Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Фитоэкдистероиды серпухи невооруженной (Serratula Inermis) и их влияние на биосинтез нуклеотидов и нуклеиновых кислот в тканях цыплят с различной обеспеченностью витамином Д3

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Фитоэкдистероиды серпухи невооруженной (Serratula Inermis) и их влияние на биосинтез нуклеотидов и нуклеиновых кислот в тканях цыплят с различной обеспеченностью витамином Д3"

РГб од

2 о сен <333

АКАДЕМИЯ НАУК УКРАИНЫ ИНСТИТУТ БИОХИМИИ им.А.В. ПАЛЛАДЙНА

Не правах рукописи

АХМЕД ИСШИЛ

ЖГОЗКДИСТЕРСИДН СЕРПУХИ НЕБООРУШНОЙ(8ЕЙНАги1А ШЗШК) И ИХ ВЛИЯНИЕ НА БИОСИНТЕЗ КУКЛЕОШОВ И НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ В ТКАНЯХ ШПЛЯТ С РАЗЛИЧНОЙ ОБЕСПЕЧЕННОСТЬЮ ВИТАМИНОМ Д3

03,00.04 - Биохимия

Авторе® ар а т диссертации на сояскашге учаной степени кандидата биологических наук

Киев - 1993

Работа выполнена на кафедра органической и бионеорганической хжш1 Украинского государственного аграрного унивар-ситета и в отделе биохзтлии'стариков Института биохимии км. А.В.Паллэдена АН Украина л '

Научный руководитель: доктор биологических наук, . -профессор ХОЛОДОВА Ю.Д. . ..

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук ЧАЯЛО П.П.:

доктор биологических каре ЛЕВИЦКИЙ БД. '

Ведущая организация - Киевский университет им. Тараса Левченко

Защита диссертации состоится "¿0" сенГя^А)? 1993 г. в -1Н часов на заседании специализированного совета . Д 016.07.01 но защите диссертаций, в Институте биохимии .. им. А.В.Палладина АН Украины (252030, г. Киев, .," ул. Леоятовича, 9). ' .---.'ч' ,■'

О диссертацией: можно ознакомиться в библиотека Института биохаяи АН Украины. /.

Автореферат разослан "/¿"У - 1993 г. "

Ученый секретарь ■ у? : .. специализированного созата КИРС5НК0 О.В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность теш. В последние года во всем мире возрос интерес исследователей к фитозкдзстеровдам, которые, являясь природными биологически активными соединениями, оказывают положительное воздействие на организм человека и тавотных.

Известно, что экдиотерон вызывает усиление синтеза РНК, белка, и гликогена.в печени, сердце и мышцах млекопитающих (анаболический эффект)стимулирует эритрояоэз, обладает тонизирующими и адаптогешшш свойствами. Кроме того., у теплокровных он -обладает гепатопротекторной, гадогликвмичаской, гйполкпвдемической, анти-атаросклеротической, психотропной, автирадакальной, антиокисли-твяъаой и др, видаки активности /Т.А.Громова и др., 1977; Ю.Д, Холодова, 1979, 1987; М.А.Ташмухамедова и др., IS86; А.А.Ахрем, Н.В.Ковгайко, 1989; В.Н.Сыров, 1992/.

Способность стимулировать процессы биосинтеза белка и отсутствие выраяанных побочных эф£актоз яри применении экдистерока /А,Г.Курмуков» В.Н.Сыров, 1980/ свидетельствуют о целесообразности изучения механизмов его действия о точки зрения использования з лечебной практике. Кроме того, экдистерон представляет собой активный и ныне.доступный препарат для изучакия молекулярных основ гормонального действия, что становится актуальным ввиду открытая двухфазного характера механизма активации генов стероидными гормонами. . '

В течение последнего десятилетия основное внимание исследователей было уделено изучению анаболического эффекта эндистеро-на, его адаптивных свойств. Препарат экдастерона "экдастен" нашел применение в клинической практика. В то ае время исследовании конкретных молекулярных механизмов влияния экдастерона на обмен веществ у теплокровных.посвященн лишь единичные работы / / Ireland B.C., Berger Е.И., 1982} Katalou-H.E. et al., 1932| Scheakel H. at al., 1933; Kiruaa K. et al., 1990j Сыров,1984/.

Многие эффекты экдиотврона на обман веществ у теплокровных могут найти свое объяснение в свете известных молекулярных механиков действия Екдастероздов:на насекомых, освещенных в литература /Kooinan J., .1982; Ю.Д.Холодова, 198?; А.А.Ахрем, Н.В.Ков-ганко, 1989; Koolaaa j.t 1990/. Так, адаптогендае действие

экдистерона - возможный результат индукции биосинтеза белков теплового шока йот так называемых стрессорных белков и актина, психотропное действие - результат воамолшой аддукции биосинтеза ацетилхолинэстеразы и т.п.

Известны две схемы механизма активации генов эвдистероном у насекомых, в основу которых положены гипотеза Карлсона (прямое действие гормона на релрэссоры генов) и гипотеза Крегера (опосредованное действие гормона на геном через одну из сет- • кальншс (кзссзнжерных).систем клеток). Ва:ашм моментом во второй схеме является двухфазность действия стероидного гормона, . причем вторичная активация генов требует для своего протекания биосинтеза белков, который запускают продукты первичных яро^ ' цессов, ■'''.''/■ . ,.*. ;•'••",.'• "V.-.

Ранее было показано, что фитоэкдистероиды способныуслда-вать лечебный эффект витамина Дд при лечении рахата' Д).Д.Хододо-ва, 1979/, в т.ч. самостоятельно ивдушроватЬ сяевдфачаскя* витамин "Д-завасишй Са2+-связываюци2 бедок. В ю яе врекя хозщреТ' ные механизмы, способные запустить этот гффект экдистерона, ос-таится неясными. ' '

Оценить значимость экдпстерона при лечении рахита и его* способность занять опредаленное место.оради.другнх известных . препаратов -стимуляторов действия ватаиина Дд пока не пред-; ставляется возможным из-за недостаточного количества исследований в данной области, особенно на уровне целостного организма.

