Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Фосфорилирование РНК-связывающих белков ооцитов рыб и амфибий

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Кандрор, Константин Вилленович

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

А. ФОСФОРИЛИРОВАНИЕ КОМПОНЕНТОВ ТРАНСЛЯЦИОННОГО АППАРАТА

И РЕГУЛЯЦИЯ БИОСИНТЕЗА БЕЛКА В ЭУКАРИОТИЧЕСКИХ КЛЕТКАХ.

1. ФОСФОРИЛИРОВАНИЕ ФАКТОРА ИНИЦИАЦИИ е1Р

1.1. Ингибитор трансляции, появляющийся в лизатах ретинулоцитов при недостатке гемина.

1.2. Ингибитор трансляции, появляющийся в лизатах ретикулоцитов при добавлении двуспиральной РНК.II

1.3. НС1 и М1 - две разные протеинкиназы с одинаковой . специфичностью по отношению к е1Р-2оо

1.4* Каким образом фосфорилирование е1Р-2оь приводит к остановке трансляции в лизатах. ретинулоцитов?.

1.5. Дефосфорилирование е 1Р-2 сь

1.6. Фосфорилирование е1Р-2уЗ

1.7. Фосфорилирование других факторов инициации.

2. ФОСФОРИЛИРОВАНИЕ РИБ0С0МН0Г0 БЕЛКА Бб.

2.1. Что приводит к изменению степени фосфорилирования эб?

2.2. Как фосфорилирование Бб может.быть связано с активацией трансляции?.

3. ФОСФОРИЛИРОВАНИЕ ЖИНОАЦИЛ-тРНК-СИНТЕТАЗ.

Б. ВЗАИМНЫЙ ОШЕН СВОБОДНЫХ РНК-СВЯЗЫВАЮЩИХ И

ИНФОМОСОМНЫХ БЕЛКОВ - ВЕРОЯТНЫЙ МЕХАНИЗМ РЕГУЛЯЦИИ.

ЭКСПРЕССИИ мРНК.

I. НЕКОТОРЫЕ БЕЛКИ ИНФ0М0С0М ПРИСУТСТВУЮТ.

В ЦИТОПЛАЗМЕ В СВОБОДНОМ СОСТОЯНИИ.

2. СВОБОДНЫЕ ЦИТОПМЗМАТШЕСКИЕ И П0ЛИС0М0СШЗАБНЫЕ ИНФОМОСОМЫ СОДЕРЖАТ РАЗНЫЙ НАБОР БЕЛКОВ.

3. СВОБОДНЫЕ ЦИТОГШАЗМТИЧЕСКИЕ ИНФОМОСОМЫ СОДЕРЖАТ РЕПРЕССОР ТРАНСЛЯЦИИ,. ОТСУТСТВШ1ЩЙ В ПОЛИСОМОСВЯЗАННЫ! ИНФОШОСОМАХ.

4. ФОСФОРИЛИРОВАНИЕ БЕЛКОВ ИНФОВЮСОМ.

5. цАМФ-НЕЗАВИСИМЫЕ ПРОТЕИНКИНАЗЫ - ФЕРМЕНТЫ,.

ФОСФОРИЛИРУЮЩИЕ БЕЛКИ ИНФОШОСОМ.

5.1. Цитоплазматические казеиновые киназы.

5.2. Ядерные казеиновые киназы.

5.3. Возможные субстраты казеиновых киназ.

5.4. Гистоновые киназы.

5.5. Протеинкиназы,. ассоциированные. с микросомами.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Фосфорилирование РНК-связывающих белков ооцитов рыб и амфибий"

