Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Регуляция казеиновой киназы второго типа при различных физиологических процессах

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Регуляция казеиновой киназы второго типа при различных физиологических процессах"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ОРДЕНА ЛЕНИНА ИНСТИТУТ БИОХИМИИ им. А.Н.БАХА РАН

на правах рукописи УДК 577.152.5

КАПКОВ ДЕНИС ВАЛЕНТИНОВИЧ

РЕГУЛЯЦИЯ КАЗЕИНОВОЙ КИНАЗЫ ВТОРОГО ТИПА ПРИ РАЗЛИЧНЫХ ФИЗИОЛОГИЧЕСКИХ ПРОЦЕССАХ

03.00.04 - биологическая химия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 1993

Работа выполнена в группе Регуляция биосинтеза белка

Института биохимии им. А.Н.Баха РАН

Научные руководители: академик РАН, А.С.Спирин

кандидат биологических наук А.С.Степанов

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

профессор Р.С.Шакулов доктор биологических наук, Д.ИЛевицкий

Ведущее учреждение: Московский Государственный Университет

им. МВЛомоносова Биологический факультет

Защита диссертации состоится " &" 199^ода в 10 часов

заседании специализированного Совета (К 002.96.01) по присуждению учен степени кандидата биологических наук в Институте биохимии имА.Н.Баха Р/ (117071, Москва, Ленинский проспект, 33, корп2).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологической литературы Р/ (Москва, Ленинский проспект, 33, корп. 1).

Автореферат разослан -1993 г.

Ученый секретарь специализированного Совета, доктор биологических наук

М.И.Молча:

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

1. Актуальность проблемы. Казеиновая киназа второго типа (СК2) является яиверсальным ферментом для всех исследованных типов клеток. Несмотря на столь еобычайно широкую распространенность и поразительную консервативность (90% змологии между СК2 млекопитающих и дрозофилы [Meisner et al.,1989] и 67% эмологии между СК2 дрозофилы и дрожжей [Chen-Wu et al,1988]), физиологическая оль этого фермента в организме остается неясной. До сих пор нет четких оказательств, какие белки являются природными субстратами СК2, так как спектр осфорилируемых белков довольно широк. Даже среди небольшого количества оказанных природных субстратов СК2, роль подобного фосфорилирования часто стается непонятной, так как обычно оно не приводит к явному изменению арактеристик субстрата.

Остаются также загадкой механизмы регуляции активности этой ротеинкиназы, поскольку она не имеет однозначных эффекторов и не регулируется по ипу "все или ничего" в отличие от подавляющего большинства других протеинкиназ.

Вместе с тем, важность этого фермента для нормального метаболизма очевидна, оскольку ген СК2 дублирован и пространственно разделен в геноме, а отсутствие беих копий неминуемо влечет к летальному исходу. Согласно современным редставления, это г фермент является полифункциональным. Он принимает участие в егуляции бисинтеза белка как на уровне транскрипции (фосфорилирование РНК-олимераз I и II [Dahmus,1981]), так и на уровне трансляции (фосфорилирование актора elF 2b [Clark et al.,1988]). Вместе с тем замечено изменение активности СК2 ри изменении скорости пролиферации и трансформации клетки (СК2 фосфорилирует ¡HK-топоизомеразы и ряд регуляторных белков [Ackerman et al.,1985]). Также замечено частие СК2 в передаче и модуляции как внутриклеточных, так и внеклеточных игналов [Grande et al.,1988, Hishimoto et al.,1987]. CK2 также может фосфорилировать акие важные ферменты, как орнитин-декарбоксилазу, и гликоген-синтазу [Meggio et [.,1981]. Это, по-видимому, далеко не полный список функциональной значимости анного фермента. Однако, при столь огромной полифункциональности, вопрос о егуляции активности CR2 in vivo остается открытым и его изучение может дать ключ к олее детальному пониманию молекулярных механизмов регуляции важнейших [етаболических процессов клетки и организма.

2.11ель и задачи. Цель настоящей работы состояла в получении информации о поведении СК2 при различных патологических и нормальных процессах. Данные исследования должны были пролить свет на функции СК2 в различных клетках. В связи с этим, были поставлены следующие экспериментальные задачи:

1. Исследовать поведение СК2 в условиях теплового шока фитопатогенного гриба Verticillium dahliae.

2. Исследовать характеристики СК2 из ооцитов амфибии Rana temporaria во время созревания ооцитов и построить модель поведения СК2 во время этого процесса.

3. Рассмотреть поведение СК2 из мозга человека в норме и патологии, с целью построить корреляцию возникновения патологии с изменением характеристик СК2.

4. Исследовать поведение СК2 в модельном эксперименте черепно-мозговой травмы у крыс.

3. Научная новизна работы. Впервые найдено, что СК2 из гриба V.dahliae является белком теплового шока. При этом его биосинтез осуществляется как за счет запасенных матриц, так и de novo с целью поддержать активность СК2 на высоком уровне. Впервые построена корреляция между флуктуацией рН в созревающих ооцитах и обратимым изменением степени сродства СК2 к полинуклеотидам. Предполагается, что реализация новых центров связывания СК2 с РНК осуществляется за счет информационных изменений четвертичной структуры фермента, и служит механизмом регуляции активности и компартментализации СК2. Впервые показано, что t-белки усиливают самофосфорилирование СК2, что находит удовлетворительное объяснение на основе уже имеющейся информации. Впервые на основе анализа количества белка найдено подтверждение, что биосинтез а и b субъединиц СК2 может регулироваться асинхронно. Ранее, это было показано только на уровне транскриптов.

