Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Взаимодействие ВИЧ с некоторыми инфекционными агентами

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Взаимодействие ВИЧ с некоторыми инфекционными агентами"

РГ6 од

/ тл?РССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК ' I Ы(Мь-2ууЗ ПОЛИОМИЕЛИТА И ВИРУСНЫХ ЭНЦЕФАЛИТОВ

Но правах рукописи

САРКИСЯН НАВЕР АГОП

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ВИЧ С НЕКОТОРЫМИ ИНФЕКЦИОННЫМИ АГЕНТАМИ "

03.00.ОЗ. - Вирусология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученей степени кандидата медицинских наук

Москва 1993

Работа выполнена в Научно - исследовательском институте эпидемиологии и микробиологии ииеш Н.Ф.Гаиалеи РАМН.

Научный руководитель: доктор медицинских наук,

профессор А.Ф.Быковский

Официальные оппоненты: доктор иедицанских наук

К.В.Ильин

доктор биологических наук М.Б.Королев

Ведущая организация: Научно - исследовательский институт

вирусологии ни.Д.И.Ивановского РАШ

Защита состоитсл ¿/иъуЯ 19ЭЗ г. в/^££час.

на заседании Специализированного Совета (Д. 001.27.01) при Институте полиошелита и вирусных енцефалитов РАШ по адресу 1427826 Иоскоаская облаохь, Ленинский район, п/о Институт полиомиелита.

С диссертацией иохнс ознакомиться в библиотеке Института полиоаиелата и шрусних энцефалитов РАМН.

Автореферат разослан " ? 1933 г.

Ученый секретарь Специализированного совета кандидат биолоигеесхих наук

I

О.А.Мэдведошэ

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Сопутствующие (ассоциированные шш оппортунистические) инфекции,вызываемые инфекционными и оикогеншаш вирусами,бактериями,протозоз и грибкаыи,играет значительную роль в патогенезе БИЧ инфекции и прогрессии СПИД* а. Механизш.с поыощыо которых инфекционные агенты воздействуют на НИЧ.еключйвт в себя как прямое генетическое,так и опосредованное через юшуннув систему взаимодействия , которые способны переключить латентное состояние вируса тшу-кодефицита человека в активно реплицирусцбеся.

Так,показано,что разные вирусы (например HSV я CMV) способны вызывать траисактивяцшэ LTR БИЧ (Rosenberg Z.y., Fauci A.S.,1989; Ostrove J.H., Leonard J.et al.,1987). В другой случае установлено,что коинфекцкя ыикоплэзной (H.ier-mentanB,nrrBiM lncognltua) увеличивает способность ВИЧ-I индуцировать цитопатаческий эффект в человеческих Т-лимфоцитах (Lo S.-C., Toal S. et Bl.1991).

Взаимодействие ВИЧ с различными инфекционными агентаии-асооциантаык (так называемыми "кофакторами" инфекционной природы) отличается чрезвычайном разнообразием и сложость»: от изменения пятогенности и других биологических свойств одного или всех сссоцтантов до нарушения чувствительности клеток - мишеней к зссоципнтэи в условиях сметанкой инфекции по сравнению с моноинфекциеЯ.

Особое значение б патогенезе СПИД'а придается мшеоплаз- ■ хгч (b.lfcntGgnier и др.,1390,1591), однако полюй ясности в представлениях о их специфическом знатапп; при Hii4-iи:фекции

нет и до нестоящего времени (L.Wontagnier, 1992).

Вследств$® St or о,по нгшму мнению .необходимо проведение в большей объеме работы по выделению от больны! СПВД'ои и ВИЧ-инфицированных различных ивфекциояшд агентов, моделированию 1л vitro экспериментальных смеешашх инфекций ШЧ с инфекционными агентами различной природа,8 таксе детальному изучении биологических свойств всех ассоциантсв.Подобные исследования позволяют получить новую информацию о патогенезе ВИЧ-инфекции и прогрессии СПИД' а, что 'необходимо для усовершенствования методов диагностики и лечения этого заболевания.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы является изучение особенностей взаимодействия ВИЧ с некоторыми инфекционными вгентами. В соответствии с втим.были поставлена следующие задачи:

- выделение от ВИЧ-инфицированных и больных СПИД'ом новых штампов ВИЧ и других инфекционных агентов;

- изучение особенностей взаимодействия БИЧ с различными видпыи ыикоплазм in vivo и In vitro.

- моделирование и исследование in vitro смешанных инфекций ВИЧ с цитоыегаловирусом.вирусон rpimna и осповакщшы.