В прокариотических кяетках с короткоживущей м Ш К экспрессия генов контролируется главным образом на уровне транскрипции. В эукариотических кяетках м^РНК, в среднем, имеет более длительный период жизни, и биосинтез белков может регулироваться не только на уровне транскрипции, но и на уровне трансляции. В последнем случае регуляция часто оср^ествляется путем специфического фосфорилирования белковых компонентов трансляционного аппарата. Установлено, что аминоацил-тРНК-синтетазы, факторы инициации, рибосомные и информосомные белки фосфорилируются различными протеинкиназами как in vivo, так и in vitro. В ряде случаев это оказывает решащее влияние на трансляцию. Так, специфическое присоединение всего одного фосфатного остатка к малой субъединице фактора инициации 2 приводит к резкому подавлению белкового синтеза во многих эукариотических клетках. С другой стороны, получены данные, свидетельствующие в пользу того, что увеличение степени фосфорилирования рибосомного белка ^ 6 , напротив, коррелирует с активацией трансляции.Вместе с тем, фосфорилирование свободных РНК-связываюпр1Х белков совершенно не исследовано. На наш взгляд, изучение посттрансляционных модификаций этих белков должно способствовать выяснению конкретных молекулярных механизмов экспрессии мРНК: во-первых, экспериментально доказано, что по крайней мере часть РНК-связывающих белков участвует в образовании информосом in vivo ; во-вторых, ядерные, свободные цитоплазматические и полисомосвязанные информосомы имеют разный набор белков, так что функциональная активность матрицы может быть непосредственно связана с ее белковым окружением; в-третьих, свободные РНК-связывающие белки могут выступать - 6 активным началом при форшровании того или иного типа частиц, поскольку этот процесс, в конечном итоге, зависит от наличия в составе РНК-связыващих белков достаточного количества необходимых в данный момент ковшонентов информосом. В таком случае, изменение набора этих белков или модификации, влияющие на их активность, могут служить важным фактором регуляции трансляции.В нашей работе показано, что протеинкиназа, фосфорилирующая РНК-связывающие белки, сама обладает высоким сродством к РНК и может быть получена в составе суммарной фракции этих белков с помощью аффинной хроматографии клеточных экстрактов на колонках с иммобилизованными полинкулеотидами. Фермент б ш очищен до гомогенности и идентифицирован как казеиновая киназа II типа. По-видимому, РНК-связывающая способность протеинкиназы используется при образовании информосом In vivo, обуславл1шая возможность вктпочения этого фермента в состав частиц. Фосфорилирование РНК-связывающих белков эндогенной протеинкиназой ведет к ослаблению их сродства к РНК, что может использоваться для изменения белкового набора инфорлосом. - 7 О Б З О Р Л И Т Е Р А Т У Р Ы А, ФОСФОРШШРОВАНИЕ КОШОБЕНТОВ ТРАНСЛЯВДОШОГО АППАРАТА И РЕГУЛЯЦИЯ БИОСИНТЕЗА БЕЛКА В ЭУКАРИОТЙЩСКИХ КЛЕТКАХ. I. ФОСФОРИЛИРОВАНИЕ ФАКТОРА ИНИПИАШШ eIF2.При изучении регуляции белкового синтеза наиболее четкие и однозначные данные получены при использовании бесклеточных систем, приготовленных из лизатов ретикулоцитов. Во-первых, в ретикулоцитах и лизатах скорость трансляции практически одинакова (163); во-вторых, синтез белка (основную массу которого составляет глобин) в обоих случаях сбалансирован с синтезом гема. Считается, что способы регуляции трансляции in vivo (в интактных ретикулоцитах) и in vitro (в лизатах) тоздественны, Лизаты, содержащие около 20 м Ш экзогенного гемина или его предшественников - железосодержащих порфиринов (161)^ синтезируют белок с постоянной скоростью по меньшей мере в течение часа, в то время как в отсутствие гемина трансляция останавливается уже через несколько минут (135). При этом в лизатах исчезают 40 sинициаторные комплексы (состоящие из малых рибосомных субчастиц, фактора инициации eiP-2, Мет-тРНК^ и ГТФ), и распадаются полисомы (200), Был сделан вывод о том, что недостаток гемина приводит к нарушению инициации белкового синтеза. Подробное изучение обнаруженного эффекта позволило обосновать важнейшую роль реакций фосфорилирования-дефосфорилирования в регуляции биосинтеза белков и выявить ряд общих моле1^лярных механизмов трансляционного контроля в эукариотических клетках. I.I. Ингибитот) т-рансляпии. появляющийся в лизатах ретикулопитов ПРИ недостатке гемина был впервые обнаружен Максвеллом и Рабиновичем (216). Они показали, что безрибосомныи экстракт лизатов, инкубированный в отсут- 8 ствие гемина, ингибирует белковый синтез в свежих лизатах, причем появление ингибитора (HCI, hemin controlled inhibitor) можно предотвратить добавлением гемина. Так как репрессор формируется в отсутствие рибосом, то, скорее всего, его образование происходит не de novo, а из некоего предсуществущего прорепрессора.Эти данные свидетельствуют в пользу того, что SH -группы прорепреосора принимают участие в процессе активации; значит, вещества типа дитиотреитола должны предотвращать формирование HCI. Действительно, Гросс наблюдал такой эффект ДТТ (135) , но его результаты оспариваются Хантом, - 9 показавшим, что 5-10мМ ДГТ не только не мешает формированию HCI в грубых лизатах, но даже способствует этому (162), Таким образом, роль SH -групп в активации прорепрессора до сих пор не установлена.Было замечено, что образование HCI в лизатах сопровоздается фосфоршшрованием полипептидной цепи с молекулярной массой 8000096000, Этот компонент соочищается с HCI на всех стадиях (сульфатное осаждение, ионообменные хроматографии, гель-фильтрация, центрифугирование), причем интенсивность его фосфорилирования в грубых экстрактах и в очищенных препаратах коррелирует с активностью репрессора. Более того, показано, что максимально очищенные препараты HCI содержат только эту цепь, причем нативная молекула репрессора представляет собой димер: 2x80000, обладавзщий самофосфорилиругощей активностью (97, 98, 162). HGI при самофосфорилировании включает несколько фосфатных остатков: 3 поданным Фагарда и Лондона (98), 4 - Ханта (162) и 5 - Гросса (138). Этот фосфат обнаруживается в основном в фосфосериновых и, в меньшей степени, в фосфотреониновых остатках (97). Кинетические исследования самофосфорилирования указывают на внутримолекулярный характер реакции, поскольку она протекает очень быстро и практически не зависит от концентрации HCI (138) Высокоочищенный HCI способен связывать гемин (97, 98),что, в принципе, еще не говорит о физиологической значимости эффекта, поскольку гемин с легкостью связывается многими белками, включая и бычий сывороточный албумин (162). Тем не менее, добавление 5 мкМ гемина к очищенным препаратам HCI снижает как степень самофосфорилирования, так и ингибирующее действие репрессора на белковый синтез; N -этилмалеимид, напротив, стимулирует обе активности (98).Таким образом, полученные в настоящее время результаты позволяют закшчить, что HCI в своей активной фоще представляет собой - 10 фосфопротеин, в то время как прорепрессор нефосфорилирован. Является ли самофосфорилирование причиной активации репрессора или её следствием - пока неизвестно. Кроме того, не исключено, что в лизатах могут присутствовать специфические киназы HCI, катализирующие превращение прорепрессора в репрессор.До последнего врнмени существовала красивая теория активации HCI, предяоженная СОчоа (236, 237), согласно которой переход неактивной формы HCI в активную связывался с фосфоршшрованием прорепрессора каталитической субъединицей Ц АЖ-зависимой протеиншшазы.Эта точка зрения, однако, вызывала много критических замечаний (125, 135, 162, 202), которые нет необходимости анатшзировать, поскольку недавно Очоа сообщил, что эффект С-субъедишщы протеинкиназы обусловлен содержанием в ней примесного термостабильного белка с молекулярной массой 68000 (70, 71). Этот белок, на существование которого впервые указано группой Хардести (156), был очищен до гомогенности. Оказалось, что он ингибирует трансляцию в лизатах ретикулоцитов с характерной для HCI (и недостатка гемина) кинетикой, причем ингибирование снимается большими количествами ГТФ и eiP- 2. По-видимому, обнаруженный термостабильный белок активирует HCI, но механизм его действия не изучен.В чем же заключаются функции HCI? Полагают, что весь ингибиторный эффект этого репрессора на биосинтез белка в лизатах обусловлен фосфоршшрованием малой субъедишщы (35000 - 38000) фактора инициации 2 ( eiP - 2об). Накоплено много экспериментальных доказательств того, что HGI представляет собой специфическую eiP-2- киназу (99, 162, 247).Эти доказательства, вкратце, заключаются в следующем: 1. при выделении HCI ингибиторная и eiP - 2 -киназная активности соочищаются на всех стадиях 2, ингибиторная и киназная активности одиниково инактивируются - II при повышении температуры.3. при активации HCI ингибиторная и киназная активности появляются параллельно 4. антитела против HCI ингибируют обе активности 5. НОТ н^аетоя в Л » н не активен пр. замене Ш на н е р а ^ я е мне аналоги 6. в грубых лизатах ингибирование белкового синтеза можно преодалеть добавлением очищенного eiP -2.7. в условиях in vitro некоторые активности чистого eiP -2 можно блокировать добавлением HCI и АТФ. Этот пункт будет подробно рассмотрен ниже.Фосфорилирование eip -2обне является специфическим для недостатка гемина механизмом остановки трансляции, К этому же результату (но иным путем) приводит обработка лизатов ретикулоцитов двуспиральной РНК, Вдобавок, способность фосфоршшровать этот фактор -одно из условий "противовирусного состояния" клетки вырабатывающегося под действием интерферона.1.2. Ингибитор трансляции, появляющийся в лизатах ретикулоцитов при добавлении двуспиральной РНК. Биосинтез белка в лизатах ретикулоцитов можно быстро подавить добавлением нанограммовых количеств двуспиральной РНК или искусственных двуспиральных полинуклеотидов (например, поли(1) ; поли (С), При этом высокие концентрации дс РНК (более I мкг/мл) не влияют на трансляхщю (164). Ингибирование биосинтеза белка до РНК сопровоядаевся фосфорилированием двух или трех новых компонентов лизата. Один из них, с молекулярной массой 35000-38000, был идентифицирован как eip -2оС. Другой имеет молекулярную массу около 67000 и, по-видимому, представляет собой дугкет: 67000/68500 (203, 245). Поскольку ингибиторная, eiP-2 -киназная активности - 12 И ЭТИ фосфорилирующиеся полипептидные цепи соочищались на всех Стадиях ( применялось сульфатное осаздение, ионообменные хроматографии на ДЭАЭ-целлвшозе и фосфоцеллклозе, гель-фильтрация на сефарозе 6В и центрифугирование в градиенте концентрации глицерина), 6ш1 сделан вывод о том, что дсРНК активирует некий penpsccop, аналогилный HCI ( то есть фосфорилирущий е1Р--2<ы. ), причем в состав репрессора входит дублет 67000/68500. Репрессор был назван D AI, или ds I, С помощью трипоинового и химотрипсинового гвдролиза с последующим анализом получившихся пептидов было показано, что дублет представляет собой одну и ту же полипептидную цепь разной степени фосфорилирования (204): +р.Эпштейном и соавт. получены данные, указывающие на то, что до РНК вдобавок ингибирует фосфатазу D AI, Во всяком случае, после активации репрессора в присутствии [у - р] АТР с помощью поЛЕ{Е):ПОЛИ (С) первоначальный уровень содержания ^% в D AI при добавлении к клеточным экстрактам избытка холодной АТФ и АТФ-регенерирующей системы не меняется. Поли (1):поли(ъг С) не вызывает активации D AI и не мешает йефосфорилированию предварительно активированного D AI при разбавлении экстрактов немеченной АТФ (91), 13 в дополнение к вышесказанному можно лишь отметить, что в отлшие от грубых лизатов, очищенные препаратыD AI могут быть активированы высокими концентрациями поли(1):поли(С) (25 мкг/мл), и что активный (фосфорнлированный) D AI обладает меньшим сродством к поли(Г>поли(С), чем его латентная форма (246). К сожалению, эти вопросы подробно не изучены.Гипотеза, выдвинутая в лаборатории Лондона и, по-видимому, в настоящее время не имеющая альтернатив, состоит в том, что активация DAI (также как и HCI) заключается в самофосфорилировании прорепрессора.Ответ ретикулоцитных лизатов на добавление двуспиральной РНК полностью совпадает с реакцией бесклеточных систем, приготовленных из других клеток ( НеЬа, фибробластов человека, мышиных ъ -клеток, клеток асцитной опухоли Эрлиха), после обработки этих клеток физиологическими концентрациями интерферона (60, 142, 160,184,278,368).Показано, что интерферон стимулирует образование в этих клетках дсИПС-стимулируемой eiF-2 -киназы, полностью аналогичной DAI из лизатов ретикулоцитов. В этом заключается один из аспектов противовирусного действия интерферона. Причины приобретения (шш сохранения) ретикулоцитами такой регуляторной системы совершенно неизвестны.В лизатах ретикулоцитов и интерферон-обработанных клеток под до действием РНК активируется ещё один фермент-олигоизоаденилат-синтетаза, образующий (2-5^олигоА из АТФ. (2-50олигоА активирует эндорибонуклеазу, расщепляющую мРНК и, возможно, решшкативные формы вирусов, что также ведет к остановке трансляции (57,81), В настоящее время ещё точно не известно, в чем заключается главная причина подавления биосинтеза белка в экстрактах интерферон-обработанных клеток или ретикулоцитов: в активации eiF-2 -киназы (233,279,280) или олигоизоаденилатсинтетазы (173,335), Не исключено, что в раз- 14 ных клетках преимущественно осуществляется какой-либо один механизм.1.3. HGI и D AI - две разных щютеинкиназы с одинаковой специфичностью по отношению к eIF-2.После обнаружения HCI и в AI было показано, что это два абсолютно разных белка (137,141,162,237,247,258): 1. HCI присутствует в пострибосомном супернатанте, а D AI ассоциирован с рибосомами и может быть получен при промывке рибосом 0,5,-1 М KCI 2. Молекулярная масса субъединиц у HCI около 90000, а у в AIоколо 70000 3. HGI и Ш1 не обнаруживают антигенного перекреста 4. HCI активируется N -этилмалеимидом, а DAI - ингибируется 5. HCI фосфорнлирует исключительно eip-2oC , а D AI, вдобавок, некоторые гистоны 6. Фос$юрилированные HCI и DAI дают разные пептидные карты 7. DAI может быть индуцирован интерфероном, а HCI - нет.Несмотря на эти различия, HCI и DAI имеют и общие свойства.Так, Mg"^ "^ ( от 0,5 до 2 мМ) стимулирует как самофосфорилирование HGI и DAI, так и их eiF-2 -киназную активность. Те же концентрации Мп"^"*" стимулируют только самофосфорилирование обоих репрессоров и не влияют на фосфорилирование eiP-2ot ; Са"^ "^ не только не стимулирует, а, наоборот, ингибирует обе активности (258). Главная особенность, роднящая эти две протеинкиназы,состоит в том, что они фосфорилируют один и тот же сериновый остаток малой субъединицы фактора инициации 2, независимо от того, проходит ли это фосфорилирование в грубых лизатах или очищенных системах (94,137,140, 203). Необходимо подчеркнуть, что фосфорилирование обоими репрессорами происходит только в одном сайте фактора (136,140). Участок - 15 фосфорилирования расположен в пептиде с молекулярной массой 4000, легко отщешшщемся от оо-субъединицн фактора при ограниченном протеолизе (367). Способность eip-2 образовывать тройной комплекс прямо зависит от присутствия в его составе этого фрагмента.1.4. Каким образом фосфорилирование eiF-g«t. приводит к остановке трансляции в лизатах ретикудоцитов? При решении этой задачи надо иметь ввиду, что для подавления белкового синтеза в интактных ретикулоцитах или лизатах совершенно необязательно фосфорилирование всего eiP-2 . Трансляция останавли;-.-вается, когда значительная часть (больше половины) этого фактора все ещё остается нефосфорилированной (201). Первый шаг инициации белкового синтеза у эукариот - образование тройного комплекса, в который входят в эквимолярных соотношениях eiP-2, GTP, Met-tRNAj^. Этот комплекс связывается о 40 sсубчастицей рибосомы с образованием 40 s-ишщиаторного комплекса.Новый фактор инициации был обнаружен практически одновременно в нескольких лабораториях. Его обозначали ESP, SP, RP (296, 297, 298, 214, 124), Co-eIP-2B, Co-elP-2C (67, 119, 120, 257), anti-HOI (19), SP (259).Функции всех этих факторов подробно анализированы в обзорах (21, 274, 276).Все они - большие белки сложного полипептидного состава, включающего компоненты с молекулярными массами около 80000, 67000, 58000, 39000 и 26000. Эти факторы, с одной стороны, необходимы для образования 40 S-инициаторного комплекса, а с другой, - способны восстанавливать трансляцию в лизатах ретикулоцитов, инкубированных в отсутствие гемина. Общность полипептидного состава и функций позволила объединить их под общим названием eiP-2B (274).При анализе распределения eiP-2 между рибосомной фршщией, где, вероятно, компартментализован активный фактор, и пострибосомальным супернатантом в клетках асцитной опухоли Эрлиха было показано, что фактор, ассоциированный с рибосомами, намного более фосфорилирован, чем свободный eiP-2 (360). Эти данные указывают на то, что и in vivo фосфоршшрованный eiP-2 менее активен в инициации.1.5. Дефосфорилирование eiF-2o6.Лизаты ретикулоцитов содержат фосфатазу, активно дефосфорилирующую eiP-20C (61, 126, 127, 230, 231, 275), поэтому, чтобы анализировать степень фосфорилирования этой субъединицы in vivo или в грубых лизатах, необходимо проводить работу в присутствии какого-либо ингибитора фосфатазы, например, 50 мМ NaP (360).Установлено, что е1Р-2оСдефосфорилируют фосфатазы I типа (162, 93). Для этих феряентов существуют специфические ингибиторы - два терюстабильных белка, впервые выделенные из мышц кро- 18 лика (58). Добавление одного из этих ингибиторов к лизатам вызывает рост фосфорилирования eiP-2oc и, соответственно, торможение трансляции с характерной кинетикой. Поскольку этот ингибитор in vitro не активировал ни HCI H H D A I , было решено, что блокирование eip--2cO-фосфатазы вызывает быстрое накопление фонового уровня фосфорилирования этого фактора (93).Тшшм образом, биосинтез белка в лизатах ретикулоцитов зависит не только от протеинкиназы, но и от фосфатазы. Регулнру!? активность фосфатазы I типа можно влиять на трансляцию. То, что этот фермент может быть подвержен сложной регуляции, доказывается данными, полученными в гр. Хардести^где бьши очищены два белковых стимулятора фосфатазы, однако функции этих активаторов in vivo и их влияние на трансляцию неизвестны (127).1.6. Фосфорилирование eiF-2/S.Помимо малой субъединицы в составе eiF-2 фосфорилируется еще одна полипептидная цепь. Как правияо, её обозначают eip-2y3 (86, 237, 341), хотя в гр. Хардести eiP-2)^ (127), В настоящее время из-за различий в условиях проведения электрофореза значения молекулярного веса полипептидных цепей, входящих в состав препаратов eiP-2 , полученных в разных лабораториях (207,320)^ не совпадают. Не известно точно даже количество субъединиц этого фактора: 3 (как традиционно считается см. (207) или 2 (51, 227, 314,315).Вдобавок, незначительные примеси протеаз могут существенно модифицировать eiP-2(элиминируется одна из субъединиц фактора, что не влияет на его активность и может быть легко упущено из виду (223), Все это затрудняет идентификацию второй фосфорилирующейоя цепи eiP-2. То, на чем сходятся все исследователи, это:1) фосфорилирование компонента eip-2, отличного от oL-субъединицы, катализирует не HCI и не DAI, а казеиновая киназа II типа или гистоновая кина- IS за, активируемая частичным протеолитическим расщеплением 2) это фосфорилирование никак не оказывается на всех исследовавшихся активностях eiP-2, 1.7. ФосФорилшювание дгоугих Фактотюв иншшадии.Многочисленные данные свидетельствуют в пользу того, что активный биосинтез белка в интактных ретикулоцитах или лизатах сопровождается фосфорилированием следующих факторов инициации: eiP-3 (по двум или трем субъединицам), eiP-4B и, возможно, eiP-5 (35, 86, 105, 106, 107). Эти факторы могут быть фосфорилирован/ы in vitro очищенными казеиновыми киназами (147, 338) (Таб,2), Кроме того, одна высокомолекулярная полипептцдная цепь фактора eiP-3 (130-140 Kd ) может фосфорилироваться цАМФ-зависимой протеинкиназой (170, 231, 337). Влияние.фосфорилирования факторов инициации на трансляцию не установлено. - 20 2.Ф0СФ0РИЖР0ВАНИЕ РИБОСОШОГО БЕЖА S6.В составе эукариотических рибосом более Юлет назад было обнаружено несколько фосфорилированных белков (196) .В силу ряда причин основное внимание исследователей привлекла модификация белка малой рибосом^ной субчастицы S6. Во-первых,этот белок непосредственно взаимодействует с факторомeiP-2 и поли (У) и,значит, участвует в инициации трансляции; во-вторых,степень фосфорилирования S 6 намного превосходит включение фосфата в другие рибосомные белки; в третьих,обработка клеток различными физиологическиактивными веществами приводит к повышению уровня фосфорилирования S 6,что, в ряде случаев, прямо коррелирует с активацией трансляции. Все это дало основания предполагать,что фосфорилирование S 6 может быть непосредственно связано с регуляцией белкового синтеза в клетке.2.1.Что ПРИВОДИТ к изменению степени фосфорижфования s6? БелокS 6 фосфорилируется в основном по сериновым остаткам (68,212,356),причем степень фосфорилирования его в тканях может быть различна (84). На двумерном форезе бывает видно 5 дискретных пятен,соответствующих различному количеству фосфата,вклю1л ченному в этот белок. Увеличение степени фосфорилирования s б можно полу-количественно определить по перекачке окрашенного материала из зоны низкофосфорилированного s 6 в зону высокофосфорилированного зБ,чем и пользуется большинство авторов.Многочисленные агенты,стимулирующие фосфорилирование s б,можно условно разделить на 3 группы. К первой группе относят сАМР и вещества,повышающие внутриклеточную концентрацию сАМР. В ранней работе Гресснера и Вул (132) было показано,что сАМР,дибути- 21 ^льные производные сЖР и глюкагон в три раза увеличивают степень фосфорилирования S6 в клетках печени крысы. Диабет,искусственно вызванный у лабораторных животных и сопроваждающийсявоз^ растанием уровня сАМР в клетках печени, приводит к тому же эффекту, а инсулин снижает включение радиоактивного фосфата в S6 до нормы (133). Необходимо отметить,что повышение уровня оАМР в клетках печени не приводит к изменению тотального белкового синтеза, хотя и может индуцировать образование отдельных ферментов (196).Обработка тимоцитов№,0-дибутирил-сАМР (равно как простагландином EJH конконавалином А) приводит к росту фосфорилирования S 6, причем наблюдаемое увеличение фосфорилирования хорошо совпадает с активацией белкового синтеза, вызванной этими аг:ентами (358).Увеличение степени фосфорилирования белка s 6 под действием сАМР или глюкагона продемонстрировано также и на клетках неЬа (193,194) В последнее время установлена несомненная связь меаду фосфорилированием белка s б и стимуляцией темпов клеточной пролиферации. Такие факторы как инсулин, инсулино-подобный фактор роста, фактор роста эпидермиса, фактор роста тромбоцитов и, наконец, свежая сывортка вызывают быстрое ( в течение первых 5-10 минут) и прасктически исчерпывающее фосфорилирование s 6 (145,193,194, 302,303,327,330,355). Эти агенты относят ко второй группе. Еслй^ связь между фосфорилированием s6, вызванным ciU^, и стимуляцией белкового синтеза прослеживается не всегда, то обработка митогенами как правило ведет к одновременному росту тотального биосинтеза белка и фосфорилирования s6.Многие клеточные процессы, связанные с активацией трансляции^ коррелируют с фосфорилированием s6. К таким процессам можно - 22 отнести переход покоящихся ST3 клеток в стадию активного синтеза G 1(329), стимуляцию секреторной активности клеток (108,109,110), мейотическое созревание ооцитов (143,182,232)^ оплодотворение яиц морского ежа (29), Напротив, торможение белкового синтеза при тепловом шоке в культуре клеток дрозофилы (122) или слиянии фибробластов (197) ведет к дефосфорилированию S6.Интересно, что трансформированные фибробласты, не нуждающиеся в факторах роста, содержат высокофосфоршшрованный ЗбЛри заражении нормальных фибробластов температурочувствительным штаммом вируса саркомы высокий уровень фосфорилирования зботмечали только при пермиссивной температуре. При непермиссивной температуре для поддержания высокого уровня фосфорилирования зб требовалось добавление свежей сыворотки (68).Наконец, третья группа веществ, вызывающих увеличение уровня фосрорилирования S6, включает ингибиторы белкового синтеза, такие как пуромицин, циклогексимид, D -галактозамин и другие (129,131). Заражение клеток НеЬа вирусом осповакцины, сопровождающееся ингибированием синтеза хозяйских белков, также влечет за собой рост фосфорилирования нескольких компонентов 40 s рибосомной субчастицы, в том числе и зб (181).Изучение влияния ингибиторов на фосфорилирование s6 последнее время приостановлено. Считают, что пуромицин и циклогексимид могут блокировать синтез либо фосфодиэстеразы сАМР, либо фосфатазы, специфичной к белку ^6 (131,196).По-видимому, фосфорилирование S6 под действием сАМР или митогенов in vivo осуществляется различными протеинкиназами.Показано, что инкубация клеток печени крысы с инсулином или глюкагоном в обоих случаях приводит к фосфорилированию S6. Однако 3? набор '^р-содержащих триптических фрагментов, полученных как из целых рибосом,так и из чистого S6„ в значительной степени - 23 различен (357).Аналогичным методом показано, что в клетках неЬа включение фосфата в s6, вызванное инсулином и дибутирил-сАМР, происходит в разные участки молекулы белка (194).Недавно установлено, что стимуляция покоящихся ЗТЗ клеток сывороткой ведет не к беспорядочному, а к строго последовательному фосфорилированию разных сериновых остатков в S6 (212).Природа ферментов, фосфорилирующих и дефосфорилирующих s6 in vivo, неизвестна; in vxtrosTOT белок может быть фосфорилирован сАМР-зависимой и сАМР-независимыми протеинкиназаьш (74)и двфосфо«. рилирован щелочной фосфатазой (131).Триптические фрагменты, полученные из белка s6, фосфорилиpoBaHHoroin vivo при добавлении в среду глюкагона, совпадают с фрагментами, полученными с помощью триптического гидролиза этого белка в составе 40 s-субчастиц после фосфорилирования их С-субединицей сАМР-зависимой протеинкиназы in vitro (356).Таким образом, очень вероятно,чшо действие агентов I грутпш непосредственно связано с активацией цАМФ-завиоимой протеинкиназы.Не исключено, что эффект митогенов (2 группа) опосредован цАМФнезависимыми казеиновыми киназами (см.ниже). Данные о том, что при раковой трансформации повышается активность казеиновых кийаз II типа косвенно подтверждают это предположение (48,264). ^ . Как йоаЬорилирование S6 может бнтт. ст^ утяяттп с ЯТГФИТ^Япией трансляции? Показано, что смена сыворотки ведет к сборке полисом в кл. HeLa И ЗТЗ, причем^их составе S6 более фосфорилирован,чем в постполисомальной фракции (82,83,327). Авторы делают выв^д о том, что полисомы в первую очередь формируются из рибосом, содержащих фосфорилированный s6. При обработке клеток ЗТЗ сывороткой, - 24 фактором роста эпителия, простагландином Р2О(У И инсулином процесс сборки полисом всегда коррелирует с фосфоридированием s6 (327).Предполагается, что фосфорилирование S6 требуется только для активации трансляции, но не для подцержания высокого уровня биосинтеза белка» Нильсен и соавт., исследовавшие фосфорилирование S6 при созревании ооцитов Xenopus laevis, придерзкиваются такой же точки зрения, однако, на наш взгляд, для доказательства этой гипотезы пока еще накоплено недостаточно экспериментального материала.По-видимому, образование полисом из рибосом - единственный известный в настоящее время процесс, который может зависеть от фосфорилирования S6. Попытки обнаружить влияние этого фосфорилирования на другие реакции биосинтеза белка потерпели неудачу.Например, 40 s-субчастицы, содержащие фосфорилированный и не фосфорилированный S6, с равной эффективностью связывают инициаторную Мет-тРНКф и вторую аминоацил-тЕНК (валиновую) • В очищенной бесклеточной системе рибосомы, включившие в свой состав фосфорилированные 40 S-субчастицы, транслируют природные и синтетические матрицы с такой же эффективностью, что и не фосфорилированные по s6 рибосомы (198), Известно, что обработка клеток циклогексимидом стимулирует образование полисом (37, 83, 118, 155, 365); с другой стороны, ЦГЙ вызывает фосфорилирование s6. Не исключено, что рост фосфорилирования этого белка происходит не вследствие подавления синтеза фосфатаз и фосфодиэстераз, как принято считать, но служит условием агрегации рибосом на 1лИЖ. Для того чтобы понять, какие функции рибосомы может менять фосфорилирование S6, необходимо четко локализовать его на рибосоме и определить парциальные реакции трансляции, в которых он участвует. Установлено, что 3 6 не взаимодействует ни с 5,8s - 25 рЕНК (343), ни с тРНК (инициаторной или элонгаторными) (344) иммобилизованными на Сефарозе-4В. В то же время было показано, что белок этот, по-видимому,принимает участие в инициации трансляции, поскольку он ковалентно сшивается с фактором elF -2 (334), а антитела против S6 блокируют связывание тройного комплекса (eiF-2* G T B •Met-tRNAj^ )c Р-участком 40s бубчастицы (44) и сшивку s6 с eIF-2 (334).Обобенно большое сродство ^6 проявляет к пож (У) (324.325, 334), сохраняя способность взаимодействовать с ней даже в 6 М мочевине (325), Этот белок в составе малой рибосомной субчастицн может быть сшит с поли (У) с помощью ультрафиолета (325), причем поли(УЬ в свою очередь, защищает s6 от сшивок с другими рибосомными белками (324).Частично очищенный препарат аминоацил-тРНК-оинтетаз, полученный с помощью аффинной хроматографии экстрактов печени и матки мыши на тРНК-сефарозе, способен фосфорилироваться цАМФ-независимой цротеинкиназой, присутствующей в этих тканях (36), В результате фосфорилирования активность 12 аминоацил-тИЖ-синтетаз (группа I) в разной степени уменьшалась, а 5 (группа 2) - увеличивалась. Обработка ферментов щелочной фосфатазой полностью или частично нивелирует эффект фосфорилирования.Установлено, что эстрадиол вызывает изменения активности аминоацил-тЕНК-синтетаз in vivo , которые, в общем, коррелируют с уровнем включения в их состав радиоактивного фосфата, что свидетельствует о возможном использовании такой регуляторной системы в клетке.Недавно в лаборат^ории Коэна было показано, что 5 аминоацилтРНК-синтетаз из группы I (метиониновая, лейциновая, изолейциновая, лизиновая и аргининовая) инактивируготся после фосфорилирования их Са"^- и цАМФ-незавиовмой протеинкиназой в грубом экстракте клеток печени крысы. Опыты проводили в присутствии 70 Ш NaF, добавляемого в качестве ингибитора эндогенных фосфатаз (66).Таким образом, несмотря на то, что фосфорилирование аминоацил-тРНК-синтетаз мало изучено, оно может рассматриваться как возможный способ регуляции активности. Дальнейшие исследования должны более четко обрисовать место, которое занимает фосфорилирование этих ферментов в общей схеме регуляции трансляции. - 27 Б. ВЗШШШ. ОБМЕН СВОБОДНЫХ РНК-СВЯЗШАЮЩИХ И ИНФ0РМ0С01ШЫХ БЕЖОВ - ВЕРОЯТНЫЙ МЕХАНИЗМ РЕГУЛЯЦИИ ЭКСПРЕССИИ мРНК К настоящему времени сложилась общепринятая точка зрения о том, что вся мРНК (вплоть до насцентных молекул прочйРНК, синтезирующихся в ядре (38,85,153) существует и функционирует только в комплексе с белками (253,308,309,310). Природа этих белков, равно как и биологическая роль информосомной организаоди мРНК до сих пор не изучены, что в первую очередь связано с методическими трудностями, возникагощигли при выделении препаративных количеств нативных информосом (3). В 1978 г. А.С.Спириныгл была выдвинута гипотеза "omnia шеа mecum porto" (309), согласно которой мРНК на всех стадиях жизненного цикла несет на себе белки, необходимые для функционирования в каждом внутриклеточном компартменте. Так, в составе ядерных информосом должны присутствовать белки процессйнга про-мРЖ и транспорта мРНК в цитоплазму; среди белков свободных цитоплазматических информосом могут находится репрессоры трансляции, удерживающие мРНК в функционально неактивном состоянии, а полисомосвязанные информосомы должны содержать белки, необходимые при трансляции мРНК. Эта гипотеза не исключает возможности существования белков, перманентно находа 1ЦИХСЯ в составе частиц и необходимых, к пршлеру, для подцержания ИХ структуры.В 1968 г. в лаборатории А.С.Спирина были обнаружены свободные РНК-связывающие белки (8). Предполагалось, что они представляют собой фонд информосомных белков, не взаимодействующих в данный момент с мРНК. В дальнейшем, эти представления подтвердили экспериментальными данными, включающигли: I) коэлектрофорез сво- 28 бодных РНК-связывающих белков и белков янформосом, 2) иммунохимический перекрест свободных РНК-связывающих белков и белков полис омосвязанных информосом, 3) инъекцию меченых РНК-связывающих белков в ооциты аглфибий и доказательство их информосомообразующей функции in vivo (253,308,310).По-видшлому, "переодевание" мРНК при переходе ее из ядра в цитоплазму и, далее, в полисомы происходит путем взшшного обмена белков информосом и свободных РНК-связывающих беш^ов. Таким образом, состав, размер и доступность пула РНК-связывающих белков выступают дополнительными факторами регуляции трансляции в эукариотических клетках.Гипотеза А.С.Спирина,предполагающая ключевую роль белкового окружения мРНК в регуляции трансляции, была выдвинута около 5 лет назад. За это время получены экспериментальные подтвервдения общих положений гипотезы и указания на молекулярные механизмы постулированных процессов. - 29 I. НЕКОТОРЫЕ БЕЛКИ ИНФОРМОСОМ ПРИСУТСТВУЮТ В щ^топмамЕ в СВОБОДНОМ состоянии Опыты по инъекции радиоактивно меченых РНК-связывающих белков в ооциты амфибий однозначно доказывают, что часть этих белков включается в состав информосом in. vivo (88), Однако до сих пор остается не выясненныгл вопрос о том, какие именно индивидуальные белки, входящие в состав гетерогенной фракции РНК-связывающих белков, обладают информосомообразующей фушщг^ей в ооцитах аглфибий.