Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние мембраноактивных соединений на барьерные функции клеточных мембран

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Влияние мембраноактивных соединений на барьерные функции клеточных мембран"

АКАДЕМИЯ НАУК РЕСПУБЛИКИ УЗБЕКИСТАН ИНСТИТУТ ФИЗИОЛОГИИ И БИОФИЗИКИ

На правах рукописи

Ел-Суфи Сами Ахмед Фуаад

ВЛИЯНИЕ МЕМБРАНОАКТИВНЫХ СОЕДИНЕНИЙ НА БАРЬЕРНЫЕ ФУНКЦИИ КЛЕТОЧНЫХ МЕМБРАН

03.00.02 — Биофизика; 03.00.04 — Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Ташкент 1992

Работа выполнена в Институте физиологии и биофизики АН Республики Узбекистан.

Научный руководитель: доктор биологических наук О. В. Красилышков

Научный консультант: академик АН Республики Узбекистан Б. А. Ташмухамедов

Официальные оппоненты: доктор биологических наук А. И. Гагельганс, доктор биологических наук М. У. Туйчибаев

Ведущая организация — Институт ботаники им. В. Комарова АН Азербайджана.

дО

Защита состоится » ^ису^с/ 1992 г. в час на

заседании специализированного совета К 15.01.01 по защите диссертации на соискание ученой степени кандидата наук при Институте физиологии и биофизики АН РУз (700095, г. Ташкент, ул. Ниязова, 1).

С Диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института физиологии и биофизики АН РУз.

Автореферат разослан <<Дл_» г.

Ученый секретарь х

специализированного совета /

доктор биологических наук ' \ 3. У. Бекмухаметова

- з -

ОБЩ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность тема Исследования последних лет показывают, что механизм действия некоторых антибиотиков, в том числе по-лиеновых, связан с их способностью изменять прош: демость мембран. В настоящее время из природного материала выделено несколько сот различающихся мевду собой полиенов. Большинство из них обладает выраженной противогрибковой активностью, тогда как их антибактериальная активность мала. Около десятка полиенов ут выпускаются в виде коммерческих препаратов. Их широкое применение в медицине позволило обнаружить, что -омимо выраженного терапевтического действия полиены вызывают и некоторые другие интересные с физиологической точки зрения эффекты (Ellis etal., 1982; идр.,), позволяющие по новому взглянуть на механизмы их действия. Поэтому именно к этим сторонам дейстг:ш полиенов обращено особое■ внимание исследователей в последние годы. В их числе следует отметить:' 1- синергизм в действии полгэнов с другими антигрибковыми препаратами, а также антиопухолевыми агентами (Cao, Zhen, 1939; Midez et al., 1989); li- стимулирующий э{фект низких концентраций полиенов на рост грибов и на иммунный ответ (Henry-Toulme et al., 1989). Кроме того бурное развитие современного метода электрофизиологического исследования клеточных мембран - patch-clamp - обратило вншаые исследователей к полиенс-i - как веществам, потенциально способным пермеабилизовать локальный участок клеточной мембраны (п^д электродом) в достаточной мере для измерения токовых ответов всей клетки, находясь при этом в режиме cell-attached, минимизируя повреадение клетки. Для рзгания отмеченных вопросов (понихегшч токсичности, понимания механизма "побочных" эффектов и расширения сферы применения полиенов)

несомненно актуально сравнительное изучение действия ряда по-лиенов и их производных на различные мембранные системы. В качестве последних наиболее часто применяют плоские бислойные липиднье мембраны (Касумов, 1981; Борисова, 1979; Ыалафриев, 1086; Шкаилова, 1090; Самедова, 1991). Тогда как исследования, проведенные на клеточном уровне, весьма отрывочны и фрагментарны. Хотя именно комплексное исследование может дать подход к направленному синтезу лекарственных препаратов и критерии отбора их наиболее перспективных форм.

Полиены способны нарушать барьерную функцию мембран, изменяя работу ион-транспортирующих систем биомембран (Уегил-0о1 еЪ а1., 1333), так и путем образования в них ион-проводящих каналов. Эти каналы интенсивно изучаются, в течении последних двух десятилетий. Большинство выводов об их структурно-функциональных параметрах основаны на результатах, полученных в экспериментах с использованием биелойных липидных мемОранС ШШ) Однако априори не исключено, что структура таких индуцированных в БЛМ каналоч отлична от таковых в природных мембранах. Следовательно, для детального понимания физиологических и фармакологических эффектов полиеиов необходим анализ структуры каналов, в частности, размеров их водных пор, образуемых поливном в клеточных мембранах, в качестве которых е настоящем исследовании мы использовали мембраны клеток крови.

Цель и задачи исследования. В'связи с важностью вышеперечисленных проблем целью настоящей работы явилось изучение влияния ряда полиеновых антибиотиков и их производных на природные и модельные мембранные системы.

В процессе исследования решались следующие задачи: 1. Выявить факторы, определяющие кинетику полиен-индуци-

рованного личиса эритроцитов.