Учитывая еыдесказанное, избегав механизма действия экда-стерона на-биосинтез нуклеотидов и нуклеиновых кислот клетки в условиях Д-гиповитаминоза, т.е» недостаточности одного из ре-гулято. .в процессов пролиферации и дафференцировки клеток -I ,25(ОН)2Ц3 , весьма актуально"'■■'"'•'•••-V. ' . - , "

Несомненно актуальной задачей современной биоорганической ха-лик, биохимия и биотехнологии является также поиск доступного растительного сырья, содержащего зкдпстероиды,'-.их. химическая идентификация,- отработка условий культивирования,и сбора сырья, обес-течивающих максимальное содержание в нем этих ценных продуктов. Изучение состава экдистероидов и особенностей их накопления в растениях с последующим выделением может способствовать разработке новых лекарственных препаратов и выяснению ролл и механизмов

действия экдистёроидов как фармакологически эктйеных средств.

Проведанный до настоящего времени скрининг большого количества растений, а т.ч. произрастающих в Украине, показал, что концентрация экдистёроидов в них подвергается сезонным колебаниям и различна в различных органах растения. Довольно высокое содержание (1-2%) экдистёроидов обнаружено у произрастакоих на территории Украины растениях рода Зегга-ьи1& (серпуха) - а.хеюш-. Шеяо1йвз, З.согоаага Ь., 3.1пеха1з вШЬ. /Ю.Д.Холодова и др., 1979; И.А.Новосельская и др., 1981; Т.А.Ревина и др., 1936; К.Шладера и др., 1992; М.Л.Саад и др., 1992/.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось выделение и исследование химической природа экдистёроидов из серпухи невооруженной ( ЭеггаЪШа 1пела1з (И11Ь. ), изучение их биологической активности и механизмов влияния на биосинтез нуклеиновых кислот при различной обеспеченности организма витамином Дд. Кроме того, наобходао было установить оптимальные сроки сбора сырья с целью получения максимального содеряаняя экдистёроидов для производства-и исследования препаратов на их основе.

Для достижения намеченной цели были определены следующие задач?.:

1. Выяснить особенности накопления экдастерона в надземной части растений серпухи 3.1аегл1з в зависимости от типа органа и фазн развития растения.

2. Выделить в индивидуальном зиде л с помощью физико-химических методов идентифицировать зкдистероида из наиболее богатого яки органа БЛаегааз.

3. Изучить в хроническом опыте антирахитичаскую активность различных препаратов экдастарона из з. 1аека1з в организме птиц:

а) как активаторов лечебного действия витамина Д3,

б) как самостоятельных антирахитических препаратов.

4. Исследовать особенности действия эвдистерона на биосинтез нуклеиновых кислот в ранней к поздней фазах его действия.

5. Определить у животных с экспериментальным Д-гиповитамлдо-зом ранние биохимические изменения, обеспечивающие антирахитический эффект экдастерона:.

а) влияние экдастерона на процесс всасывания кальция в тонком кишечника;

б) изменения з обмене нуклеиновых кислот и их предшественников -пуриновых и пиршвдиновых нуклетвдов в этероцитах тонкого кишечника;.

в) изменения в белковом и липидыом обмене в энтероцитах тонкого кишечника и сыворотке крови.

Научная новизна. Впервые описан яолный состав эадистерои-дов з.1аегя1±а . Впервые изучены особенности обмена нуклеиновых кислот и их предшественников - пуриновых и пиришдиновых йуклео-тидоз, а также оксияуринов в ранней и поздней фазе действия эк~ дистерона у птиц. Изучен механизм гормонального, действия (акти- . вацни генов) экдастерона в организме птиц. Выявлены особенности . раннего действия экдастерона на обмен веществ у птиц, определяю-' дие его биологическое действие в условиях Д-гиповятаминоза.

Показано, что в организме теплокровных экдистерон действует по типу классического стероидного гормона, причем модуляция: .км . геномных событий в ткани-мишени имеет двухфазный характер, что предполагает первоначальную активации экдистероном одной из сигнальных (мессенкерккх) систем клеток, предаочтятельно - Са-чувстветедьной фосфолилидзависимой, :

Обнаружена положительная корреляционная связь между экди- • стерон-индуцируе;.жл2 изменениями величины внутриклеточных пулов гуашшуклеотидов и мочевой кислоты, с одной стороны, а суммарной ДНК - с другой, что предполагает возыояное участие указанных соединений в механизме регуляции экдистероном экспрессии генов.

Теоретическое значение и практическая ценность работы. Из цветочных корзинок 3. 1аегв1з изолировано и достоверно идентифицировано шесть экдистерондоз - витлкостерон Б, 2-дезоксиэкди-стерон, солилодин В, интегрдстерок Д, 26-оксиэкдистерон. Определен количественный состав эхдистероидоз и'особенности накопления главного компонента - экдистерока - в наземной части растения. Показано, что 3.1пега1з является эффективным продуцентом экдк-стероидов.

Изучала антярахитическая и адаптогенная активность экдастерона и препаратов на основе сырья з. 1ает1з , БТИ-4 и БТИ-8Лв органиг.ме птиц,'

■ - А' '

, . Результаты исследований существенно дополняют сведения о механизмах действия экдистзрона на метаболизм нуклеиновых кислот и их лредаесгвенншсов ~ пургшовгй: и пирлмцдиновых нук Леонидов. Иссшдованпые препараты - экдпствроя, БТТГ-4 и БТИ-8Л из з.1аегд1а иозяо рекомендовать для комплексного лечения рахита в педиатрия и веторпнария совмеотко с витамином Д^.

Апробация работы» Результаты работы докладывались на Конференции профессорско-преподавательского состава Украинского государственного аграрного университета (Киев, 1991, 1992), 1У Международном симпозиуме по анализу стероидов (Венгрия,1991), научных семинарах отдела б ножищ сиринов Института бзохжлш АН Украшпг (Киев, 1991, 1392), У1 Украинском биохимическом съезде (Киев, 1992), научней сггжгара Института биохимии кл. А.в.Палкадана АН Украины (Казв, 1393).

Публикации, По'материалам диссертация опубликовано 6 печатных работ,

Обьем и структура работ;;. Диссертация состоит из введения, обзора лвтаратури, описания материалов и методов исследования, результатов и лх обоуззденкя, изложенных в б главах, выводов и списка использованной .татературы. Общий ойъси диссертации вкл&-чзс;' 151 страниц каппгяошгсного текста, 7 таблиц я 25 рисунков. Слисок литературы содерлит 207 наименованийс

Научные консультации проводили д.б.я., ярофДолодова Ю.Д. и Е.б.а. Коцвруба А.в.

