Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Взаимодействие рибосомного белка L1 с рибосомной и матричной РНК

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Взаимодействие рибосомного белка L1 с рибосомной и матричной РНК"

На правах рукописи

НИКОНОВ А ЕКАТЕРИНА ЮРЬЕВНА

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ РИБОСОМНОГО БЕЛКА 1Л С РИБОСОМНОЙ И МАТРИЧНОЙ РНК

03.00.03. - Молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2006

Работа выполнена в Институте белка РАН

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор

Гарбер Мария Борисовна

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор

доктор биологических наук Ведущая организация:

Донцова Ольга Анатольевна

Озолинь Ольга Николаевна

Институт молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта РАН

Защита состоится "_[_2006 года в СО часов на заседании

диссертационного совета Д 501.001.76. при Московском Государственном Университете им М. В. Ломоносова по адресу: 119992, Москва, ГСП-2, Ленинские горы, МГУ, НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова

Автореферат разослан " ^ "

2006 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук

Н.О. Калинина

¿LOOBfr

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы: Проблема регуляции экспрессии генов - одна из фундаментальных проблем молекулярной биологии. Экспрессия многих генов регулируется на уровне трансляции, что обеспечивает быстрый и чувствительный ответ клетки на изменение внешних условий. Один из хорошо изученных примеров регуляции -это регуляция синтеза рибосомных бежов в бактериях. Гены рибосомных белков объединены в опероны и продукт одного из генов может репрессировать свой собственный синтез и экспрессию других генов того же оперона, связываясь с определенным участком полицистронной мРНК. Такой тип регуляции обеспечивает сбалансированный синтез рибосомных белков и рибосомных РНК: если в клетке отсутствуют свободные молекулы рибосомных РНК, белки-репрессоры связываются со специфическими участками на матричных РНК и синтез рибосомных белков прекращается до тех пор, пока не появятся молекулы рРНК. Это классический пример регуляции по принципу обратной связи.

В течение многих лет ведутся работы, посвященные изучению механизмов регуляции трансляции. Накоплен большой объем информации, полученной, главным образом, генетическими и биохимическими методами. Однако структурные основы этого процесса до последнего времени были изучены весьма слабо из-за отсутствия пространственных структур регуляторных РНК-белковых комплексов. Актуальность нашей работы состояла в получении и кристаллизации соответствующих комплексов и в проведении их структурных исследований. Приоритетные работы по определению пространственных структур регуляторных комплексов бактериального и архейного белка L1 в комплексе со специфическими фрагментами мРНК были сделаны в Институте белка РАН в лаборатории структурных исследований аппарата трансляции, где и выполнялась данная диссертационная работа.

Цель работы: выяснение структурных аспектов регуляции экспрессии генов собственного оперона рибосомным белком L1.

Основные задачи работы:

- получение фрагментов мРНК, специфически связывающих белок L1,

- получение и кристаллизация комплексов рибосомного белка L1 с фрагментами мРНК,

- получение мутантных форм белка Lie измененным сродством к мРНК и рРНК,

- кристаллизация некоторых мутантных форм белка L1.

Научная новизна и практическая ценность работы. Получены фрагменты мРНК разной длины, специфически связывающие белок L1, и выращены пригодные для рентгеноструктурного анализа кристаллы комплексов Ll-мРНК. Определение пространственных структур закристаллизованных комплексов позволило идентифицировать структурно-инвариантные участки поверхности белка L1, 23 S рРНК и мРНК, ответственные за специфическое связывание.

Методом точечных мутаций в белке L1 найдены ключевые аминокислотные остатки, ответственные за формирование рибосомного и регуляторного комплексов. Показано, что время жизни рибосомного комплекса больше, чем время жизни регуляторного. Повышенная стабильность рибосомного комплекса определяется взаимодействиями домена II белка Lie двумя петлями рРНК, отсутствующими в мРНК.

Полученные результаты имеют фундаментальный характер. Методические разработки по выделению РНК и белков, по введению точечных замен в участки аминокислотной последовательности белка, а так же по кристаллизации РНК-белковых комплексов могут быть использованы в институтах Российской Академии Наук и других учреждениях биологического профиля как в нашей стрг нфдок

БИБЛИОТЕКА {

Структура диссертации: Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной часта результатов и их обсуждения, выводов и списка литературы. Работу иллюстрируютб / рисунков и "Ьтаблиц. Общий объем диссертации Сс^страниц. Библиография включае!^ названий.

Апробация работы и публикации. По материалам диссертации опубликовано 2 статьи. Результаты диссертации докладывались на международных и Российских конференциях

Обзор литературы посвящен оперон-специфической регуляции синтеза рибосомных белков. В нем обсуждаются различные механизмы регуляции трансляции у прокариот.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1.Получение и кристаллизация РНК-белковых комплексов для структурных

исследований.

Рибосомный белок 1Л выполняет в клетке две основные функции: он может специфически связываться как с 238 рРНК, формируя так называемый Ы протуберанец большой субчастицы рибосомы, так и с участком своей мРНК, регулируя собственный синтез. Сродство белка Ы к рРНК примерно на порядок выше, чем к мРНК, что позволяет использовать конкуренцию между 238 рРНК и мРНК за связывание с белком Ы для предотвращения избыточной продукции белков его оперона в клетке. Конкурентный механизм регуляции синтеза предполагает структурное подобие участков 23 Б рРНК и мРНК, ответственных за специфическое связывание белка Ь1. Ранее были определены кристаллические структуры свободного белка Ы из трех различных организмов и структура комплекса этого белка со специфическим фрагментом 238 рРНК. Анализ этих структур позволил выделить на поверхностях белка и рРНК участки, предположительно ответственные за РНК-белковое узнавание. Поскольку конкурентный механизм регуляции синтеза основан на незначительном различии в сродстве белка 1,1 к рРНК и мРНК, получение комплексов этого белка с фрагментами мРНК, их кристаллизация и последующее определение структур имеют решающее значение для выяснения структурных основ регуляции.

Кристаллизация макромолекул - достаточно сложный процесс. Очень многие факторы влияют на способность РНК-белковых комплексов кристаллизоваться. Важны чистота препарата, конформационная гомогенность, структура поверхности молекул, доступность участков для межмолекулярного контакта, а так же стабильность комплекса. Известно, что качество кристаллов РНК-белковых комплексов в значительной степени зависит от длины и структуры используемого фрагмента РНК. Изначально необходимо определить участок РНК, который при минимальной длине сохраняет полное сродство к белку, а в дальнейшем на его основе сконструировать фрагменты РНК, подходящие для кристаллизации комплексов.

1.1 Получение фрагментов мРНК.

Для получения кристаллов комплекса Ы-мРНК, пригодных для рештеноструктурного анализа, был сконструирован ряд специфических фрагментов мРНК (рис.1). В качестве стартового фрагмента мРНК для введения в него различных изменений был выбран фрагмент, изображенный на рис. 1А. Этот фрагмент содержит часть рехуляторного Ь1-связывающего сайта на мРНКи из Methanococcus уаптеШ и включает область, строго консервативную в 23 в рРНК и мРНК, и две спирали, которые участвуют в образовании контакта в рибосомном РНК-белковом комплексе. Верхняя полноразмерная

спирально-петельная часть, не содержащая консервативных нуклеотидов не влияющая па сродство к белку Ы, была заменена четырехнуклеотидной петлей 1ШСО.

А. стартовый фрагмент ииША В А °с5-с А-и А—и <3—С и—А &-С А А С С в А в в В 3 Б. 38нт Муа (Н5) в ес°А с 555 А А-и А—и <}-С и-А о-с А-и с—С а-с а-с В.38нт (Аи 11А)Муа иисША А ССЗ-С А-и А-и О-С Ц-А (З-С и—А О-С З-С в-с Г. Збнт Муа о вС°А с 555 А ииСббд А С(х-С А—и А-и в-с и—А О-С 5—с Ь

Д. 40нт (+вС) Муа о <зсеАд ЬМА А ев-с А—и А-и в—С Ц—А О-С А-и ©-С о-с Е. 40нт (+2<ЗС-АЦ)Муа в °ССЗАА А с<з-с А-и А-и в-С и-А о-с га о—с §=8 Ж. 37нт Муа в еС<ЗА с 555 А ииСббд А °сз-с А—и «А-и и—А в-с и-А О-с (З-С в-с 3. 49нт Муа - С^ 0е°А ОЙ ША Аа е(3-С А-и А-и (З—С Ц—А Й-С А-и сз-с (3-е (3-е

И. 49нт М]а ЗаГшО е<з-с А-и А-и о-с Ц-А &-с А—и о—с о-с (5-е К. 48нт (-в) М]а - А в . п А в А АдйШиЩ А А-и А-и (З-С Ц-А <з-с А—и &-С (З-С С Л.47нт(-АЦ)МЗа 'а^И А °о-с А—и А—и в-С Ц-А в—С в-с в-с о-с

Рисунок 1: Вторичные структуры фрагментов мРНК из М. \аптеШ (Муа) и М. )аппайски (М]а), использованные в экспериментах по кристаллизации комплексов Ы-мРНК. Фрагмента: А) стартовый фрагмент мРНК; Б) фрагмент мРНК из МмаптеШ длиной 38 нуклеотидов; В) фрагмент мРНК из МуаптеШ длиной 38 нуклеотидов с инвертированной парой (замена Аи на ИА); Г) фрагмент мРНК из МуаптеШ длиной 36 нуклеотидов (АТ1 пара убрана); Д) фрагмент мРНК из МуаптеШ длиной 40 нуклеотидов с дополнительной БС парой; Е) фрагмент мРНК из МуаптеШ длиной 40 нуклеотидов с 2 дополнительными ОС парами, Аи пара убрана; Ж) фрагмент мРНК из МуаптеШ длиной 37 нуклеотидов с выступающим нуклеотидом; 3) фрагмент мРНК из МусттеШ длиной 49 нуклеотидов, содержащий полный боковой спирально-петельный участок; И) мРНК из М. ]аппазсИН длиной 49 нуклеотидов, содержащая полный боковой спирально-петельный участок; К) мРНК из М ]алпазски длиной 48 нуклеотидов, содержащая неспаренный нуклеотид на 3' конце; Л) мРНК из М ^аппаис/ш длиной 47 нуклеотидов, содержащая полный боковой спирально-петельный участок (Аи пара убрана).

Первым пригодным для кристаллизации фрагментом РНК был 38 нуклеотидный фрагмент (рис. 1Б), у которого неспаренные нуклеотиды были заменены участком

3

спирали. В дальнейшем, этот фрагмент также был подвергнут модификациям. Так A-U пара, следующая за триплетом G-C пар, была заменена U-A парой (рис. 1В, Ж), что предположительно могло привести к формированию дополнительных кристаллических контактов. На рисунке 1Г показан фрагмент РНК, где эта пара вообще отсутствует. Кроме того, к открытому концу спирали были добавлены дополнительные G-C пары (рис. 1 Д, Е)

Кроме изменений в нижней спирали фрагмента мы заменяли малую боковую петлю из четырех нуклеотидов полноразмерной спирально-петельной частью, присутствующей в исходной мРНК (рис. 13-Л). Такие более длинные фрагменты мРНК были сконструированы как на основе мРНК из Mvannielii (рис. 13), так и из М jannaschii (рис. 1И-Л). Для оптимизации кристаллической упаковки были сконструированы фрагменты мРНК с измененной длиной нижней спирали (рис. 1К, Л).