4. Апробация работы. Результаты исследований были представлены н; международном микологическом конгрессе в г.Регенсбург (ФРГ) в 1991г., н: международном биохимическом конгрессе в Г.Иерусалим (Израиль) в 1992г. неоднократно докладывались на рабочих семинарах и конкурсах научных рабо-Института биохимии РАН. По материалам диссертации опубликовано 7 печатньи работ.

5. Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзор; литературы, методической и экспериментальной частей вместе с обсуждением

зультатов, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 108 стр. шшнописного текста, содержит 19 рисунков и £ таблицу. Список литературы лючает 153 наименования.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Для выделения СК2 гомогенат ткани готовился в зависимости от типа объекта с пользованием полигрона фирмы Brinkman (гомогенизация мозга), в бомбах на ренч-прессе (гомогенизация грибной массы) и в центрифугированием эмогенизация ооцитов). СК2 из безрибосомных экстрактов очищали до гомогенного стояния в три стадии последовательным хроматографированием на гепарин-фарозе, фосфоцеллюлозе и monoQ колонке системы FPLC (Pharmacia). Для яичественного анализа фермента была получена поликлональная антисыворотка из юлика на грибную СК2 и из курицы на СК2 из мозга крысы. Анализ количества СК2 в зрибосомном экстракте проводился методом иммунопреципитации, а в гепарин-язывающих фракциях методом иммуноблоттинга и конкурентного ELISA. Анализ [ецифической активности СК2 проводился с [^J"P]GTP и казеином в стандартных ловиях. Ингибирование полинулеотидами и гепарином также измерялось в андартной системе при различных рН буфера. Измерение РНК-связывающей :особности СК2 проводили с [14С]РНК меченной in vivo. Фосфорилированные ганокислотные остатки анализировались методом кислотного гидролиза субстрата с »следующим высоковольтным электрофорезом на бумаге. Моноклональная [тисыворотка против СК2 из тимуса человека была любезно предоставлена Аксеновой из Всероссийского Центра Психического Здоровья АМН России. Для [ализа использовалась РНК Esherichia coli, которая выделялась по стандартному :тоду. Разделение РНК и отделение высокомолекулярной поли(и) проводили нтрифугированием в сахарозном градиенте и молекулярная масса полинуклеотидов :ределялась методом электрофореза в 6% ПААГ в денатурирующих для РНК ловиях (в формамиде).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Универсальность свойств СК2 из различных источников. 5щая схема в три ступени была использована для очистки СК2 из фитопатогенного иба Verticillium dahliae (дрожжи), ооцитов амфибии Rana temporaria (травяная

лягушки), мтгя крысы и человека.. ИСТОЧНИК: КЛЕТКИ У.РАНПАЕ - гомогенизацш Френч-прессе

ООЩ1ТЫ Р-ТЕМРОЧАКГА ПЕЧЕНЬ БЫКА - гомогенизация в политроне МОЗГ КРЫСЫ - гомогенизация в политропе МОЗГ ЧЕЛОВЕКА - гомогенизация в политроне

ЦЕНТРИФУГИРОВАНИЕ: 90 мин., 105000 g. ?

БЕЗРИБОСОМНЫИ ЭКСТРАКТ

ХРОМАТОГРАФИЯ НА ГЕПАР!

ЭЛЮЦ1Ш

11Н-СЕФАРОЗЕ: наслаивание -150 мМ -150-750 мМ

АКТИВНАЯ ФРАКЦИЯ: 450-600 мМ. разбавление до 150 мМ

ХРОМАТОГРАФИЯ НА ФОСФ элюци.

0 ЦЕЛЛЮЛОЗЕ: наслаивание -150 мМ

1 - 150-600мМ

АКТИВНАЯ ФРАКЦИЯ: 350-500 мМ. разбавление до 150 мМ

ХРОМАТОГРАФИЯ НА М0>

алюцш

40 О (КРЬС): наслаивание -150 мМ -150-500 мМ

АКТИВНАЯ ФРАКЦИЯ: 420 мМ - гомогенная СК2

Рис.1. Универсальная схема _ очистки СК2, использованная в ]

с пятью различными объектами.

После разрушения клеток (Рис.1), гомогенат фракционировали на ультрацентриф; получения безрибосомного экстракта. Экстракт наслаивали на колонку с геп Сефарозой. После элюции, активную фракцию разбавляли буфером при 4е подходящей ионной силы и на-

FRACTIONS

FRACTIONS

Il

fr - 2

¡i

/Vi ! 4 / 1 1 i ' V 1 f J4"^ И ' WH ^ o 1

¡A-

* iAr /

10 20 30 Í.0 Fraction number

50

Ill

<ю

-M ^

Q

Рис2. Результаты хроматографической очистки СК2 из V.dahliac (I), R.temporaria (II), мозга крысы и печени быка (III) (совпадают)1. А - колонка с Гепрарин-сефарозой, В - колонка с фосфоцеллюлозой, С - колонка monoQ (FPLC).