В последние годы появились сообщения об идентификации некоторых белков, обнаруживающихся в составе мРНП и в свободном состоянии в цитоплазме. Они могут быть выделены из клеточных экстрактов в составе суммарной фракции РНК-связывающих белков с помощью аффинной хроматографии на ковалентно иммобилизованных полинуклеотидах.(7,9,239).Б лаборатории Шера обнаружен и ввделен из цист Artemia salina МОНОМернЫЙ белок HD -40 ( helix-destabilizing protein ) С молекулярной массой около 40 ка , характеризующийся высоким содержанием глицина и имеющий в своем составе необычную алшнокислоту диметиларгинин. HD -40 связывается с одноцепочечными нуклеиновыми кислотаг,5и (преимущественно с РНК), защищая их от действия нуклеаз. Показано, что этот белок снижает степень спирализации искусственных односпиральных полинуклеотидов поли(А), поли(О), поли (У) и природных нуклеиновых кислот (РРЖ фага MS2 и ДНК фага f XI74). В условиях низкой ионной силы (25-50 мМ NaCi ) HD -40 способен предотвращать образование дуплексов типа поли(А):поли(У) (213,235). Добавление HD -40 в бесклеточную систему ингибирует белковый синтез (213). Тома и соавт. установили, - 30 что этот белок является одним из основных структурных компонентов ядерных ЗОзРНП из Artemia salina (328).Данные лаборатории Шера были подтверждены результатами двух независимых работ (73,112), в которых показано присутствие белка, аналогичного Ш)-40, в свободных цитоплазматических информосомах Artemia saiinafl ядерных информосомах из мозга крысы.Благодаря необычному аминокислотному составу идентификация этого белка в составе частиц могла быть проведена достаточно надежно.В ряде работ показано, что пул ядерных и цитоплазматических РНК-связывающих белков может перекрываться; во всшсом случае, часть цитоплазматических белков способна принимать участие в формировании адерных информосом. Не исключено, что H D - 4 0 является одним из таких белков. Недавно де Хердт и соавт. установили, что выделенный из свободных цитоплазматических информосом но-40 после инъекции в ооциты Xenopus laevis накапливается в ядрах ооцитов (72).Участие цитоплазматических РНК-связывающих белков (наряду с ядерными компонентами) в образовании ядерных информосом доказывается данными Сузуки. Показано, что добавление белков цитозоля к изолированным ядрам клеток печени крысы, синтезирующим РНК,стимулировало транскрипцию и включение новосинтезированной РНК в РНП с плавучей плотностью в CsCi 1,36-1,37 г/см^ (317).Характерной особенностью большинства эукариотических мРНК, отличающей их от прокариотических матриц, является наличие в их составе (на 5'-конце) 7-метилгуанозина, связанного 5-5 фосфодиэфирной связью со следующт4 нуклеотидом, который, в свою очередь, тоже метилирован, но по 2 -положению. Иногда и третий нуклеотид бывает метилирован по 2 -гидроксильной группе рибозы. Подобная - 31 структура называется "кэпом". Функции кэпа в настоящее вреью неизвестны, однако есть основания предполагать, что он принимает участие в регуляции трансляции (30,104). При заражении клетки полиовирусагли (содержащими некэпированные мРНК) происходит подавление трансляции кэпированных матриц как хозях^ских, так и экзогенных (в случае суперинфекции другими вирусами с кэпированныМй мРНК) (154,336).Во всех исследовавшихся эукариотических клетках обнаружены свободные кэп-связывающие белки (СВР, сар-binding proteins ).Эти белки, по-видимому, участвуют в инициапди трансляций кэпированных матриц и не требуются для экспрессии мРНК, не содержащих кэпа. Кэп-связывающР1е белки могут быть выделены из 0,5 М КС1-смы7 ва с рибосом с помощью аффинной хроматографии на m ТДФ-сефарозе (96,305,318); при этом оказалось, что они существуют в двух формах. С5ВР I имеет молекулярную массу 24000 и способен специфически взаимодействовать с кэпом мРНК, причем аналоги кэпа ( m'ГДФ И ^'ТИШ) подавляют связывание. Показано, что СВР I в виде минора присутствует в препаратах очищенных факторов eIP-3 и eIP-4B (304,306). Этот белок способен стимужровать трансляцию кэпированных мРНК, но не восстанавливает их трансляцию в экстрактах клеток, зараженных полиовирусом (305,307,318,369).Обеими этими активностями обладает СВР П - высокомолекулярная форма кэп-связывающих белков, имеющая коэффициент седиментации 5-7 S или даже 8-10 s (318). В ее состав входят полипептидные цепи с молекулярныгли массаг/д 210, 160, 80, 50, 28 и 24 к<а, причем р24 соответствует СВР I, р50 - eIP-4A, а р80 - eIP-4B (96,274). Интересно, что все компоненты СВР П имеют общие антигенные детерминанты, поэтому не исключено, что они представляют собой продз'кт ограниченного протеолитического расщепления высоко- 32 молекулярной субъединицы р210. Возможность деградации материала при выделении, по-видимому, следует исключить, поскольку очистку СВР П проводил!'! в присутствии ингибиторов протеаз. При полиовирусной инфекции происходит инактивация СВР П (199), что может быть связано с протеолизом р210 (96).Если для связывания р24 с кэпом мРНК не требуется дополнительных условий, то другие компоненты СВР П ковалентно сшиваются с кэпом только Б присутствии АТФ, причем нерасщепляемые аналоги АТФ или Т'Ш практически неактивны (96,134). При этом kW не увеличивает связывания индивидуального eIP-4A или eIP-4B с 9 s глобиновой мРНК; стимулирующий эатфект появляется только при объединении этих факторов.Свободные цитоплазматичесгше информосомы содержат полипептидные цепи (р78 и р43), взаимодействующие с моноклональными антителагли против СВР I, в то время как в полисомосвязанных информосомах их не обнарушвают (50). Этот р78 отличен поли (А)-связывающего белка, такке обнаруженного в свободных информосомах и обладающего близкой молекулярной массой (см. ниже), поскольку последний не дает антигенного перекреста с СВР I.В сшшх полисомах токе есть белок (р43-р50), который обнаругшвает антигенное родство с р24 (50,369). С помощью игшунофлуоресцентной микроскопии было показано, что этот белок присутствует такке и в цитоскелете клеток BHK-2I (369) и мокет обеспечивать прикрепление полисом к цитоскелету.Пока не установлено, имеют ли клеточные РНП и комплекс СВР П общие субъединицы или только фрагменты полипептидных цепей, несущие антигенные детерминанты. В любом случае, компартментализация белков, родственных СВР, на РНК представляет большой интерес с точки зрения регуляции белкового синтеза на уровне - 33 трансляции.С начала 70-х годов стали появляться работы, касающиеся присутствия белка с молекулярной массой 73-78 Шв составе поли (А)-содержащих полисомосвязанных информосом. В настоящее вреыя накоплено большое количество данных, доказывающих, что этот белок ассоциирован с поли(А)-фрагментами ядерных и полисомосвязанных информосом, выделенных из разных тканей: клеток Hela (42,186,267,287), мышиных L -клеток (42,128), эритробластов утки (15,347), клеток мышиной лимфомы (229), клеток асцитной опухоли Эрлйха (345,346), ретикулоцитов кролика (254,285), мышечной ткани эмбрионов цыпленка (175,176), печени кролика (218). В лаборатории Шеррера установлено, что этот белок одинаков в эритробластах утки, мыши и кролика, то есть он относительно консервативен, по крайней мере, в клетках позвоночных (311). р73-78 действительно присутствует в составе поли(А)-блоков полисомосвязанных информосом, а не соочищается с этими частицами, что доказывается опытаьш по нативной фиксации мРНП (содержащих радиошстивную мРНК) с помощью ультрафиолетового облучения (128, 346). Исчерпывающий нуклеазный перевар фиксированных информосом и последующий электрофоретический анализ входивших в их состав белков (несущих отдельные небольшие фрагменты радиоактивной мРЖ, недоступной для рибонуклеаз) показал, что белки с молекулярной массой 73-78 Кд действительно взашлодействуют с поли(А)-з'частками частиц.Известно, что поли(А)-связывающий белок с молекулярной массой около 78 Kd можно выделить из безрибосомных экстрактов печени кролика или крысы с помощью афинной хроматографии на поли(А)-се- 34 фарозе (или поли(У)-сефарозе) (113,218,289,348). Этот белок обладает настолько большим сродством к поли(А), что может быть элюирован с аффинной колонки только с помощью bOfo формамида (218). Было показано, что свободный р78 идентичен поли(А)-связывающему бежу из полисомосвязанных информосом по электрофоретическим свойствам и аминокислотному составу, Таким образом, многие эукариотические клетки содержат поли(А)-связывающий белок с молекулярной массой 73000-78000 как в составе ядерных и полисомосвязанных информосом, так и в свободном состоянии. Необходимо отметить, что свободные цитоплазматические информосомы, по-видимому, лишены этого белка (см. ниже в гл. Б.2). Функпии поли(А)-связывающего белка до сих пор неизвестны. В ранней работе Швартца и Дарнелла (287) было заглечено, что остановка синтеза РНК и поли(А) с помощью З'-дезоксиаденозина ведет к исчезновению р75 из поли(А)-рибонуклеопротейдов, Авторы считают, что этот белок связывается только с новосинтезированными поли(А)-участками и играет какую-то роль в транспорте мРНК из ядра в цитоплазму.Интересны данные, полученные Роуз и др., касающиеся антигенного родства р75 из ядерных и полисомосвязанных информосом и поли(А)-полимеразы из клеток Hela (267). Однако существенное различие молекулярных масс обоих белков (75000 и 60000 соответственно) , а так же отсутствие каких-либо подтверждений полученных результатов оставляют открытым вопрос о биологической значимости обнаруженного антигенного перекреста.Недавно в лаборатории Агола был обнаружен и очищен до гомогенности поли(А)-связывающий белок с молекулярной массой около 80000. Этим белком оказалась РНК-зависимая АТР-аза (12,53), участвующая, по предположению авторов, в трансляции нативных - 35 матриц, В таком случае обнаруженный фермент мог бы входить в состав йнформосом, однако экспериментальные доказательства этого пока отсутствуют, По-видимому, р73-78 не единственный белок, способный взаимодействовать с пож(А)-блоками мРНК in vivo (14,177), Не исключено, что с поли(А) связаны полипептиды с молекулярными массами около 52000 (31,42,229,289), 86000 (186,345), 47000 (348) И 64000 (175), однако эти белки изучены значительно xyse.Любопытным коьшонентом свободных цитоплазматических и полисом освязанных йнформосом является большой Т-антиген вируса SV-40, необходимый для начала репликации вирусной ДНК (183), В составе Т-антигена, выделенного из клеточных экстрактов с помощью аффинной хроматографии присутствует РНК сложного нуклеотидного состава, включающая поли(А)-блоки (183). Было предположено, что in vivo этот белок связан с мРНК, Действительно, цитоплазматическая фракция Т-антигена (составляющая 1С^ от его общего количества) обнаруживается как в свободных, так и в пожсомосвязанных информосомах клеток cv -i, зараженных вирусом SV -40, Ддерный Т-антиген (составляющий остальные 9С^), добавленный перед фракционированием, не связывается с мРНП. Значение такой компартментализации Т-антигена неизвестно, однако предполагается, что присутствие его в клеточных мРНП способно влиять на экспрессию хозяйских и вирусных матриц (224,225).Интересные результаты получены в лаборатории Овчинникова при исследовании внутриклеточной локализации фактора элонгации белкового синтеза Ш-1, Было показано, что он обладает неспецифйческой РНК-связывающей активностью (240,350), что позволяет - 36 быстро выделять этот фактор в составе прочих РНК-связывающих белков ретикулоцитов кролика на РНК-сефарозе. При фракционировании экстрактов ретикулоцитов в сахарозном градиенте в условиях низкой ионной силы значительная часть (около ЗС^) этого фактора обнаруживается в составе полирибосом. Такая локализация EF-I, по-видимому, обусловлена его РНК-связывающей способностью, поскольку добавление в экстракт экзогенной РНК уводит фадтор из полисом. После диссоциации полисом с помощью ЭДТА фактор сопутствует, в основном, 60S субчастице. При повышении ионной силы до 0,1 М KCI EP-I обнаруживают в зоне седиментации полисомосвязанных информосом и свободного белка. Авторы считают, что фактор EP-I создает подвижное "облако" вокруг полисом, то есть в районе своего непосредственного функционирования (2).Еще одним белком, обнаруживающимся как в свободном виде, так и в составе рибонуклеопротеидных частиц является сАМР-независимая протеинкйназа. Идентификация РНК-связывающей протеинкиназы, доказательство ее информосомообразующей функции in vivo и выяснение биологической роли фосфорилирования информосомообразующих белков в значительной степени составило предмет нашего экспериментального исследования и будет подробно разобрано ниже.В заключение надо сказать, что почти все цитированные работы выполнены с препаратом информосом сомнительной чистоты, вероятно содержащим примеси свободных клеточных белков. Для окончательной проверки информосомообразующей функции каждого конкретного белка нужно выработать подходы, дающие более четкие результаты, чем попытки препаративного вьзделения информосом и поиска в их бежах ферментативных активностей. Таким подходом, - 37 В частности, является предложенный Елизаровым и Степановым (88) метод инъекций радиоактивных РНК-связывающих белков в ооциты и дальнейший анализ их внутриклеточной локализации in vivo , Тем не менее, нельзя не принимать во внимание результатов изложенных выше работ, поскольку большинство из них нашло независиглое подтверждение данными других авторов. Идентификация индивидуальных компонентов информосом и РНК-связывающих белков, безусловно, конкретизирует наши представления о пост-транскрипционной регуляции экспрессии мРНК. В следующей главе мы попытаемся проанализировать результаты последних работ, касающиеся смены белков информосом при переходе частиц из свободного состояния в полисомы. - 38 2. СВОБОДНЫЕ ЩТОПДАЗМТИЧЕСКИЕ И ПОЖСОМОСВЯЗАНШЕ ИНФОРМОСОШ СОДЕРЖАТ РАЗНЫЙ НАБОР БЕДКОВ Проблема сравнительного анализа белкового состава информосом разной внутриклеточной локализаоди привлекает внимание исследователей с момента открытия этих частиц. Полученные к 1980 г. результаты (суммированные в обзорах 253,308,310) указывают на то, что в состав трех классов информосом входят разные белки. Однако если в отношении ядерных и цитоплазматических мРНП этот факт не вызывает сомнений, то смена белков цитоплазматических информосом при переходе их из свободного состояния в полисомы во многом оставалась гипотетичной.За последние годы в нескольких лабораториях были получены данные, свидетельствующие в пользу "переодевания" мРНК и на этом этапе функционирования матрицы. Так, электрофоретический анализ белков свободных и полисомосвязанных информосом, выделенных с помощью нескольких центрифугирований в градиенте концентрации сахарозы из эритробластов утки, выявил значительную разницу в белковом наборе этих частиц (347,348). Днсейн и соавт. исследовали полипептидный состав свободных и полисомосвязанных поли (А)-содержащих мРШ, выделенных методом хроматографии на олиго-dT-целлюлозе из печени крысы, ретикулоцитов кролика и клеток асцитной карциномы Эрлиха. Во всех случаях полисомосвязанные информосомы содержали всего 3 основных коглпонента: 52000, 58000 и 78000, в то время как свободные частицы имели намного более сложный белковый состав, зависящий от объекта выделения (174,175). Джонсон и Илан предприняж аналогичную попытку прямого электрофоретического сравнения белков свободных и полисомосвязанных поли(А)-содержащих информосом, выделенных из клеток - 39 печени петуха с помощью олиго-аТ-целлюлозы (180). Белки одного типа частиц метили in vitro радиоактивным иодом и после коэлектрофореза по О'Фарреллу сравнивали их с белками других частиц, окрашивая последние с помощью азотнокислого серебра. Авторы обнаружили, что из 27 полипептидных цепей 15 - общие для обоих типов частиц, 7 - специфичны для полисомосвязанных и 5 - для свободных информосом, в работе (50) Чакраборти с соавт. сравнивали полипептидный состав свободных и полисомосвязанных мРНП из мышц зародышей цыпленка. Оказалось, что полисомосвязанные м Р Ш имеют в своем составе более бедный набор белков, чем свободные частицы. Было показано, что в составе свободных РНП содержатся полипептидные цепи, реагирующие с моноклональными антителами против GBP-I (см. Б.1.), в то время как в полисомосвязанных м Р Ш их нЬт.Данные Гринберга (128) свидетельствуют о том, что полисомосвязанные информосомы представляют собой динамическую структуру, непрерывно обогащающуюся новосинтезированными белками цитоплазмы (свободными РНК-связывающими белками?), В мышиных L-клетках с помощью актиномицина Д был заблокирован синтез Р Ж ; при этом продолжали синтезироваться белки, сшивающиеся с предсуществующигли поли (А)-содержащими полисомосвязанными м Р Ш при ультрафиолетовом облучении. К З'-концевой поли(А)-последовательности пришивался только один белок 78000, а к остальным участкам мРНК - еще несколько белков (98000, 78000 - но, судя по пептидным картам, другой, не тот, что взаимодействует с пож (А)-блоками мРНК, 68000, 62000 и 52000). К достоинствам работы принадлежит максимально нативный способ фиксации Р Ш (217). Интересно соотнести результаты этой работы с данными Степанова и соавт. (II), говорящими о том, что актиномицин Д - 40 ПОЛНОСТЬЮ ингибирует включение радиоактивно меченых РНК-связывающйх белков в свободные цитоплазматические информосомы, после инъекции этих белков в ооциты Rana temporaria.Ms двух работ следует вывод о том, что новосинтезируемые белки, пришиваемые к мРНК, по-видимому, специфичны для полисомосвязанных информосом.Данные о разном полипептидном составе свободных и полисомосвязанных мРНП, содержащих глобиновую матрицу, приводятся в работе Шмидта и др. (285). Сообщается, в частности, что поли(А)связывающйй белок р76 присутствует в 48s -инициаторном коглплексе и в полисомосвязанных информосомах, в то время как в свободных информосомах он не обнаруживается. Вообще, в настоящее время накоплено большое количество данных, заставляющих считать поли(А)-связывающий белок р73-78 компонентом ядерных и полисомосвязанных, но не свободных цитоплазматических информосом (186,229,254,301,311,345,346,347). Тем не менее, в группе Саркар (175,176) обнаруживают р78 в составе поли(А)-блоков как свободных, так и пожсомосвязанных информосом из мышц зародышей цыпленка. Не исюючено, что присутствие в препарате информосом другого белка с аналогичным молекулярным весом (50,128) может влиять на полученные результаты.Суммируя все изложенное, можно заключить, что пожсомосвязанные информосомы значительно отжчаются от свободных цитоплазматических информосом по пожпептидному составу. Значения молекулярных масс для белков обоих типов информосом, приводимые в большинстве цитированных работ, обнаруживают мало сходства между собой и поэтому мы их практически не анализировали. Эти данные кажутся мало информативными, поскольку, в первую очередь, зависят от чистоты полученного препарата информосом, а во вто- 41 рую - от чувствительности выбранной электрофоретическои системы, явно не одинаковой во всех работах. Очевидно, пока можно говорить лишь о принципиальном различии в белковом составе информосом разной внутриклеточной локализации. Относительно какого-либо индивидуального информосомообразующего белка (за исключением, может быть, р73-78) окончательные выводы делать превдевременно.42 3. СВОБОДНЫЕ ВДТОПМЗЖТШЕСЖИЕ ШФОРМОСОМЫ СОДЕРМТ РЕПРЕССОР ТРАНСЛЯЦИИ, ОТСУТСТВУЮЩИЙ В ПОДИСОМОСВЯЗАБНЫХ ИНФОРМОСОМАХ Шогие эукариотические клетки содержат некоторое количество репрессированной мРНК. Эта мРНК либо совсем не транслируется, либо транслируется с низким выходом белка, явно не соответствующим количеству матрицы, содержащейся в клетке, и не совпадающим с тем количеством продукта, которое может быть получено при транслявди соответствующей мРНК в бесклеточной системе. Если выделить трансляцйонно активную мРНК из пожрибосом и нетранслируемую мРНК из безрибосомного экстракта, получить продукты обоих фракций мРНК в бесклеточной системе и количественно (или полуколичественно) сравнить выход этих продуктов с помощью двумерного электрофореза или иммунологическими методами, то можно заметить, что каждая мРНК имеет свое собственное распределение между полисомами и супернатантом. Этим способом было продемонстрировано существование значительного количества трансляцйонно неактивной мРНК в клетках печени (190,366), асцитноы опухоли мыши (185,211), ооцитах Xenopus laevia (28), зародышах морского ежа (26,166,195), ретикулоцитах лягушки (294,295), моллюске Spisula solidissima (270), Грибе Dictyostelium discoidemi (18) и в развивающихся тканях млекопитающих (121,238,276).В настоящее время доступность методов генной инженерии, в частности, получения кДНК, сделало возможным тестирование мРНК непосредственно во фракциях сахарозного градиента. Такой подход был применен в лабораториях Шафритца (291,363,364), Бравермана (365) и Хейвуда (78).Независимо от использующихся методов анализа мРНК было показано, что in vivo как в развивающихся, так и в специализированных клетках большое количество матриц находится под трансляционным контролем.Например, Ре t вызывает всплеск синтеза ферритина на предсуществующих матрицах в ретикулоцитах головастиков лягушки-быка (294,295,366). Экспрессия альбуминовой мРНК в клетках печени крысы (291,363,364) и мРНК для 4 неидентифицированных пептидов в клетках мышиной саркомы (365) зависит от наличия свободных аш1нокислот, необходимых для биосинтеза белка.В настоящее время считается доказанным, что репрессированная мРНК существует в комплексе с белками в виде информосом (25,253,254,274,308,309,310). Для ряда объектов:эритробластов утки (54,215), печени крысы (234), яиц морского езка (178), клеток семенников форели (300) и мышиной саркомы (37) показано, что свободные информосомы неактивны в оесклеточной системе биосинтеза белка, в то время как экстрагированная из них м Р Ж равно как и полисомосвязанные информосомы из этих объектов способна нормально транслироваться. Главным образом на основании этих опытов часто делается вывод о том, что существует некий функциональный класс информосом, никогда не попадающих в полисомы (37,118,348). На салшм деле стационарные условия in vitro в гомологичной (а чаще гетерологичной) бесклеточной системе не могут отражать различные функциональные состояния живой клетки, связанные, по-видимому, с необходимостью диф^}еренциальной экспрессии разных информосом. Результаты Тэйла и соавт, указывают на то, что в ранних ретикулоцитах кролика мРНК для фермента липоксигеназы находится в репрессированном состоянии в виде свободных цитоплазматических информосом, не активных в гетерологич- 44 ной бесклеточной системе. Эта мРНК способна активно транслироваться на более поздних стадиях развития ретикулоцитов (326).Красивые опыты Хавараниса и Хейвуда показали, что мРНК для тяжелой цепи миозина репрессирована в миобластах и способна транслироваться в дифференцированных мышечных волокнах. Информосомы, содержащие эту радиоактивно меченую мРБК^выделяли из миобластов и заключали в липосомную оболочку. В таком виде они проникали в мышечные волокна, где их и обнаруживали в составе полисом (151).Таким образом, несмотря на то, что в некоторых тканях показано существование устойчивой и длительной репрессии мРНК (165,348), явно преждевременно делать вывод о том, что эта м Р Ж никогда не будет транслироваться.Каков же механизм избирательной репрессии или активации мРНК? В настоящее время существует по меньшей мере два объяснения этих процессов. Репрессию отдельных матриц в эукариотических клетках, в принципе, можно объяснить различной способностью мРНК конкурировать за какой-либо лимитирующий компонент аппарата трансляции (26,45,46,123,158,260,269,351), например, за факторы eIP-2, eIF-4A или СБР-П. Эти исследования пока только начинаются и проводятся в модельных системах, содержащих не больше 2 разных мРНК (из которых одна чаще всего вирусной природы). Объяснение регуляции трансляции только с этих позиций заставляет предположить невероятно сложное иерархическое распределение матриц по их сродству к разным факторам трансляции. Тем не менее, нельзя исключить возможность реализации такого механизма при некоторых клеточных процессах, происходящих, например, при вирусной инфекции.Чтобы устранить влияние различной конкурентной способности мРНК на экспрессию матриц, в лаборатории Бравермана пршленили циклогексимид (37,118,365). Этот агент замедляет элонгацию и не - 45 влияет на инициацию; в результате, даже те матриш, которые имеют меньшее сродство к инициаторному комплексу, поступают в аппарат трансляции (ср.83,155). Тем не менее в безрибосомном экстракте остаются свободные информосомы. Авторы считают, что в их составе присутствует репрессор трансляции.Вообще, наличие в составе информосом специфического репрессора трансляции белковой или нуклеиновой природы служит альтернативным объяснением явления маскирования мРНК. Многочисленныг^ш опытами (37,54,178,300,326) показано, что депротеинизация тотальной клеточной мРНК ведет к повышению ее активности в бесклеточной системе, причем трансляционная активность тем больше, чем больше белков диссоциировало от мРНК. С другой стороны, известно, что многие цитоплазматические свободные информосомы содержат в своем составе "малые" РНК, способные ингибировать белковый синтез в бесклеточной системе (22,90,189,206,209,261,281,282). Пока нельзя точно сказать какой именно компонент информосом - белок или "малая" РНК - ответственен за поддержание матрицы в маскированном состоянии. Не исключено, что информосомы разных тканей содержат разные репрессоры (например, в информосомах из печени крысы или мышц зародышей цыпленка это "малые" РНК, а в ретикулоцитах птиц и млекопитающих - информосомные белки). Это тем более вероятно, что "малые" РНК обнаружены не во всех исследовавшихся свободных информосомах.Выше было отмечено, что полисомосвязанные информосомы (в отличие от свободных мРНП) способны активно транслироваться в бесклеточной системе. Принимая во внимание данные, касающиеся разного белкового набора этих частиц, можно заключить, что активация мРНК связана с диссоциацией от нее репрессора трансляции (или присоединением дерепрессора, что менее вероятно). В любом случае, 46 даже если непосредствешшй репрессор является "малой" РНК, трудно представить себе процессы маскирования-демаскирования матрицы без участия белков информосом. Значит, вероятнее всего, при переходе мРНК из репрессированной формы в активную происходит смена взаимодействующих с ней белков. Она состоит, как минимум, в диссоциации репрессора трансляции, а, как максимум, в полном "переодевании" мРНК. Белки, не ассоциированные в данный момент с мРНК, находятся в цитоплазме клеток в свободном состоянии. По-видимому, in vivo должен существовать механизм, регулирующий обмен свободных РНК-связывающих белков и белков информосом при перемене последними своей внутриклеточной компартментализации.В настоящее время известно, что информосомные белки фосфорижруются in vivo и in vitro . ПОСКОЛЬКУ фосфорилирование может служить механизмом "переодевания" мРНК, следующую главу мы посвятили анализу этих данных.47 4. ФОО^ОРИЛИРОВАНИЕ БЕЖОВ ЖФОРМОСОМ Первые сообщения о том, что белки информосом могут фосфорилироваться1п vivo, появились около 10 лет назад. Было показано, что часть белков ядерных информосом из мозга (111,114,115) и печени крысы (288) а также полисомосвязанных информосом из эритробластов утки (116,228) и клеток НеЬа (20) содержит в своем составе фосфатные остатки. Приведенные в этих работах молекулярные веса фосфорилированных полипептидов практически не совпадают между собой, Гораздо больший интерес представляют данные о том, что в составе информосом разных тканей наряду с субстратами фосфорилирования присутствуют также и протеинкиназы. Одними из первых появились работы, выполненные на клетках неЪа (41,244). Было показано, что протеинкиназная активность сопровождает информосомы, содержащие гяРНК, при седиментации (и реседиментации) в сахарозе и в метризамиде. Эта сАМР- и Са "^ '^-независимая протеинкиназа модифицирует как сериновые, так и треониновые остатки в молекулах субстратов, использует АТФ намного (в 15 раз) лучше ГТФ и фосфорилирует казеин в 4 раза эффективнее гистонов. С помощью гельфильтрации на Сефадексе G-200 установлено, что молекулярная масса обнаруженного фермента лежит в районе 48000. Авторы считают, что эта протеинкиназа принадлежит к классу ядерных казеиновых киназ I типа (N 1)(о классификации протеинкиназ см,ниже, в главе Б.5). Однако на основании полученных ими данных нельзя сделать такого определенного вывода. Описанные свойства фермента позволяют с равной степенью вероятности отнести его как к первому, так и ко второму (н П) типу. Полученные противоречивые результаты могут указывать ж б о на присутствие в информосомах фер48 ментов обоих типов, либо на загрязнение информосом свободными ядерныгли белками, содержащшли протеинкиназные примеси.В работе Бага и Селлза содержатся указания на присутствие в свободных цитоплазматических информосомах из мышц зародышей цыпленка сАГДР-независимой протеинкиназы и субстратов фосфорилирования, но не делается попытки идентифицировать обнаруженный фермент (23).Наиболее четко (по всем известным признакам) в составе свободных цитоплазматических информосом ретикулоцитов была идентифицирована казеиновая киназа П типа (263). Выделение информосом проводили с помощью последовательных центрифугирований в градиентах сахарозы и метризамида. Было продемонстрировано хорошее совпадение между информосомными белками, фосфорилируемыми эндогенным ферментом и казеиновой киназой П типа, ввделенной из цитоплазмы ретикулоцитов. Напротив, казеиновая киназа I типа фосфорилирует другие полипептидные цепи из числа информосомных белков, а сАМР-зависимая протеинкиназа вообще не активна.Протеинкиназа казеинового типа, способная использовать как к'ЛФу так и ГТФ, была обнаружена в свободных цитоплазматических и полисомосвязанных поли (А)-содержащих информосомах, ввделенных на олиго-d Т-целлюлозе из клеток мышиной плазмоцитомы (87). Этот препарат информосом содержал также протеинкиназу гистонового типа. Как всегда, остается непонятным, является ли это следствием загрязнения информосом, или гистоновая протеинкиназа, как и казеиновая, действительно входит в состав мРНП. В работе Карделли и Пито полисомосвязанные информосомы получали с помощью хроматографии на олиго-(аТ)-целлюлозе и центрифугирования в метризамидных градиентах (48), Несмотря на то, что выделенные информосомы трудно назвать чистыш, авторы предприня49 ли поиск протеинкиназной активности в полученном препарате и обнаружили в нем сАМР-независимую протеинкиназу казеинового типа.Разногласия в определении типа информосомной протеинкиназы объективно вытекают из невозможности получения достаточных количеств чистых информосом. Если идентификация HD -40 в составе частиц облегчается его необычным аминокислотным составом; белков, родственных СВР, - наличием моноклональных антител, а р73-78 тем, что он, как правило, мажорный компонент информосом, то в отношении протеинкиназы исследователи лишены таких прешлуществ.Строго говоря, присутствие какой-бы то ни было протеинкиназы в составе информосом еще предстоит доказать.По данным Бага и Селлза, сАМР-независимая протеинкиназа присутствует в составе свободных РНК-связывающих белков из мышц зародышей цыпленка (24). Совсем не исключено, что именно этот фермент обнаруживают и в составе информосом в качестве структурного белка или как примесь. Однш^о для проверки этого предположения нужно, как минимум, провести точную идентификацию свободной и ассоциированной с м Р Ш протеинкиназы.Роль фосфорилирования информосомных белков in vivo в настоящее время представляется загадочной. Результаты немногих работ (48,89) позволяют предположить, что это фосфорилирование Может сказываться на трансляционной активности матрицы. Так, Элкаим с соавт, показали, что в клетках мышиной плазмоцитомы полисомосвязанные информосомы обеднены новофосфорижрованными белками по сравнению со свободными мРНП (89). Эти данные согласуются с результатами ранней работы Гандера и соавт., в которой говорится, что свободные и полисомосвязанные информосомы обладают разным набором фосфорилирующихся in vivo белков (116). Можно предположить, что активация мРНК связана либо с диссоциацией фос- 50 форилированных белков, либо с их дефосфорилированиеы. Однако указания на присутствие в составе мРНП(из ядер клеток неЬа) фосфатазы получены лишь в одной работе (243). Удивительно то, что этими же авторами в том же году было опубликовано сообщение (41), в котором отрицается существование фосфатазнои активности информосомных белков из ядер неЬа . Не исключено, правда, что для проявления фосфатазнои активности нужно понижение рН до 7,4 (243), в то время как при рН 8-8,5 (41) фосфатаза теряет активность. Тем не менее в обзоре Эгли и соавт, указывается на отсутствие фосфатазнои активности в белках м Р Ш (86).Карделлй и Пито сообщают о стшлуляции протеинкиназной активности, обнаруженной ими в полисомосвязанных информосомах, в клетках гепатомы, по сравнению с обычными печеночными клетками (48). Возможно, что повышение активности этого фермента каким-то образом связано с изменением трансляции при рш^овой трансформации.Во всяком случае, учитывая важность реакций фосфорилирования - дефосфорилирования в регуляции многих клеточных процессов (188,250), исследование биологической роли фосфорилирования информосомных бежов представляется актуальной задачей. Примечательно, что большинство субстратов из числа компонентов белоксинтезирующего аппарата, в том числе и белки информосом, фосфорилируются с А№-независимыми протеинкиназами. В настоящее время накоплено много данных, касающихся содержания в тканях, внутриклеточной локализации и субстратной специфичности этих ферментов. На основании полученных результатов сейчас складывается классификация сАГЛР-независимых протеинкиназ. Рассмотрению этих

