранах поры с такой же, как у амфотерицина избирательностью, но большего размера, см. выше).

Влияние непроникающих неэлектролитов

на набухание тимоцитов. /

Увеличение объема тимоцитов в ответ на повышение проницаемости плазматической мембраны клеток свидетельствует о том, что -внутри клетки имеются осмотически активные компоненты, вепрсйкнаюпдае . через индуцированные поры. Это предположение • подтверждается опытами, в которых при добавлении во енеклеточ-'ную среду сахарозы (размер которой превышает размер сечения

У' ' .. — "*;

' ^ . ; ..... - '

-2 7 - '

АВ-каналов) кабдадалойь замедление скорости АВ-индуцированного набухаяия клеток вплоть до реверсии эффекта добавки полнена, когда вместо набухания наблюдалось от'чяне тнмоцатоп. Пример таких экспериментов представлены га ряс. 12. Зависимость ста рости изменения объема клеток от концентрации сахарозы пергсг-кала ось абсцисс при концентрации, равной 125 мМ. Ослсп^могть rai-юго раствора ка 125 мОсм превкетег ссмстичность исходной среды (не содержащей сахарозы). Можно полагать, что эта в<?личина соответствует величине оикотического давления внутри моцитов в начальный момент времени «осле добавки АБ. Такое да значение градиента оикотического давления было получено ;» s опытах с леворином.

Непроникавдим неэлектролитом в случае СТ-пор является по-диэтиленгликоль с м. м. 4000 (1БГ4С00). ДйСиьктель:1.;, этот неэлектролит ужо начиная с концентрации, создающей осмэтическог давление 5 мОсм оказывал существенное влияние на кинетику СТ-индуцированног'о изменения объема тнмоцитов (рис.13), которое в присутствии ПЭГ40С0 было всегда многофазным. При увеличении ПЗГ-ом осмотичности среды вплоть до 20 мОсм в действии ОТ на клетки всегда присутствует начальная фаза набухания, которая затем сменяется их сжиманием; Такую-кинетику изменения объема можно объяснить тем, что сразу, после начала действия СТ для компенсации градиента оикотического давления через тичеекуп мембрану величина осмотичности 5-20 мОсм, создаь^/ноч ЯЭГ4СС0. "недостаточна. Далее, вследс'вии «овыаонтой токсм»о.ч' проницаемости, клетка начинает терять "малые" ос мол 4ï u v ган^а, как глюкоза, АТФ, глутатиоН, 2,3-ДФГ. ашво;и;елоты и др. ), t результате чего обшая концентрация осуолитой внутри клетки, уменьшается, и создаваемое ими осмотическое давление стг.';;.-вится меньше, чем создаваемое внеклеточным ПЭГ, что и приводят к сжатию клеток. Амплитуда набухания (начальной фазы яэмен-зикя объема тимоцитов) быстро уменьшалась, с ростом концентрация ПЭГ 4000, и при осмотичкостк больше W мОсм уже ¡se регистрировалась. Поэтому по зависимости скорости этой Фе^ы от коп цен грации ПЭГ4000 нельзя было установить величину градиента оикотического давления через лийфоцитарную мембрану.

Пэсле прохождений клетками фагы набухания и скимапил, м объем обычьо устанавливался на некотором уровне, KCïoptrt iw.v -зависел от осмотичности среды. Мота о полагать, что г. то" уро-

85, ТД

70-

Сахароза, мМ О

ПЭГ4000

ТДгвО

Амфотерицин 2,5мкМ

Время, мин

Время, мин- •"

б ~Тб~

,75

.70

Рис. 12. Действие амфотерицина В на светоиропусглиие суспензии тимоцитов в стандартном растворе, содержащем дополни--те ль но различные концентрации сахарозы. Треки скорректированы на величину изменения светопрояускания из-за ограниченной растворимости полнена. -

Рис. 13. Действие стайилотокси-на на светопропускакж суспензии тимоцитов в стандартном растворе, содержащем дополнительно различные концентрации ПЗГ4000. Справа от каждой кривой указана осмо-тичность, создаваемая данной концентрацией полиэтиленгли-коля в водном растворе. "

Рис. 14. Зависимость коэффициента отражения Ставермана для раличных неэлектролитов от их гидродина-¡¿Гческого радиуса. Обозначения: 1- поры индуцированы амфоте-рицином В; 2- поры индуцированы стаФило-токсином. .

б ■1,01

0,5

с -I

в -г

Гидроди

лнекический

20.

вень объема клетки соответствует такому, ее состоянию, когда из нее вышли все осмотически активные вещества, им^лцие размер меньший, чем сечение CT-поры. Какова же концентрация "больших" осмолитов внутри лимф: цитов? На этот вопрос ыожо ответить анализируя зависимость предельного изменения объема клеток от осмотичности среды. Обнаружено, что эта зависимость пересекает ось абсцисс при ПЭГ-создаваемой осмотичности, равной 10 мОсм. Эта р°личина, по-видимому, соответствует градиенту онког«-ческого давления через плазматическую мембрану пермеабилизо-занной стафилстоксином клетки в стационарном состоянии (когда тимоцит потерял все осмолиты, проникающие через СТ-пору). Определение размера индуцированных водных пор в' мембране ткмоцитов.

Проницаемость неэлектролитов через клеточные 'iiipffi!:,' принято характеризовать коэффициентом отражения (коэффициент Ста-вермана) (Staverman 1951, Solomon 1968). Анализ изменений осмотического равновесия клетки, вызванных пермеабилизацией плазматической мембраны, позволяет получить следующие выражения для расчета коэффициента отражения:

d »l-(dV/dt) i/(dV/dt)o -по. начальной скорости изменения клеточного объема;' _

б -С1-Д v/д Vo)/(l+AY/V)-по предельному изменению клеточного объема.

Здесь: (dV/di) i и (dV/dt) о -скорость изменения объема клетки в присутствии и отсутствии неэлектролита соответственно; У - объем интактной клетки; А V к Д Уо-пр:!ращзиио объема после пермеабилизацик и Д стихения равновесия в ¡отсутствии и отсутствии неэлектролита соответственно.