Гены специфических фрагментов мРНК были клонированы в вектор pUC18. Все фрагменты РНК, использованные для образования комплексов и для последующей кристаллизации, были получены транскрипцией in vitro с использованием Т7 РНК полимеразы с линеаризованных плазмид pUC18, содержащих гены специфических фрагментов мРНК Эффективность синтеза РНК Т7 РНК полимеразой сильно зависит от концентраций MgCl2, рибонуклеотидов и их соотношения. Концентрации данных компонентов транскрипционной смеси подбирались экспериментально Концентрации остальных компонентов транскрипционной смеси были постоянны вне зависимости от длины получаемого фрагмента РНК' 80мМ Hepes. рН 7.5; 5мМ ДТТ, 2мМ спермидин. 50-ЮОмкг плазмидной ДНК и 1250 единиц Т7 РНК полимеразы/мл транскрипционной смеси.

Фрагмент РНК очищали от побочных продуктов реакции, а также от компонентов транскрипционной смеси методом электрофореза в полиакриламидном геле в денатурирующих условиях или с помощью гель-фильтрации. В среднем чистота фрагмента РНК была выше 95% (рис. 2).

1 2

Рис 2: Электрофореграмма фрагментов мРНК, дорожка 1 -

транскрипционная смесь;

дорожка 2 - очищенный фрагмент мРНК.

Сродство фрагментов мРНК к рибосомному белку 1Л определяли с помощью экспериментов по связыванию на нитроцеллюлозных фильтрах Все использованные нами для кристаллизации фрагменты мРНК связывались с !УЦа1Л так же хорошо, как и 250 нт фрагменты мРНКм^и При использовании в экспериментах по связыванию стартового фрагмента (рис. 1 А) процент насыщения был очень низким (20-25% от общего количества РНК), поэтому этот фрагмент не был использован для кристаллизации 1 2 Выделение и очистка рибосомных белков Ы

Для кристаллизации комплексов использовались белки Ы из термофильных организмов М.]аппа$сИИ (М|аЫ) и Ткегтш 1кегторИИш (ТЛЬ1). Для каждого из этих белков был выделен дикий тип и белок с заменами метионинов на селенометионины (для

определения фаз при решении структуры методом мультиволновой аномальной дисперсии).

Гены белков LI из М jannaschii и Т. thermophilic экспрессировались в системе Штудиера. В качестве штамма-хозяина использовались клетки Escherichia coli BL21(DE3). Для экспрессии архейных белков эти клетки содержали плазмиду pUBS520. Экспрессионные векторы pMjaL1.4 и pACA-Ll несли гены белков MjaLl и TthLl, соответственно. Клетки штаммов-суперпродуцентов белка LI растили при 37°С при интенсивном перемешивании (160 об/мин) на богатой среде LB, содержащей 0.2% глюкозы, 100 мкг ампицилина и 50 мкг канамицина на 1 мл среды (для архейных белков) до оптической плотности OD590=0.5 ОЕ. Для активации Т7 РНК-полимеразы в среду добавляли ИГГТГ до конечной концентрации 0,3 мМ. После добавления индуктора клетки продолжали инкубировать в тех же условиях в течение 3 часов. Схема выделения белка LI из штаммов-суперпродуцентов включает несколько основных стадий: разрушение клеток, удаление дебриса, осаждение рибосом из клеточного лизата, прогрев, удаление термолабильных белков и хроматографическое разделение белков. Иногда после хроматографии на смоле CM-Sepharose препарат белка, очищенный от примесных белков Е coli, содержал примесь нуклеиновых кислот, от которых мы освобождались с помощью хроматографии на смоле Heparin-Sepharose. Использование такой методики (полуаффинная хроматография) позволяет получить препарат белка с чистотой до 98% (рис. 3).

А

12 3 4

Для решения проблемы фаз при определении пространственной структуры комплекса могли потребоваться кристаллы, содержащие тяжелые атомы. Один из методов введения их в кристаллы - замена метиониновых остатков на селенометиониновые в аминокислотной последовательности белка. В данной работе были выделены белки, в которых метионины были заменены селенометионинами с целью использования аномального рассеивания на нескольких длинах волн (MAD) для определения фаз. Для выделения таких модифицированных белков использовали штамм-суперпродуцент E.coli B834(DE3) ауксотрофный по метионину. Биомасса была выращена на минимальной среде, содержащей селенометионин. Во все растворы добавляли 2 мМ DTT для предотвращения окисления селенометионина.

1.3 Кристаллизация комплексов белка LI со специфическими фрагментами мРНК.

Оптимальная концентрация мРНК для кристаллизации была 5-7 мг/мл. Ренатурацию мРНК проводили при 60 С в течение 10 минут в 1мМ Na-цитратном буфере с последующим охлаждением до 0°С. Фрагмент мРНК и белок смешивались в эквимолярных количествах. Концентрация MgCb в комплексе в среднем составляла 1.5 мМ. Образование комплексов оценивали методом гель-электрофореза нуклеиновых кислот в ПААГ в неденатурирующих условиях (рис. 4).

Рис. 3: Электрофореграмма, показывающая стадии очистки белка. А. Стадии очистки до хроматографии: 1 - разрушенная биомасса; 2 -дебрис; 3 - после удаления дебриса; 4 - после прогрева. Б. Фракции, содержащие белок Ы, после хроматографии на смоле СМ-верЬагоэе

Для кристаллизации были использованы не только гомологичные, но и гибридные комплексы, содержащие мРНК и белок Ы из разных организмов. Использование гибридных комплексов возможно, поскольку белки Ы из различных организмов структурно и функционально взаимно заменяемы. Более того, гибридные комплексы иногда обладают большей способностью кристаллизоваться, чем гомологичные. Так кристаллы комплекса белка из М _/аппавсИи с фрагментом рРНК из Т 1ИегторЫ1ш, а так же комплекса белка Ы из 8и1/о1оЬш аШосаЫаНш (васЫ) с фрагментом рРНК из ТЛегторИИш отражали рентгеновские лучи лучше, чем кристаллы гомологичных комплексов из Т 1кегторЫ1ш.

Рис. 4 Электрофоретический анализ комплексов 1Л-РНК в неденатурирующих условиях. Дорожка 1 - фрагмент мРНК из вЙ Мл'аптеШ длиной 36 нуклеотидов; дорожка 2 - комплекс

М]аЬ 1 с фрагментом мРНК из Мхапте1и длинной 36 нуклеотидов; дорожка 3 - комплекс НМЛ с фрагментом мРНК из М тпп1еЫ длинной 36 нуклеотидов

1 2 3

Первичный поиск условий кристаллизации вели с помощью набора Natrix™ (Hampton research Inc., USA). Кристаллизация велась методом диффузии паров в висячей капле. Обычно смешивали 2 мкл комплекса Ll-мРНК с 2 мкл реагента и уравновешивали против резервуара, содержащего тот же самый реагент из набора Natrix™. Все кристаллы появлялись в таких условиях, когда осаждающий агент состоял из полиэтиленгликоля (ПЭГ) и моновалентных ионов. После получения первых мелких кристаллов мы оптимизировали условия, меняя концентрации каждого компонента в капле, немного изменяли рН и температуру, а так же вносили различные добавки (соли тяжелых металлов, глицерин, МПД и т.д.). Условия кристаллизации комплексов представлены в таблице 1. Кристаллы, образованные комплексами архейного белка MjaLl с 49 нт фрагментом мРНК из того же организма и бактериального белка TthLl с 38 и 36 нт фрагментами мРНК из археи М. vannielii оказались пригодными для рентгеноструктурных исследований.

Условия роста кристаллов во всех случаях были близкими. Мы использовали в качестве осадителя ПЭГ 8 или Ют, а буфером был какодилат Na, рН 5.5-7.0. Глицерин, соли ртути и 2-метил-2,4-пентандиол (МПД) улучшали качество кристаллов. Оптимальной для роста кристаллов комплекса TthLl-мРНК была температура 4°С, а кристаллы комплекса MjaLl-мРНК росли как при 4°С, так и при комнатной температуре.

Табл. 1: Результаты экспериментов по кристаллизации комплексов белка Ы с различными фрагментами мРНК

состав комплекса условия кристаллизации фотография кристаллов предел разрешения

ТЛИ мРНКмуа 38нт В капле: 0.375% ПЭГ 10т в 50 мМ какодилате Ыа, рН=6.0; 0.125 мМ Н§С12, (или 0.063 мМ мерсалила N8); 0.63% глицерина. Противораствор: 20%ПЭГ 10т в 100 мМ какодилате N8, рН=6.0. Температура 4°С. /■■/-ЖШШЯИ^ИИ 2.8А

таи мРНКмуа 38нт (Аи-иА) В капле: 1.67% ПЭГ 8т в 50 мМ какодилате N8, рН 5.5. Противораствор: 30 % ПЭГ Ют в 100 тМ какодилате Ыа, рН 5.5. Температура 22°С. 26 А

ТМЛ мРНКму. 40нт (+СгС) В капле: 1% ПЭГ 10г в 50 мМ какодилате Иа, рН 5.5; 1% глицерина. Противораствор: 20%ПЭГ 10т в 100 мМ какодилате N8, рН 5.5. Температура 4°С. ш. 1к

ТЛЫ мРНКмуа 37нт М^аЫ мРНКмуа 37нт В капле: 2 % ПЭГ 8т в 50 мМ какодилате Ыа, рН 7.0. Противораствор для комплекса с ТМЛ: 30 % ПЭГ 8т в 100 тМ какодилате N8, рН 7.0. для комплекса с М)а1Л: 5 % ПЭГ 8т в 100 тМ какодилате N3, рН 7.0. Температура 4°С. ■ 5 А

ТЛЫ (Ьу8127Мй) мРНКмуа Збнт В капле: 0.375% ПЭГ 10т в 50 мМ какодилате N8, рН=6.0; 0.125 мМ (или 0.063 мМ мерсалила №); 0.63% глицерина. Противораствор: 20%ПЭГ 10т в 100 мМ какодилате рН=6.0. Температура 4°С. 2.1 А

1 мРНКч^а 49нт В капле: 0.33% ПЭГ 10т в 50 мМ какодилате №. рН 6.0; 0.66% МПД1 Противораствор- 30 % ПЭГ 10т в 100 шМ какодилате N8, рН 6.0. Температура 22°С. 3 4 А

\ljaLl 'шшШШк

мРНКмуа 5 А

49нт

М)а1Л мРНКм^ 48нт В капле: 0.5% ПЭГ 10т в 50 мМ какодилате N8, рН 6.0; 0.63% МПД Противораствор: 10 % ПЭГ Ют в 100 тМ какодилате N8, рН 6.0. Температура 4°С. Ш 3.5 А

М]а1Л мРНКм,а 47нт В капле' 1 25 % ПЭГ 10т в 100 мМ какодилате N8. Противораствор- 20 % ПЭГ 10т в 100 тМ какодилате рН 6.0. Температура 4°С. н 4А

1.4. Комплекс ЩаЬ-мРНК

Кристаллы комплексов белка М]а1Л с короткими фрагментами мРНК отражали рентгеновские лучи до 5-10 А и часто были разу поря дочены. Наилучшие результаты были получены для комплексов белка М]аЫ с наиболее крупными фрагментами мРНК (содержащими полный боковой спирально-петельный участок): кристаллы гомологичного комплекса К^аЫ-мРНК (49 нт) отражали рентгеновские лучи до 3.4 А. Дифракционные данные были собраны на синхротроне Беву в Гамбурге (Германия) с кристаллов, содержащих белок Ы с заменой метионина на селенометионин. Структура комплекса была определена методом мультиволновой аномальной дисперсии.

