Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование механизма действия альфа-латротоксина на ооцитах Хenopus, инъецированных мРНК из мозга крысы

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Исследование механизма действия альфа-латротоксина на ооцитах Хenopus, инъецированных мРНК из мозга крысы"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ^ ИНСТИТУТ БИОФИЗИКИ КЛЕТКИ

од

• _ На правах рукописи

ТЕРТЫШНИКОВА Светлана Михайловна

ИССЛЕДОВАНИЕ МЕХАНИЗМА ДЕЙСТВИЯ а-ЛАТРОТОКСИНА НА ООЦИТАХ хштрив, ИНЪЕЦИРОВАННЫХ МРНК ИЗ МОЗГА КРЫСЫ.

03.00.02

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Пущино - 1994

Работа, выполнена в лаборатории нейрохимии Филиала Института биоорганической химии ии. академиков Н. Н. Шемякина и Ю. А. Овчинникова Российской Академии Наук

Научные руководители: д. х. н. , проф. Е. В. Гришин

к. б. н. А. К. Филиппов

Официальные оппоненты: д. б. н. Н.К. Чемерис

к. б. н. Е.Д. Носырева

Ведущая организация: Институт Теоретической и

Экспериментальной Биофизики РАН

Защита диссертации состоится "_" июня 1994 г. в __

часов на- заседании Специализированного совета Д.200.23.01 при Институте Биофизики Клетки .РАН по адресу: 142292, Московская обл. , Пущино, ИБК РАН.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института Биофизики Клетки РАН

Автореферат разослан "_"_1994г.

Ученый секретарь Специализированного совета кандидат биологических наук

Т. И. Сколихина

Актуальность проблемы. Одним из важнейших направлений современной нейробиологии является изучение молекулярных механизнов генерации и проведения нервного импульса. В последние годы достигнут значительный прогресс в понимании молекулярных механизмов, лежащих в основе ключевых этапов распространения нервного сигнала, и, в частности, процесса секреции нейромедиатора. Полученные в различных лабораториях результаты позволили установить, что в пресинаптической мембране существует высокоорганизованный белковый комплекс, участвующий в процессе экзоцитоза. Однако, несмотря на убедительные доказательства существования такого белкового комплекса, точный механизм его функционирования до конца не известен. В решении этой проблемы целесообразными представляются подходы, связанные с использованием природных нейротоксинов. Среди них особое место занимает а-Латротоксин (а-ЛТ), высокомолекулярный белковый нейротоксин, являющийся главным токсическим компонентом яда паука каракурта Latco<iectuз тасЬапз tredecimguttяtuз. Интерес к а-ЛТ обусловлен уникальной совокупностью его свойств: способностью вызывать массированный выброс медиатора из всех известных типов синапсов позвоночных, способностью формировать в БЛМ неселективные катионные каналы, наличием в пресинаптической мембране высокоаффинного рецептора. Все эти свойства сделали а-ЛТ ценным инструментом в изучении молекулярного механизма нейросек-реции. Тем не менее, до сих пор оставались нерешенными вопросы, касающиеся молекулярного механизма действия а-ЛТ на пресинапти-ческую мембрану, а именно, последовательность молекулярных событий от связывания рецептора на пресинаптической мембране дп развития эффекта а-ЛТ, заключающегося в стимуляции процесса экзоцитоза. Одним из перспективных подходов к решению этих вопросов, может быть исследование действия а-ЛТ с помощью функциональной экспрессии в модельной системе ооцитов Хвпориз 1аетг1з. Сочетая в себе современные достижения электрофизиологии, молекулярной биологии и генной инженерии этот метод позволяет исследовать функционально активный экзогенный рецептор или канал, экспрессированный в мембране ооцита, а также осуществить идентификацию структурных генов, кодирующих зкспрессированные рецепторы или каналы, что в конечном итоге ведет к установлению структурно-функциональны* взаимоотношений в белках плазматических мембран.

Цель работы. Цель швований, представленных в данной работе, заключалась в расшифровке нолекулярного механизна действия а-ЛТ. Основные задачи исследования были следующие:

1) Экспрессировать функционально активный рецептор а-ЛТ из мозга крысы в ооцитах Xencpus laevis и определить фракции мРНК, кодирующей рецептор а-ЛТ.

2) Определить и проанализировать электрофизиологические характеристики канала, индуцируемого a-JIT в ооцитах Xваориз laevis, инъецированных мРНК из мозга крысы.

3) Исследовать роль а-ЛТ и рецептора а-ЛТ в формировании канала, индуцируемого а-ЛТ в мембране ооцитов Xenopus laevis, с помощью антител к а-ЛТ и к рецептору а-ЛТ.

