Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Взаимодействие природных аутоантител в нативной ДНК с высокой авидностью: механизм реакции и факторы, влияющие на образование комплексов

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Взаимодействие природных аутоантител в нативной ДНК с высокой авидностью: механизм реакции и факторы, влияющие на образование комплексов"

р|" ^ (^шстерство здравоохранения российской федерации

ростовский ордена дружбы народов мщщщнскии институт

На правах рукописи

саенко владимир александрович

взаимодеиствие природных аутоантител с нативнои днк с высокой аввдностью: механизм реакции и фактош, влшвде на образование комплексов

03.00.04 - Биохимия

автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Ростов-на-Дону - 1994

Работа выполнена в Медицинском Радиологическом Научном Центре РАМН, г. Обнинск.

Научный руководитель:

доктор биологических наук

профессор А. М. Поверенный

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук

профессор Т. Н. Погорелова

доктор медицинских наук

профессор Л. П. Сизяюма

Ведущая организация: Московская медицинская академия

Защита состоится " 3 " 1994 г. в часов на

заседании специализированного совета Д 084.53.01 при Ростовском Ордена Дружбы Народов медицинском институте (344718, г. Ростов-на-Дону, 22, Нахичеванский переулок, 29).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Ростовского Ордена Дружбы Народов медицинского института.

Авторерферат разослан «го« 1994 г.

Ученый секретарь специализированного совета, доцент

Корганов н. Я

- 3 -

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Роль и значение природных антител (ПАт) в формировании иммунологического статуса организма и развитии аутоиммунных патологий остаются невыясненными. Известно, что антитела (Ат), реагирующие с нативной ДНК (нДНК), являются важнейшим диагностическим показателем типичного аутоиммунного заболевания - системной красной волчанки. Наиболее характерным для этого процесса считается наличие в сыворотке крови (СК) высокоавидных Ат к нДНК, которые являются причиной нефрита, тяжелейшего осложнения при волчанке. Многочисленные исследования этих Ат на протяжении более чем 30 лет показали, что экспериментально их индуцировать не удается (stollar, 1988; Tomer et al., 1988). Вместе с тем, имеются данные, свидетельствующие о том, что у здоровых людей имеются В-клетки, способные производить такие AT (Mach et al., 1984, Diamond et al., 1992). He удается обнаружить указанные Ат и в СК трансгенных мышей с имплантированным в В-клетки геном, кодирующим Ат, реагирующие с нДНК (Erikson et al., 1993). Кроме того, поликло-нальная стимуляция спленоцитов нормальных мышей in vitro вызывает синтез аутоантител (ААт), взаимодействующих с ДНК, в количествах почти на порядок больших, чем при стимуляции животных in vivo (Dziarski, 1982).

Эти данные дают основания предположить, что в организме имеется система регуляции активности ААт, реагирующих с нДНК. Изучение этой системы и исследование механизма, лежащего в основе ее функционирования, представляет большой научный интерес и актуально для практики, поскольку может расширить представления о патогенезе ряда аутоиммунных заболеваний а также о механизме регуляции гуморального иммунитета, осуществляющегося, как считается, через систему антиидиотипических Ат (Jeme, 1974; Halpern et al., 1984; Сажина Е.Г. и др., I9SÍ8).

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы было установить существуют ли среди нормальных иммуноглобулинов (ig) организма природные ААт (ПААт), реагирующие ,-с--нДНК с высокой авидностью, выяснение причин, по которым эти Ат невозможно обнаружить в сыворотке крови здоровых людей и. исследование механизмов, лежащих в основе перехода таких Ат в скрытое

состояние.

В задачи исследования входили:

- разработка метода выделения белков, реагирующих с нДНК с высокой авидностыо и их характеристика;

- определение спектра перекрестных реакций;

- изучение механизма связывания с нДНК;

- влияние СК здоровых людей на связывание Селок-нДНК.

