Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Белковые факторы маскирования и демаскирования мРНК в клетках эукариот
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия
Автореферат диссертации по теме "Белковые факторы маскирования и демаскирования мРНК в клетках эукариот"
РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ БИОХИМИИ имени А. Н. БАХА
На правах рукописи УДК 577.152.5
РГЗ од
2 7
} .1 ' м
СТЕПАНОВ Александр Семёнович
БЕЛКОВЫЕ ФАКТОРЫ МАСКИРОВАНИЯ И ДЕМАСКИРОВАНИЯ мРНК В КЛЕТКАХ ЭУКАРИОТ
03.00.04 — биохимия
Диссертация на соискание учёной степени доктора биологических наук в форме научного доклада
Москва — 1996
Работа выполнена в Институте биохимии им. А.Н. Баха РАН
Официальные оппоненты:
академик РАН А. А. Богданов
доктор биологических наук, профессор Н. Б. Ливанова доктор биологических наук, профессор А. А. Нейфах
Ведущая организация:
Московский Государственный Университет им. М.В. Ломоносова, биологический факультет
Защита состоится 1996 г. в 10 часов на
заседании специализированного совета Д 002.96.01 по защите диссертаций на соискание учёной степени доктора наук при Институте биохимии им. А.Н. Баха РАН (117071 Москва, Ленинский пр., 33, корп. 2)
С диссертацией можно ознакомиться в Библиотеке биологической литературы РАН (Москва, Ленинский пр., 33, корп. 1)
-Диссертация разослана ^ _ 1996 г.
Учёный секретарь специализированного совета, доктор биологических наук
Т.А. Валуева
Актуальность проблемы. К началу 70-х годов определились экспериментальные предпосылки для выяснения молекулярных механизмов маскирования мРНК — нахождения её во временно нетранслируемой форме на любой стадии жизненного цикла эукариотических клеток различного происхождения. Согласно гипотезе А.С.Спирина белки, блокирующие трансляцию мРНК в цитоплазме клеток, обеспечивают сохранение нефункционирующей мРНК — маскирование мРНК в форме комплексов мРНК с белками — мРНП-частиц, названных информосомами (Спирин, Белицина, Айтхожин, 1964, Ж. общ. биол., т. 25, с. 321—338). Рибонуклеопро-теидная форма существования оказалась универсальной как для новообразованных молекул про-мРНК, синтезирующихся в ядре клеток эукариот, так и для всех последующих этапов биогенеза и функционирования мРНК. По всей вероятности, белки информосом на определённых этапах функционирования должны присутствовать в клетке не только в составе комплексов с мРНК, но и в свободном состоянии. Было высказано предположение, что фонд свободных белков информосом составляют РНК-связывающие белки, обнаруженные в экстрактах животных клеток и названные так из-за своей способности к взаимодействию с экзогенными высокомолекулярными РНК (Овчинников и др., 1968, Мол. биол., т. 2, с. 752—763). По-видимому, изменения величины, состава и доступности пула свободных РНК-связывающих белков являются решающими факторами регуляции трансляции в клетках эукариот.
Если предположить, что трансляционная активность мРНК обусловлена набором связанных с ней белков, то в основе явлений маскирования/демаскирования матриц в клетках эукариот должны лежать механизмы "переодевания" мРНК, т. е смены набора белков, связанных с матрицей. Тем не менее такая гипотетическая схема, предполагающая взаимообмен свободных РНК-связывающих белков ядра и цитоплазмы с белками информосом различной внутриклеточной локализации (ядерных гяРНП, свободных цитоплазматических мРНП и полирибосомо-связанных мРНП), еще до недавнего времени не имела под собой достаточной экспериментальной базы. Более того, оставались практически невыясненными молекулярные механизмы маскирования и демаскирования мРНК, несмотря на очевидную связь этих явлений с одной из центральных проблем молекулярной биологии — проблемой регуляции биосинтеза белков в клетках эукариот.
Маскирование мРНК белками представляет собой весьма распространённый вариант трансляционного контроля. Интенсивный синтез мРНК на средних стадиях оогенеза, сохранение большей части матриц вплоть до оплодотворения и ранних стадий эмбриогенеза амфибий — наиболее изученный и яркий пример маскирования мРНК в клетках эукариот. Считается, что механизмы контроля реализации запасённых мРНК, то есть механизмы регуляции экспрессии генов на пост-транскрипционном уровне, вносят определяющий вклад в общую регуляцию биосинтеза белков на стадиях оогенеза и раннего эмбриогенеза эукариот. Не случайно, чёткие экспериментальные данные, свидетельствующие в пользу рибонукпеопротеидной формы существования маскированных, запасённых мРНК, впервые были получены именно при изучении эмбриональных клеток (Spirin and Nemer, 1965, Science, Vol. 150, pp. 214—217). Ооциты амфибий и рыб на заключительных стадиях эмбриогенеза (так называемый период созревания ооцитов) стали основным объектом исследований в нашей работе.
Возможность трансляционного контроля в ооцитах, как и во всех эукариотических клетках, определяется наличием в клетках эукариот до сих пор ещё не изученного до конца набора белков, обслуживающих мРНК на всех этапах её биогенеза и функционирования ("Omnia mea mecum porto", Spirin, 1978, FEBS Letters, Vol. 88, pp. 15—17). Согласно этой гипотезе, белки аппарата трансляции в клетках эукариот должны обладать сродством к РНК, и кроме того, эти РНК-связывающие белки должны компартментапизоваться на РНК. Очевидно, этим двум положениям полностью соответствуют белки, обеспечивающие процессы маскирования/демаскирования мРНК в ооцитах. Представления о важной роли специальных белков в регуляции трансляции мРНК сложились практически полностью на основании результатов, полученных в работах с бесклеточными системами. Оставался, однако, не выясненным принципиально важный вопрос о том, насколько эти результаты отражают действительную ситуацию в живой клетке. (Современное состояние проблемы см. в обзоре: Спирин, 1996, Успехи биологической химии, т. 36, с. 3—48). Генетические подходы к изучению механизмов регуляции трансляции в клетках эукариот пока что ограничиваются незначительным числом объектов. Использование ооцитов амфибий как естественной модели для изучения
механизмов биосинтеза белка и его регуляции, в частности, применение методов микрохирургии и микроинъекций в ооциты, предоставляют уникальную возможность для исследования этих процессов в живой клетке. Подобный подход представляется особенно перспективным для выяснения механизмов компарт-ментализации белков аппарата трансляции и для изучения пространственной организации белок-синтезирующего аппарата в цитоплазме эукариотических клеток.
Основная цель настоящей работы состояла в получении прямых экспериментальных доказательств возможности участия РНК-связывающих белков в процессах маскирования и демаскирования мРНК в клетках эукариот. При этом главная задача заключалась в разработке экспериментальных подходов для выяснения механизмов маскирования/демаскирования мРНК в живой клетке.
Научная новизна и практическая значимость работы.
1. Разработан критерий отличия естественных информосом от искусственных РНП-комплексов, которые могут образовываться в экстрактах эукариотических клеток при добавлении в них экзогенных РНК. Основой критерия является стабильность РНП-комплексов в условиях избытка РНК, повышения ионной силы и температуры реакционной смеси. Стабильность РНП-частиц определяли по величине их плавучей плотности при центрифугировании в градиенте концентрации/плотности CsCI. Использование этого критерия позволило показать, что образование стабильных РНП-комплексов возможно при взаимодействии РНК-связывающих белков с гомологичной мРНК.
2. Разработан оригинальный подход к изучению РНК-белковых взаимодействий непосредственно в живой клетке путем сочетания современных методов биохимии, молекулярной биологии и экспериментальной эмбриологии. Впервые показано, что радиоактивно меченые in vitro свободные РНК-связывающие белки после инъекции в ооциты амфибий участвуют в формировании информосом, т.е. в маскировании мРНК.
3. Впервые в составе РНК-связывающих белков обнаружена и охарактеризована эндогенная протеинкиназа, идентифицированная как казеиновая киназа типа II (СК 2). Разработана высокоэффективная схема очистки СК 2 из клеток и тканей эукариот различного происхождения.
4. Установлено, что эндогенными субстратами СК 2 являются РНК-связывающие белки, сродство которых к РНК снижается вследствие фосфорилировам.л. Протеинкиназная активность СК 2 ингибируется мРНК и некоторыми другими полианионами.
5. Выявлено участие СК 2 в образовании информосом после инъекции очищенного фермента в ооциты амфибий. Сформулирована гипотеза о зависимости процессов маскирования/демаскирования мРНК в клетках эукариот от фосфорилирования РНК-связывающих белков эндогенной РНК-связывающей протеин-киназой (СК 2). При этом молекулам РНК отводится нетривиальная функция регулятора ферментативной (протеинкиназной) активности. Регулятором активности СК 2 могут выступать не только мРНК, но и другие полирубонуклеотиды. Не исключено также, что в клетке существует особый класс РНК, служащий эффектором для полианион-чувствительных ферментов. Кроме того, важную роль в регуляции клеточной активности фермента, несомненно, выполняет и изменение его сродства к РНК в различных физиологических условиях.
6. Впервые обнаружена корреляция между ак.ивацией СК 2 и возрастанием уровня трансляции демаскированных мРНК в процессе прогестерон-индуцируемого созревания ооцитов травяной лягушки Rana temporaria. Получены данные, позволяющие предполагать, что активация СК 2 является следствием повышения внутриклеточного рН.
7. Высказано предположение, что СК 2 необходима для предотвращения маскирования мРНК в клетк х эукариот. Впервые показано, что СК 2 является белком теплового шока и это подтверждает представления о СК 2, как о возможном позитивном регуляторе трансляции.
Результаты проведённых исследований позволяют утверждать, что основная роль СК 2, универсальной и наиболее изученной протеинкиназы эукариотических клеток, состоит в контроле процессов, связанных с функционированием мРНК. Значение полученных результатов в практике научных исследований состоит в разработке оригинального методического подхода к анализу РНК-белковых взаимодействий в живой клетке и в формулировании нового направления — выяснения роли ковалентных модификаций свободных РНК-связывающих белков в трансляции
предсуществующих мРНК. Изложенные в работе оригинальные результаты создают реальную экспериментальную основу для дальнейших исследований в этих направлениях.
Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на многих конференциях и симпозиумах, в том числе: "Сборка предбиологических и биологических структур" (Москва, 1979), XVI конференция ФЕБО (Москва, 1984), IV Советско-Итальянский симпозиум "Макромолекулы в функционирующей клетке" (Киев, 1984), "Молекулярная организация биологических структур" (Москва, 1989), "Translational Control"- (Колд Спринг Харбор, США, 1989, IV Международный микологический конгресс (Регенсбург, Германия, 1990), "Protein Biosynthesis" (Пущино, 1991). Результаты исследований неоднократно обсуждались на научных семинарах в Институте белка РАН, в Институте биологии развития РАН, в НИИ Физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ, докладывались на научных конференциях в Институте биохимии им. А.Н.Баха РАН, где были удостоены I премии в 1983, 1984, 1987 и 1994 гг.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 48 печатных работ.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
В работе использовали стандартный буфер состава: 0,01 М триэтаноламин, 0,01 М KCl, 0,005 М MgCI , 0,001 М ЭДТА, 0,006 М 2-меркаптоэтанол, 10% глицерин, pH 7,8.