Научная новизна рвботы. При выполнении настоящей работы впервне получены сведения,имещие важное теоретическое значение: ',

- установлено,что gp120 ВИЧ адсорбируется на поверхностной мембране Н.pneumoniae,что может приводить к переносу этих молекул в резистентные для ВИЧ клеточные системи;

__ i* t» Q uQDTi о^г 3K#%'1°p«C?»I£iKT2JIbKl¿X Cíí?uI3*íííblX VIHl^-SKJI>*M in

vitro вирусы гриппа А и осповакцины замедляют скорость цито-деструктивных процессов в ВИЧ-ифщироввнннх клетках,что сопровождается снижением инфекционных титров всех вирусов¡

- в условиях экспериментальной смешанной инфекции in vitro циттыегаловирус переводит нзцитоцидауп или умеренно цитоциднуо инфекции ВИЧ в высоко литический процесс,что сопровождается стимуляцией формирования и накопления антигенов. ВИЧ в клетках,хронически продуцирующих этот Еирус и преодолением резистентности Т-лимфобластоидных клеток МГ4 к цато-ыегаловирусу при смешанной инфекции с ВИЧ.

Научно-практическое значение работа. В 32 материалах, взятых от ВИЧ-инфицированных и больных СПИД'ом,БИЧ был идентифицирован в четырех образцах,три из которых помимо ЕИЧ со. держали от одного до трех инфенциокных агентов (михоплазыы, цитомегаловирус,Е1фус простого герпеса, Коксакки A2I, вирус гриппа), Выделение двух последних яссоцинктов описано впервые.Выявлено двухкратное превалирование антигенов цикоплазн (M.íermentsns, М.pneumoniae и M.urealyticurn) и антител к хпш у больных СТШД'ои и ВКЧ-инфщ^фовпкных по сравнении со здоровыми лидьыи. M.XermontEns и M.arthrilidia обладает? мкто-генным эффектом на Т-лиыфоцнты,что приводит к увеличению ци-толнтогзнности Е'ДЧ-1 для а тих клеток, Получешке данные свидетельствуют о том,что выделяемые in vivo инфекционные агенты коррелирует с прогрессией ВИЧ-инфекции,а полученные in Vitro модели смешанных имущий могут бить использованы для скрининга комплексных препаратов протнз BV14 и ассемблированных о !íí¡M агентов.

За защиту выносятся следупцие основные положения диссертации. ^

1. Выделение ВИЧ из периферической крови больных и инфицировавших ВИЧ часто сопровождается изоляцией сопутству»-

4 щих агентов (в том числе цитодеструктивных виоусов и ыико-плазы ).

2. Получекч экспериментальные модели In vitro сиешанных инфекцкЛ ВИЧ + Ы.pneumoniae,ВИЧ + цитоыегаловирус, ВИЧ + вирус гриппа А, ВИЧ + вирус ос~овакцины.

3. В результате изучения смешанных инфекций in vivo и In vitro установлено:'

- деукряткое превалирование антигенов H.íerjnentans ,Н. pneumoniae, M.urealytlcum и антител к кии у больных и инфицированных ВИЧ по "равнению со здоровыми ;

- наличие иитогенного аффекта у M.íermentans и M.arth-rltldlo Hd Т-лимфоциты,что приводит к увеличению цитопато-генности ВИЧ для этих клеток;

- gp120 ВИЧ адсорбируется на поверхности микоплазмы Ы. ■ pneumoniae;

- Вирусы гриппа А и осповакцины згшедляют скорость цитодеструктивных процессов в ВЯЧ--инфицированных клетках,в то &РЕМЯ как цктоиегаловйрус переключает нецитоц..Дну» или уне-раняо цктоцидную инфекции ВИЧ в высоко литич~ский процесс.

Апробация работы

Апробация проЕеденй на коррекции отдела структуры и функции микроорганизмов и иех.табораторшл группы по изучению СПИД»а 1ШИЭМ им.Н.Й.Гииалеи РАМН, Москва, апрель 1993.

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 5 работ.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 130 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы (вклтсгцего две главы) .собственных исследований, излсзешшх в четырех главах ,обсуждение результатов,выводов к списка литературы,включающего 138 источников. Материалы диссертации иллюстрированы 3 таблицами, 5 лгагряюяюи и 56 расункшгд.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материалы исследования