Модель гомологичного комплекса белка 1Л со специфическим фрагментом мРНК длиной 49 нт из М.]аппа$сИИ представлена на рис. 5. Структура белка М]а1Л в комплексе с мРНК близка структуре белка в свободном состоянии. В обоих случаях белок находится в «открытой» конформации, и при образовании комплекса структура каждого домена не подвергается значительным конформационным изменениям. Белок взаимодействует с мРНК в основном за счет домена I.

3'

Рис. 5: Комплекс фрагментом

мРНК длиной 49 нт. Белок Ы имеет открытую конформацию. Основной контакт с мРНК образован первым доменом.

Фрагмент мРНК представляет собой две регулярные двойные спирали, образующие друг с другом приблизительно прямой угол (рис. 5, 6). Рибозо-фосфатные группы нуклеотидов 037 и С63 сближены, а фосфатные группы нуклеотидов 034, С38 и Ш5, Сбб располагаются примерно в одной плоскости и окружают немного вогнутый участок, за счет которого мРНК в основном и взаимодействует с белком Ь1. Поверхность нижней спирали фрагмента мРНК комплементарна поверхности Р-листа домена I белка Ь1.

Сравнение структур рибосомного и регуляторного комплексов белка Ы показало, что белок образует сеть недоступных растворителю водородных связей со структурно инвариантным мотивом обеих РНК, содержащим строго консервативные нуклеотиды. В то же время число неконсервативных водородных связей в рибосомном комплексе больше, чем в регуляторном, что может быть причиной различного сродства белка Ы к рРНК и мРНК. Однако низкое разрешение полученной структуры комплекса не позволило нам провести детальный анализ РНК-белковых взаимодействий.

1.5. Комплекс ШЫ/мРНК.

Кристаллы комплексов белка ТЛИ с фрагментами мРНК из М. уаптеШ, представленными на рис.Ш и Г, отражали рентгеновские лучи до 2.6 и 2.1 А, соответственно. Комплексы кристаллизовались в пространственных группах Р21 и Р6522. Первоначально кристаллы комплексов имели значительную мозаичность (более 1°). Этот недостаток был преодолен добавлением в каплю солей ртути. Хотя мы не видели сигнала

Рис. 6' Схематическое изображение двухмерной структуры 49 нт. фрагмента мРНК из М¿аппазсЬи Черным показаны консервативные нуклеотиды.

от ртути при съемке и не обнаружили ее в структурах комплексов, она положительно влияла на рост кристаллов и снижала их мозаичность.

Наборы дифракционных данных с кристаллов комплексов были собраны на синхротроне Оеву в Гамбурге (Германия). Структура комплекса белка ПЫ_1 с 38 нт фрагментом мРНК была определена методом молекулярного замещения и уточнена до разрешения 2.6 А (рис. 7). В комплексе ТЛЫ находится в «открытой» конформации, подобно архейным белкам Ь1, тогда как в изолированном состоянии его домены сближены и контактируют друг с другом, образуя «закрытую» конформацию.

Фрагмент мРНК в этом комплексе, подобно фрагменту мРНК из М¡аппазсИи, содержит две спирали, образующие практически прямой угол. Строго консервативные нуклеотиды, принадлежащие соприкасающимся концам спиралей и межспиральной петле, образуют уникальную структуру, узнаваемую первым доменом белка П.

Второй домен белка ТМЛ во взаимодействиях с мРНК практически не участвует. В асимметричной части элементарной ячейки кристалла содержатся четыре копии комплекса и только в двух из них наблюдается единственная экспонированная в растворитель водородная связь между вторым доменом белка Ы и мРНК.

1 6. РНК-белковое узнавание

Известно, что многие рибосомные белки структурно и функционально взаимозаменяемы в рибосомах из различных организмов. Исходя из этого, можно сделать вывод, что места связывания на РНК и на белке должны включать в себя структурно инвариантные участки, ответственные за РНК-белковое узнавание (так называемые узнающие модули). Ранее в нашей лаборатории было сделано предположение, что узнающий модуль должен содержать полярные и заряженные атомы, формирующие сеть внутримолекулярных РНК-белковых водородных связей, недоступных растворителю.

Детальный анализ пространственных структур белков Ы из различных организмов в свободном и в связанном с РНК состояниях выявил на поверхности белка два участка, структура которых инвариантна во всех известных молекулах Ь1. Один из этих участков принадлежит домену I и содержит остатки консервативного кластера этого домена, другой включает в себя остатки консервативного кластера домена II (рис. 8).

Рис. 7: Изображение комплекса ТШЫ с фрагментом мРНК из М \аптеШ длиной 38нт.

Рис 8- Схематическое изображение пространственных структур рибосомного белка Ы в свободном состоянии. ТЛЫ имеет закрытую конформацию, два домена белка сближены и контактируют друг с другом. М^Ы имеет полностью открытую конформацию, домены не контактируют друг с другом. Положение кластеров консервативных остатков, расположенных в домене I и домене II, показано кружками

Первоначально, на основании анализа имеющихся структур свободных белков Ы и рибосомного комплекса васЫ-рРНК мы предполагали, что оба эти участка необходимы белку 1Л для узнавания своей мишени на РНК. Однако структура регуляторного комплекса ТгМЛ-мРНК показала, что белок 1.1 контактирует с мРНК только доменом 1. Это позволяет сделать вывод, что инвариантная структура на поверхности первого домена (рис. 9а) достаточна для узнавания структурно инвариантного участка РНК.

В рибосомном комплексе второй домен белка БасЫ контактирует со структурой, образованной петлями А и В 23 Б рРНК. В мРНК петля А отсутствуе1, а петля В значительно короче, что приводит к отсутствию контактной области для домена II в мРНК и к уменьшению времени жизни регуляторного комплекса по сравнению с рибосомным. Эти структурные различия, по-видимому, и обеспечивают разницу в сродстве белка 1Л к рРНК и мРНК, необходимую для конкурентного механизма регуляции синтеза.

Как в рибосомном, так и в регуляторных комплексах фрагменты РНК имеют практически идентичную структуру в месте пересечения спиралей и вокруг него Этот участок содержит кластер нуклеотидов, строго консервативных в 235 рРНК и мРНК из разных организмов. Нуклеотиды кластера и их ближайшие соседи по последовательности (не более двух с 3' конца) формируют уникальный структурно инвариантный участок (стабилизированный внутримолекулярными водородными связями), который, по-видимому, и узнается белом Ы (рис. 9в).

Для проверки выдвинутых предположений, уточнения границы узнающего модуля и выяснения роли отдельных аминокислотных остатков в специфическом связывании с РНК мы сделали ряд замен в последовательностях белков М)аЫ и ТМЛ. Полученные мутантные формы были проверены на связывание с рРНК и мРПК и закристаллизованы.

2. Получение мутантных форм белка 1Л с измененными РНК-связывающими

свойствами.

В качестве основной модельной системы для изучения влияния отдельных аминокислотных остатков на РНК-связывающие свойства белка 1Л был выбран М^аЫ. Этот выбор был сделан по нескольким причинам: во-первых, М]аЫ один из гипертермофильных белков, работа с которыми сильно упрощена; во-вторых, известны трехмерные структуры этого белка в свободном состоянии и его комплекса с фрагментом мРНК. Для анализа влияния отдельных мутаций на РНК-связывающие способности бактериальных белков был выбран ТМЛ. Причины его выбора были те же, что и для

11

ТШЛ М)а11

М)аЫ. Аминокислотные остатки, роль которых в РНК-белковом узнавании мы хотели проверить, выбирались на основе анализа имеющихся структур свободных белков, их комплексов с фрагментами рРНК и мРНК, а также сравнения аминокислотных последовательностей белков Ы из различных организмов.

2.1. Выделение мутантных форм белков Ы и тестирование их термостабильности.

Гены мутантных форм белка Ы были получены методом сайт-направленного мутагенеза. Процедура выделения мутантных форм белков М]аЬ1 и ТМЛ не отличалась от процедуры выделения белков дикого типа. Единственным дополнительным шагом было тестирование термостабильности всех мутантных форм белка Ь1. Оптимальная температура прогрева (важного шага в процедуре выделения белка) подбиралась для каждого белка. Для этого 50 мкл безрибосомного экстракта прогревали в течение 20 минут при 45, 55, 65 и 75°С. Денатурированные белки осаждали центрифугированием при 14000 об/мин в течение 10 минут. Обе фракции (супернатант и осадок) анализировали на денатурирующем ПААГ в присутствии ДДС-Ыа (рис. 10). Все полученные мутантные формы белка Ы обладали такой же термостабильностью, как и белок дикого типа.

Рис. 9: Структурно инвариантные участки в белке Ы и во фрагментах мРНК и рРНК. А: белок М^Ы, расположение инвариантного участка показано светло-серым цветом. На левой части рисунка показано наложение соответствующих

участков белка Ы в изолированном и в связанном с РНК состоянии. В: Наложение фрагментов рРНК. Уникальная консервативная структура выделена светло-серым цветом.

В

Рис. 10 15% ПААГ с ДДС-\'а. окрашенный Кумасси С250 1 - биомасса с экспрессированным геном М)аЬ1; супернатанты. после удаления денатурированных белков 75°С (2), 65°С (4), 55°С (6), 45°С (8), осажденные денатурированные белки 75°С (3), 65°С (5), 55°С (7), 45°С (9)

2 2 Взаимодействие мутантных форм белка L1 со специфическими фрагментами 23S рРНКимРНК.

Изучение РНК-связывающих свойств мутантных форм белка L1 осуществляли in vitro с помощью связывания на нитроцеллюлозных фильтрах. Плазмиды, содержащие гены специфических фрагментов рРНК и мРНК, были получены ранее в медицинском университете г. Инсбрука (Австрия) для изучения РНК-связывающих способностей архейных белков L1. Длина специфического фрагмента 23 S рРНК из М jannaschit составляла 125нт (нуклеотиды с 2189-2312); длина специфического фрагмента мРНК составляла 104нт. Ранее было показано, что неспецифическое связывание MjaLl с любой РНК достаточно велико (К/г5*10'5 М,). Поэтому для контроля неспецифического связывания мы использовали 145 нуклеотидный фрагмент 16S рРНК, содержащий участок связывания рибосомного белка MjaS8 В ходе данной работы мы сравнивали сродство мутантных форм белка L1 к специфическим фрагментам РНК со сродством белков дикого типа к тем же специфическим фрагментам РНК (положительный конгроль). Эти эксперименты проводились в стандартном ТМК-С135о буфере.

По способности связываться с 23S рРНК и мРНК по сравнению с белком дикого типа все полученные мутантные формы белка L1 можно поделить на три группы:

1) белки, связывающиеся с рРНК с такой же аффинностью, как и белок дикого типа,

но имеющие пониженное сродство к мРНК,

2) белки с пониженным сродством как мРНК, так и к рРНК;

3) белки, не связывающиеся с РНК.

На рис. 11 представлены стандартная кривая связывания белка дикого типа с фрагментом 23 S рРНК и кривые связывания представителей каждой группы мутантных форм белка MjaLl. Константы диссоциации для комплексов, образованных с 23S рРНК белком L1 дикого типа и его мутантными формами, представлены в таблице 2. В большинстве случаев мы не видим влияния единичных аминокислотных замен на связывание белка с рРНК, однако, в некоторых случаях наблюдается снижение сродства. Отсутствие связывания с рРНК наблюдается только при замене консервативного Thr204 в РНК-узнающем модуле на фенилаланин (Thr204Phe) или же при одновременной замене двух консервативных остатков РНК-узнающего модуля (Glu27Ala и Thr204Ala). В первом случае, по-видимому, происходит значительное искажение рельефа поверхности белка, ответственного за узнавание РНК, во втором случае способность недоступных растворителю полярных атомов РНК образовать водородные связи с белком оказывается нереализованной, что ведет к дестабилизации комплекса.