Ткани и клетки гомогенизировали в стандартном буфере с 0,1 М NaCI и подвергали центрифугированию при 35000g в течение 15—20 мин. После удаления неразрушенных клеток, ядер и митохондрий проводили центрифугирование для осаждения рибосом (105000g 90 мин). Полученные безрибосомные экстракты использовали для выделения РНК-связывающих белков.
Выделение РНК-связывающих белков проводили с помощью афинной хроматографии безрибосомных экстрактов на поли(11)-, РНК- или гепарин-сефарозе 4В.
Ковалентное присоединение поли(и) и рРНК к цианогенбро-мид-активированной сефарозе осуществляли по модифицированной методике Вагнера и др. (1971).
Активацию сефарозы цианогенбромидом проводили по методу Пората и др. (1973).
РНК-связывающую активность определяли методом сорбции рибонуклеопротеидов на мембранные нитроцеллюлозные фильтры с диаметром пор 0,45 микрон,'и выражали количеством меченной [14С]рРНК E.coli (имп/мин), сорбированной на фильтре в присутствии данного количества белка. Каждая экспериментальная точка представляет собой усредненный результат трех независимых измерений.
Мечение белков in vitro проводили методом восстановительного метилирования с использованием 3Н-боргидрида натрия (Рибо и ДР., 1977).
Определение протеинкиназной активности проводили в 100 мкл стандартного буфера, содержащего, кроме анализируемой белковой фракции, 0,1 плМ [у-2Р]АТФ (Обнинское отделение "Изотоп") с удельной активностью около 500 имп/мин на 1 пмоль. Если в качестве субстрата использовали казеин, то его предварительно дефосфорилировали (10 минут на кипящей бане при рН 9,5) и добавляли в стандартную протеинкиназную систему в количестве 38 мкг. Время инкубации — 1 час при 20°С. Реакцию останавливали добавлением холодной трихлоруксусной кислоты до конечной концентрации 5%. Осадки наносили на фильтры GF/A(GF/C) ("Whatman", Англия), тщательно промывали холодной трихлоруксусной кислотой, высушивали и просчитывали их радиоактивность. Каждая экспериментальная точка представляет собой усредненный результат трех независимых измерений.
Константу Михаэлиса измеряли в той же системе, с варьированием концентрации субстрата, относительно которого данная константа измерялась. Ингибирование гепарином и поли(11) осуществляли в той же стандартной системе с казеином, но в систему добавляли различные количества ингибитора при различных значениях рН. В случае гепарина 1—Юмкг/мл, а в случае поли(и) 10—100 мкг/мл при рН 7,8 и 50—700 мкг/мл при рН 6,5. Время реакции — 1 час.
Мечение протеинкиназы радиоактивным йодом по модифицированной методике Щульце (1979) проводили в стандартном буфере (без глицерина и 2-меркаптоэтанола) с десятикратно увеличенной концентрацией всех компонентов при 0—4°С. К фасовке Na125l (Ленинградское отделение "Изотоп") объемом 15—30 мкл добавляли 250 мкл раствора белка и 10 мкл раствора хлорамина Т (3 мг/мл).
Через 15—20 минут реакцию останавливали добавлением 50 мкл метабисульфита натрия (0,76 мг/мл). От непрореагировавшей метки препарат белка очищали с помощью рехроматорграфии на поли(11)-сефарозе.
Инъекцию радиоактивного белка в ооциты R. temporaria проводили с помощью пневматического микроманипулятора производства СКВ БП (г.Пущино) по 64 или 96 нл в каждый ооцит. Препарат белков для инъекции содержал 0,5—1,0 мг/мл меченых белков в стандартном буфере с 0,1 M NaCI. Инъецированные ооциты инкубировали при температуре 18—20°С в растворе Рингера для холоднокровных, содержащем 500 ед/мл пенициллина и 250 ед/мл стрептомицина.
Экстракты фракционировали в градиенте концентрации сахарозы 15—30% на стандартном буфере, содержащем 4% формальдегида. Центрифугирование проводили в роторе SW50 при 45000 об/мин на центрифуге L5—50 в течение 120—150 мин.
В градиенте плотности CsCI анализировали либо фракции, полученные после центрифугирования экстрактов в градиентах концентрации сахарозы с 4% формальдегида, либо безмито-хондриальные экстракты после предварительной фиксации формальдегидом.
Концентрацию белка в препаратах определяли по методу Шаф-фнера и Вейсмана (Schaffner, Weissman, 1973).
Электрофорез в пластине полиакриламидного геля в присутствии додецилсульфата натрия проводили по методу Лэммли (Laemmli, 1970).
Высоковольтный электрофорез на бумаге Whatman ЗММ проводили в ЗН уксусной кислоте (pH 2,11 ) при 4900 В в течение 2 часов на приборе фирмы "Savant", США.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
РАЗДЕЛ I. Участие свободных PHK-связывающих белков в образовании информосом (маскировании МРНК) в клетках эукариот
Глава 1. Отличие информосом от комплексов, образуемых
РНК-связывающими белками и РНК in vitro.
Характерной особенностью информосом является весовое соотношение образующих их белков к РНК, варьирующее от 3/1 до 4/1. Это соотношение рассчитывается из величины плавучей плотности информосом при центрифугировании в градиенте концентрации CsCI, где они распределяются в достаточно узкой зоне, соответствующей 1,4 г/см3. Тем не менее, подобная характеристика является не достаточной для отличия естественных мРНП-час-тиц (информосом) от искусственных РНП-комплексов, которые могут образовываться в экстрактах эукариотических клеток при добавлении в них экзогенных РНК. При изучении реакции взаимодействия PHK-связывающих белков с экзогенными РНК в экстрактах разных типов эукариотических клеток нами было показано, что эта реакция обратима. Добавление избытка РНК, инкубация в растворе солей высокой концентрации, центрифугирование РНП-частиц без предварительной фиксации формальдегидом в сахарозных градиентах и т.п. могут вызвать диссоциацию белка от РНП частиц. Стабильность РНП-комплексов оказалась достаточно надежным признаком, позволяющим различать естественные мРНП-частицы (информосомы) от РНП-частиц, образованных in vitro. Если реакцию комплексообразования в экстрактах проводить на холоду (0—4°С) при концентрации KCI 10 мМ, то информосомы, присутствовавшие в таких клеточных экстрактах, в отличие от образованнных информосомо-подобных частиц, сохраняют свои плотностные характеристики при добавлении избытка РНК. Подобные различия были обнаружены и при обработке информосом и искусственных РНП-частиц физиологическими концентрациями KCI (150—200 мМ), вне зависимости от природы экзогенной РНК, добавляемой к экстрактам — гомологичные мРНК, бактериальные рРНК или мРНК (табл. 1). Следует иметь ввиду, что естественные мРНП-комплексы (информосомы) формируются in vivo при определенных физиологических температурах, тогда как реакцию взаимо-
действия экзогенных РНК с РНК-связывающими белками экстрактов животных клеток всегда проводили при 0—4"С. Прогревание реакционной смеси до физиологической температуры того организма, чьи РНК-связывающие белки взаимодействуют с экзогенными РНК (18—20°С для ооцитов амфибий, 21,5°С для клеток зародышей вьюна или 37°С для клеток печени крысы), приводит к образованию стабильных РНП-комплексов, не отличимых от информссом по всем известным свойствам и характеристикам. Дальнейшее приближение к условиям образования информосом in vivo, то есть проведение реакции при физиологических температурах и при концентрации KCI 150 мМ, позволяет РНК-связывающим белкам различать типы РНК. Стабильные РНП-частицы образуются в экстрактах только при взаимодействии с собственной экзогенной мРНК, а с чужеродными РНК формируются комплексы, диссоциирующие при добавлении избытка РНК (табл. 1, рис. 1). Выявленные закономерности образования информосомо-подобных частиц реализуются и при взаимодействии экзогенных РНК с РНК-связывающими белками, выделенными аффинной хроматографией клеточных экстрактов на Сефарозе с иммобилизованными полирибонук-леотидами.
ТАБЛИЦА 1
Плавучая плотность в CsCI искусственных РНП-частиц, образованных рРНК бактерий или мРНК вьюна в цитоплазматических экстрактах клеток зародышей вьюна, и естественных РНП-комплексов, информосом
Условия РНК—белок взаимодействия (KCI, тМ)
Тип частиц 10 200 10, избыток РНК 140, избыток РНК 140
инкубация при 4°С инкубация при 20°С
рРНК/белок 1,40 >1,60 >1,60 1,43 >1,60 1,41
мРНК/белок 1,40 1,48 1,48 1,40— —1,48 1,45 1,39
ИНФОРМОСОМ Ы 1,40 1,41 1,43 1,39 1,43 1,41
а о
а.
ЗО-
бО-
40-
20--
Р=1,41 А
р = 1,39 4 в
1
•
Ч I
ч 1
•чТ
4 ч
1 *
"1,5
-1,4
1,3
10 20 номера фракций
т
10 20 номера фракций
Рис. 1 Стабильность искусственных информосомо-подобных частиц, образованных в экстрактах клеток зародышей вьюна при физиологических условиях.
Все операции проводили в буфере с 0,15 М КС1. В безрибосомный экстракт вносили 10 мкг 23Б 4С-рРНК Е.соН (А) и (Б) или 10 мкг 14С-мРНК вьюна (В) и (Г). Смеси инкубировали 15 мин при 21°С, после чего (А) и (В) охлаждали и фиксировали формальдегидом, а к (Б) и (Г) добавляли 1 мг немеченой рРНК и через 30 мин инкубации на холоду фиксировали формальдегидом. Центрифугирование в градиенте плотности СэС1, в роторе ЭУУ-ЗЭ, 36000 об/мин, 27 часов.
1 — радиоактивность. 2 — плотность СбС1.
На наш взгляд, вышеизложенные результаты достаточно убедительно свидетельствуют, во-первых, о способности по крайней мере части РНК-связывающих белков к избирательному взаимодействию с гомологичными мРНК; во-вторых, о возможной инфор-мосомо-образующей (мРНК-маскирующей) функции таких мРНК-связывающих белков в клетках эукариот. Какова степень соответствия этих результатов истинной ситуации в живой клетке? Для ответа на этот вопрос наиболее перспективным представляется метод микроиъекций биологически-активных веществ в ооциты амфибий.
Гпава 2. Образование информосом из РНК-связывающих
белков и мРНК in vivo
Успешное использование ооцитов амфибий для трансляции экзогенных мРНК доказывает значительную резервную трансляционную способность белок-синтезирующего аппарата ооцитов. В то же время, сохранение в нетранслируемой форме большей части матриц, активно синтезируемых на средних стадиях оогенеза, является наиболее изученным и типичным примером маскирования мРНК в клетках эукариот. Одновременное существование фонда маскированных мРНК и способность ооцитов к трансляции инъецированных мРНК свидетельствуют о наличии механизмов, избирательно блокирующих трансляцию запасённых мРНК в ооцитах.
