Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Взаимодействия экдистерона и других С27-стероидов с мембранами эритроцитов

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Взаимодействия экдистерона и других С27-стероидов с мембранами эритроцитов"

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ Інститут біохімії ім. О.В. Падладіна

РГ8 Ой 1 9 СЕН 2301

Туганова Аліна Володимирівна

ВЗАЄМОДІЯ ЕКДИСТЕРОНУ ТА ІНШИХ СггСТЕРОЇДІВ ІЗ МЕМБРАНАМИ ЕРИТРОЦИТІВ

03.00.04 - біохімія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

Кию-2000

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Інституті біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України.

Науковий керівник - доктор біологічних наук, чл.-кор. НАН України ГУЛА Надія Максимівна, .

завідувач відділу біохімії ліпідів Інституту біохімії ім.О.В.Палладіна НАН України

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, старший науковий співробітник ТУТАЙ Василь Андрійович, провідний науковий співробітник Інституту біохімії ім.О.В .Палладіна НАН України

доктор біологічних наук КОВАЛЕНКО Валентина Миколаївна, завідувач відділу загальної токсикології Інституту фармакології та токсикології АМН України

Провідна установа - Київський національний університет імені Тараса Шевченка, кафедра біохімії

Захист відбудеться ” 19 11 червня 2000 року о 14 годині на засідг спеціалізованої вченої ради Д 26.240.01 в Інституті біохімії ім.О.В.Пашкц НАН України за адресою: 01601, Київ-30, вул.Леонтовича, 9.

З дастертацією можна ознаймитися в бібліотеці Інституту біохімії ім.О.ВЛалладіна НАН України (Київ, вул. Леонтовича, 9).

Автореферат дисертації розісланий" 19 " травня 2000 р.

Учений секретар

спеціалізованої вченої ради, *

кандидат біологічних наук КЗРСЕНКОО.В.

Актуальність теми. Дослідженнями останніх років переконливо доведено, і взаємодія ендогенних стероїдних гормонів із клітинами-мішенями [бувається за двома механізмами [O'Malley et al., 1991]. Один із них, який вчено детальніше, - геномний механізм дії стероїдних гормонів - дослідники в’язують із взаємодією їх із внутрішньоклітинними рецепторами [Watson et al., 99]. Другий механізм - негеномний. Вважають, що негеномну дію гормону ловлено взаємодією стероїдних молекул із плазматичними мембранами клітин і гивацією їхніх сигнальних систем [Wehling, 1997]. Проте такий шлях дії ;роїдних гормонів вивчено ще недостатньо. З огляду на це, значний інтерес кликас метаболіт вітаміну D3 - кальцитріол (1а, 25-дигідроксивітамін D3), юмна дія якого вивчена краще, ніж негеномна. Можна припустити, що за щезазначеними механізмами діють також і гормони линяння та метаморфозу мах, якщо вони попадають в організм теплокровних тварин. Представником шкого класу екдистероїдів, які синтезуються у комах та рослин, є С27-стероїд іистерон [Холодова, 1979; Ахрем и др., 1989; Lafontetal., 1995].

Молекулярні механізми дії екдистерону у комах розкрито в роботах [Dumser al., 1981; Okumura et al., 1992 та ін.]. За останні десятиріччя в організмі їлокровних тварин встановлено спричинені ним різноманітні біологічні ефекти, і він і не належить до ендогенних гормонів ссавців [Миронова и др., 1982; talan et al., 1985; Черемник и др., 1988; Сергеев и др., 1991; Сыров и др., 1992]. явлено тонізуючі, адаптогенні та протекторні властивості екдистерону, його пив на активацію ферментних систем, що беруть участь у вуглеводному та іідному обмінах, а також гіпоглікемічну дію. Але молекулярні механізми дії :ї сполуки в організмі теплокровних ще не вивчено. На основі порівняння іічної будови екдистерону та кальцитріолу і даних літератури щодо подібності іього впливу на теплокровних тварин [Коцюруба та ін., 1993; 1995], можна ипустити, що екдистерон діє за негеномішм механізмом, подібно до ендогенних :роїдних гормонів ссавців. Але це питання потребує експериментального [твердження. Тому з’ясування механізмів молекулярної дії стероїдного гормону щстерону у ссавців, зокрема негеномної, є актуальним.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами

Дисертаційну роботу виконано в межах наукової теми відділу біохімії ліпідів :титуту біохімії НАН України, затвердженої Президією НАН України.

г

Мета та завдання дослідження

Мета роботи: експериментально обгрунтувати особливості механізі ранньої дії екдистерона у порівнянні з іншими Сігстероадами на плазмати мембрани різних тканин та клітин ссавців.

Для досягнення цієї мета поставлено такі завдання:

- порівняти in vivo дію екдастерону й ендогенного стероїдного горш ссавців кальцитріолу на активацію сигнальних систем клітин,

- на модельних системах ги vitro дослідити можливість прямої екдастерону та інших Сгтстероїді® на плазматичні мембрани,

- вивчити фізюсо-хімічні властивості плазматичних мембран за умов взаємодії з єкдастероном та іншими Сзт-стероїдами.