«Чм 1 а I* f *

2 3456789

1 15Е+02

J 9 50E+01

-MjaL1 L1 23S -M205G:L1 23S

Li ies

-T204F L1 23S -T204A L1 23S

-5 OOE+OO

1E-12 1E-11 1E-10 1E-09 1E-08 1E-07 1E-06 белок[M]

Рис. 11 • Кривые связывания мутантных форм белка MjaL1 (M205G, T204F, Т204А) и дикого типа MjaLl (положительный контроль) со специфическим фрагментом 23S рРНК.

На рис.12 представлены стандартная кривая связывания белка дикого типа с фрагментом мРНК и кривые связывания представителей каждой группы мутантных форм белка L1 с тем же фрагментом мРНК. Константы диссоциации для комплексов белка L1 дикого типа и мутантных форм с мРНК представлены в таблице 2.

В большинстве случаев замены консервативных аминокислотных остатков, входящих в предполагаемый узнающий модуль белка MjaLl, приводят к значительному снижению сродства белка к мРНК (вплоть до отсутствия связывания) и не меняют сродство белка к рРНК. Эти эксперименты находятся в хорошем соответствии со структурными данными, поскольку в регуляторном комплексе MjaLl взаимодействует с мРНК фактически только доменом I. Мутации в области, занятой консервативными аминокислотными остатками этого домена, критичны для регуляторного комплекса и практически не оказывают влияния на рибосомный комплекс.

-MjaL1:MPHK -R126Y.L1 мРНК -T204F:L1 мРНК -K168SL1 мРНК -MjaL1:16SpPHK

ч V N V N V N V ^ V Ч V N белок[М]

Рис. 12: Кривые связывания мутантных форм белка MjaLl (Я126У, Т204Р, К1688) и дикого типа MjaLl (положительный контроль) со специфическим фрагментом мРНК.

Однако мутации РЬе22Аг£, \lct205Gh и \lct205А>р приводят, по-видимому, к значительным, хотя и не катастрофическим, как в случае замены ТЬг204РЬе, изменениям в рельефе поверхности узнающего модуля белка и возможному проникновению растворителя внутрь контактной области, что примерно на порядок ухудшает сродство М]аЬ1 к рРНК. Двойные замены полярных остатков узнающего модуля М)аЬ1 на неполярные полностью исключают образование комплексов как с мРНК, так и с рРНК. В этом случае, скорей всего, белок не может опознать свое место на РНК.

белок Ка мРНК, |М| КйрРНКЛМ]

М]аЬ1 (дикий тип) 5*10' 1.2x10"

П2А нет связывания 1.2x10""

ган нет связывания 1.2x10"'°

нет связывания гхю*

¥21\ 5*1<Г' 1.2x10"'"

2x10* 1.2x10"'"

в25С 7x10"' 1.2x10"'°

Б25Т 1.5x10"' 1.2x10"'°

Е27А нет связывания 1.2x10"'"

Е270 5хЮ",л 1.2x10"'°

Е270 нет связывания 1.2x10"'"

Я126А 8*10* 1.2*1<Г'°

И126Е 8x10"'° 1.2x10'°

Н126У 8x10"'" 1.2x10"'°

Т204А нет связывания 1.2x10"'°

1Л46А 8x10"'° 1.2x10'°

Ь163У 9x10"' 1.2x10"'°

1Л6У/Ш66К 4x10"' 1.2x10"'°

1Л6У/Ш66Т 8x10"' 1.2x10'°

Т204Р нет связывания нет связывания

Т204С нет связывания 1.2x10"'°

Т204Э 2.5x10"' 1.2x10"'°

М205А нет связывания 1.2x10"'°

М205Р нет связывания 1.2x10"'°

№05в нет связывания 2x10"'

М2051) нет связывания 3x10'

1Л46Е 2x10"* 1.2x10'"

ЫбЗУ 7x10"' 1.2x10"'°

ьют/твек 5x10"' 1.2x10"'°

Ы63У/1Ч166Т 7хИГ' 1.2x10"'°

К1685 9x10"' 5x10"

Е27А/Т204А нет связывания нет связывания

"ПЫЛ (дикий тип) 8x10"" 2x10"'

К134А 8x10"* 2x10"'

Т217А нет связывания 2x10"'

Р371 2x10" 1.5x10"'

Р37У нет связывания 4x10"*

вгнА 9x10"" 4x10^

М218Ь 9x10"7 3x10""

М218У 1.5x10"' 1.5x10"'

I домен не детектируется не детектируется

Табл.2.Кажущиеся константы диссоциации рибосомных белков 1Л дикого типа и их мутантных форм с фрагментами 23 Б рРНК и мРНК.

Отдельно следует остановиться на замене ЬувШБег в области междоменного контакта. Этот остаток не принадлежит к узнающему модулю, но, тем не менее, его замена оказывает влияние на сродство М]аЫ как к мРНК, так и к рРНК. Можно предположить,

15

что эта замена понижает вероятность существования конформации белка, пригодной для связывания с РНК. Уменьшение доли такой конформации в общем пуле конформаций свободного М}аЫ приводит к увеличению равновесной кажущейся константы диссоциации.

Комплекс бактериального белка ТАЬ1 с фрагментом рРНК оказывается значительно более чувствительным к одиночным мутациям в узнающем модуле, чем комплекс архейного белка. Это можно объяснить тем, что в домене II бактериального белка отсутствует сильно заряженная спираль, которая, взаимодействуя со структурой, образованной петлями А и В 23Б рРНК, стабилизирует архейный комплекс.

Как упоминалось ранее, контакт между первым доменом белка 1Л и РНК может обеспечить образование стабильного комплекса. Для подтверждения того, что строго консервативные аминокислотные остатки домена П этого белка не важны для специфического связывания с РНК нами были сделаны замены аминокислотных остатков А^]26 и 134 в М}аЫ и ТМЛ, соответственно, а так же получен изолированный домен I белка 1,1 из Т ЛегторИИш. Для всех этих мутантных форм белка Ы была проверена способность связывать рРНК и мРНК. Замены строго консервативного Агд126/134 во втором домене МЗаЫ/ТМЛ практически не сказываются на РНК-связывающей способности белка. Однако эксперименты по связыванию РНК-белковых комплексов на нитроцеллюлозных фильтрах и изучение изменения подвижности РНК в ПААГ в неденатурирующих условиях показали, что РНК-связывающая способность полученного нами изолированного домена I белка НЫЛ сильно снижена по сравнению с белком дикого типа. Тем не менее, такой белок образует комплексы со специфическими фрагментами как мРНК, так и рРНК.

Таким образом, точечные мутации в узнающем модуле белка 1Л подтвердили, что полярные остатки, формирующие этот модуль, играют ключевую роль в образовании комплекса. Из неполярных остатков в узнающий модуль белка, по-видимому, следует включить строго консервативный РЬе22 (РЬе37 в ТАЫ), который закрывает область специфического контакта от доступа молекул растворителя. Замены в кластере строго консервативных аминокислотных остатков домена II белка 1Л практически не влияют на специфическое связывание белка с РНК, что согласуется с высказанным ранее предположением о возможной роли этого домена в обеспечении конкурентного механизма регуляции синтеза.

Поскольку точечные замены любого аминокислотного остатка могут привести к значительным изменениям в структуре белка Ь1, для выявления таких изменений необходимо было получить кристаллы и определить пространственные структуры соответствующих мутантных форм. Наибольший интерес представляют формы, потерявшие сродство к мРНК или к мРНК и рРНК одновременно. 2.3. Кристаллизация мутантных форм белка Ы.

Для кристаллизации были выбраны белки М]аЬ 1, содержащие замены 01и27А1а, ТЬг204РЬе, ТЬг204А1а, С1и27А1аЛЪг204А1а, Ме1205Авр, и ТМЛ с заменами РЬе371е, 8ег211А1а, ТЬг217А1а.

Кристаллизация велась методом диффузии паров в висячей капле при 6 °С (мутантные формы М]аЫ) и 22 °С (мутантные формы НЫЛ). В случае мутантных форм белка М]а1Л капля содержала 3 мкл раствора белка (18мг/мл) в какодилате № (рН=7.5), 1.5

мкл преципитирующего раствора и 1 мкл 15% МПД. Преципитирующий раствор содержал 6-10% ПЭГ 10т или 8т, 22% ММЕПЭГ 5т, 0.012% МПД рН 7.0-8.5. Противорасгвор состоял из 33% ПЭГ 10т, 0.1М НереБ/ШОН, рН 7.5 Кристаллы появлялись через 2-3 дня и росли до максимального размера 0 3 мм х 0.2 мм х 0.1 мм в течение 1 недели (рис.13). Кристаллы были очень нестабильны в различных сохраняющих растворах, поэтому мы их фиксировали в парах 0.25% раствора глутарового альдегида. Такие кристаллы были успешно использованы для сбора дифракционных данных. Перед заморозкой в жидком азоте кристаллы мутантных форм белка MjaLl переносили в раствор 21 % бутан-2,3-диола, 1.5 % ПЭГ 10т., 50 тМ Нерев/КаОН, рН 7.5.

Tthl 1 с заменой Thr217Ala(1.45 А)

MjaL1 с заменой Glu27Ala (2.1 A) MjaUc заменой Thr204Ala (2.0 А)

MjaL1 с заменой Thr204Phe (2.0 A) MiaL1 с заменами

Glu27Ala/Thr204Ala (2.1 А)

MjaL1 с заменой Met205Asp (2.8 A) MjaL1 с заменой Ser211 Ala (1 5 А)

Рис 13: Кристаллы мутантных форм белка L1

Мутантные формы белка ТМЛ диализовали против раствора, содержащего 30% сульфата аммония, ЮОмМ Иу/ИаОН (рН 10.0) и 5% МПД. Капли содержали 9 мкл раствора белка (12 мг/мл) и 1мкл 10 мМ Противораствор состоял из 60% сульфата аммония и 6% МПД. Кристаллы появлялись через 3-4 дня и вырастали до максимального размера 0.4х0.3х0.2мМ в течение недели (рис. 13). Перед замораживанием в жидком азоте кристаллы были перенесены в 1фиораствор, содержащий 30% глюкозы и 60% сульфата аммония.

Наборы дифракционных данных с этих кристаллов были собраны на синхротроне Безу в Гамбурге (Германия). Все кристаллы сохранили пространственную группу, к которой принадлежал белок дикого типа, и параметры его элементарной ячейки. Структуры некоторых мутантных форм белка Ы определены и уточнены с высоким разрешением. Анализ решенных структур показал, что, как мы и планировали, в большинстве случаев замены привели к локальным изменениям в структуре поверхности узнающего модуля, не оказав влияния на конформацию белка в целом.

выводы

1. Получены пригодные к рентгеноструктурному анализу кристаллы комплекса рибосомного белка М]аЬ1 с фрагментом его мРНК, и двух комплексов рибосомного белка ПЫЛ с разными по длине фрагментами архейной мРНК, кодирующей белок Муа Ы.

2. Определены пространственные структуры комплекса М]аЫ-мРНКм|аи с разрешением 3.4 А и комплекса ТЙ1Ы-мРНКМул1 с разрешением 2.6 А (совместно с группой структурных исследований рибосомных белков).

3. Получены мутантные формы белков MjaLl и "МЫ с заменами аминокислотных остатков, вовлеченных в РНК-белковые взаимодействия, и измерены константы связывания этих белков с мРНКирРНК.