Для прямой экспериментальной проверки предположения о мРНК-маскирующей функции РНК-связывающих белков было применено сочетание следующих методов:
1. Количественное выделение РНК-связывающих белков из безрибосомных экстрактов овулировавших ir> vivo ооцитов R. temporaria методом аффинной хроматографии на поли(11)-Се-фарозе;
2. Радиоактивное мечение РНК-связываюших белков in vitro методом восстановительного метилирования с использованием 3Н-боргидрида натрия. После мечения белки рехроматографирова-ли на поли(и)-Сефарозе, избавляясь тем самым от избытка непро-реагировавшего меченого реагента и, одновременно, от белков, потерявших сродство к РНК в процессе мечения;
3. Инъекция 3Н-меченых РНК-связывающих белков в овулиро-вавшие in vivo ооциты лягушки, которые инкубировали в растворе
Рингера с антибиотиками, периодически отбрасывая повреждённые ооциты. Через 18—20 часов ооциты разрушали центрифугированием и полученные безмитохондриальные экстракты центрифугировали в градиенте концентрации сахарозы или, после предварительной фиксации формальдегидом, в преформированном градиенте плотности CsCI.
Судя по седиментационным и плотностным характеристикам, инъецированные в ооциты 3Н-меченые РНК-связывающие белки, обнаруживаются в составе частиц, соответствующих свободным цитоплазматическим мРНП-частицам, информосомам. Гомогенизация инъецированных ооцитов в присутствии избытка РНК не приводит к диссоциации 3Н-белка из состава РНП-частиц, что также характерно для информосом. Включение 3Н-меченых белков в информосомы оказалось специфичным именно для РНК-связы-вающих белков и наблюдалось только после инкубации инъецированных ооцитов, то есть происходило /л vivo (рис. 2 А) Контрольные эксперименты показали, что после инъекции белков, не обладающих РНК-связыващей активностью, включение 3Н-меченых белков в информосомы отсутствует (рис. 2 Б). Добавление 3Н-ме-ченых РНК-связывающих белков к гомогенатам ооцитов и последующая инкубация смесей при "физиологических" условиях также не приводит к образованию РНП-частиц с плавучей плотностью в CsCI около 1,4 г/см , характерной для информосом, (рис. 2 В). Таким образом, значительная доля (от 10% до 25%) свободных РНК-связывающих белков действительно является белками инфор-мс сом и включается in vivo в состав РНП-частиц, не отличимых по всем известным характеристикам от свободных цитоплазматичес-ких мРНП.
Предварительная обработка ооцитов актиномицином Д практически полностью подавляла включение как 14С-уридина в РНК информосом, так и 3Н-белка в состав этих частиц. По-видимому, инъецированные в ооциты 3Н-меченые РНК-связывающие белки формируют информосомы, взаимодействуя преимущественно (если не исключительно) с новосинтезированной РНК. Во всех опытах отсутствовало сколь-либо существенное включение инъецированных белков в состав РНП других типов, в том числе и в полирибосомо-связанные мРНП, то есть никакой конкуренции предсуществующих инъецированных свободных РНК-связывающих
номера фракций
Рис. 2. Специфичность включения 3Н-меченых РНК-связывающих белков в информосомы ооцитов ¡n vivo.
А — 3Н-меченые РНК-связывающие белки инъецировали в ооциты за 20 часов перед гомогенизацией:
Б — в ооциты инъецировали Н-меченые белки, предварительно очищенные от РНК-связывающих белков хроматографией на поли(1))-сефа-розе;
В —3Н -меченые РНК-связывающие белки добавляли к ооцитам непосредственно перед гомогенизацией.
Безмитохондриальные экстракты фиксировали формальдегидом и центрифугировали в градиенте плотности CsCI при 40000 об/мин, в роторе SW—50.1, в течение 24 ч.
белков с белками мРНП в наших опытах замечено не было. Этот факт представляет особый интерес в связи с "переодеванием" мРНК, сменой её белкового окружения, что абсолютно неизбежно при переходе мРНК из информосом в полирибосомы (активация, демаскирование мРНК). Полирибосомные мРНП содержат на 30—50% меньше белка чем свободные информосомы — нетрансли-руемые мРНП цитоплазмы, и можно предполагать, что белки, высвобождающиеся при демаскировании мРНК попадают в пул свободных РНК-связывающих белков. Согласно нашим данным, все РНК-связывающие белки, находящиеся в клеточном пуле, количественно выделяются аффинной хроматографией на поли(11)-се-фарозе и все белки при восстановительном метилировании становятся 3Н-мечеными. Наиболее вероятное объяснение отсутствия конкуренции инъецированных белков с белками предсуществую-щих мРНП за РНК, входящую в их состав, состоит в следующем. Скорее всего, белки диссоциируют от мРНП ¡n vivo за счёт потери или снижения сродства к РНК вследствие их модификации. Такие белки либо вообще не попадают в пул свободных РНК-связывающих белков, либо не способны конкурировать с белками предсуществующих мРНП за участки связывания на мРНК. Как известно, многие белки мРНП фосфорилируются и в ассоциации с цитоплазматическими мРНП была обнаружена протеинкиназная активность. Фосфорилирование/дефосфорилирование белков может служить механизмом, регулирующим их сродство к РНК.
РАЗДЕЛ II. фосфорилирование РНК-связывающих белков клеток эукариот
Фракция РНК-связывающих белков достаточно гетерогенна по набору полипептидных цепей, входящих в её состав, и до сих пор неясно какие именно из этих полипептидов обладают информосо-мообразующей функцией. Идентифицировано несколько индивидуальных мРНК-связывающих белков, присутствующих как в составе мРНП-частиц, так и в свободном состоянии в цитоплазме, но остаются не выясненными конкретные механизмы замены белкового окружения мРНК. Едва ли не центральную роль в регуляции белкового синтеза отводят реакциям фосфорилирования/дефосфорили-рования компонентов аппарата трансляции клеток эукариот. Представляется важным связать эти реакции с механизмами функциони-
рования информосом, в частности с маскированием/демаскированием мРНК. В отличие от выделения нативных информосом простая и высокоэффективная методика получения РНК-свя-зывающих белков надёжно отработана, что в немалой степени и предопределило исследование реакций фосфорилирования именно в этой белковой фракции.
Гпава 3. Обнаружение, очистка и идентификация РНК-связы-
вающей протеинкиназы.
РНК-связывающие белки получали аффинной хроматографией на поли(11)-сефарозе безрибосомных экстрактов ооцитов R. temporaria. Гомогенизацию ооцитов и все последующие операции проводили в стандартном буфере, содержащем 100 мМ NaCI, что повышало экстрагируемость РНК-связывающих белков, а при дальнейшей их очистке позволяло выделять лишь белки, проявляющие сродство к поли(1)) при физиологической ионной силе. При инкубации этих белков в стандартном буфере с [у—32Р] АТФ максимальное включение радиоактивного фосфата в состав белков наблюдалось при 18—22°С, т. е. при температуре, оптимальной для завершения оогенеза. Как повышение, так и понижение температуры приводило к снижению уровня фосфорилирования РНК-связывающих белков. Одновалентные катионы (К , Na ) в концентрациях, превышающих физиологические, подавляли реакцию, тогда как ни сАМР (до 5 мкм), ни Са (до 50 мМ) практически не влияли на эндогенное фосфорилирование РНК-связывающих белков. Значения рН От 7 до 9 ед. являются оптимальными для этой реакции. На определение параметров реакции фосфорилирования и последующую идентификацию фосфорилируемых эндогенной протеинкиназой белков могут существенно влиять активные протеазы и фосфатазы. Контрольные эксперименты с высокомечеными [1251] препаратами коллагена для выявления протеазной активности и [32Р] казеином для тестирования эндогенных фосфатаз показали, что эти ферменты либо неактивны в выбранных нами условиях, либо вообще не входят в состав РНК-связывающих белков.
Как уже отмечалось выше, активность РНК-связывающей кина-зы не зависит от таких вторичных мессенджеров как сАМР и ионы Са. Далее мы показали, что этот фермент неактивен в отношении гистонов, но эффективно фосфорилирует казеин в качестве экзоген-
ног о субстрата. Было также показано, что РНК-связывающая протеинкиназа может использовать в качестве донора фосфата АТФ и, с несколько меньшей эффективностью, ГТФ. Добавление гепарина даже в низких концентрациях (менее 1 мкг/мл) практически полностью ингибировало как фосфорилирование эндогенных белковых субстратов, так и протеинкиназную активность РНК-связывающих белков в отношении казеина. Анализ продуктов солянокислого гидролиза белков, фосфорилированных изучаемой протеинкина-зой, методом высоковольтного фореза на бумаге с последующей авторадиографией фореграмм показал включение радиоактивного фосфата в фосфосериновые и, в меньшей степени, в фосфотреони-новые остатки.
По всем приведённым выше характеристикам РНК-связывающая протеинкиназа может быть отнесена к казеиновым кина-зам типа II (СК 2). Для окончательной идентификации фермент очистили до гомогенного состояния и определили его полипептидный состав. Сродство протеинкиназы к РНК позволило применить для очистки фермента аффинную хроматографию на поли(11)-се-фарозе и существенно сократить процедуру выделения СК 2, обычно состоящую из 5—7 стадий. По сравнению с основной массой РНК-связывающих белков, протеинкиназа обладает значительно большим сродством к поли(и)-сефарозе и элюируется с колонки только при 300—350 мМ NaCI. В результате последующих хроматографии на ДЕАЕ- и фосфо-целлюлозах были получены препараты фермента, очищенного не менее чем в 10 ООО раз относительно белков безрибосомного экстракта ооцитов R. temporaria (Табл. 2). Р состав РНК-связывающей протеинкиназы входят три полипептидные цепи с молекулярными массами около 43, 41 и 29 kDa; при инкубации гомогенных препаратов фермента с [у—32Р] АТФ малая субъединица фосфорилируется (рис. 3 А, В). Это позволяет утверждать, что обнаруженная в составе РНК-связывающих белков протеинкиназа является казеиновой киназой типа II (СК 2), одной из наиболее изученных протеинкиназ эукариотических клеток.
Консервативность структуры СК 2 и широкая распространенность в таксономически разных группах может свидетельствовать о важной роли этого фермента в эукариотических клетках. Неудивительно, что СК 2, выделенные из разных источников, имеют одина-
Рис. 3. Электрофорез СК 2. А — 0,7 мкг СК 2 окраска кумасси Р1 250 В — 1,2 мкг СК 2 инкубировали с 0,1 мМ [У-32Р] АТФ (1000 имп/мин на 1 пМ) 1 час при 22 С в объеме 50 мкл, 15 мкл инкубационной смеси наносили на гель С — 1251 меченая СК 2 (50000 имп/мин). Р — 1251 меченая СК 2 (40000 имп/мин) инкубировали с 0,1 мМ [у- Р] АТФ (1000 имп/мин на 1пМ) и 30 мкг дефосфорили-рованного казеина в течение 1 часа при 22°С в объеме 50 мкл, 15 мкл инкубационной смеси наносили на гель.