МАТЕРИАЛУ И МЕТОДЫ ЕССЛЕЖ0Е4НИЙ

Выделение и идентификация эздмсгароидоэ 3.1пеп^1ы. Б опытах использовали серпуху яавооруаеннуп (ЗеггеЛи1а 1пот1а ИНЬ. ), которую взяли для рагилозвния э старой природной дубрава деядрозаповздвяна "Александрия", а также .дубового леса Тсчилокского лесничества.

Фенологические наблюдения за 3.1ле.га1з и отбор проб для анализов »здисгероцдов проводили как з природшис .условиях (дуб-рззи,. дендропарка "Александрия1*), «?ак а в условиях культуры (участок - ыаточппк редких лекарственных растений дендропарка "Александрия").

Количественное определение звдазтврояа а s.laermia осуществляли по методу Солодовой /1967/ о использованием реахции Бугаева. ■' .

Принадлежность выделанных индивидуальных компонентов к классу эвдистероидов и их идентификацию проводили о помодьв физико-химических ыетодоз исследования: УФ- Ж-, ПНР-спектро-скопин и масс-спехтро.ме трип, а такие сравнением пх подвшшостз при ТСХ с известными стандартам. -

Уф-спектрн записывали на спектрофотометре Specoxd uv vis, Щ-сдектры - на ин-20 , спектры Ш5Р - на приборе ик-чн-юо с рабочей частотой 200 иГц. Использовали растБоратели s^d^ii, GDjOD, в качестве внутреннего стаядарта-тетраыатилсилан.

Масс-спектры снтанам на приборе 12-1303 с систеноЯ прямого ввода веществ в ионный источник.

Изучение биологической активности е механизмов действия зк-дистерона и препаратов па его основе. Еиологичзскуп активность зкдистерона из s. lneanis, а также галеновых препаратов БТИ-4 и БТЙ-ЗЛ. из этого сырья испытывали на цыплятах с экспериаав-тальным Д-гияовигамивозсы. Препараты использовали в качаотго стимуляторов лечебного действия витамина Дд.ЛЕбо как самостоятельные антирахитические добавки к рахитогбнно2 даете.

При изучении механизмов действия (ранняя я поздняя фазы действия 0-2 ч и 24-72 ч после одноразового введения) использовали водно-спиртовые растворы кристаллического зкдпстарона, выделенного и очищенного нами из цветочных корзшок S.laeaats . Экдиотерон вводили цыплятам per оз в количества 10 ыкг (10~® К) аа 100 г массы. Гпаотных забивали через SO, 60 и 120 шш (экспери-иенталь ый Д-гпповитамлноз) или через 30, 60, 120 шш п 1, 2, 3 суток после введения эвдистерона (нормальные вявотные).

Скорость транспорта кальция в энгероцатах тонкого калачника цыплят с Д-гиповиташшозои оценивали по интенсивности всасывания 45СаС12 (15 ТЕк/моль) из просвета кишечника (введение за 10 мин.до забоя е количестве 18.5 ыБк на 100 г массы тела) ри введении per os экдастерона в дозе.10 мкг на 100 г за 10, 20, 30, 60, 120 и 180 мин до забоя.

Скорость биосинтеза нуклеиновых кислот оценивали на включай метки 1-14С глицина (2100 ТБк/моль) (РНК и ДНК) ели ыетхл-3Н2 ти мидава (1570 ТБк/моль)(ДНК), которые вводили внутрибршанно за

- - V - 6 -

10 мяв (глициа).или за 30 мин (тимидин) до забоя. Оба предшественника вводили в количестве 1,85 ЪЕк на 100 г шссы тела.

Скорость биосинтеза de novo прздпестзеннпков нуклеиновых кислот - суриковых и пиришдановьге нуклеотидов, а также оксипу-ранов оценивали по включении иска 1-14С глицина,. . . определяли скорость биосинтеза не только нуклеотэдных и белковых, но п лшгадкыг компонентов исследованных тканей.

Радиоактивность проб определяли на сцянтилляционном счетчика фирмы "Becbaaa " (США).

Кислоторастворише пуриновые а'днридадиновые коипоненты экстрагировали из гомогенатоэ тканей цыплят 5#-кой охлаяденной НСЮд а затем гядролизовалд I н. ЕСЮ^ при Ю0°С в течение I ч до пурлновых -оснований и пиривддиновых ыснофосфатов. Растгор . нойтрализсзали КОН дяк удаления хлорной кислоты, и продукты гидролиза разделяли ионообменной хроматографией на катионсобменни-кв Дауог.с 50x4 ("Serva '!, Германия) (Н+-фор1.;а, 200-400 меш, колонка 8x1 cu), используя градиентное элшрование: водой (таз?, мочевая кислота), 0,2 н. НСЮ4 (CM?, ксактпн), 0,4 н. HCI0., ( гипохсантян), I н. ЕС10^ (гуанин) и 2 к. КС10^ (аденин).ч1ри необходимости фракции, содержала пириыидиновые нуклеотиды и иочэзую кислоту, ротсроматографировали на аЕнонообиэяника Дауэхс 1x3 ("serva Германия), (Cf-форма, 200-400 warn, колонка 12x1,2 см), используя градиентное элззированиз формиатом аммония /Kamen, Hurlbert, 4959/«

Пиримидшювые монофосфатн, пуриновые основания и оксипури-нн идентифицировали по хроматографической подвижности на ионооб-мвннпь:ах соответствующих стандартов (аденин и гуанин - фирмы "Calbiochea США; гипоксантик, ксантин, ШР И С?£Р - "Heaoal", Венгрия; мочевая кислота - "Реахим? Украина), а также путем анализа спектров поглощения в области 200-300 нм.

Количество пуриновых оснований и пиргшдинбвых монофосфатов определяли, используя известные коэффициенты молярной экстинции. Сканирование спектров проводили на спектрофотометре Specorl uv vis (Германия).

Фракции суммарной РНК и суммарной ДНК выделяли из осадков го-могенатов тканей по методу Шмидта и Тангаузара после отделения фракции свободных нуклеотидов /Pilbaresity, Zarasok, 1970/. Коли-

чество ДНК и РНК определяли сдектрофотометричеоки /Спирин, 1968/.

Липида из тканей экстрагировали хлороформ-метанолом; яо, Фольчу.