Ка рис. 14 отложены коэффициенты отражении для различных (¡сзлектролмой, определенные по скорости набухания для амфоте-рициновой поры, и по предельному изменению клеточного объема зля CT- пори, с зависимости ст их перодинамических радиуст». Точка пересечения прямой с линией б=1 дает ог^ы.у радикса поры, а разброс аксперименталыиа значений ошоснгааыю Ераасй -ошибку определения. Исходя из таких зависимостей для пор, индуцированных амфотеркцкном В (в диапазоне концентраций 2,5-80 дом (5--4о мяМ), получено значение эффективного радиуса, равнее 4,1+0,3 А. Для стафилотоксиновой поры в мембране «шодагов радиус пор установлен равным 13+2 А. Отметим,

. . ' - 30 -

что для исследованных каналоформеров определенные величины образуемых ими пор в мембране тимоцитов были близки к оценкам радиуса пор, полученным в экспериментах на БЛМ и на зритроци-тарных мембранах, что является свидетельством адекватности •использованного подхода

Результаты наших исследований позволяют объяснить действие амфотерицина в и стафилотоксина на иммунную систему тем же механизмом» что и их фунгицидную (полиен) и гемолитическую активности-, образованием ионных каналов. Так, данные по калиевой утечке свидетельствуют о том, что при низкой концент-. рация каналоформера существуют состояния клетки, когда при практически неизменном объеме пассивная проницаемость клеток будет заметно повышена. Это, естественно, приведет к напряжения системы активного транспорта ионов, направленную на стабилизацию объема клетки. Такое напряжение может приводить к общему повышению метаболической активности клетки, что по-ввди-kom(v к наблюдается в опытах по активации иммунной системы.

IV.KfKOaS КАНА.Ш В И2МБРАНАХ: структура И ФУНКЦИИ. Результаты определения радиуса сечения каналов, образованных различным» порообразующими веществами в искусственных и природных мембранах позволяют вплотную подойти ■ к решению . основной задачи: установлению структурно-функциональных взаимосвязей в ионных каналах. Естественно выделить два аспекта поставленной проблемы: • ч

1. Построение структурных моделей ионных каналов; .

2. И ответ на вопрос: Как данная структура канала обеспечивает выполнение им той ях'л иной функции?

Соответственно этим двум аспектам и располагается материал данного раздела

Структурные'модели ионных каналов. ■ 1. Альфа-стафилотоксиновый канал. Совокупность литературных и полученных нами данных поэт-' лкет предположить, что СТ-канал имеет следующее строение:

-является иятербелкозой норой диаметром 25-30 А и длиной около 100 А;

-образован 6 молекулами стафилотоксина; -встроен в ыеабрану асимметрично, так, что лишь одно из устьев контактирует с полярными головками дияида, а - другое выступает еа пределы Сислоя на 35-40 А. Анализ влияния поверх-

' • - 31 -ноетного заряда липидного Оислоя на зизк^кЧескйй потенциал у входов в канал (подробно изложенный в диссертации) позволяет количественно обосновать асимметричное р?споглтта ('Т-гторг; относительно плоскости мембраны. Рая'/лпьтат такого ача.:нча соответствует электронно-микроскопическим нашил» (РичйТе ^ а1. 1981).

&№фа-стафшютоксив имеет двух-доменную структуру а состоит из двух частей (сколо 1? и 14 кДн), имеющих бота-складчатую структуру и соединенные петлей из неупорядоченной цепи аминокислот в полокэнии 119-143. Взаимное р?спг».»ог9-' ние эочк дояэнов в водорастворпмсм мономере С! ;кяш«шо ь& рис.15 (по ТоЬкез оп а1. 1985). 11а. этом жз рисушси изображена модель стафилотоксинового канала. Такое строение СТ-поры. по-ьишмому, • рвялиэуртся 2 ВЯМ,. I! М?и5уак2 ЗрЯТрСВД^СЬ Црй высоком концентрации токсина, а таюке в мембране лимфощггез.

Й настоякее время тьзамерная структура СТ-канала является - достаточно общепризнанной. В. то из время, наши опыта с эритроцитами позволяю?! предполагать, что токсин мохзт формировать фук!'4дюпальныё пентамеры и тетрамеры. Поскольку биохимическими ксгодами шеазаяо ¿¡ергдировакие ка зр'итроцитарной мембране только 1*ёК!?амеров (ВЬаксИ et аХ. 1984), возможно, олнго-аэаы физичесш состоят из я;ести молекул СТ, г пеятг- и тстг" парная паря организованы так, как изображено ни рис. гО.

2. ¡Ьдаттиновая поре.

Выделим 2 условия., которым должна удовлетворить г, ы^.ит.чшового

1. Радиус нори дол>ин варьировать й переделах и-1 '¿о •..

2. Ца селективность не должна влиять, ни одна из т--. * л:них ,-рупп можк1'ли, косш аминогруппы М-концевсго остатка

Второе из этих условий показано наш экспериментепо анализу рН-зависимости катион-анионой селективности мембран, моциЛилировячинх м?.*ипч»ном (крипа*? сри^егелстг-увт о яалкччи тогыя одной трувюй группа с 6,5. что соотшхтвугт Л-КОШ^ЗВОУУ 01у) К формиа- ЫвДК-1I ИНОМ »дигрующцеси группы отсутствуют).

Нз рис. 16 представлена молекулярная модель ыелиттиновой поры, удовлетворяется ^оспих^пгм пя&? гс-овкчм. Пора с-л :.а 7-51 мономеров, которкс рьсъъхкг;*"-'-;?. >• «лоскссч-к ^мврли 1а!-:, что ил10с^сс олкзким к оси канала оказывается ашногрупт

гэ

Мономер в растворе

ВШЯ*

Шс11§25| к&нал вР мембране

Функциональный тип поры: .

гекс'амерный

пентамерный

етрамерный

Ркс 15. Огру.{турпй« юдоль сгз$#иа1окенз:ового конного канала в мембранах.