В, С и й — радиоавтографы высушенных гелей. Экспозиция с высушенной пленкой 24 часа. Отмечены положения реперов: фосфорилаза Ь (94 кДа), сывороточного альбумина быка (67 кДа), овальбумина (43 кДа), карбоангидразы (30 кДа), ингибитор трипсина (20,1 кДа).
ТАБЛИЦА 2
Очистка РНК-связывающей протеинкиназы из ооцитов Яапа Iетрогапа
Содержа- Активность Удельная
Стадии очистки ние белка, фермента*, лмоль 32Р активность, пмоль 32Р на 1 мкг Выход,
мг Уо
РНК-связывающив
белки — — 0,3+0,9 100
поли-(и)-сефароза 4,9 3,6-10® 0,64 57
ДЭАЭ-целлюлоза 0,045 1,16-10® 26,3 21
Фосфоцеллюлоза 0,003 0,63-Ю3 210,5 11,4
* — за активность фермента принимали количество радиоактивного фосфата (пмоли), включенного за 1 час инкубации с 0,1 мМ [у- Р] АТФ в 1 мкг д^фосфо-рилированного казеина в стандартной протеинкиназной системе объемом 100 мкл при 20°С.
94000 —у" ■
Г; * ,; й
87000—
43000—р
30000 — * !
20100-,.. : .....
А В С О
ТАБЛИЦА 3
Структура и свойства казеиновых киназ типа 2, выделенных из различных объектов
Характеристика СК 2 Клетки и ткани позвоночных (ооциты fí.tempolrariai печень быка, мозг крысы, мозг человека) Клетки гриба Verticillium dahliae
субъединичный состав, кДа - 42, ~ 38, ~ 27 53, 41, 38
самофосфорилирующиеся субъединицы ~ 27 53, 41, 38
модифицируемые остатки Ser, Thr Ser, Thr
используемые нуклеотиды АТФ, ГТФ АТФ, ГТФ
ингибирование гепарином или поли(11) + +
ингибирование Мд21" - +
стимуляция спермином + +
ковые характеристики (Табл. 3) и для них применима разработанная нами универсальная трехстадийная схема очистки. В дальнейшем, для получения высокоочищенных препаратов СК 2 из различных клеток и тканей эукариот безрибосомные экстракты хроматогра-фировали на колонках с Гепарин-Сефарозой. Известно, что Гепарин-Сефарозу довольно часто используют вместо поли(11)-или РНК-Сефарозы при выделении белков, обладающих неспецифической РНК-связывающей активностью. После элюции активную фракцию разбавляли буфером до 0,1 М ЫаС1 и наносили на колонку с фосфоцеллюлозой. Фракции, содержащие СК 2, после хроматографии на фосфоцеллюлозе очищали до гомогенного состояния на колонке топо-0 системы РР1_С.
Дополнительная к ферментативной РНК-связывающая активность СК 2 и наличие эндогенных белковых субстратов фосфорипиро-
вания во фракции РНК-связывающих белков позволяют предположить участие СК 2 в РНК-зависимых процессах, в том числе и в процессах маскирования/демаскирования мРНК в клетках эукари-от. Если одной из функций свободных РНК-связывающих белков действительно является образование информосом, то влияние фосфорилирования на степень сродства этих белков к РНК нуждается в дополнительных доказательствах.
Гпава 4. фоефорилирование РНК-связывающих белков эндогенной протеинкиназой.
Если фоефорилирование РНК-связывающих белков действительно влияет на их сродство к РНК, то подобные изменения должны зависеть от времени прединкубации РНК-связывающих белков с АТФ и от концентрации АТФ в реакционной смеси. Действительно, такие условия (наличие АТФ в реакционной смеси и прединкубация белков с АТФ) существенно понижают РНК-связывающую активность изучаемых белков in vitro. В данном случае РНК-связывающую активность определяли методом сорбции на мембранных нитроцеллюлозных фильтрах РНП-частиц, образующихся при добавлении к исследуемым фракциям радиоактивно-меченой РНК. Зависимость снижения РНК-связывающей активности полностью совпадает с нарастанием степени удельного фосфорилирования изучаемых белков, что позволяет говорить о прямом влиянии фосфорилирования РНК-связывающих белков на их сродство к РНК. Относительное снижение РНК-связывающей активности наиболее отчётливо фиксировалось в тех пробах, где содержался некоторый избыток РНК-связывающих белков над экзогенной РНК. Разумеется, при слишком большом избытке белка вся добавляемая РНК задерживалась на фильтрах и различия нивелировались. Но тот факт, что избыток белка способствует проявлению обнаруженного эффекта, хорошо согласуется с представлениями о наличии в эукариотических клетках наряду с информосомами ещё и свободных мРНК-связывающих (информосомообразующих) белков.
Результаты, приведённые в табл. 4, получены в условиях, являющихся оптимальными для максимального фосфорилирования РНК-связывающих белков in vitro: белки инкубировали без АТФ или в присутствии 500 мМ АТФ при 20°С в течение 2 часов, после чего к пробам добавляли избыток холодного буферного раствора,
ТАБЛИЦА 4
Уменьшение РНК-связывающей активности в результате инкубации РНК-связывающих белков с АТФ
Условия опре- +АТФ*, -АТФ*, Падение Критерий Надеж-
деления имп/мин имп/мин РНК-свя- достовер- ность
РНК-связы- зывающей ности раз-
вающей актив- активности, ницы
ности % Стьюдента
0,01 М KCl 27736 29692 8 3,21 0,99
0,15 М KCl 10500 1261 17 5,24 0,999
* — Среднее значение 5-ти опытов с учетом фона сорбции 14С-рРНК на фильтрах, составлявшего 1 % от добавленной РНК в случае фильтрования в буфере с 0,01 М KCl и 2% — с 0,15 М KCl.
содержащего или не содержащего 150 мМ KCl, а затем C-16S рРНК Е. coli для определения РНК-связывающей активности. Видно, что прединкубация с АТФ достоверно и с высшей степенью надёжности (0,999) действительно снижает сродство изучаемых белков к РНК. Относительно небольшое падение РНК-связывающей активности (8—17%), по-видимому объясняется тем, что далеко не все полипептидные цепи, входящие в состав РНК-связывающих белков, могут служить субстратами эндогенной CK 2 протеинкиназы. Методом авторадиографии удаётся выявить не более 10 полипептидов, фосфорилируемых in vitro эндогенной протеинкиназой в составе РНК-связывающих белков. Наиболее интенсивно радиоактивный фосфат включается в полипептидные цепи с молекулярными массами около 76, 74, 54, 33, 30, 26 и 17 кДа. Существенно важно, что эффект снижения РНК-связывающей активности проявляется гораздо отчётливее в условиях физиологической ионной силы (150 мМ KCl). На наш взгляд, эти данные достаточно убедительно свидетельствуют в пользу того, что фосфорилирова-ние мРНК-связывающих белков может служить конкретным механизмом замены белкового окружения мРНК при переходе её из ядра в цитоплазму и далее в полирибосомы.
Различные эффекторы или изменения внутриклеточных условий могут модулировать РНК-связывающую активность белков, индуцируя таким образом изменения в их компартментализации. Действительно, потеря РНК-связывающей активности 5'-1ЛР-свя-зывающего репрессора трансляции мРНК орнитиндекарбоксилазы скорее всего является следствием перемены окислительных условий в клетке (Manzella and Blackshear, 1992., J. Biol. Chem., Vol. 267, pp. 7077—7082). В случае глицеральдегид-3-фосфатдегидро-геназы диссоциацию фермента от мРНК и полирибосом индуцировал NADH (Ryazanov et al.,1988.,Eur. J. Biochem., Vol. 171, pp. 301—305). Потеря сродства к РНК может быть результатом его модификации, например, АДФ-рибозилирования в случае фактора eEF-2 (Sitlkov et al., 1984., FEBS Lett., Vol. 176, pp. 406-410). Наиболее типичным примером посттрансляционных модификаций компонентов белок-синтезирующего аппарата клеток эукариот является фосфорилирование факторов инициации и элонгации, аминоацил-тРНК-синтетаз, рибосомных белков и белков мРНП (см. обзоры Ochoa et al., 1981, In: Current topics in cellular regulation, Vol. 18, New York, Academic Press, pp. 421—435; Traugh and Pendergast, 1986, Progr. Nucl. Acid Res. Mol. Biol., Vol. 33, pp. 195—230; Hershey, 1991, Annu. Rev. Biochem., Vol. 60, pp. 717—755).
Возможны, по крайней мере, два механизма модуляции РНК-связывающей активности белков при участии протеинкиназы. Согласно первому, предполагается более высокое сродство нефос-форилированного белка к РНК, по сравнению с фосфорилирован-ным. В этом случае белок, реагирующий с РНК, должен служить субстратом протеинкиназы, и такие белковые субстраты СК 2 действительно обнаружены в составе РНК-связывающих белков всех изученных нами эукариотических клеток. Другой механизм предусматривает возможность фосфорилирования/дефосфори-лирования не самого РНК-связывающего белка, а взаимодействующего с ним белкового кофактора. Предполагается, что фосфорилиро-ванная форма такого кофактора образует комплекс с РНК-связ-ывающими белками и понижает их сродство к РНК. В данном случае именно кофактор, возможно и не обладающий РНК-связывающей активностью, должен служить белковым субстратом для СК 2. Второй механизм представляется более вероятным из-за нижеследующих экспериментально обоснованных фактов. Во-первых, характер распределения РНК-связывающих белков при фракцио-
нировании клеточных экстрактов хроматографическими методами и методами ультрацентрифугирования указывает на склонность данных белков к образованию надмолекулярных комплексов. Кроме того, строгая стехиометрия взаимодействия РНК с любым весовым избытком РНК-связывающих белков (весовое соотношение белка к РНК в мРНП-частицах никогда не превышает соотношения 4:1) заставляет предполагать важность белок-белковых взаимодействий для существования и функционирования природных мРНП-частиц.
Обнаружение протеинкиназы и её белковых субстратов в составе мРНП-частиц (см. например Bag and Sells, 1979, J. Biol. Chem., Vol. 254, pp. 3137—3140; Thoen et al., 1986, Biochem. Biophys. Res. Commun., Vol. 135, pp. 347—354; Cummings and Sommerviile, 1988, J. Cell Biol., Vol. 107, pp. 45—56), как и во фракции свободных РНК-связывающих белков (см. выше), очевидно, также свидетельствует о важности белок-белковых взаимодействий, реализующихся в данном случае как фермент-субстратные взаимоотношения, в функционировании мРНП-частиц. Очевидно, не малую роль при этом должна играть "врождённая" способность большинства белков мРНП-частиц к взаимодействию с РНК.
Гпава 5. Особенности взаимодействия СК 2 с РНК.