Научная новизна. Проведенная работа выявила существование в СК сложной системы, регулирующей высокоавидное взаимодействие 10 с нДНК, не связанной с антиидиотипическими Ат. Впервые показано, что в крови нормальных людей и животных имеются природные Ат, способные связываться с нДНК с высокой авидностыо, причем это взаимодействие возможно только в присутствии компонента неиммуноглооулиновой природы с молекулярной массой меньшей, чем у 7Б способного к самостоятельному связыванию как с нДИК, так и некоторыми сывороточными Полученные результаты дают, основания полагать, что компонент, опосредующий взаимодействие с нДНК находится в СК здоровых людей в связанном (скрытом) состоянии, что делает в норме невозможным его взаимодействие с нДНК и/или с и, таким образом, может представлять собой способ регуляции активности Ат, альтернативный регуляции с помощью антиидиотипических Ат.

Практическая и теоретическая значимость работы. Приводимые данные имеют важное значение для понимании механизма регуляции активности природных ААт, реагирующих с нДНК с высокой авидностыо, и расширяют представления о способах регуляции гуморального иммунитета, так как показывают возможность опосредованного через промежуточный компонент взаимодействия с лигандами и ставят вопрос о роли такой регуляции в патогенезе аутоиммунных заболеваний.

Ряд методов, разработанных в ходе выполнения работы, внедрены и применяются в лабораториях клинической биохимии и клинической иммунологии Медицинского Радиологического Научного Центра РАМН.

Основные положения, выносимые на защиту. I. В препаратах нормальных иммуноглобулинов существуют компоненты, способные связываться с нДНК с бысокой авидностыо. Для образования высокопрочных комплексов белок-нДНК

имеет значение не только заряд молекулы, но и структурные особенности ДНК.

3. Для образования комплексов некоторых Ig различного происхождения (Оычьих или человечески*) с нДНК необходимо присутствие дополнительного промежуточного компонента - посредника неиммуноглобулиновой природы.

4. Промежуточный компонент, необходимый для связывания Ig с ДНК имеет молекулярную массу меньше, чем у 7S Ig, и является негомогенным (состоит как минимум из деух фракций).

5. Реакция связывания промежуточного компонента с нДНК ингибируется высокомолекулярными соединениями, присутствующий в СК здоровых людей.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы доложены на научной конференции отдела радиационной биохимии МРНЦ РАМН (1992 г.), Международном симпозиуме по антифэсфолипидному синдрому (МоскЕа, 1993 г.), научной конференции Экспериментального сектора MFHU РАМН (1993 г.).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 печатных работ, из них а в международных изданиях.

Структура и обЪеи диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (5 подразделов), изложения материалов и методов исследования, главы "Результатов и их обсуждение" (5 подразделов), заключения, выводов и списка литературы, включающего 159 источников, в том числе 10 отечественных и 149 иностранных. Работа изложена на 123 страницах машинописного текста, включает 23 рисунка и 2 таблицы.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Для выделения фракции белков, активно связывающих нДНК, препараты нормальных человеческих гамма- или иммуноглобулинов разделяли с помощью ионообменной хроматографии на QAE-Сефа-дексе А-50 (Pharmacia, Швеция) в буферах различного состава и рН. Полученные фракции концентрировали ультрафильтрацией и ди-ализовали против избытка фосфатно-солевого буфера (ФСБ). Концентрацию селка определяли спектрофотометрически.

Меченую тритием нДНК готоеили по модифицированному методу Мармура (Marmur, 19Ы).

- В -

Для определения связывания оолок-нДНК использовали не-жолько методов. Высокоавидные комплексы оелок-ШЩК регистрировали радаоиммунологическим тестом Фарра (ТФ) (Ио1<1 et а1., 19Ь8), как описано в нашей работе (Баепко е1; а1. 1992). Для этого смешивали расчетные количества растворов исслэдуемого еелка, ФСБ, соосадителя - оычьего гаммаглобулина и аН-ДНК до конечного оО)ема 0,5 мл и после часовой инкубации осаждали добавлением 0,5 мл насыщенного раствора сульфата аммония. Осадок промывали полунасыщ8нным раствором сульфата аммония, ресуспен-доровали в деионизованной воде и переносили на картонные фильтры. Фильтры высушивали и измеряли и их радиоактивность в то-луольном сцинтилляторе с помощью жидкостного спектрометра ЕаокВе1а 2114 (ЬКВ, Швеция).

Для определения связывания оелок-нДНК осаждением комплексов на нитроцеллшозных фильтрах смешивали расчетные количества растворов исследуемого белка, ^Н-ДНК и ФСБ до конечного оО}ема I мл и после часовой инкубации пропускали через нитро-целлюлозные фильтры. Фильтры высушивали и измеряли их радиоактивность.