Наукова новизна отриманих результатів

Вперше в комплексних дослідах in vivo на тканинах-мішенях (печін слизової оболонки тонкого кишечника) та інших тканинах (серця, голови мозку) щурів, одержано докази активації сфінгоміслінової сигнальної сист< клітин під дією єкдистерону та кальцитріолу за короткотривалий період часу ( 60 хв) після їх введення тваринам per os. В дослідах використано мет< визначення рівня загальних фосфоліпідів і сфінгомієлінів та радіоактивне попередника сфінгомієліну - L-[3H] метилметіоніну. Одержані результати аргументом, що підтверджує негеномну дію досліджуваних стероїдів. У дослі, in vitro з мембранами еритроцитів за допомогою мічених [3Н, 14С]С27-стероі вивчено зв’язування екдастерону з плазматичними мембранами. Bnef показано, що екдистерон, витісняючи з мембрани кальцитріол, конкурує з нил місця зв’язування на мембрані.

Встановлено, що взаємодія екдастерону з мембранами еритрощ супроводжується зміною таких показників фізико-хімічного стану мембран, величина молярного співвідношення холестерол/фосфоліпіди, стійкість кислотного гемолізу, в’язкість, поверхневий заряд, взаємодія з білкові компонентами, активність мембранозв’язаного фермешу Ка^К^-АТФ-ази. зміни аналогічні тим, які спостерігаються під час взаємодії да-полігідроксильованих Сгг-стероїдів із мембранами. У разі моногідроксильоваї СїГ стероїді в виявлено протилежні зміни.

з

Виявлено, що взаємодія екдистерону й інших С27-стероїдів із плазматичними гмбранами клітин залежить від структури молекули, зокрема від кількості та шоження в ній гідроксильних групи.

Теоретичне та практичне значення отриманих результатів

Отримані дані розширюють сучасні уявлення щодо механізму дії дастерону на клітини теплокровних тварин у ранній період (0-60 хв) його -аємодії з плазматичною мембраною, внаслідок чого відбувається активація [янгомієлінової сигнальної системи. Результати досліджень дозволяють оцінити гмбранотропні властивості екдистерону порівняно з іншими Сгт-стероїдами.

Одержані в дисертаційній роботі експериментальні дааяі можуть бути гкористані при розробці препаратів на основі екдистерону для застосування їх з юфілактичнокг та лікувальною метою, оскільки стероїд не має токсичного шиву на організм навіть у великих концентраціях. Одержані результати можуть ои використані у практичній медицині та фармації, а також у навчальному юцесі під час вивчення молекулярних механізмів негеномної дії стероїдних рмонів.

Особистий внесок здобувана

Дисертацію виконана здобувачем під науковим керівництвом чл,- кор. НАН фаїни, д. б. н. Н. М. Гулої у тісному співробітництві з к. б. н. А. В. Коцюрубою, яким автор має спільні публікації. Наведені в рукописі результати одержано обувачем особисто або за безпосередньої участі у спільних експериментах, жсг дисертаційної роботи написано здобувачем особисто.

Апробація результатів дисертації

Матеріали дисертаційної роботи апробовано на: VI симпозиумі з біохімії лідів (Санкт-Петербург, 1994); W. Mejbaum-Kathene llebogen’s Seminars: embrane Skeleton Structure and Function (Wroclaw/Karpacz, 1995); Workshop on ytoecdysteroids (Сиктивкар, 1996); Second International Symposium on the lemistry of Natural Compounds (Eskisehir, 1996); FEBS Special Meeting, Cell gnaling Mechanisms (Amsterdam, 1997); ХШ* Ecdysone Workshop (Jena, 1998); мінарах Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна та відділу біохімії стеринів і зхімії ліпідів.

Публікації За матеріалами дисертаційної роботи опубліковано 3 статті та 5 з доповідей.

Структура та обсяг дисертації. Дисертаційна робота складається зі вступ; огляду літератури, матеріалів та методів досліджень, результатів досліджень і їхнього обговорення, висновків і списку джерел літератури (215). Робот викладена на 117 сторінках, містить 16 рисунків та 2 таблиці.

ЗМІСТ РОБОТИ

Першим розділом роботи є огляд літератури, в якому висвітлюють* основні механізми дії екдистерону в організмі теплокровних тварин у порівнянні іншими С27-стероїдами, зокрема кальцитріолом (1а,25-дигідроксивітаміном D-Особливу увагу приділено з’ясуванню механізму негеномної дії стероїдів, яі пов’язана з активацією сигнальних систем на рівні плазматичних мембрг клітини, внаслідок чого стають можливими неспецифічні зміни фізико-хімічш властивостей ліпідного матриксу мембрани. Висловлено припущення iuoj подібності механізму дії на плазматичні мембрани екдистерону та кальцитріолу.

У другому розділі описано матеріали та основні методи досліджень.

У третьому та четвертому розділах наведено основні результати роботи їхнє обговорення.

МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Досліди in vivo проведено на щурах лінії Вістар з масою тіла 120-150 г. За 24 год до декалітації щурам вводили внутрішньочеревинно по 3,7 МБк Ь-[мети 3Н}метіошну. Радіоактивність визначали в умовних одиницях за допомогс автоматичного сцинтиляційного лічильника Beckman LS-7000. Водно-спиртс розчини оксистеролів (2 мкмоля етанолу) вводили одноразово per os концентраціях 10'8 М екдистерону та 1012 М кальцитріолу за 0; 0,5; 1,0; 1,5; 2 2,5; 10,0; 30,0 та 60,0 хв до декапітаїїії тварин, яку проводили під легким ефірні наркозом. Тваринам контрольної групи (0-й час; рис. 1, 2, 3) робили ін’скц лише водно-спиртового розчину. Видалені для дослідження тканини піс декапітації тварин негайно заморожували у рідкому азоті, потім із н одержували ліпідні екстракти.

У дослідах in vitro використовували кров донорів, до якої додава антикоагулянт (3,8%-й розчин цитрату натрію) у співвідношенні 9:1.

Моделлю плазматичної мембрани слугували мембрани еритроцитів, : отримували гіпоосмотичним гемолізом клітин за методом Доджа (1963).

Для вивчення взаємодії стероїдів із мембранами еритроцитів оста» інкубували з міцелярними розчинами стероїдів, які одержували за методом Fi

?91), оскільки, згідно з гіпотезою “вільних гормонів”, фізіологічну активність оявляють тільки стероїди, які не зв’язані з білками плазми [Rao et al., 1981].

Ліпідні екстракти досліджуваних органів та тканин одержували за методом ight et al. (1959). Ідентифікацію і кількісне визначення нейтральних ліпідів та юфоліпідів проводили за допомогою методу тонкошарової хроматографії kipski et al., 1965; Крылов и др., 1975; Лемешко та ін., 1991]. Вміст холестеролу в гідних екстрактах визначали методом Zlatkis et al. (1953), сфінгозину - методом ектрофотометрії з використанням метилового оранжевого (Lauter, 1962).

Стійкість еритроцитів до кислотного гемолізу оцінювали як описано в роботі ерсков и др., 1957]. Активність ферменту Na+,K+-ATP-a3H у мембранах итроцитів визначали за методом Post et al. (1967).

Вивчення зв’язування бромтимолового синього з мембранами еритроцитів оводили згідно з методом Древаль та ін. (1989).

Визначення мікров’язкості мембран еритроцитів здійснювали ектрофлуориметричним методом, використовуючи поліметиновий барвник Оіу [Воловик и др., 1988]. Поверхневий заряд мембран еритроцитів гановлювали за допомогою спектрофлуориметра, застосовуючи негативно эяджений флуоресцентний зонд АНС [Формазюк та ін., 1982].

РЕЗУЛЬТАТИ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Активація сфінгомієлінового циклу біологічно активними оксистеролами -екдистероном та кальцитріолом

З метою встановлення можливості активації сигнальних систем клітин 7-стероїдами - екдистероном та кальцитріолом - нами досліджено зміни рівня ісфоліпідів у клітинах. Встановлено, що в усіх досліджуваних тканинах шзова оболонка тонкого кишечника, печінка, серце, головний мозок) щезазначені стероїдні сполуки спричинюють швидке транзитне зменшення лу загальних фосфоліпідів. Оскільки, згідно з даними літератури, стероїдний рмон кальцитріол активує сфінгомієлінову сигнальну систему [Okazaki, 1989; 94], ми зосередили увагу на вивченні механізму цього процесу. За даними гератури, активація сфінгомієлінової сигнальної системи супроводжується іролізом сфінгомієліну і утворенням вторинних мессенжерів - цераміду, лінфосфату, сфінгозину [Hannun et al., 1993]. Збільшення рівня сфінгозину в ітинах може відбуватися лише внаслідок двох стадій гідролізу: спочатку

Час, хв

Рис. 1. Динаміка рівня пулів сфінгомієліну (крива 1) та сфінгозину (крива 2) у тканинах після введення щурам кальцитріолу (А, Б) та екдистерону (В).

Час, хв

сфінгомієлін під дією сфінгомієлінази перетворюється у церамід, який потЬ гідролізується церамідазою до сфінгозину.

Дані, які наведено на рис. 1, свідчать, що через короткий проміжок часу післі введення щурам стероїдів - екдистерону (10'8 М) та кальцитріолу (10‘12 М) - ; досліджуваних тканинах спостерігається зменшення рівня сфінгомієліну водночаї із зростанням вмісту сфінгозину. Додатковим доказом гідролізу сфінгомієліну < зменшення радіоактивності в його пулі, попередньо міченому Ь-[*Н]метютном, якого синтезується холін. Дані наведено на рис.2.

и

я

к

ч

о

2

Рис. 2. Радіоактивність пулу

сфінгомієліну в печінці після введеня щурам екдистерону.

Час, хв

Отже, одержані результати свідчать про можливість активаці сфінгомієлінової сигнальної системи С27-стероїдами — екдистероном т; кальцитріолом. Але інтимні механізми цього процесу залишаються поки ще нез’ясованими.

