Влияние мембранотропных соединений на стабильность и электрофизиологические свойства вакуолярных мембран

Нурминский, Вадим Николаевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Влияние мембранотропных соединений на стабильность и электрофизиологические свойства вакуолярных мембран
ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Влияние мембранотропных соединений на стабильность и электрофизиологические свойства вакуолярных мембран"

На правах рукописи

Нурминский Вадим Николаевич

ВЛИЯНИЕ МЕМБРАНОТРОПНЫХ СОЕДИНЕНИЙ НА СТАБИЛЬНОСТЬ И ЭЛЕКТРОФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ВАКУОЛЯРНЫХ МЕМБРАН

03.00.12 - физиология и биохимия растений

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Иркутск - 2003

Работа выполнена в Сибирском институте физиологии и биохимии растений СО РАН, г. Иркутск

Научные руководители: чл.-корр., доктор биологических наук,

профессор Р.К. Саляев; кандидат биологических наук, A.M. Корзун

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Ю.М. Константинов,

Сибирский институт физиологии и биохимии растений СО РАН, г. Иркутск

кандидат биологических наук В.А. Полынов,

Иркутский Государственный Педагогический Университет (ИГПУ), г. Иркутск

Ведущая организация:

Казанский институт биохимии и биофизики Каз.НЦ РАН, г. Казань

Защита диссертации состоится "4 " ноября 2003 г. в 10 ч на заседании диссертационного совета Д 003.047.01 при Сибирском институте физиологии и биохимии растений СО РАН по адресу: 664033, г. Иркутск, ул. Лермонтова, 132, а/я 1243. Факс (3952) 510754; E-mail: cell@sifibr.irk.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Сибирского института физиологии и биохимии растений СО РАН.

Автореферат разослан « ¿^22^2003 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета - /

кандидат биологических наук Г.П. Акимова

Q_co3-A

15^71 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Многие из естественных и синтетических химических соединений способны при взаимодействии с биологическими мембранами изменять их структурные и функциональные характеристики, т.е. обладают мембранотропными свойствами. Изучение механизмов реакции мембран на химические воздействия необходимо как для понимания принципов функционирования мембранных систем, так и для осуществления направленного поиска новых биологически активных соединений важных во многих областях практической деятельности.

Интерес к вакуолярной мембране (тонопласту) высших растений как к модельному объекту при исследованиях мембранотропных эффектов обусловлен следующими причинами: 1) вакуолярная мембрана может быть достаточно легко получена и доступна для таких исследований в виде фракции изолированных вакуолей или высокоочищенного мембранного препарата (Саляев и др., 1981); 2) мембрана изолированной вакуоли является "чистой" биологической мембраной; на этом объекте отсутствуют другие структурные элементы (клеточная стенка, гликокаликс), которые могут влиять на мембранотропное действие веществ; 3) мембрана имеет постоянную ориентацию - цитоплазматической стороной наружу; 4) эта мембрана хорошо изучена в структурном и биохимическом отношении (Саляев и др., 1982, Саляев и др., 1983, Kaiser et al., 1986), исследованы ее основные транспортные системы: системы пассивного транспорта ионов, активного транспорта протонов и метаболитов (Тихонова, 1998, Maeshima, 2001).

В настоящее время в мире синтезируется большое количество химических соединений. Причем скорость появления новых соединений значительно превышает возможность получения данных об их действии на биологические мембраны. Существует настоятельная потребность в разработке эффективных подходов и методов тестирования химических веществ на биологическую активность. Для оценки мембранотропной активности новых соединений особый интерес представляет изучение барьерных свойств биологических мембран, поскольку многие из них могут влиять на мембранную проницаемость и стабильность. Для этой цели нам представляется перспективным использовать компьютерную видеорегистрацию процесса распада фракции изолированных вакуолей. Очевидно, что изменение барьерной функции мембраны будет отражаться на ионной проницаемости. Поэтому при выяснении механизмов мембранотропного действия веществ важно в первую очередь исследовать реакцию основных компонентов системы пассивной ионной проницаемости мембраны на их влияние. Наиболее информативными подходами к исследованию ионной проницаемости являются электрофизиологические методы.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы явилось исследование физиологической реакции функциональных систем мембран изолированных вакуолей на воздействие веществ, пот£щшады*в-ебяздшощих мембранотропной активностью, из классов рерЛвСаЛ/^й^^^име^ных

3 I С. Петербург

TUI9

соединений и стимуляторов роста растений.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Разработать метод изучения влияния мембранотропных соединений путем регистрации динамики деструкции мембран изолированных вакуолей с наиболее высокой степенью автоматизации эксперимента.

2. Разработать подходы для исследования механизмов мембранотропного действия веществ методом регистрации электрофизиологических параметров мембран изолированных вакуолей.

3. Изучить изменение барьерной функции мембран изолированных вакуолей в ответ на воздействие окислителей, восстановителей, протекторных соединений, полимеров и некоторых новых биологически активных соединений.

4. Исследовать реакцию системы пассивной проницаемости вакуолярной мембраны на воздействие одного из широко известных мембранотропных соединений - диметилсульфоксида.

Научная новизна. В ходе исследований разработан новый автоматизированный метод тестирования мембранотропной активности химических соединений на основе компьютерной цейтрафферной видеосъемки фракции изолированных вакуолей и автоматизированной обработки данных. Исследовано влияние химических соединений из классов окислителей-восстановителей, полимеров и стимуляторов роста растений на барьерные свойства мембраны и установлен ряд веществ, оказывающих хорошо выраженное протекторное действие на мембраны. Изучены электрофизиологические особенности взаимодействия с вакуолярной мембраной широко используемого в экспериментах и практике мембранотропного соединения - диметилсульфоксида.

Теоретическая и практическая значимость работы. Результаты исследований могут быть полезными для понимания особенностей реакции биологических мембран на химические воздействия. Разработанные методические приемы открывают новые возможности для первичного тестирования химических соединений на мембранотропную активность и позволяют выявлять вещества, влияющие на барьерные свойства мембран.

Апробация работы и публикации. Основные положения диссертации были доложены на Международной конференции "Физиология растений -наука III тысячелетия" (Москва, 1999), на Международной конференции по экологической физиологии растений "Актуальные вопросы экологической физиологии растений в 21 веке" (Сыктывкар, 2001), на второй сессии электронной конференции "Информационно-вычислительные технологии в решении фундаментальных научных проблем и прикладных задач химии, биологии, фармацевтики, медицины" (Москва, 2003), на молодежном академическом форуме '"Молодежь и наука Сибири" (Чита, 2003), а также на научных сессиях (2000. 2002 г.) Сибирского института физиологии и биохимии растений СО РАН. По материалам диссертации опубликовано семь работ.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, изложения результатов и их

обсуждения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 143 страницах машинописного текста, включая 31 рисунок и 1 таблицу. Список литературы содержит 200 источников (из них 142 - зарубежных авторов).

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объект исследований. Объектом исследований были изолированные вакуоли из клеток корнеплода столовой свеклы Beta vulgaris L. Растения выращивали на опытном участке института. Корнеплоды отбирали на фазе первого года вегетации и во время покоя (корнеплоды хранили при +4-+5°С).

Выделение вакуолей и растворы. Выделение вакуолей из тканей корнеплодов проводили микрообъемным механическим методом (Саляев и др., 1981). Изолированные вакуоли переносили в камеры установки оригинальной конструкции для цейтрафферной компьютерной видеосъемки с инкубационным раствором, или в камеру пэтч-кламп установки, заполненную контрольным раствором. Раствор выделения содержал - для экспериментов по изучению влияния веществ на барьерные свойства мембраны (в мМ): 100 КС1, 5 ЭДТА, 15 HEPES/KOH, рН 8,3, аланин (до осмотической концентрации 1000 мОсм • кг"'); для пэтч-кламп эксперимента: 100 КС1, 2 MgCl2, 5 ЭДТА, 50 трис/MES, рН 7,5-8,0. Осмотическую концентрацию (1150 мОсм • кг"1) регулировали аланином и измеряли на осмометре ОМКА 1Ц-01 (Россия).

Инкубационный раствор содержал (в мМ): 100 КС1, 15 HEPES/KOH, рН 7,3, аланин (до осмотической концентрации 1 Осм • кг-1). В качестве мембранотропных агентов использовали соединения, названия, концентрация, краткая характеристика и источник получения которых представлены в таблице. Поскольку цитотоксическое действие Н202 обусловлено тем, что он может быть источником гидроксильных радикалов, в растворы с перекисью добавляли 50 мкМ FeS04 • 7Н20 и 150 мкМ аскорбиновой кислоты для запуска реакции Фентона, как описано в работе (Иванов и др., 2000).

Контрольный раствор, использовавшийся для заполнения экспериментальной камеры пэтч-кламп установки и проведения контрольных измерений в начале каждого эксперимента, содержал (в мМ): 100 КС1, 2 MgCl2, 0,1 СаС12, 1 ЭГТА, 5 трис, рН 7,3-7,5 - MES, аланин (1150 мОсм-кг"1). Для заполнения микропипеток использовался раствор, содержащий (в мМ): 100 КС1, 2 MgCl2, 5 трис, рН 5,5-6,0 - MES, аланин (1050 мОсм • кг""1).

Компьютерная цейтрафферная видеосъемка микроскопических образцов. В целях автоматизации эксперимента по изучению стабильности вакуолярных мембран в условиях действия мембранотропных соединений нами была разработана и создана экспериментальная установка для цейтрафферной компьютерной регистрации видеоизображений серии микроскопических образцов, а также программное обеспечение (создано ведущим инженером-программистом СИФИБР C.B. Розиновым), позволяющее управлять экспериментом и обрабатывать полученные видеоданные.

На рис. 1 представлен общий вид и основные компоненты установки

* Вещество Концентрация Свойства Источник

1 Пероксид водорол.1 <Н202) ЮмМ 20мМ 50мМ Прооксидан г, окисляет метио-ниновые и цистеиновые остатки, разлагается с образованием гидроксильного радикала Реахим. Россия

2 Аскорбиновая кислота ЮмМ 20мМ Антиоксидант, взаимодействует с активными формами кислорода и радикалом токоферола Реахим. Россия

3 Ь-Глутатион окисленный 20мМ Прооксидант, инактивирует белки через окисление !-связей Sigma, США

4 Ь-Глутатион восстановленный 20мМ Трипептид (01и-Суз-С1у), антиоксидант, предохраняет от окисления ЯН-связей в белках Sigma, СШ

5 Дитиотреитол (ДТТ) 1мМ ЮмМ 20мМ Антиоксидант, восстанавливает Б-Б-связи Serva, Германия

6 Диметилсульфоксид (ДМСО) 1мМ, ЮмМ, ЮОмМ Апротонный органический растворитель, антиоксидант Реахим. Россия

7 Дигидрокверцетин (ДГК) 0,1 мг/мл 1м г/мл 10мг/мл Флавоноид, антиоксидант, ингиби-рует процессы ПОЛ ИХ СО РАН

8 Поливинилпирролидон растворимый (ПВП) 0,1 мг/мл 0,5мг/мл 1 мг/мл Полимеры 1 -этенилпирроли-динона-2, адсорбент фенола и хинона Merck, Германия

9 Арабиногалактан (АГ) 1 мг/мл, Юмг/мл Полисахарид, обладает гепато-протекторным, мембранотропным и иммуностимулирующим свойствами ИХ СО РАН

10 Сывороточный альбумин бычий (БСА) 1 мг/мл Белок, электростатически взаимодействует с мембранами, адсорбирует фенолы и хиноны, связывает жирные кислоты Reanal, Венгрия

11 Сывороточный альбумин человеческий (ЧСА) 1 мг/мл -II- Reanal, Венгрия

12 Амбиол (дигидрохло-рид 1-метил-4-диметил-аминометил-5-гидроксибензимида-зола) 0,1 мг/мл 0,5мг/мл 1м г/мл Стимулятор роста растений, предположительно сильный антиоксидант ИХФ РАН

13 Фонк (фосфат окси-никотиновой кислоты) 1 мг/мл Юмг/мл Стимулятор роста растений, предположительно слабый антиоксидант -II-

14 Бихол 1 мг/мл -II- -II-

♦Выражаем искреннюю благодарность проф. В.А. Бабкину (ИХ СО РАН, Иркутск) и проф. Е.Б. Бурлаковой (ИХФ РАН, Москва) за предоставление испытуемых препаратов.