Осношпяга материалам для настоящего исследования слу-r".L73i: I) 32 образца цельной периферической крсвн людей БИЧ-юфщттровагашх и больных СТП'Д'он,полученные нз клиник различии« городов Росски. 2) Первичные и перевиваемые суспензионные клеточные линии PBL, НЭ, HTi, СИЛ, U937, Jurkat; Т-лим-фоблостоидние перевиваете клеточше линии,хрокпзскя проду-циружщис НКЧ-1 - H9/IIIB, ÍÍTÍÍIV2Y; перевиваете клеточные линии LÍDL'K и ДКЛЧ для изоляции сопутствующих агентов. Клетки были получеки из зарубежных и Российских научных центра!-. 3) Мнкошмзма 6 видое: M.arthriticiíB (Pg 6), H.hoinir.la (Pg 21 и H-34), M.pneumoniae (FH), M.fermentnns (Pg 1а я К Т), A.lald-ln',7il (Pg 8) и U.urealy tlcrai VIII били любезно предоставлены проф. К.З.РкксвсксЯ (НИИ2М им.Гамалея РАМН). 4) Антигены ии-коплпзн 7 чн^ов.мокоспецифические1 ишоротки.икмоиилизирован-ные эритроичты и другч.'г компонента pewnjrtt РДГА и РПГА бил.

кые эритроцита и другие коппопеш-л реакций РЛГА n FIITA били

„юбезио предоставлены д-розл С.АЛ'опчаровой (лаб.ижоплази ,

?

НПИЗМ ш.Н.Ф. Гамалеи РАМН); 5) ЬЬпогены школяагц 7 видов, оокре-кфуезаг в среду кулъшшропатая и связанные с ssmussi * iu;sTKt;.ri. 6) Вир/си: EÍÍ4-I ,истотщиг.оа которого служила шгрус-содертацая гультуралььая гладкость клеток II9/IIID и HTHIY27 ; CHV (ет."Весна") предоставлен д-ром H.B.Kapazac (ШИЗУ ш. Гаыалв::, РАМН); вирус гриппа A/CCCP/9D/77 (H3N2) и кррянчья •-•;иолиююиальная ыглидЕОротко к кзыу были лзбезио предоставлена д-рои Е.В.СклянскоЛ (IШ вирусологии им.Д.И.Яеяпонского РАШ); ei-'d/c оспозакщап (кг. "ЛИБ1Г) бил продостазлен проф. .В.Р.Черносоа 1ГОШ вирусных препаратов МЗ СССР ). 7) Мококло-налышз антитела (МАТ) к кцрвздуалыЕа гликопротепнаи, и белкам ЕИЧ: fclAT gpl20, MAT р24, Ш.Т J17 ( Biochrcn, Scherli-í arm, Sv/I iserlead) к глньзгат снтшазвшых кроличьих Ig G с ферритхшон(Serva) был предоставлен д-роп Н.А.Захаровой(1ШИЗМ иы.Н.Ф.Гаыэлеп РАМН). ■

Метода псслгдоважш I. Изолтгао РЙЧ от больких-ОЩ'си п ВКЧ-игфдртованнах люде*1 осуществлял;? из Т-л'д-фощ.хоз пери.; эрическол крови (РВЬ), выделенных в фиколовом градиенте, стзиуллроваЕШх ФГА и кокультцвировашмх с д^норсюши PBL в присутствии 11-2 до 45 дней.Тестирование клеток на наличие ЕИЧ или. его антигенов проводом каздуа недела по реакции непряиой имыунофлуорес-цекции (НК'5) и злектронно-шпфоскопически з ультратонких срезах.

2• Идентификатор ртоулчвнх агентов в изолятзх ВОТ проводили

на клеточных культурах !®СК,Д1{ЛЧ,Н-19 и Нер-2 .которое ютфя-вдровпли цельной культурэльнсй ЯИДКОСТЬа от РВЬ и'золятсз. и наблюдали разные сроки до виявлення спецкфичоскшс язнекений ц клетках.Еирусологнчаская цдентяфккпцал и пширспонпе выде-лвтпи агентоз просодмссь в базоьах тучних лабораториях ШЗП а ВЗ Р^Ш, НИИ грхшпа МЗ РЗ, Ш31 вярусннх препаратов МЗ-РФ,ПИТ вирусолопи им.Д.И.Ивановского РАМН и в ШЖЗм -м.Н.О. Гамалеи РАШ.