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Кандрор, Константин Вилленович

ВЫВОДЫ

1. Во фракции РНК-связывающих белков ооцитов рыб и амфибий обнаружена протеинкиназная активность и субстраты фосфорилирова-ния. Реакция фосфорилирования РНК-связывающих белков эндогенной протеинкиназой достигает максимума при температуре около 20°, рН 7-9 и низких концентрациях одновалентных катионов. В этих условиях активные формы фоефатаз и протеаз во фракции РНК-связывающих белков не выявляются.

2. Разработана методика выделения РНК-связывающей протеинкиназы, включающая хроматографии на поли(У)-сефарозе, ДЭАЭ-целлюло-зе и фосфоцеллншозе. Фермент был очищен более чем в 500 раз относительно РНК-связывающих белков (и более чем в 10000 раз относительно белков безрибосомного экстракта) с выходом около 10%,

3. В состав гомогенного препарата РНК-связывающей протеинкиназы входят 3 полипептидные цепи: 43000, 41000 и 29000. Фермент фосфорилирует казеин намного эффективнее, чем гистоны, использует при этом АТФ и ГТФ, модифицирует сериновые и треониновые остатки в молекулах субстратов. Низкие концентрации гепарина подавляют активность протеинкиназы. Эти свойства позволили идентифицировать обнаруженный фермент как казеиновую киназу II типа.

4. Фосфорилирование РНК-связывающих белков эндогенной протеинкиназой снижает их сродство к РНК, тогда как полинуклеотиды подавляют реакцию фосфорилирования. то с

5. I-меченный фермент, сохраняющий протеинкиназную и РНК-свя-зывающую активности, после инъекции В ООЦИТЫ Rana temporaria специфично включается в состав 703-частиц, аналогичных по се-диментационным свойствам свободным цитоплазматическим информо-сомам ооцитов лягушки.

6. Возрастание биосинтеза белка на запасенных матрицах при созревании ООЦИТОВ Acipenser stellatus Pall. сопровождается ЭК-тивацией РНК-связывающей протеинкиназы и изменением набора фос-форилирующихся РНК-связывающих белков. Предложена экспериментальная схема взаимосвязи фосфорилирования РНК-связывающих белков с реакциями маскирования-демаскирования мРНК в клетках эукариот.