2. Изучить гемолитическую активность производных амфоте-рицина В (АВ), леворина А и некоторых других полиенов.

3. Установить размеры водных пор, индуцировании, различными концентр; щями ряда полиеновых антибиотиков (ПА), в различных мембранах.

Научная новизна. Основные результаты, полученные в данной работе, заключаются в следующем:

Кинетика индуцированого АВ лизиса аритроцитов не монотонна. Лаг период процесса определяется целостностью ^пекгриновой ' сети клеток, а не интенсивностью юс ыетайолитичесгаа процессов.

Все использованные в настоявдн исследовании ПА (нистатин, розеофунгин, АВ и его производные, леворин А и его производные) , за исключением розеофуягина, образуют в зритроцитарных мембранах водные поры с практически не отличимым эффективный диаметром, с -таким к 8А.

Эффективный диаметр образуемой АВ водной поры не зависит от типа использованных мешрая.

Структурная модель аияотерицинового канала очевидно верна . и для каналов, образованных другими подменами.

Для каждого ПА и юс производных имеется такая критическая концентрация, г^и которой размер образуема; ими пор в мембранах драматически возрастает. В рядах производных АВ и ."ворина А критическая концентрация возрастала о увеличением длины алифатического радикала заместителя.

Практическая цашгость. Полученные данные углубляют наши знания о молекулярных оснс~ах действия ПА и структурно-функциональных зависимостях их эффектов и расширяет возможности

использования полиенов в медицине и практике научных исследований.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на: Всесоюзной симпозиуме "Ионные каналы в биологических мембранах" (Кара-дат, 1990) и на научной семинаре Института физиологии и биофизики АН F73.

Публикация результатов исследования. Ib материалам диссертации опубликовано 4 печатные работы.

Структура к объем диссертации. Диссертация изложена на 101 странице машинописного текста и состоит из введения, 3-х глав, вклшащих обзор литературных данных, описания методов и использованных материалов, изложения и обсуждения полученных результатов, заключения, выводов и списка цитированной литературы, содержащего 35 наименований на русском и 82 -на иностранных языках. Диссертация содержит три таблицы и 28 рисунков.

ООДЕРМАШ ДИССЕРТАЦИИ ШЕРИМНН 1Шода ШХЩЩЦЩ

В работе использованы; амфотерицин в, полученный из лаборатории Squibb France (франция)} производные амфотерицина и леворина, любезно предоставленные проф. Касумовым X. Ы.; нистатин, микогептин, леворин и роаеофунгин, любезно предоставленные к. б, н. Казаковым И. (Институт физиологии и биофизики АН Узбекистана); Трио-HCl (Calblochem-Behring Corp., Германия); -еалектролиты: L-рибова, D-тагатоаа, маннит( Institute оГ Chemistry, Чехо-Словакия)j общие фосфолипиды на белого веврст-ва бычьего мовга, получали по методу, описанному Бергельсоном и соавт. (1081). Остальные реактивы были отечественного производства градации "х. ч." и "ч. д. а.

Получение суспензии эритроцитов и определенна гемолитической актиш гости. В качестве основной среды использовали 5мМ трие-ffîl буфер, рН-7,5, содержат^ 15О Ш NaCl. Гематокрит исходной суспензии эритроцитов человека (триады отмыт: : в этой среде) опредг -яли центрифугированием в капиллярах (8000 of/мин, 6 мин). Рабочую (27.) суспензию клеток инкубировали с полиеном и неэлектролитами в' необходимых концентрациях в течении указанного времени и затем центрифугировали 5 мин при 3000 об/мин. Оптическое поглощение супернатанта определяли спектро-фотометрически при 540 нм. Величину, соответству-тую 1002 лизису эритроцитов, определяли после осмотического лизиса алик-воты клеток в дистиллированной воде. На рисунках представлены средние значения не менее чем 3 экспериментов. Стандартная ошибка определения уровня гемолиза составляла ±(1-3)Х.

Использовали свежеприготовленные растворы полиенов в ди-метилсульфоксиде. Конечная концентрация растворителя не превышала 3%.

Лимфоциты из тимуса крыс получали по (Клаус, 1990). Изменение объема клеток регистрировали с помощью микрофотометра ЛМ$-69. Использовали красный светофильтр. Выходной сигнал регистрировался с помощью самописца К 200 (ГДР).

концентрации ионов калия определяли с помощью пламенного фотометра ПФМ-УЛ 4.2. 100% выход калия оп- делялся после полного лизиса эритроцитов в дистиллированной воде.

Биелойные ли: щкые мембраны (БЛМ) формировали по методу Montai & Mue lier (1972) и модифицировали путем внесения в оба отсека экспериментальной ячейки (по 5-10 мкл) препарата антибиотика Электрические параметры мембран измеряли в режю,.~ фиксации потенциала с помощью усилителя У5-11. Числа переноса

катионов (t+) модифицированных полиенаш мембран рассчитывали из величин потенциала нулевого тока(. .я) при наличии на мембране трех-кратного градиента концентрации КС1 ЮОмМ/ЗООмМ Б присутствии 5 мЫ трис-Ю1 буфера с рН 7.J по формуле: t+-(Eo-Ve) /(Ео-Еа) Осмотич!гость растворов определяли с помощью осмометра ОЫКА 1-Ц-05.