1 - оптическая плотность Ajgg

2 - градиент концентрации NaCl (ионной силы).

3 - ферментативная активность СК2

Ферментативная активность измерялась путем включения радиоактивного фосфора [ £ -32Р]АТР (ОДмМ, 100-200срт/рМ) в экзогенный субстрат казеин (600 мкг/мл) при добавлении20 мкл фракции к 80 мкл реакционной смеси.

носили на колонку с фосфоцеллюлозой. Активная фракция с фосфоцеллюлозы очищалась на monoQ (Pharmacia) колонке системы FPLC.

Во всех случаях наблюдали сходную картину очистки до получения гомогенного фермента после третьей стадии. СК2 элюируется с гепарин-Сефарозы в диапазоне ионной силы 450-550 мМ, с фосфоцеллюлозы сравнительно широким пиком от 350 до 500 мМ и с monoQ при 420 мМ узким гомогенным пиком (Рис.2). Учитывая редкую консервативность в структуре казеиновых киназ второго типа, выделенных из различных источников, неудивительно, что для всех известных СК2 применима универсальная схема очистки с полностью идентичными условиями проведения на всех трех стадиях. Нами эта схема была разработана и апробирована по крайней мере на СК2 из пяти различных источников (гриб V.dahliae, ооциты R.temporaria, печень быка, мозг крысы и человека). Даже несмотря на структурное различие СК2 из млекопитающих и СК2 из дрожжей (только 60% гомологии по а субъединице и, вероятно, гораздо меньше по b субъединице [Pinna.,1990]), результаты очистки полностью совпадают. Эта закономерность косвенно подтверждает универсальность роли СК2 во всевозможных клетках организмов, тем более, что клетки, дефицитные по гену любой из субъединиц СК2, летальны [Padmanabha et al,1990].

Было замечено отсутствие воспроизводимости результатов в случае СК2 из человеческого мозга, что предположительно было связано с отсутствием заметного количества СК2 в безрибосомном экстракте. Факт осаждения СК2 вместе с рибосомами и клеточным матриксом, по-видимому, имеет физиологическое значение, т.к. во всех случаях, кроме человеческого мозга, ткань замораживалась, либо разрушалась сразу после отделения, т.е. клетки находились в активном состоянии. Поскольку, в случае человеческого мозга некоторые процессы отмирания ткани имели место, то косвенно можно предположить регуляцию доступности СК2 путем обратимого связывания с молекулами клеточного матрикса и рибосомами. Характерно, что при выдерживании гомогената человеческого мозга при комнатной температуре 2 часа, значительное количество СК2 появляется в супернаганге после центрифугирования. Характер и

v \имл/мин '

-0,1 0,1 1,0 // VSy,dlM)-105

Р,< с. ¿I

У— *-х

20

61 100 1-пзли ((.'). (мкг/мл

<2" ГСОАрнИ , nicr/rtA

РисЗ. Определение значений Км по отношению к А.ТР (1) и GTP (2) для СК2 из печени быка (а) и из гриба V.dahliae (б) методом двойных обратных величин. 0,18 мкг (А) и 0,2 мкг (Б) фермента инкубировали с указанным количеством [у-^Р]АТР и [ ¡f-^PJGTP с удельной активности 500 срш/рМ и с 60 мкг дефосфорилированного казеина в общем объеме 100 мкл в течение 10 мин.

Рис.4. Ингибирование протеинкиназной активности СК2 поли(и) (1) и гепарином (2). ОД мкг фермента инкубировали 1 час в стандартной системе определения активности, содержащей [у32Р]АТР (0.1мМ, 100срм) 30 мкг дефосфорилированного казеина и различные количества гепарина.

места связывания СК2 в человеческом мозге, а также универсальность этого явлен] еще предстоит узнать.

Характеристики активности СК2 из различных источников in vitro показа; полную идентичность: использование как АТР гак и GTP в качестве субстрата (AT использовался эффективнее) (Рис.3), ингибирование пикомолярными количества]^ гепарина (Рис.4), фосфорилирование как Ser, так и Thr в казеине (но S фосфорилировался сильнее) (Рис.5). Все это неудивительно в связи с появившимися последнее время работами, показывающими редкую консервативность СК2. SD электрофорез показал классическую четырехсубъединичную структуру СК2 aa'bj (ajb (Рис.6), причем Mw субъединиц, позвоночных был идентичен и составлял 42кДа, 38к] и 26кДа соответственно (Рис.6). Несмотря на полную идентичность ферментативнь свойств с киназой из позвоночных, СК2 гриба обладала отличным молекулярны весом субъединиц, равным 41кДа и 38кДа для а и Ь соответственно. Кроме того, у CI из V. dahliae наблюдается наличие еще одной субъединицы с массой 53кДа, ро: которой до сих пор не выяснена. По всей видимости, явное отличие в b структуре гриба связано с субстратной специфичностью, т.к. в свете последних данных наличие субъединицы дозволяет регулировать активность СК2 по отношению к некоторы природным субстратам, а также локализовать СК2 в определенных местах клеточнь структур. Например, eIF-2b не модифицируется а субъединицей СК2 в отсутствии субъединицы [Lin et а1.Д991]. В то же время, активный центр СК2 полность локализован на а/а' субъединице, которая может фосфорилировать сама доводы широкий спектр субстратов. Поэтому, именно отличие в структуре b субъединицы гриба и позвоночных будет определять узнавание казеиновой киназой специфичеси субстратов для каждой группы организмов.