3. Регмагт кащишоЗ,гамунофлгрргзцзнцга ■ (ИИ) исиольйовалх-дат спредалегал внутрдягЗточшх п_ поверхностных антлгепов различных вкусов. В кзтаствз. а:гп*гел попользовала гомолспгч-шо полкзяонвльныа. аюткпгоро'дзт» а згакяе шшгшае ЫАТ к отдельным глтжоаротеянаи 2р120 и /гр41 я балкам р24 и р17 Еяраопа ПН. -

4. Ь'етодч определения ентягэиоз 'шегоплзац и р.^тите^ г; тлел_в

сыророткзх лыг.^й . Использова-гл раакцая Е1р2гаг^ганагглятпна-щс! (РЛГД) для спроде^еягя гаиигвнов и реакцию пассиБясв геггагглшлшзции (РИГА) для определения антлтзл. Обе реакция стап'/ли в агглЕгкгнЕЦЯоивых досклх ¿икротитратора "Та'тсШ." в «одифлкнциях лаб.шксплчзы КСТБМ ЕИ.Н.&.Гацалеп РАгШ. Чувствительность тест-систеи определялась пзиболыплн разведешеы соотезтстесшю гомологичного антигена или 8нтптел,дагадах аг-

глютипсцпэ с зрнтроцятаркьсз диагностлкуцои.

■ г

5 • Метод электронно-цихроскопического исследогштия в ультра-тонких срезах. Подлегацзе исследовании метки фиксировали, обрабатывали и заклвчяли в нралдит по^общепринятым ыетодпи. Ультратонкие срезы получали на . тльтратоие Ке1с'пег* . прт

псиацз стекляшх Kossñ. После дополнительного окрашивания срезов соляш свинца и уронила проводили их анализ в электронной ышсроскопе JE! 100GX.

6. Непрямой гадлуноферриткновый__уетод . был использован для

идентификации гликопротеинов ВИЧ-I н доказательства специфичности их взаимодействия с иикоплазыой. В качестве каркеря использован ферризин (Fe++) из лошадиной селезенки (Serva), кошлэгированяый с антишаиныыи Ig G кролика .Конъюгацию Fe++ с Ig G кролика проводила по иетоду Shick (Shlck et al.,1951).

7. Статистическая обработка донных. Статистической обработке подвергались все результаты,которые требовали количественной оценки. Обработку данных проводили иетодоы вариационной статистики (Ь5айстрах и др.,1360).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ ' f

Изоляция BÍW и сопутствующих агентов их крови ладей.

Исследовано 32 образца периферической крови (в тон чис -,че 5 образцов от больных СГЩ'оц,18 образцов от клинически здоровых шрусоноситег£й,3 - от вирусоносктелей на начальной стадии диифоаденопатии, 6 - от клинически здоровых ладей, сыворотки которых либо не содерзали постоянно определяемых ШГЧ-антигенов и антител в ИФА.либо содержали р24 в шшуно-блотз). ВИЧ был идентифицирован в четырех образцах,в трех из которых обнаружены и другие индукционные агенты.

Мэолят H.L, - 9.Пациент из Испании,19 лет,наркоман. Выявлены внтитела к EÍI4 в ИМ (титр 1:12 ООО ООО) и незначк-

, тельно увеличенный правосторонний подчелюстной лш:фоузел. Из взолята выделены ВИЧ,Н. рпешюп1ае, Коксакки А21 и вирус гриппа. г '

Изолят ВБ - 17.Падиент из России,34 год а, офицер флота, заболел после прибытия из загранплаишия. Выявлены анта^зла к В^Ч в ЙФА (титр 1:10 ООО 00и) »увеличенные подиышечнне н 1 паховые лимфоузлы, опоясывающий лишай. Из изолят^ аделены ВИЧ »вирус гриппа ¿.вирус герпеса простого нейтрализуемый ап-' тисыворотками к герпесу I и II тов.

Изолят Ш) - Д. Пациентка из Эфиопии,22 года,обследова-. на в период беременности. Линфовдеяопатия,выявлены антитела к ВИЧ в ИФА (1:12 ООО ООО). Диагноз СПИД'а (СЗ по классификации СВС,иБА,1986) поставлен на основании комплекса клина- ' ческих и лабораторных данных« йаделег ВИЧ,других инфекционных агентов не обнаружено.

Изолят В - 16.Пациент из Волгограда, I год и 7 месяцев, инфицирован в клинике . В момент взятия крови для изоляции вируса обнаружен НЬв - антиген и антитела к цитоыегэлоакрусу (титр 1:8). Диагноз -ВИЧ-инфекция,титр антител к ВИЧ з ЙФА 1:10 ООО. После 23 дней культивирования лиогфсщитов периферической крови (РВЬ) и кокильтквирсваяня пх с клетка-тг МТ4 выявлен только ВИЧ.

Анализ взаимодействия ВИЧ с ыикоплвзмаки различных

видов

I. Выявление антигенов (АГ) микоплззы и антител к ъш в крови ВИЧ-позитивных,больных СПЯД оя д здоровых лиц. Основные результаты исследования суммированы в таблице N 1 ,из которой..