ономер в мембране

Оаигомерная пора в мембране

Рис. 1С. Структурная модель мелиттиновой поры. В верхней части рисунка по!савано расположение мономера относительно поверхности мембраны (пунктирная линия), детектируемое совокупностью физических методов,.(Тет 11 ^Бег е1 а]. *?8;').

ff-концевого остатка глицина Такое расположение мономера в наибольшей степени удовлетворяет его локализации, детектируемой совокупностью физических методов (Tcràlllger et al. 1982) и схематично показанной на этом же рисунке. Ионогеняые группы остатков лизина и аргинина располонены на достаточном удалении от оси поры, и в силу этого практически не влияют на проходящие через нее ионы.

3. Пора, образуемая полиеаозиая айтаСяогисигл. ключевой параметр полиеновой поры - ее размер - оказался крайне консервативным: ни изменения температуры и pH среды, ни глубокие структурные изменения в самых различии* частях макро-лидного остова не меняли её в широком ниапазозе ковпзотрацйЯ - гемолитиков. Таким образом, можно полагать,'. 'что структурная ' hgücüj канала, первоначально йролло«еннай для zu&isрмааисьсго.' (Finkelstein « üolz 1S7G; Do KruHff,.<5 Dessl 1574), имесг высокую степень общности. По-видимому, пора, образуемая полве-новыМи антибиотиками как в модельных,' так и в природных «емб- . ' ранах, состоит из двух полулор в виде лодш далетяроз (с внутренним диаметром 8 А), построенных из 8-10 .молекул антибиотика и чередующегося с ним стерина Следуя- этой модели,; первый тип . структурных изменений, . исследованных в нашей работе, затрагивает внутреннюю полость канала, ¿ 'второй тип - устье поры. В • работах (Borisova et al. 1986; Errpishkin et al. 1977) иокага-Ho, что транспортвыз свойства омфотершичс-вого канала определяются связыванием ионов в.ц&кг'ральяоЯ части пора 8го хорошо согласуется с результатами настоящей рчботы: для гатиои-анионной селективности полиеновш каналов наиболее значимыми бы.«' структурные изменения, затрагивающие централизую часть какалг<, но не устье пора. Таким образом, можно вак точить, что >п>с структурную модель ' АВ-поры, так и механизм транспорта ионов черев нее можно распространить на более сирокий круг каналов, образованных полиеновыми антибиотиками как в природных, тёк и, Боамолпо, в искусственных мембранах.

v;:îc:'.'.':i ионных каналов. Одной из основных функций транс-мембранной поры является-транспорт ионов и воды. В настоящее время не суоэствует однозначного способа для установления связи между структурой поры и ее ион-транспортирующими свойствами. Результаты наших исследований могут оказаться полезными в решении этой проблемы. Tait,

- щ-

экспериыещы, по. алхтщ ¡юэлекщолитрв на норные токи ' через ста^ило^сснповьф, латротокрицрвдй, каналы, а тага» через поры,' образовали® фрагментом.. С7;, тркс«ч§скщп! белками холерного виб^кода. и. Р. рыПиИ^укадьщеввг, на,дцффузиочный механизм ион-цого транспорта, осуществляемого этими,структурами. В то - же гремя, ионная селектданрсть, в.рйзлщюй мере выраженная для.

каяаарв, а. а© целинеЩфст^, их вольт-амперных характеристик. ^.сущо.стврва^цщ.в структуре поры заря-гюш'кх фущщ«?цал}.дых, РбУРладяцвакща. ионную иэбира-грлх-нрстд и, эцср^етцуескуц ^однородность транспортного пути какала. }^тр.м^ти,ч?сг^,Ц9дель,,СЕрбо®1.оЯ диффузии в водойапол-цэниой цор^. чдаю .вднсгещшх групп, бы- • л:д. реализована, пгдмл, щщрх.- с,трдесгзф£Юй,шде.гв, описанной в ланцоц раздзлз.). для., стаф^одтодаувдвой.-. поры (Красильниксв, Сабуров 198-7', Кг^с11п!кс/ & ЙаЬ! гоу 1989) и в-более простом виде (С/с-о ^ае-та,эл^',етичес)фго ,пррф51ля). для латротоксинового кана-!1,др. .1986; Красильншов, Сабиров 1988), При агсц, уст^вдвлекр., что диффузионные уравнения при учете элсч^ррстатд^с;;ст,.^а1?м6действий проходящих ионов с заряда},ш и/>, входах порц .праБрляаг толичественно описать большую часть эдиюрда^атадьвдх дарах. •

При., рассмотрении взаимодействия каналоообразухздю; веществ с, кг.етс&щ. ид.первый..план .выходит гемолитическая ( или в более ' об^ем,случае. - цитолжгическая). функций, которая является одной ир основу д^я. згаогеиньсх порообрадуюдих веществ.

Теор^тедескмЯ,,ацадир "коллоидно-осмотического лизиса.эритроцитов, ,(Рро1ег, 1985) основывается на предположении, что объем клетки. определяется.доннановским равновесием, а нарушение этого равновесия связано .с повышением катиоююй проницаемости клеточной мембрана. Однако, экспериментальная -проверка застав- * ллег уооьзипъсп в таком .механизме. Так, разрушен :е спектрино-вой сети эритроцитов приводило к исчезновению лаг-периода и кинетика гемолиза становилась экспоненциальной, что противоречит приведенной выше схеме, согласно которой кинетика лизиса описывается с пошиью электро диффузионных уравнений, которые решается совместно с уравнениями осмотического баланса. Исследование роли таких параметров кон-транспортируюшей структуры, как ее ионная избирательность и размер сечения так же свидетельствуют о ее сомнительности.

«саульз'АТ логарифм лиу.^за-*»:* S0¿-••„...•

..ток. Однако,-на наы вагляд.правильнее использовать разность в

i'J¡l -".^'C í.HJi'-ji'

i i -1 'jv'1 /;. i) - T ;0" лагиГ", ;г: "'-п.:; Í ■ ■.'.". r>i'.'.