Согласно литературным данным, фосфорилирование белков, обладающих сродством к нуклеиновым кислотам, во многих случаях может приводить и к повышению их сродства к РНК/ДНК (Isenberg, 1979, Annu. Rev. Biochem., Vol. 48, pp. 159—192; Langan, 1982, J. Biol. Chem., Vol. 257, pp.14835—14846; Sommerviile, 1990, J. Reprod. Fert., Vol. 42, pp. 225—233). Безусловно, наиболее привлекательным из обнаруженных нами свойств РНК-связывающей (СК 2) протеинкиназы является способность этого фермента фос-форилировать РНК-связывающие белки так, что в результате подобной модификации сродство белков к РНК заметно снижается. Но не менее важной является, по-видимому, ещё одна из первоначально выявленных нами in vitro характеристик РНК-связывающей протеинкиназы. Оказалось, что полирибонуклеотиды в достаточно низких концентрациях (для поли(и)-менее 10 мкг/мл) способны ингибировать активность фермента при фосфорилировании как эндогенных субстратов — РНК-связывающих белков, так и казеина (рис. 4).
Рис. 4. Ингибирование ферментативной активности СК 2 по-ли(11) при рН 6,5 (1) и 7,5 (2).
0,1 мкг фермента иню/бирова-ли 1 час с 0,1 мМ [у- Р] АТФ (100 имп/мин на 1 пмоль), 30 мкг дефосфорилированного казеина и различные количества поли(и) в общем объёме 50 мкл.
со О ,
^20-X
S i
с 2 ¿10- \2 ■ \
CL
со ■ \
I I
200 400 600
[поли(и)], мкг/мл
о
Способность поли(11) ингибировать ферментативную активность СК 2 проявляется наиболее чётко при физиологических условиях, являющихся оптимальными для протеинкиназной реакции, катализируемой СК 2 из ооцитов амфибий (см. главу 3), но существенно зависит от величины рН. При значении рИ 6,5 в стандартной системе определения активности СК 2 требуются в 8—10 раз большие концентрации поли(и), по сравнению с рН 7,5—7,8, для воспроизводимого ингибирования включения радиоактивного фосфата в казеин (рис. 4). Кажется очевидным, что ярко выраженное сродство СК 2 к РНК предопределяет возможность влияния полирибонуклеотидов на ферментативную активность СК 2.
Между тем, оставались не определёнными как субъединицы СК 2, ответственные за связывание с РНК, так и количественные параметры этого взаимодействия. Поскольку до сих пор неизвестно, с какими именно типами РНК (мРНК) взаимодействует СК 2 /л vivo, для дальнейших исследований мы выбрали наиболее доступные и удобные в работе 16S и 23S рРНК £ coli. При помощи методов лиганд-блоттинга мы показали, что радиоактивно-меченая бактериальная рРНК взаимодействует исключительно с а/а'-субъ-единицами СК 2. Именно на этих субъединицах расположены также НТФ-связывающий центр фермента и участок связывания белковых субстратов. Анализ первичной структуры СК 2 позволяет предположить наличие в районах каталитических центров СК 2 а-спи-ральных участков, где положительно-заряженные аминокислоты собраны в кластеры и экспонированы наружу (см. ниже). Скорее всего, именно взаимодействием с этими положительно-заряженны-
э
Рис. 5. Зависимость протеинки-назной (2) и РНК-связываю-
Н
32Р щей (1) активности СК 2 из
40
40 v '
mQ fí. temporaria при различных рН.
со
Измерение протеинкиназ-
30 | ной активности проводилось
по стандартной методике. Для
20 | определения РНК-связываю-
^ щей активности 0,25 мкг СК 2 и 0,6 мкг 16Э [14С] рРНК инкубировали 10 мин в 1 мл буфера с различным рН при комнат-
10
о
6
6.5
7
7.5
рн
0 ной температуре, после чего раствор фильтровали через нитроцеллюлозные фильтры.
ми кластерами аминокислот и объясняется достаточно высокое сродство СК 2 к РНК. С той степенью приближения, какую предусматривает возможность использования чужеродной рРНК вместо эндогенной мРНК, мы определили константы связывания изучаемого фермента с РНК при разных условиях. Выяснилось, что относительно небольшие изменения рН очень сильно влияют на РНК-связывающую активность фермента, не оказывая при этом существенного влияния на его протеинкиназную активность (рис. 5). Учитывая зависимость связывания СК 2 с 16Б рРНК от рН, а также то, что время установления равновесия не превышает 5 мин. при температуре 20°С, определение константы связывания и стехиометрии взаимодействия СК 2/РНК проводили при рН 6,5 за 10 мин. Значение константы оказалось довольно высоким (1.5-Ю10 М), при этом одна молекула 16Б рРНК может связать 20—30 молекул белка. Отдельные стадии реакции и сколь-либо заметная кооперативность в связывании СК 2 с РНК не зарегистрированы. Как уже отмечалось выше, ингибирующий эффект поли(и) ослабевает приблизительно на порядок при снижении рН с 7,8 до 6,5 (см. рис. 4). Противоположным образом изменялась РНК-свя-зывающая активность СК 2, определяемая методом сорбции на мембранных фильтрах РНП-частиц, образующихся при добавлении к ферменту радиоактивно-меченой 16Б рРНК £ соП. Именно при рН 6,5 фермент проявлял максимальное сродство к РНК, тогда как увеличение рН до 7,5 приводило к падению величины константы
с
связывания СК 2 с РНК на два-три порядка. Из сопоставления данных по ингибированию ферментативной активности СК 2 полири-бонуклеотидами и изменению сродства СК 2 к РНК при различных рН следует, что молекула СК 2 должна обладать несколькими участками связывания РНК.
Подавляющее большинство казеиновых киназ типа 2, полученных в гомогенном состоянии из различных клеток и тканей эукари-от, являются олигомерами с молекулярной массой 130—150 «Да и четырёхсубъединичной структурой <х2р2 или аа'Р2 , где а(а') имеют молекулярную массу 36—44 кДа и р — 24—29 кДа. Каталитический центр СК 2 полностью локализован на а(я')-субъединицах, причем отсутствие р-субъединицы не влияет существенным образом на активность фермента в отношении казеина. Консервативной чертой а(а')-сУбъединиц СК 2 является последовательность шести основных аминокислотных остатков из семи, расположенных в позициях 72—78 после Lys-66, инвариантного для большинства протеинкиназ, имеющих не более трех основных остатков в этих позициях. Lys-66 участвует в связывании нуклеозидтрифосфа-та у всех изученных протеинкиназ, но лишь у СК 2 найден основной кластер, формирующий, по-видимому, а-спираль, положительно заряженную и выступающую наружу.
His158 у СК 2 участвует в узнавании пептидного субстрата и является консервативным (очень редко замещенным на Asp) почти у всех известных Ser/Thr протеинкиназ. Однако, у а-субъединицы СК 2 найдено еще 5 основных^аминокислот, расположенных на одинаковом расстоянии друг-от- друга: Lys 140, His( 146,152, 158, 164), Arg170. Возможно, эта характерная последовательность, как и положительно-заряженная а-спираль в позициях 72 — 76 (см. выше), необходимы для узнавания кислотных кластеров в белковых субстратах СК 2.
Ингибирование полианионами осуществляется, по-видимому, за счёт их конкурентного взаимодействия как с основной «-спиралью активного центра СК2 (Lys140, His146, 152, 158, 164, Arg170), участвующей в связывании кислого белкового субстрата, так и с кластером поли^уэ) в позициях 74—77. Прямыми экспериментами было показано,что замена Lys74 и Lys75 на Glu74 и Glu75 в 70 раз понижает способность гепарина ингибировать СК 2 из Caenorhabditis elegans (Ни and Rubin, 1990, J. Biol. Chem., Vol. 265,
рр. 20609—20615). Очевидно, гепарин до некоторой степени может действовать как аплостерический ингибитор, взаимодействуя не с активным центром, а с а-спиралью вблизи связывания НТФ. Вместе с тем, являясь конкурентным ингибитором по отношению к казеину, он может не оказывать влияния на активность фермента с другими белковыми субстратами. Природа этого явления скорее всего объясняется большим сродством этих субстратов к СК 2 по сравнению с гепарином, чем стерическими эффектами, благодаря которым конкуренция за связывание основной а-спирали активного центра может просто отсутствовать. Можно предположить, что соединяясь с поли(1_уз) в позициях 74—77, гепарин стерически воздействует на Ьувбб, участвующий в переносе фосфата.
В зависимости от константы связывания и конформации ингибиторов, сила их взаимодействия с элементами структуры СК 2 будет различной. Так, гепарин в наномолярных количествах ингиби-рует пикомолярные концентрации фермента, при миллимолярных концентрациях субстрата (казеина). Гепарин считается наиболее специфическим ингибитором СК 2, хотя при концентрациях на три порядка больших, он начинает ингибировать и другие протеинкина-зы, в частности СК 1.
Физиологическая роль ингибиторов может быть ограничена видом ткани, в которой они наиболее распространены. Так, например, гепарин скорее всего действует в печени, полифосфат — в дрожжах, а 2,3-дифосфоглицерат — в эритроцитах. Следует отметить, что по-видимому, общим ингибитором СК 2 во всех тканях могут служить нуклеиновые кислоты, в частности тРНК или мРНК, но не рРНК.
Одно из характерных свойств СК 2 — сродство к нуклеиновым кислотам, обусловленное как наличием основных а-спиралей в структуре а-субъединиц, так и основной природы С-конца р-субъединицы. Причем, если связывание полинуклеотидов с экспонированной наружу а-спирапью должно приводить к ингиби-рованию СК 2, то связывание с р-субъединицей играет скорее регуляторную роль и зависит от доступности р-субъединицы при различных внешних условиях. Исходя из этого, сформулирована гипотеза об обратимом ингибировании СК 2 при связывании с мРНК и некоторыми другими полирибонуклеотидами.
РАЗДЕЛ 111. Участие СК 2 в процессах маскирования/демаскирования мРНК в ооцитах Rana temporaria
В наших исследованиях выявлены такие неординарные характеристики СК 2, как:
(1) — высокое сродство фермента к полирибонуклеотидам;
(2) — способность в результате такого взаимодействия, по крайней мере некоторых полирибонуклеотидов, ингибировать ферментативную активность СК 2;
(3) — способность СК 2 фосфорилировать некоторые РНК-свя-зывающие белки таким образом, что в результате подобной модификации эти белки теряют/снижают сродство к РНК. Эти данные позволяют предполагать непосредственное участие казеиновых киназ типа II (СК 2) в РНК-зависимых процессах, в частности, маскировании/демаскировании мРНК в клетках эукариот. Для проверки этого предположения мы вновь обратились к методу микроинъекций функционально активных белков в ооциты амфибий (см. главу 2).
Глава 6. Инъекция СК 2 в-ооциты, включение -фермента в состав информосом ооцитов амфибий
Фермент очищаяп до-гомогенного состояния из овулировавших in vivo ооцитов R. temporaria й метили радиоактивным иодом по стандартной методике с использованием хлорамина Т до удельной радиоактивности 105—106 имп/мин на 1 мкг белка. Немедленно после мечения препарат СК 2 рехроматографировали на гепарин-или поли(и)-Сефарозе для удаления избытка непрореагировавше-го меченого реагента и белков, потерявших сродство к РНК в процессе мечения. Последующая радиоавтография меченных иодом препаратов СК 2 подтвердила гомогенность и сохранение протеинкиназной активности меченной in vitro СК 2 (см. рис. 3 С, D). После инъекции в завершившие рост ооциты R. 'temporaria судьбу 1251-меченого фермента выясняли с помощью гисторадиоавтог-рафии и биохимических методов. Оказалось, что за 24 ч. инкубации весь инъецированный фермент сосредоточивается исключительно в цитоплазме и не проникает в ядро ооцита. В цитоплазме меченная радиоактивным иодом СК 2 распределяется не равно-
Рис. 6. Сагиттальный срез ооцита ЯЛетрогапа после инъекции меченной 1251 СК 2 и инкубация в течение 24 ч.