Математическая обработка данных. Константу скорости изменения объема тимоцитов (Kd) определяли путем апроксиыацйй экспериментальных кривых зависимости оптической плотности суспензии тиыоцитое(Б) от времени (t) уравнением типа: D-top*{l-exp(-Kd *t)> где Dnp - предельное значение оптической плотности, Ап-роксимацию проводили путем минимизации суммы наименьших квадратов опа.ненкй экспериментальных точек от теоретических кривых с помощью алгоритма случайного поиска минимума (Эдер, 1972, Красильников и др.,1386).

Статистическую обработку данных проводили по стандартным формулам и программам. Вся математическая обработка проводилась на компьютере IBM PC/XT.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОЩУЩЕНИЕ.

Кинетика гемолиза, индуцированного амфотерициноы R. Установлено, что АВ в мик^омолярных концентрациях вызывает лизис эритроцитов. Кинетике этого процесса достаточно сдож-на(рис. 1). В ней можно выделить лаг-период, который составлял от 9 мин(С -20 мкМ) до 30 мин( С-3 мкМ), и фазу роста ууовня гемолиза, которая при низких концентрациях антибиотика моглс. продолжаться до 4-6 часов. При низких концентрациях АВ (3-10 мкМ) фаза роста уровня гемолиза адекватно описывалась суммой

0,2 100 Время,мин 0,6 300 1,0

1еСАВ1икМ 1

-0£5

о-0,50 -21 \ /_^ I

\ У

а К

а >

-3 -0,75 ОР

-1,0

Бремя, мин

100

300

Рис. 1. Кинетика лизиса человеческих эритроцитов под действием различных концентраций АВ. Концентрации АВ (мкМ) на рисунке обозначены : • -1.5; о - 2.0; з -2.5; Д - 3.0; А -4.0; в - 6.0; в -

8.0; о - 10.0; о -14.0;. - 20.0

Рис.2. Кинетика индуцированного АВ гемолиза в линеари-зовшшых координа--1,0 тах.

Обозначения: в и о •• зависимости 1п(аов- И) (левая шкала) от времени (мин) для концентраций амфотерицина В, -20 равных 3 мкМ (левая ' ось ординат-1) и 14 мкМ (левая ос1, ординат-2)- соответственно; Д - зависимость логарифма максимальной скорости лизиса >30 (7. гемолиза/мин, ' правая шкала) от логарифма концентрации антибиотика.

100

100

14

«Г

(О §

50

л-к

<а

ш &

50

Вреда, ник

ЮР

Рис.3. Влияние де-иахураци спегегрииа (V) и блоюцхзвшшя анионного транспорта предобработкой эркг-роцитов 011В (О) на юойтику гемолиза (сйетлые символы, правая шкала) и выхода ионов калия (Темные символы, левая икала) под действием АВ.

Обозначения: р ,-нативные эритроциты человека. Использована концентрация АВ равная 2,5 мкМ.

двух экспоненциальных процессов (рис.2). Постоянные времени этих процессов уменьшались с увеличением концентрации антибиотика и становились неразличимыми при концентрации АВ>10 мкМ. То есть число выявляемых кинетических составляющих изменялось при варьировании концентрации полиена. Зависимость максимальной скорости гемол .за (наклон линейного участка зависимости уровня гемолиза от времени, X гемолиза /мин) от концентрации антибиотика и в двойных логарифмических координатах Г рис. 2) имел два линейных участка с наклоном, равным 3,0+0,1 при малых и 1,3+0,1 при больших концентрациях АВ, Это указывает на изменение общего кинетического порядка процесса с ростом концентрации антибиотика. Полученные значения наклонов были близки к обнаруженным ОеиНске еЬ а1. , (1973) на эритроцитах (1,5т2,5), но существенно меньше величин, полученных на искусственных Оислойных липидных мембранах (4-10 по Саээ е1 а1., 1970).

Поскольку набухание непосредственно предшествует собственно лизису, то понимание механизма гемолиза во многом определяется пониманием механизмов стабилизации клеточного объема. Есть основания полагать, что метаболизм эритроцитов (Атауллаханов ч др. 1986), а также система транспорта анионов и состояние цитоскелета играют заметную роль в стабилизации объема клетки. В наша экспериментах такие факторы, как блокирование системы транспорта анионов (рис.3) и уровень внутриклеточного АТФ не оказывали существенного влияния на форму кинетических кривых. В то да время разрушение спектриновой сети эритроцитов приводило к исчезновению лаг-периода и кинетика гемолиза становилась экспоненциальной (рис. 3).