Научная новизна и практическая ценность работы. В результате исследований была осуществлена экспрессия функционально активного рецептора а-ЛТ из мозга крысы в ооцитах Xenopus laevis и определен молекулярный вес фракций мРНК, кодирующих рецептор а-ЛТ. Впервые зарегистрирован одиночный канал, образуемый а-ЛТ в мембране ооцита и определены некоторые параметры канала, что позволило предложить качественную модель работы канала и сделать заключения, касающиеся молекулярного механизма действия а-ЛТ. Расшифровка молекулярного механизма действия а-ЛТ вносит вклад в фундаментальные представления о молекулярной организации пресинапти-ческой мембраны и принципах действия природных нейротоксинов. Полученные результаты могут найти применение в нейробиологии и медицинской биохимии при изучении молекулярных основ патологических изменений в электровозбудимых тканях.

Апробация работы. Основные результаты работы были доложены на двух Гордоновских конференциях: по ионным каналам (NewLondon, США, 1990) и по механизму мембранного транспорта (Plymouth, США, 1991); на Советско-Германском симпозиуме "Рецепторы и ионные каналы" (Иосква, 1991); на Международном Биофизическом конрессе (Budapest, Венгрия, 1993); на международном симпозиуме "Ооциты: инструмент для изучения клеточных и молекулярных процессов" (Arolla, Швеция, 1993); на международном симпозиуме "Динамика и функции биомолекул" (Szeged, Венгрия, 1993).

обьеи и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 108 страницах машинописного текста и содержит 4 таблицы и

23 рисунка. Список литературы содержит 117 наименований. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, и выводов. Обзор литературы состоит из двух глав. Первая глава рассматривает современное представление о механизме действия а-ЛТ. Вторая глава посвящена обсуждению возможностей метода функциональной экспрессии в ооцитах Xenopus laevis.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В экспериментах использовались ооциты 5-6 стадий зрелости от взрослых самок лягушек Xenopus laevia. Ооциты инкубировали в нормальном физиологическом растворе следующего состава (в мМ): NaCl 96, KCl 2, СаС12 1,8, MgClg 1, ХЕПЕС S, pH 7,5. Инъекции мрнк в ооциты проводили с помодью микроиньектора Mikroinjector 5242 (Eppendorf, ФРГ). В каждый ооцит инъецировали около 50 нл водного раствора РНК в концентрации 1 нг/нл.

Электрофизиологические эксперименты проводили на 3-8 день после инъекции РНК в ооциты. Токи от целых ооцктов регистрировали при помощи двухмикроэлектродного метода фиксации потенциала. В этом случае ооцит помещали в экспериментальную камеру, и перфузи-ровали требуемым раствором, в который добавляли а-ЛТ до концентрации 10 нМ.

Токи, потекающие через одиночные каналы, регистрировали при помощи метода фиксации потенциала на изолированном мембранном фрагменте. В этом случае экспериментальную камеру заполняли раствором КАспЮО (в мМ) : К-аспартат 100, KCl 20, MgCl2 1, ЭГТА 2, ХЕПЕС 10, pH 7,4; или раствором КС1120 (в мМ): KCl 120, MgCl2 1, ЭГТА 2, ХЕПЕС 10, pH 7,4. Для заполнения микропипеток использовали нормальный физиологический раствор или раствор с пониженной концентрацией Na+ и повышенной концентрацией Ca2t следующего состава Св мМ) : NaCl 9,6, KCl 2, СаС12 44, MgCl2 1, глюкоза 44, ХЕПЕС 5, pH 7,4, в которые добавляли а-ЛТ до конечной концентрации от 0,1 нМ до 10 нМ в разных экспериментах. Накопление и анализ данных проводился с помощью пакета программ "Bioquest".

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Глава.1. Функциональная экспрессия в ооцитах Xenopus laevis рецептора а-ЛТ.

С целью осуществления функционально* экспрессии рецептора а-ЛТ, в ооциты Xenopus была инъецирована поли(А*)-РНК из мозга крысы. Регистрацию токов, индуцируемых в мембране ооцитов Xenopus после инъекции РНК, проводили методом двухмикроэлектродной фиксации потенциала.

На 2-4 день после инъекции РНК в ооциты наблюдалась экспрессия рецепторов и каналов, характерных для мозга. В частности, в ответ на добавление в омывающий раствор ГАИК, каината, L-глютамата, ацетилхолина, глицина и субстанции Р развивался характерный мембранный ток, что использовалось в качестве теста для контроля прохождения экспрессии. Контрольные ооциты от тех же доноров не давали ответа на аппликацию перечисленных веществ.

На 5-8 день после инъекции РНК в ооциты, в ответ на добавление в омывающий раствор а-ЛТ (до конечной концентрации 10 нМ), развивался медленный мембранный ток, который при поддерживаемой потенциале -60 кВ был входящин (Рис 2,А). Ток развивался с задержкой 1,5-2 мин после аппликации а-ЛТ и выходил на плато а течение 3-5 мин. Когда а-ЛТ удаляли из омывающего раствора, ток исчезал с тем же временным интервалом. Повторная аппликация а-ЛТ приводила к раз'витию значительно меньшего (в 1,5-4 раза) ответа. Контрольные ооциты от тех же доноров не давали ответа на аппликацию а-ЛТ.