Згідно з даними літератури, “сигнальний пул” сфінгомієліну локалізований у азматичній мембрані [Linardic et al., 1994], що також підтверджує мембранну о стероїдів. Можливо, що активація ферментів, які беруть участь у трансдукції гнапу, відбувається внаслідок взаємодії гормону з рецептором на плазматичній мбрані. Проте активація ферментів плазматичної мембрани стероїдами жлива і шляхом змін фізико-хімічного стану ліпідного бішару мембран. Взаємодія екдистерону з мембранами еритроцитів

З метою перевірки гіпотези, згідно з якою активація сигнальних систем ітин спричинена взаємодією молекули Сггстероїду з плазматичною мембраною алежить від зміни фізико-хімічного стану останньої, подальші експерименти оведено на модельних системах в дослідах in vitro.

Оскільки екдистерон та кальцитріол дещо подібні за хімічною структурою лекул і мають спільного попередника у біосинтезі - 7-дегідрохолестерол [Rees, 89], то можна було припустити подібність у взаємодії цих сполук із мбранами еритроцитів у теплокровних тварин. Крім того, викликає значний ерес виявлення механізму мембранної дії інших Сггстероїдів, молекули яких різняються за кількістю гідроксильних груп та положенням їх як в клопентанпергідрофенантреновому ядрі, так і в ізооктиловому (бічному) іцюгу.

пєстерол

7-Дегідрохолестерол

25-Гідрокси-7 -дегідрохолестерол

Холекальциферол

Кальцитріол

2-Дезоксиекдистерон Рис. 3. Структура досліджуваних С27-стероїдів.

Як випливає з рис. З, екдистерон, його похідна сполука -

езоксиекдистерон та кальцитріол належать до полігідроксильованих -стероїдів, тоді як інші - до моно- та дигідроксильованих. Спочатку доцільно

було вивчити зв’язування радіоактивно мічених С27-стероїдів із мембранам еритроцитів (рис. 4), які інкубували за присутності радіоактивно мічених сполу (10"6 М). Ефективність зв’язування холестеролу з мембранами еритроцитів бул прийнято за 100%. Для холекальциферолу, який відрізняється від холестерол модифікацією в кільці В (розірваністю його), становить майже 60% від такого холестеролу. Зв’язування кальцитріолу, молекула якого порівняно з холестероло: містить додаткові гідроксильні групи і має розірване кільце В, було незначним.

У подальших дослідженнях ДЛЯ ОЦІНКИ МІСЦЬ зв’язування С27-СТЄрОЇДІВ І

.5 в £ 5

. > *

'*■» і і'-'іЗ1"11

Рве. 4. Включення С2т-стероїдів у мембрани еритроцитів:

1 - [7-3Н]холестерол,

2 - [4-І4С]холекальциферол,

3 - [23Д4(п)-3Н]кальцнтріол

* Зміни порівняно з контролем вірогідні, р<0,05, я=5.

мембранами нами було проведено такі . експерименти. Насамперед бул досліджено здатність екдистерону порівняно з іншими С27-стероїдами запобігат: зв’язуванню холестеролу з мембранами еритроцитів, які інкубували з Присутності в середовищі 10"6 М евдистерону та ІНШИХ С27-СТЄроІДІВ. Через ЗО хв інкубаційну суміш додавали радіоактивно мічений холестерол у концентрації 10‘12 М, після чого інкубацію продовжували ще ЗО хв. Потім визначалі радіоктивність ліцідного екстракту мембран еритроцитів.

Одержані дані, які наведено на рис. 5, віддзеркалюють те, щ< полігідроксильований евдистерон конкурує за місця зв’язування з холестероло? менше, ніж моногідроксильований холекальциферол.

100 _

«0 _

£ чв 6 ,

І * 6° _

І 3

40

20 '

0

ті-

ї

-3-

Рне. 5. Включення |7-5Н] холестеролу в . мембрани еритроцитів за

присутності Сл-стероїдів:

1 - холестерол,

2 - 2-дезоксіекдистерон,

3 - 7-дегідрохолестерол,

4 - екднетерон,

5 - холекальциферол.

* Зміни порівняно з контролем вірогідні, р<0,05, п=5.

*

У наступному експерименті ми дослідили вплив різних концентрацій дистерону (1О"10-1О'І4М) на включення радіоактивно мічених С27-стероїдів О'12 М) у мембрани еритроцитів. Останні інкубували протягом ЗО хв за іисутності екдистерону, після чого в інкубаційну суміш додавали інші стероїди, /міш інкубували ще ЗО хв. За 100% прийнято включення радіоактивно мічених ероїдів за відсутності екдистерону.

Дані, які наведено на рис. 6, свідчать, що екдистерон не впливає на ’язування холестеролу з мембранами еритроцитів. На відміну від цього для ілекальциферолу, який порівняно з кальцитріолом має модифікації у кільці В, >но зменшується. Знижується також і дозозалежне зв’язування кальцитріолу, :ий подібно до екдистерону має гідроксильні групи в кільці А та в бічному інцюгу.

Рис. 6. Включений» радіоактивно

мічених С2г-стероїдів у мембрани еритроцнтів за присутності скдпстеропу.:

1- ІТ-ТЗІхолестерол,

2 - [4-,4С] холекальцнферол,

3 - [23Д4(п)-3Н] кальцитріол.