Рис. 1. Общий вид установки для цейтрафферной компьютерной видеосъемки (А) и коллектор микроскопических объектов (Б). 1 -инвертированный микроскоп, 2 - коллектор микроскопических образцов, 3 — видеокамера, 4 - микрофотонасадка, 5 - фиксатор видеокадра, 6 -персональный компьютер, 7 — верхний диск, 8 — нижний диск, 9 — электродвигатель, 10 — диск привода коллектора, 11 — корпус крепления двигателя, 12 — камера для микроскопических образцов, 13 — винт крепления и регулировки вертикального положения камер, 14 — узел подшипника скольжения, 15 — потенциометр.

для цейтрафферной компьютерной видеосъемки и коллектора микроскопических образцов. Установка состоит из инвертированного микроскопа "Биолам П-1" (Россия) (1), закрепленного на столике микроскопа коллектора микроскопических образцов на 12 камер (собственного изготовления) (2), видеокамеры КТП-67 (Россия) (3), установленной на микроскопе через микрофотонасадку МФН-11 (Россия) (4), фиксатора видеокадра на базе приборного интерфейса КАМАК (5), персонального компьютера (процессор Celeron - 600 МГц, RAM - 128 Мб, HDD - 30 Гб) (6).

По команде компьютера электродвигатель осуществляет вращение коллектора, помещая в поле зрения микроскопа следующий образец. Через заданные промежутки времени в соответствии с заранее составленным планом эксперимента ведется запись видеокадров микроскопических образцов на жесткий диск компьютера.

Программное обеспечение экспериментальной установки состоит из двух компонент - программы сбора данных и программы обработки. Программа сбора данных осуществляет управление аппаратной частью установки, отслеживание интервалов времени, прием видеоизображения с фиксатора телевизионного кадра, запись растровых файлов на жесткий диск персонального компьютера. Сбор данных может производиться без вмешательства оператора в течение суток и более. Программа обработки предоставляет оператору интерфейс для просмотра кадров, выделения круговых областей с целью отметки интересующих оператора микроскопических объектов, подсчета количества выделенных областей и позволяет отслеживать изменение количества объектов в каждом образце в ходе эксперимента. Полученные данные являются основой для построения экспериментальных зависимостей количества объектов в разных образцах от времени инкубации.

Таким образом, экспериментальная установка позволяет регистрировать на протяжении длительного промежутка времени видеоизображения 12-ти микроскопических образцов, а программа обработки данных позволяет наблюдать динамику состояния образцов по ходу эксперимента.

В экспериментах с пероксидом водорода, редокс-парой глутатиона, диметилсульфоксидом, поливинилпирролидоном, арабиногалактаном и альбуминами были следующие варианты: без мембранотропного вещества (контроль) и с исследуемым веществом в разных концентрациях. Для проверки протекторных свойств аскорбиновой кислоты, дитиотреитола, дигидрокверцетина, амбиола, фонка и бихола при перекисном окислении липидов исследовали совместное действие каждого их этих веществ с пероксидом водорода. В этом случае эксперименты проводили по схеме с такими вариантами: 1) без мембранотропного вещества (контроль); 2) с пероксидом водорода (Н202) в концентрации 20 мМ; 3) с исследуемым веществом; 4) вместе с Н202 и исследуемым веществом.

Пэтч-кламп измерения проводили по стандартной методике, в режиме фиксации мембранного потенциала, используя пэтч-конфигурации "whole vacuole" (аналогично "whole cell") и "cytosolic side-out" (аналогично "outside-

out"). Измерения электрофизиологических характеристик изолированной вакуоли проводили на автоматизированной установке, изготовленной в лаборатории физиологии растительной клетки СИФИБР. Программное обеспечение эксперимента создано ведущим инженером-программистом СИФИБР C.B. Розиновым. Ток через мембрану измеряли при помощи преобразователя ток-напряжение на операционном усилителе Б1404УД1А-1 (Корзун и др., 1997). Интегральные токи и токи через одиночные каналы фильтровали в полосе частот 1 кГц и 10 кГц, соответственно, и записывали на жесткий диск компьютера. Направление токов и потенциалов принималось согласно Бертлу (Berti et al., 1992). Мембранный потенциал равен потенциалу цитоплазмы по отношению к вакуоли, а положительный (выходящий) ток определяется потоком катионов из цитоплазмы в вакуоль.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Влияние мембранотропных соединений на стабильность изолированных вакуолей. Рассмотрим ход эксперимента на примере с дигидрокверцетином (ДГК) (рис. 2). Из графика на рис. 2 видно, что в контрольном растворе наблюдается постепенный и достаточно быстрый распад вакуолей в суспензии. Очевидно, что при этом происходит изменение барьерной функции мембраны с последующей деструкцией тонопласта. Исходя из того, что стабильность липидного бислоя и клеточной мембраны в целом определяется наличием липидных пор (структурных дефектов в липидном бислое) (Антонов и др., 1999), разрыв тонопласта, прежде всего, является следствием изменений в липидном матриксе мембраны. Причины нарушения целостности липидного бислоя могут быть различны, например, перекисное окисление липидов, гиперактивация катаболических ферментов, изменения в липид-белковых взаимодействиях и др. Эти процессы приводят к образованию стрессовых пор, их последующему расширению и разрыву мембраны.

No™, % 100

0 8 16 24 32 40 48 56 64 I, ч

Рис. 2. Зависимость относительного количества вакуолей от

времени инкубации (г) при действии пероксида водорода и дигидрокверцетина.

Стрессирование и разрыв мембраны могут быть также вызваны нарушением водно-осмотического равновесия вакуоли, вследствие лизиса крупных молекул внутри вакуоли и повышения осмотической концентрации внутривакуолярного содержимого, что должно привести к поступлению воды в вакуоль, увеличению ее объема и фатальному растяжению мембраны.

На графике также отчетливо видно, что естественный ход разрушения вакуолей существенно изменяется в присутствии Н202 и ДГК. В растворе с Н202 распад вакуолей происходил быстрее, а с ДГК - значительно медленнее, чем в контроле. Пероксид водорода сильно нарушал структуру мембраны, вероятно, способствуя формированию и расширению пор в мембране, и она разрушалась за короткое время. Дигидрокверцетин (ДГК), напротив, резко стабилизировал мембраны, сохраняя их барьерную функцию.

Известно, что характерной чертой липидных пор, принципиально отличающей их от известных белковых и пептидных пор, является способность к самозалечиванию (Антонов и др., 1999). По всей видимости, ДГК приводил к залечиванию (затеканию) стрессовых пор или напрямую, связываясь с липидным бислоем мембраны, или опосредованно, при замедлении процессов ПОЛ, действуя как антиоксидант (Теселкин и др., 1996). Будучи добавлен к суспензии мембран вместе с Н202, он оказывал заметное протекторное действие. Как видно из графика, процесс разрушения изолированных вакуолей при добавлении ДГК можно условно разделить на 2 фазы. В первые 14-16 часов инкубации разрушается незначительное количество вакуолей. В этой фазе скорость распада вакуолей в растворах ДГК с Н202 и одного ДГК практически совпадает. Во второй фазе наблюдается более интенсивный распад вакуолей в суспензии, причем динамика распада в этой фазе подобна динамике распада в растворе с Н202. При добавлении одного дигидрокверцетина характер кривой распада радикально меняется. Как видно из рис. 2 она становится весьма пологой и даже через 64 часа, когда во всех предыдущих вариантах все вакуоли разрушились, в варианте с ДГК остаются целыми почти 80% вакуолей. По результатам экспериментов получены значения периода полураспада изолированных вакуолей Т1/2 (времени, в течение которого в регистрируемом образце разрушаются 50% вакуолей).

Метод тестирования мембранотропной активности химических соединений с помощью цейтрафферной компьютерной видеосъемки позволил разделить исследованные вещества по характеру действия (и в зависимости от концентрации) на три группы (рис. 3): стабилизирующие (столбцы 14-17), дестабилизирующие (столбцы 2-7) и не оказывающие заметного влияния на стабильность вакуолярных мембран (столбцы 8-13).

В наших экспериментах разрушению мембраны способствовали Н202, глютатион окисленный, ДМСО в высоких концентрациях. Механизм действия указанных веществ, как мы предполагаем, основан на стрессовой дестабилизации липидного матрикса мембраны и связан с процессами перекисного окисления липидов (ПОЛ) или ослаблением молекулярных взаимодействий в матриксе при встраивании в него молекул неполярного органического растворителя (как, например, в случае с ДМСО). Несмотря на

то, что амбиол и фонк могут обладать антиоксидантной активностью (Воронина и др., 2001), в условиях нашего эксперимента они сами оказывали повреждающее действие на тонопласт, а вместе с Н202 лишь ускоряли разрушение вакуолей. Вероятно, эти вещества в данных условиях, кроме замедления процессов ПОЛ, способствовали образованию пор в мембране, что в конечном итоге приводило к снижению ее барьерных свойств.

ge goo -|-

f 800 --т-

а 700 --[у-

600 ---

Рис. 3. Влияние мембранотропных соединений на период полураспада изолированных вакуолей относительно контроля: 1 - контроль, 2 -глутатион окисленный 20 мМ, 3 -ДМСО 100 мМ, 4 - Н202 20 мМ, 5 - амбиол 1 мг/мл, б - фонк 1 мг/мл, 7 - ДТГ 1 мМ, 8 - ПВП 0,5 мг/мл, 9 - глутатион восстановленный 20 мМ, 10 - аскорбиновая кислота 20 мМ, 11 - БСА 1 мг/мл, 12 - ЧСА 1 мг/мл, 13 - ДТГ 10 мМ, 14 - арабиногалактан 1 мг/мл, 15 -дигидрокверцетин I мг/мл (3,3 мМ), 16 - бихол 1 мг/мл, 17-ДМСО 10 мМ.

Протекторное действие на стабильность вакуолярных мембран, как видим, оказывали вещества, относящиеся к классу антиоксидантов (ДМСО в низких концентрациях, дитиотреитол, глютатион восстановленный и особенно дигидрокверцетин). Антиоксиданты различной природы могут замедлять и прерывать процессы ПОЛ и тем самым повышать стабильность изолированных вакуолей. Такой механизм отчетливо проявлялся в экспериментах с совместным использованием в опытах Н202 (вещества, приводящего к ускорению перекисного окисления липидов) и антиоксидантов, ингибирующих этот процесс. Наиболее сильное протекторное действие на тонопласт оказывал дигидрокверцетин. Период полураспада фракции изолированных вакуолей при его действии в концентрации 3,3 мМ (1 мг/мл) увеличивался в 7,5 раза. Для нового биологически активного соединения бихол также было выявлено протекторное действие на изолированные вакуоли. Это соединение значительно стабилизировало тонопласт. Период полураспада вакуолей при его влиянии в концентрации 1 мг/мл увеличивался почти в 4 раза. Однако бихол не предотвращал дестабилизирующего действия Н202. Не выявлены существенные изменения стабильности вакуолярной фракции при

добавлении в раствор белков, электростатически взаимодействующих с мембраной (БСА, ЧСА), которые используют в качестве адсорбента фенола (сильного окислителя) и хинона.

Таким образом, влияние испытанных веществ на барьерную функцию мембраны изолированной вакуоли может приводить или к стрессовой дестабилизации тонопласта и разрушению вакуолей (например, при действии прооксидантов, органических растворителей), или стабилизации барьерных свойств мембраны (ДГК, арабиногалактан, бихол).

В исследовании действия мембранотропных веществ на барьерные характеристики мембраны изолированной вакуоли особый интерес вызывает диметилсульфоксид. Это вещество представляет собой распространенный и широко применяемый в биотехнологии и медицине органический растворитель, который способствует снижению барьерной функции биологических мембран (Anchordoguy et al., 1992, Yu and Quinn, 1994). В наших экспериментах ДМСО проявил себя следующим образом: в концентрации 10 мМ заметно стабилизировал мембрану, а при увеличении концентрации в 10 раз приводил к очень быстрому разрушению вакуолей. Применение пэтч-кламп метода позволило исследовать механизм действия ДМСО на основные компоненты системы пассивной проницаемости тонопласта, в частности, на ионную проницаемость (электропроводность) мембраны.

