Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Казеиновая киназа второго типа при различных физиологических состояниях эукариотической клетки

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Казеиновая киназа второго типа при различных физиологических состояниях эукариотической клетки"

р V $ " РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК

О '/.Г1!'.' •. ИНСТИТУТ БИОХИМИИ им. А.Н.БАХА РАН

на правах рукописи УДК 577.152.5

ТУРАПОВ Оболбек Акматбекович

КАЗЕИНОВАЯ КИНАЗА ВТОРОГО ТИПА ПРИ РАЗЛИЧНЫХ ФИЗИОЛОГИЧЕСКИХ СОСТОЯНИЯХ ЭУКАРИОТИЧЕСКОЙ КЛЕТКИ

03.00.04 - биологическая химия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 1995

Работа выполнена в группе Регуляции биосинтеза белка Института биохимии им. А.Н.баха РАН

Научный руководитель: кандидат биологических наук

А.С.Стеланов

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

профессор P.C. Шакулов доктор биол. наук М.А. Панов

Ведущее учреждение:

Московский Государственный Университет им.М.В. Ломоносова Биологический факультет

За щита диссертации состоится 28 ноября 1995 года в 10 часов на заседании специализированного Совета (К 002.96.01) по присуждению ученой степени кандидата биологических наук в Институте биохимии им. А.Н.Баха РАН (117071, Москва, Ленинский проспект, 33, корп. 2).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологической литературы РАН (Москва, Ленинский проспект, 33, корп. 1).

Автореферат разослан

1995 г.

Ученый секретарь специализк доктор биологических наук

М.И. Молчанов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Казеиновая киназа типа 2 (СК-2) является характерным ферментом всех изученных типов клеток эукариот. Анализ первичной структуры субьединиц фермента, выделенного из разных источников от дрожжей до человека [Saxena et al.. 1987, Chen Wu et al.. 1988, Meisner et al.. 1989, Dobrowolska et al.. 1991, Mandor et al., 1991, Jedlicki et al., 1992,] окончательно подтвердил представления об уникальности и консервативности СК-2; позволил обосновать некоторые эмпирические свойства СК-2, в частности, РНК-связывающую активность фермента (Ни and Rubin, 1990, Gatica et al.,1994). Именно белки, также обладающие РНК-связывающей активностью (ферменты и белковые факторы, осуществляющие и контролирующие экспрессию генома эукариот), составляют главную группу субстратов СК-2. Участие в контроле процессов, связанных с функционированием нуклеиновых кислот, по-видимому, является основной функцией СК-2.

Установлено, что изменение активности СК-2 сопряжено -с любыми изменениями физиологического состояния клеток, будь то трансформация, дифференцировка, рост или пролиферация клеток [Krebs et al.,1988, Berberich and Cole.,1992, Pepperkok et al.,1994, Gruppuso et al.. 1995]. Однако, отсутствие явных вторичных мессенджеров для СК-2, широкая субстратная специфичность фермента [Pinna, 1990, Allende et al., 1995) значительно усложняет анализ процессов активации - ингибирования СК-2 in vivo. Возможно, наблюдаемые изменения активности CIC-2 являются следствием перераспределения фермента между различными клеточными структурами Действительно, иммуноцитохимическими методами было показано, что действие некоторых гормонов вызывает обратимую транслокацию СК-2 из цитоплазмы в ядро эукариотических клеток (Filhol et al.,1990, Ahmed et al.,1993]. По-видимому, CK-2 распределяется по всему клеточному пространству неравномерно и в значительной степени зависит от локализации природных субстратов

фермента, определяемой физиологическим состоянием клетки. Наблюдаемая во многих работах активация СК-2 может быть объяснена переходом фермента в обычно исследуемую фракцию свободных цитозольных белков из мембрано/цитоскелет-связанной фракции.

Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы состояла в экспериментальном обосновании предположения о том, что регуляция активности СК-2 в клетках эукариот на посттрансляционном уровне осуществляется за счет обратимой локализации фермента в различных клеточных структурах.