* Зміна вірогідні порівняно з контролем,

р<0,05, п=5.

[Екдистерон], М

На основі одержаних нами даних можна дійти висновку, що екдистерон, іаємодіючи з мембранами еритроцитів, витісняє з них кальцитріол і, отже, шкурує з останнім за місця зв’язування на мембрані. На наш погляд, екдистерон і інші стероїди з гідроксильованими бічними ланцюгами мають інші місця і’язування ніж негідроксильовані. Стероїдні сполуки, які мають гідроксильні >упи в основному скелеті молекули та бічному ланцюгу, можливо, не можуть ззміщуватися подібно до холестеролу у фосфоліпідному бішарі між залишками ирних кислот, а, ймовірно, локалізуються у зоні залишків гліцеролу або серед отярних голівок ліпідів. Ми припускаємо, що саме ця відмінність у взаємодії зсліджуваних стероїдів із мембранами зумовлює неоднакові ефекти їхньої дії.

3. Зміни фізико-хімічних властивостей мембран еритроцитів під час їх взаємодії з екдистероном та іншими С27-стероїдами

Для порівняння дії екдистерону і інших С27-стероїдів на фізико-хімічни стан мембран досліджено такі показники як стійкість еритроцитів до кислотног та пероксидного гемолізу, мікров’язкість їхніх мембран, значення та величин поверхневого заряду останніх, активність мембранозв’язаного ферменту Ыа+,К< АТФ-ази.

% гемолізу

х/фп

%гемалізу

х/фл

15

1.0

0.5

0.0

Час.хв

Рис. 7. Швидкість кислотного гемолізу еритроцитів та величина молярного співвідношення холестерол/фосфоліпіди (Х/ФЛ) у мембранах під впливом Сг7-стероїдів (10'1г М): А) 1 - контроль, 2 - еіеднстерон, 3 - холестерол;

Б) 1 — контроль, 2 - кальцитріол, 3 -холекальциферол.

Отримані нами дані (рис. 7) свідчать про те, що взаємодія екдистерону мембранами зумовлює зниження стійкості еритроцитів до кислотного гемолізу Подібна дія характерна також для кальцитріолу, тоді як під час інкубаці еритроцитів із моногідроксильованими стероїдами (холестеролом холекальциферолом) спостерігається підвищення стійкості їх до кислотног< гемолізу. Крім того, нами відзначено зміну величини молярного співвідношенні холестерол/фосфоліпіди в мембранах еритроцитів після їхньої інкубації : екдистероном та іншими С27-стероїдами. Як випливає з рис. 7, швидкісті кислотного гемолізу еритроцитів знаходиться в оберненій кореляційнії залежності від молярного співвідношення холестерол/фосфоліпіди в мембранах що узгоджується з даними літератури [Халилов и др., 1982].

До інтегральних параметрів, які характеризують стан ліпідного б і шар) мембрани, належить мікров’язкість. Як випливає з рис. 8, інкубація еритроцитІЕ та їхніх тіней з екдистероном (10*6 - 10‘12 М) спричинює зменшення

и

сров’язкості мембран. Такий самий ефект спостерігається також під час дії цих ди- та полігідроксильованих С27-стероїдів, тоді як моногідроксильовані

Рис. 8. Мікрав’язкість мембран еритроцитів під час інкубації суспензії

1 - контроль,

2 - холестсрол,

3 - 7-дегідрохолестерол,

4 - холекальциферол,

5 - 25-гідрокснхолестерол,

6 - 25-гідрокси-7'Депдроюлестерол,

7 - екдистерои,

8 - 2-дезоксіекдистерон.

* Зміни порівняно з контролем вірогідні, р<0,05, п=5.

ероїди зумовлюють зменшення мікров’язкості мембран внаслідок кондесу-того ефекту, який властивий для холестеролу.

Специфіка хімічної будови холестеролу забезпечує взаємодію гідроксильної упи його молекули з карбонільним киснем ацильних ланцюгів фосфояіпідів, а кож гідрофобну взаємодію між жирнокислотними залишками та стероїдним льцем молекули. Такі особливості хімічної структури холестеролу зумовлюють зго конденсуючий ефект [Slotle J.P. et al., 1994]. На наш погляд, відмінності у дії злестеролу та полігідроксильованих С27-стероїдів можна пояснити тим, що зедення додаткових гідроксильних груп у молекулу стероїду, особливо у бічний шцгаг, знижує її гідрофобність і, тим самим, зменшує гідрофобну взаємодію з ирнокислотними залишками фосфоліпідів.

У подальших дослідах нами було приділено увагу вивченню впливу кдистерону та інших С27-стероїдів на поверхневий заряд мембран еритроцитів, «убування останніх та їхніх мембран з моногідроксильованими сполуками {олестеролом та 7-дегідрохолестеролом) призводить до зменшення поверхневого зряду мембран, тоді як інкубування з ди- та полігідроксильованими стероїдами більшуе величину цього показника. Зміни мікров’язкості та поверхневого заряду гембран можуть спричинити модуляцію активності мембранозв’язаних >ерментів, проникності мембран для іонів та міжклітинної взаємодії [Krayenhof tal., 1993].