2. СК2 гриба Y.dahliae является белком теплового шока.

На СК2 из гриба V.dahliae была получена высокоспецифическая антисыворотк С ее помощью было измерено сравнительное количество СК2 в дрожжевой фор.\ гриба V.dahliae в нормальных условиях роста (при 28°С) и в условиях теплового iuoi (при 40°С после 45 мин.)(Табл.1). Иммунопреципитация с белком-А-сефарозой последующий электрофорез образцов показал усиление включения ^%-метионина СК2 в условиях теплового шока, что коррелирует с увеличением биосинтеза это! фермента de novo. При этом пропорциональное увеличение включения мет! наблюдалось для всех трех субъединиц СК2 (Рис.7). Отсюда видно, что СК2 проявля! свойства белка теплового шока, т.е. ее синтез увеличивается при общем падею биосинтеза белка в 3,5-4 раза.

•START

Да

91000

9 t ооо-

61000

67000-

ДЗОО0-

I -Thr

<3ooo —

ioooo —

43000

30000

-jeг

Рис. 5

Рис.5.

30000-

20ЮО -

50ЮО

22100

Ъ

Рис. б

Авторадиографическая идентификация прдуктов солянокислого гадролиза фосфорилированиого в стандартных условиях казеина СК2. 180 мкг [ ^Р] казеина осадили 5 объемами охлажденного этанола и подвергли частичному пиролизу в 5 н. HCl (2 часа). Продукты гидролиза анализировали методом высоковольтного электрофореза на бумаге.

Рис.6. SDS-электрофорез гомогенных СК2 из ооцитов R.temporaria (А), мозга крысы (Б) и гриба V.dahliae (В). Положение реперных белков показано стрелками.

А

Включение Активность Количество Удельная

ОБЪЕКТ 14С аминокислот СК2 в соста- СК2 в сос- актив-

в тотальный ве ГСФ таве ГСФ ность

белок, ерш пМ3-Р/мкгГСФ нгСК2/мкгГСФ пМ32Р/

нгСК2-

дрожжи 28°С 7200 2,2 1.15 = 0,21 1,91

дрожжи 40°С 2000 1,17 3,24 = 0,17 0,36

Таблица 1. Количество и активность СК2 V.dahliae в гепарин-связывающнх фракциях (ГСФ) из грибной массы, выросшей в нормальных условиях и в условиях теплового шока (40°С, 45 мин.). Количество белка измерялось методом конкурентного ELISA. Активность фермента измерялась с использованием меченого GTP (100 ерт) и казеина, как описано выше.

В целях понижения фонового сигнала, последующие измерения казеин киназной активности и количества фермента проводились с фракцией гепарин-связывающих белков. Это допустимо, т.к. СК2 практически полностью уводится из раствора, связываясь с гепарин-Сефарозой. В качестве источника фосфата использовалась [у ^P]GTP, т.к. из гепарин-связывающих белков только СК2 может использовать GTP как субстрат. Иммуноблотгинг гепарин-связывающих фракций подтвердил данные по включению метки в СК2, т.е. наблюдалось заметное увеличение количества СК2 в образцах теплового шока (Рис.8). Количественная оценка киназы была сделана с помощью конкурентного твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA). Анализ показал увеличение содержания СК2 с 1,15 мкг/мг тотального белка до 3,24 мкг/мг тотального белка, т.е. почти в три раза. Интересно, что при этом наблюдается обратная корреляция с удельной активностью СК2, которая во время теплового шока падает в 6 раз. Тем не менее, за счет увеличения биосинтеза СК2, ее тотальная активность в условиях теплового шока снижается не более чем в два раза по сравнению с нормой (Табл.1).

Природа такого драматического падения удельной активности СК2 не очень ясна, поскольку выдерживание гомогенного фермента при температуре 40°С в течение часа практически не снижает его удельную активность. Вместе с тем, а-субъединица СК2, на которой сосредоточен активный центр, довольно лабильна и инактивируется в течение часа в растворе при той же температуре, в условиях теплового шока, частичная инактивация каталитической субъединицы СК2 происходит по-видимому до сборки и в поцессе сборки фермента. Это не противоречит фактам, т.к. во-первых, гены субъединиц СК2 пространственно разделены и могут экспрессироваться асинхронно. Во-вторых, ни при каких физиологических условиях in vivo~CK2 не диссоциирует на субъединицы, а полная структура СК2 чрезвычайно стабильна, как было отмечено выше.

Во время шока, клетки, пытаясь выжить в неблагоприятных условиях, синтезируют строго ограниченный набор белков. Тем не менее, факт поддержки тотальной активности СК2 за счет увеличения биосинтеза фермента говорит о критической роли СК2 для выживания организма. Контроль синтеза осуществляется как на трансляционном уровне за счет запасенных матриц, так и на транскрипционном уровне.