В связи с этим были поставлены следующие экспериментальные задачи:

1.Охарактеризовать изменение активности СК-2 во фракции свободных РНК-связывающих белков в процессе прогестерон-стимулируемого мейотического созревания ооцитов Rana temporaria.

2. Определить ферментативную активность СК-2 в клеточных фракциях (мембраны, цитоскелет, нуклеопротеиды, свободные белки цитоплазмы), полученных из ооцитов, находящихся на разных стадиях мейотического созревания.

3. Определить влияние нейродегенеративных процессов (болезнь Альцгеймера, шизофрения) на активность СК-2 во фракции свободных РНК-связывающих белков мозга человека.

4. Исследовать in vitro зависимость РНК-связывающей и ферментативной активностей СК-2 от величины рн.

Научная новизна работы. Впервые проведено систематическое исследование характера изменения активности СК-2 во фракции свободных РНК-связывающих белков в процессе мейотического созревания ооцитов Rana temporaria. Показано, что возрастание активности СК-2 при стимуляции ооцитов прогестероном обусловлено как посттрансляционной активацией фермента, так и биосинтезом СК-2 de novo на завершающих стациях созревания. Впервые показано, что активация СК-2 на посттрансляционном уровне является результатом перехода мембрано- и цитоскелет-связанных фракций в свободную "' 2 >

цитозольную фракцию. Обнаружено резкое падение удельной

активности СК-2 во фракции свободных РНК-связывающих белков при---------------------

нейродегенеративных процессах о мозге человека. Тотальная клеточная активность СК-2 в исследованных процессах остается постоянной. Выявлена зависимость РНК-связывающей активности СК-2 от величины рН в созревающих ооцитах Rana temporariat Предполагается, что изменение рН от 6,5 до 7,5, наблюдаемое при созревании ооцитов и приводящее к диссоциации комплексов СК-2 - РНК служит механизмом регуляции ферментативной активной и компартментализпции СК-2.

Апробация работы. Результаты исследований были представлены на международных симпозиумах о г, Пущино 1991 (Россия), в г. Иерусалим 1993 (Израиль), докладывались на рабочих семинарах и конкурсах научных работ ИНБИ РАН (1991, 1992), совместных семинарах с Институтом биологии развития РАН, и с Институтом белка РАН. По материалам диссертации опубликовано 2 печатных работ, 1 подготовлена к печати.

С1рух1ураллбьем_рабйты. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы (180 ссылок). Работа изложена на 110 стр. машинописного текста, содержит 25 рисунков и 3 таблицы.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Объектами исследования выбраны ооциты травяной лягушки

{Rana temporaria} и кора головного мозга крысы и человека в норме и патологии (болезнь Альцгеймера и шизофрения). Обычно клетки и ткани гомогенизироаали в стандартном буфере, содержащем 0,01 М триэтаноламин, 0,01 М KCI, 0.05 М MgCI2, 0,001 М ЭДТА, 0,006 М 2-меркаптоэтанол, 10% глицерин, рН 7,8; с 0,1 М NaCI. СК-2 из безрибосомных экстрактов очищали до гомогенного состояния в три стадии последовательным хроматографированием на гепарин-

Сефарозе, фосфоцеллюлозе, и на колонке mono-Q системы FPLC (Pharmacia). Определение протеинкиназной активности проводили а стандартном буфере с [3JP]GTP/ATP, в качестве субстрата добавляли казеин (60 мкг). Ингибирование гепарином и полинуклеотидами также измеряли в стандартной системе при различных значениях pH буфера. Для определения РНК-связывающей активности СК-2 использовали метод сорбции РНП-комплексов на мембранных нитроцеллюлозных фильтрах, активность выражали количеством меченой [иС]рРНК, задержавшейся на фильтрах. SOS-электрофорез проводили по методу Леммли (Laemmli 1970). Концентрацию белка определяли по методу Шаффнера и Вейсмана (Schaffner, Weissman, 1973). Высоковольтный электрофорез на бумаге Whatman ЗММ проводили в 3 H уксусной кислоте (pH 2,11) при 4900,В в течение 2 часов на приборе фирмы "Savant", США.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Разработка универсальной схемы очистки СК-2.