Эти данные свидетельствуют о том, что сложившиеся к настоящему времени теоретические представления о коллоид-

но-осмогическом гемолизе и их математическая интерпретация нугвдаются в существенных дополнениях. Так, лаг-период, характерный для коллоидно-осмотического гемолиза, кроме времени изменения проницаемости мембраны, включает также, по-видимому, и время, необходимое на преодоление сил, препятствующих изменению объема, в частности, жесткость цитоскелета. Поэтому, S-об-разную кинетику правильнее описывать в рамках формализма, разработанного для кинетики последовательных реакций (Эмануэль, Кнорре 1984).

Предотвращение гемолиза ноэлектролитами и размер анфото-рицюговоЯ поры Одним из критериев коллоидно-осмотического механизма гемолиза является его предотвращение инертными веществами, выравнивающими онкотический градиент через эритроцитар-ную мембрану (Velner et al., 1985; Katsu et al., 1988). В наших экспериментах добавление bj внеклеточную среду инертных дисахаридов приводило к замедлению гемолиза,- индуцированного АВ (рис.4). При концентрации сахарозы >40 мМ гемолиз даже при больших концентрациях АВ (>14 мкМ) практически не наблюдался вплоть до 2 часов, хотя в его отсутствии он заканчивался за несколько минут (рис.4). Перенос эритроцитов в среду без неэлектролита после 2-х часовой инкубации в присутствии АВ и 40 мМ сахарозы приводит к быстрому лизису клеток, что указывает на осмотический механизм протекции. Использованные для предотвращения гемолиза концентрации сахарозы не являются избыточными, так как онкотическое давление гемоглобина внутри эритроцитов близко к 33-34 мосМ (A'ider, 1928; Freedman, Hoffman, 1979).

Варьирование размера неэлектролитов во внеклеточной среде позволяет оценить размер амфотерициновой поры, так как прони-

60

Время.кин

Рис.4. Кинотика амфотерйцин В-индуцированного гемолиза при различном содержании а среде сахарозы.

При проведении экспериментов использованы стандартные условия. Концентрация АВ ЕО мкМ. Температура инкубации 37 С. Концентрации сахарозы (мм): Д- 0; о- б; •- 10; »- 20; А" 40.

2,62 ЗД 3,4 3.6 4 4Я 4,640 3

i я -й i i ■ ■ a s

I g g. g g d g

* * S I * I 1

6PH .8

t'C

О_.20 40

.10

1 2 IgCABJMKH

Рис. S. Зависимость уровня гемолиза от гидродинамического радиуса неэлектролитов.

Обозначения: о - концентрация АВ 14 мкМ; А - концентрация АВ 40 мкЯ Время инкубации 120 мин. Концентрации неэлектролитов были равны 40 мМ.

Рис. 6. Зависимость радиуса амфотерициновой поры от концентрации полнена (нижняя шкала), температуры и pli среда (верхние вкалы).

Обозначения: о- r-f(CAB)), 37 С. 120 мин, рН-7.5; •-r-f(t С), 20 мкМ АВ, 240 мин, рН 7.5; Д- r-f(pH), 37 С, 20 мкМ АВ,' 120 мин.

О

кающки неэлектролиты осмотически не активны и не могут выравнивать онкоткческий градиент и предотвращать лизис клеток. Действительно, глицерин, этиленгликоль, арабиноза и глюкоза не ингибировали гемолиз, тогда как сахароза, мальтоза и меллибио-за эффективно его блокировали (рис. 5). Радиус неэлектролита, соответствующий 503-му лизису клеток, может быть принят в качестве эффективного радиуса амфотерицияовой водной поры. Используя такой подход мы установили, что эффективный радиус AB-индуцированной водной поры в эритроцитарной мембране очевидно близок к 4,0 А при использованных концентрациях полнела, равных 14 и 40 мкМ (Рис.S).

Оставался неизвестным вопрос: способен ли AB образовывать Еодные поры различных размеров в природных мембранах, поскольку для некоторых других каналоформеров размеры образуемых ими водных пор в мембранах варьирует от условий среды. В случае амфотерицюговой поры ее размер оказался стабильной величиной и не изменялся в достаточно широком диапазоне концентрации полнена (от 2 до 60 мкЮ и диапазоне температуры от 4 до 37 С (рис.б). Размер амфотерициновой поры был таклй неизменен на всем исследованном диапазоне вариации величины pH среды*( от рН-4,5 до рН-9,1; рис.б). Следует отметить,однако, что при очень высоких концентрациях гемолитика (больше 60 мкЫ) наблюдался резкий рост определяемого таким способом размера пор, что, по-видимому, связано с детергентоподобным действием полнена на липндньй остов эритроцитарной мембраны.

Отметим, что определенное нами значение радиуса амфотерициновой поры в мембране эритроцитов близко к оценкам, полученным в экспериментах на БЛМ (3. БА, Борисова и др., 1978; 4А, Holz а Finkelsteln, 1970) и молекулярной модели (4А, хуторский

- 14 -

и др., 1988; Хуторе кий. Наменчук, 1988).