Ответ на <х-ЛТ в ооцитах развивался только, когда токсин добавляли в омывающий раствор снаружи ооцита. Инъекция 25-30 нл а-ЛТ в концентрации 50-500 нМ в ооцит (п-6) не приводила к развитию тока. Это говорит о том, что токсин способен взаимодействовать с участком связывания на рецепторе только на внешней стороне мембраны. Обработка ооцитов, инъецированных поли(А+)-РНК, коклюшным токсином (0,5-1 мг/мл) в течение 6-14 часов также не влияла на индуцируемый а-ЛТ ток (п-8). Это означает, что эффект а-ЛТ не опосредуется G-белками, чувствительными к коклюшному токсину.

Однако, ток, индуцируемый а-ЛТ в ооцитах, инъецированных суммарной поли(А+)-РНК из мозга крысы, как правило, был неболь-

Рис. 1. Ток, индуцируемый а-ЛТ в ооцитах Хепориз, после инъекций различных фракций поли( А)+-РНК из нозка крысы. На гистограмме представлены величины токов, индуцируемых а-ЛТ в ооцитах, после инъекций соответствующих фракций РНК. Непрерывная линия -профиль поглощения фракций РНК при 260 ни. Положения маркеров (28 Б и 18 Э рибосомальная РНК) на идентичном градиенте сахарозы указаны стрелками.

шим (20-60 пд) и развивался не в каждом ооците, что связано с минорным содержанием специфической рецепторной РНК в препаратах суммарной поли(А+)-РНК из мозга крыс. Обогатить препарат специфической мРНК позволило фракционирование суммарной поли(А*)-РНК в градиенте плотности сахарозы. Нами были определены фракции, экспрессия которых в ооцитах Хепориз, приводила к развитию токов, индуцируемых а-ЛТ. Эти фракции содержали РНК с молекулярным весом от 2,0х103 кДа до 2,8х103 кДа. Токи, развивающиеся в ответ на аппликацию а-ЛТ в ооцитах, инъецированных данными фракциями, был и значительно больше по амплитуде (средняя амплитуда 185470 нА, в отдельных ооцитах до 400 нА), чек в случае инъекций суммарной поли( А+) - РНК (Рис.1). Все последующие эксперименты по функциональной экспрессии рецептора а-ЛТ в ооцитах проводились с использованием фракционированной поли(А*)-РНК.

Глава 2. Исследование ионной природы тока, индуцируемого а-ЛТ в целых ооцитах Хепориз, инъецированных мРНК из из мозга крысы.

В специальной серии экспериментов измерялись сдвиги потенциала реверсии тока, индуцируемого а-ЛТ. Потенциал реверсии тока, который определяли с помощью импульса со скоростью нарастания 150 мВ/с, варьировал от -8 мВ до -20 мВ (Рис.2), составляя в среднем -17,4±4,4 мВ (п-25) в различных партиях ооцитов от нескольких доноров.

4 * » /2 18 U НОМЕР ФРАКЦИИ

0.75 0.50

Г

-0.25 -0.50 -0.75

2мин

-80 -60 -40 -20 0

Мембранный потенциал, мВ

Рис. 2. А - Ток, индуцируемый a-JlT в целом ооците, после инъекции РНК. Горизонтальная линия показывает продолжительность аппликации а-ЛТ. Стрелками отмечено время наложения импульсов. Б - вольт-амперная характеристика тока в контроле (1) и во время пика ответа на а-ЛТ (2). Поддерживаемый потенциал -60 нВ.

При увеличении концентрации К+ в омывающем растворе с 2 мН до 48 мМ (К* заменял Na*), наблюдался сдвиг потенциала реверсии в положительную сторону на 20 мВ. Поскольку величина сдвига потенциала реверсии намного меньше ожидаемой при допущении, что канал проводит только один ион, можно предположить, что канал, индуцируемый а-ЛТ, может проводить как Na+, так и К+, при этом К+ лучше чем Na+.

Замена омывающего нормального физиологический раствора, на раствор с пониженной концентрацией Na+ и повышенной CaJt (9,6 мИ Na4 и 44 мм Саг+) не приводила к достоверному сдвигу потенциала реверсии тока, что позволяет предположить, что канал, индуцируемый а-ЛТ, может проводить как Ns+, гак и Саг+. Эти данные совладают с результатами, полученными ранее на нейросекреторных клетках линии РС12 (Wanke et al., 1986) .

Ток, индуцируемый а-ЛТ, эффективно блокировался Cd2* (Рис.3).

Замена в омывающем нормальном физиологическом растворе 1/3 ионов С1 на не проникающие через мембрану ионы метансульфоната приводила к сдвигу в положительную сторону потенциала реверсии на 3±0,23 мВ (п-4), тогда как замещение 2/3 ионов С1~ метансульфона-том вызывало положительный сдвиг на 11,4±1,7 мВ (п-6). Однако,

- 6 -

2мМ Cd:*

а-ЛТ

Рис. з. Эффект Сс1 (г мМ) на ток, индуцируемый а-ЛТ. Горизонтальные линии указывают время аппликации а-ЛТ и Сс1 + . Поддерживаемый потенциал -60 мВ.