Консервативность структуры СК-2 и широкая распространенность в таксономически разных группах может свидетельствовать о важной роли фермента в эукариотических клетках. Неудивительно, что СК-2, выделенные из разных источников имеют одинаковые характеристики, и для них применима универсальная схема очистки.

Для получения СК-2 из цитозопьной фракции ооцитов амфибии йапа temporalis и мозга крысы ткани гомогенизировали в стандартном буфере с 0,1 M NaCI. Гомогенат фракционировали ультрацентрифугированием до получения безрибосомного экстракта и наслаивали на колонку с Гепарин-Сефарозой для выделения фракции РНК-связывающих белков. Известно, что Гепарин-Сефарозу довольно часто используют вместо поли (U)- или РНК-Сефарозы при выделении белков, обладающих неспецифической РНК-связывающей активностью. После элюции активную фракцию разбавляли буфером до 0,1 M NaCI и наносили на колонку с фосфоцеллюлозой. Фракции, содержащие CK-

ГОМОГЕНИЗАЦИЯ 0,1 М NaCI (цитозольная фракция). 0,5 М NaCI и 1% Triton Х-100 (цитоскелет/мембрано-связанные фракции).

20 000д, 30 min

ЭКСТРАКТ,

(разбавление цитоскелет/мембрано-сеязанных фракций до 0,1 М NaCI)

108 000д, 90 т!п

ХРОМАТОГРАФИЯ НА ГЕПАРИН-СЕФАРОЗЕ наслаивание - 0,1 М N80, элюция - 0,1-0,75 М N80

СК-2 ФРАКЦИЯ (0,45-0.6 М N30). разбавление до 0,1 М N80

1

ХРОМАТОГРАФИЯ НА ФОСФОЦЕЛЛЮЛОЗЕ наслаивание - 0,1 М N80, элюция • 0,1-0,75 М N80

СК-2 ФРАКЦИЯ (0.35-0,5 М N801), разбавление до 0,1 М МаС1

ХРОМАТОГРАФИЯ НА MONO•S (РР1С) (для цитоскелет/мембрано-саяэанных фракций)

I

СК-2 ФРАКЦИЯ (несорбирующаяся на MONO-S)

I .

ХРОМАТОГРАФИЯ НА МОМО-О (РРСС) наслаивание - 0,1 М N80, элюция • 0,1-0,5 М N80

I

СК-2

гомогенная фракция (0,37-0,42 М №С1)

Рис. 1. Универсальная схема очистки СК-2.

5Г

2, после хроматографии на фосфоцеллюлозе очищали до гомогенного состояния на колонке mono-Q системы FPLC (Рис.1).

Для выделения СК-2 из цитоскелет- и мембрано-ассоциированной фракции клеточных белков ткани гомогенизировали в стандартном буфере с 0,5 М NaCI и 1% Triton Х-10О. Экстракт после центрифугирования при 30 000д, 30 мин. разбавляли стандартным буфером до О,1 М NaCI. Далее все процедуры проводили как и при выделении СК-2 из цитозольной фракции. На рис. 2. показаны профили распределения активности СК-2 при хроматографии на Гепарин-Сефарозе и фосфоцеллюлозе. При элюции с колонок mono-Q фракция СК-2 сильно загрязнена (рис. 3). Для очистки фермента фракцию, полученную пойле фосфоцеллюлозы наносили на колонку с mono-S, связывающую все балластные белки. Последующей хроматографией на mono-Q белков, не сорбировавшихся на mono-S, получали гомогенный препарат СК2 (рис.?).

При выделении СК-2 из цитоскелет/мембрано-связанных фракций

оказалось, что на каждой стадии очистки тотальная активность

фермента (а не только удельная!) увеличивается. Вполне возможно, что

в жестких условиях (0,5 М NaCI, 1% Triton Х-100) из клеток

экстрагируются также эндогенные ингибиторы, находящиеся в

*1>

комплексе с ферментом вплоть до последней стадии очиски СК-2. Действительно, добавление аликвот из некоторых фракций, сорбировавшихся на колонке mono-S, практически полностью подавляет фосфорилирование казеина, катализируемое СК-2 (рис. 4.).