Згідно з даними літератури, функціональні властивості інтегрального білка їлазматичної мембрани еритроцитів Ь'а+,К+-АТФ-ази є ліпідзалежними [Cornelius :t al., 1991]. Результати наших досліджень свідчать (рис. 9), що інкубація

екдистерону та його 2-дезоксипохідного з еритроцитами та їхніми гін. зумовлює збільшення активності ферменту, тоді як за присутності в середов:

Рве» 9. Активність. Na+(K+-ATP-ajH при інкубі еритроцитів із Iff* М С27-стероїдами:

1 - коптороль,

2 - 2 - юлесгеро.т, ,

3 - 7-дегідрохолестерол,

4 - холекальциферол,

5 -екдистерон,

6 - 2-дезоксіекдистероя.

* Зміни порівняно з контролем вірогідні, р<0,05, п=5.

моногідроксильованих стероїдів (холестеролу, 7-дегідрохолестеролу, холекаль феролу) вона знижується.

Одержані нами дані, що характеризують модуляцію активне мембранозв’язаного фермешу Ка\К+-АТФ-ази, корелюють (г = 0,72) зі змії величини мікров’язкості. Зокрема, інкубація еритроцитів та їхніх тінеі полігідроксильоваїшми стероїдами (екдистероном та 2-дезоксіекдистерон призводить до зменшення мікров’язкості мембран та збільшення активне ферменту. За присутності в інкубаційному середовищі моногідроксильоваї сполук (холестеролу та 7-дегідрохолестеролу) спостерігається збільш© мікров’язкості мембран та інгібування Ка+,К+-АТФ-ази. Таку дію Сг7-стерої ймовірно, можна поясниш неспецифічною зміною ліпідного бішару вгаслі, впливу на плазматичні мембрани досліджуваних сполук.

Отже, взаємодія екдистерону та Сгт-сгерощів із мембранами клг модулює фізико-хімічні властивості мембран. Ефекти, які спостерігаюп можуть відбуватися шляхом модифікації ліпідного бішару або лілід-білке взаємодії і зміни конформації мембраіших білків. Не виключено, що це може б; причиною активації сигнальних систем клітини. Результати роботи дозволж висловити припущення, що екдистерон, хімічна структура якого подібна хімічної структури ендогенного гормону ссавців кальцитріолу, мс спричинювати, подібно до останнього, негеномну дію в клітинах теплокрові тварин.

ІЗ

висновки

Встановлено, що за умок короткочасної взаємодії (0-60 хв) екдистерону та кальцитріолу з тканинами-мішенями для кальцитріолу (печінка, слизова оболонка тонкого кишечника) та іншими тканинами (серце, головний мозок) щурів відбувається гідроліз сфінгоміеліну з утворенням вторинного месенджера - сфінгозину, що свідчить про можливість активації сфінгомієлінової сигнальної системи.

В дослідах ш vitro на мембранах еритроцитів за присутності в реакційному середовищі екдистерону та радіоактивно мічених Сггстероїдів - [7-^Щхолестеролу, [4-І4СІхолекальциферолу та [23,24(п)-ЗН]кальцитріолу -виявлено, що екдистерон витісняє з клітинних мембран кальцитріол, конкуруючи з ним за місця зв’язування.

Взаємодія екдистерону та інших С^-стероїдів (холестеролу, 7- дегідрохолесте-ролу, 25-гідрокснхолестеролу, 25-гідрокси-7-дегідрохолестеролу, холекальци-феролу, кальцитріолу і 2-дезоксіекдистерону) з мембранами зумовлює зміни фізико-хімічного стану останніх. Під впливом екдистерону та інших ди- і полі-гідроксильованих стероїдів знижується величина молярного співвідношення холестеролу та фосфоліпідів в мембранах, стійкість еритроцшів до кислотного гемолізу, зменшується мікров’язкість мембран і збільшується поверхневий заряд. Моногідроксильовані стероїди спричипюють протилежні зміни.

Встановлена кореляційна залежність між активністю інтегрального мембранного білка еритроцитів №+,К+-АТФ-ази та мікров’язкістю мембран у випадку дії на мембрани екдистерону та інших Сггстероїдів: під впливом екдистерону і його 2-дезоксипохідното відбувається зменшення мікров’язкості та збільшення активності Ыа+,К.+-АТФ-ази, тоді як за дії моногідроксильованих стероїдів відзначено протилежний ефект.

Виявлено зв’язок між хімічною будовою молекули Сггстероїдів та їхньою дією на мембрани. Це підтверджується різноспрямованістю ефектів екдистерону і інших полі- (2-дезоксіекдистерону) та дигідрокеильованих С27-сгероїдів (25-гідроксихолестеролу, 25-гідрокси-7-дегідрохолестеролу, кальцитріолу) порівняно з моногідроксильованнми стероїдними сполуками (холестеролом, 7-дегідрохолестеролом, холекальциферолом).