Для определения связывания белок-нДНК осаждением комплексов в полиэтиленгликоле (ПЭГ-тест) смешивали расчетные количества растворов исследуемого оелка, ФСБ, соосадителя и °Н-ДНК до конечного объема 0,5 мл и после часовой инкубации добавляли 0,5 мл 7% раствора ПЭГ 6000. После центрифугирования измеряли радиоактивность надосадочной жидкости как описано ранее (Зшеепк, Аагйеп, 1980).

Определение связывания иммуноглобулинов человека с ДНК проводили методом иммуноферментного анализа (МФА). Для этого поверхность лунок планшета покрывали ДНК, блокировали раствором бычьего сывороточного альбумина, инкубировали с исследуемым раствором и проявляли с помощью конъюгатов к различным классам ^ человека или тотальным человека. В качестве хромогена использовали орто-фенилендиамин. Оптическую плотность в лунках измеряли с помощью многоканального ридера Ми1г1всап (т^ехЧек, Финляндия).

Концентрацию человека различных классов определяли спомощыо ИФА. Для этого поверхность лунок планшета покрывали

антителами к igG, igM или igA человека, блокировали раствором бычьего сывороточного альбумина, инкубировали с исследуем}"! раствором и проявляли с помощью конъюгатов к различным классам Ig человека или тотальным Ig человека.

Выделение различных классов Ig человека из растворов проводили с помощью аффинных сорбентов коммерческого производства или собственного приготовления.

Химическую модификацию Igti проводили с помощью 2-меркап-тоэтанола (Onue et al., 1964, Schrohenloher et al., 1964).

Разделение растворов белков ульрацентрифугированием производили в 5-40:? линейном градиенте плотности сахарозы при 50000g в течение 6 ч в препаративной ультрацентрифуге L8-\"j (Beokman, Австрия) на Оакет-роторе SW-50.1. Фракции отбирали со дна пробирки.

Препаративное разделение СК человека методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) проводили на хроматографе высокого давления Gilson (Франция) на тандеме колонок GF-25Q XL/ GF-450 XL (Du Pont, США).

Электорофоретическое разделение белков проводили в вертикальных блоках полиакриламидного геля с линейным градиентом 3-15%, по методу Лэммли (Laemmli, 1968) на оборудовании производства фирмы LKB (Швеция). После разделения гели фиксировал:; и окрашивали с помощью раствора кумасси голубого R-250.

Иммуноблоттинг проводили в соответствии с ранее описанной методикой (Towbin et al., 1979). Для этого получали реплики на нитроцеллюлозах листах путем электропереноса белков из нефиксированного геля с помощью оборудования фирмы LKB (Швеция;. Проявлелние производили, используя антитела к некоторым компонентам СК человека, и последующей обработкой соотввтсвующими конъюгатами к первым антителам. В качестве хромогена использовали 4-хлор-1-нафтол.

результаты исследования и обсуждение

I. Выделение фракции белков, способных связывать нативнук ДНК с высокой авидностыо. _ . ■

о

Вежи, способные связывать Н-ДНК с еысокой эеидностью, выделяли из фармакопейных препаратов нормальных гамма- или к.«.-

- а -

15

12

й

и

<Ц ЧЭ

S.-H

-IZL

_С1

М_CL

ли

100

к

8D §

60

40

20

0

со к ю о

dH — выход белка, связавшегося с ионообменником; ■■ - % связывания ^-ДКК в тесте Фарра. Рис.1. Выход сорОировавшихся на анионоосменнико оелков и их спосооность связывать нДНК в тесте по Фарру при различных условиях проведения ионообменной хроматографии.

1 - 0.0IM ацетатный буфер, рН 4,0; •

2 - 0.0IM ацетатный буфер, рН 4,5;

3 - 0.0IM фосфат-цитратный буфер, рН 5,0;

4 - 0,01М фосфат-цитратный буфер, рН 5,5;

5 - 0,01М фосфатный буфер, рН 6,8.