Таблица 1. Очистка СК-2 из мозга человека.

Стадия очистки белок, , мкг активность , пмоль/ч уд.активность, пмоль/ч на мкг белка

Гепарин-Сефароза 2000 242000 121

Фосфоцеллюлоза 300 248000 827

колонка MonoQ 20 277000 13850

Результаты хроматл'ра^ической очистки из мозга человека (норма). А - колонка с гепарин-сефярозой, В - колонка с фосфоцеллюлозой, С - Ki

ломка '--ono-Q

1 - оптическая ПЛОТНОСТЬ Aggg

2 - градиент концентрации Nad (ионной силы)

3 - ферментативная активность СК-2

7

« 11 14

В.

то но -£

) Г

т о по-О

¿0 I? 15 1» ¡? 16

' «—ч гг» ^

. 66 . 45 . 30

Рис 3. БОБ-электрофорез СК-2 из мозга человека (в норме) после хроматографии на гепарин-сефарозе, фосфоцеллюлоэе и в снсгемеРРЬС. А - хроматография на колонке шопо^. Фракции 12, 13, 14 содержат негомогенный СК-2.

В - последовательная хроматография на шопо-Б и топо-у. На колонке шопо-Б сорбируются балласгные белки, фракции 16, 17 после колонки топо<> содержат гомогенный СК-2.

Агго Щ РЫ> |б' Г!

Kto

го

Рис.4 Результаты хромагографической очистки СК-2 из мозга человека (норма). А - колонка с гепарин-сефарозой, В - колонка с фосфо-йеллюлозой, С - колонка raono-S (FPLC) D- колонка mono-Q (РРЬС)

1 - оптическая плотность A£qo

2 - градиент концентрации Nad (ионной силы)

3 - ферментативная активность СК-2

9 .:

На- плекгрофореграмме этих фракций

выявлены полипептиды с мол. весом 56-57 кДа, отсутствующие во всех остальных фракциях элюата с колонок mono-S (рис.;? )• Как известно, до сих пор еще не выявлены природные ингибиторы СК-2, и обнаружение таких ингибиторов дало бы ключ к пониманию процессов регуляции СК-2 в клетках эукариот.

2. СК-2 активируется при созревании ооцитов Rana temporary

Для стимулированных прогестероном ооцитов Rana temporaria характерно возрастание уровня трансляции на стадиях, предшествующих разрушению зародышевого пузырька (ЗП). Увеличение биосинтеза РНК-связывающих белков наблюдается через 7 ч после добавления гормона, затем заметно снижается, параллельно с этим изменяется и активность СК-2 (рис.5)-

Через 7 ч после стимуляции ооцитов прогестероном самофосфо-рилирование во фракции свободных РНК-связывающих белков возрастало в 10 раз по сравнению с исходными, не стимулированными прогестероном, яичниковыми ооцитами, затем вновь снижалось. Повторное возрастание активности СК-2 (в 2-4 раза) наблюдается на стадиях разрушения ЗП, завершающих мейотическое созревание ооцитов. Можно предположить, что наблюдаемые изменения активности СК-2 связаны с биосинтезом de novo РНК-связывающих белков, в частности, самого фермента и/или его эндогенных субстратов.

Добавление в среду циклогексимида на 90-95% подавляет и биосинтез РНК-связывающих белков в ооцитах, однако, несмотря на ингибироваше трансляции, всплеск активности СК-2 наблюдается вновь через 7 ч после стимуляции ооцитов прогестероном (рис.5 ). Последующее падение активности фермента также не зависит от биосинтеза белков, добавление циклогексимида в момент максимального подъема активности СК-2 (7 ч) не препятствует этому спаду. Эти результаты исключают объяснение активации СК-2 за счет новообразования фермента или его субстратов. Таким образом, как активация СК-2 так и ее последующее ингибироеание на ранних

Срт л/О

2.0 •

1.0

1.0

А- -

*-иг

п

Р. ftMOAi НКГ

.ь

.3

? 12 /б го дз

IMic 5. 11 iMciiv'HHo ¡ucnmiiiH-m С'К-2 и уровня бносинтсм белкой в ооцитах Runa temporaria при сгнмуляиии мсЛотнческо! о софеишшя прогестероном UU >. I - iipoivHiiKiiiiainyio акгнвность СК-2 определяли в стандартной chcivmc no включению М* в кик-ми.