Действие диметилсульфоксида на электропроводность мембраны изолированной вакуоли. Основными компонентами системы пассивной ионной проницаемости (электропроводности) тонопласта являются ионные каналы, из которых наиболее изучен канал с медленной кинетикой активации (медленный вакуолярный (MB) канал) (Тихонова, 1998). В интегральную электропроводность тонопласта входит также неспецифическая компонента, за которую ответственны так называемые каналы утечки (Ward, 1997).

С целью изучить действие ДМСО на функционирование медленных вакуолярных каналов и неспецифическую электропроводность, обусловленную каналами утечки, осуществляли регистрацию электропроводности тонопласта пэтч-кламп методом в режиме фиксации потенциала в конфигурации "whole-vacuole" на вакуолях стандартного диаметра (60±5 мкм). Для более детального изучения механизмов мембранотропного действия ДМСО мы провели исследования его влияния на уровне одиночных каналов в конфигурации "outside-out patch".

В результате 50 экспериментов получили кривые, отражающие динамику активности МВ-каналов и каналов утечки в условиях ступенчатой подачи командного сигнала в контроле и при воздействии ДМСО (рис. 4). В соответствии с работой (Hedrich and Neher, 1987) активность МВ-каналов проявлялась в условиях, когда в окружающем растворе присутствовали ионы Са2+(>10 мкМ). Как видно из рисунка, кривая имела сигмовидный характер. Среднее время активации тока было порядка 1 сек. Вольтамперная характеристика при этом была нелинейной и демонстрировала выходящее выпрямление (Тихонова, 1998). Особенность тока утечки состояла в том, что каналы утечки находились преимущественно в самой мембране, а не в месте

ее контакта со стеклом микропипетки. Это подтверждалось существенно более низким сопротивлением мембраны целой вакуоли (менее 1 ГОм) в сравнении с сопротивлением, полученным при перезамыкании микроплощадки этой же мембраны на отверстии микропипетки (более 10 ГОм), которое характеризовало утечку в месте контакта.

1м, нА

Рис. 4. Типичная зависимость трансмембранного тока (¡м) от времени при подаче на мембрану изолированной вакуоли серии

командных напряжений (Vм) в условиях воздействия 100 мМ ДМСО.

0 12 3

Прежде всего, было исследовано влияние ДМСО на проводимость тонопласта в тех концентрациях, при которых он оказывал воздействие на стабильность фракции изолированных вакуолей. По результатам 9 экспериментов были построены зависимости относительной проводимости МВ-каналов и каналов утечки от напряжения (рис. 5).

а)

в отн 3.5 -

-1 3 -

-2 2,5 -

-3 2 -

1,5 -

1 -

0,5 -

5—4-

-80 -60 -40 -20 0 20

-80 -60 -40 -20 0 20 40

60 80 V™, мВ

40 60 80 V™. мВ

Рис. 5. Действие ДМСО на: а) относительную проводимость (С ^ медленных вакуолярных каналов, б) относительную проводимость каналов утечки, в зависимости от напряжения на мембране изолированной вакуоли

(V, мВ), где в

' хг '' о,

О - проводимость мембраны, в

проводимость мембраны в контроле при Уи=40 мВ. 1 — контроль, 2 — ДМСО 1 мМ, 3-ДМСО 10 мМ.

Из полученных данных можно сделать вывод, что ДМСО в концентрации 110 мМ не влияет ни на специфическую проводимость МВ-каналов (рис. 5а), ни на проводимость каналов утечки (рис. 56). Подтверждение этим данным было получено в экспериментах на изолированных пэтчах (данные не показаны).

Стабилизирующий эффект ДМСО в концентрации 1-10 мМ на мембраны изолированных вакуолей проявлялся через несколько часов, а электрофизиологические опыты проводили в течение 20-30 мин по причине ограничения метода (одной из особенностей пэтч-кламп метода является малая длительность эксперимента). Возможно, из-за этого действие ДМСО в низких концентрациях на проницаемость тонопласта не было обнаружено. С другой стороны, было интересно выяснить, как скажутся на электрофизиологических свойствах тонопласта более высокие концентрации ДМСО, приводящие к быстрому разрушению вакуолей.

После воздействия ДМСО в концентрации 100 мМ и подачи командного напряжения (Ук) более +80 мВ мембрана изолированной вакуоли в большинстве случаев разрушалась. В других случаях перед разрушением наблюдалась повышенная флуктуирующая проводимость (см. вариант при Ук =+80 мВ на рис. 4).

По результатам 6 экспериментов, в которых мембрана после воздействия ДМСО оставалась целой, были построены зависимости относительной проводимости МВ-каналов и каналов утечки от напряжения (рис. 6). Как видно из этих кривых, ДМСО не влияет на специфическую проводимость МВ-каналов (рис. 6а). Проводимость же каналов утечки значительно возрастает (рис. 66), причем этот процесс обратим, так как после удаления ДМСО из омывающего мембрану раствора величина проводимости каналов утечки восстанавливается.

-80 -60 -40 -20 0 20 40 60 80 _80 -60 -40 -20 0 20 40 60 80

мВ ум, мВ

Рис. 6. Влияние ДМСО на: а) относительную проводимость медленных вакуолярных каналов, б) относительную проводимость каналов утечки, в зависимости от напряжения на мембране изолированной вакуоли (У^ мВ), где Смю йм — проводимость мембраны, Си40 -проводимость мембраны в контроле при Ум=40 мВ. 1 — контроль в начале эксперимента, 2 -ДМСО ЮОмМ, 3-контроль в конце эксперимента.

В результате экспериментов по влиянию ДМСО на одиночные МВ-каналы было обнаружено, что небольшие участки мембраны (пэтчи) в отличие от целой вакуоли выдерживают более высокие концентрации ДМСО (100-700 мМ). Типичная регистрация токов одиночных МВ-каналов при смене контрольного раствора на раствор, содержащий ДМСО в концентрации 700 мМ (Ут=40мВ) представлена на рис. 7а. В диапазоне концентраций 350700 мМ ДМСО заметно снижал проводимость МВ-канала (при 700 мМ проводимость канала снижалась в 4 раза по сравнению с контролем). При этой концентрации ДМСО значительно влияет и на активность МВ-канала (рис. 76 и в). При 700 мМ ДМСО вероятность нахождения канала в открытом состоянии уменьшилась в 3 раза, а частота флуктуации между открытым и закрытым состояниями уменьшилась в 10 раз относительно контроля. Влияние ДМСО на одиночный МВ-канал было необратимым. Часто после повторного заливания контрольного раствора в экспериментальную камеру каналы вообще не фиксировались.

ДМСО

Т, сек

4,5

I, пА 35

30 25 20

в)

5 Т, сек 79

79,5

80 Т, сек

Рис. 7. Типичная регистрация токов одиночных МВ каналов при смене контрольного раствора на раствор, содержащий ДМСО в концентрации 700 мМ (Ут=40мВ'): а) вся трасса регистрации, б) и в) участки трассы до и после внесения ДМСО соответственно.

В ряде экспериментов выявлено влияние ДМСО на неспецифическую проводимость тонопласта (проводимость утечки), которую оценивали по базовой линии регистрации тока при подачи командного напряжения (толстая линия на рис. 7). При концентрации ДМСО 350 мМ

неспецифическая проводимость пэтча увеличивалась в 2-3 раза относительноконтроля. Влияние ДМСО на проводимость утечки было обратимым. При изъятии ДМСО из экспериментального раствора проводимость принимала первоначальное значение.

Из литературных данных известно, что ДМСО может взаимодействовать как с белковыми макромолекулами, так и с липидным матриксом биологических мембран (Johannesson et al., 1997, Yu and Quinn, 1998). Как видно из экспериментов, ДМСО в концентрации 100 мМ не изменяет структурно-функциональную организацию МВ-канала. В то же время, наблюдалось существенное увеличение неспецифической проводимости через каналы утечки. То есть, ДМСО в своем действии не затрагивает функционирование специфичных каналов, но значительно влияет на проводимость каналов утечки. Скорее всего, это может происходить за счет расширения размеров пор этих каналов. Косвенным подтверждением этого может быть кривая на рис. 4, полученная при напряжении +80 мВ. Она представляет собой типичную картину, характерную для стрессовой проводимости мембраны (Чизмаджев и др., 1982). Особенности такого состояния для тонопласта описаны в работе (Ботоев и др., 1987) и объясняются флуктуацией размера поры под воздействием стрессирующих факторов. Можно полагать, что эти эффекты обусловлены изменениями в липидном матриксе мембраны, поскольку известно, что молекулы ДМСО способны модифицировать структуру липидных бислоев (Smondyrev and Berkowitz, 1999). Наиболее вероятно, что в нашем случае этот процесс способствовал новому образованию или расширению существующих в мембране неспецифических каналов в виде водных пор и их флуктуации под воздействием как напряжения, так и ДМСО, вплоть до разрыва мембраны. С результатами по влиянию ДМСО на интегральную проводимость вакуолярной мембраны согласуются данные экспериментов на пэтчах. ДМСО обратимо увеличивал проводимость утечки. По-видимому, после промывания раствора от ДМСО мембрана залечивалась, при этом размеры пор каналов утечки уменьшались. Однако в высокой концентрации (более 100 мМ) ДМСО влияет на характеристики МВ-канала. В этой связи, индуцируемое ДМСО явление увеличения проницаемости мембран для различных соединений (снижение барьерных свойств), при сохранении функциональной активности специфических ионных каналов, может быть объяснено образованием или расширением существующих в мембране неспецифических водных пор. Наиболее вероятно, что изменения ионной проницаемости мембраны изолированной вакуоли при действии ДМСО в концентрации более 100 мМ связано не только с влиянием на мембрану в области липидного бислоя или в области контакта интегральных белков с липидами, но и в области специфических водных пор (ионных каналов), образуемых интегральными белками.

Таким образом, действие ДМСО в концентрации 100 мМ на мембрану изолированной вакуоли заключается в увеличении проводимости через неспецифические мембранные каналы. В концентрации более 100 мМ ДМСО, кроме того, понижает проводимость МВ-канала.

Возможные механизмы действия мембранотропных веществ.

Процессы, происходящие в наших экспериментах с мембранами, скорее всего, имели разнообразную природу. В пользу того, что при разрушении вакуолей происходит ПОЛ, может указывать протекторное действие антиоксидантов. Однако, аскорбиновая кислота, эффективный ингибитор ПОЛ, оказывала слабое стабилизирующее действие на мембрану. Стимуляторы роста растений амбиол и фонк, обладающие антиоксидантными свойствами (Воронина и др., 2001), в наших условиях, наоборот, способствовали разрушению вакуолей. Из антиокислителей стабильность мембраны сильно повышали только дигидрокверцетин и ДМСО в концентрации 1-10 мМ.

Флавоноид дигидрокверцетин является исключительно активным антиоксидантом, который ингибирует процессы ПОЛ, реагируя, как предполагают, с липидными радикалами (Теселкин и др., 1996). ДГК весьма эффективно стабилизировал мембраны, сохраняя их барьерную функцию. При добавлении к суспензии мембран вместе с Н202, ДГК оказывал заметное протекторное действие.

Известно, что взаимодействие флавоноидов со свободными радикалами на мембране происходит в полярной области липидного бислоя (Ratty et al., 1988). Вероятно, ДГК приводил к "залечиванию" стрессовых пор в тонопласте или напрямую, связываясь с липидным бислоем мембраны, или опосредованно, при замедлении процессов ПОЛ. Антиоксидантный эффект флавоноидов может усиливаться в присутствии таких соединений как аскорбиновая кислота, фосфолипиды и др. Синергизм флавоноидов с аскорбиновой кислотой широко обсужден в литературе (Ratty and Das, 1988, Cholbi et al., 1991). Предполагают что, механизм взаимного усиления действия основан на способности синергистов регенерировать антиоксиданты. Мы исследовали совместное действие ДГК и аскорбиновой кислоты на барьерной функции мембраны изолированной вакуоли, однако отчетливого синергизма этих веществ в отношении протектирования тонопласта не обнаружили.