Сравнительный анализ действия а-дои- замещенных производных амфогерицина В та эритроциты и ВЛМ. Молекула АВ является амфифильной, причем гидрофобная зона локализована в области сопряженных двойных связей, а гидрофильные свойства определяются карбоксильной группой и микозамином. Замещение аминных водородов в углеводной части молекулы и этерификация карбоксила позволяет изменять как общий заряд молекулы, так и ее амфи-фильные свойства, что несомненно сказывается и на мембраноак-тивных свойствах антибиотика. Нами научен ряд производных АВ с общей формулой: С00М-1М1(И)3

где й.• метил, этил, пропил, бутил; й- лактонное ядро молекулы ДВ. В отличие от исходной молекулы, которая является цвиттерионной, эти вешэства несут один положительный заряд на атоме ааот;. , а такав более гвдрофобны.

Обнаружено, что все исследованные соединения оказывали лизирующее действие на эритроциты. В качестве меры гемолитической активности удобно использовать величины равноэффектив-ных концентраций, вызывающих 50%-й лизис кг ток. Установлено, что проведенные замещения приводят к уменьшению гемолитической активности полиена, причем эффективность действия производных уменьшается с увеличением длины И (рис.7).

Применяя описанный 1ыше метод определения размера водных пор в эритроцитарной мембргле показано, что в области низких концентраций эти производные АВ формируют поры, размеры которых были неотличимы от размеров пор образуемых исходной молекулой АВ. Изучение зависимости эффективного радиуса пор ог концентрации гемолитиков показало, что для каждого вещества существует определенная пороговая концентрация, выше которой

13 5

Длина алкильной цепи Рис. 7. Равнозффегаишше юищентрацин алкил-производных АВ (е- правая шала) и леворина (о- левая скала).

По оси ординат-длина алкильной цепи. 240 мин, 37 С, рН среды 7. 5.

0,10

0,15

§

I 0.2

10 20 Время,мин

30

« 0,75

•0.5

¡0,23

>а-о

2

сахароза, лактоза

щшозит глюкоза

^рябоза Тглицерия

2 3 4 5 Гидродинамический радиус

Рис. а Влшпшз АВ па оптические свойства суспензии тимоцягов.

Представлен результат типичного эксперимента. На оси ординат: изменение оптической плотности суспензии тимоцитов (3,8 млн. клеток/мл) во времени в ответ на добавку АВ. Стрелкой отмечен момент добавки антибиотика, конечная концентрация которого (мкМ) указана с правой стороны от каждой кривой.

Рис. 9. Зависимость коэффициента отражения АВ-индуцированных пор в мембранах тимоцитов для различных неэлектролитов от эффективного гидродинамического радиуса последних.

наблюдается резкий рост размера пор. Величина этой пороговой концентрации, также возрастала при увеличении длины алкильной цепи. Кроме радиуса поры, другим важным свойством формируемого полиенами канала является его катион-анионная избирательность. Установлено, что в БЛЫ все изученные препараты амфотерицина В и его алкильных производных формируют в БЛМ анион-селективные ионные каналы (табл.1), причем ни изменение заряда полярной части полнена, ни увеличение длины алифатической цепи не сказываются кардинально на,ионной избирательности полиен-индуцированных каналов. По-видимому, "селективный фильтр" поры локализован в центральной части поры. Этот вывод хорошо согласуется с механизмом ионной избирательности амфотерицинового канала, предлагаемого в работе ВоПБОУа еЬ а1., (1986).''

Гемолитическая активность полиешвьи антибиотиков, родственных АВ. Антибиотики нистатин, микогептии и леворин по химическому строению очень близки к АВ. Розеофунгин является пентаеном, то есть несет только пять сопряженных двойных связей. К сожалению, точная структура этого антибиотгсса пока неизвестна.

В наших экспериментах все эти полиены, также как и АВ, были способны дизировать эритроциты человека. Как и в предыдущем случае, для сравнения их относительной активности использована равноэффективная доза гемолитика (ГА). Наиболее эффективным гемолитиком является леворин (ГА-0,12 мкЮ. Ыикогептин, розеофунгин и амфотерицин имеют примерно равную эффективное^ (ГА-3,5 шМ, 1,9 мкЫ и 1,6 мкМ соответственно), тогда как гемолитическая активность нистатина была с умственно меньше (ГА-40 мкМ).

В области низких концентраций эти"антибиотики (8а исклю-

- 17 -

Таблица ^Катион-аниошоя селективность каналов, индуцированные в ЕЛИ из о&зого липида шгга амЗготерицюгом В, ловоровэа А и их алкилькьыи произведшим.