1 2.

S* ss

II I I

'3 ООО

'iooo

\BDO0

Рис. 7 A

Рис.7 &

5зооо_ 4iooo_ 33ооо~

-«AS*. -

■к 0--U

Рис. 8

-5Г

Рис.7. Включение [ SJMct в СК2 из V.dihiiae при нормальных условиях (линия 1) и в условиях теплового шока (линия 2). Образец для электрофореза и последующего радиографа был получен методом иммунопреципитации с высокоспецифической антисывороткой против СК2 с использованием белок-А сефарозы (А). Результат сканирования полученного автографа (В). Стрелками указано соответствие полученных полос молекулярным массам субъединиц гомогенного фермента.

Рнс.8. Результаты иммунобпотинга гепарин-связывающнх белков гриба V.dahliae с антисывороткой против СК2: А - фракция из грибной массы, выросшей в нормальных условиях (28°С), Б - гриб, подвергнутый тепловому шоку (40°С, 45 мин).

З.Характеристики СК2 из Травяной лягушки (Rana temporaria') обратимо изменяются в процессе созревания ооиитов.

Во время развития ооцитов наблюдается резкий рост рН от 6,2 до 6,8 ед. предшествующий мейозу, а затем более плавный рост рН до 73 ед. в процессе мейоза и последующий после оплодотворения рост рН до 7,5 ед во время митоза. Необходимость подобного изменения рН очевидна, тле при попытке поддержать рН ниже уровня 6,5 наблюдался арест мейоза, а остановка роста рН на уровне 6,9 ед. вызывала задержку митоза на неопределенный срок, пока внутренний рН не достигал 73 ед [Grandin et а1,1990]. Природа этого явления, а также механизм зависимости процессов созревания от роста рН до сих пор не известны, однако интересная корреляция была найдена в связи с обратимым изменением свойств СК2 при изменении рН среды.

Ранее была замечена способность СК2 связываться с поли(и)-сефарозой и РНК-сефарозой. При попытке количественно определить'константу связывания (К^) СК2 с меченой 16S рРНК, нами было замечено резкое, не менее чем на 3 порядка ослабление связывания СК2 с рРНК при увеличении рН среды с 6,5 до 7,5. При этом активность СК2 по отношению к казеину возрастала не более чем на 10% (Рис.9). Измерение К^ при рН 6,5 дало значение 1,5*10^ М, что само по себе указывает на высокоафинное и специфическое взаимодействие. Это значение было получено в координатах Скэтчарда для двух различных концентраций фермента и оно не зависело от выбранного буфера (Рис.10). Количественно измерить связывание СК2 с рРНК при рН 7,5 не было возможным, т.к. падение К^ более чем на три порядка вызывало чисто технические трудности в получении достоверных значений.

Интересно, что способность СК2 связываться с рРНК при понижении рН не коррелировала с изменениями кинетических характеристик фермента по отношению к казеину, а также с усилением ингибирующего действия полинуклеотидов на активность СК2. Напротив, рРНК и поли(А), вообще не ингибировали протеинкиназную активность, а способность поли(и) к ингибированию (как и способность гепарина) ослабевала в 8-10 раз при уменьшении рН с 7,5 до 6,5 (Рис.11). Отсюда, можно предположить связанное с колебаниями рН обратимое изменение конформации СК2 с сохранением структуры каталитического центра и образованием новых центров связывания полинуклеотидов. При этом, новые центры конкурируют с каталитическим за связывание с поли(и) или гепарином, что вызывает уменьшение константы ингнбирования последних. Из этих экспериментов также выявляется важность жесткости структуры и размеров РНК для ингибирующего эффекта. Так, жестко структурированная и относительно тяжелая 16SpPHK не ингибировала СК2

7 5 рн

Рис.9. Зависимость протеинкиназной (1) и РНК-связывагсщей (2) активности СК2 из Юетрогапа при различных рН. Измерение протеинкнназной активности проводилось как описано выше. Для определения РНК-связывающей активности 0,25 мкг СК2 и 0,6 мкг 1б5[14С]рРНК инкубировали 10 мин в 1 мл буфера с различным рН при комнатной температуре, после чего раствор фильтровали через нитроделлюлозные фильтры.

[РН п]

Рис.10. График Скэтчарда для связывания СК2 с 16S[:1',C]pPHK E.coli. В 1 мл стандартного буфера с рН 6,5 (MES), содержащего постоянное количество СК2, вносили от 1,2*10 до б'Ю"1 мкг рРНК (Мг = 5*10^ кДа). Раствор инкубировали при комнатной температуре в течение 10 мин и затем фильтровали через нитроцеллюлознуго мембрану. Константу связывания определяли как tg угла наклона: 1 -1,7 пМ СК2,2 - 0,8 пМ СК2.

активность, хотя и связывалась с ферментом. Напротив, поли(и), представляющая из себя статистический клубок, и тРНК, небольшая и гибкая Ь-образная молекула, с успехом ингибировали фосфорилирование казеина.

Рис.11. Ингибирование ферментативной активности СК2 поли(и) при рН 6,5 (1) и 7,9 (2).