ЗАКЛШЕНИЕ

В жизни эукариотической матрицы можно проследить несколько этапов: посттранскрипционные модификации (процессинг, полиаде-нилирование), транспорт из ядра в цитоплазму, более или менее длительное "маскирование" в цитоплазме и, наконец, трансляцию. На всех этих этапах мРНК существует в комплексе с белками в виде информосом. Согласно гипотезе А.С.Спирина в состав информосом входят белки, принимающие участие в обслуживании мРНК. Набор этих белков не постоянен; он обновляется всякий раз при изменении внутриклеточной локализации матрицы. "Лишние" информосомные белки, не взаимодействующие в данный момент с мРНК, образуют пул свободных РНК-связывающих белков, которые явились объектом наших исследований. Учитывая исключительную важность реакций фосфорилировашя-дефосфорилирования в регуляции биосинтеза белка на уровне трансляции, можно предположить, что именно эти модификации РНК-связывающих белков каким-то образом способны влиять на экспрессию мРНК.

Первой нашей задачей стала попытка обнаружения фосфорилиро-вания свободных РНК-связывающих белков, поскольку до сих пор не было известно о каких-либо посттрансляционных модификациях этой белковой фракции.

Было показано, что РНК-связывающие белки, сохраняющие способность взаимодействовать с поли(У) при физиологической ионной силе, содержат в своем составе протеинкиназу и несколько белковых субстратов. После оптимизации системы и необходимых контрольных опытов, показавших отсутствие активных форм фосфатаз и протеаз в РНК-связывающих белках, мы провели идентификацию обнаруженного фермента. Выяснилось, что он не нуждается в цАМФ или Са"^, эффективно фосфорилирует казеин и неактивен в отношении гистонов, модифицирует как оериновые, так и треониновые остатки в молекулах субстратов и использует при этом АТФ и ГТФ. Низкие концентрации полианионов (гепарина и полиуридиловой кислоты) подавляют активность исследуемой протеинкиназы. Все это дало возможность отнести ее к казеиновым киназам П типа. Известно, что эти ферменты, как правило, состоят из трех субьединиц (см. Табл. I). Наша протеин-киназа не явилась исключением - в составе гомогенного препарата присутствуют три полипептидные цепи с молекулярными массами 43,41 и 29 Kd.

Выделенный фермент был помечен радиоактивным йодом с сохранением как протеинкиназной, так и РНК-связывающей активностей и инъецирован в ооциты Rana temporaria . Показано, что он включается в состав частиц, гомологичных по своим седиментационным свойствам свободным цитоплазматическим информосомам. На наш взгляд, этот факт является сильным доказательством информосомо-образующей функции протеинкиназы. Включение фермента в полисомо-связанные информосомы не было зарегистрировано, что может быть связано либо с отсутствием в их составе РНК-связывающей протеинкиназы, либо с недостаточной чувствительностью метода микроинъекций.

В настоящее время известно много белков, фосфорилирующихся казеиновыми киназами П типа in vitro (Табл. 2), однако ни один из них нельзя с уверенностью считать их эндогенным субстратом. "Самофосфорилирование" РНК-связывающих белков (обусловленное наличием в их составе протеинкиназы и фосфорилирующихся полипептидных цепей) указывает на то, что некоторые компоненты исследуемой белковой фракции могут служить субстратами казеиновых киназ П типа в живой клетке. Обнаружение специфических субстратов, несомненно, очень важно, так как должно способствовать выяснению биологической роли этих малоизученных протеинкиназ. Во всяком случае, тот факт, что фермент, фосфорилирующий РНК-связывающие белки, сам обладает РНК-связывающей активностью и, по-видимому, входит в состав информосом еще раз доказывает важность компарт-ментализации для функционирования эукариотической клетки.

Полученные результаты подкрепили наши предположения о тесной взаимосвязи фосфорилирования РНК-связывающих белков с механизмом функционирования информосом; в дальнейшем,мы решили выяснить влияние фосфорилирования на РНК-связывающую активность изучаемых бежов, поскольку именно этот параметр может отражать их способность образовывать информосомы in vivo.

Установлено, что фосфорилирование РНК-связывающих бежов ведет к достоверному снижению РНК-связывающей активности, причем это снижение наиболее отчетливо проявляется в условиях, приближающихся к физиологическим: при измерении РНК-связывающей активности в среде, содержащей 0,15 М KCl и некоторый избыток РНК-связывающих бежов над РНК (что модежрует пул свободных РНК-связывающих бежов, существующий в эукариотической клетке).

Мы предположили, что изменение РНК-связывающей активности за счет фосфорилирования информосомообразующих бежов может использоваться клеткой в целях "переодевания" мРНК при отщеплении от матрицы бежов, соответствующих прежнему функциональному состоянию частицы и ненужных (или даже мешающих ей) на новом жизненном этапе. Примером таких бежов может служить пока неиденти-фицированный репрессор трансляции, содержащийся в свободных ци-топлазматических информосомах и препятствующий их утилизации, in vitro отщепление этого репрессора может быть достигнуто с помощью обработки свободных информосом концентрированными растворами KCl, вызывающей диссоциацию части белков от мРНК. Образовавшиеся частицы обладают такой же трансляционной активностью in vitro , что и полисомосвязанные информосомы. В живой клетке фосфорилирование репрессорных белков, влекущее за собой их диссоциацию от матрицы, может быть эквивалентно солевой обработке. В таком случае, следует ожидать, что в процессах, связанных с массовой утилизацией маскированных матриц, происходит увеличение активности РНК-связывающей протеинкиназы. Одним из этих процессов является созревание ооцитов рыб и амфибий - ряд физиологических и морфологических изменений, происходящих во время первого мейотического деления и характеризующихся, в частности, возрастанием уровня биосинтеза белков (4,353). Созревание ооцитов не зависит от активности ядерного материала и целиком находится под контролем цитоплазматических механизмов, обеспечивающих реализацию запасенных ранее молекул мРНК (10). Нами было показано, ЧТО при созревании ООЦИТОВ севрюги Acipenser stellatus Pall. одновременно с повышением уровня трансляции действительно происходит активация РНК-связывающей протеинкиназы, сопровождающаяся изменением набора фосфорилирующихся in vitro .РНК-связывающих белков. Последнее явление можно рассматривать как результат обмена полипептидными цепями между свободными РНК-связываю-щими белками и информосомами; часть белков диссоциировала от свободных цитоплазматических информосом, а их место заняли другие белки, участвующие в формировании полисомосвязанных информосом. При этом пул РНК-связывающих белков обогатился одними компонентами - субстратами фосфорилирования и обеднился другими.

Со «.* этой точки зрения полученный результат можно рассматривать как иллюстрацию гипотезы о смене белков информосом, полученную при анализе не самих частиц, а свободных РНК-связывающих белков.

В наших первых опытах было установлено, что добавление поли (У) в протеинкиназную систему сильно ингибирует реакцию фосфо-рилирования (Рис.7). На основании этого факта было предположено, что in vitro протеинкиназа в составе РНП-комплекса намного менее активна, чем в свободном состоянии. Так как при созревании ооцитов севрюги мы исследовали изменения активности лишь свободного фермента, поведение протеинкиназы, находящейся в составе информосом,остается неизвестным. Не исключено, что под действием какого-то стимула она выходит из-под ингибирующего действия мРНК и фосфорилирует окружающие информосомные белки; с другой стороны, информосомные белки (в составе частиц) могут служить субстратами для активированного свободного фермента. При этом нельзя игнорировать значения реакций фосфорилирования протекающих среди свободных РНК-связывающих белков. Уменьшение РНК-свя-зывающей активности отдельных информосомообразующих компонентов этой фракции должно, по-видимому, препятствовать их включению в состав информосом и приводить к преимущественному формированию того или иного типа частиц. Если предположить существование динамического равновесия менаду белками, связанными с мРНК, и свободными белками, то только за счет фосфорилирования свободных белков, влекущего за собой сдвиг равновесия в реакциях белкового обмена, можно объяснить механизм "переодевания" мРНК.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Кандрор, Константин Вилленович, Москва

1.Белицина H.B. ,Айтхожин М.А.»Гаврилова Л.П.,Спирин A.C. 1964.Информационные рибонуклеиновые кислоты дифференцирующихся животных клеток.- Биохимия, т. 29,Л°2, с.363-374.

2. Власик Т.Н.1983. Факторы трансляции эукариот как РНК-связывающие белки.- Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук.Пущино.

3. Воронина А.С.1979.Проблема препаративного выделения свободных цитоплазматических информосом.-Молек.биол., t.I3,M,c.5-í5.

4. Детлаф Т.А.,П.Е.Фельгенгауер,А.С.Степанов,Е.В.Чулитская.1980.Синтез белка в ооцитах севрюги в разные сроки периода созревания и влияние подавления этого синтеза на изменение ооцитов.- Онтогенез,т.11 с. 24-30.

5. Елизаров С.М. »А.С.СтепановЛ978.РНК-связывающие белки ооцитов лягушки Rana temporariaJfc^^eHHe методом аффинной хроматографии и радиоактивное мечение in vitro.-Биохимия, т. 43 , с. 1347-1356.

6. Овчинников Л.П. »Воронина A.C. »Степанов A.C. »Белицина Н.В., Спирин A.C.1968.Информосомоподобные комплексы,образуемые при добавлении РНК к гомогенатам животных клеток.- Молекулярная биология,т.2,№5,с.752-763.

7. Э.Преображенский А.А.,С.М.Елизаров.1975.Аффинная хроматография РНК-связывающих белков на колонках с ковалентно иммобилизованной на сефарозе рибосомной РНК.- Еиоорганич. химия,т.I, $7,с.1633-1638.

8. Ю.Степанов А.С.1977.Созревающие ооциты как модель для изучения механизмов синтеза белков и его регуляции in vivo.-В.кн.:Современные проблемы оогенеза.М. :Наука,с. 267-280.

9. Н.Степанов А.С., С. М.Елизаров, П. Е.Фельгенгауер. 1983. Образование информосом в созревающих ооцитах амфибий.- Биохимия, т.48,Щ2,с. 2035-2040.

10. Чумаков К.М. ,М.Н.Розанов,В.И.Агол. 1980.РНК-зависимая АТФ-аза из клеток асцитной карциномы Кребс-П.- Доклада АН СССР,т.254,J&2,с.509-512.

11. Шульце X.А. 1979.Радиоактивное маркирование белков.Мечение белка и хлорамином Т.- В кн.:Иммунологические методы. М.¡Наука,с.414-422.

12. Adams,D.S.,D.Hoonan,W.R.Jeffery.1981.Cytoplasmic polyadeny-late processing events accompany the transfer of mRUA from the free mRNP particles to the polysomesin Physarum.- Proc.Nat.Acad.Sci.USA,vol.78,N1,p.83-87.

13. Akhayat,0.,A.Vincent,S.Goldenberg, A.Person,K.Scherrer.1983.The translation of the messenger for the poly(A)-binding protein-associated with translated mRUA is suppressed.- PEBS-Ъеtters,vol.162,N1,p.25-32.

14. Alshanova,A.T.,A.N.Pedorov,L.P.Ovchinnikov.1982.Aminoacyl-tRUA synthetases of rabbit reticulocytes with andwithout the ability to bind high-M^, RUA. -FEBS- Lett era, vol.144,N1,p.149-153»

15. Alshanova,A.T.,Fedorov, A. N., L. P.Ovchinnikov,A.S.Spirin.1980.Eukaryotic aminoacyl-tRNA synthetases are RÎTA-binding proteins whereas prokaryotic ones are not.-FEBS-Letters,vol.120,N2,p.225-229.

16. Alton,T.H.,H.F.Lodish.1977.Translational control of protein synthesis during the early stages of differentiation of the slime mold Dictyostelium discoideum.-Cell, vol.12,N1,p.301-310.

17. Auerbach,S.,T.Pederson.1975.Phosphorylation of messenger RNA-bound proteins in HeLa cells.-Biochem.Biophys. Res.Commun.,vol.63,IT1,p.149-156.

18. Austin,S.A.,M.J.Clemens.1980.Control of the initiation of protein synthesis in mammalian cells.-FEBS-Letters, vol.110,N1,p.1-7.

19. Bag,J,,M.Hubley,B.Sells.1980.A cytoplasmic ribonucleoprotein complex containing a small RHA inhibitor of protein synthesis.-J.Biol.Chem.,vol.255,N15,p.7055-7058.

20. Bag,J,,B.H.Sells,1979.The presence of protein kinase activity and acceptors of phosphate groups in nonpoly-somal cytoplasmic messenger ribonucleoprotein complexes of embryonic chicken muscle.-J.Biol.Chem.,vol.254,N9,p.3137-3140,

21. Bag,J.,B,H,Sells.1980.Presence of cyclic AMP-independent protein kinase activity in RNA-binding proteins of embryonic chicken muscle.-Eur,J.Biochem.,vol.106, N2,p.411-424.

22. Bag,J,,B,H,Sells.1981.Cytoplasmic nonpolysomal ribonucleo-protein complexes and translational control.-Mol. Cell.Biochem.,vol.40,N3,p.129-141.

23. Baker,E.J.,A.A.Infante,1982.Nonrandom distribution of histone mENAs into polysomes and nonpolysomal ribonucleopro-tein particles in sea urchin embryos,- Proc.Uat.Acad. Sci,USA,vol.79,H8,p,2455-2459.

24. Balkow,K,,T.Hunt,R.J.Lackson.1975.Control of protein synthesis in reticulocytes lysates: the effect of nucleotide triphosphate on formation of the translational repressor.-Biochem.Biophys.Res.Commun.,vol.67,H2,p.366-375.

25. Ballantine,J.E.M,,H,R.Woodland,E.A.Sturgess.1979.Changes in protein synthesis during the development of Zenopus laevis,-J,Embryol.Exp.Morph.,vol.51,H1,p.137-153.

26. Ballinger,D.A.,T.Hunt.1981.Fertilization of sea urchin eggs is accompanied by 40S ribosomal subunit phosphorylation. -Devel.Biol. ,vol.87,N2,p.277-285.

27. Banerjee,A,K,1980,5'-terminal cap structure in eukaryotic messenger ribonucleic acid.-Bacteriol.Rev.,vol.44,1. N1,p.175-205.

28. Barrieux,A,,H.A.Ingraham,S.Nystul,M.A.RosenfeId. 1976.Charac-terization of the association of specific proteins with messenger ribonucleic acid.-Biochemistry,vol,15,1. N16,p.3523-3528.

29. Baydoun,H., J.Hoppe,W. Freist,K. G.Wagner. 1982. Purificationand ATP-substrate site of a cyclic nucleotide-inde-pendent protein kinase (N1) from porcine liver nuclei.-- J.Biol.Chem.,vol.257,N2,p.1032-1036.

30. Baydoun,H., J.Hoppe, G. Jacob, K. Wagner. 1980. Purification andquarternary structure of a cyclic nucleotide-inde-pendent protein kinase (HII) from porcine liver nuclei.-FEBS-Letters,vol.122,N2,p.231-233.

31. Beker-Ursic,D.,J.Davies.1976.In vivo and in vitro phosphorylation of ribosomal proteins by protein kinases from Saccharomyces cerevisiae.-Biochemistry,vol.15, N11,p.2289-2296.

32. Benne,R., J.Edman,R.R.Trant,J.W.B.Hershey.1978.Phosphorylation of eukaryotic protein synthesis initiation factors.-Proc.Nat. Acad, Sci.USA,vol.75,N1 ,p. 108-1 12.

33. Berg,B.H.1977.The early influence of 17-/-oestradiol on 17-aminoacyl-tRNA synthetases of mouse uterus and liver.Phosphorylation as a regulation mechanism.-Biochim.Biophys.Acta,vol.479,N2,p.152-171.

34. Beyer,A.L.,0.I.Miller,S.L.McKnight,1980,Ribonucleoprotein structure in nascent mKNA is nonrandom and sequence-dependent .-Cell,vol.20,N1,p.75-84.

35. Bhorjel,J.S.1981.Differential phosphorylation of nuclear nonhistone high mobility group proteins HMG-14 and HMG-17 during the cell cycle.-Proc.Nat.Acad.Sci. USA,vol.78,N11,p.6944-6948.

36. Bingham,E.W.,M.L.Groves,1979.Properties of casein kinase from lactating bovine mammary gland.-J.Biol.Chem., vol.254,N11,p.4510-4515.

37. Blanchard,J.M.,C.Brunei,P.Jeanteur.1977.Characterizationof an endogenous protein kinase activity in ribonuc-leoprotein structures containing heterogenous nuclear RNA in HeLa cell nuclei.-Eur.J.Biochem.,vol.79,N1, p.117-131.

38. Blobel,G.1973#A protein of molecular weight 78000 bound to the polyadenylate region of eukaryotic messenger RNAs,-Proc.Nat.Acad.Sci,USA,vol.70,N3,p.924-928,

39. Boivin,P.,C,Galand.1979.Purification and characterization of a casein kinase from human erytrocyte cytosol.-Biochem.Biophys.Res.Commun.,vol.89,N1,p.7-16.

40. Bommer,U,-A.,P.Noll,G.Lutsch,H.Dielka.1980.Immunochemical detection of proteins in the small subunit of rat liver ribosomes involved in binding of the ternary initiation complex,-FEBS-Letters,vol.111.N1,p.171-174.

41. Brendler,Т., T.Godefray-Colburn,R.D.Carlill,R.E.Thach,1981, The role of mRNA competition in regulating translation, II,Development of a quantative in vitro assay,-J.Biol.Chem,,vol.256,N22,p.11747-11754.

42. Brendler,T.,T,Godefroy-Colburn,S,Yu,R,E,Thach.1981.The role of mRNA competition in regulating translation. Ill,

43. Civelli,0.,A,Vincent,K.Maundrell,J.-F.Buri,K.Scherrer.1980. The translational repression of globin mRNA in free cytoplasmic ribonucleoprotein complexes.-Eur.J.Biochem. ,vol.107,N2,p.577-585.

44. Clari,G.,V.Moret.1981.Further purification and characterization of casein kinases from human erythrocytes hemolysate,Effect of Thriton X-100.-Biochim.Biophys. Acta,vol.659,U2,p.370-377.

45. Clari,A,,L.A.Pinna,V.Moret.1976.Comparative study of mitochondrial and cytosol protein kinase activities.-Biochim.Biophys.Act a,vol.451,N2,p.484-490.

46. Clemens,M.J.,C.M.Vaquero,1978.Inhibition of protein synthesis by double-stranded KNA in reticulocyte lysates: evidence for activation of an endoribonuclease.-Biochem.Biophys.Res.Commun.,vol.83,N1,p.59-68.