Таблица N 1

Выявление шжоплааы у ВИЧ-позитивных и здоровых лиц

Контингент Число М.рпешш1ае М^егтшпгаив { ЫЛют1д1в

обследованных обследованных АГ АТ АГ АТ | АР

Здоровые ~ 134 2(1 »53{) 1 (0,7535) 5(3,7%) 2(1,535) 3(6)5)

Больные 139 4(2,5») 12(8,6!$) 9(6,75) 9(6,75) 9(6.735.)

Продсипсение

Контингент Число И.ЬсшИйв и.игеа!уг1сш

обследованных обследованных АТ ¿Г ( АТ ! ЛГ 1 АТ !

Здоровые 134 2(1 ,555) 6(4,431) 0 21 (15,7?) з( г»21)

Больные 139 • 7(5«) 9(6,735) 2(1,53) 31(г?,ЗХ) 35(25,2Х)

следует,что в пробах сыворотки от ВИЧ-позитивных и больных СПИД'ом АГ М.рпешюп1ае,И.1еппеп1;апв и и.игеаШ1сит , * обнаруживались в 2 раза чаще,чем у здоровых. АГ М.Ьот1п1в у больных и здоровых лиц были выявлены в одинаковой проценте случаев.В контрольной группе у 21 (или 15,7Х) обследованных в крови имелись ыикоплазменные АГ и у 3 (или 2,2% ) -АТ к ним.Среди лиц,инфицированных ВИЧ и больных СПИД'оы.АГ микоплазмы обнаружены в крови у 31 ( или 22, ЗЖ ) обследованного,а АТ к шш - у 35 (или. 25,2%). При этой следует подчеркнуть,что*у 6 ВИЧ-позитивных лиц в сыворотке обнаружены АГ, к 2 и более видам ыикоплазм,то есть они оказались инфицированными нескольким! ввдаии мшюплазм одновременно,а 11 имели АТ также к нескольким видам ыикоплазм.

Очевидно,что объем обследованных' сбразцоа пе является достаточно представительным для окончательных выводов.Однако как нам кззется, на этом этапе исследований четко прослеживается тенденция к увеличении числа инфицированных иикоплазмаыи лидей среди ВИЧ-позипшных и больных СПИД'он, по сравнению со здоровэдш.

Донные по анализу образцов, составляете панель ВИЧ-поз!!ТИВных сшюроток для контроля диагаостакуна на ВИЧ следует прокомментировать сбоссбг.згао.В отдельных образцах этой панели ( 2-1055 случаев) такие сбларугеш АГ к шпсош!азааи,а именно :И.рпетюп1Ее - в 5.(или 10%), МЛеплэп-1апв - в 3 (илибЗ), Ц.Ьо:п1п1з - а 4 (пли ОЯЬи.иге-иуИсип -

• I

в 1 (или 2%).Таких обрззои.ЕЗ 50 скьороток АГ обизругекп

в 15 (или26%) случаев. Причем три из этих проб содержали одновременно АГ 3 или 4 видов иикоплазы.Этот факт наличия ДГ микоплазм в образцах стандартной панели требует особого внимания, так как при использовании в качестве контроля сывороток,содержащих АГ микоплазм,могут быть получены ложноположительные результаты в тех случаях,когда исследуется кровь инфицированных шкоплазмам или перенесших микоплваиенную инфекцию пациентов.

2. Ыитогены макоплазм и инфекция лимфоцитов человека ВИЧ-1 Известно,что миконпазмы обладают способностью адсорбироваться на лимфоцитах различного происхождения и либо угнетать , либо стимулировать их бласттрансфориацию (Санин А.В.и др. ДЭВЗ). Эффект зависит не только от вида ииксплазмы,но и

с «т

от дозы.Дозы низе 10 -10 КОЕ/мл являются стимулирухщими,а более высокие ингибируют митогенное действие ФГА и Кон А. Природа ыитогенов микоплазм и их локализация в клетке различны.Поатоиу в. программу сравнительного исследования уровня бласттрансформации Т-лиыфоцитов РВЬ были включены штогены сеш видов микоплазм и лектины ФГА или Кон А.

Результаты, измерений показали,что слабый штогенвьш действием обладают етше клетки 1!Легтсеп1;алв и Ц.рпеш10п1ае,индексы стимуляции которых более чем в 100 раз оказались нижа таковых у ФГА или Кон А¡максимально 12,5 у МЛегтепшш и 12,0 у Ц.рпешюп1ае на 3 сутки в сравненные 152,5 у Кои А с некоторым незначительным увеличением к 6 суткам.

Из црепярагсь ш;тогенов семи видов цикоплазц слабый

тгвет показал лишь митогек M.arthritldlB (индекс стимуляции в среднем 4,5 по сравнении с 20,4 у Кон А стимулированных лимфоцитов).