I**

2мин

потенциал реверсии и наблюдаемый сдвиг потенциала реверсии были значительно меньше таковых, предсказанных по уравнению Нернста для чисто хлорной проводимости (+11 мВ для внешнего раствора с замещенными 1/3 ионов С1~, и +24 мВ для внешнего раствора с замещенными 2/3 ионов С1 , соответственно). Эти результаты показывают, что хлорная проводимость также может вносить некоторый вклад в ток, индуцируемый а-лт в целых ооцитах. По-видимому, вход ионов Саг+в клетку, активирует Са2*-завясимый С1-ток в ооцитах. Эти данные совпадают с результатами, полученными ранее на ооцитах, инъецированных иРНК из мозга крысы (Ombah et al. , 1990) . Вклад Саг+-зависимого Cl -тока варьирует в различных партиях ооцитов от разных доноров, что отражается в разбросе величины потенциала реверсии для тока, индуцируемого а-ЛТ. Однако, возможный вклад хлорного тока в суммарный ток, развивающийся в ооцитах под действием а-ЛТ, затрудняет исследование селективности канала,открываемого а-ЛТ. Более информативным методом, в данном случае является метод фиксации потенциала на изолированном мембранном фрагменте.

Глава з. Одиночный канал, образуемый а-ЛТ в мембране ооцитов Хепориз, инъецированных поли(А+)-РНК из мозга крысы.

3.1. Проводимость и селективность одиночного канала.

В ооцитах, инъецированных поли(А+) - РНК, наблюдалось появление одиночных каналов примерно а 30% экспериментов при наличие в пипетке а-ЛТ. Каналы появлялись, как правило, в течение минуты после образования гигаомного контакта я затем почти все

время находились в открытом состоянии. Возникновение каналов наблюдалось как в конфигурации "cell-attached", так и "inside-out". Ток, проходящий через канал, при отрицательных потенциалах был входящим и уменьшался при деполяризации мембраны. На Рис. 4,5 представлены вольт-амперные характеристики каналов, индуцируемых а-ЛТ. Точки для вольт-амперных характеристик были определены из анализа амплитудных гистограмм, построенных по записям тока для каждого потенциала.

j-70-e0-50~40-30-a0-10 о

Мембранный потенциал, мВ

Рис.4. Вольт-амперные характеристики СВАХ) каналов, индуцируемых а-ЛТ с проводимостью 11 пСм и 31 пСм. Потенциал реверсии составлял О мВ для обеих ВАХ. Справа показана запись тока через одиночный канал проводимостью 31 пСм.

Активность канала представляла собой импульсы тока, сгруппированные в серии ("пачки"). В случае, когда а-ЛТ в пипетке находился в нормальном физиологическом растворе между "пачками" обычно наблюдались длительные интервалы "молчания". Эти интервалы становились значительно короче, когда в концентрацию Саг+ в пипетке увеличивали до 44 кМ.

Потенциал реверсии одиночных каналов был "коло о нВ. Добавление в раствор с внутренней стороны мембраны 15 мМ Ка+ приводило к сдвигу потенциала реверсии на 15 мВ в отрицательную сторону, что говорит о том, что ионы На+ могут проходить через канал. Потенциал реверсии достоверно не изменялся в растворе с пониженной концентрацией Иа+ и повышенной Са2+ (9,6 мМ Ыа+ и 44 мМ Са2+), что позволяет предположить что канал, ин-

- а -

дуцируемый а-ЛТ, может проводить кан N8*, так и Са2+.

Добавление с внутренней стороны кембраны 2 кМ СА2*, полностью блокировало открывание канала.

Тот факт, что значение потенциала реверсии находится около О мВ указывает на то, что ионы К+ также могут проходить через канал.

Потенциал реверсии не ненялся, когда непроникающие ионы аспартата заменяли на ионы С1 с внутренней стороны мембраны

0.4

¡2-0.4

-0.8 -1.2

• - ИЗпСм Т - 8=24 пСм V - 15мМ [Ма],. У.

Рис. 5. Вольт-амперные характеристики каналов, индуцируемых а-ЛТ, с разной проводимостью. Добавление в раствор с внутренней стороны мембраны 15 мМ На приводит к отрицательному сдвигу потенциала реверсии на 15 мВ.

-60 -20 20 60 Мембранный потенциал, мВ

(концентрацию ионов С1 увеличивали в 6 раз). Это указывает на то, что ионы С1 не проходят через канал.

Таким образом, полученные результаты демонстрируют, что канал, образуемый а-ЛТ. в мембране ооцитов, инъецированных поли(А+)-РНК из мозга крыс, представляет собой неселективный катионный канал. Проводимость одиночного канала составляла в среднем 11,4±1,2 пСм (п-8).

3. 2. Подуровни проводимости канала.