2 - Сносите» Годка определял» по включению радиоактивно меченых аминокислот (они добавлялись одновременно с прогестероном) в ТХУ осаждаемый материал фракции PI IK-свячывающик белков. В отдельных опытах, кроме прогестерона, в сре;^у вносили 40-50 ыкг/мл циклогексимида согласно приведенной нижесхеме.

1. К оошгшм был добавлен прогестерон (момент времени = 0). 2. Одновременно к прогестероном к части ооцигов добавляли циклогексимид и инкубировали 7 ч. 3. Через 7 ч к другой части ооцитов добавляли циклогексимид. Общая продолжительность инкубации составляла 23 ч. 4. HepeJ 12 и 16ч проводили аналогичные процедуры.

И

/

I

/

I

I

стадиях созревания ооцитов R.temporaria являются следствием изменения активности предсуществующего фермента, т.е. происходят на посттрансляционном уровне. Повышение активности СК-2 на поздних стадиях созревания, в период разрушения ЗП, блокируется циклогексимидом и может быть объяснено биосинтезом фермента de novo на этих стадиях (рис.5)-

3. Активация СК-2 в прогестерон-стимулиоованных ооиитах Rana temporaria обусловлена переходом фермента из иитоскелет/мембрано-связанной Фракции во фракцию свободных читозольных белков.

На примере стимулированных к мейотическому созреванию прогестероном ооцитов R. temporaria продемонстрирована активация СК-2 при изменении физиологического состояния клетки. Для выяснения возможных механизмов активации СК-2 в этом процессе определяли активность фермента (рис. 6 ) в различных клеточных фракциях (мембраны, цитоскелет, РНП, свободные белки). Если предположить, что в клетке поддерживается равновесие между цитоскелет/мембрано-связанными и свободной (цитозольной) фракциями фермента, то. при изменении физиологического состояния клетки (в данном случае в ответ на действие прогестерона) это равновесие может сдвигаться в ту или иную сторону. Оказалось, что при обработке ооцитов прогестероном значительная часть СК-2 переходит из цитоскелет/мембрано-связанной фракции во фракцию цитозольных белков, чем и можно объяснить наблюдаемое нами резкое возрастание активности СК-2 во фракции свободных РНК-связывающих белков (рис. 5). Тотальная клеточная активность фермента в процессе прогестерон-стимулируемого созревания ооцитов R. temporaria оставалась при этом практически неизменной (рис. 6 ).

4. Изменение активности СК-2 пои болезни Альагеймеоа

Уникальным объектом исследования внутриклеточной

локализации СК-2 в зависимости от физиологического состояния клеток служат нейроны, для нормального функционирования которых фосфорилирование белков цитоскелета является определяющим