1 П--1-1-1

п|Вещество |Vm, м& | t+ |

Н-:-1-1-1

ЦЛеворин (23,7+0, б |0,97+. ОН

I lit 2|Штлеворин |23,3+1,2|0,9б+.02|

II I I

3|Проплеворин|23,5+0,б|0,9б+. 011 I III

4|Бутлеворин'| 20 I 0,9 | I I I I

51Амиллеворин124,5+1,010,98+. 021 I I I I

б|Нарблеворин|23,8+0,4|0,97+. 011 I III

7|Леворвдон 124,7+0, б 10,99+. 011

г 1 ■ — |nlВешество 1 i г ------1" ■—.....1 Vm, мВ | t+ | ' 1 1

1 1 ШАмфотерицин 1 i 1 1 -20,4+1,8| 0,10+. 04| 1 1

1 1 |2|Мэтамфоцин 1 1 1 1 -20,б+р,8|0,09+.02| 1 1

1 ( |3|Этамфоцин 1 1 1 1 -22,3+2,0|0,06+. 041 ' 1 1

1 1 |4|Пропамфоцин и 1 1 -21,4+1,410,08+. 031 1 |

1 1 |5|Бутамфоцин 1 1 1 1 -23,2+0,310,04+. 01| 1 1

1 1 |б|Шнтамфоцин 1 1 1 1 -23,8+0,310,03+. 011 1 1

1 1 |7|Кар0амфоцин 1. ,.!,_, _, .... .. 1 1 -21,2+0, б |0,08+. 01| > ■

'В случае бутлеворина в начальный момент времени после добавки антибиотика потенциал нулевого тока доходил до 20 ыв (что указано в таблице) и далее постепенно уменьшался до о мВ и доходил до -18 мВ.

чением розеофунгина) формируют в мембранах водные поры, размеры которых были практически ралш размеру пор, образуемых ам-фотерицином В (около 4 А).

Различия в катион-анионной селективности каналов, индуцированных в липидных бислоях этими полиенами, боли более значительными, чем в случае алкил-замещенных производных АВ: число переноса катионов для нистатина, микогептина, розеофунгина ле-ворина равны 0,14+0,02; 0,25+0,02; 0,18+0,01-и 0,97+0,01 соответственно. Таким образом, наиболее геюжиттески активный антибиотик леворин обладал не анионной, как все остальные полиены, а выраженной катионной избирательностью. Отметим, что в атом ряду полиенов нет корреляции между эффективностью действия а :тиСиотика на эритроциты и селективностью образуемого им ионного канала.

Так хе, как и в случае АВ и его проиаводных, для каадого вещества существует определенная пороговая концентрация, выше которой наблюдается резкий рост размера пор, образуемых полиенами в эритроцитарных мембранах.

Антибиотик, розеофунгин стоит особняком в ряду изученных полиенов. Оказалось, что размер водных пор, образованных им в эритроцигаркой мембране, рос с увеличением концентрации антибиотика на всем исследованном диапазоне концентраций. Этот факт позволяет "педположить, что этот полиен не способен формировать поры фиксированного размера, а механизм его мембранной активности близок к детергентоподобному действию на липид-ный остов плазматической мембраны.

Сравнительный анализ действия алкил-аамещеннъи и некоторых других производите леворина на эритроциты и БЛМ. Среди исследованных антибиотиков леворин является наиболее эффектив-

ным гемолитиком. Поэтому представляло интерес изучить струк-турно-функционаллные взаимосвязь в молекуле этого представителя полиенов. С этой целью мы исследовали ряд алкилзамещенных производных леворина с общей формулой, такой же, как и в случае АВ.

В отличии от АВ, молекула которого является цвиттерионом, леворин несет на себе один положительный заряд, связанный с п-анинофенильным фрагментом. Поэтому, алкил-замещенные производные леворина имеют два положительных заряда на противоположных концах молекула

Леворидон и изолеворидон представляют собой комплексы антибиотика с поливинилпйрролидоном, хорошо растворимые в воде. Изолеворин является структурным изомером леворина.

Карблеворин ( также как и карбамфоцин, см. выше) является производным, в котором дополнительно введена карбоксильная группа следующим образом: НаООС-й-НН-сгв-ОСШа

Все изученные производные леворина в той или иной степени обладали гемолитической активностью. Как и в случае *"юизвод-гых АВ, гемолитическая активность производных леворина уменьшалась с ростом длины алкильной цеь.1 (рис,7). Размер водных пор, образуемых производными леворина в мембране эритроцитов был практически не отличим от размера амфотерициновой поры. Следовательно, используемая модификация леворина, хотя и существенно изменяет гемолитическую активность полнена, не сказывается на структуре образуемой им водной поры в мембранах.

Ранее в работе Микаиловой (1990) было показано, что алкил -замещенные производные леворина способны повышать проводимость бислойних липидньи мембран, очевидно, путем образования ионных каналов. В наших экспериментах все изученные произвол-

ные, также как и исходный леворин, увеличивали проводимост) БЛМ из общего липида мозга, причем селективность ион-проводя-щего пути при этом, также как в случае леворина, была катион-ной (табл.1).