ПЕРЕЛІК РОБІТ, ЩО ОПУБЛІКОВАНО ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІ

1. Коцюруба А.В., Буханевіч О.М.,Туганова А.В., Тараканов С.С. Механі ранньої дії біологічно активних оксиетеринів: кальцитріолу та евдистерс Модуляція внутрішньоклітинних пулів арахідонової кислоти та продукті окиснювальногометаболізму.//Укр. биохим. журн.-1995 - 67,№ 5-С.45-

2. Коцюруба А.В., Туганова А.В., Буханевіч О.М., Тараканов С.С. Механі: ранньої дії біологічна активних оксиетеринів: кальцитріолу та екдистерс Ідентифікація обміну сфінгомієліну як ефекторного механізму ранньої д Укр. биохим. журн. -1995 - 67, № 5. - С. 53-58.

3. Коцюруба А.В., Буханевіч О.М.,Туганова А.В., Тараканов С.С., Бердишев і Дослідження механізмів ранньої дії біологічно активних оксистери кальцитріолу та екдистерону. Модуляція систем, що генеруї низькомолекулярні активатори гуанілатциклази.// Укр. биохим. журн. - 19S 67, № 5. - С.58-64.

4. Tuganova A.V. and Kosytiruba А.У. The in vitro interaction of C27-sterols with erythrocyte membranes depends on the sterol structure and concentration Cellular and Molecular Biology Letters -1996 -1, N 2. - P. 129 - 135.

5. Туганова A.B., Коцюруба A.B. Исследование взаимодействия Сгт-стерино мембранами эритроцитов // Укр. биохим. журн. -1996 - 68, №6. - С. 61 - 61

6. В.Г.Пивоваренко, А.В.Туганова, Л.Ф.Осинская, Ю.Д.Холодова. Синтез антиоксидантная активность изофлавонов, содержащих гидрофильные липофильные заместители.// Химико-фарм. журнал. -1997,- №3,- С.14-18.

7. V.G.Pivovarenko, A.V.Tuganova, A.S.Klimchenko, A.P.Demchenko. Flavonols models for fluorescent membrane probes. I. The response to the charge of micelle Cellular and Molecular Biology Letters -1997 - v.2. - P. 355 - 364.

8. A.S.KHmchenko, A.V.Tuganova, I.D.Petrina, V.G.Pivovarenko, A.P.Demchen 4’-dialkylaminoflavonolsas a model for fluorescent membr probes.//W.Mejbaum-Katzenellebogen’s Seminars in Mol.Biology, Wroclaw, J 3-5,1996-P.5.

9. A.V.Tuganova, A.V.Kothyuruba. C27-sterols in vitro alter lipid and proi components of erythrocyte membranes/Workshop on phytoecdysteroids, Syctyvi Russia, September2 - 6,1996. P.l 18 - 119.

10. V.G.Pivovarenko, A.V.Tuganova. The synthesis and investigation of antioxidant

activity of isoflavones with different hydrophylic and lipophilic substituents.// Second Int. Symp. on the chemistry of natural compounds (SCNC), Eskisehir, Turkey, October 22-24, 1996,-P. 146.

1. A.V.Tuganova, A.V.Kotsyruba. The in vitro interaction of different C2rsterols with plasma membrane.// Second Int. Symp. on the chemistry of natural compounds (SCNC), Eskisehir, Turkey, October 22-24,1996,- P.169.

2. A.V. Tuganova, N.L. Kindruk, G.V. Konriethz, A.V. Kotsyuraba. Steroids interaction with erythrocyte membranes. Modulation of the activity of Na+,K+-ATPase//XIIIft Ecdysone Workshop, Jena, Germany, July 27 - 31,1998. - PI2.

АНОТАЦІЯ

Туганова A.B. Взаємодія екдистерону та інших Сгт-стероідів із мембранами ритроцитів. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за пеціальністю 03.00.04 - біохімія. - Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна НАН 'країни, Київ, 1999.

Дисертацію присвячена вивченню дії екдистерону на мембрани у порівнянні іншими біологічно активними Сгг-стероїдами. В дослідах in vivo отримана дані додо можливості активації у щурів сфінгомієлінового циклу у ранній період дії а них С27-фітоекдистероїду - екдистерону (20-гідроксіекдизону) та ендогеїшого ормону теплокровних тварин кальцитріолу (1а,25-дигідроксивітаміну D3). З гетою одержання доказів прямої мембранної дії екдистерону проведено досліди і vitro на моделі мембран еритроцитів. Встановлено, що екдистерон взаємодіє з лазматичними мембранами, внаслідок чого відбуваються зміни їхніх фізико-імічних властивостей: зменшується стійкість еритроцитів до кислотного емолізу, величина молярного співвідношення холестерол/фосфоліпіди та ікро в’язкість, збільшується поверхневий заряд. Це може спричинювати їодуляцію активності мембранозв’язаних ферментів, зокрема Na+ ДС+-АТФ-ази. Еорівняння дії екдистерону та інших досліджуваних Сггстероїдів дозволяє рипустите, що напрямок змін фізико-хімічних властивостей мембран залежить ід хімічної будови молекул стероїдів, а саме від кількості та положення ідроксильних груп. Одержані дані е суттєвими для подальшого розуміння та ивчення механізму дії екдистерону в організмі теплокровних тварин.

Ключові слова: екдистерон, С27-стероїди, сфінгомієліновий і

плазматичні мембрани, еритроцити.