После определения стимулирующих доз матогенов ыикоплазм и жигах клеток было предпринято исследогагае их влияния на цитспатогенность ВИЧ-1 в РВЬ. Анализ дашшх,полученных в этих акспериментах позволяет сделать по крайней ыере один предварительный вывод о наличии слабо вырахегчого цито_'енного аффекта у препаратов . M.arthritidie и U.fermentana,который способен статистически достоверно увеличивать цитопзтогенность ВИЧ-1 для лимфоцитов периферической крови человека.

3.Ультраструктурный анализ взаимодействия микоплазм с ВИЧ-1

1п Yitro.

Для изучения характера взйимодейстБия шшоплаэн с

ВИЧ-1 на клеточном уровне использовала непр&ыой

иимуноферритиновый метод (Fe**) маркирования антигенов ВИЧ-1

на ульгратодаих срезах.В скстеие использованы ьшшзшв

ионоклоналыше антитела к gp120 ЕЙЧ-1 (МАТ gp120) и

кроличьи ангииышше Ig С.коныггирсзешше с ?в++

Клетки H9/IIIB,хронически продуцирукцие ВИЧ-1 были .

проверяла на отсутствие контаминации цдксалаБмэыи.Иосяе

отого oía были инфицированы ииксчтлазиой H.pneumpniae о к

множественностью 10 КОВ/кд.После часового контакта с ялетквмн при 1°-37сС,ЕесплзяЕлпяся мякоплазмз била ооторссто стшта бессыБоротачЕОй средой RPMI 1640 , и клетки инкубировали пря tr^37°G в атмосфере С0?=4,7Я втечение Д субкульткЕвций для колокззедаи н paaiísoseraM кккопдазмы. Ib

конце 3 naccaza (14 день культивирования) культуры были фиксированы и обработаны по схеме для электронно-микроскопического исследования.

Опытные образца клеток НЭ/IIIB,инфицированные М.pneumoniae инкубировали вначале с MAT gp120 и после отмывания с Ig G,конъыгированныии с Реч+. Контролем служили:суспензия И.pneumoniae,инкубированная с MAT gp12Q, HAT р17, МАТ р24 И IgG + Fe++,a таксе сыш клетки H9/IIIB, инфицированные ми-коплазмой и инкубированные с МАТ р24 и МАТ р17 и с IgG + Fe++"

Результаты изучения ультратонких срезов показали,что гранулы ¥е++ локализуются на (Волочке некоторых вирионов ВИЧ, а также па мембране некоторых клеток микоплазмы или в непосредственной близости от нее.

Ни в одном случае не были обнаружены гранулы Ре++ в контрольных препаратах суспензии М.pneumoniae,контактировавшей на тех же условиях с MAT gp120 и Ig G + Fe++.

Таким образом , специфическая связь гранул Ре++с поверхностью ii. pneumoniae представляется сгрого доказанной.Это указывает на способность gp120 ЕИЧ адсорбироваться на мембране шкошшзиы,что открывает путь к его успешному переносу в другие системы.

Анализ взаииодействия ВИЧ с рядои инфекционных вирус >в

in vitro

1 .Анализ взашодействия ВЙЧ-1 с вт,фусом гриппа типа А.

В связи с изоляцией полноценного вируса хтриппа из лимфоцитов ВИЧ-инфнц'.фозанкого пациента представлялось

ваанкм смоделировать in vitro смешанную инфекция для анализе взаимовлияния двух РНК-содергащих вирусов на клеточное» уровне.

В эксперимент были включены высоко-- в умеренно чувствительные к ВИЧ-I Т-лиыфобластоидные клетки человека МТ4 и промоноцитарная линия U-937.06e зги линии клеток оказались умеренно чувствительный н к вирусу гриппа человека тш18 А/СССР/90/77(K3N2).

Как следует нз анализа данных,представленных на рис.1 одновременное или последовательное внесеше вируса гршша в смененную инфекцию приводит к следующим' изменениям:р )до 5 суток уменьшается скорость распространения цитодэструктнвыых изменений в культуре,вызываемых этик вирусом,по сравнении с контрольными препаратами,где полная цятодеструхция от гриппа-наступила через 24 «аса. При этом АГ-позитибными была ляшь 10-1НХ клеток; б)умепьшаатся количество АГ-позитившх клеток вируса Гр.А до! -35 квк в высокочувствительных,так н в умеренно чувствительных к ВИЧ клеточных сяптеиах; в) вт^рячнэя анфекция вирусом гршша практически не влияет на уровень репликации ВИЧ-Х в клеточной популяция, В процессе сиэп.'.аной инфекции инфекционный титр вируса гриппа' снизился до 10°-100,5Ш1Д5С/ш! по сравкенздг с 10Т-10Г,ЗЦВДБ0/мл в контроле.