би/. клеток), будут зависеть как от параметров поры (являюпихся

'b.-.i ó;v<eo ;vh, tcíj "■-■.'■к.- ;.'¡ .- ..

Физический смысл параметра мом:о пояснить следующим примером.

кг» ИМ ИРПУарФИП BPfnnU ТГГ*Г*Т% t» С»ГУТЛП'TVNHT*rnоГ>итГtA t <cmtM"\OTJ4T УЖ Г!

ее проницаемость, по гемолиза еще ¡¡е произошло, ю ото осн<т;а--ет,- что клеточные механизма стабилизации объема справляются с индуцированными нарушениями проницаемости плазматической раны. При дальнейшем повышении концентрации гемолитика с.ог;-пости потоков, создаваемых образуемыми им порами становятся достаточными для преодоления сопротивления клеточной системы стабилизации объема. - Ясно, что чем больше гемолитическая Эф-ЙЭКТЯВЯССП. "НДЛШЭСЗОПНЭЙ о ЗВИТССШТарНОЙ ШибППКб лори. :<">>'»" > '¡ ■ i., •„-,'?:-., т.*м Mein-' - -:.viv ' -" ^

!о->:.-долскиг! ! клети'.'ного , ... .

\Ы йьучкли <с*ъ зарс^-трл I» ••:• v.unu •«

ьоэи. iKw. ее K-vn-л;. ил>н.>ымя i' легион-катиыкии > К/.'м v/ . •:;;Ы1С"ТГ1. 'Л рпдкус. ^-„^„¡со::,, ч;'"' !1>ч-ь>-п

ьи корселирукя с , ймолкшч-о^.г йк^кьнспп^к- kí«-: ».«л... .. (. рис. 1У). гак, поры близкого диаметра, но противоположной из-

Ли'")Л7,л пь>;лр[г;1 ( fíanтошрр .^и^уптпп^гчрипт.гш и' ^то^фр^улпяа) rrvní.-

.-.и f.cíí.mh аитс/ит •'■> -скуй 4/ Олед;;?': г • ; • „

функции с уменьшением ионной избирательности поры, кап это видно на рис. 17.

К 1*0 J ^TV^Wa í"-f ргор ТТЛ nnTlíaUUUO Г^П:^ Т! 1*i;>iиЧП VQfnp Т* 1111', ч<

i ?5ли"ну11 химическую nr-'-ip.-.;?-/ г,:< ^кк?-- у ¡■zi.'/.a-j ^poíilT-'

Il'JД'líiHHJliiüií CTPOI C.í '...wj^iíwlííí ^Ciñutu^iÁ'ilT-íw»j¡U.*/4 см vi Ao'

uoci'^x поп '.рис. i8¡. 'Гак r:o ;-лй.\.~д>у :;•. ■

. Параметрh

Параметр h

•20 0 . 20 мВ

5 . 10. 15

Радиус поры, А

Рис. 17. Зависимость параметра Рис. 18. Зависимость параметра

h от катион-анионной селек- h от радиуса водных пор, ин-

тивности пор, образованных дуцироваккьк различньии кака-

разлкчньми каналоформорами. лоформерами в мембране зрит -

На абсциссе - потенциал нуле- • роцитов. .Обозначения: 1-гра-

вого тока на градиёнте шщи'дин D; 2-среднее значения

(50/150 мЮ- KGI. Пунктир - '. для амфотерицина В, бутамфо-

'теоретический' -нернстовский' цина, леворина, амиллеЕорина,

потенциал. ■ Обозначения: 1-бу- ' нистатина и микогептина;

тамфоцин, 2-микогептин; З-грдмицидин S; 4-стафило-

3-иистчтин; 4-амфотерицин В;- ' токсин; "5-мелиттин,

5-стафилотоксин; 6-грамицндин ... .

S; 7-медиттин; 8-грамицидин .

D; 9-амллеворин; 10-леворин. "

ванные поры характеризуются величиной параметра Ь в районе 1,4+0,6 (среднее для всех полиенов), хотя их селективность варьирует в широких пределах. В то же время, небольшое уменьшение радиуса поры при переходе от леворина к грамицидину 0 (обладающему близкой к леворину ионной избирательностью) дра-.штически уменьшало его гемолитическую активность. Переносчик валиномицин вовсе не образует пор и, соответственно, лишен гемолитической функции, несмотря на то, что эффективно повышает катионную проницаемость зритроцитарной мембраны.

Ключевая роль размера поры в определении гемолитической

активности канадофсрмеров является сильным аргументом в пользу ■ того, что движущей силой коллоидно-осмотического гемолиза является повышение водйОй проницаемости эритроцитарной мембраны. Обычно предполагается, что клетка находится з осмотическом равновесии с внеклеточной средой. Результаты напш эксперииеи-тов позволяют предположить, что состояние покоя клетки является- скорее стационарным, чем равновесным. То есть в покое существует система, обеспечиваю^* компенсацию потоков вог<н, инправленных внутрь клетки по градиенту оиконыззкого дагле-лия, создаваемого разнообразными осмолита^ (бедка, шкрозрга, • аминокислоты и другие метаболиты). Геыодитики, образуя в шмб-расо эритроцита поры, прявсдзт. т. псяздаяж спзтетелйыг потоков во^ы, направленных по градиенту огаютического давления внутрь клетки, которая тeпep¿ Кб в состояли таягажипих имеющимися системами стабилизации обкома. Огсяда понятно, что чем больше размер поры, я, соответственно ее способность пропускать воду, .тем большей гемолитической способностью эта пора будет обладать. . Пэ-видимому, разность концентраций ионов иат-рия и калия внутря и снаружи клетки не играет заметной роли в стабилизации клеточного объема, ■ поскольку лаж эчя^озькоз повышение проницаемости илазматинеской яембсаны в отнскэнил этих ио;юв не вызывает лизиса.

в к а о д ы.