IZ

ТКАНЬ

гомогенизация в 0,1 М №С1

ЦЕНТРИФУГИРОВАНИЕ

20 000д. 30 гтап

^ Гепарин-сефароза

ОСАДОК гомогенизация в 0,3-0,5 М ЫаС1

ЦЕНТРИФУГИРОВАНИЕ 20 000д, 30 гп!П

^ цитозольная СК-2

Гепарин- , ^РНЛ/цитоскелет/мембрано-сефароза связанные СК-2

ОСАДОК гомогенизация в 1% ТЫоп Х-100, 0.5 М МаС1

ЦЕНТРИФУГИРОВАНИЕ

20 ОООд. 30 т'т

Гепарин-,_^РНП/мембрано/цитоскелет-

сефароза связанные СК-2

ОСАДОК

Рис. 6. Фракционирование клеточных гомогенатов

И

Овулировавшие in vivo (полостные) ооциты

NaCIO.eM 604

14Tr,N*CI O.SM 10%

NaCIO.IM >0%

■ NaCIS.IM

■ HtCIO.lM □ N•01 O.CM OlXTt>toCI0.«M

in

Завершившие рост (исходные) ооциты

t%Tr,NaCt 0.М

m

■NaCIO.IM ■NaCI O.JU О NaCI в.*М niMi.mcio.m

Рис. 6 Распределение активности CK2 по фракциям гомогената ооцитов, последовательно экстрагируемых 0,1М NaCl; 0,3M NaCI; 0,5М NaCI; 0,5М NaCI + 1% Triton Х100. Активность СК2 определяли по фосфорилированию казеина по стандартной методике.

И

процессом. Предполагается, что именно СК-2 осуществляет основное фосфорилирование белков, ассоциированных с микротрубочками, участвуя таким образом в регуляции процессов образования и функционирования цитоскелета нейронов. Исследование различных болезней мозга показывает, что СК-2 вовлечена в общий процесс нейродегенерации, в частности, иммуноцитохимическими методами установлено изменение компартментализации СК-2 при болезни Альцгеймера.

Нами были выделены фракции цитозольных белков из височной коры мозга человека в норме и при болезни Альцгеймера (БА). Электрофоретический анализ выявил изменение количества ряда полипептидов в составе гепарин (РНК)-связывающих белков при БА по сравнению с нормой (рис. 7 ). Полученные результаты можно объяснить либо действительным изменением количества этих полипептидов in vivo, либо изменением их способности к солюбилизации при патологии.

Как и следовало ожидать, фракция гепарин-связывающих белков из мозга человека, как в норме, так и в патологии , содержит СК-2 и её эндогенные белковые субстраты. Однако, данные авторадиографии демонстрируют слабо выраженное фосфорилирование in vitro гепарин-

Таблица 2. Активность казеиновой киназы типа 2 из мозга.

человека в норме и патологии.

Мозг удельное фосфорилирование гепарин-связывающих белков, Р пмол/мкг белка удельное фосфорили-рование . казеина, Р пмол/мкг белка

Норма 1.00±0,18 2,83+0,13

Шизофрения 0,44±0,14 2,09+0,20

Альцгеймер 0,32±0,10 1,49±0,18

Значения были обсчитаны согласно кригерию Стьюдемта с Р<0,05

п;

А

И

i г 1 2 i 2 t г

П

66- f > rr-т

4F •

30 •

м I

»"Ч _. _

ЩШЧ Г-Ч 9*1$

frnJI I

—4

Рис. 7. SDS-электрофорез гепарин-связывяющнх белков из образцов мозга человека в норме и патологии.

Н • мозг без патологий. Линия 1 - полипситнды, экстрагированные из ткани в стандартном буфере с 0,1 М NaCI. Линия 2 - полипептиды экстрагированные из ткани в стандартном буфере с 0,5 М NaCI, 1% Triton Х-100. А - мозг с болезнью Альцгеймера. Ткани гомогеншировали в стандартном буфере с 0,1 М NaCJ. Линия 2 • полипептиды, экстрагированные из ткани в стандартном буфере с 0,5 М NaCI, 1% Triton Х-100. а - в треки иапосшга по 5 ыкг бсяха. б - в треки наносили по 10 шегбещеа

связывающих белков из мозга БА. Специальные эксперименты продемонстрировали отсутствие активных форм фосфатаз и АТФаэ в этих фракциях.

На рис. 8 представлены данные, демонстрирующие

распределение СК-2 по фракциям мембрано/цитоскелет-связанных и свободных цитозольных белков из мозга человека. Как и в случае с СК-2, выделенной из ооцитов, для СК-2 из коры головного мозга человека характерно значительное преобладание активности фермента во фракции мембрано/цитоскелет-связанных белков по сравнению со свободными цитозольными белками. Видно, что удельная активность СК-2 в цитозольной фракции по отношению и к казеину, и к эндогенным субстратам значительно ниже при БА чем в нормальном мозге.