Из всех антиоксидантов, использованных в наших экспериментах, только ДГК обладает липофильными свойствами. При этом он наиболее сильно воздействовал на период полураспада вакуолей. Вероятно, в процессе стабилизации мембраны для антиоксиданта очень существенна способность встраиваться в липидный бислой.

Эффект ДМСО при стабилизации вакуолярной мембраны, вероятно, объясняется его антиоксидантными свойствами (Yu and Quinn, 1994) или протектирования белков тонопласта при гидрофобном взаимодействии с их неполярными группами (Arakawa et al., 1990). Однако увеличение концентрации ДМСО напротив вызывало разрушение вакуолей. Пэтч-кламп методом показано, что в этом случае ДМСО значительно влиял на каналы утечки. Можно полагать, что мембранотропный эффект обусловлен изменениями в липидном матриксе мембраны, поскольку известно, что это вещество способно модифицировать структуру липидных бислоев (Smondyrev and Berkowitz, 1999). При взаимодействии с мембраной молекула

ДМСО образует дефект на ее поверхности, позволяя проникнуть внутрь бислоя молекулам воды (Paci and Marchi. 1994). Наиболее вероятно, что в нашем случае этот процесс способствовал возникновению или расширению существующих в мембране пор и их флуктуации под воздействием как напряжения, так и ДМСО, вплоть до разрыва мембраны.

Одним из следствий ПОЛ является окисление тиоловых групп мембранных белков (Владимиров и др., 1991). Этот процесс, вероятно, приводит к дестабилизации мембраны, поскольку по нашим данным окислители SH-групп (глютатион окисленный, пероксид водорода) значительно ускоряли, а восстановители (глютатион восстановленный, дитиотреитол (ДТТ)) несколько замедляли распад вакуолей.

Действие фосфолипаз и механическое растяжение мембраны вызывают нарушение ее барьерных свойств. Мембраносвязанные фосфолипазы обнаружены во многих растительных объектах, в том числе в вакуолярной мембране (Tavernier and Pugin, 1995), но не известно, присутствуют ли они в тонопласте Beta vulgaris. К тому же большинство этих ферментов, например фосфолипазы А2 и D, Са2+-зависимы, а наши растворы Са2+ не содержали. Механическое растяжение мембраны при разрушении изолированных вакуолей представляется маловероятным, так как все растворы были выровнены по осмотической концентрации, и вряд ли она изменялась во время эксперимента.

Адсорбция на поверхности липидного бислоя поликатионов или полианионов также приводит к нарушению барьерных свойств мембраны. Мы исследовали влияние альбуминов, поливинилпирролидона и арабиногалактана на стабильность мембран. БСА и ЧСА представляют собой кислые белки животного происхождения, которые являются преобладающими в плазме крови, т.е. белками, определяющими свойства микроокружения пограничных мембран. Эти белки не оказывали заметного влияния на процесс распада вакуолей.

Протекторное соединение поливинилпирролидон (ПВП), которое используют в качестве адсорбента фенолов или хинонов (токсических эндогенных компонентов тканей, окисляющих SH-группы белков) несущественно влияло на стабильность вакуолей. Тонопласт непроницаем для ПВП, поэтому если даже находящиеся внутри вакуоли токсические агенты способствовали нарушению барьерных свойств мембраны, ПВП, оставаясь снаружи, не мог повлиять на этот процесс.

Полисахарид арабиногалактан повышал стабильность изолированных вакуолей. Скорее всего этот эффект обусловлен его взаимодействием с тонопластом и формированием на поверхности вакуоли примембранного углеводного слоя (или пространственной сетки), способствующих сохранению барьерных свойств мембраны.

Завершая обсуждение экспериментальных данных, можно заключить, что метод цейтрафферной компьютерной видеосъемки фракции изолированных вакуолей позволил изучить мембранотропное действие различных химических соединений. Обнаружено, что наиболее выраженное стабилизирующее действие на мембраны изолированной вакуоли оказывает

дигидрокверцетин. На примере диметилсульфоксида показано, что нарушение барьерной функции вакуоли происходит за счет увеличения неспецифической проводимости тонопласта.

ВЫВОДЫ

1. Для изучения мембранотропного действия веществ на барьерную функцию мембраны изолированной вакуоли разработан метод автоматизированного слежения за динамикой разрушения изолированных вакуолей с помощью компьютерной цейтрафферной видеосъемки микроскопических объектов и компьютерной обработки серии телевизионных изображений.

2. Для изучения механизмов действия влияния мембранотропных соединений на уровне транспортных белков (ионные каналы) и липидного матрикса мембраны реализован подход на основе регистрации интегральной электропроводности мембраны и активности одиночных ионных каналов пэтч-кламп методом.

3. Впервые удалось изучить реакцию барьерной функции мембран изолированных вакуолей на воздействие ряда соединений из групп редокс-агентов, полимерных соединений и стимуляторов роста растений и установить вещества, оказывающие дестабилизирующее и выраженное протекторное действие на мембраны. Прооксиданты - пероксид водорода (20 мМ), глутатион окисленный (20 мМ) - и органический растворитель диметилсульфоксид в высокой концентрации (100 мМ) дестабилизируют мембрану изолированной вакуоли, что приводит к снижению ее барьерной функции, а антиоксиданты - дигидрокверцетин (3,3 мМ), диметилсульфоксид в низкой концентрации (1-10 мМ) и дитиотреитол (10 мМ), а также соединения арабиногалактан (1 мг/мл) и бихол (1 мг/мл) повышают стабильность мембраны.

4. Наибольший эффект для стабилизации барьерной функции мембраны проявил дигидрокверцетин (3,3 мМ), флавоноид, антиоксидант, обладающий липофильными свойствами (период полураспада фракции изолированных вакуолей превышал контроль в 7,5 раз). В то же время такие антиоксиданты как аскорбиновая кислота (20 мМ) и глутатион восстановленный (20 мМ), не оказывали влияние на барьерные свойства тонопласта, как и полимерные соединения, адсорбирующие фенолы и хиноны - поливинилпирролидон (1 мг/мл) и альбумины (1 мг/мл).

5. В концентрации 100 мМ диметилсульфоксид обратимо увеличивает неспецифическую компоненту интегральной проводимости тонопласта, не изменяя специфической проницаемости через медленный вакуолярный канал. Дестабилизация барьерной функции мембраны осуществляется за счет стрессовой модификации липидного матрикса - образования и расширения неспецифических водных пор. Влияние диметилсульфоксида на МВ-канал (необратимое затухание активности) зафиксировано только при очень высоких концентрациях (700 мМ).

(дигидрокверцетин - липофильное вещество, Д]ЦЬ(^ 5 4ш^>т1шый растворитель) и предотвращать перекисное окисление липидов (процесс, ведущий к образованию дефектов в лип идном матриксе мембраны, . увеличению проницаемости и снижению стабильности мембраны). оЗ А

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Корзун A.M., Нурминский В.Н., Розинов C.B., Саляев Р.К. Действие ДМСО на ионную проницаемость вакуолярной мембраны // Международная конференция "Физиология растений - наука III тысячелетия". Москва. 1999. Тезисы докладов. С. 165.

2. Нурминский В.Н., Корзун A.M., Розинов C.B., Саляев Р.К. Исследование влияния диметилсульфоксида на медленные вакуолярные каналы и каналы утечки мембраны изолированной вакуоли // Международная конференция по экологической физиологии растений "Актуальные вопросы экологической физиологии растений в 21 веке". Сыктывкар. 2001. Тезисы докладов. С. 54.

3. Корзун A.M., Нурминский В.Н., Розинов C.B., Саляев Р.К. Компьютерная обработка телевизионного изображения процесса распада фракции изолированных вакуолей как метод мониторинга действия мембранотропных веществ // Международная конференция по экологической физиологии растений "Актуальные вопросы экологической физиологии растений в 21 веке". Сыктывкар. 2001. Тезисы докладов. С. 58.

4. Корзун A.M., Нурминский В.Н., Розинов C.B., Саляев Р.К. Действие диметилсульфоксида (ДМСО) на электропроводность мембраны изолированной вакуоли // ДАН. 2001. Т. 381, № 5. С. 691-693.

5. Нурминский В.Н., Корзун A.M., Розинов C.B., Саляев Р.К. Влияние мембранотропных соединений на барьерную функцию мембраны изолированной вакуоли // ДАН. 2003. Т. 389, № 2. С. 283-285.

6. Нурминский В.Н., Корзун A.M., Розинов C.B., Саляев Р.К. Компьютерная цейтрафферная видеосъемка фракции изолированных вакуолей // Вторая национальная конференция "Информационно-вычислительные технологии в решении фундаментальных научных проблем и прикладных задач химии, биологии, фармацевтики, медицины". Москва. 2003. Тезисы докладов.

7. Нурминский В.Н., Корзун A.M., Розинов C.B., Саляев Р.К. Влияние окислителей, восстановителей, полимеров и регуляторов роста растений на стабильность мембран изолированных вакуолей // V съезд общества физиологов растений России. Пенза. 2003. Тезисы докладов.

8. Нурминский В.Н., Корзун A.M., Розинов C.B., Саляев Р.К. Цейтрафферная компьютерная видеосъемка микроскопических образцов // Молодежный академический форум "Молодежь и наука Сибири". Чита. 2003. Тезисы докладов.

^р3

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Нурминский, Вадим Николаевич

Введение.

Обзор литературы.

9 Глава 1. Мембранотропные эффекты.

1.1. Типы мембранотропного влияния веществ.

1.2. Мембранотропные соединения.

1.2.1. Редокс-агенты.

1.2.2. Ионы тяжелых металлов.

1.2.3. Протекторные соединения.

1.2.4. Детергенты.

1.2.5. Активаторы и ингибиторы слияния мембран.

1.2.6. Ионофоры и каналоформеры.

1.2.7. Полимерные соединения.

Глава 2. Подходы к исследованию мембранотропного действия веществ.

2.1. Объекты для исследований реакции биологических мембран на действие веществ.

2.2. Методы исследования мембранотропных эффектов.

2.2.1. Электрофизиологические методы.

2.2.2. Физические методы.

2.3. Постановка задач диссертационной работы :.

Экспериментальная часть.

Глава 3. Объект и методы исследования.

3.1. Растительный материал.

3.2. Выделение вакуолей.

3.3. Растворы.

3.4. Компьютерная цейтрафферная видеосъемка микроскопических

• образцов.

3.4.1. Экспериментальная установка.

3.4.2. Схемы экспериментов.

3.5. Пэтч-кламп измерения.

3.5.1. Приготовление микропипеток для пэтч-кламп измерений.

3.5.2. Система регистрации. ф 3.5.3. Методика пэтч-кламп измерений.

3.5.4. Обработка результатов измерений.

3.6. Статистический анализ.

3.7. Использованные реактивы.

Результаты исследований.

Глава 4. Влияние мембранотропных соединений на стабильность изолированных вакуолей.

4.1. Редокс-агенты.

4.1.1. Пероксид водорода.

4.1.2. Аскорбиновая кислота.

4.1.3. Редокс-пара глутатиона.

4.1.4. Дитиотреитол.

4.1.5. Диметилсульфоксид.

4.1.6. Дигидрокверцетин.

4.2. Полимерные соединения.

4.2.1. Поливинилпирролидон.

4.2.2. Арабиногалактан.

4.2.3. Альбумины.

4.3. Стимуляторы роста растений: амбиол, фонк, бихол.

4.4. Сравнительный анализ влияния биологически активных веществ на стабильность мембраны изолированной вакуоли.

Глава 5. Действие диметилсульфоксида на электропроводность мембраны изолированной вакуоли.

• Общее обсуждение.