47. Cohen,P.1978.The role of cAMP-dependent protein kinase in the regulation of glycogen metabolism in mammalian skeletal muscle.-In:Current topics in cellular regulation, vol. 14, p. 1 17-196.

48. Cohen,P.1982.The role of protein phosphorylation in neural and hormonal control of cellular activity.-Nature, vol.296,N5858,p.613-620,

49. Cooper,J.A,,P.J,Farrell,1977.Extracts of interferon-treated cells can inhibit reticulocyte lysate protein synthesis ,-Biochem,Biophys.Res.Comraun.,vol.77,N1,p.124-131.

50. Crouch,D.1980.Purification and properties of eIF-2 phosphatase.-J.Biol.Chem.,vol.255,N16,p.7918-7924.

51. Dabanvalle,M.C,,P.Meggio,C.Creuz et, J. E. Lo eb. 1979.Phosphorylation of most non-histone proteins of chromatin of rat liver by an ATP-GTP-type protein kinase.-PEBS-Letters,vol.107,N1,p.193-197.

52. Dahnrus,M.E. 1976.Stimulation of ascites tumor RNA polymerase II by protein kinase.-Biochemistry,vol.15,N9,p.1821-1829.

53. Dahmus,M.E.1981.Purification and properties of calf thymus casein kinases I and II.-J.Biol.Chem,,vol.256,N7, p.3319-3325.

54. Damuni,Z.,B.Caudwell,P.Cohen.1982.Regulation of the amino-acyl-tRNA synthetase complex of rat liver by phospho-rylation/dephosphorylation in vitro and in vivo.-Eur.J.Biochem.,vol.129,N1,57-65.

55. Decker,S.1981.Phosphorylation of ribosomal protein S6 in avian sarcoma virus-transformed chicken fibroblasts.-Proc.Nat,Acad.Sci.USA,vol.78,N7,p.4112-4115.

56. DelGrande,R.W.,J.A.Traugh.1982.Phosphorylation of 40S ribo-somal subunits by cAMP-dependent,cGMP-dependent and protease-activated protein kinase.-Eur,J.Biochem,, vol.123,N2,p.421-428.

57. De PaolirRo6ch,A,A.,P.J.Roach,1982.Heparin inhibition andpolyamine stimulation of a rabbit muscle glycogen synthetase kinase (PGq y).-Fed.Proc,,vol.41,N4,p.871.

58. De Paoli-Roach,A.A.,P.J.Roach,J.Larner.1979.Multiple phosphorylation of rabbit skeletal muscle glycogen synthetase. Comparison of the action of different protein kinases capable of catalyzing phosphorylation in vitro,

59. J.Biol.Chem.,vol.254,N23,p.12062-12068.

60. Desjardius,P.R.,P.F.Lue,C.C.Liew,A.G.Gornall.1972.Purification and properties of rat liver nuclear protein kinases. -Ganad. J. Biochem. ,vol.50,N12,p.1249-1259.

61. Donella Deana,A.,F.Meggio,L.A,Pinna,V.Moret,1978.Different susceptibility of whole casein components to enzymatic phosphorylation by two forms of rat liver casein fcinase.-Biochim.Biophys.Acta,vol.524,N2,p.316-326.

62. Dougherty,J.P.,H.Samanta,P.J.Parrell,P.Lengyel.1980.Interferon, double-stranded RNA,and RNA degradation.Isolation of homogeneous pppA(2*fp5synthetase from Ehrlich ascites tumor cells.-J.Biol.Chem.,vol.255, N9,p.3813-3816.

63. Duncan,R.,E.H.McConkey.1982.Preferential utilization of phosphorylated 40S ribosomal subunits during initiation complex formation.-Eur,J.Biochem.,vol.123,N3, p.535-538,

64. Duncan,R,,E,H,McConkey,1982,Rapid alterations in initiation rate and recruitment of inactive RNA are temporally correlated with S6 phosphorylation,-Eur,J,Biochem., vol.123,N3,p.539-544.

65. DuVernay,V,H,, J,A,Traugh, 1978,Two-step purification of the major phosphorylated protein in reticulocyte 40S ribosomal subunits,-Biochemistry,vol.17,N11,p.2045-2049.

66. Economidis,I.V.,T.Pedersonf1983.Structure of nuclear ribo-nucleoproteinjheter genous nuclear RNA is complexed with a major sextet of proteins in vivo.-Proc.Nat, Acad.Sci.USA,vol.80,N6,p,1599-1602.

67. Egly,J.M.,R.Elkaim,M.Pierre.1979. mRNA proteins,initiation factors and phosphorylation.-Molec.Biol.Rep.,vol.5, p.91-97,

68. Egly,J.-M.,M.Schmitt,R.Elkaim,J.Kempf.1981.Proteinkinases and their protein substrates in free messenger ribo-nucleoprotein particles and polysomes from mouse plasmacytome cells,-Eur.J.Biochem.,vol.118,N2,1. P.379-387.

69. Elizarov, S. M,, A, S, St epanov, P. E, Felgenhauer,E,V,Chulit skaya, 1978. Involvement of RNA-binding proteins in the formation of informosomes in vivo.-FEBS-Letters,vol. 93»N2,p.219-224.

70. Elkaim,R.,I.Kempf,J.M,Egly.1981,Phosphorylated proteins in the passage from free mRNP to polysomes in mice plasmacytoma. -FEBS-Letters, vol. 130, N1 ,p.60-64.

71. Eller,M. S,, R, E. Cullinan, P. M, McGuire, 1982. The involvementof small cytoplasmic RNA*s as inhibitors of protein synthesis in human placenta.-Fed,Proc,,vol,41»N4, p.1456.

72. Fagard,R.,J.-P.Boissel.1983.Structure of the heme-regulated eukaryotic initiation factor 2 kinase.End group analysis and phosphoaminoacid content.-Biochimie,t.65,N7,p.441-445.

73. Fagard,R.,I.M.London.1981.Relationship between phosphorylation and activity of heme-regulated eukaryotic initiation factor 2 kinase.-Proc.Nat.Acad.Sci.usa, vol.78,N2,p.866-870.

74. Farrell,P.J.,K.Balkow,T.Hunt,R.J.Jackson,H.Trachsel,1977. Phosphorylation of initiation factor eIF-2 and the control of reticulocyte protein synthesis.-Cell, vol.11.N1,p.187-200,

75. Farron-Furstenthal,F.1980,Two naturally occuring inhibitors of nuclear protein kinase,-J,Biol,Chem,,vol,255,N10, p.4589-4594.

76. Farron-Furstenthal,F.1982.Isolation of an oligonucleotide inhibitor of nuclear protein kinase from cultured cells.-Fed.Proc.,vol,41.N4,p.872.

77. Farron-Furstenthal,F,,J.R.Lightholder.1978.Effects of poly-amines oh the phosphorylation of non-histone proteins in isolated rat liver nuclei.-Biochej»jBiophys.Res. Commun.,vol.83,N1,p.94-100.

78. Feige,J.J.,F.Pirolett,C.Cochet,E.M.Chambaz.1980.Select ive inhibition of a cyclic nucleotide independent protein kinase (G-type casein kinase) by naturally occuring glycosaminoglycans.-FEBS-Letters,vol.121,N1,p.139-142.

79. Filipowicz,W.1978.Function of the S'-terminal rJd cap in eukaryotic mRNA.-FEBS-Letters,vol.96,N1,p,1-11.

80. Floyd,G.A.»w.c.MerrickJ.A.Traugfo. 1979.Identification of initiation factors and ribosome-associated phospho-proteins by two-dimensional polyacrylamide gel elect-phoresis.-Eur.J.Biochem.,vol.96,H2,p.277-286.

81. Floyd,G.A.,J.A. Traugh.1979.Phosphorylation of ribosomal-associated proteins in reticulocyte lysates.-Methods in Enzymology,vol.60,p.511-521.

82. Floyd,G.A.,J.A.Traugh.1980.Heme-deficiency and phosphorylation of ribosome-associated proteins.-Eur.J.Biochem,, vol.106,N1,p.269-277.

83. Freedman,S.D,j.d.Jamieson.1982.Hormone-induced protein phosphorylation. 1.Relationship between secretagogue action and endogenous protein phosphorylation in intact cells from the exocrine pancreas and parotid.-j.Cell Biol.,vol.95,N3,p.903-908.

84. Freedman,S.D.,J.D.Jamieson.1982.Hormone-induced protein phos--phorylation.3.Regulation of the phosphorylation ofthe secretagogue-responsive 29000-dalton protein by both Ca2+ and cAMP in vitro.-J.Cell Biol.,vol.95,N3, p.918-923.

85. Fuchs,J.^P.,M.Jacob.1980.Fractionation of constituents of ribonucleoproteins containing heterogeneous nuclear ribonucleic acid.-Biochemistry,vol.18,N19,p.4202-4208.

86. Fuchs,J.-P.,C.Judes,M.Jacob.1980.Characterization of glycine-rich proteins from the ribonucleoproteins containing heterogeneous nuclear ribonucleic acid.-Biochemistry, vol.19,N6,p.1087-1094.

87. Pukami,H.,H.A.Itano.1976.In vitro translation of globin: effect of proteins purified by affinity chromatography on polyadenylate-Sepharose.-Biochemistry,vol.15, N16,p.3529-3535.

88. Gallinaro-Matringe,H.,M.Jacob.1973.Nuclear particles from rat brain:complexity of the major proteins and their phosphorylation in vivo.-FEBS-Letters,vol,36,N1,p.105-108.

89. Gallinaro-Matringe,H.,J.Stevenin,M.Jacob.1975.Salt-dissocia-ticln of nuclear particles containing DNA-like RNA. Distribution of phosplirylated and nonphosphorylated species.-Biochemistry,vol.14,N11,p.2547-2554.

90. Gander,E.S.,A.G.Stewart,C.M.Morel,K,Scherrer.1973. Isolation and characterization of ribosome-free cytoplasmic messenger-ribonucleoprotein complexes from avian erythroblasts.-Eur.J.Biochem,,vol,38,N3,p.443-452.

91. Genot,A,,J.P.Reboud,Y.Centatiempo,A,J,Cozzone.1979.Differential phosphorylation of basic and acidic ribosomal proteins by protein kinase bound to membrane-free rat liver polysomes.-FEBS-Letters,vol.99,N2,p.261-264.

92. Geoghegan,T.,S.Cereghini,G,Brawerman,1979.Inactive mRNA-protein complexes from mouse sarcoma-180 ascites cells.-Proc.Nat.Acad.Sci.USA,vol.76,N11,p.5587-5591.

93. Grankowski,N.,D,Lehrausvirta,G.Kramer,B.Hardesty,1980.Partial purification and characterization of reticulocyte phosphatase with activity for phosphorylated peptide initiation factor 2,-J.Biol.Chem.,vol.255,N1,p.310-317.

94. Grankowski,N.,D.Lehrausvirta,G,В.Stearns,G.Kramer,B.Hardesty. 1980.The isolation and partial characterization of two substrate specific protein activators of the reticulocyte phosphoprotein phosphatesе.-J.Biol.Chem,, vol.255,N12,p.5755-5762.

95. Greenberg,J.R,1981,The polyribosomal mRNA-protein complex is a dynamic structure.-Proc.Nat.Acad.Sci.USA,vol,78, N5,p.2923-2926.

96. Greesner,A.M.,H,Greiling,1977,The phosphorylation of rat liver ribosomal protein S6 during the development of acute hepatic cell injury induced by D-galactos-amine.-PEBS-Letters,vol.74,N1,p,77-81,

97. Greesner,A,M,,E,van de Leur,1980,Interaction of synthetic polynucleotides with small rat liver ribosomal sub-units possessing low and highly phosphorylated pro-t ein S6.-Biochim.Biophys.Act a,vol,608,N2,p,45 9-468.

98. Greesner,A,M,,I.G,Wool.1974.The stimulation of the phosphorylation of ribosomal protein S6 by cycloheximide and puromycin.-Biochem.Biophys.Res.Commun.,vol.60,N4,p. 1482-1490.

99. Greesner,A.M.,I,G,Wool,1976,Influence of glucagon and cyclic adenosine-31»5'-monophosphate on the phosphorylation of rat liver ribosomal protein S6,-J,Biol,Chem,,vol. 251,N5,p.1500-1504.

100. Greesner,A.M.,I.A,Wool.1976.Effect of experimental diabetes and insulin on phosphorylation of rat liver ribosomal protein S6.-Nature,vol.259,N5539,p.148-150.

101. Grifo, J. A., S.M.Tahara, J.P. Leis ,M. A.Morgan, A. J. Shatkin, W.C.

102. Merrick,1982.Characterization of eukaryotic initiation factor 4A, a protein involved in ATP-dependent binding of globin mRNA.-J.Biol.Chem.,vol.257,N9,p.5246-5252.

103. Gross,M.1980.The control of protein synthesis by hemin in rabbit reticulocytes,-Mol.Gen,Biochem.,vol.31,N1,p. 25-36.

104. Gross,M,,M.Rabinovitz,1972,Control of globin synthesis by hemin: factors influencing formation of an inhibitor of globin chain initiation in reticulocyte lysates.

105. Biochim.Biophys.Acta,vol.287,N2,p.340-352.

106. Gross,M., J.Rynning,W.M.Knish.1981.Evidence that the phosphorylation of eukaryotic initiation factor by the hemin-controlled translational repressor occurs ata single site.-J.Biol.Chem.,vol.256,N2,p.589-592.

107. Grosfeld,H.,S.0choa.1980.Purification and properties of the double-stranded ENA activated eukaryotic initiation factor 2 kinase from rabbit reticulocytes.-Proc. Nat.Acad.Sci.USA,vol.77,N11,p.6526-6530.

108. Gupta,S.L.,B.Y.Rubin,S.L.Holmes.1979.Interferon act ion: induction of specific proteins in mouse and human cells by homologeous interferons.-Proc.Nat,Acad.Sci.

109. USA,vol.76,N10,p.4817-4821.

110. Hanocq-Quertier,J.,E.Baltus.1981.Phosphorylation of ribo-somal proteins during maturation of Xenopus laevis oocytes.-Eur.J.Biochem.,vol.120,N2,p.351-355.

111. Hardie,D.G.,D.A,Stansfield.1977.Endogenous phosphorylation of microsomal proteins in bovine corpus luteum.Tenfold activation by adenosine-3':5'-cyclic monophosphate. -Biochem. J. ,vol.164,N1,p.213-221.

112. Hathaway,G.M.,J.A.Traugh.1979.Cyclic nucleotide-independent protein kinases from rabbit reticulocytes.-J.Biol, Chem.,vol.254,N3,p.762-768.

113. Hathaway,G.M,,J,A,Traugh.1982.Mechanism of inhibition of casein kinase II,a cAMP-independent protein kinase,by 2,3-diphosphoglycerate and pyridoxal-5*-phosphate,-Fed.Proc.,vol,41,N4,p.872.

114. Hathaway,G.M.,M.J.Zoller,J.A.Traugh.1981.Identification of the catalytic subunit of casein kinase II by affinity labeling with 5'-p-fluorosulfonylbenzoyl adenosine.-J.Biol,Chem.,vol.256,N22,p.11441-11446.

115. Havaranis,A.S.,S.M.Heywood.19S1.Cytoplasmic utilizationof liposome-encapsulated myosin heavy chain messenger ribonucle-o-protein particles during muscle cell differentiation. -Proc.Nat.Acad.Sci.USA,vol.78,N11,p.6898-6902.

116. Hebert, J. ,M.Pierre, J.E.Loeb. 1977.Phosphorylation in vitro and in vivo of ribosomal proteins from Saccharomyces cerevisiae.-Eur.J.Biochem.,vol.72,N1,p.167-174.

117. Heinrich,P.C.,W.Northemann.1981.The structure of ribonucleo-protein particles from rat liver nuclei.-Mol.Biol. Rep.,vol.7,N1-3,p.15-24.

118. Helentjaris.,T.,E.Ehrenfeld,M.L.Brown-Iuedi,J.W.B.Hershey.

119. Alteration in initiation factor activity from poliovirus-infected HeLa cells.-J.Biol.Chem,,vol.254,N21, p.10973-10978.

120. Helinek,T.A. ,T,M,Delvin, J. J.Ch'ih.1982,Mechanism of initial inhibition and recovery of protein synthesis in cyclo-heximide-treated hepatocytes.-Fed.Proc.,vol.41»N4,p.1285.

121. Henderson,A.B.»Miller,A.H.,B.Hardesty.1979.Multistep regulatory system for activation of a cyclic AMP-independent eukaryotic initiation factor 2 kinase.-Proc.Nat, Acad.Sci.,USA,vol.76,N6,p.2605-2609.

122. Henry,S.M.,L.D.Hodge.1983.Nuclear matrix: a cell-cycle-dependent site of increased intranuclear protein phos-phorylation.-Eur.J.Biochem.,vol,133,N1,p,23-29.

123. Herson,D,»A.Schmidt,S,Seal,A.Marcus,L. van Vloten-Doting, 1979.Compatitive mRNA translation in an in vitro system from wheat germ.-J.Biol.Chem.,vol.254,N17,p.8245-8249.

124. Hirsch,J.,0.J.Martelo.1976.Phosphorylation of rat liver ribonucleic acid polymeraes I by nuclear protein kinases.-J.Biol.Chem. ,vol.251,N17,p.5408-5413.

125. Hovanessian,A.G.1980.Double-stranded RNA dependent protein-kinase(s) in rabbit reticulocyte lysates analogousto kinase from interferon-treated cells,-Biochimie, t.LXII,N11-12,p.775-778.

126. Hronis,T,S,,J.A.Traugh.1982.Porphyrin requirements for maintenance of protein synthesis and inhibition of phosphorylation of eIF-2oC by the hemin controlled repressor,-Fed,Proc,,vol.41,N4,p.1285.

127. Hunt ,T.1980.Phosphorylation and the control of protein synthesis in reticulocytes.-In: Recently discovered systems of enzyme regulation by reversible phosphorylation.Elsevier/North Holland Biochemical Press,p.175-202.

128. Hunt,T.»Vanderhoff,I.M.London.1972.Control of globin syn-thesissthe role of heme.-J.Mol.Biol.,vol.66,N2,p.471-481.

129. Hunter, T. ,T.Hunt,R. J. Jackson, H.D.Robert son. 1975. The characteristics of inhibition of protein synthesis by double-stranded ribonucleic acid in reticulocyte lysate.-J.Biol.Chem.,vol.250,N2,p.409-417.

130. Infante,A.A.1981.Nonpolysomal messenger RNA and its rolein translational control of protein synthesis in sea urchin embryos.-Mol.Biol.Rep.,vol.7,N1-3,p.190.