1. Шоведоно систематическое исследование электропровод-нсс;1;! и втакостк злоктролнт-неэлектролптных растворов. Установлена шарообразность формы молекул ПЭГ в растворах, а также ^¡ооаалсямосгь подвижности конов от размера молекул исследованных неэлектролитов. Определены эффективные гидродинамические радиусы для 40 гидрофильных неэлектролитов (полиолы, углеводы, полпэтнлгкгликоли) с м. м. от 62 до 20000.

2. Исследовано влияние гидрофильных неэлектролихов на з:ол-транспортирую!дие свойства ионных каналов. Показан диффузионный механизм транспорта ионов через широ;;ле поры (стафило-тскспн, латротоксин). Установлено, что взаимодействие неэлектролитов со стенками поры, незначительное в широких кгшалах, существенно возрастает при переходе, к узкой поре. Определен

. критерий проницаемости неэлектролита -' наклон зависимости проводимости г-анала от электропроводности водной фазы, содержащей даг«:1ый неэлектролит.

3. Впервые детально обоснован новый метод определения разверз а; ■;зпия водных лор одиночных ионных каналов в планарных лнпчдных мембранах на основе только электрических измерений. Его применение к ионным каналам, ' индуцированным стафшютокси- • ном я его 16 кДа каналообраэующим фрагментом, латротоксином, холерным энтеротоксином и гемолизином показало высокую информативность и надежность метода, а также хорошее соответствие полученных данных с имеющимися электронномикроскопическими исследованиями.

4. Показано, что электродиффузионное описание, свойств ионных каналов позволяет выявлять их асимметричное расположение в -плоскости бислойной планарной липидной мембраны с точностью, сравнимой с точностью электронной микроскопии.

5. Летально исследован механизм коллоидно-осмотического_ лизиса эритроцитов под действием порообразующих веществ. Показано, что кинетика гемолиза в значительной мере определяется состоянием систем стабилизации объема клетки. Установлено, что

каждого 1?аналоформера.. можно определить гемолитическую С:\чкц.то образуемого т канала, которая слабо зависит от его ионной избирательности и в основном определяется размером сечения и, соответственно, водной проницаемостью поры. ,

. - 39 -

6. Исследовано влияние гидрофильных цездестролитоз па, взаимодействие порообразукют земств с зрдароцетшя. Детгщ-до. обоснован метод определения р&дор-ч кядуц5фовшэдш в .!-е;.<бръпл\ эритроцитов лодгпгх пор по протекции гтсчш Обнаружено, что одик- и тот яэ каналоформер обладает способностью Формировать з мембранах н*скок-чо таадй зсккчх пор <• различными эффективными радиусам;::

формировать ионные каналы трех танов 1 <,Г» А; '■:>-'< >\ и ЛЬ

кглйттия - два типа (12 л и £5 л); грздицидии 3 - т^ле -¡/ч; типа (б А и 13 А), образование каюгого типа тряг^тг*'!?. белками я пептида!«! истых ганалог с рээдоз.ьм р>хчус:=. . сд-^'-п«".р рег/дир/етея э.Мтклтакой концецт^адай кс.цецофор^ра. * мембране, температурой и, возможно, транс-мембранным иотенша-

"К йсслздогапо взшаюдаЯсувве .цорообразуквдх веществ с лимфоцитами из тимуса крыс, разработан подход к определению проницаемости гидрофильных- неэлектролитов через индуцированные водные поры в мембране лимфоцитов из тимуса крыс и измерению размеров тагах пор. Установлено, что исследованные каналофор-меры форгаруют в .пимфоцитерной мембране поры .такого да размера, что. и в искусственных ЛЩ и > мембране эритроцитов.

8. Разработаны структурные модели строения етефгпятпссг'г. -г,ого и ттл'л тикового каналгой. Обе пори предстзали.е- аобс-• «.Штерне олигомары, асимметрично расположенные в пло-'Яб-п- • ¿нлщшого натрикоз. Выявлено, "то структура по-зш:ш« пор не зависит от типа усУбрал, температуры, рй ергпи структурных шдкфикидай лактечного кольца и/кяа гкдрофигмь»? тодовки полизнов. Погаэано, что молекулярная модель амфстзс-.-,-цшювого канала (две пояупоры, образованные 8-10 тюкул»»* антибиотика, стабилизированные стериком и т:ек>ыке радиус 4 },) полно распространить на все исслбдоьакныз в работе полкены: амЛотерииин В и его алчкл-проиев^тчг. лззорик к г го <:>-;-кил- продаподные, пкетагин, лменчт'як.

СУНЪИЙ ВА ТАБИИЙ МЕМВРАНАЛАРДА ИВДЖДОЯ ДОИНГАН ИОН КАНАЛЛАР:СТРУКТУРАСИ ЕА ФУНХЩШАРИ.

Диссертация ишининг асосий надсади - ион каналларининг тузилшини хамда уларюшг функдиялари ва структураларининг Узаро боглшуигишг Урганиш. Адабиётдаги бор маълумотларнинг анализи луни к?рсагадики, хозирги пайтда кан^лнинг энг асосий параметрларидан брлмиш - унинг катталиги (ион ташиш й^лининг радиуси) тугрисидаги ахборот куда хам кам ва фрагментардар. Вахоланки, бундай маълумотлароиз ион каналининг тузилишини аншуши аоло мункин емас. Шу сабабдан . биринчи ' навбатда биз сунъий мембранвларда индукция к^шинган каналларнанг радаусини аншлага усулларини тадкик втдик. Шу максадда влектр заряди бУлмаган неэлектролит моддаларни к?ллаш максадга мувоффиадкр. Виз шулар таркпбига кирувчи 40та куйи молекуляр дамда полимер моддаларни туз, орктмаларининг електр утказувчйялигкга ва ковущоклигига таъсирини урганиб-чикдак. Такрибалар натижаевда новлектролитларнинг ■ гидродинамик радиуслари аникланди/ ва ' уларнинг ион хвракатчанглигига таъсири модца молекуляр огирлигига (яъни молекулакинг катталигига), боглик емаслиги топилди. Полимер ноелектролитлар (поливтиленгликаллар) сув вритмаларида ионлар шиыдарилган тзрлар шаклида'еканлиги к?роатилди.