А — общий вид. Распределение меченого фермента между ядром и цитоплазмой.
Б — фрагмент ооцитов при большем увеличении.
мерно, но в виде диффузного концентрического кольца (рис. 6). Прилегающая к поверхности ооцита зона практически не содержит метки, за ней располагается зона с высоким содержанием меченой СК 2, тогда как в центральной части ооцита радиоактивность невелика. Из-за ограниченности возможностей гисторадиоавтогра-фии в идентификации клеточных структур, с которыми может быть ассоциирована СК 2, причины такого внутриклеточного распределения СК 2 пока остаются невыясненными. При фракционировании гомогенатов; полученных через 18—20 ч. после инъекции радиоактивного фермента в овулировавшие /л vivo ооциты, основная часть метки (от 2/3 до 3/4) остаётся в осадке при низкоскоростном центрифугировании. По-видимому, зтот результат может быть следствием ассоциации СК 2 с элементами ц>г "»скелета или эндоппазматичес-кого ретикулума.
Центрифугирование в градиенте концентрации сахарозы безмито-хондриального экстракта ооцитов, инъецированных 1251-меченым ферментом за 18—20 ч. до гомогенизации, выявляет отчётливый пик радиоактивности в зоне 50—70 S, характерной для седиментации информосом ооцитов R. temporaria (рис. 7 А). Основная часть материала, включившего радиоактивно-меченый фермент, при центрифугировании в градиенте плотности CsCI имеет плавучую плотность около 1,40 г/см , также характерную для информосом (рис. 7 В). Согласно данным нескольких опытов в состав этих мРНП-частиц включается от 20 до 30% радиоактивного материала, содержащегося в безмитохондриальном экстракте. Ни в одном из опытов не было замечено включения инъецированной в ооциты СК 2 в состав рибосом или полирибосом; добавление 1251-меченой СК 2 к ооцитам во время их гомогенизации также не приводило к появлению метки в зоне РНП-частиц (рис. 7 Б). В совокупности эти данные, на наш взгляд, достаточны для заключения об избирательной локализации СК 2 в составе свободных цитоплазматичес-ких информосом, но не в составе полирибосомо-связанных (транслируемых) мРНП-частиц. Выявленная способность СК 2 к образованию комплексов с мРНК in vivo может служить одновременно и способом регуляции активности фермента, поддержания его в репрессированном состоянии на определённых этапах клеточного цикла в эукариотических системах. Исследования, проводимые параллельно с изложенными выше опытами, подтверждают правомерность таких рассуждений. Полученные нами данные позволяют утверждать, что в составе информосом СК 2 практически полностью ингибирована. Только находящийся в свободной, не связанной с мРНП, форме фермент способен фосфорилировать казеин, как i- эндогенные белковые субстраты.
Принципиальная возможность участия СК 2 в функционировании информосом следует уже из результатов, приведённых в предыдущих главах. Более того, в литературе есть сообщения об обнаружении СК 2 среди белков свободных цитоплазматических информосом, выделенных из ретикулоцитов кролика (Rittschof and Traugh, 1982, Eur. J. Biochem., V. 123, pp. 333—336) и криптобиотических гаструл Artemia salina (Thoen et al., 1984, Biochim. Biophys. Acta, V. 783, pp. 105—113). Однако подход, применённый авторами этих работ для поиска активности СК 2 в препаратах мРНП, чреват неиз-
600--
400- ■
200--
т
10 20 номера фракций
-3 125
40т Ю • I имп/мин
номера фракций
X £ 5 с £
150-
_-100-
50 -
1-Г
0 10 20 номера фракций
125
Рис. 7. Включение l-меченой СК 2 в информосомы ооцитов in vivo.
Седиментационное распределение в градиенте концентрации (15—30%) сахарозы меченого фермента.
(A) — после инъекции в ооциты и инкубации в течение 18 ч.
(Б) — при добавлении к ооцитам перед гомогенизацией. Центрифугирование в течение 3 ч при 39000 об/мин в роторе SW—50.
(B) — плотностное распределение в градиенте CsCI частиц, включив-
ших в свой состав меченый фермент. Центрифугирование при 40000 об/мин в роторе SW—50 в течение 24 ч.
бежными артефактами, связанными с практически до сих пор непреодолимыми методическими трудностями при получении препаратов "чистых информосом", что досконально рассмотрено в обзоре А.С.Ворониной (Молекуляр. биология, 1979, т.13, стр. 5—15). Результаты, изложенные в этой главе, предоставляют более прямые доказательства возможной информосомообразующей функции СК 2 in vivo.
Биологический смысл участия СК 2 в формировании информосом не вполне понятен, поскольку мРНК наряду с другими полианионами, ингибируют ферментативную активность СК 2 (см. главу 5). Тем не менее, наличие в белковом составе информосом этого фермента предоставляет дополнительные способы регуляции процессов маскирования/демаскирования мРНК в клетках эукариот. При определённых изменениях внутриклеточных условий возможно обращение реакции комплексообразования СК 2 с мРНК/мРНП в сторону диссоциации фермента из состава мРНП-комплексов. Таким образом СК 2 освобождается от ингибирующего действия мРНК, активируется и начинает фосфорилировать белки информосом, вследствие чего мРНК демаскируется и поступает в белоксинте-зирующий аппарат. Для оценки возможности реализации такой последовательности событий /л vivo мы изучали изменение активности СК 2 при мейотическом созревании ооцитов R. temporaria.
Гпава 7. Изменения активности СК 2 в процессах прогесте-рон-стимулируемого мейотического созревания ооцитов Rana temporaria.
Процесс оогенеза амфибий можно разбить на две стадии: стадию роста ооцитов и стадию их созревания. Завершившие рост ооциты под действием прогестерона претерпевают ряд физиологических и морфологических изменений, обозначаемых термином "созревание". При этом в ооците происходит мейоз и ооцит превращается в зрелую яйцеклетку, способную к оплодотворению и дальнейшему развитию.
Основная масса мРНК в ооцитах синтезируется на средних стадиях оогенеза и большая часть мРНК маскируется, запасается в форме трансляционно неактивных мРНП. Часть маскированной мРНК используется на заключительных стадиях оогенеза при мейотическом созревании ооцитов, сопровождающимся возрастанием
интенсивности биосинтеза белков в 2—4 раза. Начиная от момента гормональной стимуляции, в течение приблизительно 2/3 от общего времени, необходимого для завершения созревания, этот процесс абсолютно зависит от новообразования белков, но не от транскрипционной активности ядра ооцита (Masui and Clarke, 1979, Internatl. Rev. Cytol., Vol.57, pp. 185—282). Возрастание интенсивности биосинтеза белков в созревающих ооцитах можно объяснить только вовлечением в аппарат трансляции ранее запасённых мРНК —демаскированием мРНК. Ключевая роль трансляционного контроля в регуляции процессов созревания ооцитов предопределила исследования биохимических изменений именно во фракции белков, связанных с функционированием мРНК. Если фосфорилирова-ние РНК-связывающих белков действительно связано с демаскированием мРНК, то при созревании ооцитов можно ожидать изменения активности РНК-связывающей протеинкиназы, СК 2.
Биосинтез РНК-связывающих белков возрастает через 7 ч после стимуляции ооцитов прогестероном, затем заметно снижается и вновь возрастает на заключительных стадиях созревания ооцитов. Точно также изменяется и ферментативная активность СК 2, определяемая по включению радиоактивного фосфата как в эндогенные субстраты — РНК-связывающие белки, так и в казеин. Через 7 ч после стимуляции ооцитов прогестероном активность СК 2 во фракции свободных РНК-связывающих белков возрастала в 10 раз по сравнению с завершившими рост, но не стимулированными прогестероном ооцитами, затем снижалась до исходного уровня. Повторное возрастание активности СК 2 (в 2—4 раза) наблюдается на стадиях, завершающих мейотическое созревание ооцитов (рис. 8). Можно предположить, что наблюдаемые изменения активности СК 2 связаны с биосинтезом РНК-связывающих белков, в частности, самого фермента и/или его эндогенных субстратов.
Добавление в среду циклогексимида на 90—95% подавляет трансляцию, в том числе и биосинтез РНК-связывающих белков в ооцитах. Однако, несмотря на ингибирование трансляции, всплеск активности СК 2 вновь наблюдается через 7 ч после стимуляции ооцитов прогестероном (рис. 8). Падение активности фермента также не зависит от биосинтеза белков: добавление циклогексимида в момент максимального подъема активности СК 2 (7 ч) не препятствует этому спаду. Эти результаты исключают
Рис. 8. Изменение уровня биосинтеза белков и активности СК 2 при созревании ооцитов R. temporaria.
1 — биосинтез белка определяли по включению радиоактивно меченых аминокислот в ТХУ осаждаемый материал фракции РНК-связывающих белков.
2 — протеинкиназную активность СК 2 определяли в стандартной системе по включению 2Р в казеин.
3 — в отдельных опытах, кроме прогестерона, в среду вносили 40—50 мкг/мл цикпогексимида согласно приведенной ниже схеме:
а) к ооцитам добавляли прогестерон (момент времени 0);
б) одновременно с прогестероном к части ооцитов добавляли циклогексимид и инкубировали 7 ч.;
в) через 7 ч. к другой части ооцитов добавляли циклогр^симид. Общая продолжительность инкубации составляла 2.3 й
г) через 12 и 16 часов проводили аналогичные процедур
объяснение активации СК 2 за счет новообразования фермента или его субстратов. Таким образом, как активация СК 2, так и ее последующее ингибирование на ранних стадиях созревания ооцитов R.temporaria являются следствием изменения активности пред-существующего фермента, т.е. происходят на посттрансляционном уровне. Повышение активности СК 2 на поздних стадиях созревания, в период разрушения ЗП, блокируется циклогексимидом и может быть объяснено биосинтезом фермента de novo на этих стадиях.
Активация СК 2 в ооцитах, стимулированных прогестероном, коррелирует с возрастанием уровня биосинтеза белков в созревающих ооцитах лягушки. Аналогичные результаты были получены нами ранее при изучении созревания ооцитов севрюги, однако эффект, наблюдаемый на ооцитах R. temporaria, выражен значительно ярче: активность СК 2 возрастает в 10 раз. Эти данные с несомненностью свидетельствуют в пользу предположения об участии СК 2 в процессах демаскирования мРНК. Всплеск фосфори-лирования РНК-связывающих белков можно рассматривать как промежуточный этап в последовательности реакций, начинающихся рецепцией прогестерона мембраной ооцита и приводящих к активации мРНК, запасённых в форме информосом.