Выводы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Влияние мембранотропных соединений на стабильность и электрофизиологические свойства вакуолярных мембран"

Биологические мембраны являются универсальным полифункциональным образованием клетки, обеспечивающим компартментацию метаболизма и нормальное протекание биохимических реакций, как на самих мембранах, так и в примембранном пространстве. Исследование мембран растительных клеток и их реакции на физико-химические факторы различной природы составляет одно из важнейших направлений физиологии растений. Общеизвестно, что мембраны состоят из жидкокристаллического бислоя определенным образом ориентированных фосфолипидных молекул, в который погружены интегральные белки. Основные функции клеточных мембран заключаются в отделении содержимого клеток от внешней среды, в создании внутренней структуры клетки, поддержании электрохимического градиента, осуществлении транспорта веществ (барьерная, транспортная, осмотическая, структурная, энергетическая, биосинтетическая, секреторная, рецепторно-регуляторная и другие функции). Лабильность структурной организации мембраны определяет ее динамические свойства. Молекулярные изменения и структурные перестройки в молекулах мембранных компонентов оказывают влияние на все формы функциональной активности биологических мембран.

Многие из естественных и синтезированных химических соединений способны при взаимодействии с мембранами изменять их структурные и функциональные характеристики, т.е. обладают мембранотропными свойствами. Химические вещества могут способствовать или нарушению функциональной активности мембраны, или стабилизации ее свойств и повышению устойчивости в неблагоприятных условиях. Изучение механизмов реакции мембран на химические воздействия необходимо как для понимания принципов функционирования мембранных систем, так и для осуществления направленного поиска новых биологически активных соединений важных во многих областях практической деятельности.

В настоящее время в мире синтезируется большое количество химических соединений. Причем увеличение числа новых соединений значительно превышает возможность получения данных об их действии на биологические мембраны. Поэтому часть веществ, которые могут быть полезны или, наоборот, % могут представлять опасность для природы и человека, остаются до сих пор слабо изученными. Таким образом, существует большая потребность в оценке действия веществ на различные функции мембран (Баренбойм и Маленков, 1986). Решение этой задачи затруднено отсутствием эффективных методов скрининга мембранотропной активности химических соединений (тестирования химических веществ на мембранотропность). Кроме того, выбор биологического объекта для исследований подобного рода должен быть обусловлен возможностями, прежде всего, тестирования (отбора) веществ на Ф мембранотропную активность, а также детального исследования конкретных механизмов действия веществ. Как нам представляется, подходящим в этом отношении тест-объектом может быть мембрана изолированной вакуоли. На данный момент достаточно хорошо изучены структурные и биохимические параметры этой мембраны (Саляев и др., 1982; Саляев и др., 1983; Kaiser et al., 1986), исследованы ее основные транспортные системы: протонные насосы (НГ1"-АТФаза и ЬГ-пирофосфатаза), переносчики (Maeshima, 2001), ионные каналы 4 (Тихонова, 1998), из которых наиболее подробно изучен медленный вакуолярный (MB) канал (Hedrich andNeher, 1987).

Целью настоящей работы явилось изучение физиологической реакции функциональных систем мембран изолированных вакуолей на воздействие веществ, потенциально обладающих мембранотропной активностью, из классов редокс-агентов, полимерных соединений и стимуляторов роста растений. В работе были поставлены следующие задачи: а) разработка методов тестирования мембранотропных соединений и исследования механизмов их ^ действия; б) изучение влияния окислителей, восстановителей, протекторных соединений, полимеров и некоторых новых стимуляторов роста растений на барьерную функцию мембраны изолированных вакуолей; в) исследование механизмов воздействия одного из широко известных мембранотропных соединений - диметилсульфоксида на транспортные характеристики мембраны изолированной вакуоли. % Одним из видов реакции мембраны на химические воздействия является изменение ее барьерной функции, которая тесно связана со стабильностью (механической прочностью) мембраны. Поэтому для выявления мембранотропной активности веществ разумно использовать подход, основанный на определении изменения стабильности мембран при воздействии. Для этой цели нами был разработан автоматизированный метод регистрации серии микроскопических изображений, отражающих процесс разрушения фракции изолированных вакуолей. Конкретные механизмы щ действия химических веществ на функциональные структуры мембраны, приводящего к изменению ее барьерной функции, на наш взгляд, наиболее детально можно изучать, применяя электрофизиологические методы исследования.

В результате проведенных исследований получены новые данные о влиянии химических соединений из классов окислителей-восстановителей, полимеров и стимуляторов роста растений на барьерные свойства мембраны и * установлен ряд веществ, оказывающих хорошо выраженное протекторное действие на мембраны. Изучены электрофизиологические особенности взаимодействия с вакуолярной мембраной широко используемого в экспериментах и практике мембранотропного соединения -диметилсульфоксида.

Работа выполнена в лаборатории физиологии растительной клетки Сибирского института физиологии и биохимии растений СО РАН (г. Иркутск).

Автор выражает благодарность руководителям работы члену* корреспонденту Р.К. Саляеву и к.б.н. A.M. Корзуну, ведущему инженеру-программисту C.B. Розинову а также всем сотрудникам лаборатории физиологии растительной клетки СИФИБР за поддержку и помощь в работе.

Обзор литературы Глава 1. Мембранотропные эффекты

Биологические мембраны ответственны за выполнение многих важнейших * функций живой клетки. Согласно жидкостно-мозаичной модели (Singer and

Nicolson, 1972) основу любой клеточной мембраны составляет фосфолипидный бислой, в который встроены определенным образом ориентированные белковые структуры. Монослои биологических мембран могут иметь различия в составе и соотношении липидов. Непрерывность липидного бислоя определяет барьерные и механические свойства мембраны. Мембраны формируют ультраструктуру клетки и поддерживают неравновесную концентрацию веществ в ее компартментах. Кроме того, липидный бислой ^ мембран выполняет структурную функцию. В мембране непрерывно идут разнообразные биохимические реакции. Благодаря встроенным белкам мембраны способны избирательно пропускать заряженные частицы, осуществлять активный транспорт ионов, используя энергию АТФ, поддерживать контакт клетки с окружающей средой, осуществлять ферментативные реакции.

Заключение Диссертация по теме "Физиология и биохимия растений", Нурминский, Вадим Николаевич

121 Выводы

3. Впервые удалось изучить реакцию барьерной функции мембран изолированных вакуолей на воздействие ряда соединений из групп редокс-агентов, полимерных соединений и стимуляторов роста растений и установить вещества, оказывающие дестабилизирующее и выраженное протекторное действие на мембраны. Прооксиданты - пероксид водорода (20 мМ), глутатион окисленный (20 мМ) - и органический растворитель диметилсульфоксид в высокой концентрации (100 мМ) дестабилизируют мембрану изолированной вакуоли, что приводит к снижению ее барьерной функции, а антиоксиданты -дигидрокверцетин (3,3 мМ), диметилсульфоксид в низкой концентрации (1-10 мМ) и дитиотреитол (10 мМ), а также соединения арабиногалактан (1 мг/мл) и бихол (1 мг/мл) повышают стабильность мембраны.

4. Наибольший эффект для стабилизации барьерной функции мембраны проявил дигидрокверцетин (3,3 мМ), флавоноид, антиоксидант, обладающий липофильными свойствами (период полураспада фракции изолированных вакуолей превышал контроль в 7,5 раз). В то же время такие антиоксиданты как аскорбиновая кислота (20 мМ) и глутатион восстановленный (20 мМ), не оказывали влияние на барьерные свойства тонопласта, как и полимерные соединения, адсорбирующие фенолы и хиноны — поливинилпирролидон (1 мг/мл) и альбумины (1 мг/мл).

6. Наиболее вероятно, что стабилизация барьерной функции тонопласта мембранотропными соединениями обусловлена, прежде всего, способностью веществ взаимодействовать с липидным матриксом мембраны (дигидрокверцетин — липофильное вещество, ДМСО — апротонный растворитель) и предотвращать перекисное окисление липидов (процесс, ведущий к образованию дефектов в липидном матриксе мембраны, увеличению проницаемости и снижению стабильности мембраны).

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Нурминский, Вадим Николаевич, Иркутск

1. Акимова Е.И., Мельгунов В.И. Моделирование липидного окружения Са-зависимой АТФазы саркоплазматического ретикулума скелетных мышц неионными детергентами // Биохимия. — 1981. Т. 46, В. 12. - С. 22422249.

2. Антонов В.Ф., Аносов A.A., Богатырева Н.Э. и др. Липидные поры: стабильность и проницаемость мембран // 2-й Съезд биофизиков России, Москва, 23-27 авг., 1999: Тез. докл., Т. 2. М., 1999. - С. 476-477.

3. Архипова Г.В., Погорецкая И.Л., Бурлакова Е.Б. Полиморфизм липидного бислоя и толщина фосфатидилхолиновых мембран под влиянием ноотропных веществ // 2-й Съезд биофизиков России, Москва, 23-27 авг., 1999: Тез. докл., Т. 2. М., 1999. - С. 478.

4. Баренбойм Г.М., Маленков А.Г. Биологически активные вещества: Новые принципы поиска. М.: Наука, 1986. - 368 с.

5. Богданенко Е.В., Свиридов Ю.В., Московцев A.A., Жданов Р.И. Невирусный перенос генов in vivo в генной терапии // Вопр. мед. химии. — 2000. Т. 46, № 3. - С. 226-245.

6. Ботоев А.Н., Корзун A.M., Саляев Р.К. О механизме стрессового состояния мембраны изолированных вакуолей // Докл. АН СССР. 1987. - Т. 293, № 5.-С. 1274-1278.

7. Введение в биомембранологию: Учебное пособие / Под ред. A.A. Болдырева. М.: Изд-во МГУ, 1990. - 208 с.

8. Викторов A.B., Грепачевский A.A., Бергельсон Л.Д. ДНК-фосфолипидное взаимодействие. Исследование методами 3|Р-ЯМР // Биоорган, химия. — 1984. Т. 10, № 7. - С. 935-939.

9. Владимиров Ю.А. Нарушение барьерных свойств внутренней и наружной мембран митохондрий, некроз и апоптоз // Биол. мембраны. — 2002. — Т. 19, №5.-С. 356-377.

10. Владимиров Ю.А., Азизова O.A., Деев А.И. и др. Свободные радикалы в живых системах // ИНТ, серия Биофизика. Т. 29. - М.: Изд-во ВИНИТИ АН СССР, 1991.-252 с.

11. Воронина С.С., Жижина Г.П., Лозовская Е.Л. Биофизические аспекты действия регуляторов роста амбиола и фонка // Биофизика. — 2001. — Т. 46, В. 1.-С. 34-38.

12. Воронина С.С., Калинина И.Г., Кузнецов Ю.В., Комиссаров Г.Г. Использование метода термогравиметрии для изучения влияния амбиола на набухание семян ячменя // Изв. РАН. Сер. Биол. 1994. - В. 3. — С. 476478.

13. Гончарик М.Н. Регуляция функций мембран растительных клеток. Мн.: Наука и техника, 1979. - 200 с.

14. Досон Р., Эллиот Д., Эллиот У., Джонс К. Справочник биохимика. М.: Мир, 1991.-544 с.

15. Ермаков Ю.А. Липидные и клеточные мембраны в присутствии ионов с высоким родством к фосфолипидам // 2-й Съезд биофизиков России, Москва, 23-27 авг., 1999: Тез. докл., Т. 2. -М., 1999. С. 329.

16. Ермишкин Л.Н., Зильберштейн А.Я. Ионные каналы, образуемые антибиотиками. Структура и свойства // ИНТ, серия Биофизика мембран. Т. 2. М.: Изд-во ВИНИТИ АН СССР, 1982. - С. 82-160.

17. Зенков Н.К., Меньшикова Е.Б. Активированные кислородные метаболиты в биологических системах // Успехи соврем, биологии. 1993. - Т. 113, № З.-С. 286-296.

18. Иванов А.Ю., Дейнега Е.Ю., Мирошников А.И., Савлук О.С. Исследование электроориентации клеток Е. coli при действии дезинфектантов // Микробиология. 1985. - Т. 54, В. 5. - С. 826-829.