Ноалектролит. ыеддаларнинг еритыадаги холатини ургангандан cJht, уларнинг ион каналларига' таъсирини к^риб чиадик. By ыоддалг.р иш канз.чи Утказув'-ганлигини' дям, узгартирар вкан. Хусусан, агар модда'радиуси кичик Cjtaea, канал Утказувчанлиги вритма утказузчанлиги ^анча камайса, шунчага камаяда. Лекин, катта хажмдаги ыоддалар -каналдан ?таётгяц влэктр токини камайтирмайди, аксинча. оз иикдорда купайтиради дам. Шу нарса аёнки, катта ноэлектролятлар кавалдан ?тыайди ва шу оабаСдан унинг ?тказувчанлкгини рзгаргара олмайда. Шундай таггрибалар аоосида новлектролит иоддаларшшг канал оркали Jfram критерийси тггрйфланди ва ион каналларининг радиусини аниклаш принцяпиал янги усули кашф етилди. Шу уаулни к?ллаб, катор ион' каналларининг радиуси аншуганди! стафилококкнинг алфа-токеши (13,5±0,5 А) В8 унинг 15 цДа фрашентн (13,1±0,7 А) хосил кцлган, коракурт задари таркибадаги вльфа-латротсксин . юсил кдлган (9,4±0,6 А олтита турдаги турли Утказ.увчанликка вга амшштудалар учун),.ва бир неча бодща каналлар учун. Янги метод ёрдамида

ла,тротокеии каналлари кластер тузилишяга эга еканлиги топилди.

Табшй мембраналар .-рифатида биз эритроцит хамда лимфоцит хукайраларининг плазматик мембраналарини танладак. Канал хссил "килувчи " " моддалвр" таъсирида кечадаган""' гемолиз' (яъни еритроцитларнинг вриш) жарвёни батефсил $рганилди ва унинг механизм аникланди. Поранинг гемолятик хусусияти унинг гэн танлашга эмас, балки сув ?тказиш хусусиятигз узвчй богликдаги к?рсатилди. Гемолиз жараёняга ноелектроит модааларюшг таъоирини тадкяки эритроцит мембранасида индукция вталган каналларнинг Р''диусгшя Улчаш имконини Серди. Стафилокозс: токсияи уч турдаги (7,5 А; 8-9 А ва 14-15 А), асалари захари твркибидаги меляттии 'моддасп ккгт турдаги (12 & вз 26 А), гретлтдедин 3 ентябиотикя шага турдаги (б 1 ез 13 А) порзлзряи тс сил кустист аякцланди. Поранинг у ёки бу катталига канал' хосты хулувчя модцанинг концентрацинси ва температурага боглиадир.

Каналоформерлар таъсирида лимфоци-г хужайраларининг шиша жараёни кузатилада, лекин улар вримайди. Шуиякг учун бу типдага мембраналарда индукция оулган каналлврнинг катталигини аницлаш учун бощача усумгар г к?ллвш 'керак. ' Шу максадда биз хужайрэ хаяаяшинг узгаршари ва ундан тешки мухитга кадай иоалардтшг чикин кинетихасшш батзфсзи ^рганиб чивдих. Неэлектролит моддалэрнинг мсмбранадан 'Утишни Стэверман коэффяциетям ёрдзмида таърифлаш мацсэдга мувсффик деб .топилди ва шу йрл билан индукция кзышнган лорал ершит радиусларя улодяди. Амфотериция В, яевория ва отафилотоксинлар лимфоцитларда бошца системязрдвгига $жшаш каналлар хосил килиш курсатилда.

Иш якунида биз стафилотркоин хавда мелиттин хосил килг&н каналларштг молекуляр структурасини таклиф кладок . Полней антибиогиклар хосвл килган каналларшшг тузилиша амфотериция канали учун таклиф килвнган молекуляр моделга т?ла лойинлигини в^рсатдик.

INDUCED IONlC CHANNELS IN ARTIFICIAL, AND HATORAL MEMBRANES: STRUCTURE AND FUNCTION.

•At present the molecular structure as well as exact values of radii for the 'most chant (els are unknown ; or contradictory. in this 'tfcssis the Influence of nonelectrolytes on conductivity ¿¿rid Viscosity 'of KCl sol at 4 on as well as on ion channel conductance studied. It was 'found that:

i-nobility of I'Orts i'n solutions only depended on percent* 'concentration ( v/v) of added 'noneiGctTolytes and practically ¿id not depend dn its CheWical nature '(sugars or polyglycols) and Wolecul&r sl£o;

li - the proportionate 'Change both the ion • channel conductance and the conductivity or bulk solution by low m. w. ndnslectroiytes my toe Kised as the criterion of diffusion 'inschdn'iSn of lo'n transport through channels;

*&ii i"i - ths slope of dependence of ion channel conductance ¿gai'nst conductivity of bulk.- solution containing different concentration of nonelectrolyte is a good measure of channel permeability for nonelectrolyte. .

The new method of pore size determination is substantiated. . The results of practical apply of this simple method tc several type of ionic channels (formed by alpha-latrotoxin, by staphylococcal alpha-toxin (ST) and its H-torminal fragment etc.) were shown. The preferences and the difficulties of this method were discussed. • The' cluster organization for alpha-latrotpxin channels in lipid bilayers was established.

Erythrocytes and lymphocytes were taken as exanples of natural roambranes. Si2es of water pores formed by channel forming substances in these msinbranes were determined by. analysis of nonelectrolytes influences on haemolysis or voIuwq change respectively.

It was established that some distinct channel former was able to induce several types of pore with different radii. Indeod, three types of pore structures, were found for ST-channels (7.5 A; 8-9 A and 14-15 A respectively), and two types for melittm Channels (12 A and 25 A) and for gramicidin

- 43 r

S channels (6 A and 13 A), tt vss established that toth the-: increase in channel-former concentration and the rising oi' temperature leaded to the creating of pores with larger effective radius.