Подтверждено выдвинутое ранее предположение о ключевой роли кластера консервативных аминокислотных остатков первого домена белка Ы в специфическом связывании с РНК.

Подтверждены выводы, сделанные из сравнительного анализа структур комплексов 1Л-рРНК и Ы-мРНК, об определяющей роли домена II белка Ы в обеспечении повышенного сродства этого белка к рРНК по сравнению с его сродством к мРНК.

4. Получены кристаллы ряда мутантных форм белка Ы, что позволило определить пространственные структуры пяти из этих мутантных белков.

Показано, что замены полярных остатков на аланин не приводят к значительным изменениям рельефа поверхности белка Ы, контактирующей с РНК.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Nevskaya N., Tishchenko S., Gabdoulkhakov A., Nikonova E., Nikonov O., Nikulin A., Platonova O., Garber M., Nikonov S., Piendl W. Ribosomal protein LI recognizes the same specific structural motif in its target sites on the autoregulatory mRNA and 23S rRNA. Nucleic Acids Res. 2005, 33(2):478-85.

2. Nevskaya N, Tishchenko S, Volchkov S, Kljashtorny V, Nikonova E, Nikonov O, Nikulin A, Kohrer C, Piendl W, Zimmermann R, Stocldey P, Garber M and Nikonov S. New insight into the interaction of ribosomal protein LI with RNA. JMB 2006, 355: 747-59.

3. Nikonova E.Yu., Tishchenko S.V., Piendl W., and Garber M.B. Crystallization of LI-mRNA complexes. Conference for young scientists, PhD students and students on molecular biology and genetics, dedicated to the golden jubilee of the double helix of the DNA and 30 anniversary of the Institute of molecular biology and genetics NAS of Ukraine, Kyiv, Ukraine, 2003. Abstracts, p. 185.

4. Никонова Е.Ю., Платонова О.Б., Пиндл В., Невская Н.А., Никонов С.В., Гарбер М.Б. Влияние мутаций в белке L1 из Methanococcus jannaschii на его сродство к рибосомным РНК. XVI зимняя молодежная научная школа, Москва, Россия, 2004. Тезисы докладов и стендовых сообщений, стр. 35.

5. Никонова Е.Ю., Платонова О.Б., Тищенко С.В., Пиндл В., Гарбер М.Б. Кристаллизация комплексов рибосомного белка L1 со специфическими фрагментами мРНК. 8-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых, Пущино, Россия, 2004. Сборник тезисов, стр.23.

6. Никонова Е.Ю., Тищенко С.В., Костарева О.С., Никулин А.Д., Пиндл В., Гарбер М.Б. Кристаллизация регуляторных комплексов белка L1 с мРНК. XVII зимняя молодежная научная школа, Москва, Россия, 2005. Тезисы докладов, стр. 12.

7. Волчков С.А., Кляпггорный В.Г., Никонов О.С., Тшценко С.В., Костарева О.С., Никонова Е.Ю., Гарбер М.Б. Структура комплекса рибосомного белка L1 из Thermus thermophilus со специфическим фрагментом мРНК из Methanococcus vannielii. XVII зимняя молодежная научная школа, Москва, Россия, 2005. Тезисы стендовых сообщений, стр. 36.

8. Волчков С.А., Кляпггорный В.Г., Тищенко С.В., Костарева О.С., Никонова Е.Ю., Невская Н.А., Никонов С.В. Выделение функционально значимых сайтов на поверхности комплекса Ll-мРНК. 9-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых, Пущино, Россия, 2005. Сборник тезисов, стр.13.

9. Никонова Е.Ю., Тищенко С.В., Пиндл В., Гарбер М.Б. Влияние аминокислотных замен в белке L1 на его сродство к фрагментам рРНК и мРНК. 9-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых, Пущино, Россия, 2005. Сборник тезисов, стр.42.

10. Е. Nikonova, N. Nevskaya, S. Tishchenko, S.Volchkov, V. Klyashtornii, O. Nikonov, A. Nikulin, O. Platonova, W. Pindl, R. Zimmermann, M.Garber, S. Nikonov. Ribosomal protein LI recognizes the same specific structural motif in its assembly site on 23 S rRNA. Murnau, Germany, 2005. Abstracts, p. 58.

11. Волчков C.A., Кляшторный В.Г., Никонов O.C., Тищенко С.В., Костарева О.С., Никонова Е.Ю., Невская Н.А., Никонов С.В., Гарбер М.Б. Изучение РНК-связывающих свойств рибосомного белка L1. Структурные аспекты регуляции трансляции. XVIII зимняя молодежная научная школа, Москва, Россия, 2006. Тезисы докладов, стр. 6.

к исполнению 13/04/2006 Исполнено 17/04/2006

Заказ № 267 Тираж: 100 экз

ООО «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 Москва, Варшавское ш., 36 (495) 975-78-56 (495) 747-64-70 www autoreferat ru

AûPàï.

IvJf !

i

p - 8 в 31

i

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Никонова, Екатерина Юрьевна

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.КТУРНЫЕ АСПЕКТЫ ОПЕРОН СПЕЦИФИЧЕСКОЙ РЕГУЛЯЦИИ СИНТЕЗА РИБОСОМНЫХ БЕЛКОВ.

Введение.

Rps А оперон.

-оперон. str оперон. spc оперон.

S15(rpsO) оперон.

L1/LU оперон.

S10 оперон.

LIO (rplJL) оперон.

L20 оперон.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Никонова, Екатерина Юрьевна

выводы

1. Получены пригодные к рентгеноструктурному анализу кристаллы комплекса рибосомного белка М]аЬ1 с фрагментом его мРНК, и двух комплексов рибосомного белка ТЧЫЛ с разными по длине фрагментами архейной мРНК, кодирующей белок Муа Ы.

2. Определены пространственные структуры комплекса муаЫ-мРНК^аи с разрешением 3.4 и комплекса ТЧЫЛ-мРНКмуаы с разрешением 2.6 (совместно с группой структурных исследований рибосомных белков).

3. Получены мутантные формы белков М]а1Л и ТЧЫЛ с заменами аминокислотных остатков, вовлеченных в РНК-белковые взаимодействия, и измерены константы связывания этих белков с мРНК и рРНК. Подтверждено выдвинутое ранее предположение о ключевой роли кластера консервативных аминокислотных остатков первого домена белка Ы в специфическом связывании с РНК.

Подтверждены выводы, сделанные из сравнительного анализа структур комплексов Ы-рРНК и Ы-мРНК, об определяющей роли домена II белка Ы в обеспечении повышенного сродства этого белка к рРНК по сравнению с его сродством к мРНК.

4. Получены кристаллы ряда мутантных форм белка Ь1, что позволило определить пространственные структуры пяти из этих мутантных белков.

Показано, что замены полярных остатков на аланин не приводят к значительным изменениям рельефа поверхности белка Ь1, контактирующей с РНК.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Никонова, Екатерина Юрьевна, Пущино

1. Agalarov S.C., Sridhar Prasad G., Funke P.M., Stout C.D. & Williamson J.R. (2000). Structure of the S15, S6, S18-rRNA complex: assembly of the 30S ribosome central domain. Science, 288, 107-113.

2. Agrawal R.K., Spahn C.M., Penczek P., Grassucci R.A., Nierhaus K.H., Frank J. (2000) Visualization of tRNA movements on the Escherichia coli 70S ribosome during the elongation cycle. J Cell Biol. 150(3), 447-60.

3. Allen T., Shen P., Samsel L., Liu R., Lindahl L. and Zengel J.M. (1999) Phylogenetic analysis of L4-mediated autogenous control of the S10 ribosomal protein operon. J. Bacteriol., 181, 61246132.

4. Allmang C., Mougel M., Westhof E., Ehresmann B. & Ehresmann C. (1994). Role of conserved nucleotides in building the 16S rRNA binding site of E. coli ribosomal protein S8. Nucl. Acids Res. 22, 3708-3714.

5. Baier G., Hohenwarter O., Hofbauer C., Hummel H., Stoffler-Mailicke M. & Stoffler G. (1989) Syst. Appl. Microbiol. 12, 119-126.

6. Ban N., Nissen P., Hansen, J., Moore P.B. and Steitz T.A. (2000) The complete atomic structure of the large ribosomal subunit at 2.4 A resolution. Science, 289, 905-920.

7. Batey R.T. and Williamson J.R. (1996) Interaction of the Bacillus stearothermophilus ribosomal protein S15 with 16 S rRNA: II. Specificity determinants of RNA-protein recognition. J. Mol. Biol., 261, 536-549.

8. Baughman G., and Nomura M. (1983) Localization of the target site for translational regulation of the Lll operon and direct evidence for translational coupling in Escherichia coli. Cell 34, 979-988.

9. Benard L., Philippe C., Dondon L., Grunberg-Manago M., Ehresmann B., Ehresmann C. and Portier C. (1994) Mutational analysis of the pseudoknot structure of the S15 translational operator from Escherichia coli. Mol. Microbiol., 14, 31-40.

10. Benard L., Mathy N., Grunberg-Manago M., Ehresmann B., Ehresmann C. and Portier C. (1998) Identification in a pseudoknot of a U.G motif essential for the regulation of the expression of ribosomal protein SI 5. Proc. Natl Acad. Sci. USA, 95,2564-2567.

11. Berkhout B., van Duin J. (1985) Mechanism of translational coupling between coat protein and replicase genes of RNA bacteriophage MS2. Nucl. Acids Res. 13, 6955-6967.

12. Boni I., Zlankin I.V., and Budowsky E.I. 1982. Ribosomal protein SI associates with Escherichia coli ribosomal 30S subunit by means of protein-protein interactions. EurJ.Biochem. 121,371-376.

13. Boni IV, Issaeva DM, Musychenko ML, Tzareva NV (1991) Ribosome-messenger recognition: mRNA target sites for ribosomal protein SI. Nucleic Acids Res 19,155-162.

14. Boni IV, Artamonova VS, Dreyfus M. (2000) The last RNA-binding repeat of the Escherichia coli ribosomal protein SI is specifically involved in autogenous control. J Bacteriol. 182(20), 5872-9.

15. Boni IV, Artamonova VS, Tzareva NV, Dreyfus M. (2001) Non-canonical mechanism for translational control in bacteria: synthesis of ribosomal protein SI. EMBOJ. 20(15), 422232.

16. Boynton J.E., Gillham N.W., Harris E., Hosier A.M., Johnson Hosaka, H., Nakagawa A., Tanaka I., Harada N., Sano K.,Kimura M., Yao M., and Wakatsuki S. (1997). Structure 5, 11991208.

17. Brodersen D. E., Clemons Jr, W.M., Carter A.P., Wimberly B.T., and Ramakrishnan

18. V. (2002) Crystal structure of the 30 S ribosomal subunit from Thermus thermophilus: structure of the proteins and their interactions with 16 S RNA. J.Mol. Biol. 316, 725-768.

19. Brot N., Caldwell P., and Weissbach H. (1980) Autogenous control of Escherichia coli ribosomal protein L10 synthesis in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 77, 2592-2595.

20. Brot, N., Caldwell, P., and Weissbach, H. (1981) Regulation of synthesis of Escherichia coli ribosomal proteins LI and LI 1. Arch. Biochem. Biophys. 206, 51-53.

21. Butler JS, Springer M, Dondon J, Graffe M, Grunberg-Manago M (1986) Escherichia coli protein synthesis initiation factor IF3 controls its own gene expression at the translational level in vivo. JMolBiol 192, 767-780.