1

5

4

муноглооулинов человека с помощью ионообменной хроматографии на сильном анионообменнике (ОАЕ-Сефадекс) в различных условиях. Результаты этих экспериментов приведены на рис. I. Из рисунка видно, что с возрастанием рН буфера количество оелка, сорбирующегося на матрице, увеличивается, поскольку уменьшается содержание положительно заряженных оелков в растворе вследствие меньшей степени протонирования. При этом способность белков связывать нДНК в тесте по Фарру имеет обратную зависимость от рН исходного буфера и с возрастанием рН в ин-

тервалв от 4,0 до 6,8 значительно снижается. На основании этих данных в последующем выделение высокоавидных Овлков, реагирующих с нДНК (считается, что по методу Фарра определяются именно такие Ig (Smeenk et al., 1982; Smeenk et al., 1988), проводили ионообменной хроматографией в O.OIM Na-ацетатном оуфере, рН 4,5. Выход фракции белков, задерживавшихся ионоооменником, составлял от 0.2Ж до 1,0% от общей массы нанесенного белка в зависимости от исходного материала (различные партии препаратов гаммаглобулинов или иммуноглобулинов человека!,

Использование ионообменной хроматографии на сильном ионо-обменнике при значении рН буфера ниже 7 представляется обоснованным в силу ряда обстоятельств. Буфер с низким значением рН должен сыграть двоякую роль: во-первых - создать условия для диссоциации межмолекулярных комплексов и,' во-вторых, обеспечить протежирование белков в растворе. Последнее обстоятельство является весьма важным, поскольку при низких рН с положительно заряженной матрицей внионобменника способность связываться могут сохранить только те белки, которые имеют отрицательно заряженные сайты даже в условиях протежирования. Таким образом, достигалось рэшение проблема выделения наиболее отрицательно заряженных белков, взаимодействие которых с отрицательно заряженной молекулы ДНК зависит в значительной мере (или даже в основном) не только от электростатических сил, хотя они и являются одними из наиболее важных для взаимодействия АГ-Ат (Absolom, Van Oss, 1986).

фракция белков, задерживающаяся на матрице и ротированная с нее буфером, содержащим 0,5 М Nací, в отличии от исходного препарата и несорбирующейся фракции, действительно содержала компоненты, способные связываться с нДНК в ТФ (рис.2).

О помощью ИФА было показано, что содержащиеся в выделенной фракции человеческие ig классов G, М и А также способны связывать иммобилизованную на твердой фазе ДНК.

Для подтверждения высокой авидности связи в образующихся комплексах оелок-нДШ определяли их константу диссоциации. Поскольку в данном случае оба компонента аффинной пари - белки, способные связывать нДНК, и сама нДНК, являются магасмоле-кулярными соединениями, причем точное определение концентрации

8000 ж 7000 6000

X

- 5000

Л Н

0 4000

X и

1 3000

с!

§ 2000 и

СИ

04 1000 о

10 20 50 100 200 400

Концентрация белка в пробе, мкг/мл Рис.2. Способность различных Оелковых фракций, получении х в процессе ионоооменной хроматографии в 0,01М ацетатном буфере, рН 4,5 связывать нДНК в тесте по Фарру.

1 - препарат нормального гаммаглооулина человека;

2 - фракция белков,не сорбировавшаяся на анионооб-

меннике;

3 - фракция белков, сорбировавшаяся на анионооб-

меннике.

белков, связывающихся с нДНК, не представлялось возможным, то использовали методику, описанную в работе (Ргх^иег а1., 1985), в которой приведено модифицированное уравнение Клотца, справедливое для случаев реакции макромолекулярных антигенов с в условиях как гетерогенного, так и гомогенного иммунологического анализа. Рассчитанное значение равное 1,04±0,18'10""'11м, свидетельствует о том, что рассматриваемое взаимодействие бе-лок-нДНК может быть отнесено к разряду высокоавидных. Полученная величина согласуется с данными, опубликованными в литера-

туре как для моноклональных Ат (АН е! а1., 1985; Тепцтк аг а1., 1988), так и для ПААт (Леках И.В. и др., 1991).

2. Влияние условий реакции на связывание выделенные белков с нативной ДНК.

Влияние условий реакции на связывание выделенных белков с нДНК изучали путэм сравнения закономерностей взаимодействия в буферах с различной рН и ионной силой.

Эти экспорименты показали, что кислотность ФСБ и фосфатного буфера (ФБ) заметным образом не влияет на способность белков связываться с нДНК.