УльтрЕструктурнш анализ взаимодействия ВКЧ-1 а Гриппа А показал,что оба яируся проходят а клетке морфологически по-пшй рзп-'зпеа-пшн^й цикл с формированием тарфояоги-чеекнр' арелых вкркопоз. ft у/ьтрэтонкгсх срезах, пс "обяиругекн кгатн.

РИС.Я 1

Количество АГ-позитивных клеток с вирусами БИЧ-1 ' и Гриша А при смешанной инфекции

% ВИЧ-1 и Гр.А АГ-иозитивных клеток 100-

80-

20-

15-

10-

5-

г!

г1л

-I

-I-

г!

гЪ

е1.

вич-1 гр. А ВИЧ гр ВИЧ гр ВИЧ гр ВИЧ гр' контр. .контр, одновр. одновр. Зс. 1с. 3с. 1с.

ГП - клетки МТ4

[5 - клетки и-937

; сыепакно-инфацировашше двумя вирусами,в протиЕополо;шссть данный Ш'5,з результате того,очевидно,что число таких клеток невелико. В стой модели был обнаружен . чрезвычайно интересзлй факт- формирование в клетках структур,являшгихся производными пероховвтого реиякулуьз и описашшх исключительно в клетках волосовидной лейкемии человека (Hairy cell leukemiae).

2 * Анализ взаимодействия ВИЧ с цитоиегаловирусоц

Предварительное определение чувствительности различных • типов Т-лжгфобластовдих'клеток к С!.Г7 (шта^я! "Весна-1990"), щфщированких с шкжествакностыз 100-1000 Ч^Цо/ыл показало,что они практически не чувствительны к мояошгЬекции огтл вирусом,что совпадает с ранее полученными сведениями.

Культура МТ4 была включена в конструирование моделей смешанных игфэкцкй Iri vitro, что 'и позволило после" суперш^эшгш ВИЧ-1 получить обильную информацию о характера взаимодействия двух неродственных вирусов.Кроме этого били использованы клетки H9/IIIB г; ШЗДО27, хронически продуцируйте В'Я-I «и отличаицггеья по уровню продукции этого втфуса от пассагя к пассаиу (30-60Х и 100" АГ-позитивных глетск соответственно).

• Анализ дагаых,представленных на рис.2 позволяет констатировать,что в модельных систечах смешанных инфекций ЕИЧ-I и CMV in vitro происходит: я)стимуляция процесса формирования и накопления кгпггенов ВИЧ-I в клетках, хронически продуцирующих этот вирус; 6} преодоления

■-I

резистентности Т-лиафобластоидних клеток fiT4 . к СМ? при ■

С

PlK2.lI 2 •• . . '.

Количество вотигец-Еозитквшх клеток БИЧ-I и С'ЛЧ

• г

в снгигл:лх жгфекщщх In vitro % ЛГ-поззтнвкых кяе-ток в 'Ш13 О

10090-

ео-

70605040-

so-2010-

Г-1-1

rh

h.

-Il

ВИЧ с:?! ыоиоинф.

ВИЧ CMV,

смешан.

инф.

ВИЧ

t.iOHO

инф.

ВИЧ CliV

супер

инф.

ЬИЧ fe'iV : ыоно c.;,<Tiep инф. иуф.

| |- клетки Ш4

В- клетки ИЭ/ШВ

Щ- кле-рки КШ1У27

хо-шг!ог.д\г? с БИЧ-I; в) трансформация пецятопатаческой продуктивной нкфзкщс: ЕЙ1"!-! в гшэ уках ШШУ27 я H9/IIIB а острую литаческув üop?jy пря суперж* гщж CF. 3 • Анализ, взаццодейиттая. Р''Я-I о цьтоссц оспот?зкцйш

лсрето известно,чго г: втрусу осповпкцяпп (ОВ) не суцзствуэт нечувствительных метек. Hp-i '.»тс-r t в jt-jóc-ü клеточной енота,"е этот шсст:е щтолптачеекмп вирус- проходит? полннп цикл решпп:ог?5п с образодапвш зрзлого *n*¿3ra?¡;caiií>ro пс?с::зтва. " '

3 предпаритедыс.'.г гкеперп^еяяге; ln ?itro по определенна чувствительЕОстл клетой ISHá з U337 к 03 покезапо, что в первых накапливается до 70-73S ¿Г-поздтнвтшх клеток 03 .»с 72 часам,вторые зе •содзряпли за гтот -пе период вренэни всего 3-5% ДГ-посптшжзх клеток баз 'ярко глрвгенпнх цитодо с труктив -них И2:мнг!2П1 культури.