В наших экспериментах, кроме каналов со средней проводимостью 11,411,2 пСм мы наблюдали также появление каналов со значительно большей проводимостью. Каналы большой проводимости регистрировались как в случае, когда в пипетке был нормальный физиологический раствор, гак и в растворе с 44 мМ Са", однако чаще такие каналы можно было видеть в р&створе с 44 мН Саг+. Потенциал реверсии всех каналов как большей, так и меньшей проводимости был около О мВ. Анализ величин проводимостей позволяет предположить, что ве-

- 9 -

личины больших проводимостбй кратны величинам меньших проводимос-тей. В Табл.1 представлены результаты 9 экспериментов, которые показывают, что работа одного и того же канала может стабилизироваться в различных проводящих состояниях (Табл.1, шифры экспериментов 170393 И 3003932).

Табл.1. Потенциал реверсии IЕрвв' и ПР0В°ДИМ0СТЬ Сд) каналов, образуемых а-лт, при различных концентрациях токсина и растворов в пипетке и ячейке.

Шифр Ерев (мВ) Я Токсин KoHijiHr. Раствор Раствор

эксперим. (ПСм) <нМ) "noria" в пипетке в ячейке

61092 2 10 10 inside-out Ca44 KAcnlOO

30393 -7 11, 9 2 cell-attach. Ca44 KAcnlOO

403931 8 10 2 cell-attach. Ca44 KAcnlOO

403932 -5 12 2 inside-out Ca44 KAcnlOO

60393 -8 12, 9 10 inside-out Ca44 KC1120

160393 10 28, 8 1 cell-attach. Ca44 KC1120

170393 0 30, 8 0,1 cell-attach. Ca44 KC1120

170393 0 12 0,1 cell-attach. Ca44 KC1120

3003931 0 12 10 inside-out ND-96 KC1120

3003932 0 24 10 inside-out ND-96 KC1120

3003932 0 11 10 inside-out ND-96 KC1120

3003932 0 5, 5 10 inside-out ND-96 KC1120

На Рис.6 приведены записи работы каналов, на которых обнаруживаются подуровни проводимости. Распределения относительных площадей под каждым пиком амплитудных гистограмм сравнивались с коэффициентами биномиального распределения. Как известно, соответствие биномиальному распределению характерно для независимых процессов. Сравнение показало, что распределение площадей не соответствует биномиальному распределению, и, следовательно, наблюдаемые каналы не являются независимыми, а представляют собой подуровни проводимости одного канала.

Для канала, запись работы которого приведена на Рис.6,л, наиболее вероятными оказались проводимости 3,5 пСм, 11 пСм и 24. пСм (Табл.2, шифр эксперимента 3003932), а на Рис. 6,Б - 12 пСм и 30 пСм (Табл.2, шифр эксперимента 170393). Переходы кежду подуровнями проводимости значительно чаще происходили в растворе с нормальной концентрацией Са2+, чем с высокой концентрацией Саг+. Это позволяет предположить, что ионы Са" могут стабилизи-

Рис.е. Подуровни проводимости одиночного канала, индуцируеного а-ЛТ. В верхней части рисунка прдставлень^+записи токов, в нижней - амплитудные гистограммы. А - 1,8 кМ Са , мембранный потенциал -70 мВ, конфигурация inside-out, различаются подуровни проводимости 5,5 пСм, 11 пСм, 24 пСм. Б - 44 КМ Са мембранный потенциал -SO мВ, конфигурация cell-attached, подуровни проводимости 12 пСм, 34 пСм.

ровать канал в наиболее вероятных состояниях проводимости. Иногда мы наблюдали каналы проводимостью 200 пСм. Как правило, в таком случае с появлением очередного канала большой проводимости возрастал ток и "пэтч" разрушался.

3.3.Кинетические характеристики канала.

В некоторых экспериментах, в частности, в случаях, когда в пипетке находился раствор с высокой концентрацией Са", удавалось зарегистрировать работу канала на одном уровне проводимости. Это позволило оценить некоторые кинетические характеристики канала (Рис.7).

Распределение времен открытого состояния канала описывалось суммой двух экспонент. Постоянная времени первой экспоненты (более быстрой), была около 85 мс при -40 мВ и увеличивалась при гиперполяризации мембраны (Рис. 7,Б,В). Постоянную времени второй экспоненты было трудно оценить точно, поскольку для получения временного распределения потребовалась бы очень длительная регистрация работы канала. При -40 кВ постоянная времени второй экспоненты была около 3000 мс. Вероятность компонент определяли

- 11 -

1 Ьзутттп

1СI = I мс

1С2=2»МС

20 30 Ш 50 Время, мс

Мембранный потенциал, мВ Мембранный потенциал, мВ

Рис 7. Некоторые кинетические характеристики одиночного канала, индуцируемого а-ЛТ. А - гистограмма распределения времен открытого, Б - закрытого состояний. В - график зависимости постоянной врекени быстрой компоненты открытого состояния и медленной компоненты закрытого состояния от мембранного потенциала. Г - график зависимости вероятности открытого состояния от мембранного потенциала.

как относительную площадь под экспонентой на гистограмме. Лля распределения времен открытого состояния, вероятности быстрой и медленной компоненты были определены, как 0,62 и 0,37, соответственно.