В сыворотке крови определяли мочевую кислоту сдектрофотометричеоки после разделения кислоторастворимой фракции на.ка- . тионообменнике , общий белок (по Лоури), содержание Са, Р1 и холестерина,-г с помощью стандартных наборов фирмы " ОЬеиароГ'. (Чехо-Словакия).

Проводили корреляционный анализ и статистическую обработку. ■ экспериментальных данных /Лакин, 1980/. . ; * ; -

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ЕССВД0а<Шйй 'V . ' ' - ;

В последние года в Институте бшхиши им.А.В.Палладана АН . Украины (г.Киев) в Институте химии растительных веществ АН Узбекистана (-г.Гашкент), в ряде нсучных учреждений АН Беларуси ус- т. тановлеяо, что гкдастероиды проявляют различные виды биологической активности в организме яшзотекх и человека. .

Возникла потребность в поисках источников растительного:сырья о высоким содержанием экдастероидов, разработке методов их идентификации, выделения и количественного определения. На базе отдела биохимии стеринов Института биохимии АН Украины и кафедры биоорганической лшиа Украинского, аграрного университета проведен скрининг большого числа растений Украина и разработаны химические и биологические методы их тестирования /Холодова, 1976, 1979; .Ахмед и соавт.,1991; Мяладера и соавт.,1992; : Саад и соавт. 1992/. . \ ■ :- .• /. '•■■'. ": V" V*

Наш изучены,биологические особенности одного из растений; рода Зегга-Ьи!а - а.1пега1а0111Ъ., динамика накопления ыаяорногс компонента - экдистерона в различных органах растения в эаэиси-пости от фазы его развития, определены сроки сбора сырья для получения максимального выхода экдистеьрна. '

З.1веет1з введена в производственную культуру в Дендроза-поведнике "Александрия" (г.Белая Церковь). Там же созданы производственные участки с целью получения сырья для выделения фито-экдистероидов. . . ^. .V- /У '•':,'

Г,!ы показали, что содержание экдистерона было ¡максимальным

в. цветовых корзинках дикорастущей s.iaemlo в фазе цветения ,1,58-1,8$) я несколько меньше з фазе бутонизации (1,29-1,44$). В листьях оно соствляло 0,18/S и 0,22$ соответственно.

При культивировании в полевнх условиях содержание эвдисте-рола в.цветочных корзинках снижалось до 1,10а. Однако в последнем случай отмечалось значительное увеличение урожайности растения: так, трехлетний куст в культура жал в среднем 7000 корзинок,- в то время," как в природных условиях - всего лишь 50-60. По наши расчетам.содержание .зкдастарона в культивируемом растении на 3-яй год вагзтацик может составить до 200 кг с I га, что погЕэяязт'ОТЕзсиг культуру, s.inemía к достаточно перспективным источникам 'зтого ценного стероида.

. ' Вцдеяэнши идентификация пндвидуальных фитоэкдистерсядов S.ln'eaala., ■ Используя метод колоночной хроматографии, ш выделили пз цветочных корзинок s.inoráis 6 зкдиствроидов (1-У1) и установила их структуру с яомошьв УФ-, ИК-, ПМР~слектроскопил и масс-спзктромотрпи (рис, I);

пат IIlf'p^OH

НО- ОН

г/ :

но лн

Рис.1. Структурные формулы зкдастаровдов з.inoráis.

I - ватикостерон 3 (25-ацетат зкдиотерона) ^29^4 6% , П - 2-дезоксиэкдистёрон 027^4496' И ~ полиподин В (5-ок-.. сизкдис'терон) С2?H^Og, 17 - эвдисторон С^гД^О^, 7.-- ин-тз-;тристерокА (1-скспзкдастсрон) ^Т^Л'Рз' ^ ~ 26-ок-сиэкдистерон .

1 Из очищенного катаиольного извлечения сухих соцветий s. inoráis путем хроматографии на окисй алшивгя, алшруя колонку системой хлорофоргл-метанол возраставдей полярности (0-10$ метанола), выделили соединение I, затем И, Ш и 1У. Их принад-леаность к классу звдистерокдов подткарздаатоя УФ- и ЯК-спектрами, характером масс- и ШР-спекгров, а также сравнением на . ТХС с известными стандартами. Эти вещества идентифицированы как витикостерон Е, 2-дезоксиэкдистерон, яодагодан В и зхдасте-рон. Их характеристики представлена в табл. I,

I. Спектральные характеристики идентифицированных экдистероидов соцветий s.ineicis

Эшшставоады 1 Ю&ааектр-.-?, и.д. : о^ю^иад» 9псктр,| спектр',——,-р-——¡-—у-—--

unas i v,cm"i!C7-HÍCTo «я!C7q-Me!Сот-Ме!с2б'27" !hu !КВг ! 7 ! I8_Me! 19 1 217 !

1

-'I ч

!

-Me

I .Витикостерон 243 E (25-ацетат экдиотерона) щоо

П.2-дезсксиэк-дистерон .

243 12100

243

Ш.Полиподин Э (5-оксиэвдв-стероп) II600

1У.Экдистерон 242

12200

УЛвтагристеров А (1-оксиэкди- 245 стерон)

10600

71.26-оксиэкде-стерон

10200

.1720 1650 1615

3450 1645

3340 1685 3400 1650 1510

3350 3480 1670

3430 1655

;у 1,20 . 1,07 1,60 1,45 Дейтеропиридин'

0,93 0,87 1,17 1,17 Дейтеропиридин

1,15 .1,09 1,52 1,35 Дейтеропиридин 6,20 1,19 1,05 Г,55 1,35

; ■ W

6,14 1,10 1,29 1,45 1,25

C5Í5ÍT

1,21 1,07 1,58 1,48 . ДеЙтеропЕрЕдан

Путем хроматографии экстракта соцветий на оидакагегс при элшровашш смесью растворителей хлорофора-матанол-вода

,(60:32:6) выделили вещество V и в более полярной системе - вещество У1, которые на основании изученных УФ-, ИК-, ШР- и масс-спектров идентифицировала с 1-оксиэадистероном, найденным нами ранее в цветочных корзинках s.xeranthciaoidea Долодова и со-авт., 1976/, и 26-оксиэвдпстероном - одним из распространенных метаболитов в половой системе насекомых (Eüapler, 1969/. Соотношение метаболитов в цветочных корзинках 0,025:0,05:1:100:1: 0,25.