22. Bycroft M., T. J. P. Hubbard, M. Proctor, S. M. V. Freund, and A. G.Murzin. (1997) The solution structure of th SI RNA binding domain: a member o an ancient nucleic acid-binding fold. Cell 88, 235-242.

23. Calogero RA, Pon CL, Canonaco MA, Gualerzi CO (1988) Selection of the mRNA translation initiation region by Escherichia coliribosomes. Proc Natl Acad Sci USA 85, 6427-6431.

24. Capel M.S. et al. (1987) A complete mapping of the proteins in the small ribosomal subunit of Escherichia coli. Science, 238, 1403-1406.

25. Cate J. H., Yusupov M. M., Yusupova G. Z., Earnest T. N. & Noller H. F. (1999). X-ray crystal structures of 70S ribosome functional complexes. Science 285, 2095-2104.

26. Ceretti D. P., Mattheakis L. C., Kearney K. R., Vu L. & Nomura M. (1988). Translational regulation of the spc operon in Escherichia coli. Identification and structural analysis of the target site for S8 repressor protein. J. Mol. Biol. 204,309-329.

27. Chiaruttini C, Milet M, Springer M (1996) A long-range RNA-RNA interaction forms a pseudoknot required for translational control of the IF3-L35-L20 ribosomal protein operon in Escherichia coli. EMBOJ15, 4402-4413.

28. Changchien L. M., and Craven G. R. (1976) The function of the N-terminal region of ribosomal protein S4. J. Mol. Biol. 108, 381-401.

29. Chothia C., and Janin J. 1975. Principles of protein-protein recognition. Nature 256, 705-708.

30. Christensen T., Johnsen M., Fiil N.P., Friesen J.D. (1984) RNA secondary structure and translation inhibition: analysis of mutants in the rplJ leader. EMBOJ. 3,1609-1612.

31. Climie S. C., and Friesen J. D. (1987) Feedback regulation of the rplJL-rpoBC ribosomal protein operon of Escherichia coli requires a region of mRNA secondary structure. J. Mol. Biol. 198,371-381.

32. Cormack R. S. and Mackie G. A. (1991) Mapping ribosomal protein S20-16 S rRNA interactions by mutagenesis. JBC. 266, 18525-9.

33. Davis C., Ramakrishnan V. & White S. W. (1996). Structural evidence for specific S8-RNA and S8-protein interactions within the 30S ribosomal subunit: ribosomal protein S8 from Bacillus stearothermophilus at 1.9 A resolution. Structure, 4, 1093-1104.

34. Dean D. and Nomura M. (1980) Feedback regulation of ribosomal protein gene expression in Escherichia coli. Natl Acad. Sci. USA, 11, 3590-3594.

35. Deckman I. C., Draper D. E., and Thomas M. S. (1987) S4-alpha mRNA translation repression complex. I. Thermodynamics of formation. J. Mol. Biol. 196,313-322.

36. Dennis P. P., and Fiil N. P. (1979) Transcriptional and post-transcriptional control of RNA polymerase and ribosomal protein genes cloned on composite ColEl plasmids in the bacterium Escherichia coli. J. Biol. Chem. 254, 7540-7547.

37. Douthwaite S., Christensen A., and Garrett R. A. (1982) Binding site of ribosomal proteins on prokaryotic 5S ribonucleic acids: a study with ribonucleases. Biochem istry 21, 2313-2320.

38. Dragon F, Brakier-Gingras L (1993) Interaction of Escherichia coli ribosomal protein S7 with 16S rRNA. Nucleic Acids Res 21, 1199-1203.

39. Dragon F, Payant C, Brakier-Gingras L (1994) Mutational and structural analysis of the RNA binding site for Escherichia coli ribosomal protein S7. J Mol Biol 244, 74-85.

40. Draper D.E., Hippel P.H.(1978) Nucleic acid binding properties of Escherichia coli ribosomal protein SI. II. Co-operativity and specificity of binding site II. J Mol Biol 122,339-359.

41. Draper D.E. (1989) How do proteins recognize specific RNA sites? New clues from autogenously regulated ribosomal proteins. Trends Biochem. Sei., 14, 335-338.

42. Draper D. E. (1996) in Escherichia coli and Salmonella typhimurium: Cellularand Molecular Biology (Neidhardt, F. C., ed) pp. 902-908, American Society for Microbiology, Washington, D. C.

43. Draper D.E., Gluick TC, Schlax PJ (1998) in: The RNA Structure and Function (Simons RW, Grunberg-Manago M., Eds.), pp. 415-436, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY.

44. Draper D.E. (1999) Themes in RNA-protein recognition. J Mol Biol 293, 255-270.

45. Draper D.E., Reynaldo L.P.(1999) RNA binding strategies of ribosomal proteins. Nucleic Acids Res 27, 381-388.

46. Dunn JJ, Buzash-Pollert E, Studier FW. (1978) Mutations of bacteriophage T7 that affect initiation of synthesis of the gene 0.3 protein. Proc Natl Acad Sei U SA. 75(6), 2741-5.

47. Ehresmann C., Stiegler P., Carbon P., Ungewickell E. and Garrett R.A. (1977) FEBS Lett., 81, 188-192.

48. Ehresmann C., Stiegler P., Carbon P., Ungewickell E., and Garrett R. A. (1980) Eur. J . Biochem. 103, 439-446.

49. Egebjerg J., Christiansen J. and Garret R.A. (1991) Attachment sites of primary binding proteins LI, L2 and L23 on 23S ribosomal RNA of Escherichia coli. J.Mol.Biol., 222, 251-264.

50. Fiil N. P., Friesen J. D., Downing W. L., and Dennis P. P. (1980) ost-transcriptional regulatory mutants in a ribosomal protein-RNA polymerase Operon of E. coli. Cell 19,837-844.

51. Fredrick K., Dunny G. M., and Noller H. F. (2000) Tagging ribosomal protein S7 allows rapid identification of mutants defective in assembly and function of 30 S subunits. J. Mol. Biol. 298, 379-394.

52. Freedman L.P., Zengel J.M., Archer R.H. and Lindahl L. (1987) Autogenous control of the S10 ribosomal protein operon of Escherichia coli: genetic dissection of transcriptional and posttranscriptional regulation. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84, 6516-6520.

53. Friesen J. D., Tropak M., and An G. (1983) Mutations in the rpIJ leader of Escherichia coli that abolish feedback regulation. Cell 32, 361-369.

54. Fukuda R. (1980) Autogenous regulation of the synthesis of ribosomal proteins, L10 and L7/12, in Escherichia coli. Mol. Gen. Genet. 178,483-486.

55. Gausing K. (1974) Ribosomal protein in E. coli: rate of synthesis and pool size at different growth rates. Mol. Gen. Genet. 129, 61-75.

56. Geyl D., and A. Bock. (1977) Cold-sensitive growth of a mutant of Escherichia coli with an altered ribosomal protein S8: analysis of revertants. Mol.Gen. Genet. 154, 327-334.

57. Gerstner R. B., Pak Y., and Draper D. E. (2001) Recognition of 16S rRNA by ribosomal protein S4 from Bacillus stearothermophilus. Biochemistry 40, 7165-7173.

58. Gluick T. C., Gerstner R. G., and Draper D. E. (1997) Effects of Mg2+, K+, and H+ on an equilibrium between alternative conformations of an RNA pseudoknot. J. Mol. Biol. 270, 451-463.

59. Gold L (1988) Posttranscriptional regulatory mechanisms in Escherichia coli. Annu Rev Biochem 57,199-233.

60. Gourse RL, Thurlow DL, Gerbi SA & Zimmermenn RA. (1981) Specific binding of a procaryot ribosomal protein to an eukaryotic ribosomal RNA: Implications for evolution and autoregulation. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 78, 2722-2726.

61. Gregory R. J. & Zimmermann R. A. (1986) ite-directed mutagenesis of the binding site for ribosomal protein S8 within 16S ribosomal RNA from Escherichia coli. Nucl. Acids Res. 14, 5761-5776.

62. Gregory R. J., Cahill P. B. F., Thurlow D. L. & Zimmermann R. A. (1988). Interaction of Escherichia coli ribosomal protein S8 with its binding sites in ribosomal RNA and messenger RNA. J. Mol. Biol. 204, 295-307.

63. Greuer B., Thiede B., and Brimacombe R. (1999) The cross-link from the upstream region of mRNA to ribosomal protein S7 is located in the C-terminal peptide: experimental verification of a prediction from modeling studies. RNA 5, 1521-1525.

64. Gutell R. R. (1994) Collection of small subunit (16S- and 16S-like) ribosomal RNA structures: 1994. Nucleic Acids Res. 22, 3502-3507.

65. Hanner M., Mayer C., Köhrer C., Golderer G., Gröbner P., Piendl W. (1994) Autogenous translational regulation of the ribosomal MvaLl operon in the archaebacterium Methanococcus vannielii. J. Bacteriol., 176, 409-418.

66. Hartz D., McPheeters D.S., Traut R., Gold L. (1988) Extension inhibition analysis of translation initiation complexes. Methods Enzymol. 164, 419-25.

67. Harms J, Schiuenzen F, Zarivach R, Bashan A, Gat S, Agmon I, Bartels H, Franceschi F,

68. Yonath A (2001) High resolution structure of the large ribosomal subunit from a mesophilic eubacterium. Cell 107,679-688.

69. Held W. A., and Nomura M. (1973) Rate determining step in the reconstitution of Escherichia coli 30S ribosomal subunits. Biochemistry 12, 3273-3281.

70. Held W.A., Ballou B., Mizushima S. and Nomura M. (1974) Assembly mapping of 30 S ribosomal proteins from Escherichia coli. Further studies. J. Biol. Chem. 249,3103-3111.

71. Henkin T.M., Moon S.H., Mattheakis L.C. and Nomura M. 1989. Cloning and analysis of the spc ribosomal protein operon of Bacillus subtilis: comparison with the spc operon of Escherichia coli. Nucleic Acids Res. 17, 7469-7486.

72. Ho S.N., Hunt H.D., Horton R.M., Pullen J.K., and Pease L.R. (1989) Site-directed mutagenesis by overlap extension using the polymerase chain reaction. Gene, 77,51-59.

73. Holowachuk E. W., Friesen J. D., and Fiil N. P. (1980) Bacteriophage lambda vehicle for the direct cloning of Escherichia coli promoter DNA sequences: feedback regulation of the rplJL-rpoBC operon. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 77,2124-2128.

74. Hui A., J. Hayflick, K. Dinkeispiel, and H. A. DeBoer. (1984) Mutagenesis of the three bases preceding the start codon of the beta-galactosidase mRNA and its effect on translation in Escherichia coli. EMBO J. 3,623-629.

75. Huttenhofer A. and Noller H.F. (1994) Footprinting mRNA-ribosome complexes with chemical probes. EMBO J13, 3892-3901.

76. Jacobson A.B., Good L., Simonetti J &Zuker M. (1984) Some simple computational methods to improve the folding of large RNAs. Nucl. Acids Res. 12,45-52.

77. Jinks-Robertson S, Nomura M. (1982) Ribosomal protein S4 acts in trans as a translational repressor to regulate expression of the alpha operon in Escherichia coli. Bacteriol. 151(1), 193-202.

78. Johnsen M., Christensen T., Dennis P. P., and Fiil N. P. (1982) Autogenous control: ribosomal protein L10-L12 complex binds to the leader sequence of its mRNA. EMBO J. 1, 9991004.

79. Kamen R., Kondo M., Rommer W. Amd Weussman C. (1972) Recognition of QB replicase kacking subunit a with protein-synthesis-interference factor i. Eur. J. Biochem3\, 44-51.