Распределение времен закрытого состояния показало две хорошо различимых экспоненты с постоянными времени приблизительно 1,5 мс я 20 мс, которые соответствуют интервалам закрытого состояния внутри "пачек" и между "пачками" (Рис.7,А). Для распределения времен закрытого состояния вероятность быстрой компоненты была определена как 0,88, в то время как вероятность медленной компоненты - как О,12. Постоянные вренени этих компонент практически не зависели от потенциала (Рис. 7,В). Иногда мы наблюдали очень длинные (порядка десятков секунд) интервалы

- 12 -

"молчания" канала. Такие длительные интервалы "молчания", как правило, возникали, когда в пипетке находился раствор с нормальной концентрацией Саг+.

Распределения времен открытого и закрытого состояний были одинаковы для каналов как большей, так и меньшей проводимости. Вероятность открытого состояния канала, определяемая как отношение всего времени, которое канал находился в открытом состоянии, ко всему времени регистрации, была около 0,89 при -80 мВ и немного уменьшалась при деполяризации мембраны (Рис.7,Г). Таким образом, большую часть времени работы канал находился в открытом состоянии.

Кинетические характеристики работы канала в условиях, когда в пипетке находился раствор с нормальной концентрацией Саг+, было трудно проанализировать, так как в этом случае, как правило, наблюдались постоянные переходы между подуровнями работы канала. Однако, анализ кинетики работы канала в нормальном Са", в нескольких экспериментах, когда переходы между подуровнями наблюдались редно, показал, что кинетические характеристики были

близки к полученным в экспериментах с высокой концентрацией « 2+ Са .

3. 4. Действие различных концентраций а-ЛТ.

В исследованном диапазоне концентраций а-ЛТ 0,1 нМ - 10 нМ, проводимость одиночного канала и потенциал реверсии тока не зависели от концентрации а-ЛТ. Каналы как большей, так и меньшей проводимости, а также подуровни проводимости, наблюдались в экспериментах с различной концентрацией а-ЛТ (Табл.1). Кинетические характеристики канала также не менялись. При всех концентрациях, открывания канала носили "пачечный" характер. Внутри "пачек" распределения времен открытого и закрытого состояний не зависели существенно от концентрации токсина. Средняя длительность пачки и число открываний на "пачку" не менялось с изменением концентрации токсина.

Следует отметить, что при уменьшении концентрации токсина, возрастала длительность интервалов "молчания", которые могли продолжаться до нескольких десятков секунд. Однако, анализ таких интервалов "молчания" не представляется возможным, поскольку для

того чтобы разрешить такие . события на гистограмме, потребовались бы записи нескольких часов работы канала.

Таким образом, нами был зарегистрирован одиночный канал, образуемый а-ЛТ в мембране ооцитов Хепориз, инъецированных нРНК из мозга крысы, и проанализированы некоторые кинетические характеристики. Основным вопросом, принципиальным для поникания механизма действия а-ЛТ, остается вопрос - что же образует канал -молекула (молекулы) а-ЛТ или рецептор а-ЛТ?

Известно, что а-ЛТ способен формировать неселективный ка-тионный канал в ЕЛИ (Finkelstein et al., 1976; Красильников и др., 1982; Robello et al., 1984; Mironov et al., 1986., Krasilnikov, Sabirov, 1992) и ионы Саг+ значительно облегчают внедренее молекул а-ЛТ в БЛМ (Robello et al., 1984; Mironov et al., 1986). Каналы, формируемые а-ЛТ в БЛЙ, имеют очень широкий спектр проводимостей: от 13 пСк до 200 пСм и более (Mironov et al., 1986; Krasilnikov, Sabirov, 1992), a также большую часть времени находятся в открытом состоянии (Wanke et al., 1986; Mironov et al., 1986; Krasilnikov, Sabirov, 1992; Sheer et al., 1986). Недавно было показано, что каналы, образуемые а-ЛТ в БЛИ, имеют кластерную организацию, то есть -состоят из множества ассоциированных элементарных каналов (Krasilnikov, Sabirov, 1992). Таким образок, проводимость результирующего канала может варьировать в очень широком диапазоне, в зависимости от числа молекул, ассоциированных в кластеры. Наши результаты весьма похожи на наблюдаемые на ЕЛИ и подтверждают гипотезу о том, что молекулы а-ЛТ или кластеры молекул, способны формировать неселективные катионные каналы, в самом деле, в наших экспериментах, каналы, образуемые токсинон, могли проводить Na+, К+ и Са2+. Подуровни проводимости также находились в очень широком диапазоне от 3 до 200 псм. Ионы Са2+ стимулировали открывание канала и стабилизировали его работу на одном уровне проводимости, возможно синхронизируя открывание каналов в кластере. Работа канала большой проводимости приводила, как правило, к разрушению мембраны, что трудно объяснить, считая данный канал - нативнык каналом. Более вероятным представляется предположение, что кластер молекул а-ЛТ, синхронно открывающийся после внедрения в мембрану вызывает

тон, приводящий к разрушению мембраны. Анализ кинетических характеристик канала показал, что канал находится в открытом состоянии большую часть времени, что также подтверждает данные, полученные на БЛМ.