Взаимодействие амфотерицина В с тимоцигами. В последне« время показано, что АВ способен стимулировать как гуморальный так и клеточный иммунитет (Во1агс1,198б). Механизм этого явления до настоящего времени остается малоизученным. Поскольк; тимоциты высокочувствительны к действию АВ (Непгу-Тои1шэ е< а1., 1989) мы испольаовали их в качестве клеточной модели дш установления первых этапов иммуномодулирующего действия полие-нов. Установлено, что внесение в среду, содержащую суспензи лимфоцитов тимуса (3,8 млн. клеток на мл), АВ в концентраци 1-5 мкЫ вызывало увеличение объема клеток (рис. 8). Кривьи обычно имели Б-образный вид с лаг-периодом продолжительность! до 10 мин. После вычитания времени лаг -периода кинетически кривые удовлетворительно описывались одной зкспонентой. В- ка честве кинетической характеристики этих экспериментов выбран; константа скорости набухания КЗ, зависимость которой от кон центрации антибиотика была линейна в двойных логарифмически координатах с наклоном, равным 1,9. Отметим, что это значени близко к величине, полученной нами в экспериментах на эритро цитах.

Увеличение объема тююцитов в ответ на повышение проница емости плазматической мембраны клеток свидетельствует о том что внутри клетки имеются осмотически активные компоненты непроникающие черев амфотерициновые пора Это подтверждаете тем, что с увеличением концентрации сахарозы во внеклеточно среде наблюдалось замедление скорости АВ-индуцированного набу

хания клеток вплоть до реверсии эффекта действия полиена -сжатия тимоцитов. Зависимость скорости изменения объема клеток от концентрации сахарозы пересекала ось абсцисс при концентрации неэлектролита близкой к 100 мМ. Поскольку средняя величина осмотичности содержащих неэлектролиты растворов равна 40146 мОсм/кг, а осмотичносо?ь базовой среды (не содержащей неэлектролиты) равна 297+9 мОсм/кг, то можно полагать, что разность между этими значениями (104 мОсм/кг) равна величине онкоти-ческого давления внутри тимоцитов.

Априори ясно, что неэлектролиты с различной молекулярной массой и, следовательно, размерами их молекул неодинаково будут влиять на скорость изменения объема тимоцитов, вызванного добавкой АВ. однако именно это дает возможность оценить размеры водных пор индуцируемых АВ в плазматических мембранах тимоцитов. Проницаемость неэлектролитов через клеточные мембраны принято характеризовать коэффициентом отражения /^.(коэффициент Ставермана) (Сорокина, 1978). В нашем случав, эту величину можно оценить по формуле: .(}. -1-(<1У/<1Ц 1/(<Г/ЛЛ)о, где <1У/Л скорость изменения объема клеток в контроле (о) и в опыте (1).

На рис. 9 отложены определенные таким способом коэффициенты отражения для различных неэлектролитов в зависимости от их гидродинамических радиусов. Видно, что молекулы с маленьким радиусом - глицерин и рибоза - осмотически не активны и хорошо проникают через мембраны, обработанные АВ, тогда как неэлектролиты с большими радиусами уже оказываются осмотически активными. Точка пересечения прямой зависимости Сд от величины гидродинамического радиуса неэлектролитов с линией <а«1 дает оценку радиуса амфотерициновой поры в мембране тимоцитов, которая оказалась близкой к 4,1 А.

Полученные нами данные позволяют утверждать, что первой стадией модулирующего действия АВ на иммунную систему является образование им в плазматических мембранах лимфоцитов ионных каналов, проницаемых только для веществ, гидродинамический радиус которых не превышает 4А, то есть практически тем же механизмом, который обусловливает их основную фунгицидную активность.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

Проведе лые нами исследования позволили выявить некоторые взаимосвязи между кинетикой лизиса и метаболическим состоянием клетки. • Так, движущей силой процесса полиен-индуцированного гемолиза и набухания лимфоцитов является градиент онкотическо-го давления чррез клеточные мембраны, который составлял приблизительно 40 мОсм и 100 мОсм соответственно, оч может быть выровнен добавлением непроникающих неэлектролитов во внеклеточную среду. Кинетика лизиса имела выраженный Б-образный вид, характерный для коллоидно-осмотического механизма. Однако, длительность лаг-периода определялось не только кинетикой изменения ионной проницаемости плазматической мембраны, как это предполагалось ранее, но и в значительной мере це "остностью спектриновой сети клеток.

Полученные нами результаты подтвердили опубликованные ранее данные о том, что изменения в макролидном фрагменте полие-новых антибиотиков существенно сказываются на ион-транспортирующих свойствах полиеновой поры, в частности, на ее селективности.

обнаружено, что изменения в области "гидрофильной головки" молекулы полиенов, которые заключались в алкилировании аминогруппы углеводного фрагмента при одновременной этерифика-

ции карбоксила, приводя к изменению общего заряда молекулы на +1 (теряется ионизованный карбоксил), к увеличению общей гид-рофобности молекулы и "экранированию" заряда аминогруппы объемными алкильныыи радикалами, практически, не сказывались на ионной избирательности образуемых ими каналов. Гемолитическая активность оказалась более чувствительной к таким структурным изменениям. О увеличением длины адкильной цепи заместителей гемолитическая активность производных как амфотерицина, так и леворина закономерно уменьшалась.