The radius of aTphoterioin 8 (A3) pore in erythrocyte membrane was independent on the AB concentration, on the incubation temperature (4-37®C) and on the pH of media s. pH 4.5-9.1). Alkylation cf AB and levorin decreased the haemolytic activity of polyenes, but did not change botn th.-lon transporting properties of channel« and pore iadi:. . Nystatin and micohsptin differed from AB by ha;sf»lytio activity and channel selectivity but had simiJsr -f

pores.

The detailed analysis, of channel-formers induced haemolysis yielded that:

i- lag-period that is characteristic for colloid-osmotic lysis/was determined by the state of cell spectrins;

ii- only the size of pore, but not the ionic selectivity of channel is important for. its cytolytic capability.

For lymphocytes it. was established that channel-forwrs (a^photnerioin 8, levorin and ST) at micromoiar ooncentraiic:..' increased cell ' nercbrane permeability and induced ti:e ceil SY/elJing. The Staverman's reflection coeff icier,i s. fo-different hvdrodynami <J radii nonelectrolyles «ere jeter.ninei'i, and the equivalent radii of the pores induced in the thvi.ocy: 5 coll membrane were estimated. It was suggesto,! that ch&.rie) formation in cell membranes is actually able to modulate the immune responses.

In conclusion, structural models for channels forr»<3 by staphylococcal alpha-toxin and melittin were proposed. It ras proposed that the .TOlecular model of AB channel oan oe extended to large class of polyene antibiotics.

СПИСОК РАБОТ. ' ОПУБЛИКОВАННЫХ Ю ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ. .

1. Красильников О. Е , Терновский ЕИ., Сабиров Р. 3. Дашму-хамедов RA. Устойчивость некоторых белковых каналоформеров к протеолитической деградации.// Биофизика- 1985.- т.30,

• ВЫП. 1. - С. 79-81. '

2. Красильников О. Е , Сабиров P. 3. Бислойные лшшдные мембраны в исследовании мембранной активности бактериальных токсинов.// Ыат._ 1 Всесоюзной конф. по бактериальным токсинам. -Москва. : 1985. - С. 130. .

3. Красильников 0. Е Терновский Е И., Сабиров Р. 3., Зари-пова Р. К., Ташмухамедов Е А. Катион-анионная селективность стафилотоксиновых каналов в липидном бислое. // Биофизика -1986. - т. 31, вып. 4. - С. 606-610.

4. Красильников 0^ Е , • Сабиров Р. 3., Терновский Е И., Ташмухамедов В. А. Природа и приближенное математическое описание свойств латротоксинового канала // Биол.- мембрана - 1986. -т. 3, No 9. - С. 936-94а; •

5. Красильников О. Е . - Терновский Е И., Сабиров Р. 3., Ташмухамедов Я А. Токсин-индуцированные' ионные каналы в липидном бислое.// Mat. 37th feeling Int. Soc. El&ctroch&w., Vilnius, USSR, August 1S86. r V. 4.- P. 440-451.

6. Красильников 0. E Сабиров P. 3. * Бислойные липидные , мембраны в исследовании мембранной. активности бактериальных токсинов.// В сб.: • Бактериальные токсины (ред.KlЕЕзепчун).-It: 1987. - С. 55-66. '

7.КрасильникоЬ 0.JEL, Сабиров Р.3..Ташмухамедов RA. Строение и транспорт ионов черев канал, образованный альфа-токсином Stahylococcus aureus в липидных бислоях. // В сб. : Бактериальные токсины (ред.Ю.аЕзепчук). - It: 1987.- С.66-81.

8. Красильников 0. Е , Сабиров Р. 3. .Влияние ионов кальция на калиевую проводимость датротоксиновых каналов. // Биофизика. - 1988. - т. 33, ВЫП. 2- - С. S5S-369.

2. Гфасильников О. & .Сабиров Р. а , Чантурия А .Паршико? А. Проводимость и диаметр латротоксиновых каналов в липидном бислое.//.Укр. биох/м. журнал. - 1988. - т. 60, No 6.- С. 67-71.

10. Krasilnikov 0. V. , Sabirov R.Z.. Ternovsky V. I., Merzliak P. 6., Tashmtikhamedov B. A The structure of staphylococcus Aureus alpha-toxin-induced ionic channel.//

- 45 -

Gen. Physiol.Biophys. 1983. V 7. - P. 4<p-473. • -

11. Сабиров P. a , Захидова Л.Т., 1фратходжаев Д. H. Д;истиве грамицидина С на пириродные и искусственны.? мбмбарны. // Тезисы IV съезда физиологов' Узбекистана. - Ташкент.: 1988, - О. 182-183.

12. Красильников О. В.. Сабиров Р. 3.. Ташмухамедов Б. А. Бели-чина . проводимости латротоксиновых каналов./V Тезисы IV съезда физиологов Узбекистана. - Ташкент.: 1922. С. 185-185.

13. Krasilnikov o.V. and Sabirov R. Z. Ion transport trough chassis ferret} by StaphyJococcus aureus alpha-term. // "Gon. Physiol. Siophys. - 1989.- V. 8. - P. 213-222.

14. Красильников О. В., Мерзляк а P., Сабиров P. 3. Структур-нофункциональные взаимоотновения между стафилотоксиновым каналом и мембраной.// Тезисы Всесоюзн.симп. "Одиночные ионные каналы в биологических мембранах". - Кара-Дат.: 1989. - С- 52.

15. Красильников 0. В., Сабиров Р;3. Доказательства кластерной организации Са-кайалов, образованных латротоксином в ВШ// Тезисы Всесоюзн. симп. "Одиночные ионные каналы в биологических мембранах",- Кара-Еаг.: 1989.-' С. 53.

16. Красильников О. а , Муратходжаев Д. Н. , Сабиров Р. 3., Воронов С.. Е., Езепчук ю. R Образование В-субъединицей холерного токсина водонаполненных пор в о плоских липидных мембранах. // феэисЫ ?,-ой Всесоюзной конференции "Бактериальные токсины". - ¡фмала.: 1989,- С. 60.

17. Сабиров Р. 3., Красильников О. & , Костряэвская Е. Г. Ионная избирательность модифицированных мелиттином плоских ли-пидных бислоев.// Укр. биохим. jsypn. - 1990.- т. 62, N 1.-С. 82-87.