Известно, что прогестерон, индуцируя мейотическое созревание, вызывает ряд биохимических изменений в завершивших рост ооцитах Xenopus laevis, в частности, возрастание внутриклеточного рН от 7,3 до 7,7 (Wasserman et al., 1986, Gametogenesis and the Early Embrio. N. Y.: Alan and R. Liss & C, pp. 111—130; Rezai and Wasserman, 1994, Biochem.Biophys.Res.Comm., Vol. 205, pp 979—983). Согласно изложенным выше данным (глава 5), изменения рН в диапазоне 6,5—7,8 in vitro влияют на РНК-связывающую, но не на ферментативную активность СК 2. Сродство СК 2 к РНК резко падает при возрастании рН, что позволяет связать активацию фермента в составе свободных РНК-связывающих белков с изменениями внутриклеточного рН в процессе созревания ооцитов R. temporaria. Вероятная последовательность событий, приводящих к возрастанию активности СК 2 во фракции свободных РНК-связывающих белков и к возрастанию уровня трансляции при созревании ооцитов R. temporaria, может быть представлена следующим образом (рис. 9).
1). Индукция ооцитов прогестероном вызывает повышение внутриклеточного рН до 7,7, что приводит к падению сродства СК 2 к мРНК и к диссоциации фермента от мРНП-частиц.
2). Диссоциировавший фермент освобождается от ингибирую-щего влияния мРНК и фосфорилирует белки мРНП-частиц, маскирующие мРНК.
3). Демаскированная мРНК/мРНП поступает в аппарат трансляции, вследствие чего биосинтез белка в ооцитах возрастает в 2—4 раза. СК 2, ранее ассоциированная с информосомами, переходит
ПОЛИРИБОСОМЫ
Рис. 9. Вероятная последовательность событий в процессе мейотического созревания ооцитов ПЛетрогапа.
в состав растворимых белков ооцита и обнаруживается во фракции свободных РНК-связывающих белков. Таким образом, активация СК 2 при мейотическом созревании ооцитов амфибий объясняется изменением в компартментализации фермента, влияющим и на интенсивность биосинтеза белков в ооцитах.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
На примере стимулированных к мейотическому созреванию прогестероном ооцитов R. temporaria продемонстрирована активация СК 2 при изменении физиологического состояния клетки. Если предположить, что в клетке поддерживается равновесие между цитоскелет/мембрано-связанной и свободной (цитозоль-ной) фракциями фермента, то при изменении физиологического состояния клетки (в данном случае в ответ на действие прогестерона) это равновесие может сдвигаться в ту или иную сторону. Оказалось, что при стимуляции ооцитов прогестероном значительная часть СК 2 переходит из цитоскелет/мембрано-связанной во фракцию растворимых белков цитоплазмы, чем и можно объяснить наблюдаемое нами резкое возрастание активности СК 2 в составе свободных РНК-связывающих белков, экстрагируемых буфером с 0,1 М NaCI (рис. 8, 10). Тотальная клеточная активность фермента в процессе прогестерон-стимулируемого созревания ооцитов R. temporaria оставалась при этом практически неизменной .
Одновременно с результатами, изложенными выше, зависимость активности СК 2 от физиологического состояния эука-риотической клетки была обнаружена нами и для других клеточных систем. Полученные в этих исследованиях данные не только подтверждают предположение о важной роли СК 2 именно в РНК-зависимых процессах, но и дополняют представления о способах регуляции активности СК 2 в клетках эукариот.
При исследовании фракции свободных РНК-связывающих белков гриба Verticillium dahliae в их составе также была обнаружена СК 2 [см. работы 24, 26, 34, 38, 39, 43]. С помощью высокоспецифической антисыворотки, полученной к ферменту из гриба, было измерено количество СК 2 во фракции РНК-связывающих белков V. dahliae в нормальных условиях роста (28°С) и в условиях теплового шока (45 мин при 40°С). На фоне 3—4-х кратного падения
ЗАВЕРШИВШИЕ РОСТ ОВУЛИРОВАВШИЕ IN VIVO
(ИСХОДНЫЕ) ООЦИТЫ (ПОЛОСТНЫЕ) ООЦИТЫ
I-1 NaCI 0,1 М I-1 NaCI 0,3M ЕЭ NaCI 0,5М
ВВ| NaCI 0,5М, Triton 1%
Рис.10. Распределение активности СК 2 по фракциям гомогената, завершивших рост (левая часть диаграммы) и овулировавших in vivo ооцитов (правая часть диаграммы), последовательно экстрагируемых стандартным буфером с 0,1М NaCI, 0,3M NaCI, 0,5М NaCI, 0,5М NaCI + 1% Triton. Активность СК 2 определяли по фосфорилированию казеина по стандартной методике.
интенсивности биосинтеза белков при тепловом шоке содержание СК 2 возрастало почти что в три раза, в то время как удельная активность фермента уменьшалась в 6 раз. Иммунохимическими методами удалось показать 3-х кратное увеличение биосинтеза всех трёх субъединиц фермента в условиях теплового шока. За счёт усиления биосинтеза фермента его тотальная активность при тепловом шоке снижалась не более чем в 2 раза по сравнению с нормой. Изменение активности СК 2 в клетках V. dahliae при тепловом шоке — яркий пример регуляции активности СК 2 за счёт новообразования фермента. Таким образом, СК 2 входит в состав строго ограниченного набора белков, абсолютно необходимых для поддержания жизнедеятельности клеток и образующихся de novo в неблагоприятных условиях.
Различия в активности СК 2, наблюдаемые многими авторами в связи с изменениями физиологического состояния клеток эука-риот, относятся фактически лишь к ферменту, локализованному во фракции свободных цитозольных белков. Мембрано/цитоске-лет-связанные формы СК 2 не привлекают обычно внимания исследователей. Между тем, регистрируемая в подобных работах
активация СК 2 может быть объяснена именно переходом фермента во фракцию растворимых клеточных белков. Показанное нами включение СК 2 в состав информосом, в определенной мере, объясняет преимущественную локализацию фермента во фракции мембрано/цитоскелет-связанных белков. Являясь неотъемлемым компонентом трансляционного аппарата клеток эукариот, мРНП частицы, согласно современным представлениям, должны быть в значительной степени ассоциированы с мембранными и цитоске-летными структурами клетки. Не исключено, что "полирибосомы и свободные мРНП-частицы формируют в эукариотической цитоплазме особый функциональный компартмент, где могут локализоваться многие факторы и ферменты общего назначения, благодаря их неспецифической РНК-связывающей активности." (Спирин, 1996, Успехи биол. химии, т. 36, с. 39). Поскольку разные клеточные компартменты могут отличаться и значениями рН, ферментативная активность СК 2, если даже она и комплексирована с РНК (в составе информосом), определяется все-таки компартмен-тализацией фермента, зависящей именно от физиологического состояния клетки. Учитывая предполагаемую ключевую роль СК 2 в регуляции важнейших метаболических процессов, обратимая компартментализация может служить способом регуляции активности фермента, необходимого для нормальной жизнедеятельности клетки. Локализация активной СК 2 во фракции свободных РНК-связывающих белков, по-видимому не случайна. Именно в этой фракции, судя по изложенным выше данным , находятся свободные информосомообразующие белки, являющиеся, скорее всего, эндогенными белковыми субстратами СК 2 (см. главы 2 и 4). Фосфорилирование РНК-связывающих белков эндогенной протеинкиназой снижает сродство этих белков к РНК и приводит к демаскированию мРНК. Не исключено, что одинаковая компартментализация СК 2 и её белковых субстратов в клетке — в составе мРНП или свободных мРНК-связывающих белков — необходима для предотвращения "неправильного" маскирования/демаскирования мРНК. Для выяснения конкретных механизмов такой регуляции необходимы дальнейшие исследования.
ВЫВОДЫ
1. Установлено, что стабильность РНП-комплексов в условиях избытка РНК при физиологической концентрации солей и температуре служит критерием отличия естественных информосом от искусственных РНП-комплексов.
2. Показано, что радиоактивно меченые in vitro свободные РНК-связывающие белки после инъекции в ооциты амфибий участвуют в формировании информосом, т.е. в маскировании мРНК in vivo.
3. В составе РНК-связывающих белков обнаружена и охарактеризована эндогенная протеинкиназа, идентифицированная как казеиновая киназа типа И (СК 2). Разработана высокоэффективная схема очистки СК 2 из клеток и тканей эукариот различного происхождения. Показано, что эндогенными субстратами СК 2 являются РНК-связывающие белки, их сродство к РНК снижается вследствие фосфорилирования.
4. Показано, что участки связывания РНК расположены на каталитических а, а'-субъединицах СК 2. ПротеинКиназная активность СК 2 ингибируется мРНК и некоторыми другими полирибонуклео-тидами. Показано, что ингибирование СК 2 полирибонукпеотида-ми и сродство фермента к РНК зависят от величины рН.
5. Обнаружено включение СК-2Чв •соетав-.информосом после инъекции очищенного фермента в%о\1£ШМгаТмфйбий. Сформулирована гипотеза о зависимости тфоцеееов^ маскирования/демаскирования мРНК в клетках эукариот от фосфорилирования РНК-связывающих белков эндогенной протеинкиназой (СК 2).
6. Показано, что возрастание уровня трансляции демаскированных мРНК в процессе прогестерон-индуцируемого созревания ооци-тов Rana temporaria сопровождается резким увеличением активности СК 2 во фракции свободных РНК-связывающих белков. Предлагается модель, объясйя'ющая'активацию СК 2 и усиление трансляции в созревающих ооцйтах R< temporaria.
7. Предполагается, что активность СК 2 в клетках эукариот регулируется на двух уровнях: на уровне трансляции путём новообразования фермента и на посттрансляционном уровне за счёт обратимой компартментализации СК 2.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ
1. Степанов А.С., Воронина А. С. Образование стабилизированных информосомо-подобных частиц при физиологических температурах // Докл. АН СССР.- 1972 - Т. 203, № 6.- С. 1418—1421.
2. Степанов А.С., Воронина А.С., Преображенский А.А., Овчинников/1.П. Белковый РНК-связывающий фактор цитоплазматичес-ких экстрактов животных клеток // Тезисы докл. III Всесоюзного биохим. съезда.- Рига, 1974.- С. 38—39.
3. Овчинников Л.П., Воронина А.С., Степанов А.С. Определение плавучей плотности рибонуклеопротеидов // Современные методы биохимии.- Москва, 1975.- С. 42—44.
4. Степанов А.С. Созревающие ооциты как модель для изучения механизмов синтеза белка и его регуляции in vivo // Современные проблемы оогенеза.- Москва, 1977.- С. 267—280.
5. Elizarov S.M., Stepanov A.S., Felgenhauer Р.Е., Chulitskaya E.V. Involvment of RNA binding proteins in the formation of ¡nformo-somes in vivo // FEBS Letters.- 1978 - Vol. 93, N9 2.- P. 219—224.
6. Елизаров C.M., Степанов A.C. РНК-связывающие белки ооци-тов лягушки Rana temporaria. Выделение методом аффинной хроматографии и in vitro радиоактивное мечение // Биохимия.-1978 - Т. 43, № 8 - С. 1347—1355.