Полоса поглощения сопряженного кзтока в ИК-спектра проявляется в области Ï640-1670 см"1, полоса поглощения гидроксиль-ной группы - 3300-3480 см-1. В полилодпнз В присутствие 5 -ок-сигрупш рядом с 6-кетогрупдой сдвигает полосу ее поглощения на 30 см (1685 см"1). В витккостероне Б полоса 1720 см"1 свидетельствует о наличии эфирной группировки.

Масс-спектры имеют пики молекулярного иона М+ в I - if ди-ацетоняда при п/е 602, П - M при а/в 464, Ш, 1У и Л - при и/в 496. Для экдастерона (1У) и I-оксиэкднстерона (V ) приводим фрагментацию: 1У - 462, 444, 426, 411, 408, 363, 345, 344, 328, 327, 309, 301, 300, 125, 99, 81, 69; 7 - 478, 460, 442, 424, 409, 391, 379, 374, 368, 361, 343, 325, 316, 301, 143, 125, 99, 81,69.

Изучение эффективности препаратоз экдистерокдов из a.lnenata совместно с витамином Дд в условиях Д-гиповиташтозаИзвестно, что при активации бе локс№"озирувдей система экзогенными предшественника™ пуриновых и пирлшдановых нуклеотидов достигалось значительное повышение эффективности лечебного действия витамина Дд при лечении рахита у цыплят /Коцюруба, Кокунин,1979,1980/. Можно было предположить, что использование витамина Дд совместно с экдистеропдаш, стимулирутацши биосинтез белка и абсорбцию Са2+ в тонком кишечнике Долодова,1979/, будет способствовать быст-рейиой нормализации минерального ж других видов.обмена при лечении рахита. Опыты проводили на обычно используемой при изучении рахита модели - экспериментальном Д-гияовитаминозе у цнп-ляг. В течение 30 дней, начиная о однодневного возраста, цыплята всех групп содержались на рахитогзнной диете (группа 0, рахит). Кииотные подопытных групп ежедневно дополнительно получали' препараты на основе экдистероядов из s.inem'ia - 10 мкг экдастерона (группа 2), 100 мкг галзиового препарата БГИ-4 (группа 3), 100 мкг

галенового препарата БТИ-8Л, содержащего сумму экдистероидов и лшиды (группа 4) или 100 ыкг лшосомальной формы препарата . БТИ-8Л (группа 5). Часть животных из каждой группы в течение 10 дней,начиная с 20 дня опыта, получали ежедневно лечебную дозу . витамина Дд (40 ME). Препараты экдистерона и витамин íg вводили per оз . За норму служили животные, с первого дня опыта ежедневно получавшие физиологические дозы (13 ME) витамина Дд. \

Данные, представленные на рис. 2, 3, свидетельствуют о положительном действии исследуемых преяараговна белоксинтезирую-щую систему в этероцитах тонкого кишечника цыплят (ткань - мишень действия витамина ¿Ц) при лечении рахита. Максимальное стимулирующее действие наблюдали в группах 3 (БТЙ-4) и 5 (БТЯ-81, липосоаальная форма). Об этом свидетельствуют также данные табл. 2, в которой представлены биохимические показатели сыворотки крови щплят с Д-гиповЕтамююзом, получавших лечебные дозы витамина Дд. - , . /.■■,■■.'"•

Как уже отмечалось выше, именно изменения в белковом обмене рассматриваются как решающе для .нормализации минерального гомео-стаза при лечении рахита,. Общепринято для тестирования обеспеченности витамином Д определять уровни Са и Pi в/сыворотке крови. Мы ввели дополнительные показатели - уровни мочевой.кислоты, холестерина и тимоловую пробу, которые, как показывают данные табл. 2,достоверно отражают состояние экспериментальных животных, коррелируя с изменениями уровней,Са и Р1.

Гипохолестаринемпческое действие экдистерона было установлено Холодовой и сотр. Д'лронола и соавг., 1982/. Что касается пока затеей белкового обмена -уровней мочевой кислоты - конечного продукта деградации белкового азота у,птиц и тимоловой пробы,- . то они могут быть рекомендованы как хорошие дополнительные тесты для определения статуса впгамша Д в организме.,Данные табл. 2 . ■ указывают на суцественйую'нормализацию минерального, белкового и липздного обменов в течение 10-дневного' курса лечения птиц с Д-гиповитаминозоы "минималхной" лечебной дозой витамина Л^ (10Ш) совместно с препаратами ЕТИ-4 (гр. 3} ж БТИ-8Л, липосомальная форма (гр. 5). В других группах - экдистерон (гр. 2), БТЙ-8Л (ip. 4) действие препаратов менее выраяено.

Отметим, что в отсутствие витамина Дд использование препара-

Урачил- Цитозть

иуклеотиды нувлеотнды 1,2Г

2

сГ й

h

у ч

2 сх \

и ц о Л ' §

О К

X

Я

гЬ

4 -

О

- зог

3

а

Р

U

9 \

р 2

а И

g 5'»

5 S

Л я а

Я

0,8

0,1

гЬ

4i

12 3 15

щ

tí

fe

■Г-

а

щ

12 3 4 5

Лнсяии-

нуклеотвды

zzszz:

Гу«»и!>-цуклеопшы

Í2

rf

ОД

[Ж

Ж

¿

«г i

1 23 4 S

1 2Г1 S

Pec. 2. Влияние препаратов экдистероидов из s.ineraia на вели-.

чину внутрш* латочных пулов (вверху) л скорость биосинтеза нуклеотидов по путл de novo (включение метки I-í.^C глицина, i =IC ms, внизу) в энтероцитах тонкого кишечника цыплят в.процессе лечения рахита.

Заштриховано - уровень лормы, незаштриховано - уровень Д-гипо-витаыиноза (рахит).

I - контроль (рахитогеняая диета (РД) +- 40 MB Дд), 2 - РД + 40 МЗ Дд + 10 тг эхдастерона, 3- - РД > 40 !ЛЕ Дд + 100 мкг БТИ-4', 4 - РД + 40 № Дд + 100 глкг 5ТИ-8Л, 5 - РД t 40 !.Ш Дд + 100 БТИ-8Л (липссомальная форма). ,

.- 13 -

а

РНК

Б

«г 52

м-

§ч

Зь1

0>-

тш

ж

о<-

Днк

Ш

та

30

20

10

01-

Общий бедок

о

С*?

к о § -

8 И

3 3 2

Ш

4

а

1,0

0,5

«О

40

20

и

12345 12345

[Ш

20

10

й

*

е2

1 2 3 4 3

1 2 3 4 5

Рис. 3. Влияние препаратов экдистероидов из з.1п.еш1а на вэличи-ну внутриклеточных пулов (вверху) и скорость биосинтеза (включение метки I- ^ глицина, ( = 10 мин, в:шзу) нуклеиновых кислот, белков и липидов в этероцптах тонкого кисзчника хыплят в процессе лечения рахита. Обозначения см. рис, 2.

о

Тонкого кишечника. Скорость биосинтеза нуклеиновых кислот, их предшественников - пургновых и пиримидиновых нуклеотидов,мочевой кислоты, а таксе общего белка определяли по вклвчению метки 1-14С глицина (экспозиция 10 мин).

Всасывание кальция из просвета кияечшка оценивали по радиоактивности сыворотки крови после введения рог os '^СаС^-

Как видно из рис. 4, ужа в интервале 1-3 ч после введения экдистерон активирует процесс транслокации 45СаС12 из просвета кишечника в кровяное русло (максимум через 2 ч дооле введения). Это.совпадает по бремени с наблюдаемой ранее /Коцюруба»Кокунин, 1979,1980/ активацией всасывания кальция после введения 500 MB (12,5 гш») витамина Jig 'цыплятам с экспериментальным Д-гиповитами-нЬзои. Причем, в последнем случае активация всасывания Са (ранняя фаза действия'витамина'^), предшествовала зо времени ицдук-рш специфического витамин Д-зависимого Са2+-связывавдего белка (поздняя фаза действчя или эффект витамина Дд на уровне генома), т.е. эффект витамина Дд нмел двухфазный характер.

На рно. 5 представлена дшшлиа изменения внутриклеточных аулов сухарных йуриновых. и пиримидиновых нуклеотидсз и скорость ах биосинтеза по пути . de novo . Уваличешшй в условиях Д-гидо-витаюшоза пул суммарных уранплнуклеотидов очень быстро нормализуется уже в течение 30 мин после введения оядистерона (кр.1), возможно,за счёт "перекачки"ЮТ в СТР в СТР-синтетазной реак-..хии, поскольку .величина пула суммарных цитозиннуклеотидов в течение первого часа после введения экдястеронг резко увеличивается (кр. 2) . Таким, образом', одним из рарних.ответов энтероцитов тонкого кишечника на .введение гормональных количеств экдастерона :яожет быть активация фермента СТР-синтетазы, катализирующего единственный путь превращения урацилнуклеотидов в цятозиннуклести-ды. В свою очередь, увеличение пулов цитозиннуклеотидоз в период гормонального ответа может положительно сказаться как на синтезе РИС (суммарная РНК энтерощтгов на 9С# состоит из рРНК GO -типа), так и на синтезе липидов,' особенно фос^олштадов, структур..ах компонентов мембран эктероцитоз. Из литературы известно, что нормализация липидного обмена является важным звеном в механизме ан- • тирахитического.действля витамина Дд./Бауман, I98S/. Не исключено, что экдистерон, активируя синтез OTP, тем самым нормализует и'

биосинтез фосфолипидов, В литературе данные о таком действии гормональных доз экдастерона отсутствуют. Что касается фармаколо-. гических доз, то доказано, что при их хроническом введении, наблюдается усиление биосинтеза de novo фосфолипидов в сердечной , и скелетной мышцах крыс /Есеябаева,1991/.•

Как видно из рис. 5, после введения экдастерона резко сни-' кается скорость включения метки глицина в пулы как.ура-

цил- (кр. 5), так и цитозиннуклаотндов (кр. 6). Эти данные указывают на то, что после введения экдистерона снижается биосин-., тез ит? по пути, de aovo „ отсюда же п низкая радиоактивность ■ пула цитозиннуклеотидов. Увеличение пула цатозшнунлеотидоэ (кр. 2), з таком случае, глохет быть сбеспачанй только за счет интенсификации превращения в CIP ранее образованного ЮТ,, величина пула которого (кр. I) в условиях Д-гипозптамлноза значительно выиа уровня корш.

В з'словиях Д-гипозатаминоза (0 время) внутрзглзго'зые пулы адениянуклеотидов ниже урозня нормы я резко увеличиваются в интервале 30-S0 ыик после введения, экдастерока (рцо* 5. кр. 3)„ В отличие от адекиннуклеотидов, пул гуакшшуклзотвдоа в энтаро-цитах в зслозиях Д-гшовктамядоза вкше уровня ЕОр:ды,Е в ответ на введение.экдпатерона величина его рззко уменьшается з первые 60 минут после взедения. Раиве ш. показывала (рис, 2). снпкенка уровней гуаниннуклеотидов у цыплят, получавших фармакологические' дозы препаратов экдастерона совместно с витамином Дд в процесса лечения рахита. Учитывая это обстоятельство, увеличение пула ци-тоЕПНкуклеотидоу однозначно iJокно отнести только, за счет de nevo биосинтеза СТР из ранее образованного ТО? (учитывая сникание пулов гуаниннуклеотвдов, отпадает вариант реутилизации, т.е. увеличение пула цитозиннуклеотидов за счет деградации суммарной РНК GC-тша).

т i

Данные по' включению-метка I- -С глицина в пулы пурпновцх нуклеотидов указывают ж .то, что'посла введения экдистерона резко увеличивается . do novo .'синтез аденакпуклеотидов (кр, 7) из .нециклических предшественников и, наоборот, резко .снижается

do.novo синтез гуаниннуклеотидов (кр. 8). Последнее возможно только з суча а блокирования пуринового шунта (AMP — IMP G££P ) на уровне превращался IMP.в ХЙР (iiúP-дегйдрогеназа), или X!.? в ghp (Gil? -синтетаза).

«

к f-

l .

ишштКпшк/

WtHlk

t-i-!-^

Рис. 4. Динамика изменения скорости всасиваняя ^^CaCIg из - просвета топкого кишечника цыплят с Д-гиловигаминозом,

• (0 время), после одноразового введения экдистерона . (норма = 10055). '

... Тесная корреляция гуакиннуклеогиды -. ДНЯ, обнаруженная нами, у животных в процессе лечения рахита» предполагает в раннем ответе на введение экдистерона снижение, уровней ДНК, что ш и на-ботдали (рио. 6, кр.2). Значительное уканыпение радиоактивности сутаярной ДНК (рис.' 6, кр.б) предполагает-возмсяное торхнясаим ее биосинтеза. (репликации). при введении экдистерона Д-гипозита-ыинозным животным. ,

■В отличие- от ДНК, при введении экдистерона имеет место быстрая нормализация внутриклеточного пула суммарной РНК (рис. 6, крЛ), которая мокат быть обусловлена возможной активацией ее биосинтеза, о чем свидетельствует интенсивное включение метки глицина, (рис. 6, кр.5). Таким образин, уже в интервала 0-60 мин после введения экдистерона нквотеым с Д-ишовитаминозо>л мы наблюдали быстрые изменения на уровне генома онтероцитов тонкого кишечника, что предполагает возмо-шуда антйзацию трансляции. На это за указывает динамлка изменения скорости биосинтеза балка (рис.6, кр. 7).

В условиях Д-г^ярвитаминоза в, энтероцптах накапливается большое количество ыочево? кислоты (рлс. 6, кр.4), которое достоверно снижается ухе чарез 30 шн после введения экдистерона, причем к 60 кин наступает его полная нормализация. Столь быстро? и значительное скляениа величины внутриклеточного пула мочевой ■ кислоты мохет быть обусловлено, гормоне кием ее биосинтеза dt navo ' (рис. 6, кр. 8).

о se

ftpCH«, «

Peo, 5. Динамика изменения внутриклеточная пулов и скорости биосинтеза по пути ^jo ¡щщповнхе пиршгздяновых нуклеотидов в энтероцитах цыплят с Д-гиповлтаминозом после введения зкдпстерока.

к

zzzzzz

J'

y,

" i

Ï,

'не. 6. Динамика изменения внутриклеточных пулов s сйоростз; . биосинтеза нуклеиновых кислот, общего- .бажш и мочевой кислоты е. затероцатах. .тонкого ккиачвлха петлят.с Д-ги-niBKtnMHK03îM посла одноразового введения окдпотерояэ,

Это может приводить к нормализации уровня мочевой кислоты в сыворотке крови. Если участь, что у птиц биосинтез мочевой кислоты является самостоятельным и 'чрезвычайно' важным метаболическим путем, регулирующим весь азотный (белковый, нуклеотидный) метаболизм, становится ясной, физиологическая роль экдистерона у теплокровных как одного из гормонов, регулирующих азотный мета-, болизи.

Наличие столь существенных ранних изменений в сторону их нормализации в обмене нуклеиновых кислот и их предшественников, а такко белков и мочевой кислоты в первые 0-60 мин.после введения экдистерона ейвотшм с экспериментальным Д-пгповатаминозои ■ свидетельствует, что мззду витамином Дд и экдастероном имеет место функциональное сходство,и экдестерон частично дублирует действие витамина Дд в организме птиц.

Как указывалось визе, шленно индуцирование процессов, зависящих от активации гена, т.е. синтеза РНК и специфических белков, характеризует классический путь воздействия на клетку-мишень стероидного гормона (эхспрассия гена). Как видно из представленных нгзе данных, экдястврон в организма теплокровных действует по типу классического стероидного гормона, сходному с действием анти-рахлтичесяого витамина Дд.

Изучение механизмов гормонального действия экдистерона в организме птиц с нормальной обеспеченностью витамином Д.В настоящем разделе мы приводил доказательства высокой биологической активности экдистерона 8 отновонш модуляции биосинтеза нуклеиновых кислот.и их предшественников в организма нормальных животных (ткани печени, слизистой тонкого кишочника, селезенки и поджелудочной железы). Активность экдистерона проявляется как в ранней фазе действия (0-2 ч), аналогично таковой у .тавотных с недостаточностью вита:яна Д, так и в поздней фазе (24-72 ч), т.е. тлеет четкий двухфазный характер, что соответствует современным воззрениям на механизмы действия классических стероидных гормонов. '.

На ряс. 7 представлена, динамика изменения суммарных пулов • (мкмоль на I г ткани) пуриновых я пиришдиновых нуклеотидов кис-лоторастворт/ой фракции и оксипуринов н? примере энтероцитов цыплят после одноразового введения гормональной дозы (10~® М)

& ■t

л*

«2 НИ * яи }i *tu 41 I

ii—ft •

A. £

» u tj * e im it ' i i м it Ерсмя в осле >кеде>ш£ »хднстсрокя, ч

Рис. 7. Динамика изменения внутриклеточных пулов пурановых и пи-ришдановш: нухлвотвдов к оксипуринов в энтероцитах ' цыплят посла введения экдистерона.

у

г 4 3

а %

& г

г

О !

ДНК

1 7

f

\ 7 .

6 = о й м Й

5 t 4

в дпк

/ £-

г J! ;г

с- j jj Врохя исслс взедгнкя вхдистсроод. ч

Рис. 8. Динамика изменения внутриклеточных пулов нуклеиновых

кислот (А-5) и скорости биосинтеза ДНК (3) в энтероцитах после Бвадвння: зютоясрона.

экдистерона. Обращает на себя внимание то обстоятельство, что нуклеотидные пулы имеет широкую амплитуду изменений как в ранней, так и в поздней фазах гормонального действия экдистерона, причем максимальные отклонения от базовых уровней наблвдади для пулов дуриновых Еуклеотидоз и оксппуринов.

, Общая тенденция к скияению суммарных пулов как РНК, так.и. ДНК проявилась в ранней фаза действия экдистерона (рио. 8), тогда как зФркт гормона в поздней фазе противоположный - содержа- ... ние нуклеиновых кпелот, особенно РНК, увеличивается.

Ранее подобное действие экдистерона наблюдали у насекомых, причем отмечалось, что зддистерон (10Г®"Ы) предотвращает деление клеток за счет снижения активностей тимэдпнкиназы и ДНК-полиме-разы л . Не исключено, что и у цыплят лнгибирование роста (пролиферация) энтероцптов эвдистероном в поздней фазе его гормонального действия обеспечивается за счет аналогичных механизмов.

В .я в о д и

; X. Сравнительная оценка содержания ээдистзрош в различных органах дикорастущих и введенных з полевуа культуру растений Зегг^и1а 1аопа1з' й!1±ь. в разные периода вегетации показала, что максимальное количество экдист .рона характерно для цветочных корзинок дикорастущих особей я достигает 1,6-1,8$ к весу воздушно сухого сырья. Культивируемый вид несколько уступаей этом отношении.дикорастуадал растениям (1,3-1,4$ экдистерона), однако высокая биологическая продуктивность позволяет рекомендовать его в качестве эффективного сырьевого источника.экдистероидов.

2. Из цветочных корзинок поделено к с помощью физико-химических методов идентифицировано 6 зкдистероидов: ма-яорный компонент эклясте'рон, .полиподин В (5-оксиэкдистерон), интегристербн А (1-окспзкдастарои), витикостерон В (25 ацетат экдистерона), часто встрачахшеся в.растениях, а также реже обнаруживаемые 2-дезоксиэкдистерон и 26-оксиэкдистерон. Соотношение указанных зкдистероидов. в цветочных корзинках составило со-^ ответственно 100:1:1:0,025:0,05:0,36.

3. Испытана биологическая активность различных препаратов ка:основе зкдистероидов з.хаегпйэ в условиях различной обеспе-

-

ченности цыплят ватажном Дд. Установлено, что как эвднстврон, так и препараты на его основе, применяемые - в курсе лечения экспериментального рахита у цыплят совместно с витамином Дд, способствуют ускорению интенсивности роста цыплят и нормализации биохимических показателей сыворотки крови (Са, Н, общае содержание белков, лшщдов, холестерина, мочевой кислоты, краа-тинина и др.). Наиболее эффективными были препараты БТИ-4 и БТИ-8Л в форме липосоы.

4. Показано положительное воздействие препаратов на биосинтез нуклеотидов. и нуклеиновых кислот слизистой 'тонкого кишечника цыплят с Д-гиповитаминозом. Наличие достоверной пололи- ' тельной связи мезду изменениями содержания гуаниннуклеотидов и ДНК указывает на то, что одним из механизмов усиления препаратами лечебного действия витамина Дд является тормояание шшй биосинтеза гуаниннуклаотдцоз, ■ . .«

5. Отмечена эффективность исследуемых препаратов, в частности БТИ-4 и БТИ-81 в форма лнпосом, при адаптации цыплят к недостаточности витамина Дд в диате: 'ускорение ■ интенсивности -роста, увеличпванио выживаемости к улучшение бкохишческшс показателей сыворотки крови по сравнению с состоянием.Д-гааовитйма-коза« •

" 6. Показано, что после одноразового введения гормональной дозы экдастерона (10"® М) цыплятам с экспериментальным Д-гляо-вита^нозом иыэют место быстрые (в' гачонза 0-120 мин) активация процесса-всасывания кальция в кипела::? к нормализация сг.оросга биосинтеза общего бояка »вухяашовых кислот ц ех арвдрасхввнпакоа -яурановкх и виргплЕдиновнх нуклаотздов.. а такхс вежган их сухарных пудов: увеличение содержания гщтоз^ннуклеотидоз, аденаннук-леоткдов и снижоеи? уровней гуашшвуклзотгдов и ДНК.

7. Установлено, что посла одноразового Езадеяпя гормональной дозц екдкбтарона (10™® М) цыплятам о .аортальной обеспеченностью вита^нсм Дд наблэд-ййтая язаепзшй баахкмачаегкх показателей сыворотки крови, а гаже иодуггщгя биосинтеза нуклеиновых кисяот н тканях печзкя,ея^зисгса совкого кишечника, саяеззнви п . водка почвой 'аахаз», которая .иаое« дзухфа&ь^ характер. Отмочз-ш геаденцр» к овзкеш® сухарного-содарегная РНК и да в энтаро-;®тах цыплят в равней §азв явйоязвз акдасгеропа (I ч.) :: их уаз-

- -

.лачвнае, особенно РНК, в поздней фазе (72 ч.). Скорость биосинтеза ДНК в поздней фазе сажается, свидзтельствуя об икгибировапип Пролиферации эптероцптоэ под влиянием зкднотерона. Двухфазный .. характер действия экдистерона предполагает первоначальную активацию ям одной из сигнальных (иессенжерных) систем клеток, предпочтительно Са-чувствительнуо фосфолипидзависимул систему.

8.. Положительная корреляционная свчзь между экдистерон-ин-дуцяруеиыш изменоккямя величины внутриклеточных пу."?в гуанин- ! нуалеотадов п мочевой кислоты у-цшлят с различной обеспечен-ностьа ццтагоком Дд, о одной, стороны, и суммарной ДНК, с другой, предполагает возможное участие указанных соединений в механизме регулягоз зкдпотероноы биосинтеза ДНК.

' ' ' У';'/:'; \ .■'.;'-.■. П У Б Л И К А ЦК И

1. Ахкед I., Воз1ял H.A., Кляшторна Т.Е. та 1н. Serratuia tincto. . "-ría I. A SörratuLa. wolf£11 Andxao - перспектзвн! даерела

, 6torort4HO актнвнзх-ф!тоекдастероУд1В // Укр.ботан,журн. -: 1990. - 47, й 4. - С. 81-64.

2. Sholotí,^7aIu.D., Voziyáa P.A., UiladeraCh., Ahaed I. The comparativo éstlaatioa p£ colour reaction' sensitivity for the phytoecdyatsrolda analysis bastoa -the absorption and fluorescence data'// Forth-syapoaiiBü oa the analysis of steroids. April 24626-, 1990. 6:^ Pecs. Eungary. - ;1990. - j?. 136.

3. Холодова Ю.Д., Кжэшторная T.B., Данильченко И.Б., Ахмед И.

и др. Экологически безопасные регуляторы продуктивности на- . секомых на"основе фитоэкдастероидов из растений рода Serra-tuia // Химизация и агроэкология. - К.:, 1991. - С. 9-17.4. Коцюруба A.B., Ахмед I., Холодова В.Д., Тараканов С.С.

Вплив екдистерону. на o6míh р'ечовин в .тканинах курчат за углов Д-гшов1тамшозу // У1 Укр.б1ох1м.з"1"зд. - К.,1992. - C.I95.

5. Коцоруба A.B., Ахмед И.,- Тараканов С.С., Холодова Ю,Д. Влияние экдястерона на обмен пурине ж и пиримидиповых нук-леотидов в тканях цыплят // Укр.биохим.журн. -.1992, - 64, й 5. - С. 52-60,

6. Коцюруба A.B., Ахмед И., Тараканов С.С., Холодова Ю.Д. Изучение механизмов действия экдистероьа. Ранняя фаза действия.

// Укр.биохим.журн. - 1993. - 65, й 5. У/>' К rXvy у s ЗоС- SCO