131. Infante,A.A.,L.J.Heilmann.1981.Distribution of messengerribonucleic acid in polysomes and nonpolysomal particles of sea urchin embryos;translational control of actin synthesis.-Biochemistry,vol.20,N1,p.1-8.

132. Isenberg,I.Histones.1979.Ann.Rev.Biochem.,vol.48,p.159-192.

133. Issinger,0.-G.,R.Benne,J.W.B.Hershey,R.R.Traut.1976.Phosphorylation in vitro of eukaryotic initiation factors IP-E2 and IF-E3 by protein kinases.-J.Biol.Chem., vol.251,N20,p.6471-6474.

134. Itarte,E,,K,-P.Huang.1979.Purification and properties of cyclic AMP-independent glycogen synthase kinase I from rabbit skeletal muscle.-J.Biol.Chem.,vol.254, N10,p.4052-4057.

135. Iwasa,Y.,Y.Takai,U.Kikkawa,Y.Nishizuka,1980.Phosphorylat ion of calf thymus H1 histone by calcium-activated,phos-lipid-dependent protein kinase.-Biochem.Biophys.Res. Commun.,vol.96,N1,p.180-187.

136. Jain,S.K,,M,C,Pluskal,S,Sarkar.1979,Thermal chromatography of eukaryotic messenger ribonucleoprotein particles on oligo-(dT)-cellulose.Evidence for common mRNA-associated proteins in various cell types.-FEBS-Letters, vol. 97, N1,p, 84-90.

137. Jain,S,K,,R,K,Roy, M, G,Pluskal,D.E.Croall,C.Guba,S.Sarkar. 1979,A model of translational control involving mRNA-associated proteins in chick embryonic muscles,-Mol. Biol,Rep,,vol.5,N1-2,p,79-85,

138. Jain,S.K,,S,Sarkar,1978.Organization of polyadenilate-prote-in complex in messenger ribonucleoprotein particlesof embryonic chick muscles,-Fed,Proc,,vol,37,p,1307,

139. Jeffery,W,R,,D.S.Adams,D.Noonan.1981.Cytoplasmic processing events in the polyadenylate region of Physarum messenger RITA.-Mol.Biol,Rep.,vol.7,N1-3,p.63-70,

140. Jenkins,N.A.,J.E.Kaumeyer,E.M.Yeung,R.A.Raff.1978.A test for masked message:the template activity of messenger ribonucleoprotein particles isolated from sea urchin, eggs.-Devel.Biol,,vol.63,N2,p.279-298.

141. Johnson,T.R.,J.Ilan.1982.Proteins associated with poly(A)+ RNA of cockerel liver.Effects of estradiol stimulat ion.-Proc.Nat.Acad.Sci.USA,vol.7 9,N13,p.4088-4092.

142. Kaerlein,M.,I.Horak.1976.Phosphorylation of ribosomal proteins in Hela cells infected with vaccinia virus.-Nature,vol.259,N5539,p.150-151.

143. Khandj ian, E. W,,M. Loche, J. -L, Darlix,H. (Curler, R. Weil.1982.

144. Simian virus 40 large tumor antigen: a "RNA binding protein"?.-Proc.Nat.Acad.Sci.USA,vol.79,N4,p.1139-1143.

145. Kimchi,A,,A.Zilberstein,A.Schmidt,L.Shulman,M.Revel.1979. The interferon-induced protein kinase PK-i from mouse L cells.-J.Biol.Chem.,vol.254,N19,p.9846-9853.

146. Kinniburgh,A.J,,M.D.McMullen,T.E.Ifertin.1979.Distributionof cytoplasmic poly(A+)RNA sequences in free messengerribonucleoproteirtf and polysomes of mouse ascites cells.-J.Mol.Biol.,vol.132,N4,p.695-708.

147. Kish,V.M.,T.Pederson.1975.Ribonucleoprotein organizationof polyadenylate sequences in HeLa cell heterogeneous nuclear RNA.-J.Mol.Biol.,vol.95,N2,p.227-238.

148. Krebs,E.G.,J.A.Beavo.1979.Phosphorylation-dephosphorylation of enzymes.-Ann.Rev.Biochem.,vol.48,p.923-960.

149. Kuhn,B.,A.Yillringer,H.Falk,P.C.Heinrich.1982.Inhibit ionof cell-free protein synthesis by low molecular weight RNAs from free cytoplasmic ribonucleoprotein particles.-Eur.J.Biochem.,vol.126,N1,p.181-188.

150. Kurtz,D.T.,K.-M.Chan,P.Feigelson.1978.Translational control of hepatic o^ 2u globulin synthesis by growth hormone.-Cell,vol.15,N3,p.743-750.

151. Laemmli,U.K.1970.Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.-Nature, vol.227,N ,680-685.

152. Langan,T.A.1982.Characterization of highly phosphorylated subcomponents of rat thymus H1 histone.-J.Biol.Chem., vol.257,N24,p.14835-14846.

153. Lastick,S.M.,E.H.McConkey.1980.Control of ribosomal protein phosphorylation in HeLa cells.-Biochem.Biophys.Res. Commun.,vol.95,N3,p.917-923.

154. Lastic,S.M. ,E.H.McConkey. 1981.HeLa ribosomal protein S6.Insulin and dibutyryl cyclic AMP affect different phos-phopeptides.-J.Biol.Chem.,vol.256,12,p.583-585.

155. Lau,J,T,Y,,W,J.Lennarz,1983.Regulation of sea urchin glycoprotein mRNAs during embryonic development,-Proc.Hat, Acad.Sci.USA.vol.80,N4,p.1028-1032.

156. Leader,D.P.1980.The control of phosphorylation of ribosomal proteins.-In:Molecular aspects on cellular regulation. Recently discovered systems of enzyme regulation by reversible phosphorylation. Elsevier/North Holland Biomedical Press,vol.1,p.203-233.

157. Leader,D.P.,A.D.Rankiae,A.A.Coia.1976.The phosphorylation of ribosomal protein S6 in baby hamster kidney fibroblasts, Biochem.Biophys.Res.Comraun.,vol,71,N4,p.966-974.

158. Leader,D.P.,A.Thomas,H.O.Voorma,1981.The protein synthetic activity in vitro of ribosomes differing in the extent of phosphorylation of their ribosomal proteins.-Biochim. Biophys.Acta,vol.656,N1,p.69-75.

159. Lee,K,A.W.,N.Sonenberg.1982,Inactivation of cap-binding proteins accompanies the shut-off of host protein synthesis by poliovirus.-Proc.Nat.Acad,Sci.USA,vol,79, N11,p.3447-3451.

160. Legon,S.,R.J.Jackson,T.Hunt.1973.Control of protein synthesis in reticulocyte lysates by haemin.-Nature New Biology,vol.241,N ,p.150-152,

161. Leroux,A,,I,M.London,1982.Regulation of protein synthesis by phosphorylation of eukaryotic initiation factor 2o0 in intact reticulocytes and reticulocyte lysates,-Proc.Nat,Acad.Sci,USA,vol.79,N7,p.2147-2151.

162. Levin,D.H.,R.Petryshyn,I.M.London.1980.Characterization of double-stranded-RNA-activated kinase that phosphoryla-tes cL subunit of eukaryotic initiation factor 2 (eIP-2cL) in reticulocyte lysates.-Proc.Nat.Acad,Sci, USA,vol,77,N2,p,832-836.

163. Levin,D.H,,R.Petryshyn,I.M.London,1981.Characterization of purified double-stranded RNA-activated eIF-2 ot- kinase from rabbit reticulocytes.-J.Biol.Chem.,vol.256,N14, p.7638-7641.

164. Levy-Wilson,B.1981.Enhanced phosphorylation of high-mobility group proteins in nuclease-sensitive mononucleosomes from butyrate-treated HeLa cells.-Proc,Nat.Acad.Sci. USA,vol.78,N4,p.2189-2193.

165. Liautard, J.P., J.Sri Widada,C.tei"unal. 1981 .Particles containing small molecular weight nuclear RNAs (snRNPs).Structure and possible functions.-Mol.Biol.Rep.,vol.7,N1-3,p.41-45.

166. Lloyd,M.A., J. C. Osborne, B. Safer, G.M. Powe 11, W. C.Merrick. 1980.

167. Characteristics of eukaryotic initiation factor 2 and its subunits.-J.Biol.Chem.,vol.255,N3,p.1189-1193.

168. Lubben,T.H.,J.A.Traugh.1982.Purification and characterization of protease activated kinase II from rabbit reticulocytes,-Fed,Proc, ,vol.41,N4,p.872.

169. McCarthy,T.L.,E,Siegel,B.Mroczkowski,S,M.Heywood.1983.Characterization of translational-control ribonucleic acid isolated from embryonic chick muscle.-Biochemistry, vol.22,N4,p.935-941.

170. McDonald,J.R,,P,S,Agutter,1980.The relationship between polyribonucleotide binding and the phosphorylation and dephosphorylation of nuclear envelope protein.

171. PEBS-Letters,vol,1l6,N2,p,145-148,

172. McMullen,M.D.,P.H.Shaw,T.E.Martin.1979.Characterization of poly(A)+RNA in free messenger ribonucleoprotein and polysomes of mouse taper ascites cells.-J.Mol.Biol., vol.132,N4,p.679-694.

173. Martin-Perez,J.,G.Thomas.1983.Ordered phosphorylation of 40S ribosomal protein S6 after serum stimulation of quiescent 3T3 cells,-Proc.Nat.Acad.Sci,USA,vol.80,N4, p.926-930.

174. Marvil,D.K.,L.Nowak,W.Szer.1980.A single stranded nucleic acid-binding protein from Artemia salina.-J.Biol. Chem.,vol.255,N13,p.6466-6472.

175. Maxwell,C.R.,Rabinovitz,M.1969.Evidence for an inhibitor in the control of globin synthesis in a reticulocyte lysate.-Biochem.Biophys.Res^Commun. ,vol.35,N1,p.79-85.

176. Mayraud,S.,T.Pederson.1981.Nuclear ribonucleoprotein particles probed in living cells.-Proc.Nat.Acad.Sci.USA, vol.78,N4,p.2208-2212.

177. Mazur,G.,A.Schweiger.1978.Identical properties of an mRNA-bound protein and a cytosol protein with high affinity for polyadenylate.-Biochem.Biophys.Res.Commun.,vol.80, N1,p.39-45.

178. Meggio,F.,A.Donella Deana,A.M.Brunati,L.A.Pinna.1982.Inhibition of rat liver cytosol casein kinases by heparin,-FEBS-Letters,vol.141,N2,p.257-262.

179. Meggio,F.,A.Donella-Deana,L.A.Pinna.1981.Rapid and reliable identification of'casein kinases TS" in many tissues by means of a new specific and very suitable model substrate.-Anal.Biochem.,vol.111,N1,p.158-162.

180. Meggio,F,,A.Donella-Deana,L.A.Pinna. 1981 .Endogenous phosphate acceptor proteins for rat liver cytosolic casein kinases. -J.Biol.Chem.,vol.256,N23,p.11958-11961.

181. Mercier,J.-C.1981.Phosphorylation of caseins,present evidence for an amino acid triplet code posttranslationally recognized by specific kinases.-Biochimie,t.63»N1,p.1-17.

182. Hershey,W.B.1981.The purification and characterization of multiple forms of protein synthesis eukaryotic initiation factors 2,3 and 5 from rabbit reticulocytes.-J.Biol.Chem.,vol.256,N1,p.351-356.

183. Michel,M.R.,M.Schwyzer.1981.Large T-antigen associated withmessenger ribonucleoproteins of CV-I cells infected by simian virus SV-40.-Experientia,vol.37,lT6,p.654.

184. Michel,M.R.,M.Schwyzer.1982,Messenger ribonucleoproteins of cells infected by simian virus 40 contain large T-an-tigen.-Eur.J,Biochem.,vol.129,N1,p.25-32.

185. Mitchelson,K.,T.Chambers,E.M.Bradbury,,H.R.Mattews.1978. Activation of histone kinase in G2 phase of the cell cycle in Physarium polycephalum.-FEBS-Letters,vol.92, N2,p.339-342.

186. Mitsui,K.-I.,A.Datta,S.0choa.1981.Removal of the ft -subunit of the eukaryotic polypepetide chain initiation factor 2 by limited proteolysis.-Proc.Hat.Acad.Sci.USA,vol.78, N7,p.4128-4132.

187. Muller,W.E.G.,J,Arendes,R.K.Zahn,H.C.Schroder.1978.Control of enzymic hydrolysis of polyadenylate segment of messenger RNA:role of polyadenylate-associated proteins. -Eur. J. Biochem. ,vol.86,m,p.283-290.

188. Mumby,M.,J.A.Traugh.1979.Dephosphorylation of translational components by phospl^rotein phosphatases from reticulocytes. -Methods in Enzymology,vol.60,p.522-534.

189. Mumby,M.,J.A.Traugh.1979.Dephosphorylation of translational initiation factors and 40S ribosomal subunits by phos-phoprotein phosphatase from rabbit reticulocytes.

190. Biochemistry, vol. 18,1121,p. 4548-4556.

191. Nielsen,P.J,,G.Thomas,J.L.Maller.1982.Increased phosphorylation of ribosomal protein S6 during meiotic maturation of Xenopus oocytes,-Proc,Nat.Acad.Sci.USA,vol.79,N9, p.2937-2941.

192. Nilsen,T.W.,P.A.Moroney,C.Baglioni.1982.Initiation of protein synthesis in reovirus-infected HeLa cells with elevated levels of interferon-induced protein kinase activity.-J.Biol.Chem.,vol.257,N24,p.14593-14596.

193. Northemann,W.,E.Schmelz er,P.C.Heinrich.1980.Charact erizat ion of 20S and 40S non-polysomal cytoplasmic messenger ri-bonucleoprotein particles from rat liver.-Eur.J.Biochem,, vol.112,N3,p.451-459.

194. Pain,V.M.,M.J.Clemens.1983.Assembly and breakdown of mammalian protein synthesis initiation complexes:regulation by guanine nucleotides and by phosphorylation of initiation factor eIF-2.-Biochemistry,vol.22,N4,p.726-733.

195. Pavlovic-Houraac,M.,D.Delbauffe,A.Virion,J,Nunez.1973.Prot ein phosphokinases of bound and free thyroid polyribosomes.-FEBS-Letters,vol.33,N1,p.65-69.

196. Periasamy,M.,C.Brune1,J.M.Blanchard,P,Jeant eur.1977.Charact e-rization of a phosphoprotein phosphatase activity in ribonucleoprotein particles from HeLa cell nuclei.-Biochem.Biophys.Res.Commun.,vol.7 9,N4,p.1077-1083.

197. Periasamy,M.,C.Brunei,P.Jeanteur.1980.Protein kinase associated with mRNP from HeLa cell nuclei.Partial purification and properties.-Biochimie,t.61,N4,p.1190-1198.

198. Petryshyn,R.,D.H.Levin,I.M.London,1980,Purification and characterization of a latent precursor of a double-stranded RNA dependent protein kinase from reticulocyte lysates,-Biochem, Biophys,Res, Commun., vol. 94,N4,p• 1190-1198.

199. Petryshyn,R.,D.H.Levin,I.M.London.1982.Regulation of double-stranded RNA-activated eukaryotic initiation factor2cL kinase by type 2 protein phosphatase in retycu-locyt e lysat es.-Proc.Nat.Acad,Sci,USA,vo1,7 9,N21, p.6512-6516,

200. Pierre,M,,J,E,Loeb.1977.Regulation of a microsomal protein kinase from mouse liver by hemin and the interferon inducer tilorone.-Biochem.Biophys.Res.Commun.,vol.77, N2,p.481-488.

201. Pierre,M.,J.E.Loeb.1982.Purification and characterization of the cytoplasmic casein kinase I from rat liver.-Biochim.Biophys.Acta,vol.700,N2,p.221-228.

202. Pinna,L.A.1982.Protein phosphorylation:biochemical aspects and physiological significance.-Biol.Cell,vol.45,p.377.

203. Phillips,I,R.,E.A.Shephard,W.B.Tat cher, J. L. St e in, G. S. St ein.1979.Evidence for nonhistone chromosomal protein kinase activity associated with nucleosomes isolated from HeLa S^ cells.-FEBS-Letters,vol.106,N1,p.56-62.

204. Porath,J.,K.Aspberg,H.Drevin,R.Axen.1973»Preparation of cya-gen bromide-activated agarose gels.-J.Chromatography, vol.86,N1,p.53-56.

205. Preobrazhensky,A,A.,A.S.Spirin.1978.Informosomes and their protein components:the present state of knowledge.-In: Prog.Nucl. Acid Res. and Mol. Biol.,vol.21,p.2-38.

206. Princen,H.M.G.,C.A.G.van Eekelen,F.A.M. Asselbergs,W.J. van Venrooij.1979.Free cytoplasmic messenger ribonucleo-protein complexes from rabbit reticulocytes.-Molec.Biol.1. Rep.,vol.5,111-2,p.59-64.

207. Quirin-Stricker,Ch,,M.Schmitt.1977.Messenger RNA binding of a ribosome-associated protein kinase and a ribosomal phosphoprotein(s) in mouse plasmacytoma,-Biochim.Bio-phys.Acta,vol.477,N4,p.414-426,

208. Quirin-Stricker,C,,M,Schmitt,1981.Purification and characterization of a specific histone H1 protein kinase from mouse plasmacytoma,-Eur,J,Biochem,,vol.118,N1,p.165-172,

209. Ray, B.K., T. G. Brendler, S. Adya, S. Daniels-McQueen, J.MlLler,

210. J.W.B.Hershey,J.A.Grifo,W.C.Merrick,R.E.Thach.1983.

211. Role of mRNA competition in regulating translation: further characterization of mRNA discriminatory initiation fact ors.-Proc.Nat.Acad.Sci,USA,vo1.80,N3,p.663-667.

212. Reddy,R.,H,Busch.1983.Small nuclear RNAs and RNA processing,-IniProg.Nuc.Acid Res. and Mol.Biol.,vol,30,p.127-162.

213. Richter,J.D.,W,J.Wasserman,L.D.Smith.1982.The mechanism for increased protein synthesis during Zenopus oocyte maturation. -Develop. Biol. ,vol.89,N1,p.157-169.

214. Rose,K,M,,S,T.Jacob,1979,Phosphorylation of nuclear poly(A)po~ lymerase;comparison of liver and hepatoma enzymes,-J.Biol.Chem.,vol.254,N20,p.10256-10261.

215. Rose,K.M.,S.T.Jacob.1980.Phosphorylation of nuclear poly(ade-nylic acid) polymerase by protein kinasermechanism of enhanced poly(adenylic acid)synthesis.-Biochemistry, vol.19,N7,p.1472-1476.