В случае катионного буфера (трис-солевого буфера, ТСБ) величина связывания была значительно ниже, чем в ФСБ и ФБ. Отчасти это, возможно, объясняется несколько меньшей доступностью остатков фосфорной кислоты в молекулах ДНК в катионном буфере, однако весьма вероятным является и то, что в катионном буфере может несколько изменяться и структура самих белков, способных связывать нДНК (уместно принять во внимание, что эта фракция белков задерживается на матрице, имеющей четвертичную аммониевую группировку).

Как известно, состав буфера практически не влияет на способность "патологических" ААт связывать нДНК (Бтеепк ег а1., 1980; Бтеепк еЬ а1., 1982; ЕИа^ 1989). В наших экспериментах разница в связывании нДНК в анионных буферах и ТСБ была весьма существенной. Для волчаночных ААт характерно также свойство к уменьшению связывания с нДНК при возрастании рН в интервале 6,5-8,0 (Бтеепк е! а1., 1980; Бгаеепк et а1., 1982). Аналогичное свойство изучаемой фракции проявлялось только в ТСБ (интервал рН 7,4 - 8,2), в то время как в ФСБ и ФБ (интервал рН 6,8 - 8,0) таких изменений не наблюдали. По-видимому, в катионном буфере влияние положительно заряженных ионов сказывается на структуру компонентов системы белок-ДНК сильнее, чем влияние анионов в ФСБ и ФБ.

С возрастанием ионной силы буфера (ТСБ) связывание белок - нДНК уменьшалось, что находится в полном согласии-с^аннымн литературы (Бтеепк et а1., 1980; Бтеепк е1; а1., 1982; Сулаева Н.И. и др., 1986) и объясняется, очевидно, известным влияние;.'.

концентрации ионов на структуру макромолекул в растворе, а также блокировкой зарядных взаимодействий (экранирование), играющих на этапах сближения и взаимной ориентации макромолекул определяющую роль (Absolom, Van Oss, 1986).

Реакция связывания изучаемой фракции с нДНК протекала очень быстро, как и следовало ожидать при столь низкой константе диссоциации комплексов. Из данных литературы известно, что аутоиммунные ААт реагируют с нДНК также очень быстро, при этом за первые 10 минут степень связывания достигает 95,i (Smeenk et al., 1982). В наших экспериментах максимум связывания достигался за очень короткое время, а в интервале времени от 15 минут до 48 часов разницы в связывании обнаружено не было.

Таким образом, сходство изучаемых белков с аутоиммунными ig заключалось в скорости реакции связывания нДНК и одинаковых закономерностях изменения • связывания при изменении рК (для ТСБ) и ионной силы, а отличие - в значительной разнице ДНК-связывающей способности в различных буферных системах (анионных и катионных).

3. Специфичность реакции выделенных белков с нативной ДНК.

Для изучения специфичности фракции, выделенной в результате ионообменной хроматографии, был проведен ряд экспериментов, в которых изучалась способность различных веществ ингиои-ровать реакцию связывания 3Н-ДНК. Результаты этих опытов приведены в таблице I.

На основании результатов опытов по изучению специфичности реакции с нДНК выделенной фракции, можно сделать заключение о том, что они предпочтительно связывались со структурами, имевшими выраженные свойства полианионов, что является, возможно, необходимым, но недостаточным условием образования распознаваемого участка. Об этом говорят различия во влиянии на связывание белок-нДНК полирибо- и полидезоксирибонуклеотидов, а также пурин- и пиримидинсодержащих полинуклеотидов. Эти данные свидетельствует о том, что не только доступность отрицательно заряженных группировок в молекуле потенциального антигена, но и структурные особенности, связанные с прочими участками моле-

Таблица I. Эффективные количества ингибитора в смеси (нг), вызывающее 50% ингибирующий эффект в тесте Фарра (среднее х стандартная ошибка).

Природные полимеры

Нативная ДНК 927 ± 26

Денатурированная ДНК 973 ± 13

РНК НИ

Гепарин > 2000*

Декстран НИ

Липополисахарид ет Е.ооН НИ

Полирибонуклеотиды

Поли (А) > 2000

Поли (Ц) НИ

Поли (Г) 1265 ± 167

Поли (И) 1002 ± 248

Поли (У) НИ

Поли (И)'Поли (Ц) НИ

Полидезоксирибонуклеотиды

Поли [дА] 853 ± 15

Поли [дТ] > 2000

Поли [ДА]-поли [ДТ]10 1610 ± 389

Поли [д(Г-Ц)] > 2000

Поли [д(И-Ц)] 1252 ± 213

Синтетические полианионы

Декстрансульфат 777 ± 195

Полистролсульфонат 1105 ± 7

Поливинилсульфат 875 ± III

В пробу вносили 75 нг 3Н-ДНК. НИ - не ингибирует.