Исходя из этих данных, указывающих на обширную связь СК-2 с элементами цитоструктуры, следует, обращать особое внимание на использование различных методов экстракции тканей при выделении фермента. Очевидно, что при жёстких условиях обработки исследуемых тканей (повышение концентрации солей, добавление детергентов, мочевины и т. п.) экстрагируются многие белки, ассоциированные с элементами цитоструктуры. Среди этих белков могут присутствовать и ингибиторы СК-2 (см. рис.4 )

5, Ферментативная и РНК-связь'вашая активности СК-2 зависят от величины рН.

Исследование локализации СК-2 в клетке показало, что действительно большая часть этой протеинкиназы находится в связанной форме. Наблюдаемые в подавляемом большинстве работ изменения активности фактически относятся лишь к СК-2, содержащейся во фракции свободных цитозольных белков, тогда как мембрано/цитоскелет-связанные СК-2 не принимаются во внимание. Между тем, обнаруживаемая во многих подобных работах активация СК-2 может быть объяснена переходом СК-2 в изучаемую фракцию из мембрано/цитоскелет-связанной фракции белков. Ранее сотрудниками

А1

80 70 60

удельная 50 40

активность

рМ'К

30 20 10 ■ 0

оо

0.5М МаС1, 1 % Тг

0.1М N801

В1

45-1

40 ■

35

удельная 30

актив- 25 ■

ность 20

рМ^ 15

10

5

0-

0.5М МаС1, 1%Тг

0.1 М N80!

А2

В2

0.5М №С1. 1%Тг 54%

0.1М N301 46%

0.5М ЫаС1, 1%Тг 66%

0.1М ИаС1 34%

Рис. 8 Распределение активности СК2 по фракциям свободных цитоэольных и цитоскелет/мембранно-связанных белков в норме (А) и патологии (В):

! - удельная активность фермента (пмол/час/мкг белка): 2 - соотношение ферментативных активностей.

нашей группе было показано, что СК-2 входит в состав белков мРНП-частиц (информосом), эти данные были подтверждены многими . зарубежными исследователями. Не исключено, что именно содержанием СК-2 в составе мРНП-частиц объясняются результаты данной работы относительно преимущественной локализации СК-2 во фракции мембрано/цитоскелет-связанных белков. Являясь неотъемлемой частью трансляционного аппарата клеток эукариот, мРНП частицы, согласно современным представлениям, должны быть в значительной степени ассоциированными с мембранными и/или цитоскелетными структурами эукариотической клетки.

Во время развития ооцитов наблюдается сложнейшая картина не только морфогенетических но и биохимических изменений. Так, было показано увеличение на 0,5 ед. внутриклеточного рН при прогестррон-стимулируемом мейотическом созревании ооцитов Xenopus laevis. В настоящей работе мы показали, что изменение рН влияет in vitro преимущественно на РНК-связывающую активность GK2. При определении константы связывания (Kb) СК-2 с 16S меченой [14С] рРНК из Е. coli, было замечено, что уменьшение рН среды с 7,5 до 6,5 ■ приводит к резкому увеличению (не менее чем на три порядка) связывания СК-2 с рРНК, Kb при рН 6,5 составляет 1,5хЮ'юМ (рис.10).

Возрастание РНК-связываюшей способности при понижении рН не связано с изменением ферментативной активности СК-2 по. отношению к казеину (рис. 9 )• Более того, несмотря на менее выраженную РНК-связывающую способность фермента при значении рН 7,5-8,0, ингибируюющее действие полинуклеотидов на СК-2 проявляется гораздо сильнее именно в этом интервале рН, чем при рН 6,5. Так, способность поли(11), как и способность гепарина, к ингибированию СК-2 ослабевала в 8-10 раз при уменьшении рН с 7,5 до 6,5 (рис.11).

Ингибирование СК-2 традиционно рассматривалось как единственный результат связывания фермента с полинуклеотидами. Из представленных данных следует, что СК-2 может оставаться активной

19

HC (cpm)xlO'J

32Р (cpm)xlO-4

? Г!" 1

I

$ 1

V i

; S

?