19. Иванов А.Ю., Новоселов В.И., Гаврюшкин A.B., Фесенко Е.Е. Сравнительная эффективность антиоксидантов при защите бактериальной плазматической мембраны от активных форм кислорода // Биофизика. — 2000. Т. 45, В. 4. - С. 660-665.

20. Иванов А.Ю., Фомченков В.М., Хасанова J1.A. и др. Влияние ионов тяжелых металлов на электрофизические свойства бактериальных клеток Anacystis nidulans и Escherichia coli II Микробиология. — 1992. T. 61, В. 3. -С. 455-463.

21. Козлова Н.М., Лукьяненко Л.М., Антонович А.Н. и др. Окислительная модификация белков и физико-химическое состояние липидов в мембранах эритроцитов при действии диамида // Биофизика. 2002. - Т. 47, В. 3. — С. 500-505.

22. Козлова Н.М., Слобожанина Е.И., Черницкий Е.А. Окисление мембранных белков и изменение поверхностных свойств эритроцитов // Биофизика. -1998. Т. 43, В. 3. - С. 480-483.

23. Корепанова Е.А. Изучение ионофорной активности пептидных поликатионов в липидном бислое // 2-й Съезд биофизиков России, Москва, 23-27 авг., 1999: Тез. докл., Т. 2. -М., 1999. С. 516-517.

24. Корзун A.M., Розинов C.B., Абашин Г.И. Операционный усилитель Б1404УД1А-1 в пэтч-кламп-преобразователе ток-напряжение // Биол. мембраны. 1997. - Т. 14. - С. 219-223.

25. Кравченко А.Т., Милютин В.Н., Гудима О.С. Микрокиносъемка в биологии (цитология, вирусология, риккетсиология). — М.: Изд. медицинской литературы, 1963. 176 с.

26. Кувичкин В.В., Волкова Л.А., Нарышкина Е.П., Исангалин Ф.Ш. Исследование взаимодействия полинуклеотидов с фосфатидилхолиновымилипосомами и двухвалентными катионами методами ЭПР и ПМР // Биофизика. 1989. - Т. 34, В. 5. - С. 405-409.

27. Кувичкин В.В. ДНК-липидные взаимодействия in vitro и in vivo II Успехи соврем, биологии. 2000. - Т. 120, № 5. - С. 466-476.

28. Кувичкин В.В., Сухомудренко А.Г. Взаимодействие природных и синтетических полинуклеотидов с липосомами в присутствии двухвалентных катионов // Биофизика. 1987. - Т. 32, В. 4. - С. 628-633.

29. Кузеванов В .Я., Катков Б.Б., Кошкина С.В., Саляев Р.К. Влияние различных веществ на стабильность изолированных вакуолей растительных клеток // Опер, информ. материалы СИФИБР СО АН СССР. -Иркутск, 1983.-С. 12-15.

30. Кузеванов В.Я., Катков Б.Б., Саляев Р.К. Общие принципы выделения вакуолей и вакуолярных мембран // Структура и функции биологических мембран растений. Новосибирск: Наука, 1985. - С. 93-107.

31. Лихацкая Г.Н., Анисимов М.М. Молекулярные механизмы мембранотропного действия сапонинов // 2-й Съезд биофизиков России, Москва, 23-27 авг., 1999: Тез. докл., Т. 2. М., 1999. - С. 378.

32. Медведев С.С. Электрофизиология растений: Учебное пособие. — С.-Пб.: Изд-во СПбГУ, 1998. 181 с. (электронная версия) http://www.bio.pu.ru/win/lit/fbr/

33. Мельникова Н.Б., Иоффе И.Д. Биосовместимость дигидрокверцетина с Ф липофильным и гидрофильным фрагментами биомембраны. Влияниеионов металлов и аскорбиновой кислоты // Химия растительного сырья. -2002.-№2.-С. 93-103.

34. Мирошников А.И., Фомченков В.М., Иванов А.Ю. Электрофизический анализ и разделение клеток. М.: Наука, 1986. - 198 с.

35. Морозова Е.Р., Корепанова Е.А., Антонова В.Ф. О влиянии пептидных поликатионов на физическое состояние липидного бислоя // 2-й Съезд биофизиков России, Москва, 23-27 авг., 1999: Тез. докл., Т. 2. — М., 1999. -С. 154.

36. Накагаки М. Физическая химия мембран: Пер. с японск. М.: Мир, 1991. -255 с.

37. Овчинников Ю.А., Иванов В.Т., Шкроб A.M. Мембраноактивные комплексоны. М.: Наука, 1974. — 463 с.

38. Островский Д.Н. Молекулярная организация биологических мембран // Биомембраны. Структура, функции, методы исследования. Рига, 1977. -С. 7-27.

39. Панасенко О.М., Арнхольд Ю. Механизм гипохлорит-индуцированного перекисного окисления фосфолипидных липосом // Биол. мембраны. -1996.-Т. 13.-С. 89-99.

40. Панасенко О.М., Арнхольд Ю., Сергиенко В.И. Влияние pH на перекисное окисление фосфолипидных липосом, индуцированное гипохлоритом // Биофизика. 1998. - Т. 43, В. 3. - С. 463-469.

41. Полевой В.В., Максимова Г.Б., Синютина Н.Ф. Методы изучения мембран растительных клеток: Учебное пособие. JI.: Изд-во ЛГУ, 1986. - 192 с.

42. Поликарпова Ф.Я., Леонтьев-Орлов O.A., Леонтьева-Орлова Л.А. и др. // Плодоводство и ягодоводство России. М.: РАСХН, 1994. — С. 50-55.

43. Пучкова Т.В., Путвинский A.B., Владимиров Ю.А. Снижение электрической прочности как основной механизм нарушения барьерной функции биомембран // Докл. АН СССР. 1983. - Т. 270, № 6. - С. 14891492.

44. Саляев Р.К., Козаренко Т.Д., Озолина Н.В., Кузеванов В.Я. Аминокислотный состав белков изолированной вакуолярной мембраны // Физиология растений. 1983. - Т. 30, В. 3. - С. 487-491.

45. Саляев Р.К., Кузеванов В.Я., Озолина Н.В. и др. Содержание липидов, белков и углеводов в мембране изолированных вакуолей красной свеклы // Физиология растений. 1982. - Т. 29, В. 5. - С. 933-940.

46. Саляев Р.К., Кузеванов В.Я., Хаптагаев С.Б., Копытчук В.Н. Выделение и очистка вакуолей и вакуолярных мембран из клеток растений // Физиология растений. -1981.-Т. 28, №6.-С. 1295-1305.

47. Сигворс Ф., Сакман Б., Неер Э. Регистрация одиночных каналов: Пер. с англ. / Под ред. Б. Сакмана и Э. Неера. — М.: Мир, 1987. 448 с.

48. Теселкин Ю.О., Жамбалова Б.А., Бабенкова И.В. и др. Антиоксидантные свойства дигидрокверцитина // Биофизика. — 1996. — Т. 41, В. 3. С. 620624.

49. Тихонова Л.И. Ионные каналы вакуолярной мембраны высших растений // Биол. мембраны. 1998. - Т. 15, № 3. - С. 245-258.

50. Фомкина М.Г. Каналообразующие свойства антипаразитарного препарата абамектина в бислойных липидных мембранах // 2-й Съезд биофизиков России, Москва, 23-27 авг., 1999: Тез. докл., Т. 2. М., 1999. - С. 232.

51. Черномордик JI.B., Меликян Г.Б., Чизмаджев Ю.А. Плоские липидные бислои как модель для изучения слияния биологических мембран // Биол. мембраны. 1987. - Т. 4, № 2. - С. 117-164.

52. Чизмаджев Ю.А., Черномордик JI.B., Пастушенко В.В., Абидор И.Г. Электрический пробой бислойных липидных мембран // ИНТ, серия Биофизика мембран. Т. 2. М.: Изд-во ВИНИТИ АН СССР, 1982. - С. 161266.

53. Юрин В.М. Основы ксенобиологии: Учебное пособие. Мн.: Новое знание, 2002. - 267 с.

54. Юсипович А.И., Соколов B.C., Ермаков Ю.А. Влияние гадолиния на электрические и упругие свойства липидных мембран // 2-й Съезд биофизиков России, Москва, 23-27 авг., 1999: Тез. докл., Т. 2. М., 1999. — С. 327.

55. Abalis I.M., Eldefrawi А.Т., Eldefrawi М.Е. Actions of avermectin Bla on the gamma-aminobutyric acidA receptor and chloride channels in rat brain // J. Biochem. Toxicol. 1986. - V. 1. - P. 69-82.

56. Ahkong Q.F., Fischer D., Tampion W., Lucy J.A. Mechanisms of cell fusion // Nature.- 1975.-V. 253.-P. 194-195.

57. Akaike N. Gramicidin perforated patch recording and intracellular chloride activity in excitable cells // Prog. Biophys. Mol. Biol. 1996. - V. 65. - P. 251264.

58. Anchordoguy T.J., Carpenter J.F., Crowe J.H., Crowe L.M. Temperature-dependent perturbation of phospholipid bilayers by dimethylsulfoxide // Biochim. Biophys. Acta. 1992.-V. 1104.-P. 117-122.

59. Andreopoulos D., Kasi L.P. 99mTc-labelled diphytanoyl-phosphatidylcholine liposomes: in vitro and in vivo studies // J. Microencapsul. 1997. — V. 14. — P. 427-436.

60. Annesini M.C., Memoli A., Petralito S. Kinetics pf surfactant-induced release from liposomes: A time-dependent permeability model // J. Membr. Sci. 2000. - V, № l.-P. 121-131.

61. Anzai K., Ogawa K., Goto Y. et al. Oxidation-dependent changes in the stability and permeability of lipid bilayers // Antioxid. Redox Signal. 1999. - V. l.-P. 339-347.

62. Arakawa T., Carpenter J.F., Kita Y.A., Crowe J.H. The basis for toxicity of certain cryoprotectants a hypothesis // Cryobiology. — 1990. - V. 27. — P. 401415.

63. Arakawa T., Timasheff S.N. The stabilization of proteins by osmolytes // Biophys. J. 1985. - V. 47. - P. 411-414.

64. Arnhold J., Panasenko O.M., Schiller J. et al. The action of hypochlorous acid on phosphatidylcholine liposomes in dependence on the content of double bonds. Stoichiometry and NMR analysis // Chem. Phys. Lipids. 1995. — V. 78. -P. 55-64.

65. Arnold W.M., Geier B.M., Wendt B., Zimmermann U. The change in the electro-rotation of yeast cells effected by silver ions // Biochim. Biophys. Acta. -1986.-V. 889.-P. 35-48.

66. Atkinson D., Small D.M. Recombinant lipoproteins: implications for structure and assembly of native lipoproteins // Annu. Rev. Biophys. Biophys. Chem. -1986.-V. 15.-P. 403-456.

67. Bamberg E., Lauger P. Channel formation kinetics of gramicidin A in lipid bilayer membranes//J. Membr. Biol. 1973.-V. 11.-P. 177-194.

68. Bangham A.D., Standish M.M., Watkins J.C. Diffusion of univalent ions across the lamellae of swollen phospholipids // Ibid. 1965. - V. 13. - P. 238-252.

69. Barcelo F., Sanchez B., Kitajka K. et al. Effect of oleic acid on membrane lipid structure: Abstr. 3-rd Eur. Bioph. Cong., Sept., 9-13, 2000 // Eur. Biophys. J. -2000. V. 29, № 4-5. - P. 287.

70. Baumann E., Stoya G., Volkner A. et al. Hemolysis of human erythrocytes with saponin affects the membrane structure // Acta Histochem. 2000. - V. 102. -P. 21-35.

71. Baxter S.J., Lathe G.H. Biochemical effects of kidney of exposure to high concentrations of dimethyl sulphoxide // Biochem. Pharmacol. — 1971. — V. 20. -P. 1079-1091.

72. Bergstrand N., Edwards K. Effect of lysolipids and fatty acids on structure andiLstability of phospholipid liposomes: Abstr. 7 Liposome Research Days Conference, Napa Valley, Calif., Apr. 12-15, 2000 // J. Liposome Res. 2000. -V. 10, №2-3.-P. 214.