* - очень слабый ингибирующий эффект, 50% ингибирования не было . достигнуто в использованном интервале количеств ингибитора.

кул, отличными от сахарофосфатного остова, но играющими существенную роль в конформациц полимеров, также чрезвычайно важны для обеспечения связывания белок-нДНК:

4. Непрямой характер взаимодействия иммуноглобулинов с нативной ДНК.

Изначально предполагалось, что появляющаяся после ионообменной хроматографии способность белков связывать нДНК с высокой авидностью в ТФ обусловлена Действительно, в пользу этого свидетельствовал целый ряд обстоятельств. Прежде всего, в качестве исходного материала использовались препараты гам-маглобулина или иммуноглобулина, состоящие главным образом из сывороточных Для выявления связывания белок-ДНК использо-Еали ТФ, который, как считается, позволяет регистрировать комплексы, содержащие С помощью ИФА было показано, что человека принимают участие в связывании с нДНК. Наконец, из данных литературы известно, что Ат, способные реагировать с ДНК, часто имеют общий идиотипический маркер с из СК здоровых людей и могут являться продуктами экспрессии немутированных зародышевых линий генов (Майа1о et а1., 1986; Биаггг, 1986), что должно свидетельствовать об их широком представительстве в общем пуле сывороточных

Для проверки участия сывороточных и з^А в образовании высокоаввдного комплекса белок - нДНК были поставлены опыты по истощению полученных после ионообменной хроматографии растЕо-ров с помощью аффинных сорбентов, селективно связывавших указанных классов (белок А - Сефароза и якалин - агароза). После обработки сорбентами остаточное количество ^ измеряли с помощью ИФА, и результаты независимо верифицировали с помощью электрофореза. На воздействовали химически, разрушая внутримолекулярные дисульфидные связи 2-меркаптоэтанолом. После обработки сорбентами или модифицирующим агентом сравнивал! способности растворов исходного и полученного после истощения или химической обработки белков связывать цЦНК в ТФ.

На рис. 3 приведены результаты измерения связывания белка с нДНК в исходном и обработанных сорбентами или химическим агентом растворах. Из этих данных следует, что при практически

1Е4 8000 6000 4000

g. 2000

st a.

: \

: М.З " О \\ i. \

. V

10

Рис.

1

20

40

ВО 160 3Z0 10 20 40 80 160 320 Разведение растворов белка Связывание белок-ДНК в растворах, полученных после ионообменной хроматографии и обработки сорбентами или 2-меркаптоэтанолом. А- I- исходный раствор, полученный после ионообменной хроматографии, концентрации Iga и igA составляли соответственно 119,9 мкг/мл и 292,8 мкг/мл; 2- раствор, обработанный белок А-Сефарозой, концентрация igo - 0,8 мкг/мл; 3- раствор, обработанный якалин - агарозой, концентрация IgA - 162,1 мкг/мл. I- исходный раствор, полученный после ионообменной хроматографии, 2- раствор, обработанный 2-меркаптоэтанолом.

Б-

полном отсутствии в растворах igG, более, чем вдвое сниженных концентрациях IgA или химически модифицированном, не имеющим антительных свойств igM, способность растворов белков, подвергнутых обработке, связывать нДНК в тесте по Фарру практически не изменялась.

Номер фракции от дна пробирки

Рис. 4. Рапределение (7Э (19Э з^) и ДНК-свя-

зыващей активности по фракциям при ультрацентрифугировании в 10-30$ линейном градиенте плотности сахарозы смеси белков, полученной после ионообменной хроматографии.

- распределение з:^, - распределение з%м.

- связывание белок-ДНК в тесте Фарра.