Условия эксперимента полностью соответствовали условиям измерения ингабирования СК2 гепарином (см. выше).

С целью выявления структурных изменений при различных рН, была проведена седиментация СК2 в сахарозном градиенте. Оказалось, что при уменьшении рН с 7,6 до 6,5 наблюдается утяжеление СК2 с 10S до 22S через промежуточные, по-видимому дискретные, формы. При этом, при рН 6,95 количество легкой и тяжелых форм эквивалентно (Рис 12). Интересно, что заметная способность СК2 связывать РНК появляется при рН=6,5, но у легкой формы (10S) она заметно больше и ослабевает по мере утяжеления. Отсюда видно, что приобретение СК2 дополнительной способности связывать РНК не зависит от утяжеления, а определяется конформационными изменениями в классической структуре фермента. Удельная ферментативная

0000 Мп/мнк

А

23 S

16 S 8 5S 5S

Т i

X'

V

' х х Х

' t I I I I 1 t I I I 1 I I « I I

5 10 15 :c

ЮООО »""/л«.

5000

23S 16 S B.5S 5S

* x xx

II II

X

"Л

Л,«

X x.

x-x x-x X.

10 15 y, 20

10000 "»"/пин

ьооо

23 S x

16 S x

85 S 5 S x x

Л - A

\ \

\

Vx

15 20

rte

Рис.12. Определение коэффициента седиментации CK2 при различных рН: А - 7,6, В - 6,95, С -6,45. 1 мкг фермента центрифугировали в 10 - 30%-ном сахарозном градиенте, приготовленном на стандартном буфере. По окончании центрифугирования супернатанг разделяли на 19 фракций по 0,75 икл. Ферментативную активность в каждой фракции определяли в стандартной системе с АТР (300 ерт) и казеином, как описано выше (сплошная линия). РНК-связывающую активность (прерывистая линия) измеряли с 1,5 мкг меченой рРНК, как описано в комментарии к рисунку 9. Стрелками показано положение реперных белков.

активность СК2 также слегка уменьшается с утяжелением. Этот необычный результат предполагает возможную зависимость утяжеления от приобретения дополнительной способности СК2 связывать полинуклеотиды.

Таким образом, нами была найдена интересная связь между явлениями, на первый взгляд не имеющими ничего общего друг с другом. На примере ооцитов лягушек (и возможно не только в них) прослеживается резкое колебание рН во время созревания и на ранних стадиях эмбриогенеза. В то же время, из других источников известно об активации и усиленном биосинтезе СК2, которые сопровождают мейотическое созревание и ранние стадия развития эмбриона. В результате наших экспериментов оказалось, что сродство СК2 к РНК резко падает с ростом рН, что позволяет более детально связать активацию СК2 с флуктуацией рН.

Другие результаты говорят об ингибировании СК2 некоторыми полинуклеотидами, такими как тРНК, поли(и), мРНК и об отсутствии ингибирования жестко структурированными нуклеиновыми кислотами типа рРНК и поли(А). Долгое время ингибирование рассматривалось как единственный результат связывания фермента с РНК, и предполагался механизм инактивации СК2 in vivo путем связывания с матрицами. Из наших экспериментов следует, что при понижении рН, ингибирование, когда оно существует, ослабляется в 10 раз. Следовательно, речь идет о реализации дополнительных центров связывания на поверхности фермента, в результате которой, СК2 может оставаться активной, будучи компартментализованной на матрице.

Очевидно, что компартментализация ферментов в клетке необходима для нормального метаболизма и делокализованный фермент с большей вероятностью может служить объектом действия протеаз. Поэтому, образование комплекса СК2-РНК при пониженном рН в котором СК2 активна, по-видимому, предшествует мейозу и сопровождается им при созревании ооцитов. Физиологическое значение этого комлекса сейчас неясно. Кроме того, необходимое для дальнейшего митотического деления повышение рН, предполагает также демаскирование матриц за счет падения сродства к ним со стороны СК2 и возможное перераспределение фермента. Учитывая многофункциональность СК2, подобная двоякая роль этой киназы не кажется противоречивой.

4. Tau-белки активируют самофосфорилирование СК2 из мозга крысы.

Вообще, tau-белки были рассмотрены нами в качестве потенциального носителя специфического для болезни Альцгеймера антигена Alz50. Известно, что данная антигенная детерминанта возникает в области локализации tau-белков в результате

специфического конформационного изменения, предположительно в результате фосфорилирования. Этот переход сопряжен с болезнью Альцгеймера и является характеристикой этой болезни при анализе т БПи. При анализе как растворимой, так и нерастворимой фракций экстракта иммуноблоттингом, особой разницы в норме и патологии не наблюдается. Это может служить подтверждением важности трехмерной структуры для экспозиции антигенной детерминанты А1г50. Поэтому, такой процесс как фосфорилирование, принимает особое значение в приобретении 1аи-белками специфических антигенных свойств.

Рис.13. Результаты электрофореза (А) и фосфорилирования (Б) очищенных «с-белков из мозга крысы. ФосфорилированиеЧГ-белков осуществлялось гомогенной СК2 из мозга крысы в стандартных условиях с использованием меченых АТР и GTP(500cpm).