18. Сабиров Р. 3.Красильников О.. В. , Шпкулова С. В.,' Костржезская S. Г., Щербацкая НЕ Действие аниснов на гемолитическую активность мелиттина. // Укр. биохим. дурная. - 1990. -Т. 62, No 17. - С. 87-91.

19. Сабиров Р. 3. , Захидова Л. Т., Красильников 0.3. Зависимость эффективного радиуса индуцируемой алъфа-тсксипом S. aureus в эритроиитарных мембранах водной поры от концентрации каналоформера и. температуры.// Тез. докл. Всесоюзного симпозиума "Конные ¡«шалы в биологических меьбранах'Ч 24-27 апреля, 1990, Кара-Дат), Москва.: 1990,- С.78.

20. Мерзляк Я Г., Красильников 0. Е , Сабиров Р. 3. ПЬтенци-

ал-индуцировь^нуй переход стафилотоксиновых каналов в малопро-водявде состояния и радиус их водных пор. // Тез. докл. Всесоюзного симпозиума "Ионные канавы в биологических мембранах" (24-27 апреля, 1990, Кара-Дат)Шсква.: 1990.- С. 38.

21. Эл-Оуфи С. А. Ф., Сабиров Р. 3. -, Красильников О. Е Амфо-торлцинозые каналы в зритроцитарных мемС>рз::ах. // Тез. докл. Всесоюзного аашоинума "/lochte каналы в биологических мембранах" (24-27 апреля, 1990, Кара-Дат), Москва.: 1990,- С. 104.

22. Сабиров Р. а , Красильников О. Е ., Зарубина А. 11, .Захи-дова Л. Т., Ыуратходлаев Д. Н., Юдина Т. IL Действие грамицидина * S на на клеточные и модельные мембраны. // Вестник Московского Университета сер. 16, Биология. - 1990. - No 2. - С. 51-56.

23. Красильников 0. Е , Сабиров Р. 3., Терновский В. И., Мерзляк IL Г., Таимухамедов Б. А. Селектизность латротоксиновых каналов в липидных бислоях.// Биофизика. - 1990.- т. 35, вып. 5.-С. 601-804. ' -

{ 24. Сабиров Р. 3., Захидова Л. Т., Красильников О. Е , Таш-мухамодоб Е. А. Избирательность цитолитического действия стафи-лотойсина и структура образуемых им водных пор в зритроцитарных мемранах. // ДАН СССР. -1990. - т. 315, N 6. - С. 1479-1481.

25. Сабиров Р. 3., Красильников О. Е , Терновский Е И., 15ерзляк П. Г. Влияние неэлектролитов на подвижность ионов в объеме водного раствора и в. полости канала. Определение радиуса поры из электрических^ измерений. // Биол. мембраны. - 1991. -Т. 8, No 3. - С. 280-291. .

26. Сабиров Р. 3., Захидова JL Т., Красильников О. Е Три типа пор, образуемых в эритроцитарлых мембранах альфа-токсином S. aureus.// Биол. мембраны. - 1991.- т. 8.- С. 749-754.

27. Эл-Суфи С. А. Ф., Сабиров Р. 3., Красильников О. Е ,Таш-мухамедов Б. А. Размер амфотерициновой поры в мембране эритроцитов.// ДАН СССР,- 1991.- Т. 317. No 2.- С. 780-781.

28. Krasilnikov 0. V. and Sabirov R. 7.. The evidence of ■ cluster organization of ion channels formed by latrodectus trediciiryuttatus alpha-toxin in lipid bilayers. // In: 1st International V/orksfiop "Pore Forming Toxins" Castel Ivano, Italy.: 26-29 September 1991.- P.82.

29. Krasilnikov 0. V., Sabirov R.Z., „ Ternovsky V.l., Xterzliak P.Ü, Muratkhodjaev D.N. The simple method of determination of ion channels water pore radii in planar lipid

b! layer membranes.// In: 1st International Workshop "Pen' Forming Toxins" Caste! Ivano, Italy.: £3-22 sapteiifcer 1891,-P. 48.

30. Красильников 0. В., Сабиров P. a , Терпоаский В. К Валки, ионные каналы и регуляция транспорта ионов о «кбршгах. -Тажент.: ФАН, 1991, - 208 с.

31. Сабиров Р. 3., Таджибаеаа Г. Ш., Красильников 0. В., Зл-Су$я С. А. О., Ташмухашдов В. А. Вдиякке гидрофильна неэлектролитов на одиночные аг^фотерициковые ка-гадц, // Докл. АН ?Уз, -1992.- No 1.- С. 52-64

32. Сабиров Р. 3., Мангюсовз 11А., Ирасидьникой о. В. Эл-Суфи О.А;Ф. , Ташмухе>«лов В.А.. ДафэгериадшойЬг» лчнали в иембране лимфоцитов из тауса крыс. // Докл. АН РУз. - 1932. - No а - С. 52-54.

33. Krasilnikov 0: V., Sabirov R. Z., Ternovsky V. I. , J,ferzliak P. G., Muratlihodjaev D. M. The sinple mathod of determination of ion channels water pore radii in planar lipid bilav^r rombranes. // FEM3 Microbiol. Iirmunology. - 1992.-Y. 105. - P. 93-103. ...

' " 34. Сабиров P. 3., ¡Сяьчнбаева H. Л., красильников О. а Блокирование латротоксинового канала ионами кадаия. Виофиакт. • 1393.- Т. 38, вып. 1.- С. 1-4.

35. Krasilnikov 0. V. and Sabirov R. Z. ТЬз com".* analysis of latrotojiin channels of different с№:й,:гсл";сс i,. planar lipid bilavers. The evidence for aiu^tir organization.// Biochim. et Biophys. Acta - 199? - tf. I'M", P. 124-128.

Информация о работе

Сабиров, Равшан Заирович
доктора биологических наук
Ташкент, 1993
ВАК 03.00.02

Автореферат

Похожие работы