АННОТАЦИЯ

Туганова А.В. Взаимодействие экдистерона и других Сгт-стероиді мембранами эритроцитов. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наї специальности 03.00.04 - биохимия. - Институт биохимии им. А.В. Палла НАН Украины, К., 1999.

При исследовании влияния на млекопитающих экдистерона - гормона j ка и метаморфоза насекомых - выявлены четко выраженные фармакологич« эффекты. Однако вопросу молекулярного механизма действия на них экдисте посвящены только единичные исследования. Согласно данным литерагу] наших исследований, имеется основание предполагать, что действие экдисте по некоторым параметрам подобно негеномному действию эндогенного гор млекопитающих - кальцитриола. Негеномный механизм действия стерои, гормонов, вероятно, связан с активацией сигнальных систем плазматкче мембран клеток.

В экспериментах in vivo установлена возможность актив сфингомиелиновой сигнальной системы биологически активными С27-СТЄр0Ч в ранней фазе их действия на мембраны (0-60 мин): гормона лины метаморфоза насекомых экдистерона и эндогенного гормона млекопитак кальцитриола (1а,25-дигидроксивитамина Dj)

С целью подтверждения гипотезы о механизме мембранного дейс экдистерона в сравнительном аспекте с другими Q; 7-стероидами были прове, эксперименты in vitro на модели мембран эритроцитов. В исследованиях исі зованы производные холестерола с модификациями в цшслопентанпергидр нантреновом ядре и в боковой изооктильной цепи. Установлено, что экдиск как и другие соединения данного класса, способен взаимодействова мембранами эритроцитов. Эффективность связывания Q 7-стероидов с зрі цигарными мембранами зависит от количества и положения гидроксильных г в молекуле. Показано, что моно- и полигадроксилированные стероиды, к шк относится экдистерон, имеют разные локусы связывания с мембранами.

Сравнительное изучение влияния экдистерона и других Оп-стероидов на >изико-химические свойства мембран показывает, что вследствие действия кдистерона на мембраны наблюдается снижение устойчивости эритроцитов к ислотному гемолизу, уменьшение микровязкосги и величины соотношения олестерол/фосфолипиды, увеличение поверхностного заряда мембран, л алогичные эффекты отмечены также в опытах с другими ди- и полигидрокси-ированными стероидами. Моногидроксилированные стероиды обусловливают ротивоположные изменения.

Изменение физико-химических свойств мембран вследствие действия кдистерона может быть причиной модуляции активности мембраносвязашшх •ерментов. Это предположение подтверждено данными о связи между кгивностыо №+,К+-АТФ-азы и степенью микровязкости мембран при действии ^7-стероидов. Так, инкубация эритроцитов с экдистероном, а также с другими и- и полигидроксилированными соединениями, обусловливает уменьшение икровязкости и увеличение активности Ыа+Д+-АТФ-азы, в то время как оногидроксилированные стероиды способствуют ее увеличению и снижению ктивности фермента.

Представленные в работе результаты позволяют выдвинуть предположение о егеномном действии гормона линьки насекомых экдистерона на клетки лекопитающих, подобно эндогенному гормону млекопитающих кальцитриолу, следствие сходства химической структуры их молекул.

Полученные нами данные имеют значение дли дальнейших исследований олекулярных механизмов негеномного действия эндогенных гормонов лекопитающих и биологически активных оксистероидов, не являющихся щогенными гормонами последних.

Ключевые слова: зкдистерон, Сгт-стероиды, сфингомиелиновый цикл, лазматические мембраны, эритроциты.

18

SUMMARY

Tuganova A.V. The ecdysterone and the other C27*sterols interaction w erythrocytes membranes. - Manuscript.

Thesis for a scientific degree of candidate of biological sciences by specia &3.00.04 - Biochemistry. O.V. Palladin Institute of Biochemistry of the Natioi Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv, 1999.

The dissertation deals with the investigation of ecdysterone action and c&mparis with others biological active C27-sterols. In the in vivo experiments the activation of 1 sphingomyelin signal transduction system under the Cj7-oxysterol - ecdysterone (2 hydroxyecdysone) as well as under endogenous C27-steroid hormone calcitriol (la^ dihydroxyvitamin D3) early action has been shown. In order to obtain the evidence the direct ecdysterone membrane action the in vitro experiments on the erythroc] membrane model have been carried out. It has been shown that ecdysterone interact with plasma membrane and caused in the changes in the chemical composition a physical properties of membranes. The increase of resistance of erythrocyte to a< hemolisys, molar ratio cholesterol/phospholipid, and microviscosity as well as decree of surface charge under ecdysterone action have been observed. It is supposed, t modulation of the activity of membrane bounded enzymes is a result of changes chemical composition and physical properties of membranes. Under ecdysterone acti the direction of changes observed is dependent on chemical structure, namely quant and position of hydroxyl substitutes. The data obtained are significant for fiirtt investigation and understanding of the mechanisms of the action of endogenous sterc hormones and biological active Qroxysterols that are not act as endogenous sterc hormones.

Key words: ecdysterone, Czrsteroids, sphingomyelin cycle, plasma membrane erythrocytes.