Какова же роль рецептора для а-ЛТ в механизме действия а-ЛТ? Известно, что для действия а-ЛТ характерна строгая тканевая специфичность (Meldolesi et al., 1386; Grasso et al., 1987). Иы не наблюдали открывания похожих каналов в мембране неиньецированных контрольных ооцитов. В наших экспериментах мы регистрировали образование одиночных каналов даже когда концентрация а-ЛТ в пипетке была 0,1 нМ, то есть сравнимой с концентрацией, в которой он действует на синапсы позвоночных. Sheer et al. (1986) показали, что рецептор а-ЛТ, реконструированный в БЛН, уменьшал эффективную концентрацию в которой токсин был способен формировать каналы, а также время образования каналов. По-видиному, связывание токсина с рецептором значительно облегчает внедренее токсина в БЛМ, а внедренее токсина в нативную плазматическую мембрану вообще возможно только после связывания с рецептором. Известно, что рецептор а-ЛТ находится исключительно на внешней стороне пресинаптической мембраны (Meldolesi et al., 1986; Eetrenko et al., 1990; Ushkarev et al., 1992), а именно, локализуется в активной зоне синаптической передачи (Petrenko et al., 1991; Surkova, Grishin, 1991; Grihsin et al., 1992), ответственной за транспортировку и слияние синаптических пузырьков. Мы можем предположить, что драматические последствия действия а-ЛТ, связаны именно с тем, что он связываеся с рецептором, локализованным точно в активной зоне синаптической передачи, и, внедряясь в мембрану,^.образует в ней проницаемый для катионов канал. Вход Саг+ через такой постоянно открытый катионный канал, в конечном итоге, стимулирует массированный выброс медиатора из нервных окончаний.

3.5.Кинетическая модель работы канала.

На основе результатов исследования работы одиночного канала, была предложена вероятная модель действия а-ЛТ.

В схеме, представленной на Рис.8, R обозначает рецептор а-ЛТ, комплекс рецептора с кластером п молекул а-ЛТ в закрытой

R

i

—>-

/ S. 2 (nT)R и С, в о

(nT)R < ■ > О, «ад** и °2

—2 А лйкул тпкгяка в

-S

О

2 к

конформации обозначен как (пТ)К и С, в открытой конфор-Количество молекул токсина в кластере может варьировать. Скорость связывания а-ЛТ с рецептором И пропорциональна концентрации токсина X, константа скорости ас-

~4

Рис. 8.

Вероятная модель действия а-ЛТ.

мала (вероятно меньше ностъю связывается с рецептором

время как константа скорости диссоциации 1 - мала. В результате равновесная константа диссоциации очень

чем 0,1 нМ), и токсин с высокой аффин-Лаже когда концентрация токсина

в растворе очень мала (0,1 нЮ, токсин связывается с рецептором и вовлекается в процесс внедрения в мембрану и формирование канальной активности. Средняя длительность жизни в состоянии R составляет 1/JCjX (Colquhoun, Hawks, 1977, 1981) и увеличивается с уменьшением концентрации токсина X, в результате чего возрастают длительные интервалы "молчания" канала. Ионы Ca2t способствуют внедрению токсина в мембрану и увеличивают Jc^, в результате чего ' интервалов "молчания" канала уменьшается. Кроме

длительность

того, ионы С а синхронизируют открывания каналов в кластере, в результате чего, при увеличении концентрации Саг+, главным образом наблюдается один уровень проводимости.

После связывания с рецептором молекула токсина участвует в последовательности конформационных изменений, которые характеризуются двумя открытыми и двумя закрытыми состояниями. Ранее было показано существование двух открытых состояний для каналов, формируемых а-ЛТ в БЛН (Mironov еЪ а1., 1986). Состояние (пТ)К соответствует интервалам между пачками, состояние С - закрытым интервалам внутри пачек, состояния 01 I Ог - коротким и длинным интервалам открываний, соответственно. Мы наблюдали в экспери-ментых все перечисленные состояния и переходы между ними. Все константы скоростей переходов между состояниями <пТ)К, о^, с и

Og не зависят от

концентрации токсина или ионов са . В резуль-

социации к. очень велика, в то

тате среднее время жизни в этих состояниях не зависит от концентрации токсина и Ca", что, в действительности и наблюдалось в экспериментах. Это говорит о некооперативнон связывании а-ЛТ с рецептором. По-видимому, молекула (кластер молекул) а-ЛТ связывает рецептор в одном участке.

Хотя мы не проводили количественный анализ работы модели, данная модель удовлетворительно объясняет качественное поведение одиночного канала в наших экспериментах.

Глава 4. Влияние антител против а-ЛТ и рецептора токсина на суммарный ток, индуцируемый а-ЛТ в мембране ооцита Хепо-pus, инъецированного поли( А+)-мРНК из мозга крысы.