Представлялось интересным проверить tau-белки в качестве субстрата СК2 и посмотреть влияние фосфорилирования на появление антигенных свойств к моноклональным антителам Alz50. Оказалось, что СК2 фосфорилирует очищенные tau-белки in vitro, при этом могут использоваться как АТР, так и GTP с равной эффективностью (Рис.13). Тем не менее, фосфорилирование СК2 не придает свойств Alz50 антигена tau-белкам, т.е. не экспонирует специфическую антигенную детерминанту. Вероятно, механизм образования Alz50 антигена из tau-белков более сложный, чем акт простого фосфорилирования. Зто, однако, не отрицает возможное

участие СК2 в процессе изменения конформации tau-белков, особенно путем каскадного фосфорилирования.

При исследовании процесса фосфорилирования было замечено, что tau-белки усиливают самофосфорилирование СК2 по Ь-субъединице (Рис.13). Это особенно интересно в связи с кислой природой tau-белков и ингибирующим влиянием полианионов (в частности поли(С1и)) на протеинкиназную активность СК2. Следует отметить, что действие tau-белков не влияло на фосфорилирование казеина и относилось только к b-субъединице СК2. Здесь можно предположить специфическую активацию СК2, без изменения структуры каталитического центра.

5. Количество СК2 из мозга человека изменяется в связи с болезнью Альцгеймера.

Проверка гепарин-связывающих фракций из образцов человеческого мозга показала уменьшение СК2 активности в ряде случаев у больных шизофренией и во всех случаях болезни Альцгеймера. Протеинкиназная активность СК2, приходящаяся на 1 мг белка, в случае болезни Альцгеймера составляла половину нормы, а в случае шизофрении в среднем три четверти нормы при фосфорилировании казеина. Разница в эндогенной активности была еще больше, причем наблюдалось также качественное различие в фосфорилированных белках на форезе (Рис.14). Сравнительное измерение количества СК2 в образцах нормального и пораженного болезнью Альцгеймера человеческого мозга не дало однозначных результатов. Опыты с моноклональной против СК2 антисывороткой показали уменьшение количества СК2 в безрибосомном экстракте, в то время как поликлональная антисыворотка против СК2 крысы, узнающая а-субъединицу СК2 человека, показала очень незначительное увеличение этой субъединицы (Рис.15). Осложнения в интерпретацию данных вводит зависимость результатов от способа приготовления образцов в случае человеческого мозга. Причиной этого явления служит невозможность работы со свежей человеческой тканью мозга, что и приводит к невоспроизводимым результатам.

Рис.14. Результаты электрофореза (А) и эндогенного фосфорилирования (Б) гепарин-связываюших белков из образцов мозга человека: линия 1 - мозг без патологий, линия 2 - мозге болезнью Альцгеймера. Эндогенное фосфорилирование осуществлялось путем добавления меченой ОТР (500 ерт) к фракции гепарин-связывающих белков выровненных по содержанию белка. После инкубации в течение часа, ферментативная реакция останавливалась добавлением электрофорезного буфера и образцы подвергались электрофорезу.

Рис.15. Результаты иммуноблотинга проведенного с фракциями гепарин-связывающих белков образцов мозга человека и антисыворотками против СК2. А - моноклональная антисыворотка против СК2 человека, Б - лоликлональная антисыворотка против СК2 крысы (дает воспроизводимый перекрест с ^ -субъединицей СК2 человека). Линия 1 -нормальный мозг, линия 2 - мозг с болезнью Альцгеймера.

1а 3 А 5"

Рис.16. Результаты иммунопреципитации с антисывороткой против СК2 образцов м крысы после черепно-мозговой травмы. Гомогенизированный участок мозга в об л; травмы центрифугировали до получения безрибосомного экстракта. В каче контроля брали симметричную зону другого полушария. Преципитацию проводи. белок-А сефарозой, затем фракции подвергали ЗОЗ-электрофорезу. Каждая I колонок соответствует разному временному интервалу с момента травмы: 1 - 1 мин., мин., 3 - 15 мин., 4-45 мин. 5 - 90 мин. В каждой паре колонок левая поло контрольная зона, правая полоса - область травмы.

Л**™

*иг ч* «г> е.

Л'гГ' Я8» ^бСвЙ®^«""«'

«йа? ЙГй -. Й&гз1- .- ¿Цак^

'" I г з к ' з

Рис.17. Результаты иммуноблотиша безрибосомного экстракта из образцов мозга к после черепно-мозговой травмы с антисывороткой против СК2 из мозга к] Обозначения аналогичные предыдущему рисунку.

6. Регуляция биосинтеза СК2 в мозге крысы после черепно-мозговой травмы.

Завершающей серией экспериментов, представленных в данной работе, было исследование поведения СК2 в мозге крысы во время черепно-мозговой травмы. Этот фермент был очищен до гомогенного состояния, по схеме показанной выше (Рис.1). На него была получена высокоспецифическая ангисыворотка из курицы. С помощью точно выверенного пневмостержня на крысах моделировалась черепно-мозговая травма глубиной в 2 мм.в области париетального участка коры головного мозга. При анализе образцов мозга после травмы в качестве контроля брался аналогичный участок другого полушария того же мозга.