73. Berlett B.S., Stadtman E.R. Protein oxidation in aging, disease, and oxidative stress // J. Biol. Chem. 1997. - V. 272. - P. 20313-20316.

74. Bertl A., Blumwald E., Coronado R. et al. Electrical measurements on endomembranes // Science. 1992. - V. 258. - P. 873-874.

75. Bethke P.C., Jones R.L. Ca -calmodulin modulates ion channel activity in storage protein vacuoles of barley aleurone cells // Plant Cell. 1994. — V. 6. — P. 277-285.

76. Brasseur R., Pillot T., Lins L. et al. Peptides in membranes: tipping the balance of membrane stability // Trends Biochem. Sci. (TIBS). 1997. - V. 22, № 5. -P. 167-171.

77. Bruggemann L.I., Pottosin I.I., Schonknecht G. Cytoplasmic polyamines block the fast-activating vacuolar channel // Plant J. 1998. - V. 16. - P. 101-105.

78. Budker V.G., Godovikov A.A., Naumova L.P., Slepneva I.A. Interaction of polynucleotides with natural and model membranes // Nucleic Acids Res. — 1980.-V. 8.-P. 2499-2515.

79. Carpaneto A., Cantu A.M., Gambale F. Redox agents regulate ion channel • activity in vacuoles from higher plant cells // FEBS Lett. 1999. - V. 442. - P. 129-132.

80. Cheng Y., Liu M., Li R. et al. Gadolinium induces domain and pore formation of human erythrocyte membrane: an atomic force microscopic study // Biochim. Biophys. Acta. Biomembranes. 1999. - V. 1421, № 2. - P. 249-260.

81. Chernomordik L.V., Kozlov M.M., Zimmerberg J. Lipids in biological membrane fusion // J. Membr. Biol. 1995. - V. 146. - P. 3.

82. Cholbi M.R., Paya M., Alcaraz M.J. Inhibitory effects of phenolic compounds on CCU-induced microsomal lipid peroxidation // Experientia. — 1991. — V. 47, №2.-P. 195-199.

83. Conner J.A., Stevens C.F. Voltage clamp studies of a transient outward membrane current in gastropod neural somata // J. Physiol. (Lond.) — 1971. — V. 213.-P. 21-30.

84. Crowe J.H., Whittam M.A., Chapman D., Crowe L.M. Interactions of phospholipid monolayers with carbohydrates // Biochim. Biophys. Acta. — 1984.-V. 769.-P. 151-159.

85. Delauney A.J., Verma D.P.S. Proline biosynthesis and osmoregulation in plants // Plant J. 1993. - V. 4. - P. 1-8.

86. Dobrovinskaya O.R., Muniz J., Pottosin I.I. Inhibition of vacuolar ion channels by polyamines // J. Membrane Biol. 1999. - V. 167. - P. 127-140.

87. Epand R.M., Vogel H.J. Diversity of antimicrobial peptides and their mechanisms of action // Biochim. Biophys. Acta. 1999. - V. 1462, № 1-2. - P. 11-28.

88. Fahsel S., Pospiech E.M., Zein M. et al. Modulation of concentration fluctuations in phase-separated lipid membranes by polypeptide insertion // Biophys. J. 2002. - V. 83. - P. 334-344.

89. Fan J.S., Palade P. Perforated patch recording with p-escin // Pfliigers Arch. -1998.-V. 436.-P. 1021-1023.

90. Faustinella F., Smith L.C., Chan L. Functional topology of a surface loop shielding the catalytic center in lipoprotein lipase // Biochemistry. — 1992. V. 31.-P. 7219-7223.

91. Finnie C., Borch J., Collinge D.B. 14-3-3 proteins: eukaryotic regulatory proteins with many functions // Plant. Mol. Biol. 1999. - V. 40. - P. 545-554.

92. Fragneto G., Bellet-Amelric E., Braslau A. et al. Fluid free bilayers: a new model for biological membranes: Abstr. 3-rd Eur. Bioph. Cong., Sept., 9-13, 2000 // Eur. Biophys. J. 2000. - V. 29, № 4-5. - P. 288.

93. Frank P.F., Op den Kamp J.A., Roelofsen B., van Deenen L.L. Does diamide treatment of intact human erythrocytes cause a loss of phospholipid asymmetry? //Biochim. Biophys. Acta. 1986. -V. 857, № l.-P. 127-130.

94. Fujii G., Selsted M.E., Eisenberg D. Defensins promote fusion and lysis of negatively charged membranes // Protein Sci. 1993. - V. 2, № 8. - P. 13011312.

95. Fujita Y., Izumiguchi S., Noda Y. Effect of dimethylsulfoxide and its homologues on the thermal denaturation of lysozyme as measured by differential scanning calorimetry // Int. J. Pept. Protein. Res. 1982. - V. 19. - P. 25-31.

96. Galinski E.A. Compatible solutes of halophilic eubacteria: molecular principles, water-solute interaction, stress protection // Experientia. 1993. — V. 49. - P. 487-496.

97. Ganesan A. T., Lederberg J. A cell-membrane bound fraction of bacterial DNA // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1965. - V. 18. - P. 824.

98. Geier B.M., Wendt B., Arnold W.M., Zimmermann U. The effect of mercuric salts on the electro-rotation of yeast cells and comparison with a theoretical model // Biochim. Biophys. Acta. 1987. - V. 900, № 1. - P. 45-55.

99. Gershon H., Ghirlando R., Guttman S.B., Minsky A. Mode of formation and structural features of DNA-cationic liposome complexes used for transfection // Biochemistry. 1993. -V. 32. - P. 7143-7151.

100. Gilroy S., Jones R.L. Calmodulin stimulation of unidirectional calcium uptake in the endoplasmic reticulum of barley aleurone // Planta. — 1993. — V. 190. — P. 289-296.

101. Gordeliy V.I., Kiselev M.A., Lesieur P. et al. Lipid membrane structure and interactions in dimethyl sulfoxide/water mixtures // Biophys. J. — 1998. — V. 75. -P. 2343-2351.

102. Halliwell B., Gutteridge J.M. The antioxidants of human extracellular fluids // Arch. Biochem. Biophys. 1990. -V. 280. - P. 1-8.

103. Hamill O.P., Marty A., Sakmann B., Sigworth F. Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches // Pflugers Arch. 1981. - V. 391. - P. 85-100.

104. Hart B.A., Ip Via Ching T.R., Van Dijk H., Labadie R.P. How flavonoids inhibit the generation of luminol-dependent chemiluminescence by activated human neutrophils // Chem. Biol. Interact. 1990. - V. 73, № 2-3. - P. 323-335.

105. Hartsel S.C., Hatch C., Ayenew W. How does amphotericin B work?: studies on model membrane systems // J. Liposome Res. 1993. - V. 3. - P. 377-408.

106. Hedrich R., Neher E. Cytoplasmic calcium regulates voltage-dependent ion channels in plant vacuoles // Nature. 1987. - V. 329. - P. 833-835.

107. Heerklotz H.H., Seelig J. The impact of amphiphiles on membrane stability, Abstr. 3-rd Eur. Bioph. Cong., Sept., 9-13, 2000 // Eur. Biophys. J. 2000. - V. 29, №4-5.-P. 289.

108. Hincha D.K., Oliver A.E., Crowe J.H. Lipid composition determines the effects of arbutin on the stability of membranes // Biophys. J. 1999. — V. 77. — P. 2024-2034.

109. Horn R., Marty A. Muscarinic activation of ionic currents measured by a new whole-cell recording method // J. Gen. Physiol. 1988. - V. 92. - P. 145-159.

110. Horth M., Lambrecht B., Khim M.C. et al. Theoretical and functional analysis of the SIV fusion peptide // EMBO J. 1991. - V. 10. - P. 2747-2755.

111. Huebner S., Battersby B.J., Grimm R., Cevc G. Lipid-DNA complex formation: reorganization and rupture of lipid vesicles in the presence of DNA as observed by cryoelectron microscopy// Biophys. J. 1999. - V. 76. — P. 3158-3166.

112. Hung S.-C., Wang W., Chan S.I., Chen H.M. Membrane lysis by the antibacterial peptides cecropins B1 and B3: a spin-label electron spin resonance study on phospholipid bilayers // Biophys. J. 1999. - V. 77, № 6. - P. 31203133.i

113. Hunter D.R., Haworth R.A. The Ca -induced membrane transition in mitochondria. I. The protective mechanisms // Arch. Biochem. Biophys. — 1979.-V. 195.-P. 453-459.

114. Israelachvili J.N., Mitchell D.J., Nanham B.W. Theory of self-assembly of lipid bilayers and vesicles // Biochim. Biophys. Acta. 1977. - V. 470, № 2. - P. 185-201.

115. Johannesson H., Denisov V.P., Halle B. Dimethyl sulfoxide binding to globular proteins: A nuclear magnetic relaxation dispersion study // Protein Science. — 1997.-V. 6, №8.-P. 1756-1763.

116. Kaiser G., Martinoia E., Schmitt J.M. et al. Polypeptide patterrn and enzymatic character of vacuoles isolated from barley mesophyll protoplasts // Planta. -1986. V. 169, № 3. - P. 345-355.

117. Kamp F., Corkey B.E., Hamilton J.A. Long-chain fatty acids enter and leave cells by free diffusion: Abstr. 3-rd Eur. Bioph. Cong., Sept., 9-13, 2000 // Eur. Biophys. J. 2000. - V. 29, № 4-5. - P. 291.

118. Kanno Y., Yamami T., Muneoka Y., Shiba Y. Effects of heavy metal ions on the electrical properties of mucous epithelial cells in the newt stomach // J. Toxicol. Sci. 1978. - V. 3, № 1. - P. 39-50.

119. Kiselev M.A., Lesieur P., Kisselev A.M. et al. DMSO-induced dehydration of DPPC membranes studied by X-ray diffraction, small-angle neutron scattering, and calorimetry // Journal of Alloys and Compounds. — 1999. V. 286, № 1-2. -P. 195-202.

120. Konishi M., Watanabe M. Molecular size-dependent leakage of intracellular molecules from frog skeletal muscle fibers permeabilized with P-escin // Pfliigers Arch. 1995. - V. 429. - P. 598-600.

121. Kosower N.S., Kosower E.M. Diamide: an oxidant probe for thiols // Methods Enzymol.- 1995. -V.251.-P. 123-133.

122. Kosower N.S., Kosower E.M., Wertheim B., Correa W.S. Diamide, a new reagent for the intracellular oxidation of glutathione to the disulfide // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1969. - V. 37. - P. 593-596.

123. Kowaltowski A.J., Castilho R.F., Vercesi A.E. Mitochondrial permeability transition and oxidative stress // FEBS Lett. 2001. - V. 495. - P. 12-15.

124. Kowaltowski A.J., Vercesi A.E. Mitochondrial damage induced by conditions of oxidative stress // Free Rad. Biol. Med. 1999. - V. 26. - P. 463-471.

125. Lasic D.D., Strey H.H., Stuart M.C.A. et al. The structure of DNA-liposome complexes // J. Am. Chem. Soc. 1997. - V. 119. - P. 832-833.

126. Leslie S.B., Israeli E., Lighthart B. et al. Trehalose and sucrose protect both membranes and proteins in intact bacteria during drying // Appl. Environ. Microbiol. 1995. - V. 61. - P. 3592-3597.

127. Lisetski L.N., Vashchenko O.V., Tolmachev A.V., Vodolazhskiy K.B. Effects of membranotropic agents on mono- and multilayer structures of dipalmitoylphosphatidylcholine // Eur. Biophys. J. 2002. - V. 31, № 7. - P. 554-558.

128. Luneva V.A., Gendel L.Ya., Kruglakova K.E., Fedin V.A. Effects of sintheyic antioxidants on structure of erythrocyte membrane: Abstr. 13th Int. Biophys. Congr., New Delhi, 19-24 Sept., 1999 // J. Biosci. 1999. - V. 24, Supl. № 1. -P. 119.

129. Maeshima M. Tonoplast transporters: Organization and function // Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 2001. - V. 52. - P. 469-497.