7. Елизаров С.М., Степанов А.С., Фельгенгауэр П.Е., Чулицкая Е.В. РНК-связывающие белки ооцитов лягушки Rana temporaria. Включение в состав информосом ооцитов in vivo // Биохимия- 1979 - Т. 44, № 3 - С. 407—416.
8. Детлаф Т.А., Фельгенгауэр П.Е, Чулицкая Е.В., Степанов А.С. Синтез белка в ооцитах севрюги в разные сроки периода созревания и влияние подавления этого синтеза на изменение ооцитов // Онтогенез.- 1980.-Т. 11, № 1- С. 24—30.
9. Степанов А.С., Кандрор К.В., Елизаров С.М. Протеинкиназная активность РНК-связывающих белков ооцитов амфибий // Мол. биология - 1982 - Т. 16, № 5.- С. 965-972.
10. Stepanov A.S., Kandror К. V., Elizarov S.M. Protein kinase activity in RNA-binding proteins of amphibia oocytes // FEBS Letters.-
1982.- Vol. 141, № 2 - P. 157-160.
11. Кандрор K.B., Степанов AC. Исследование протеинкиназной, фосфатазной и протеазной активностей во фракции РНК-свя-зывающих белков // Биохимия.- 1983.- Т. 48, № 10.- С. 1674-1679.
12. Степанов АС., Елизаров С.М., фельгенгауэр П.Е. Образование информосом в созревающих ооцитах амфибий // Биохимия.-
1983.- Т. 48, № 12 - С. 2035-2040.
13. Елизаров С.М., Фельгенгауэр РЕ., Степанов А.С. Некоторые свойства РНК-компонента информосом ооцитов амфибий // Биохимия.- 1984.- Т; 49, № 1.- С. 81—86.
14. Kandror K.V., Stepanov AS. RNA-binding protein kinase from amphibian oocytes is a casein kinase III I FEBS Letters.- 1984.-Vol. 170, № 1- P. 33-37.
15. Степанов А.С., Кандрор К.В. Влияние самофосфорилирования РНК-связывающих белков на их РНК-связывающую активность //Докл. АН СССР.- 1984 - Т. 275, № 5.- С. 1227-1230.
16. Кандрор К.В., Степанов АС. Идентификация и выделение казеиновой киназы типа 2 из РНК-связывающих белков ооцитов лягушки // Биохимия.- 1984.- Т. 49, № 6.- С. 1038—1045.
17. Степанов А.С., Кандрор К.В. Изменение активности РНК-связывающей протеинкиназы при созревании ооцитов Acipenser stellatus Pall // Биохимия.- 1984.- Т. 49, № 7.- С.-1184—1188.
18. Степанов АС., Кандрор К.В. Роль РНК-связывающей протеинкиназы в образовании и функционировании информосом // Тезисы докл. 16-ой конференции ФЕБО - Москва, 1984.- С. 277.
19. Степанов А.С., Кандрор К.В. Фосфорилирование РНК-связывающих белков и трансляционный контроль в ооцитах рыб и амфибий // Тезисы докл. 4-го Советско—Итальянского симпозиума "Макромолекулы в функционирующей клетке".- Киэв,
1984.- 0. 116.
20. Кандрор К.В., Степанов А.С. Информосомы и трансляционная активность мРНК в клетках эукариот// Мол. биология.- 1988.Т. 22, № 1- С. 31—43.
21. Степанов А.С., Кандрор К.В. Индуцируемая прогестероном активация РНК-связывающей казеиновой киназы типа 2 при созревании ооцитов лягушки // Мол. биология.- 1988.- Т. 22, № 2,- С. 393-399.
22. Кандрор К.В., Бенюмов А.О., Степанов А.С. Внутриклеточная локализация казеиновой киназы типа 2 в ооцитах Rana temporaria // Мол. биология - 1988 - Т. 22, № 4,- С. 1097—1107.
23. Кандрор КВ., Степанов А.С. Выделение одного из белков свободных цитоплазматических информосом — РНК-связывающей протеинкиназы // Новые методы практической биохимии.-Москва, 1988 - С. 93—97.
24. Степанов А.С., Кандрор К.В., Васильев А.О. Протеинкиназная активность РНК-связывающих белков Verticillium dahliae в процессе роста и дифференцировки гриба // Биохимия,- 1988.Т. 53, № 5.- С. 872—878.
25. Васильев А.О., Кандрор К.В., Степанов А.С. Выделение и свойства казеиновой киназы типа 1 из РНК-связывающих белков Verticillium dahliae // Биохимия.- 1988.- Т. 53, N9 6.- С. 930-936.
26. Кандрор КВ., Васильев А.О., Степанов А.С. Выделение и свойства казеиновой киназы типа 2 из РНК-связывающих белков Verticillium dahliae // Биохимия.- 1988.- Т. 53, № 7,- С. 1121—1127.
27. Кандрор К.В., Степанов А.С. Идентификация РНК-связывающих субъединиц казеиновой киназы типа II // Докл. АН СССР - 1989,- Т. 309, № 2 - С. 491—492.
28. Елизаров С.М., Степанов А.С. Выделение и характеристика казеиновых киназ типов I и II из печени кролика. Анализ их влияния на биосинтез белка в клетке // Биохимия.- 1989.- Т. 54, N° 3 - С. 409—420.
29. Kandror K.V., Benumov А.О., Stepanov A.S. Casein kinase 2 from Rana temporaria oocytes. Intracellulare localizaron and activity during progesterone-induced maturation // Eur. J. Biochem.-1989 - Vol. 180, № 2 - P. 441—448.
30. Kandror K.V., Kapkov D.V., Stepanov A.S. Participation of CK 2 in the formation and functioning of the informosomes. I I Abstracts of Translational Control Meeting.- Cold Spring Harbor- 1989,- P. 115.
31. Stepanov A.S., Kandror K.V. Regulation of CK 2 activity by the formation of complexes with RNA in vivo. // Abstracts of the Conference "Modern problems of Phisico-chemical biology and biotechnology".-Alma Ata, 1989.- P.11.
32. Кандрор K.B., Капков Д.В., Степанов А.С. рН-зависимые изменения в структуре и РНК-связывающей активности казеиновой киназы типа 2 из ооцитов амфибий // Биохимия.- 1990.- Т. 55, № 4 - С. 579—585.
33. Кандрор К.В., Степанов А.С. Стабильные плотные нукпеотид-связывающие частицы в ооцитах амфибий, коседиментирую-щие со свободными цитоплазматическими информосомами // Биохимия - 1990.- Т. 55, № 8.- С. 1461—1467.
34. Vasiiiev А.О., Kapkov D.V., Kandror K.V., Stepanov A.S. Casein kinase 2 and heat-shock in Verticillium dahliae cells. // Abstr. 4-th Internat. Mycological Congress.- Regensburg, 1990.- P.261.
35. Кандрор K.B., Степанов A.C. Ингибирование активности казеиновой киназы типа 2 за счёт образования комплексов с мРНК in vivo // Биохимия,- 1990.- Т. 55, № 9.- С. 1584—1589.
36. Кандрор К.В., Васильев А.О., Капков Д.В., Фуэнтес A.M., Степанов А. С. Сравнительный анализ хроматографических, кинетических и антигенных свойств казеиновых киназ типа 2 из печени быка и фитопатогенного гриба Verticillium dahliae // Биохимия.- 1990 - Т. 55, № 12 - С. 2115—2121.
37. Елизаров С.М., Кандрор КВ., Степанов А.С. Казеиновые киназы эукариотических клеток: структура, свойства, субстраты и возможные функции //Успехи биол. химии.- 1990.- Т. 31.- С. 50-70.
38. Kandror K.V., Vasiiiev А.О., Kapkov D.V., Stepanov A.S. Casein kinase 2 from Verticillium dahliae: isolation and characterization // Biochemistry Internat.- 1990.- Vol. 20, № 1- P. 59—69.
39. Васильев A.O., Капков Д.В., Кандрор K.B., Степанов АС. Экспрессия и регуляция казеиновой киназы типа 2 при тепловом шоке у Verticillium dahliae // Мол. биология.- 1991.- Т. 25, № 2,- С. 525-530.
40. Aksenova M.V., Burbaeva G.Sh., Kandror K.V., Kapkov D.V., Stepanov A.S. The decreased level of casein kinase 2 in brain cortex of schizophrenic and Alzheimer's disease patients // FEBS Letters.- 1991.-Vol. 279, № 1.- P. 55—57.
41. Kandror K.V., Kapkov D.V., Turapov O.A., Stepanov A.S. pH-dependent changes in structure and RNA-binding activity of casein kinase 2 from Rana temporaria oocytes // FEBS Letters.-1991- Vol. 283, № 2 - P. 223—226.
42. Kandror KV., Stepanov A.S. Casein kinase 2 and pretranslational regulation of protein synthesis in maturing frog oocytes. // Abstracts Internet. Conference "Protein Biosynthesis".- Pushchino, 1991- P. 50.
43. VasilievA.O., Kapkov D.V., Kandror K.V., Stepanov A.S. Expression and regulation of casein kinase 2 during heat shock in Verticillium dahliae // Mol. Reprod. and Development - 1992 - Vol. 31, № 1-P. 42—47.
44. Kandror K.V., Tsuprun V.L, Stepanov A.S. The main adenosine triphosphate-binding component of amphibian oocytes is Ferritin // Mol. Reprod. and Development.- 1992 - Vol. 31, № 1.- P. 48—54.
45. Сёмин Б.В., Кандрор K.B., Семакин А.Б., Цупрун В.Л., Степанов А.С. Выявление ДНК-связыващих белков в препаратах вирусоподобных частиц D. melanogaster // Докл. АН СССР.-1992.- Т. 322, № 1.- С. 166—169.
46. Syomin B.V., Kandror K.V., Semakin А.В., Tsuprun V.L, Stepanov A.S. Presence of the gypsy (MDG4) retrotransposon in extracellular virus-like particles // FEBS Lett.- 1993.- Vol. 323, № 3.-P. 285— 288.
47. Сёмин Б.В., Кандрор К.В., Семакин А.Б., Цупрун В.Л., Степанов А.С. Исследование некоторых биохимических характеристик препаратов внеклеточных вирусоподобных частиц ретротран-спозона gypsy (МДГ 4) // Биохимия.- 1994.- Т. 59, № 4.- Р. 503—512.
48. Капков Д.В., Турапов О.А., Степанов А.С. Казеиновые киназы типа 2: структура и локализация в клетках эукариот // Успехи биол. химии - 1995 - Т. 35.- С. 135—159.
-
Степанов, Александр Семенович
-
доктора биологических наук
-
Москва, 1996
-
ВАК 03.00.04
- Изучение динамики перехода мРНК из информосом в полирибосомы у разных видов амфибий
- Влияние белков мРИП на трансляцию глобиновой мРНК в бесклеточной системе
- Влияние мажорного белка цитоплазматических мРНП р50 на трансляцию мРНК
- Кальций- и актинзависимое ингибирование синтеза белка в культуре клеток
- Фосфорилирование РНК-связывающих белков ооцитов рыб и амфибий