80. Komarova A. V., Tchufistova L. S., Supina E. V.,and Boni I. V. (2002) Protein SI counteracts the inhibitory effect of the extended Shine-Dalgarno sequence on translation. RNA 8,113741147.

81. Mackie G. A. (1981) Nucleotide sequence of the gene for ribosomal protein S20 and its flanking regions. J. Biol. Chem. 256, 8177-8182.

82. Markus M. A., Gerstner R. B., Draper D. E., and Torchia D. A. (1998) The solution structure of ribosomal protein S4 delta41 reveals two subdomains and a positively charged surface that may interact with RNA. EMBOJ. 17, 4559-4571.

83. Maseda H. and Hoshino T. (1995) Screening and analysis of DNA fragments that show promoter activities in Thermus thermophilus. FEMS Microbiol. Lett. 128, 127-134.

84. Mattheakis L., and Nomura M. (1988) Feedback regulation of the spc operon in Escherichia coli: translational coupling and mRNA processing. JBacteriol. 170, 4482-4492.

85. Mattheakis L., Vu L., Sor F., and Nomura M. (1989) Retroregulation of the synthesis of ribosomal proteins L14 and L24 by feedback repressor S8 in Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86, 448-452.

86. Merianos H. J., Wang J., and Moore P. B. (2004) The structure of a ribosomal protein S8/spc operon mRNA complex. RNA 10, 954-964

87. Miyamoto A, Usui M, Yamasaki N, Yamada N, Kuwano E, Tanaka I, Kimura, M (1999) Eur J Biochem 266, 591-598.

88. Mizushima S. & Nomura M. (1970) Assembly mapping of 30S ribosomal proteins from E. coli. Nature 226, 1214-1218.

89. Mogridge J., Mah T.-F. and Greenblatt J. (1995) A protein-RNA interaction network facilitates the template-independent cooperative assembly on RNA polymerase of a stable antitermination complex containing the lambda N protein. Genes & Dev. 9, 2831-2844.

90. Moine H., Cachia C., Westhof E., Ehresmann B. & Ehresmann C. (1997) The RNA binding site of S8 ribosomal protein of Escherichia coli: Selex and hydroxyl radical probing studies. RNA, 3, 255-268.

91. Mougel M., Ehresmann B. & Ehresmann C. (1986) Binding of Escherichia coli ribosomal protein S8 to 16S rRNA: kinetic and thermodynamic characterization. Biochemistry 25, 2756-2765.

92. Mougel M., Allmang C., Eyermann F., Cachia C., Ehresmann B. & Ehresmann C. (1993) Minimal 16S rRNA binding site and role of conserved nucleotides in Escherichia coli ribosomal protein S8 recognition. Eur. J. Biochem. 215, 787-792.

93. Müller E. and Wittmann-Liebold B. (1997) Phylogenetic relationship of organisms obtained by ribosomal protein comparison. Cell. Mol. Life Sei., 53, 34-50.

94. Mueller F, Brimacombe R (1997) A new model for the three-dimensional folding of Escherichia coli 16 S ribosomal RNA. II. The RNA-protein interaction data. J Mol Biol. 271:545-565.

95. Nevskaya N., Tishchenko S., Fedorov R., Al-Karadaghi S., Lilyas A., Kraft A., Piendl W., Garber M., Nikonov S. (2000) Archaeal ribosomal protein LI: the structure provides new insights into RNA binding of the LI protein family. Structure. 8, 363-371.

96. Nikulin A., Serganov A., Ennifar E., Tishchenko S., Nevskaya N., Shepard W. et al. (2000) Crystal structure of the S15-rRNA complex. Nature Struct. Biol. 1, 273-277.

97. Nikulin A., Eliseikina I., Tishchenko S., Nevskaya N., Davydova N., Platonova O. , Piendl W., Selmer M., Liljas A., Drygin D., Zimmermann R., Garber M., Nikonov S. (2003) Structure of the LI protuberance in the ribosome. Nature Str. Biol., 10, 104-108.

98. Nomura M. (1973) Assembly of bacterial ribosomes. Science 179, 864-873.

99. Nomura M. and Held W.A. (1974) Ribosomes. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, pp. 193-224.

100. Nomura M., Yates J.L., Dean D. and Post L.E. (1980) Feedback regulation of ribosomal protein gene expression in Escherichia coli: structural homology of ribosomal RNA and ribosomal protein MRNA. Proc. Natl Acad. Sci. USA, 77, 7084-7088.

101. Nowotny V., and Nierhaus K. H. (1988) Assembly of the 30S subunit from Escherichia coli ribosomes occurs via two assembly domains which are initiated by S4 and S7. Biochemistry 27, 7051-7055.

102. Olsson MO, Isaksson LA. (1979) Analysis of rpsD mutations in Escherichia coli. I. Comparison of mutants with various alterations in ribosomal protein S4. Mol Gen Genet. 169(3), 251-7.

103. Orengo CA, Thornton JM. (1993) Alpha plus beta folds revisited: some favored motifs. Structure 1, 105-120.

104. Parsons G. D., and G. A. Mackie. (1983) Expression of the gene for ribosomal protein S20: effects of gene dosage. J. Bacteriol. 154, 152-160.

105. Parsons G. D., Donly B.C., and Mackie G. A. (1988) Mutations in the leader sequence and initiation codon of the gene for ribosomal protein S20 (rpsT) affect both translational efficiency and autoregulation. J. Bacteriol. 170, 2485-92.

106. Peattie D. A., Douthwaite S., Garrett R. A., and Noller H. F. (1981) A "bulged" double helix in a RNA-protein contact site. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1 6, 1697-1701.

107. Pfeiffer T., Jorcke D., Feltens R. and Hartmann R.K. (1995) Direct linkage of str-, S10- and spc-related gene clusters in Thermus thermophilus HB8, and sequences of ribosomal proteins L4 and S10. Gene, 167,141-145.

108. Philippe C., Portier C., Mougel M., Grunberg-Manago M., Ebel J.P., Ehresmann B. and Ehresmann C. (1990) Target site of Escherichia coli ribosomal protein S15 on its messenger RNA. Conformation and interaction with the protein. J. Mol. Biol., 211,415426.

109. Philippe C., Benard L., Portier C., Westhof E., Ehresmann B. and Ehresmann C. (1995) Molecular dissection of the pseudoknot governing the translational regulation of Escherichia coli ribosomal protein S15. Nucleic Acids Res., 23, 18-28.

110. Portier C., Dondon L., Grunberg-Manago M. (1990) Target site of Escherichia coli ribosomal protein S15 on its messenger RNA. Conformation and interaction with the protein. J. Mol. Biol. 211,407-414.

111. Powers T, Noller HF (1995) Hydroxyl radical footprinting of ribosomal proteins on 16S rRNA. RNA 1, 194-209.

112. Raibaud S, Vachette P., Guillier M., Fre'de' ric Allemand, Chiaruttini C., and Fre'de' ric Dardel (2003) How bacterial ribosomal protein L20 assembles with 23 S ribosomal RNA and its own messenger RNA. J Biol. Chem. 278, 36522-36530.

113. Ramyrez C., Kopke A. K. E., Yang D. C., Boeckh T. & Matheson A. T. (1993). The Biochemistry of Archaea Archaebacteria) (Kates, M., Kushner, D. J. & Matheson, A. T., eds), pp. 439-466, Elsevier, Amsterdam.

114. Rasmussen M. D., Sorensen M. A., and Pedersen S. (1993) Isolation and characterization of mutants with impaired regulation of rpsA, the gene encoding ribosomal protein SI of Escherichia coli. Mol. Gen. Genet. 240,23-28.

115. Ringquist S, Shinedling S, Barrick D, Green L, Binkley J, Stormo GD, Gold L (1992) Translation initiation in Escherichia coli: Sequences within the ribosome-binding site+ Mol Microbiol 6, 1219-1229.

116. Ringquist S, Jones T, Snyder E, Gibson T, Boni I, Gold L (1995) High-affinity RNA ligands to Escherichia coliribosomes and ribosomal protein SI: Comparison of natural and unnatural binding sites. Biochemistry 34, 3640-3648.

117. Robert F., Gagnon M., Sans D., Michnick S., and Brakier-Gingras L. (2000) Mapping of the RNA recognition site of Escherichia coli ribosomal protein S7. RNA 6,1649-1659.

118. Robert F., and Brakier-Gingras L. (2001) Ribosomal protein S7 from Escherichia coli uses the same determinants to bind 16S ribosomal RNA and its messenger RNA. Nucleic Acids Res. 29, 677-682.

119. Rossmann MG, Liljas A, Branden C-I, Banaszak LJ. (1975) The Enzymes XI 62-102. Academic Press, New York, NY.

120. Said B., Cole J.R. and Nomura M. (1988) Mutational analysis of the LI binding site of 23S rRNA in Escherichia coli. NAR 16(22), 10529-10545.

121. Saito K, Mattheakis LC, Nomura M (1994) Post-transcriptional regulation of the str operon in Escherichia coli. Ribosomal protein S7 inhibits coupled translation of S7 but not its independent translation. J Mol Biol 235, 111-124.

122. Saito K, Nomura M (1994) Post-transcriptional regulation of the str operon in Escherichia coli. Structural and mutational analysis of the target site for translational repressor S7. J Mol Biol 235,125-139.

123. Sayers E. W., Gerstner R. B., Draper D. E., and Torchia D. A. (2000) Structural preordering in the N-terminal region of ribosomal protein S4 revealed by heteronuclear NMR spectroscopy. Biochemistry 39, 13602-13613.

124. Schlax P. J., Xavier K. A., Gluick T. C., and Draper D. E. (2001) Translational repression of the Escherichia coli alpha operon mRNA: importance of an mRNA conformational switch and a ternary entrapment complex. JBC 276, 38494-38501.

125. Schluenzen F., Tocilj A., Zarivach R., Harms J., Gluehmann M., Janell D.,

126. Bashan A., Bartels H., Agmon I., Franceschi F., and Yonath A. (2000) Structure of functionally activated small ribosomal subunit at 3.3 A resolution. Cell 102, 615-623.

127. Schluenzen F., Zarivach R., Harms J., Bashan A., Tocilj A., Albrecht R., Yonath A. and Franceschi F. (2001) Structural basis for the interaction of antibiotics with the peptidyl transferase centre in eubacteria. Nature, 413, 814-821.

128. Schulte C. & Garrett R. A. (1972) Optimal conditions for the interaction of ribosomal protein S8 and 16S RNA and studies on the reaction mechanism. Mol. Gen. Genet. 119, 345-355.

129. Schwarzbauer J. and Craven G.R. (1981) Apparent association constants for E. coli ribosomal proteins S4, S7, S8, SI5, S17 and S20 binding to 16S RNA. Nucl. Acids Res. 9, 2223-37.

130. Scott L.G. and Williamson J.R. (2001) nteraction of the Bacillus stearothermophilus ribosomal protein S15 with its 5'-translational operator mRNA. J. Mol. Biol., 314, 413-422.

131. Serganov A., Benard L., Portier C., Ennifar E., Garber M., Ehresmann B. and Ehresmann C.2001) Role of conserved nucleotides in building the 16 S rRNA binding site for ribosomal protein S15. J. Mol. Biol., 305, 785-803.

132. Serganov A., Polonskaia A., Ehresmann B., Ehresmann C. and Patel D. J. (2003) Ribosomal protein S15 represses its own translation via adaptation of an rRNA-like fold within its mRNA. EMBO J. 22, 1898-1908.

133. Sha Y., Lindahl L. and Zengel J.M. (1995a) RNA determinants required for L4-mediated attenuationcontrol of the S10 r-protein operon of Escherichia coli. J. Mol. Biol., 245,486-498.