Вопреки ожиданиям, ключевой параметр поры - ее размер -оказался крайне устойчивый: ни изменения температуры и рН среды, ни глубокие структурные изменения в самых различных частях макролидного остова не меняли ей в широком диапазоне концентраций гемолитиков. Тип мембраны (эритроцит или лимфоцит) также был несущественен для радиуса полиеновых пор.

Наши данные свидетельствуют о том, что структурная модель канала, первоначально предложенная для амфотерицинового, имеет высокую степень общности. Как уже упоминалось, пора, образованная АВ в мембранах, состоит из двух полупор в виде полых цилиндров диаметром 8 А, каждая на которых состоит из 8 молекул антибиотика и 8 молекул чередующегося с ним стерина. Следуя этой модели, первый тип структурных изменений, исследованных в нашей работе, затрагивает внутреннюю полость канала, а второй тип - устье поры. В работах ЕгпцзШп еЬ а1.(1977) и Вопэоуа вЬ а1. (1984) показано, что транспортные свойства амфотерицинового канала определяются связыванием ионов в центральной части пора Это хорошо согласуется о результатами настоящей рабе .чь наиболее значимы структурные изменения, затрагивающие центральную часть канала, но не устье пора Таким

образом, можно заключить, что как структурную модель АВ-поры, так и механизм ионного транспорта ионов черев нее можно распространить на более широкий круг каналов, образованных полие-новыми антибиотиками как в природных, так и, возможно, в искусственных мембранах.

•Несколько особняком стоят данные, подученные с розеофун-гином. Этот тнтибиотик индуцирует транспортные пути, размер водных пор которых монотонно рос с увеличением концентрации полиена. Пг видимому, розеофунгин не способен формировать фиксированные поры, и лизирует клетки по детергентоподобному механизму. Этот результат ставит вопрос о необходимом (и достаточном?) условии для формирования поры фиксированного размера, который может быть решен только после расшифровки молекулярной структуры розеофунгина.

ВЫВОДЫ.

1. Кинетика амфотерицин-индуцированого ливиса эритроцитов не монотонна ваза роста уровня гемолиза двухэкспоненциальна при низких концентрациях АВ (<10 мкЮ и одноэкспоненциальна при больших концентрациях. Кинетический порядок процесса равен 3,0 +0,1 при малых и 1,3+0,1 при больших концентрациях АЕ Лаг период процесса определяется целостностью спектриновой сети клеток, а не кинетикой изменения внутриклеточных концентраций осмолитов.и не зависит от интенсивности клеточного метаболизма.

2. Лизис эритроцитов под действием полиенов происходит по коллоидно-осмотическому механизму и может быть предотвращен выравниванием онкотического градиента через клеточную мембрану.

3. В исследованном диапазоне концентраций для каждого из изученных соединений (нистатин,микогептин, амфотерицин В и его производные,леворин и его производные, за исключением розеофун-

гина) существует критическая концентрация, ниже которой диаыет-ры полиен-образоьанных водных пор в мембранах неиаменны, не зависели от температуры (4-37 С) и кислотности среды (рН 4,5-9,1) и близки к 8 А. При концентрациях антибиотиков больше критических расположена зона детергентоподобного действия полиенов.

4. Эффективный диаметр образуемой АВ водной поры не зависит от типа использованных (эритроцит или лимфоцит) мембран.

6. Алкилирование амфотерицина В и леворина уменьшает гемолитическую активность и детергентоподобное действие полиенов, не меняя при этом ион-транспортирующих свойств формируемого ими ионного канала и размера поры. В рядах производных АВ и леворина А критическая концентрация возрастала с увеличением длины алифатического радикала заместителя.

7. Молекулярная модель амфотерициновой поры может быть обобщена для широкого класса полиеновых антибиотиков, включая все изученные в настоящей работе (исключая розеофунгин).

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Ел-Суфи С. А. Ф., Сабиров Р. 3., Красильников о. В. Амфоте-рлциновые каналы в эритроцитарных мембранах. Тез. докл. Всесоюзного симпозиума "Ионные каналы в биологических мембранах" (24-27 апреля, 1990, Кара-Лаг), Москва, 1990, С. 104.

2. Ел-Суфи С. А. Ф., Сабиров Р. 3., Красильников О. К .Ташму-хамедов В. А. Размер амфотерициновой поры в мембране эритроцитов. ДАН СССР, 1991, Т. 317, N.2, С. 780-781.

3. Сабиров Р. Э., Таджибаева Г. Ш., Красильников О. В., Ел-Суфи С. А. Ф., Ташмухамедов Б. А. Влияние гидрофильных неэлектролитов на одиночные амфотерициновые каналы. Докл. АН УзССР,1992, N1.

4. Сабиров Р. 3., Манжосова М А., Красильников 0. а . Ел-Суфи С. А. Ф., Ташмухамедов Б. А.. Амфотерициновые каналы в мембране лимфоцитов из тимуса,крыс. Докл. АН УзССР, 1992, N3.

Подписано в пе.ать 18/2-52

Заказ № 172 Объем 1.0 а.л. Тираж 100 Типография ТапГосМИ ул. Хамэы 103