Было проведено исследование влияния пяти моноклональных антител (мАТ), полученных против а-ЛТ и трех поликлональных моноспецифических антител (пАТ) против рецептора токсина на суммарный ток, индуцируемый а-ЛТ в целой клетке. Эксперименты проводили с помощью метода двухмикроэлектродной фиксации потенциала.

В наших экспериментах пАТ, полученные против N- и С-концевых участков молекулы рецептора не оказывали влияния на ток, индуцируемый а-ЛТ, в то время как все МАТ против а-ЛТ в разной степени влияли на эффект а-ЛТ. Полученные ранее результаты показали, что все используемые мАТ способны связываться с а-ЛТ в растворе и, при этом, не мешают связыванию а-ЛТ с рецептором на синаптосокальных мембранах (Pashkov et al., 1993). Поскольку мАТ против а-ЛТ не мешали связыванию а-ЛТ с рецептором, и, в то же время, в разной степени ингибировали эффект а-ЛТ, по-видимому, модифицированный антителами а-ЛТ терял способность формировать канал в мембране ооцита. Таким образом, данные результаты могут служить дополнительным подтверждением нашего предположения, что канал, индуцируемый а-ЛТ в мембране ооцита Хепориз не является рецептором а-ЛТ, а формируется молекулой (молекулами) а-ЛТ.

выводы

Методом двухмикроэлектродной фиксации потенциала на целых ооцитах Xenopus, инъецированных мРНК из мозга крысы, показано:

1) а-ЛТ индуцирует в мембране ооцита медленно активирующийся ток, направленный в клетку при п оддерживаемом потенциале -60 мВ. Ионы Na+, к+ и Са2+ могут вносить вклад в развитие данного тока, при этом вход Са2+ в клетку стимулирует развитие вторичного Са2+-зависимого С1 -тока.

2) Индуцируемый а-ЛТ ток развивается в мембране ооцитов Xenopus, инъецированных фракцией мРНК, молекулярный вес которой соответствует области 2,0х103кД - 2,8х103 КД.

3) Исследовано влияние на ток, индуцируемый а-ЛТ пяти мАТ против а-ЛТ и трех поликлональных моноспецифических АТ против рецептора а-ЛТ. Показано, что АТ против рецептора а-ЛТ не влияли на ток индуцируемый а-ЛТ, в то время как все исследованные мАТ против а-ЛТ частично или полностью ингибнровали данный ток.

4) Методом фиксации потенциала на изолированном мембранном фрагменте, впервые зарегистрирован одиночный канал, образуемый а-ЛТ в мембране ооцитов, инъецированных мРНК из мозга крысы. Показано, что данный канал является неселективным катионным каналом, потенциал реверсии которого около О мВ. Средняя проводимость канала составляла 11 пСм.

5) Показано существование подуровней проводимости канала, которые варьировали от 3 пСм до 200 пСм. Ионы Са2+ стабилизировали работу канала в наиболее вероятных состояниях проводимости.

6) Проанализированы кинетические характеристики одиночного канала, образуемого к-ЛТ. На основании экспериментальных данных предложена качественная модель работы канала, объясняющая наблюдаемые закономерности работы канала.

7) Вся совокупность полученных результатов лозволяет сделать предположение, что молекулы а-ЛТ, связываясь с рецептором, формируют неселективные катионные каналы в мембране.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Tsurupa G., Pashkov V., Filippov A., Kovalevskaya G.f Griko N., Tertisnikova S., Himmelreich N,, Strochak L., Grishin E., Latrotoxin-receptor interaction studied by antibodies and mRNA expression in Xenopus oocytes - Abstr. 4th Soviet-FRG Symposium on Receptors and Ion Channels. Moscow, USSA, 1991, p.57.

2. Filippov A., Tertishnikova S., Alekseev A., Grishin E., a-Latrotoxin opens the ion channel in the membrane of Xenopus oocytes injected by brain mBNA. - In: "Aspects of Synaptic Transmission" , 1993, Taylor and Francis, London , p.211-220.

3. Filippov A., Tertishnikova S., Alexeev A., Grishin E., Ion channel coupled to presynaptic a-Latrotoxin receptor. Abstr. 11th International Biophysics Congress, July 25-30, Budapest, Hungary, 1993, p.140.

4. Filippov A., Tertishnikova S., Alexeev A., Grishin E., a-Latrotoxin receptor channel expressed in Xenopus oocytes after brain mBNA injection - Abstr. European Symposium on "The oocyte: A tool for the study of cellular and molecular processes", Arolla, Switzerland, 4-8 July, 1993, p.28.

5. Tertishnikova S., Filippov A., Alexeev A., Grishin E., Mechanism of action of protein neurotoxin from black widow spider - Abstr. Simposium on "Dynamics and Function of Biomolecules", Szeged, Hungary, 30 July - 2 August, 1993.

6. Filippov A.K., Tertishnikova S.M., Alekseev A.E., Tsurupa G.P., Pashkov V.N., Grishin E.V. Mechanism of a-Latrotoxin action as revealed by patch clamp experiments on Xenopus oocytes injected with rat brain mBNA - Neuroscience (in press).