130. MO.Maggio B., Lucy J.A. Interactions of water-soluble fusogens with phospholipids in monolayers//FEBS Lett. 1978. - V. 94.-P. 301-304.

131. Marassi F.M., Opella S.J., Juvvadi P., Merrifield R.B. Orientation of cecropin A helices in phospholipid bilayers determined by solid-state NMR spectroscopy // Biophys. J. 1999. - V. 77, № 6. - P. 3152-3155.

132. Markin V.S., Martinac B. Mechanosensitive ion channels as reporters of bilayer expansion. A theoretical model // Biophys. J. 1990. - V. 60. - P. 1120-1127.

133. Martin I., Defrise-Quertain F., Decroly E. et al. Orientation and structure of the NH2-terminal HIV-1 gp41 peptide in fused and aggregated liposomes // Biochim. Biophys. Acta.- 1993.-V. 1145,№ l.-P. 124-133.

134. Martinac B., AdlerJ., Kung C. Mechanosensitive ion channels of E. coli activated by amphipaths // Nature. 1990. - V. 348 - P. 261-263.

135. May S., Ben Shaul A. DNA-lipid complexes: stability of honeycomb-like and spaghetti-like structures // Biophys. J. 1997. - V. 73. - P. 2427-2440.

136. McConnell E.J., Wagoner M.J., Keenan C.E., Raess B.U. Inhibition of1. I «calmodulin-stimulated (Ca + Mg )-ATPase activity by dimethyl sulfoxide // Biochemical Pharmacology. 1999. - V. 57. - P. 39-44.

137. Mcintosh T.J., Kulkarni K.G., Simon S.A. Membrane fusion promoters and inhibitors have contrasting effects on lipid bilayer structure and undulations // Biophys. J. 1999. - V. 76, № 4. p. 2090-2098.

138. Means A.R. Molecular mechanisms of action of calmodulin // Recent Prog. Horm. Res. 1988. - V. 44. - P. 223-262.

139. Milligan J.R., Ward J.F. Yield of single-strand breaks due to attack on DNA by scavenger-derived radicals // Radiat. Res. 1994. - V. 137. - P. 295-299.

140. Miyajima K., Tomita K., Nakagaki M. Effect of saccharides on the freezing and thawing of liposome dispersion // Chem. Pharm. Bull. — 1986. V. 34, № 7. - P. 2689-2697.

141. Morris C.E. Mechanosensitive ion channels // J. Membr. Biol. 1990. - V. 113. -P. 93-107.

142. Muskatello U., Alessandrini A., Valdre G. et al. Lipid oxidation deletes the nanodomain organization of artificial membranes // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2000. - V. 270, № 2. - P. 448-452.

143. Muslin A.J., Tanner J.W., Allen P.M., ShawA.S. Interaction of 14-3-3 with signaling proteins is mediated by the recognition of phosphoserine // Cell — 1996.-V. 84.-P. 889-897.

144. Nakahiro M., Arakawa O., Narahashi T. et al. Dimethyl-sulfoxide (DMSO) blocks GABA-induced current in rat dorsal-root ganglion neurons // Neuroscience Letters. 1992. - V. 138. - P. 5-8.

145. Oliver A.E., Hincha D.K., Crowe L.M., Crowe J.H. Interactions of arbutin with dry and hydrated bilayers // Biochim. Biophys. Acta. 1998. - V. 1370. - P. 8797.

146. OpusXpress. The world's first, and only, commercially available automated parallel electrophysiology system // AxoBits. 2002. - V. 34. - P. 3. (электронная версия) http://www.axon.com/axobits/AxoBits34.pdf

147. Paci E., Marchi M. Membrane crossing by a polar molecule a molecular-dynamics simulation // Molecular simulation. — 1994. - V. 14. - P. 1-10.

148. Panasenko O.M., Arnhold J., Schiller J. et al. Peroxidation of egg yolk phosphatidylcholine liposomes by hypochlorous acid // Biochim. Biophys. Acta. 1994. - V. 1215. - P. 259-266.

149. Papageorgiou G.C., Murata N. The unusually strong stabilizing effects of glycine betaine on the structure and function of the oxygen-evolving photosystem II complex // Photosyn. Res. 1995. - V. 44. - P. 243-252.

150. Papahadjopoulos D., Moscarello M., EylarE.H., Isac T. Effects of proteins on thermotropic phase transitions of phospholipid membranes // Biochim. Biophys. Acta. 1975. - V. 401. - P. 317-335.

151. PatchXpress. Automated parallel patch-clamp system // AxoBits. — 2003. — V. 37. — P. 4-5. (электронная версия) http://www.axon.com/axobits/ AxoBits37.pdf

152. Preisler H.D., Lyman G. Differentiation of erythroleukemia cells in vitro: properties of chemical inducers // Cell Differ. 1975. - V. 4. - P. 179-185.

153. Rae J., Cooper K., Gates G., Watsky M. Low access resistance perforated patch recordings using amphotericin B // J. Neurosci. Methods. — 1991. — V. 37. — P. 15-26.

154. Ratty A.K., Das N.P. Effects of flavonoids on nonenzymatic lipid peroxidation: structure-activity relationship // Biochem. Med. Metab. Biol. 1988. - V. 39. -P. 69-79.

155. Ratty A.K., Sunamoto J., Das N.P. Interaction of flavonoids with 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl free radical, liposomal membranes and soybean lipoxygenase-1 // Biochem. Pharmacol. 1988. - V. 37, № 6. - P. 989-995.

156. Ribarov S.R., Benov L.C. Relationship between the hemolytic action of heavy metals and lipid peroxidation // Biochim. Biophys. Acta. 1981. - V. 640. - P. 721-726.

157. Richards D.M.C., Dean R.T., Jessup W. Membrane proteins are critical targets in free radical mediated cytolysis // Biochim. Biophys. Acta. 1988. - V. 946, №2.-P. 281-288.

158. Roberts D.M., Harmon A.C. Calcium-modulated proteins: Targets of intracellular calcium signals in higher plants // Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 1992. - V. 43. - P. 375-414.

159. Robinson C., Larsson C., Buckhout T.J. Identification of a calmodulin-stimulated (Ca

160. Mg )-ATPase in a plasma membrane fraction isolated from maize {Zea mays) leaves // Physiol. Plant. 1988. - V. 72. - P. 177-184.

161. Rozycka-Roszak B., Pruchnik. H. Effect of counterions on the influence of dodecyltrimethylammonium halides on thermotropic phase behaviour of phosphatidylcholine bilayers // Z. Naturforsch. 2000. - V. 55, № 3-4. - P. 240244.

162. Rudolph A.S., Crowe J.H., Crowe L.M. Effects of three stabilizing agents -proline, betaine, and trehalose on membrane phospholipids // Arch. Biochem. Biophys.- 1986.-V. 245.-P. 134-143.

163. Ruppersberg J.P., Stocker M., Pongs O. et al. Regulation of fast inactivation of cloned mammalian Ik.(A) channels by cysteine oxidation // Nature. 1991. - V. 352.-P. 711-714.

164. Sackin H. Mechanosensitive channels // Annu. Rev. Physiol. 1995. - V. 57. -P. 333-353.

165. Schuber F. Influence of polyamines on membrane functions // Biochem. J. -1989.-V. 260.-P. 1-10.

166. Schubert R., Beyer K., Wolburg H., Schmidt K.H. Structural changes in membranes of large unilamellar vesicles after binding of sodium cholate // Biochemistry. 1986. - V. 25. - P. 5263-5269.

167. Schubert R., Jaroni H., Schoelmerich J., Schmidt K. H. Studies on the mechanism of bile salt-induced liposomal membrane damage // Digestion. — 1983.-V. 28.-P. 181-190.

168. Sharon N., Lis H. Lectins: cell-agglutinating and sugar-specific proteins // Science. 1972. - V. 177, № 53. - P. 949-959.

169. Shashkov S.N., Kiselev M.A., Tioutiounnikov S.N. et al. The study of DMSO/water and DPPC/DMSO/water system by means of the X-ray, neutron small-angle scattering, calorimetry and IR spectroscopy // Physica B. — 1999. — V. 271.-P. 184-191.

170. Sheetz M.P., Singer S.J. Biological membrane as bilayer couples. A molecular mechanism of drug-erytrocyte interactions // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -1974. V. 71. - P. 4457-4461.

171. Singer S.J., Nicolson G.L. The fluid mosaic model of the structure of cell membranes // Science. 1972. - V. 175. - P. 720-731.

172. Smondyrev A.M., Berkowitz M.L. Molecular dynamics simulation of DPPC bilayer in DMSO // Biophys. J. 1999. - V. 76. - P. 2472-2478.

173. Stephens G.J., Owen D.G., Robertson B. Cysteine-modifying reagents alter the gating of the rat cloned potassium channel Kvl.4 // Pfliigers Arch. — 1996. V. 431.-P. 435-442.

174. Tavakoli N., Kluge C., Golldack D. et al. Reversible redox control of plant vacuolar H^-ATPase activity is related to disulfide bridge formation in subunit E as well as subunit A//Plant J.-2001.- V. 28.-P. 51-59.

175. Tavernier E., Pugin A. Phospholipase activities associated with the tonoplast from Acer pseudoplatanus cells: identification of a phospholipase Ai activity // Biochim. Biophys. Acta. 1995.-V. 1233.-P. 118-122.

176. Tristram-Nagle S., Moore T., Petrache H., Nagle J.F. DMSO produces a new subgel phase in DPPC: DSC and X-ray diffraction study // Biochim. Biophys. Acta. 1998. - V. 1369. - P. 19-33.

177. Van den Wijngaard P.W.J., Bunney T.D., Roobeek I. et al. Slow vacuolar channels from barley mesophyll cells are regulated by 14-3-3 proteins // FEBS Lett.-2001.-V. 488.-P. 100-104.

178. Van der Zee J., Dubbelman T.M.A.R., van Steveninck J. Peroxide-induced membrane damage in human erytrocytes // Biochim. Biophys. Acta. 1985. -V. 818, № 1.-P. 38-44.

179. Vanderkooi G., Capaldi R.A. Discussion paper: a comparative study of the amino acid compositions of membrane proteins and other proteins // Ann. N. Y. Acad. Sci. 1972. - V. 195. - P. 135-138.

180. Ward J.M. Patch-clamping and other molecular approaches for the study of plasma membrane transporters demystified // Plant Physiol. 1997. - V. 114. -P. 1151-1159.

181. White J.M. Membrane fusion // Science. 1992. - V. 258. - P. 917-924.

182. Winterbourn C.C., van den Berg J.J.M., Roitman E., Kuypers F.A. Chlorohydrin formation from unsaturated fatty acids reacted with hypochlorous acid // Arch. Biochem. Biophys. 1992. - V. 296. - P. 547-555.

183. Yu Z.W., Quinn P.J. Dimethyl-sulfoxide a review of its applications in cell biology // Bioscience Reports. - 1994. -V. 14, № 6. - P. 259-281.

184. Yu Z.W., Quinn P.J. Solvation effects of dimethyl sulphoxide on the structure of phospholipid bilayers // Biophys. Chem. 1998. - V. 70. - P. 35-39.

185. YuZ.W., Quinn P.J. Phase stability of phosphatidylcholines in dimethylsulfoxide solutions // Biophys. J. 1995. - V. 69. - P. 1456-1463.

186. YuZ.W., Quinn P.J. The effect of dimethyl sulfoxide on structure and phase behavior of palmitoleoylphosphatidylethanolamine // Biochim. Biophys. Acta. -2000. V. 1509. - P. 440-450.

187. Zheliaskova A., Naydenova S., Petrov A.G. Interaction of phospholipid bilayers with polyamines of different length // Eur. Biophys. J. 2000. - V. 29. - P. 153157.

188. Zimmerberg J., Vogel S.S., Chernomordik L.V. Mechanisms of membrane fusion // Annu. Rev. Biomol. Struct. 1993. - V. 22. - P. 433-466.

Информация о работе

Нурминский, Вадим Николаевич
кандидата биологических наук
Иркутск, 2003
ВАК 03.00.12

Диссертация

Влияние мембранотропных соединений на стабильность и электрофизиологические свойства вакуолярных мембран - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы