Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Серпуха венценосная (Serratula coronata L.) как перспективный источник фитоэкдистероидов

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Серпуха венценосная (Serratula coronata L.) как перспективный источник фитоэкдистероидов"

РГ6 од

*-1лП

АКАДКШ НАУК УКРАИНЫ ИНСТИТУТ БИОХКЛЖ ил. А.В.ШШШС'ЛА

На правах рухохшся МУ№ЕД ЛАБИБ АБД ЭЛЬ-ГАБШЬ СЛАД

СЕРПУХА НШШНОСНАЯ: /вЕЯ*лти1.А сококлтл и. / КАК ШРСГЕХт-Ш ИСТОЧНИК ФЭТОЭГСДИСТЕРОЗДОЗ

'03.00.04 - биохимия

Автореферат

диссертации но соискагхио ученой стопзак кзнд:щата биологических на т.:

Люз - 1393

Работа выполнена на кафедре органической и бионеорганической химии украинского государственного аграрного университета и в отделе биохимии стеринов Института биохимии ив. A.B.Палладина АН Украины

Научные руководители: доктор биологических наук, npofe ссор ХСШОРОВЛ Ю.Д.

кандидат сельскохозяйственных наук, профессор БЕЛОНОУКО М.А.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

профессор СУ?ЬША Е.Г.

доктор биологических наук ITAJiJIAJИНА Т.А.

Ведущая организация - Киевский университет

им. Тараса Шевченко

Защита диссертации состоится - о'ц 1993 г..

в часов на заседании специализированного совета

Г 016.07.01 по защите диссертаций в Институте биохимии им. А.В.Паллавина АН'Украины /252601, г.Киев, ул.Леоитовича, 9/

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биохимии АН Украины.

Автореферат разослан 1993 г.

Ученый секретарь специализированного совета

УА* ХОЛУ^У-Ж-гГСС?

ОЕШАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Акт^2.льно_оть_темы. Расширение мзсетэОтсв поисков и исследований природных биологически активных соединении дало тодчэк к изучению класса '?.нтаэкднсте роняоз, ранее известных только у нас-комнх и ракообразных под общим названием экдизоиы Лолодова, 1979,1987; Ахрем.Ковганко, 1989/, Эти полнгидрохснлированные стерины обладают характерней!: физиологическими свойствами: проявляют активность гормонов линьки и we та мор 503 а у насекомых, а также половых феромонов у ракообразных.

Обнаружение горюнов насекомых в болыгом количестве в растениях • было достаточно неожиданным, и представляло практический интерес, открывая доступный источник необходимых количеств чистых гормонов для исследований их биологической активности. пункции экдистероидов в растительном организме изучены недостаточно. Не исключено, что фитоэкдистероиды участвуют в процессе роста и развития растений /горовин и соавт. ,197't; La font, Hon., 1989/.

Зкдисгероиды проявляют различные виды биологической активности. На теплокровных они обладают анаболическим, гипогликеми-ческим, гепатопротекторным, адаптогеннкм, тонизирующим действием /Сыров и соавт., 1978/. Кроме того, они препятствуют развитии атеросклероза, положительно рлиягл* при лечении миокардита и переломов костей /Сыров и соавт., 1986/. Некоторые из перечисленных свойств нас;ли применение в нракт®е. Цз основе окдиете рона, выделенного кз :ih.*r>onticu« esrthaoeiciee , разработан и производится в промышленных масштабах тонизирующий препарат "Экдистен", применяемый при различных заболеваниях, связанных с ослаблением белоксинтезирующих процессов /Сыров, Кур-муков,197б/. На основе зкдисгероидоз растении рода serratula разработан биостимулятор, увеличивающий силу и продуктивность пчелиной сеиьи и других насекомых /Холодова и соавт., l990/.

Несомненно, актуальной задачей современной бкооргз ни ческой химия, биохимии и биотехнологии является поиск доступного растительного сырья, cojiepirasero экдистерогаш, их химическая идентификация, разработка-методов их аналитического контроля, а также исследование бпологкческой активности к механизмов действия в различных организмах. Изучение состава эклистсрои-

- г -

дов к особенностей их накопления в органах растений будет способствовать разработке новых лекарственных препаратов к выяснению роли и механизмов действия экдиетероидов как фармакологически активных средств.

Содержание фктоэкдистероидов в растительном материале весьма велико у видов рода sen лиЬ и- /горовии а соавт., I97V, Холодова, 1987/ и достигает иногда Г-2 Наиболее распространенным в растениях представителем экдистероидоз является окдистерон или в-экдизон. он представляет собой Cgy-cTe-рокд гормонального действия, безопасный для окружающей среды и привод яций либо к летальному расстройству метаморфоза насекомых /дхрем.Ковганко, 1989; <ooiman ,1990/, либо'к интенсификации их разведения /Холодова,1ЭТ9: Холодова и соавт.,1990/. £ля получения экдистероидог с целью создания на их основе эффективных препаратов, используемых в биологических исследованиях и для практических целей, необходимы, сырьевая база /Ахмед и соавт.,1990/, разработка способов выращивания продуцентов экди-'стероидов и технологии производства культур тканей и клеток растений для обеспечения условий эффективного накопления экди-стерона в них. Использование арсенала методов культуры клеток S тканей растений послужили толчком для создания технологии, направлз иной на получение фитоикдистероидов серпухи венценосной В Культуре in vitro .

цель и задачи исследования, целью настоящей работы явилось исследование возможности создания сырьевой базы для получения зкдистероидов серпухи венценосной / Scn^tuia coronata t../, изучение их химической природы и биологической активности.

Исходя из цели исследования, поставлены следующие задачи:

1. ввести в полевую культуру типичное луговое растение -серпуху венценосную и изучить возможности ее выращивания в правобережной лесостепи Украины в качестве технического сырья для получения зкдистероидов.

2. Определить оптимальные нормы и сочетания органических к минеральных удобрений, густоту стояния серпухи венценосной, обеспечивающих на типичных малогумусных черноземах максимальное содержание'зкдистероидов в растениях.

3. Изучить закономерности накопления экдистерона /главно-

го компонента экдистерондов серпухи венценосной/ в надземной части растений з зависимости от Фаза'развития, органа, возраста растений, а такте режима питания.

Выгелить экдисгерокды из растения з индивидуальном виде и установить их структуру.

5. Исследовать возможности спектрофотонетрической оценки зкдистерондов различной структуры.

6. Оиенкть антисксидентну» активность основных зкдистерои-дов данного растения и некоторых их метаболитов.

7. Ввести растение серпуху венценосную в культуру в опытах in vitro и изучить:

- возможности получения суспензионной культуры для непрерывного культивирования с целью извлечения вторичных метаболитов;

- сравнительное содержание белков клеточной культуры и полевых растений;

- возможность проведения трансформации клеток плазмидой Agrobnctoriun.rhizooencs (Ri)' для усиления выхода вторичных

метаболитов з культуре тканей.

Нау-шя новизна. Впервые в зоне неустойчивого увлажнения правобережной лесостепи Украины типичное луговое растение - сер-, пуха венценосная выращивалась как полевзя техническая культура для получения зкдистероидов. В условиях типичных малогуму сных черноземов установлены оптимальные уровни минерального питания к густота растений серпухи венценосной, обеспе- гаакщж ей максимальную урожайность и высокий выход экдистеропдов с единицы по- ' севной пложази. .Установлены особенности накопления экдистерона в серпухе венценосной в зависимости от фазы развития, типа органов, возраста растений и режима их. питания в условиях Киевской области.

Из наземной части серпухи венценосной изолировано и достоверно идентифицировано 7 экдистерокдол, среди них 5 ранее не били обнаружены в этом растении, с целью выбора оптимального метода аналитического контроля экд«стероидов впервые проведено сравнительное изучение чувствительности семи цветных реакций на стероиды по отношению к экдистероидам различной структур». Установлены антирадикальные и антиокислительные свойства зкдистероидов различной структуры.

разработана технология получения суспензионной клеточной культуры и каллусз серпухи венценосной, а также определены факторы, влиявшие на синтез экдистероидов в культуре i" vitro Впервые проведено сравнительное изучение новосинтезированных белков в тканях полевых растений и в кулыуре тканей, как паркеров выхода зтори-нух метаболитов. Определены оптимальные режимы трансформации клеток и тканей агробактериями, способными усиливать зыход вторичных метаболитов.

Теоретическое значение и практическая иенность работн. Охарактеризован состав экдистероидов есе одного перспективного источника биологически активных стероидов. Выявление антирадикальных и антиокпслительнкх свойств экдистероидов способствует более глубокоi.íy понимании возшаных механизмов действия этих ценных биологически активных соединений.

Разработанные способы выраиивания ссрпухи венценосной в условиях in vivo и in vitro' могут быть рекомендовани для практического применения с целью получения экдистероидов и последующего изготовления лекарственных препаратов на их основе. Предложенные методы аналитического контроля могут быть использованы для идентификации экдистероидов и стандартизации препаратов на их основе.

Апгобапия работа. Результаты исследований докладывались и обсуждались на I Международном конгрессе "Биоконверсия органических отходов для получения биогумуса, биогаза, белковых ве-сеств и охрана окружасией среды" /Киев, 1991/, Конференции профессорско-преподавательского состава Украинского государственного аграрного университета /Киев, 1991/, У1 Украинском биохимическом съезде /Киев, 1992/ и научных ce i1 тарах отдела биохимии стеринов Института биохимии АН '/крайня /Киев, 1992/.

Публикации, по материалам диссертации опубликовано ? печатных рабо".

Объем и структура работа, риссертаиия состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов и обсуждения, изложенных в 5 разделах, выводов и списка использованной, литературы. Обаий объем диссертации включает 159 страниц машинописного текста, 16 таблиц и 18 рисунков. Список литературы содержит ?Г7 нзиненовпнкй, в то," од еле 114 иностранных авторов.

Научные консультации проводили д.б.п., яроф. >. о л олова р. Д.,

д.ех.н., про}1. Еелоножхо М.А. , д.¿.а., Гэлипн А. Я. н к.б.н. Коваленко П.Г.

Автор выражает искреннюю благодарность своей супруге за сказанную помопь и поддер»а<у в работе.

МАТЕРИАЛУ " МУТОТУ КССЛЬ5г03АЙГт

_сеп ^ 115. 5._про то -

7-или б Г9Р9--1Р92 гг. на Агроном-йс::оЙ опытной станции украинского государственного аграрного уаквзгсктета на черноземе ти-и кчк ом мало гуну сном гру дотлеваю-^ огко оугл нни сто го .меха и иче с-кого состава, подстилаемого карбои&томи лессом. Орг.шические /навоз/ и минеральные - амхиачпзя селитра /м - 3'+ '■-/, суперфосфат А'2°5 ~ 19,5 калийная соль /тс^О - АО удобрения вносили в соответствии со следующей схемой опытов: I - контроль /без удобрений/, 2~П - навоз* ч0; Х50; 5-7 - навоз*

+ "90?90: М90К90: Р90К90; 8 ~ "авоз+ 11 9С?9(УС90 соответственно..

Посадку растений провели осенью - в сентябре месяое - из расчета 35 тыс. растений /кустов/ на I га - по 2,5 куста па I линейный метр с гириной мэклуряднй - 70 см.

3 полевых и лабораторных и с еле? о раниях использовали методики, общепринятые в изучаю лабораториях НШ АН Украины.

Изучая влияния условий вырап:..рация на рост и развитие серпухи венценосной, проводили *енологические наблюдения с фиксацией дат наступления у растений основе!-« фая развития /Вавилов, 19РЗ/; определение по Фазам развития высоты растений, площади листовой поверхности, сырой и сухой мае си отдельных органов растений, влажности почвы в слоях 0-20 и 20-40 см, нитратного азота - колершетркчеосп о помощь» дисульфофеноловой кислоты, подвитой фосфорной кислоты, обменного калия - методом пламенной фотометрии в вытяисе /Петербургский,1968/.

В диссертации представлена морфолого-биологпческая характеристика серпухи веннеяоеней.

Выделение и идентификацию экдкетероидов проводили с помощью разнообразных экстрактивных процедур /Холодова, 1987/, применяя затем колокочп-ую И тонкослойную хроматографию / с;а1ЬгаИгИ, ногп, 1969/. При этом использовали окись алюминия, силикагель КСК и силжагель " 100/160 мкм /ЧСТР/. Применяли следующие системы растворителей: хлороформ-метанол 25:1; 15:1; 9:1; 4:1; 2:1; хло-

- б -

ро^орм-метанол-вода 4:1:0,1- Тонкослойную хроматографию /ТСХ/ пр о ю л к л и на пластинках silufol uv-25'i. Зкдистероиаы на ТСХ обнаруживали путем опрыскивания ванилин-серной кислотой с последующим нагреванием в течение 2-5 мин при 110-120 °С /galbraith, мот ,1959/.

Идентификацию выделенных кил ив иду альних компонентов осуществляли с помощь«1 Физико-химических методов исследования: масс-спектр и элементные составы ионов получены на приборе MX-I3I0 при ионизирующем напряжении 50 В и температуре 100-140 °С; VK-спектры получали на спектрофотометре и:<-20 в КВГ ; У^-спектры -на приборе s poco г d uv . Спектры ПУР соединений получали на приборе oj -557 А. /ЮО мГи,- " тооХи "/; спектры ЯМР /1Н и YbJ -на приборах ,;М-250 и ;/К-300 /вги';ог/, растворитель c5D5N. С-•"Л'С.

Оптическое вращение определяли на поляриметре "Цейсс". Кривые кругового дихроизма записывали на спектрополяримзтре 3-.2СО j-2c. Температуры плавления определяли на приборе БОЭЦИУС.

Цветные реакции на истерочды гззличной структуры иссле,-дсвали с целью выбора наиболее чувствительной и специфичной реакции г.гя аналитических определений. Проводили реакции чугаева /Холотюва к соавт., 1976/, J!ибермана-Еурхарза Л-.огс.йаииапп, 1952Л сЧк /anderson et,al ,1554/, Илька /Розенцвейг, 1952/, Портера-?ильбертз / porter,silbcr . ,1550/, Кобера / 'иоЬог , 193Г и Г пн е / cl-rk .1955/.

Анткгзд икздьнь'С .свой сгр?._рк? псте рондо в оценивали по их способности у стгзнять ■ супероксипнгп з к ион-радикал кислорода Qp. генер ируемый Фотохимической системой /чумакова, Осинская» 1977/, суг.е рок сипу страп ягау к» активность экдистероидов опрег.еля--ли по их способности ингибпровать восстановление пара-нитротет-разолия хлористого. с.у."марг:уэт энтпоккслпгс льнур активность зкдистероидов определяли по образованию калонового лиальдегила в модельной системе, используя липосомн яичного foсфаткаклхолинз ' aovillan et, al ,1СРР/. •

Каллус- и к лет 0"}?у у, суспек?г.онйу"*>_ку.тътуру ' сегпууи

венценосной из семян к -ДОлЬгмс листьев • получали, помета я стерильный материал на -а^&р.Изованную /0,7 среду Мура сиге-Ску га /МО/' /"kúrashír.j¿ , sk'oog ,1952/, солер»ашу.р 3 * сахарозы и 0,05 мг/л бензиламинопурина. Каллус индуцировали

на модифицированной питательней среде /сзп-.ьогд ,1988/ и МС. содержащих 5^-ную сахарозу, а так® ^ктогориоаы: гибберелло-вую кислоту - 0,5-1,0 мг/л; индолилуксускую кислоту - 0,020,2 мг/л; 2,4-дихлорфеноксиуксуснуо кислоту - 0.0'|-0,'1 мг/л и бензиламинопурин - 0,02-0,5 мг/л. Питательные среды Сил:: токае обогащены поливинилпкрролидоном. Каллус образовывался в темноте при 25 °С в течение 7 недель в чайках Петри, с * ор»«7 о:» т*г ся каллус /овале 0,3 г/ переносили ка свежую пигатолкгу» среду. После че твертого пасса ка была получена клеточная суспензионная культура. Количественное определение окдистсрокдов в листьях и каллусной суспензионной культуре проводили с помощью хромато-графического разеделения метанольного с-кстракта в гонком слое силикагеля Ls 5Л0 М, содержащем 13 гипса /Холодова, 1977/.

Анализ белков клеточной культуры и листьев полевых растений осуществляли методом электрофореза в ПЛАГе^аомп].! ,1970 ;

Бт 11: И ,1984/.

Для агробактер калькой трансформации клеток использовали дикий вирулентный ста мм иВА 9-'Ю2 из лаборатории биотехнологии Норвич, Великобритания ! iiaai.il (п.,1987/. Культугу штзша 1.ВА 9402 наращивали в гидкой среде У?,'В в течение 48 ч при 28 °С. Совместное культивирование каллуса /0,5 г/с агробактериямн/Ю®, клеток в I мл/, проводили в зддкеп среде мс в течение '48 ч при 28 °С /когдап ,1989/.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ИССДВД 0?Ж\Я И !-1Х 0БСУ)7ЕН!''Е

Культивирование серпухи в сниеноснок в п о левых условиях. Мы предприняли попытку изучить возможность и целесообразность выращивания серпухи венценосной в условиях полевой культуры, изыскать пути повнвения ее продуктивности на типичных малогу-мусных черноземах. В качестве одного из весьма элективных рычагов повышения почвенного плодородия и получения максимума качественной продукции мы избрали органические и минер ал ыие удобрения.

Анализируя данные по. соадркани» к динамике подвишнх- элементов в почве на удобренных и неудобренных вариантах по '{азам развития серпухи венценосной, отметим весьма важную, на наш взгляд, тенденцию: на удобрешии фенах по сравнению с контролем в первой половике вегетации содержание основных элементов пита-

нии стремительно уменьшается особенно по азоту и калию, достигая минимума в Фале цветения растений. Такой »е характер изменении наблюдается при поглощении фосфора, разница лишь в сравнительном уровне его потребления. Обнаруженные особенности усвоения питательных весеств серпухой венценосной свидетельствуют о том, что на удобренных взр кантах развиваются более шж-ные растения и пх потребности в почвенном питании, естественно, увеличиваются, достигая ь'акск?.-уг.'3 к гзссоюцу и не тени», когда в растениях наиболее активно протекают обменные процессы с включением элементов питания.

В контроле растения к -фазе кассового цветения наиболее интенсивно поглсвзгт калий, затем - азот и, наконец, - фосфор, кривая поглощения которого более плавная. Слелует добавить липъ, «то растения на неуд обр он у ом ?оне, слабее развиваясь, потребляют аяеренту питания в геи« их количествах.

3 более поздние фазы развития растений, когда они теряют часть листьев и процессы метабол из га ослабевают, содержание доступных питательных векеств в почве начинает постепенно увеличиваться, что особенно заметно по фосГору и калиг. Содержание в почве азота и в этот период продолжает снижаться, расходуясь растениями на постепенно зятухзтаке ростовые процессы.

Органические и минеральные удобрения - весьма i/оинкй и бястрoreйстьуV-кй фактор возлей стш» на рост и развитие растений, формирование отдельных органов и их. химический состав, рля нас весью важно было изучить реакцию серпухи венценосной на регулируемый уровень питания в условиях полевой культуры и установить влияние его на урожайность гастений и содержание в них экдистегона. Показатели, представленнце в таблице I, свидетельствуют о значительном влиянии используемых удобрений в опыте на рост растений в высоту и -*огмиро панне л исто го го аппарата - главного to тосинтетиче ского - органа растений. Разиина в фогмигобзнки стеблей и листьев растений на удогт.ер.них вариантах и контроле достаточно хотоЕС проявляется у?е к начале -мзк бутонизации, особенно при внесении азотных угобрениЛ: на контроле высота растений достигает 4 С см, а плотзгь листьев 2,2 Vе на i у- плота -•изнтах с азотом - соответственно 60-75 см, и 2,5-

Лзотнге удобрения, гоеезннге на ^оне im-osa, сгособстяугт

Таблица I

Влияние удобрений на рост вегетативных органов серпухи венценосной /среднее за 1990-1992 гг./

_____■*>эзн_т50ста

R :Начало"Т5утони-ЛНссовая Суто-'

í; „ ~ :___за ни и___:__низания___

£ f'j ~ : в ы с о т а : п л о щ а д ь : в н с о т а : п л о а ! а л ь

„ : расте - : л истье д: расте - : л ист т-с в,

'Лп i"2/"2 Ь^2

['ветение Начало оьмира-u :ния листьеп

высота : площадь: высота : шшааг ь р а с те -: л ист ье в,: р асте л ист ье в, ПИЙ. :м2/м2 :нкй, : г/м2

см :м ' : см • '

1 40 2,2 95 2,7 105 3,6 105 2,7

2 60 3,5- 115 '1,1 140 4,6 III 3,8

3 50 2, В 100 3,1 I3Ó 3,9 136 3,3

4 50 2,7 [05 3,2 137 4,0 138 3,4

5 65 2,5 115 3,9 140 4,2 141 3,6

6 67 2,9 120 3,9 145 4,3 147 3,7

7 54 2,4 105 3,3 138 З.Р 138 3,1

Р 75 3,6 135 4,7 155 5,0 157 3.8

энергичному росту серпухи венценосной к концу массовой бутонизации растений, обеспечивая прирост листовой поверхности по сравнению с контролем на 1,2-2 м^/м^, стеблей в высоту - на 2040 см. Листья становятся мощным аппаратом, обеспечивающим растения необходимыми для жизни метаболитами. Максимальной высоты и размеров листовой поверхности серпуха венценосная достигает к фазе массового цветения, когда растения энергично вступают в ■Формирование генерзтивных органов. Однако в эту фазу более интенсивный рост рас'гений наблюдается не только на вариантах с внесением азотных удобрений, а и при использовании на фоне навоза фосфорных и калийных удобрений.

Из таблицы следует, что сырая масса технически пригодных для переработки органов серпухи венценосной - прежде всего листьев, как и всего растения, значительно колеблется в зависимости от особенностей питания и фазы развития растений. Разнила массы одного усредненного растения на контрольном варианте и наиболее перспективном варианте, где были внесены минеральные удобрения в дозе ^ 9<f qqKoo на ^оне 30 Т'/гз навоза- составляет в начале Фазы бутонизации'^ОО г,а в фазу массовой бутонизации -420 г, цветения - 't85 г, по листьям-соответственно 170, 190, 215 г, стеблям - 140, 125 и 185 г.

Из отдельных видов удобрений более сильное влияние на увеличение массы одного растения и биологическую урожайность серпухи венценосной оказали азотные удобрения, причем он-/, сохт'-ни-

ли ^ое действие по восходящей в продолжение всех контролируемых таз развития растений. Из парных сочетаний более эффективными оказались ззотно-кзлийные удобрения, которые на фоне наьоза обеспечили в у словиях опытов близкий к максимальному /вар.8/ сбор листьев, составивший по Фазам развития соответственно 203,0; 187,3 и 228,8 и/га, а также листостебельпсй части - 400,8; 421,8 и 477,8 ц/га. рругие парные сочетания минеральных удобрений /кр, РК/ на фоне навоза были менее эффективными в увеличен™ урожайности исследуемых растений.

Максимальную урожайность серпухи венценосной на типичном черноземе обеспечили органические удобрения /30 т/га нзеозэ/ с дополнительным внесением тройного сочетания минеральных удобрений / иооРсоКдс/' ЭТОм УГ0Ха"ность листьев от более ранних к более поздним фазам роста составила 210,0; 234,5 и 246,8 ц/га, листостебельно., массы соответственно 399,0; 484,8 и 519,8 и/га.

Приведенные результаты исследований подтверждают многократно отмеченную в литературе регулирующую функцию удобрений в формировании урожая сельскохозяйственных культур. Это относится и к серпухе венценосной, которая хорос:о адаптируется к условиям полевой культуры и способна при регулируемом питании обеспечить высокую урожайность ценного сырья для получения экд.истероидоз.

Анализируя содержание окдистероидов в растениях, ; мы показали его зависимость от органной принадлежности тканей , Фаз развития, возраста растения, а также приемов выращивания /табл. 2/. Максимальное содержание экдисте-рона в растениях первого года жизни отмечено в цветочных корзинках, в растениях второго и третьего года жизни - в •Т'азах отрастания листьев /прикорневая розетка/, моано предположить, что биосинтез экгистегона пгопсходит в начале роста растений в листьях, а в процессе развития растений он транспортируется в гене-ратичные органы, его содержание в листьях снижается, в трехлетних растениях содержание зкдистегона бьло наиболее высоким. Нами показано также высокое содержание окд истер она в корневой части растений. Так, у трехлетних растений в период массовой бутонизации оно составляло 1,35

При исследовании содержания экдистерона в вегетативных и генеративных органах серпухи венценосной в зависимости от реви-

Таблица 2

Содержание экдистерона в различных органах серпухи венценосной в зависимости от возраста и фазы развития, к сухой массе растения

^азн развития

: Г-й год; 2-й го:'.'3-й год

I. Образование прикорневой возетки, листья 0,16 1.49 2,06

2. Начзло бутонизации: листья 0,37 1,57 2,05

бутоны 0.Т9 1,33 •,29

3. Массовая бутонизация: листья 0,12 1,19 ■ ! , 4 6

бутоны 0.21 Т. 13 :,35

4. Цзетение: листья 0,16 0,8? 0,с!>

цветочные корзинки 0, 24 0, 54 1,08

5. Конец вегетации, листья следы 0,25 0,31

т питания были использованы растения, пересаженные из открытого участка Белоиерковского сельхозинститута, урокая Т9°2 г. Они характеризовались несколько иными исходными показателями содержания экдистерона /табл. 3/. Максимальным содержанием экдистерона по-прежнему отличались листья прикорневой розетки серпухи венценосной: на удобренных вариантах оно достигало 1,12-1, 80 к сухому веществу.

Таблица 3

Содержание экдистерона з растениях серпухи венценосной в зависимости от ренп-.п пктаняяЛ

Ва~:______

ри-:(10разование а н -: пр гас о р н е во и роз ты :листья

__^азы роста, огганы растений

ПТатз.яо ГРассовая етки, :бу'гонизаиу.:,: бутонизация, __1^тоны___LÜII£1!M.__

; Цветение, ; и ве тк и

1

2 3

•4

5

6

7

8

0,67^0,05 1,12-0,10 1,50^0, II Г,РО"-0,12 I,31^0,90 I >46-0,12 1,65-0,09 I.53±0,II

О, 31-0, 03 0,31-0,02 0,36-0,02 0,33±0.03 0,34-0,02 0,32-0,01 0,31^0,02 0,33^0,03

I, 0-4-0,0-4 1,08-0,05 0,93-0,06 С, 59-0,07

0.94^0,05

1,С4±0,05 0,35-0,09 0,99-0,05

0, CT ¿0,05

1, 20-0,09 I,Cö±0,04 1,12-0,05 1,16-0, Об I, СО-0,05 1, 08^0,Об 1,22±0,08

При выраг.-лвании серпухи зсниеносной на типичном черноземе с вне сени гк 30 т/га навоза и минеральных удобрений в дозе ''со0 о(у(до урожайность серпухи пение поеной мотет превысить 00-550 н/га, что при среднем со дергании зкд.истзрона даке около

0,2-0,3 - к сухому веществу всей массы растения обеспечит сбор . сырья с содержанием экдистерона в полевых условиях - до 100 кг/га.

ДИТОЭКДИСТерОИДЫ Serrotul¿icoron.it.3 L •

истер он - наиболее распространенный экдистероид в растительном мире. Мы получили его перекристаллизацией из этилацетата суммы экдистероидов, выделенной при элюировзнии бутанольного извлечения растения системой хлороформ-метанол 2:1 на колонке Al203. С^Н^О,, т.пл. 210-241 °С, /v/¿V;9,7 ¿ 2°/с 0,40,мета-нол/.

По физико-химическим константам, УЬ=, Ж=, масс= и Ш/Р= спектральным данным он аналогией эталонному образцу.

»<•-зк7ч:зон - первый выделенный из насекомых в кристаллическом виде экдистероид. Нередко обнаруживается в растениях. Выделен нами с использованием системы хлороформ:метанол 4:1 на коло-ке с силикзгелем. CpyH^Og, т. пл. 236-237 °С +63,6 - 2° /с 0,РЗ,метанол/. По физико-химическим константам и спектральным данным идентифицирован с -экдизоном.

Экдистерон и <х -экдизон были выявлены в серпухе венценосной ранее /Новосельская и соавт.,ISPI/.

Приведенные ниже соединения были идентифицированы в серпухе венценосной нами впервые.

полиподин в - п;ироко распространен в растительном мире, но не встречается в тканях животных, обладая тем не менее высокой гормональной активностью - 400 * по сравнению с экдистероном. Получен при использовании системы хлороформ-метанол 4:1 на колонке с силикзгелем. С?7Н^0р, т.пл. 250-252 °С /из аиетона /,/°«-/р0 + 93,2 1 2° /с 0,2В,~ метанол/.

В У^-спектре наблюдается максимум поглощения при 241 им /сопряженная с двойной связью кетогруппировка/.

В ИК-спектре имеет полосу поглощения сопряженной 5-кето-группы при I6P5 см--'-. Смешение этой полосы на 25 см~^ в сторону длинных волн по сравьению с соответствуем; максимумом в экдисте-роне свидетельствует о присутствии 5 ß-OKcurfуппы в этом экдисте-роиде. Положения максимумов и величина дихроичного поглощения Ае = -5,5253 нм; дЕ = +3,2330 нм/ кривой КГ характегнм для 5 ß -оксиэкдистероидов. характер масс - спектрометрического распада указывает на идентичность боковых испей этого соетнчеиия и экдистерона и различие стероидных ядер, выразившееся 3 наличии дополнительной оксигруппы, положение которой определено с поло-

шью П?ЛР-спектра.

Смешение б слабое поле сигнала прогонной ангулярной группы СНу-19 /1,02 м.д./ указывает па отличие в ближайпем ее окружении в сравнении с экдистероном. Совокупность экспериментальных данных позволяет идентифицировать соединение с полиподином В.

Унтегристерон А - часто встречается в растениях семейств Гвоздичные и Астровые. Выделен также в другом виде растения рода ,£огга1:и1,з-з.хзгопгЬопо1йез /Холодова и соадт., 1979/.

Полунин при использовании полярной системы хлоро*орм-мета-нол-г,ода 4:1:0,1. С^пУ^О^, т.пл. 246-248 °С /этилацетат-мета-нол/, 36,0 -2° /с 0,22,метанол/.

В У*>-спектре имеет ызксисум поглощения 245 им. в масс-спектре отсутствует пик молекулярного иона, характер масс-спект-рометрического распада исследуемого соединения свойственен экди-стероидус боковой цепью, идентичной экдистерону, и с 4 оксигруп-пами в стероидном'ядре. уюиреяныЯ синглет при 4,15 м.д. в ПМР-спектре обусловлен тремя пготонаки, геминально расположенными к вторичным ОН-группам. Совпадение значения указанного химсдви-га этого соегинения и интегристерона А указывает на то, что дополнительная гидрокскльная группа по сравнению с экдистероном расположена ггри С^-. Значения сигналов протонов метильпых групп 1,10 /СН3-1В/, 1,32/С!!3-19/. 1,24/СН3-2б/27/ и 1,45 м.д. /СН3~ 21/ совпадают со значениями соответствующих сигналов интегристерона А. Соединение на основании Физико-химических констант, спектральных данных и при непосредственном сравнении с эталонным образном идентифицировано с ингегристероном А.

20.2?-моноаиетонид эк д к стер он а встречается в некоторых растениях, как нативный метаболит. Получен с использованием системы хлороу-орм:метэнол 9:1 на колонке с силикагелем. С^Н^рС^. т.пл. 220-222 °С /из этилаиетата-гексана/, 58,9 1 2 0

/с 0,32, метанол/. В У-ч-спекгре имеет максимум поглошения -244 нм. КК-спектр соединения характерен для экдистероидов - в нем имеются полосы поглощения гидроксильных групп /34003460 см"V и кетогрунпы, сопряженной с двойной связью /1660 см-"'/. П'/Р-спектр: 0,93 м.д. /сН3-1Р,с/, 0,91 /СН3~19, с/, 1,25 /СН3-26/27,с/, 1,43 /СН3-21,с/, 3,9-4,1 /СН при С-2 и С-3,м/, 6,П /н при С-7, Д, а =- 2 Га/, 1,25; 1,34 /бП, СП3 - группы изопро-п ил ид Й н о го й гг у п п ир с г,к и.

Перечисленные лиге данные, а также наличие б масс-спектре этого ье шест за молекулярного иона и1" 520, пиков ионов с «/г 363, 345 и 301 позволяю/ претдаолокить, что данное соединение является 20,22-моноаиетонидок зкдистерона /с-Гл-^ь.ыогг. ,1559; Ззцны и соавт., 1975/.

Выделенный из растения 20,22-моио:.;не тонид охдястерона по константам и спектральным данным совпал с еазегог/нк образном, полученным гидролизом 2,3; 20, 22-Дпаиетон;;да зхдистеропа разбавленной уксусной кислотой.

?р.-ттояйтонет зкуйстегокз - кзтзввый метаболит некоторых растений. Выделен при повторной хсоматографии маточников, полученных при перскристаллизании зкдистерона, на колонке с еялкхагелек при элвиройгипк системой хлорогорм-метанол, ¿5' I. С33%2С7' т-пл- З^0-2"2 °с /'!:з а и е т ы - э фи р г. /, / ^ + 36,8 2°

/С 0,30ко та вол А

?, ул-спек?гс ^ « 242 нк свидетельствует д наличии кето-

1:1 а х

группы, сспря/кеннсй с двойной связь«, КС-спектр характерен для кгдистероидоЕ /1650 с:.Гг; 3400-3460 с и-1/. Ш?-спектр: 0,80 и. д. /СгЦ-ТВ.с/, 0,97 /СН3-19,с/. 1,23 /СКд-?б/27. с/, 1,23 /СНд-21, с/, 4,11-4,21 /2Н при С-2 и С-З, и/, 5,80 /Н пь,; 0-7 Д./. Рейтерохлоро-'-орм.

Д"нныз, а также наличие в спектре этого вещества слабого пика .молекулярного иена 560 и пиков ионов с л/а 403, 385 и 341 позволяет предположить, что дзялое соединение - 2,3; 20, 22-Дианетовйу. эк д истер о на. ГЮ константам и спектральным данным вещество совпадало с заведомым обрагвси/,. полученным обработкой Екдястероза зистоком с каталитическим количеством: фоаторномо-л?бгоново2 кислоты / с51&га«ь,ногп ,1969/.

Пттчт-стбчпи - структурный изомер гкдкетер-гна, обнаруживаемый в растениях, получен нами после, влюировэнг.я колонки после выделения 2,3; 20,22-дкаиетоии?а эклисгеропа более полярной системой улсро.адрм-метанол Т5:1. С^Н^О? х.п/.. 217-218 °С /из метансл-годы/, /<</■£+ 7,0 ± 2^ /СО.ЗО, метанол/.

т) ?'"т>-скэте > ?42 км, ЕС-спектр. /1645/. О - о, тй25 /С=С/,

П С X '

ТИПИЧЕН для экд'хтеропдов.

По к аз а те л мм-;. < б гр.р-спектре птеростерона / п'.м;Дсг .1959/ является наличие енгпгла С-26 и С-27 /дублет," ¿=7 Н / на Т,00 м.д. у отличие от ехдпетерона, где этот сигнал является

синглетом, 1,35 м.д., а такте в ма с с-спз ктре - № аг мзи та с и/г 419 /М-Н?0-Ч3/, свидетельствующего о' положении ОН-группы при С-2'1. По'полученным характеристикам вещество совпадало со стандартным пте росте роном.

Таким образом, нами впервые идентифицированы в серпухе.венценосной 5 экдистероидов - интегристерон А, полиподин в, птсро-стерон, монсаиетонид и дианетонид экдистерона и подтверждено наличие двух ранее описанных в этом обьекте /Новосельская и соавт.,1981/ экдистерона и « -экдизона /рис. I/.

Зндистероиды серпухи Венценосной (в. Согопа1а L.)

он Яз =

он он он = =

I. /?, = /?2 = Й3 = н ОС- экдизон

II. Я1 = Я2 = Н; Я3-0Н зкдистерон

III. Я, = Н\ /?2 = = он полиподин В

IV. ^=ОН; Я2 = н интегристерон А

V., птеростерон

VI. /?,=Я2=н 20,22 -моноац итонид экдистерона VII , = смег 2.3; 20,22- диац стон ид экдистерона

Рис.1.

М. Я. 0,5; 100; 0,5; 0,3; 0,15; ¡0 ; 2,5.

реакций с экдистероидамч. Нами была проведена сравнительная характеристика цветных реакций, обычно используемых для определения холестерина и других стероидов, с иелъю нахождения наиболее чувствительных методов количественного определения экдистероидов.

Наиболее характерными элементами структуры ждистероидов являются в'.шинальная 2ß ; зв - диольная группировка в кольце д, 5S -атом водорода /цис-А В-сочленение/, ¿7-6-сопряженпая кетогруппировка в кольце в, 14 -оксигруппа между кольцами с иди боковая цепь в I7ß -положении кольца д, которая всегда содержит оксигруппу при с^ 11 часто при с20 и С25. Такая структура этих соединений и определяет их поведение при проведении цветных реакций Долодова и соавт., 1976/. Анализ данных показывает, что наиболее чувствительной к .экдистероидам была реакция Либермана-Бурхарда, ранее используемая для определения холестерина / 656 им/ при достижении максимума окраски образовавшейся хромофоров через 35 мин реакции, а также для 7-дегидро-7-оксихолестершга и зргостерина - через 1,5 мин. Экдистсроиды в этой реакции проявили себя как "бцстролействую'лие" стероиды: гсжеимум окраски при длине волны /»00 им. достигался через I? мин реакции, что характерно для наличия сопряженных двойных српзеП. У полиподина В этот максимум был сг.екен до 425 им.

Наиболее специфичной для экдкстероидов различной структуры "'-.•¡залась реакция «угаева, коночные продукты которой имели дополнительные качественно различные максимумы поглощения в зависимости от введения дополнительных GT-функций или эфирных груп- . пл'оьок в структуру пентанпергидрофенантгепового скелета либо ¡''■-.•/гнюй цепи.

Результаты анализа показали, что использование цветных ре-:---|;ий может дать предварительную информацию о Физической структуре экдистероидов и послужить основой спектрофотометрических методов их количественного определения.

днтнрзликзльчье свойства и антиоксклительнзя активность ■-■/71 н^трг'опдо-я, мембранотлопный эффект экдистероидов, их воздействие на биосинтез белка и активность ферментных систем, влия-

на угле водный и липидный обмен, а также тонизирующие и адап-;;гекчне свойства позволяют предположить их способность угнетать пг рскисное окисление липидов мембран, свойственную стероидным

гормонам позвоночных.

Как следует кз полученных данных, эклистероп обладает ан-тирэдикзльным действием, линейно завися.'1.им от концентрации. У.н-гибирование препаратом восстановления пара-нитротетразолия составляло 1,65 условных единиц при концентрации ю-'-* ?•!, превышая более чем в 3 раза степень ингибгаования этой реакции при кон-

центрации ю

-6

которая все еге вызывала ингибиторный зофскт..

СупероксидустрзияРЮ я активность эку/пстср ска как к супер-оксиддисмутазк обусловлена, очевидно рекомбинацией 0~: 20^+21'Л

11.^2^2' Иехакизн огого Действия екдистерона пока неясен.

В системе, сод органе и липосомн из тостатпдилхолипз, ипду-иаруеиа" как *ерр.о -/ р«?1"/, так и *ерр и иенами / Ре-'"/, зкдистерон

и ф-ерр и иенами / Ре-'"/, вузквэл подавление накопления малонового диальдегида /ЦГЛ/ как в концентрации 5.Ю--5 М /рис. 2 А, поз. 2 и Б, поз. 5,соответственно/, т?к и 10_1> И /рис. 2 IV,' поз. 3, Б, поз. 6, соответственно/. Ийгибарувр;ее действие стерогаа не зависело от того, вызывалось ли окисление липосом восстановленным /рис. 2 к/ или окисленным железом /рис. 2 Б/, и составляло 13 и 26 ^ при

-5 „ г ,л-'!

концентрациях препарата 5.10

5

|

а; з

DJ

«а -о

О '5!

З.и

сз а; с> с:

Ы

I г з

4- 5 б

тпскисгпте*' твгггесть нотзгопз.

виз я

и 1.10" Н соответственно.

Кз исследованных минорных компонентов экд«стероидов серпу-' хи венценосной - << -экдизона, интегристерона л и полиподина В в концентрации М наибольшей

антирад нкальной активностью обладал полиподин В /153 ^ по сравнений с экдистероиом /. Его эффект сравним с известным анти-оксидантом ко иолом, активность которого л концентрации М

достигала 162 * активности экдистерона /табл. и/. 1'нтег'ристерон Аи "V -экдизон, а так>?е 2-Д.е-зоксипгоизводные т'-экдизона ' и экдистерона /ТОV/ обладали антирадикальной активностью, составлявшей 70 52 >. 50-55 ^ активности :?;<днстерспа. Взятый

для сравнения зитамин д^ также обладал антирадикальной активностью - 140 f активности экдкстерона.

Антиокислительная активность исследованных экдистероидов в концентрации I0_it M - 5-Ю--' M имела несколько иной характер. Ее зависимость от структуры практически не наблюдалась. Экдисте-рон, 'V -экдизон, их дезокснпроизводные, полплодин в, заметно не различались по способности подавлять накопление малонового диальдегига /мгк/. Кнтегркстерон был практически неактивен, витамин Е, известный своими аитиоксидактными свойствами, тормозил

накопление МРА на 19-24

известный антиоксп дант ионол - до

47 1. характерно, что антиокислитель!!се действие одного из про-, 'парадов на основе суммы эх? истер ока ов - БИС 5,7 - составляло 45

Таким образом, антиокислительная активность экдистероидов сравнима с таковой витамина Е, ' но-ниже понола. Взятый для сравнения витамин тр^ " концентрациях 5-10"^- Ю-'4 <4 проявлял проок-с:'.?ант!и;о свойства, увеличивая продукции мга до 25

Таблица 4

Аптпрадикальная и антиокислительная активность экдистероидов *

конгеитт„рГТйнгкбнровавье вое- : Тот>кеп15е UOHueh^paui.H, : сгаЯовления п-автро^З.^'^1"'

:тетразолия, усл.ед.:'"1 R'_;_

Название

Г'Кдистероп

•V -зкдизон '

2-дез ок спэкдистерон

2-'лазок си -<-о?:дизон

Кнтагрпстерон А

Полилодик 3

монзл /2,5-Дптгет-

оут ил -4 -не т кл-ftt п ол/

В/лапин с

/ «г - то к о фе р о л /' ■

г<итамин д3

/>, о z е к а л ьц иф е р о л /

БТК-5,7 /сум.-!а екди-

стгг.опдо» сегпу:;;; вег

nc::c:n-;oi-;/

10' 10'

10' 10'

10 10

10

10'

10' 10' ТО"

Ï0 10

10

10'

10

10

зг

-3 ~4

-4

,"4

3

■-J,

.-3

-4

-5

1,65 0,62

0,86 0,70

0,92 0,66

0,80 0,72

1,11 2,10 2,10

2,53 0,88,

2,6 В

2,22 2,30

О, I мл КОгШ.1

'/мл

21 25 9'

14

б

15 47

22 -25 45

В исследоюн иях возможности получения каллуса и клеточной суспензионной культуры из семян и молодых листьев серпухи венценосной с хорошим выходом зкдистероидов мы исходили из представлений о том, что их содержание зависит от генотипа растения, окс-плантата, его возраста, среды культивирования и ренима нырзичпп -пия. На рис. 3 показан прирост массы сырого вещества /кр.1/ каллу оной ткани, из которой в аосясгуюяеи била полу чэ из суспензионная культура на среде КО в зависимости от времени при постоянной температуре 25 °С. Здесь не представлены данные об увеличении содержания зкдистероидов по мере роста каллусной ткани /кр.2/. Как видно из рис. 3, это увеличение наиболее выракено в экспоненциальной фазе роста клеток.

Рис. 3. Прирост сырой массы каллусной ткани серпухи венценосной на питательной среде Мо/г/. а такте количественное содержание зкдистероидов /2/.

На рис. 4 показан прирост биокассы /масса сырого вешества, масса сухого вешества/, а также числа клетск по мере роста суспензии клеток серпухи венценосной. При анализе параметров роста суспензионной культуры установлено, что ростовой никл на модифицированной нами питательной среде Щ с добавками 1 -аминокислот составляет 28-30 дней. Прирост биомассы суспензии клеток ха-

сх пз О о ti я о a r* tr: CS о Wj

о о Я о о и (-2 ki o о CJ t

'Л нэ tic X О o >-- о го M

о» .s t-2 03 о О о « « -н »-3

О) о со 23 ¡•о О О il1 Г* s со

сз о о О * ^ О ; ^

со о ПЗ га »5 } я v.n vi О Г* О rt

—-4< •-3 2Ü tSJ со о >-ь ü; Q ri с? '"С — и

EL, i;',: t-J Ü o о V CD о

л 1 Гт4 S о t-> "С CI) о о i X о

х X W t4 ' * о я fa ^ ьЗ о С\

►в К à а írl i—i ■■■■< о о

я к сл CD • In b"1 СХ и .п о. \ /i

Ö J о л о V h o С

ГЦ ч ' ГЗ S.4 £> Hâ ti о ы ó

11 ПЗ со 1-3 о £Л f •zj il? -J

^ 05 о (D «< п t?4 о о --

Í-2 о Т> ^ zc í"- о г:- -Э О Ti -■-i

о ю о о Cti o о О ; ' Mí Ô

?" г; ъЗ из ÜJ 'si LH о Î-S Ó - ? '0

13 Л 03 оэ Л} ££ o Ô -i;

СО С сх 23 и> CrJ Уч O и >-ч ri О

S3 ^ g к со X О » ^ C-J о с; О Я

о о о ы w .о О О о

о гз о о ►-г TJ 4 txj Гч - 3 va

а Й о ь к п о о о,

г- о о о а t^ Й - п ó сх ' - ¿

о о о в a ^ Cù с? X Q О X

, , 1 о 23 сх X Й-"? cd о о L" О

U.1 ь СП О 03 о ч ы

1 я N о ^ Ц5 O ^ о Í-1 ii.1 №

Ч о ¡•«'Г и o О -3 to о

в о « Й ?» -г; m о Ч;

«< • СО •-3 <D Í:J С\ с П' с t.-í fs-

t-3 S д л Î4 X o Гг -•-< T--J О Ú5 о

^ ZG ^ ч пз o a Ö i-- Гч ^

il Цэ ГС to Vi о y.4 ;c s^ ►з и со - (О •ci' о

г» f bí О W 25 о 1-А о о. О tí

X ?» X № о Г? о о o o g а ь ГтЧ } '•i -5 s

Ü ^ с4 о о y-} W О о • и

Q Ь tj.7 о 'О C.J

я о ^ fc* сх '/I г^ b-í ы Ci 1

о О 1-5 Г-Ц ^ ixi ь« О W о - « и О

з: 1 .г СО »J о o сл Г-3 г; О.

к L5 h J и ш O Vj о го гз Ш Т

о п О "6 ^ г-3 O CO i - ta о о

и" О t^î -, г. J. j Г-Ч 03

•-3 ¡V О о о H с> CÜ ь-З

Tí о О fjí >-3 л о Ст* о

(J и -\¡ СХ Ч; H ï^ic

ЛЗ О F» •LQ О O о ^ •"3 о s et ьЭ

0? JT ^ H о о о !.;

д к О S-! X Iii ей } о ^ 'Ö ^ о « Ó

'О 5 L- Ï» it: er СУ Ó Î«? ТЗ

1—1 О (.3 W to '•O ' j О •t" Г î f-j, CJ

3 ru u> с £> с? « • И Ir- - о

"X! О. Tí О с ТТ. П2 ГС

¡ W -5? О "A о сх te о W«

Г Г ш о О 0 1 £3 о ) g 1 а ¿Í Cr« 1 О О tr1 О I . я о . т и

Ol -

ca

4

<-ч

1

4

§ ^

tu О

Ol

Питательная средцг2/л

c-, £3 ^ Q Q

o-, со

СЭ Q

C) M +

Ca a

_j 1-!-,-,-j

и сухая масса

Q — м tu ц>

Число плеток сырой массы-Ю7/г

го о

130 мг/л, обеспечивший прирост снрол массы клеток до 80 Известно / Hashimoto,Yamada ,1987/, ЧТО L-ГЛуТЗМИН ВЛИяеТ На активность глутаматсинтазы, способствуя больней компактности клеток.

Таким образом, подобранные и оптимизированные нами культу -ральнне среды для вида серпухи венценосной обеспечивают возможность получения из первичных эксплантатов каллуса, из него -суспензионной культуры.

Получение новых клеточных линий и генетически измененных культур серпухи венценосной служит реальной основой для получения ценных биологически активных веществ либо путем количественного увеличения биомассы либо усиления необходимого метаболита в клетках методами генетической инженерии растений.

При выращивании в условиях in vitro происходит "перепрограммирование" заблокированной в нативных условиях информации генома клеток, возмокнл перестройки з структуре хромосомного аппарата, чувствительными маркерами физиологических и биохимических изменений служат новосинтезируемые белки /галкич и соавт., 1989/. Сравнительное изучение новосинтезировзнных белков в ии-тактной растительной, ткани из полевых растений и в культуре полезно для объяснения ее способности к синтезу вторичных метаболитов при выращивании in vitro . Анализ синтезируемых белков может также позволить определить новые подходи к регуляции*активности ферментов генетическим способом, то есть после введения в культивируемые клетей чужеродных генов ключевых ферментов синтеза вторичных метаболитов и после обработки клеток синтетически,ми регуляторами роста или элиситорами.

Кз данных электрофореграмм /рис. 5/ видно, что спектр белков, синтезируемых в кадлусной суспензионной культуре /Б/ менее разнообразен, чем в листьях полевых растений /к/', В - маркерные белки /"piiarmacia ", Швеция/. Практически все белки, синтезирующиеся в культуре, за исключением двух полипептидов со значениями ?,im 150 и 200 кра, обнаруживаются и в листьях.

Помимо белков, идентичных каллусныл, в листьях обнаруживается ряд специфических полипептидов с разной злектрофоретичз с-кой подвижностью.

Содержание нагорного компонента' экдистерона в листьях и репродукт'.гных органах одно-трех летних растений превышает таковое в клетках суспензии серпухи венценосной /см. табл. 2/, что

коррелирует с более разнообразным спектром белковых фракций листьев на электро-фореграмме.

Как следует из проведенных нами исследований, клеточная суспензионная культура серпухи венценосной содержала небольшой процент экдистероидов. Кроме того, е последующих пас саках каллус-пых тканей снижалась их общая продуктивность Эти результаты вместе с ненадежностьа использования экзогенных регуляторов роста и нестабильностью роста каллусных зионной клеточной куль- тканей серпухи венценосной побудили нас венненоской!6В СерПуХК обратиться к генетической трансформации

клеток с помощью ki -плазмиды

A3 го bac t о г iura rhir.ooene д .

Благодаря функик ж.феванкю в трап с'орупроъаннья клетках растений фитогормональных генов агрсбактерк?. такие клетки растений приобретает опухолевый фенотип, отлнчарс.ийся способностью к быстрому делении клеток, что открывает riepen. ктиеы их эффективного использования в биотехнологии. Мы использовали возможности агробактерпальней трансформации серпухи венискосаой и получения культуры трансформированных тканей с увеличенным содержа н ке м эк д и ст е р о и д о в.

О том, что в на;; их экспериментах образовывалась генетически измененная культура .свидетельствует содержание гкди -тероидов в нетранерормированной каллу с я ой куль ту ne /0,085-0,010 >/ и культуре после трансформации /0,156*0,015 2/. трансформированная кгллусная ткань хорошо росла на агаризованной питательной среде МО без ф.итогормонов.

Следуе- заметить, что в листьях полевых растений содержание экдистероидсв все же превышало их количество в культуре, составляя в одногодичных растениях 0.12-0.17 Интенсивный рост трансформированных клеток серпухи венценосной на безгормональ-кых средах предполагает упрощение способа их выращивания и экономическую эффективность их биотехнслогического использования.

Получение новых тр.анм-ормированных клеток серпухи венценосной, а также способность этих клеток синтезигевать стероидные гормоны указывает на принципиальную возможность их использования в качестве источника стероидов.

А Б 3 Ä*

figig^ 9 ьо

¿^м 1

а 'г"

t

..... ; «s» >»*•»

- i

Рис.. 5. фракционный

состав белков, выделенных из суспен-

ВЫВОДЫ

1. Серпуха венценосная в условиях правобережной лесостепи Украины - весьма перспективная техническая культура для получения фитоэкдистероидов. Максимальная урояайность ее листостебель-ной масон на типичных малогумусных черноземах - 519,В ц/га обеспечивается при густоте растений 35 тыс./га внесением навоза

30 т/га к полного минерального удобрения ^g^giy^gQ-

2. Накопление экдистероидов в серпухе венценосной носит различный характер в зависимости от фазы развития, типа органа и возраста растения. Максимальны.!« содержанием отличаются листья прикорневой розетки - в среднем за три года исследований на удобренных вариантах око достигало 1,12-1,80? к сухом}' веществу. Высоким содержанием отличались также цветочные корзинки /0,90-1,22 "V и корни /до 1,35

3. Из наземкой части растения выделено и с помощью физико-химических и спектроскопических /У5-, КХ-, ШР-, массспектро-метрия/ методов идентифицировано семь экдистероидоз различной структуры: зкдистерон, «с-экдизон, полиподин В, интегристерон А, 20,22-моноапетонид, 2,3;20,22-Диаиетонид экд.истерона, птеро-стерон в соотноп-ениях - 100:0,5:0.5:0,3:0,15:10:2.5.

Пять последних экдистероидов выявлены нами в этом источнике впервые.

Сравнительный анализ семи различных цветных реакций на стероиды выявил наибольшую чувствительность реакции Либермана-Бурхарда и наибольшую специфичность реакции чугаева в применении к эк диете ро идам.

5. На моделях in vitro. установлены антирадккальные и антиокислительные свойства экдистероидов серпухи венценосной и их метаболитов, сравнимые с таковыми известных антиоксидантов.

6. На основе известных сред для культивирования клеток и тканей m vitro оптимизирован состав питательных сред и определены условия для получения каллуса и клеточной суспензионной культуры серпухи венценосной. Наибольшее увеличение содержания экдистероидов достигалось, в экспоненциальной Фазе роста, составляя 0,(77-0,01 # к сухому веществу ткани. Генетическая трансформация клеток С ПОМОЩЬС fti -ПЛЗЗМИДЫ A^robnctcriua гШгодспео способствовала увеличению содержания экдистероидов более, че^ я 2 раза.

7. Сравнительное изучение новосинтезиоованннх белков в ин-тзкгнсй растительной т.сзни полевых растений и культуре показало более разнообразный спектр белковых ■фракций нативных нолевых растений, что коррелирует с более высоким содержанием экднстероидов в них.

пуешодш

1. Саад M.JI., Ииладера К.рк., Холодова Г.р., Саатов 3., Га турок вй Я.П. Биостимуляторы на основе серпухи венценосной / bssr-r_.tuia woi f tii, ündr^e. // Тезисы докл. I Международного конгресса "Екоконверсия органических отходов для получения биогумуса, биогаза, белковых вешеств и охрана окружающей среды Киев-Ивано-Франковск, 25 - 27 марта 1991 //Киев Тс-91. С. 72-7").

2. ^рв№ев А.Г., Саад М.1:., *о?,-оковка Г.Н., Осинська Л."».,

уололовз E..F. .[муномо;iyляторп; та знтиоксидантп! властивост1 екгистерону. // Тези доповтдей .I!' "УТ Украшський 6ioxiMi4-кий з"Узд" // КиУв-випавиинтво УСГЛ 1992 / - Киев,1992, с. 91

3. "Осипска я 1\.1>., Саад М.Л., Холодова Г.,". Лнтирадикальные свой-стна и антиокислитсльная активность экдистерона // Укр. био->им. »yjiH. 1992. T.6'i, № I, с. П'1-117.

/). См'? ц.л., «.оваленко П.Г., Матведеав Т.В., Корн иен Г.В., Р'укап И.В., Холодова ЮГалкин А.П. Культура изолированных клеток и тканей серпухи венценосной как источник биологически активных фитоэкдистероидов // Физиология и биохимия .культ, растений. - 1992, Т.24, й 6, с. 6II-6I5.

5. Счад мл., Коваленко п.Г., Заеп В.Н., Корниец P.S., Шатурский я.П.. Холодова Т.}'., Галкин Л.П. Сравнительный анализ белков клеточной культуры и полевых растений продуцента зк-киотероидов U'-rrutulii coronata L. // Укр. биохим. КурН. -П'92. Т. 64, № 6, с. 84-87.

6. С'ЧП N.J5., Илонокко К.А., Kopiiicub Г.В., Н'зтурський я.П., уоло?ова Г.р. Залежи! сть вмтсту щ тоекдистероШв у вегета-

■гпишх та ген?ратипних органах cepni'r1 увтнчансго / serr.itula