В УСЛОГИЯХ üiXCrGKIOñ ОЖТЗКГОП ИЛ^ОКЦЧК пгепехг^.гло статистически достоверное cuziлстг/з количества антиген -позитивных клеток как ОВ так и БИЧ-I в обеих культурах. Crc.- -ошк числа ЛГ-поялтивпах клеток 03 наблюдалось п в хроничйсх! продуцирующих BÍI4 кягтжгс H9/IIIB л imiiV2?,по сравнению о контрольной мопоитфагтргай" зт. и вирусе«. При злсктротю-'тафоскопичсском исследовании в ¡слетках с двойкой инфекцией б'шн обкзругеки последовательные стадии развития втфуса ОВ о образованней морфологически зрелого втоусного потомства и сбычного по цорфолегии и циклу репликации ЕИт;-1. Однако во всех вариантах сыегсэнкых икфетций произошло пропорциональное снижение алтра вируса ОВ кз 1,5-2,0 lg.

ВЫВОДЫ

I. Установлено, что идентификация и изоляция Е'1Ч в периферической крови ВИЧ - инфицированных и больных СПИД'ом находится в прямой зависимости от степени активации в ллкфоцг(тах периферической 1срови других инфекционных агентов. Обнаружено деукратное превалирование антигенов иикоплазм и антител к ним у ВИЧ - инфицированных и больных СПИД'ом до сравнению со здоровыми людьми;

II.Приведены доказательства многообразия форм взаимодействия и взяумовлияния мезду ВИЧ и "кофакторами" инфекционной агиологии ,'п ¥1^0,8 именно:

1. Показано наличие митогенного эффекта у двух видов м-.'-.ошшзл (Ц.&гШгПШЮ и ЫЛегаепгапв) на Т -- лимфоциты, который способен достоверно увеличивать цито-патогеняость ВИЧ-1 для этих клеток;

2. Микоплазиа способна адсорбировать на себа антигенниз детерминанта ВИЧ,что открывает возаэгкос^ь переноса и ргснрострвыекия его информации не др/гие системы.

3. Показано,что одни инфекщюь'ше вирусы (грипп А и О1?.? занедляггг скорость цитодеструктивных процессов в ВИЧ-инфицированных клетках,в то время как другие ((Ж) наоборот,переводят нецитоцидаую или умеренно цитоциднув 1шфекцию ВИЧ в еысоко литичесгай процесс. При итоц происходит снижение инфекционных титров всех перечисленных вирусов.

...гррвып обнаружено, что в условиях ¿мешанной ш.^зщик ИЛЧ и вируса гриппа А в клетках происходит фсрм>;рови--

ние de novo структур.присущи только определенному типу лейкозе человека - волосовидно-клеточной лейкемии.

СПИСОК

научных работ .опубликованных по теме диссертации

1.Саркисян H.A. "Электронно-микроскопическое изученье вируса иммунодефицита человека" - XII научная конференция болгарских аспирантов в СССР с международным участием Москва, 14 - 15 июня 1990г., с.53-54 .рукопись доклада депонирована в ЦШБ - Софич, N депонента 3557/90

2.Саркисян H.A. "Электронно-микроскопическое изучение вируса иммунодефицита человека и цитомегаловируса в условиях смешанной инфекции" - XIV конференция по электронной микроскопии (биология и медицина),п.Черноголовка,! - 5 июня 1992г. с.37

3.Е.П.Шумай, И.Л.Грабовская, А. А. Кущ, Н. А. Саркисян, И.В.Титове,Г.Г.Миллер "Сравнительный анализ Т-лиыфобласто-чдной клеточной линии МТ4 и ее субклона,хронически инфицироввшюгс вирусом иммунодефицита человека" "Цитология" ,1992 .Том 34.N 9. с.122 .

4. И. В. Ра ковск8Я, С. А. Гонч арова, H. А. С аркисян, Г. Г. Миллер "Выявление ыикоплэзм и антител к ним в крови ВИЧ-позитивных и здоровых Лиц" - Вестник РАМН,1992,H 9-10,с.41-43

5.1.RfüiovBkB,1a,G.Miller,S.Goncharova,N.SarkiSE 'an "Putative Signilicance oi Mycoplasmas in AID Pathogenesis", TOM letters Vol.2 ,9th Liternational Congress oi the ЮН,' August 2-7,1992, Агеев, lOYa U.S.A.,p.219