216. Rose,K.M.,S.T.Jacob,A.Kumar.1979.Poly(A)polymerase and poly-(A)-specific mRNA-binding protein are antigenically related.-Nature,vol,279,N5710,p.260-262.

217. Rose,K.M. ,D.A.Stetler,S.T,. Jacob. 1981 .Protein kinase activity of RNA polymerase I purified from a rat hepatomajprobable function of Mr42000 and 24600 polypeptides,-Proc.Nat. Acad.Sci.USA,vol.78,N5,p.2833-2837.

218. Rosen,H.,G.Di Segni,R.Kaempfer,1982,Translational control by messenger RNA competition for eukaryotic initiation factor 2.-J.Biol.Chem.,vol.257,N2,p.946-952.

219. Rosenthal,E.T. ,T.Hunt, J.Ruderman. 1980.Selective translation, of mRNA controls the pattern of protein synthesis during early development of the surf clam,Spisula soli-dissima.-Cell,vol.20,N2,p.487-494.

220. Roy,R.K.,S.Sarkar.1982.Correlation between the protein and mRNA levels for myosin light chains and tropomyosin subunits during chick fast muscle development in vivo.-PEBS-Letters,vol.149,N1,p.22-28.

221. Rubin,C.S.,O.M.Rosen.1975.Protein phosphorylation.-In:Ann. Rev.Biochem,,vol,44.

222. Rychlik,W.,W.Zagorski.1980.Purification and characterization of adenosine-31,5'-phosphate-independent protein kinase from wheat germ,-Eur,J,Biochem.,vol.106,N2,p.653-659.

223. Safer,B,,M.Grunberg-Manago,D.Badman,F,Bergman,C,Freeman,

224. Safer,B,,R,Jagus,1981,The regulation of eIF-2 function during protein synthesis initiation,-Biochimie,t.63,N8-9, P.709-717,

225. Saffer,J.D.,J.E.Coleman,1980.Reversible phosphorylation ofa nucleosome binding protein that stimulates transcription of nucleosome DNA.-Biochemistry,vol.19,N2£p.5874-5883.

226. Samuel,C.E.,G.S.Knutson.1982.Mechanism of interferon action. Kinetics of induction of the antiviral state and protein phosphorylation in mouse fibroblasts treated with natural and cloned interferon,-J.Biol.Chem,,vol.257, N19,P.11791-11795.

227. Samuel,C.E.,6.S.Knutson.1982.Mechanism of interferon action.

228. Kinetics of decay of the antiviral state and protein phosphorylation in mouse fibroblasts treated with natural and cloned interferon.-J.Biol.Chem.,vol.257,N19,p.11796-11801.

229. Sarkar,S.,A,K.Mukherjee,C,Guha,1981.A ribonuclease-resistant cytoplasmic 10S ribonucleoprotein of chick embryonic muscle,(A potent inhibitor of cell-free protein synthesis). -J. Biol. Chem. ,vol.256,N10,p.5077-5086.

230. Sarma,M.H.»N.K.Chatterjee,1980.A low molecular weight nuclear RNA from HeLa Cells inhibits exogenous messenger RNA-dependent protein synthesis.-Biochim.Biophys.Acta,vol. 608,N2,p.387-397.

231. Schaffner,W. »C.Weissman. 1973.Rapid,sensitive and specificmethod for determination of protein in dilute solution,-Anal.Biochem.,vol,56,N2,p.502-514.

232. Schlepper,J.,R.Knippers,1975.Nuclear protein kinases from murine cells.-Eur.J.Biochem,,vol.60,N1,p.209-220.

233. Schmid,H,-P,,M.Schonfelder,B.Setyono,K.Kohler.1983. 76kDa poly-(A)-protein is involved in the formation of 48S initiation complexes.-FEBS-Lett ers,vol.157,N1,p.105-110.

234. Schmitt,M,,J,Kempf,C.Quirin-Stricker,1977.Resolution and general properties of different types of ribosomal protein kinases in mouse plasmocytoma.-Biochim.Biophys,Acta, vol.481,N2,p,438-449.

235. Schweiger,A.,G.Mazur.1975.Rat liver soluble nuclear andcytoplasmic proteins with high affinity to polynucleotides. -FEBS-Lett ers,vo1.60,N1,p.114-118.

236. Sculley,T.B.,A.G.Mackinlay,1982.Substrate specificity studies on a calf thymus nuclear phospliprotein kinase.-Eur. J» Biochem.,vol.124,N3,p.449-455.

237. Shoemaker,C.B,»R.Chakley.1980,H3-specific nucleohistone kinase of bovine thymus chromatin.-J.Biol.Chem.,vol.255,N22, p.11048-11055.

238. Shull,G.E.,E.C,Theil.1982.Translational control of ferritin synthesis by iron in embryonic reticulocytes of the bullfrog.-J,Biol.Chem.,vol.257,N23,p.14187-14191.

239. Shull,G.E.,E.C,Theil.1982.Translational control of ferritin synthesis by iron in red blood cells of embryos,-Fed.Proc.,vol.41,N4,p.1285.

240. Siekierka,J.,V.Manne,L.Mauser,S.Ochoa.1983.Polypeptide chain initiation in eukaryotes:reversibility of the ternary complex-forming reaction.-Proc.Nat.Acad.Sci.USA,vol.80, N5,p.1232-1235.

241. Siekierka,J.,L.Mauser,S.Ochoa.1982.Mechanism of polypeptide chain initiation in eukaryotes and its control by phosphorylation of the oC-subunit of initiation factor 2.-Proc.Nat.Acad.Sci.usa,vol.79,N8,p.2537-2540.

242. Siekierka, J, ,K.-I.Mitsui,S.Ochoa. 1981:.Mode of action of he-mine-controlled translational inhibitor:relationship of eukaryotic initiation factor 2-stimulating protein to translation restoring factor.-Proc.Nat.Acad,Sci.USA, vol.78,N1,p.220-223.

243. Simkowski,K.W.,M.Tao.1980.Studies on a soluble human erythrocyte protein kinase.-J.Biol.Chem.,vol.255,N13,p.6456-6461.

244. Sonenberg,N.,D.Skup,H.Trachsol,S.Millward.1981.In vitrotransaltion in reovirus and poliovirus-infected cell extracts,Effects of anti-cap binding protein monoclonalantibody.-J.Biol.Chem.,vol.256,N9,p.4138-4141.

245. Spirin,A.S.1979.Messenger ribonucleoproteins (informosomes) and RNA-binding proteins.-Mol.Biol.Rep.,vol.5,N1-2, p.53-57.

246. Spirin,A.S.1978.Eukaryotic messenger RNA and informosomes.

247. Omnia mea mecum porto.-FEBS-Letters,vol.88,N1,p.15-17.

248. Spirin,A.S.,L.P.0vchinnikov.1980.Informosomes and RNA-binding proteins of eukaryotic cells.-In* Soviet Scientific Reviews,section D.Biology Reviews (Physico-Chemical Aspects),vol.1,p.157-213.

249. Standart,N.,A.Vincent,K,Scherrer.1981.The polyribosomalpoly(A)-binding protein is highly conserved in vertebrate species.Comparison in duck,mouse and rabbit.-FEBS-letters,vol.135,N1,p.56-60.

250. Stetler,D.E.,K.M.Rose.Phosphorylation of deoxyribonucleic acid dependent RNA polymerase II by nuclear protein kinase Nlljmechanism of enhanced ribonucleic acid synthesis.-Biochemistry,vol.21,N15,p.3721-3728.

251. Stetler,D.A.,K.M.Rose.1983.Protein kinase Nil.Interaction with RNA polymerase II and contribution to immunological cross-reactivity of RNA polymerase I and II.-Biochim. Biophys.Acta,vol.739,N1,p.105-113.

252. Stringer,E.A,,A.Chandhuri,U.Maitra.1979.Purified eukaryotic initiation factor 2 from calf liver consists of two polypeptide chains of 48000 and 38000 daltons.-J.Biol. Chem.,vol.254,N15,p.6845-6848.

253. Stringer,E.A.,A.Chaudhuri,D.Valenzuela,U.ffiaitra.1980.Rabbit reticulocyte initiation factor 2 consists of two polypeptide chains of molecular weight 48000 and 38000,

254. Tahara,S.M.,M.A.Morgan,A.J.Shatkin.1981.Two forms of purified7m'G-cap binding protein with different effects on capped mRNA translation in extracts of uninfected and poliovirus-infected Hela cells.-J.Biol.Chem,,vol.256, N15,p.7691-7694.

255. Tahara,S.M.,J.A.Traugh.1981.Cyclic-nucleotide-independent protein kinase from rabbit reticulocytes.Indentification andcharacterization of a protein kinase activated by proteolysis. -J. Biol. Chem. ,vol.256,N22,p.11558-11564.

256. Tahara,S.M.,J.A.Traugh,S.B.Sharp,T.S.Lundak,B.Safer,W.C.Merrick, 1978.Effect of hemin on site-specific phosphorylation of eukaryotic initiation factor 2,-Proc,Nat.Acad. Sci.USA,vol.75,N2,p.789-793.

257. Takai,Y.,A,Kishimot o,Y.Iwaza,Y.Kawahara,T.Mori,Y.Nishizuka. 1979.Calcium-dependent activation of a multifunctional protein kinase by membrane phospholipids,-J.Biol.Chem.,vol.254,N10,p.3692-3695.

258. Takai,Y.,M.Yamamoto,M.Inone,A.Kishimoto,Y.Nishizuka.1977. A proenzyme of cyclic nucleotide-independent protein kinase and its activation by calcium-dependent neutral protease from rat liver.-Biochem.Biophys.Res,Commun., vol.77,N2,p.542-550.

259. Terao,K.,K.Ogata.1979.Proteins of small subunits of rat liver ribosomes that interact with poly(U). II.Crosslinks between poly(U) and ribosomal proteins in 40S sub-units induced by UV irradiation.-J.Biochem,,vol,86,N3, p.605-617.

260. Thiele,B,J.,H,Andree,M.Hohne,S.M.Rapoport.1982.Lipoxygenase mRNA in rabbit reticulocytes.Its isolation,characterization and translational repression.-Eur.J.Biochem., vol.129,N1,p.133-141.

261. Thomas,G.,J.Martin-Perez,M.Siegmann,A.M.Otto.1982.The effect of serum,EGPjPGPg and insulin on S6 phosphorylation and the initiation of protein and DNA synthesis,-Cell,vol,30,N1,p.235-242,

262. Thomas,J.0.,Razinddin,A.Sobota,M.Boublik,W.Szer.1981.A RNA helix-destabilizing protein is a major component of Artemia salina nuclear ribonucleoproteins,-Proc,Nat,. Acad.Sci,USA,vol.78,N5,p.2888-2893.

263. Thomas,G.,M.Siegmann,J.Gordon.1979.Multiple phosphorylation of ribosomal protein S6 during transition of quiescent 3T3 cells into early G1 and cellular compartmentaliza-tion of phosphate donor.-Proc.Nat.Acad.Sci.USA,vol.76, N8,p.3952-3956.

264. Thomas,G.,M.Siegmann,A.-M.Kubler,J.Gordon,I.J.de Asua.1980. Regulation of 40S ribosomal protein S6 phosphorylation in swiss mouse 3T3 cells.-Cell,vol.19,N4,p.1015-1023.

265. Thornburg,W.,S.Gamo,A.F.0'Malley,T.J.Lindell.1979.Properties of rat liver nuclear protein kinases.-Biochim.Biophys. Acta,vol.571,N1,p.35-44.

266. Thornburg,W.,T.J.Lindell.1977.Purification of rat liver nucle-' ar protein kinase N11.-J.Biol.Chem.,vol.252,N19,p.66606665.

267. Thornburg,W.,A.F.O'Malley,T.J.Lindell.1978.Purification of rat liver nuclear protein kinase N1.-J.Biol.Chem.,vol.253, N13,p.4638-4641.

268. Tolan,D.R.,R.R.Traut.1981.Protein topography of the 40S ribosomal subunit from rabbit reticulocytes shown by cross-linking with 2-iminothiolane.-J.Biol.Chem., vol.256,N19,p.10129-10136.

269. Traugh,J.A.,I.S.Lundak.1978.Phosphorylation of translational initiation factor 3 (eIF3) by cyclic AMP-regulated protein kinase.-Biochem. Biophys. Res. Coramun,,,vol.83, N2,p.379-384.

270. Traugh,J.A.,S.M.Tahara,S.B.Sharp,B.Safer,W.C.Merrick.1976. Factors involved in initiation of haemoglobin synthesis can be phosphorylated in vitro.-Nature,vol.263,N5573, p.163-165.

271. Traugh,J.A.,R.R.Traut.1974.Characterization of protein kinases from rabbit reticulocytes.-J.Biol.Chem.,vol.249, N4,p.1207-1212.

272. Tuazon,P.T.,E.Bingham,J.A.Traugh.1979.Cyclic nucleotide-in-dependent protein kinases from rabbit reticulocytes. Site specific phosphorylation of casein variants.-Eur.J,Biochem,,vol.94,N2,p,497-504.

273. Tuazon,P.T.,W.C.Merrick,J.A.Traugh.1980.Site-specific phosphorylation of initiation factor 2 by three cyclic nucleo^ tide-independent protein kinases.-J.Biol,Chem,,vol,255, N22,p.10954-10958.

274. Tuazon,P.T.,J,T,Stull,J,A.Traugh.1982,Phosphorylation of myosin light chain by a protease-activated kinase from rabbit skeletal muscle.-Eur.J.Biochem,,vol.129,N1,p.205-209.

275. Ulbrich,N.,A.Lin,I.G.Wool,1979.Identification by affinity chromatography of the eukaryotic ribosomal proteins that bind to 5,8S ribosomal ribonucleic acid.-J.Biol. Chem.,vol.254,N17,p.8641-8645.

276. Princen,1977,Specific poly-A-binding protein of 76000 molecular weight in polyribosomes is not present on po-lyA of free cytoplasmic mRNP,-Nature,vol.270,N5633, p.189-191.346.van VenrooiJ,W,J.,A,J,M.Wagenmakers,P. van den Oetelaar,

277. R.J.Reinders.1981.In vivo cross-linking of proteins to uiRNA in human cells.-Mol,Biol,Rep,,vol.7,N1-3, p.93-99.

278. Vincent,A.,O.Givelli,K.Maundrell,K.Scherrer.1980.Identification and characterization of the translationally repressed cytoplasmic globin messenger-ribonucleoprotein particles from duck erythroblasts.-Eur.J.Biochem.,vol. 112,N3,p.617-633.

279. Vincent,A.,S.Goldenberg,N.Standart,0.Givelli,T.Imaizumi-Scherrer,K.Maundrell,K,Scherrer.1981.Potential roleof mRNP proteins in cytoplasmic control of gene expression in duck erythroblasts,-Mol.Biol.Rep.,vol.7,N1-3, P.71-81.

280. Vlasik,T.N.,S.P.Domogatsky,T,A.Bezlepkina,L.P,Ovchinnikov. 1980.RNA-binding activity of eukaryotic initiation factors of translation,-PEBS-Letters,vol.116,N1,p.8-10,

281. Vlasik,T.N.,L,P,Ovchinnikov,Kh.M.Radjabov,A,S.Spirin.1978. Translational factors of the wheat embryo extract are

282. RNA-binding proteins.FEBS-Letters,vol.88,N1,p. 18-20.351 .Walden,W.E. ,T.Godefroy-Colbum,R.E.Thach. 1981 .The role ofmRNA competition in regulating translation. ^Demonstration of competition in vivo,-J.Biol.Chem.,vol.256, N22,p.11739-11746.

283. Walton,G.M.,G.M.Gill,1975.Nucleotide regulation of an eukaryotic protein synthesis initiation complex.-Biochim.Bio-phys.Acta,vol,390,Fl,p.231-245,

284. Wasserman,W,J.,J.D.Richter,L,D.Smith.1982.Protein synthesis during promoting factor- and progesterone-induced maturation in Xenopus oocytes.-Devel.Biol., vol.89,N1,p.152-158.

285. Weller,M,Protein phosphorylation.Pion Lmt,London,1979.

286. Wettenhall,R.E.H,,C.N.Chesterman,T.Walker,P.J.Morgan,1983, Phosphorylation sites for ribosomal S6 protein kinases in mouse 3T3 fibroblasts stimulated with plateled-derived growth factor,-FEBS-Letters,vol,162,N1,p.171-176,

287. Wettenhall,R.E,H.,G.J.Hewlett.1979,Phosphorylation of a specific ribosomal protein during stimulation of thymocytes by concanavalin A and prostaglandin E^.-J.Biol.

288. Chem,,vol.254,N18,p.9317-9323,

289. Wilson,M.J.,R.C.Steer,K.W.Kaye.1982.Presence and characterization of two protein kinases activities in humans eminal fluid.-Bio chim.Biophys.Act a,vol,700,N2,p.206-212.

290. Wong,S.T.,W.Mastropaolo,E.C,Henshaw.1982.Differential phos- • phorylation of soluble versus ribosome-bound eukaryotic initiation factor 2 in the Ehrlich ascites tumor cells,-J,Biol.Chem.,vol.251,N9,p.5131-5238.

291. Yamamot o,M.,W,E.Criss,Y.Takai,H.Yamamura,Y.Nishizuka.1979.

292. A hepatic soluble cyclic nucleotide independent protein kinase.Stimulation by basic polypeptides,-J.Biol.Chem., vol.254,E12,p.5049-5052.

293. Yap,S.H.,R.K.Strair,D.A.Shafritz, 1978.Identification of albumin mRNPs in the cytosol of fasting rat liverjinfluence of tryptophan or a mixture of amino acids.-Biochem.Biophys.Res,Commun,,vol.83,N2,p.427-433.

294. Yenofsky,R.,I.Bergman,G.Brawerman,1982,Messenger RNA species partially in a repressd state in mouse sarcoma ascitescells.-Proc.Nat.Acad.Sci.USA,vol.79,N19,p.5876-5880.

295. Zahringer,B.S.Baliga,H.N.Munro.1976.Novel mechanism for translational control in regulation of ferritin synthesisby iron.-Proc.Nat.Acad.Sci.USA,vo1.73,N3,p.857-861.

296. Zilberstein,A.,A.Kimchi,A.Schmidt»M.Revel.1979.Isolation of two interferon-induced translational inhibitors: a protein kinase and an oligo-isoadenylate synthetase.-Proc.Nat.Acad.Sci.USA,vol.75,N10,p.4734-4738.

297. Zumbe,A.,C.Stahli,H.Trachsel.1982.Association of a ^50000 cap-binding protein with the cytockeleton in baby hamster kidney cells.-Proc.Nat.Acad.Sci,USA,vol.79,N9,p.2927-2931.