1 "i i л

*

í, ?

N fl

i; i- ¡X

»WMA Hndlng *c«v«y^pm

pH

Рис. Зависимость протеинкиназной (I) и РНК-свяэывающей (2) активности СК2 из R.temporaria при различных рН. Измерение протеинкиназной активности проводилось по стандартной методике. Для определения РНК-связывающей активности 0,25 мкг СК2 и 0,6 мкг 16S {,4С1 рРНК инкубировали 10 мин в I мл буфера с различным рН при комнатной температуре, после чего раствор фильтровали через нитроцеллюлозные фильтры.

0.71 0.6 о я

0.4, 0Л 0.2 ai о

[РНП1 {РНК}

[РНП) пМ

Рис. График Скэтчарда для связывания СК2 с I6S [|4С]рРНК E.Coli. В I мл стандартного буфера с рН 6,5 (MES), содержащего постоянное количество СК2, вносили от 1,2x10-» до 6x10-' мкг рРНК (Mr=Sxl05 кДа). Раствор инкубировали при комнатной температуре в течение 10 мин н затем фильтровали через нитроцеллюлозную мембрану. Константу связывания определяли как tg угла наклона: 1-1,7 пМСК2; 2-0,8 пМСК2.

Ш Щ яю 7о а

поли ( ) , мкг/мл

Рис.Цингибированне ферментативной активности СК-2 поли ( ) при

рН 6,5 (I) и 7,9 (21. Условия эксперимента полностью соответ с овевали условиям измерения ингибировакия СК-2 гепарином.

и в форме комплекса с РНК. Очевидно, что в разных клеточных компартментах могут отличаться и значения рН, поэтому ферментативная активность СК-2, если даже она и комплексирована с РНК (в составе информосом) все-таки определяется компартментализацией фермента, зависящей, на наш взгляд, именно от физиологического состояния клетки. Учитывая предполагаемую в настоящее время ключевую роль СК-2 в регуляции важнейших метаболических процессов, обратимая компартментализация фермента может служить необходимым и достаточным условием для обеспечения нормальной жизнедеятельности клеток.

ВЫВОДЫ

1. Прогестерон-стимулируемое мейотическое созревание ооцитов травяной лягушки сопровождается резким (до 10 раз) возрастанием активности казеиновой киназы типа 2 (СК-2) во фракции свободных РНК-связывающих белков.

2. Проведено биохимическое фракционирование ооцитов на разных стадиях мейотического созревания. Показано, что стимуляция ооцитов прогестероном вызывает переход мембрано- и цитоскелет-связанной СК-2 во фракцию свободной цитозольной СК-2.

3. При нейродегенеративных процессах (болезнь Альцгеймера. шизофрения) наблюдается падение удельной активности СК-2 во фракции свободных РНК-связывающих белков мозга человека. Показано, что во фракции мембрано- и цитоскелет связанных белков присутствует эндогенный ингибитор СК-2.

4. Выявлена зависимость РНК-связывающей и ферментативной активностей СК-2 от величины рН. Изменение рН от 6,5 до 7,5 приводит к диссоциации комплексов СК-2 - РНК.

5. В целом. результаты работы свидетельствуют, что посттрансляционная регуляция активности СК-2 осуществляется за счет обратимой локализации фермента в разных клеточных структурах.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Kandror К.., Kapkov D.V.rTurapov О.А., Stepanov A.S. pH-dependent

changes in strukture and RNA-binding activity of casein kinase 2 from Rana temporaria oocytes //FEBS. Lett. 1991, V. 283, P. 223-226.

2. Капков Д.В., Турапов О.А., Степанов А.С. Казеиновые киназы типа 2: структура и локализация в клетках эукариот //Успехи биологической химии, т.35, 1995, с. 135-159.

3. Kapkov D.V., Guenzi C.F., Turapov О.А., Lehman J.C. Reciprocal interaction between protein kinasre CK2 and Tau-proteins //FEBS. Lett. 1995 (в печати).