134. Sha Y., Lindahl L. and Zengel J.M. (1995b) Role of NusA in L4-mediated attenuation control of the S10 r-protein operon of Escherichia coli. J. Mol. Biol., 245,474-485.

135. Shen P., Zengel J.M. and Lindahl L. (1988) Secondary structure of the leader transcript from the Escherichia coli S10 ribosomal protein operon. Nucleic Acids Res., 16, 8905-8924.

136. Shimmin L.C., Dennis P.P. (1989) Characterization of the Lll, LI, L10 and L12 equivalent ribosomal protein gene cluster of the halophilic archaebacterium Halobacterium cutirubrum. EMBO J. 8, 1252-1235.

137. Shine J, Dalgarno L (1974) The 39-terminal sequence of E. colil6S ribosomal RNA: Complementarity to nonsense triplets and ribosome binding sites. Proc Natl Acad Sci USA 71, 1342-1346.

138. Skouv J., J. Schnier, M. D. Rasmussen, A. R. Subramanian, and S. Pedersen. (1990) Ribosomal protein SI of Escherichia coli is the effector for the regulation of its own synthesis. J. Biol. Chem. 265, 17044-17049.

139. Spedding G. S., and Draper D. E. (1993) Allosteric mechanism for translational repression in the Escherichia coli alpha operon. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 90, 4399-4403.

140. Spedding G. S., Gluick T. C., and Draper D. E. (1993) Ribosome initiation complex formation with the pseudoknotted alpha operon messenger RNA. J. Mol. Biol. 229, 609-622.

141. Springer M. and Portier C. (2003) More than one way to skin a cat: translational autoregulation by ribosomal protein SI5. NAR 10,420-422.

142. Stelzl U., Spahn C.M.T. and Nierhaus K.H. (2000) Selecting rRNA binding sites for the ribosomal proteins L4 and L6 from randomly fragmented rRNA: application of a method called SERF. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97,4597-4602.

143. Stelzl U, Zengel JM, Tovbina M, Walker M, Nierhaus KH, Lindahl L, Patel DJ. (2003) RNA-structural mimicry in Escherichia coli ribosomal protein L4-dependent regulation of the S10 operon. J Biol Chem. 278(30), 28237-45.

144. Stern S., Wilson R. C., and Noller H. F. (1986) Localization of the binding site for protein S4 on 16 S ribosomal RNA by chemical and enzymatic probing and primer extension. J. Mol. Bwl. 192,101-110.

145. Stern S., Changchien, L.-M., Craven, G. R., and Noller, H. F. (1988) Interaction of proteins SI6, S17 and S20 with 16 S ribosomal RNA. J. Mol. Biol. 200,291-299.

146. Stoffler G. and Stoffler-Meilicke M. (1984) Immunoelectron microscopy of ribosomes. Annu. Rev. Biophys. Bioeng., 13, 303-330.

147. Stormo, G. D., T. D. Schneider, and L. Gold. (1982) Characterization of translational initiation sites in E. coli. Nucleic Acids Res. 10, 2971-2996.

148. Subramanian AR and van Duin. (1977) Exchange of individual ribosomal proteins between ribosomes as studied by heavy isotope-transfer experiments. Mol Gen Genet. 158(1), 1-9.

149. Subramanian AR (1983) Structure and functions of ribosomal protein SI. Prog Nucleic Acid Res Mol Biol 28, 101-142.

150. Suh J.-W., Boylan S.A., Oh S.-H., Price C.W. 1996. Genetic and transcriptional organization of the Bacillus subtilis spc-a region. Gene. 169,17-23.

151. Svensson P., Changchien L.-M., Craven G. R. & Noller H. (1988) Interaction of ribosomal proteins, S6, S8, SI5 and S18 with the central domain of 16 S ribosomal RNA. J. Mol. Biol. 200, 301-308.

152. Tang C. K., and Draper D. E. (1989) Unusual mRNA pseudoknot structure is recognized by a protein translational repressor. Cell 57, 531-536.

153. Tang C. K., and Draper D. E. (1990) Evidence for allosteric coupling between the ribosome and repressor binding sites of a translationally regulated mRNA. Biochemistry 29,4434-4439.

154. Thomas M., Bedwell D. M., and Nomura M. (1987) Regulation of alpha operon gene expression in Escherichia coli. A novel form of translational coupling. J. Mol. Biol. 196, 333-345.

155. Thurlow D. L., Ehresmann C., and Ehresmann B. (1983) Nucleotides in 16S rRNA that are required in unmodified form for features recognized by ribosomal protein S8. Nucleic Acids Res. 11, 6787-6802.

156. Traub P., and Nomura M. (1969) Structure and function of Escherichia coli ribosomes. VI. Mechanism of assembly of 30 s ribosomes studied in vitro. J. Mol. Biol. 40, 391-413.

157. Tumminia SJ, Hellmann W, Wall JS, Boublik M. (1994) Visualization of protein-nucleic acid interactions involved in the in vitro assembly of the Escherichia coli 50 S ribosomal subunit. J Mol Biol. 235(4), 1239-50.

158. Turner D.H. and Bevilacqua P.C. (1993) in: The RNA World (Gesteland, R.F. and Atkins, J.F., Eds.), pp. 447-464, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY.

159. Tzareva NV, Makhno VI, Boni IV (1994)Ribosome-messenger recognition in the absence of the Shine-Dalgarno interactions. FEBSLett. 337:189-194.

160. Vartikar J. V., and Draper D. E. (1989) S4-16 S ribosomal RNA complex. Binding constant measurements and specific recognition of a 460-nucleotide region. J. Mol. Biol. 209, 221234.

161. Williamson J.R. (2000) Induced fit in RNA-protein recognition. Nat. Struct. Biol., 7, 834-837.

162. Wimberly B.T., White S.W., and Ramakrishnan V. (1997) The structure of ribosomal protein S7 at 1.9 A resolution reveals a beta-hairpin motif that binds double-stranded nucleic acids. Structure 5, 1187-1198.

163. Wimberly B. T., Brodersen D. E., demons W. M., Jr. Morgan-Warren R. J., Carter A. P., Vonrhein C., Hartsch T., and Ramakrishnan V. (2000) Nature 407, 327-339.

164. Wirth, R., and A. Bock. (1980) Regulation of synthesis of ribosomal protein S20 in vitro. Mol. Gen. Genet. 178:479-481.

165. Wirth R., J. Littlechild and A. Bock. (1982) Ribosomal protein S20 purified under mild conditions almost completely inhibits its own translation. Mol. Gen. Genet. 188, 164-166.

166. Worbs M., Huber R. and Wahl M.C. (2000) Crystal structure of ribosomal protein L4 shows RNA-binding sites for ribosome incorporation and feedback control of the S10 operon. EMBOJ. 19, 807-818.

167. Wower I.K., Zwieb C.W., Gueven S.A., and Wower J. 2000. Binding and cross-linking of tmRNA to ribosomal protein SI, on and off the Escherichia coli ribosome. EMBO J. 19, 6612-6621.

168. Wyatt J.R. and Tinoco I. Jr. (1993) in: The RNA World (Gesteland, R.F. and Atkins, J.F., Eds.), pp. 465-496, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY.

169. Yates J.L. and Nomura M. (1980) E. coli ribosomal protein L4 is a feedback regulatory protein. Cell 21, 517-522.

170. Yates J.L., Arfsten A.E. and Nomura M. (1980) In vitro expression of Escherichia coli ribosomal protein genes: autogenous inhibition of translation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 1837-1841.

171. Yates J. L., Dean D., Strycharz W. A., and Nomura M. (1981) E. coli ribosomal protein L10 inhibits translation of L10 and L7/L12 mRNAs by acting at a single site. Nature 294, 190192.

172. Yusupov MM, Yusupova GZ, Baucom A, Lieberman K, Earnest TN, Cate JH, Noller HF. (2001) Crystal structure of the ribosome at 5.5 A resolution. Science. 292(5518), 883-96.

173. Yusupova G. Z., Yusupov M.M., Cate J.H.D., and Noller H.F. (2001) The path of messenger RNA through the ribosome. Cell 106,233-241.

174. Zengel J.M., Mueckl D. and Lindahl L. (1980) Protein L4 of the E. coli ribosome regulates an eleven gene r protein operon. Cell 21, 523-535.

175. Zengel J.M. and Lindahl L. (1990a) Escherichia coli ribosomal protein L4 stimulates transcription termination at a specific site in the leader of the S10 operon independent of L4-mediated inhibition of translation. J. Mol. Biol. 213,67-78.

176. Zengel J.M. and Lindahl L. (1990b) Ribosomal protein L4 stimulates in vitro termination of transcription at a NusA-dependent terminator in the S10 operon leader. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87,2675-2679.

177. Zengel J.M. and Lindahl L. (1992) Ribosomal protein L4 and transcription factor NusA have separable roles in mediating terminating of transcription within the leader of the S10 operon of Escherichia coli. Genes & Dev. 6, 2655-2662.

178. Zengel J.M. and Lindahl L. (1994) Diverse mechanisms for regulating ribosomal protein synthesis in Escherichia coli. Prog. Nucleic Acids Res.Mol. Biol. 47, 331-370.

179. Zengel J.M. and Lindahl L. (1996) A hairpin structure upstream of the terminator hairpin required for ribosomal protein L4-mediated attenuation control of the S10 operon of Escherichia coli. J. Bacteriol. 178,2383-2387.

180. Zimmermann R. A., Muto A., Fellner P., Ehresmann С., and Branlant C. (1972) Location of ribosomal protein binding sites on 16S ribosomal RNA. Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 69, 1282-1286.

181. Zimmermann R. A. (1980) in Ribosomes: Structure, Function, and Genetics (Chambliss, G., Craven, G. R., Davies, J., Davis, K., Kahan, L., and Nomura, M., eds) pp. 135-170, University Park Press, Baltimore.

182. Zimmermann RA, Thurlow DL, Finn RS, Marsch TL & Ferret LK. (1980) Genetics and evolution of RNA polymerase, tRNA and ribosomes. 569-584, University of Tokyo Press, Tokyo.

183. Zuker M. and Stiegler P. (1981) Optimal computer folding of large RNA sequences using thermodynamics and auxiliary information. Nucleic Acids Res. 9, 133-148

184. Патон Е.Б., Крупская И.В., Живолуп A.H. (1989) Определение минимального фрагмента рибосомного белка L10 из Е. coli, сохраняющего регуляторную функцию. Доклады Академии Наук. 309(2), 493-6.

185. Патон Е.Б. и Живолуп А.Н. (1996) Наличие сайта связывания рибосомного белка L10 в нетранслируемой лидерной области гена rplJ у Thermotoga maritima свидетельствует о аутогенном контроле экспрессии данного гена. Генетика 32(1), 140-145.1. БЛАГОДАРНОСТИ

186. Выражаю искреннюю благодарность моему научному руководителю, Марине Борисовне Гарбер, за чуткое руководство и внимание к моей работе, а так же за ценные советы и рекоммендации, сделанные в процессе подготовки диссертации.

187. Приношу свою глубокую благодарность Светлане Викторовне Тищенко за огромную помощь в освоении различных биохимических методов, за обучение методам кристаллизации, за ценнейшие советы и постоянную поддержку во время выполнения этой работы.

188. Очень признательна всем сотрудникам группы структурных исследований рибосомных белков за помощь в совместной работе и обсуждении полученных результатов.

189. Благодарю всех сотрудников лаборатории структурных исследований аппарата трансляции за дружескую поддержку.