Иммунопреципитация с антителами против СК2 крысы при анализе безрибосомных экстрактов травмированного участка кортекса, показала незначительное возрастание а и b субъединиц в различных временных точках в течение первых полутора часов (Рис.16). В то же время, анализ экстракта мозга иммуноблоттингом показывает, что количество b-субъединицы падает в течение первых пяти минут, и далее, в течение полутора часов подъема не наблюдается (Рис.17). Позже, спустя сутки, наблюдается одинаковое количество b-субъединицы в обоих полушариях головного мозга. Учитывая вероятную независимую экспрессию а и Ь субъединиц СК2 [Maridor et а1Д991], можно предположить различную интенсивность биосинтеза этих субъединиц после травмы. Причем, иммунопреципитацией выделяется полная молекула СК2, а в экстракте анализируется общее количество субъединиц.

Всех этих данных недостаточно для строгой интерпретации, поскольку вследствии клеточно-фуншиональной гетерогенности мозга (нервные и глиальные клетки), не совсем ясна природа полученных результатов. Для удовлетворительной интерпретации следует сделать иммуногистохимические эксперименты. Так или иначе, в отличие от результатов с печенью крысы, упомянутых в обзоре литературы, результаты с мозгом не так однозначны.

В-заключение обсуждения хочется подчеркнуть, что полученные результаты указывают на многофункциональность казеиновой киназы второго типа и сложную природу регуляции активности этого фермента. Вместе с тем необходимость его нормальной активности для выживания организма не вызывает сомнений. Дальнейшие исследования на молекулярном уровне in vivo прольют свет на детальные механизмы регуляции важнейших метаболических циклов и процессов экспрессии генома с участием казеиновой киназы второго типа.

выводы

1. Сравнение хромагографических и физико-химических характеристик гомогенных СК2, выделенных из млекопитающих, амфибий и грибов, показывают универсальность свойств этого фермента в эволюционно далеких организмах.

2. Показано увеличение количества СК2 в клетках гриба У^аЬНае в условиях теплового шока. Увеличение содержания СК2 сопровождается падением удельной активности данного фермента и служит, по-видимому, механизмом поддержания постоянной тотальной активности СК2 на достаточном уровне.

3. Обнаружено усиление самофосфорилирования СК2 в присутствии

1аи-белков, что согласуется с ранее полученными данными о возможных механизмах регулирования активности СК2.

• таты количественного анализа СК2 из мозга крысы во время реабилитации .-репно-мозговой травмы подтверждают возможность независимой регуляции экспрессии генов каталитической (а) и структурной (Ь) субъединиц СК2.

5. Обнаружена способность СК2 из ооцитов амфибии Ыдетрогапа высокоафинно связываться с РНК при понижении рН от 7,5 до 6,5. Изменение рН в этом диапазоне необходимо для успешного созревания ооиитов, что предположительно связано с диссоциацией комплекса СК2-РНК. В работе предложена гипотеза конформационных изменений СК2 связанных с обнаруженным эффектом на основе анализа структуры фермента.

СПИСОК ПЕЧАТНЫХ РАБОТ

К.В.Кандрор, А.О.Васильев, Д.В.Капков, А.М.Фуэнтес, АС.Степанов. Сравнительный анализ хроматографических, кинетических и антигенных свойств казеиновых киназ типа 2 из печени быка и фитопатогенного гриба Verticillium dahliae.//BHOXHMHR.-1990.-T.55.-Bbin.l2-c2115-2121.

К.В.Кандрор, Д.В.Капков, А.С.Степанов. рН-зависимые изменения в структуре и РНК-связывающей активности казеиновой киназы типа 2 из ооцитов амфибий.//Биохимия.-1990.-т.55.-вып.4.-с.579-585.

А.О. Васильев, Д.В. Капков, КВ. Канярор, АС.Степанов. Экспрессия и регуляция казеиновой киназы типа 2 при тепловом шоке у Verticillium dahliae. //Молекулярная биология.-1991.-т-25.-вып.2.-с.525-530.

K.V.Kandror, A.O.Vasiliev, D.V.Kapkov, A.S.Stepanov. Casein Kinase II from Verticillium dahliae: Isolation and Characterization.//Biochemistry International.-1990.-VoI20,-No.l,-p.59-69.

K.V.Kandror, D.V.Kapkov, OA.Turapov, A.S.Stepanov. pH-Dependent Changes in Structure and RNA-Binding Activity of Casein Kinase 2 from Rana temporaria oocytes.//FEBS Letters.-1991.-Vol283,-No2,-p223-226.

M.VAksenova, G.Sh.Burbaeva, K.V.Kandror, D.V.Kapkov and A.S.Stepanov. The decreased Levei of Casein Kinase 2 in Brain Cortex of Shizophrenic and Alzheimer's Disease Patients.//FEBS Letters.-1991.-Vol.279,-No.l,-p55-57.

A.O.Vasiliev, D.V.Kapkov, K.V.Kandror, A.S.Stepanov. Expression and Regulation of Casein Kinase 2 During Heat Shock in Verticillium dahliae.//Molecular Reproduction and Development.-1992.-Vol31,-p.42-47.