Полученные данные свидетельствовали о том, что ни один из классов сывороточных 3^ человека в растворе белков, элюирован-ных с сорбента при ионообменной хроматографии, не являлся "ответственным" за формирование высокоавидного комплекса белок -ДНК. Чтобы подтвердить полученное заключение, и получить сведения о свойствах компонента, взаимодействующего с нДНК, раствор был подвергнут разделению ультрацентрифугированием в градиенте плотности сахарозы, а фракции, полученные при разделении, испытывались на способность связывать нДНК в ТФ (рис. 4). Как следует из рисунка, фракции, на которые приходился максимум связывающей способности (ш 15-16) не совпадали с фракциями с наибольшей концентрацией 73 (I^а и А, щ 13-14). Мо-

лекулярная масса белка, взаимодействовавшего с нДНК, судя по результатам ультрацентрифугирования, меньше массы 7Б (150-170 кДа), поскольку фракции, имевшие наибольшую способность связывать нДНК в ТФ, находились дальше от дна пробирки, чем фракции, содержавшие максимальные концентрации

В пользу этого заключения свидетельствовали и результаты опыта, в котором раствор белков, элюированных с сорбента при ионообменной хроматографии, фракционировался добавлением насыщенного раствора сульфата аммония до 50% насыщения (т.е. в условиях осаждения реализующихся в ТФ). Было показано, что компонент, ответственный за связывание с нДНК (далее - Х-ком-понент), сосредоточен главным образом в супернатанте, а не во фракции, осаждаемой в полунасыщенном растворе сульфата аммония. Очевидно, что такая концентрация сульфата аммония недостаточна для того, чтобы вызвать вггрегацию и преципитацию белков с молекулярной массой меньшей, чем у 7з ■

Было показано, что Х-компонент осаждает 3Н-ДНК в ТФ только в присутствии нефракционированного соосадителя - бычьего гаммаглобулина, а без него связывание можно было выявить только в СНцФ-тесте (рис. 5, в опытах с использованием СНцФ из выделенной фракции предварительно удаляли ^ путем осаждения и истощения на иммуносорбентах).

Эти сведения дали основания полагать, что что в комплексах ДНК-белок, выявлявшихся в ТФ, присутствуют также которые, войдя в состав образующегося комплекса, создают условия для его преципитации в полунасыщенном растворе сульфата аммония (ТФ). При этом в составе комплекса могли быть либо любые (в этом случае они должны вступать во взаимодействие . только с уже образовавшимся комплексом Х-компонент-нДНК, поскольку очистка растворов, содержавших Х-компонент от была неполной), либо отдельные субпопуляции 10 с определенными специфическими характеристиками (в этом случае такие могли присутствовать только в составе' соосадителя - бычьего I®, всегда добавляемого в реакционную смесь при стандартной постановке определения иммунных комплексов в ТФ, и взаимодействовать не только с уже образовавшимся комплексом, но и самим Х-компонентом).

Объем раствора белка, мкл Концентрация соосадителя, мг/мл Рис. 5. Способность фракции, выделенной из препарата нормального иммуноглобулина человека с помощью ионообменной хроматографии, связывать цДНК в тестах СНцФ и ТФ.

А - взаимодействие выделенной фракции (ig удалены) с 3Н-ДНК, определенное методом СНцФ.' Концентрация белка 108 мкг/мл. . Б - взаимодействие выделенной фракции с 3Н-ДНК, определенное в ТФ. Общая концентрация белка 443 мкг/мл.

Способность соосадителя взаимодействовать с Х-компо-нентом, содержащимся во фракциях, элюированных с анионообмен-ника, и с комплексами Х-компонент - ДНК была проверена в ряде экспериментов. Для этого смешивали исследуемый раствор белков с соосадителя и после инкубации добавляли сульфат аммония, разделяя тем самым смесь на две фракции - осадок и надосадок в отсутствии 3Н-ДНК. После приведения растворов белков обеих фракций к "физиологическим" условиям и выравнивания концентра-

ций соосадителя (к надосадку добавляли свежий соосадитель) проверяли способность каждой фракции связывать нДНК. В этих экспериментах были получены данные, свидетельствующие о том, что обе фракции обладали способностью связывать нДНК в тесте Фарра, причем несколько большая активность была сосредоточена во фракции осадка. Это указывало, по-видимому, на то, что некоторые ^ действительно способны взаимодействовать с Х-компо-нентом, обеспечивая тем самым условия для его преципитации в полунасыщенном растворе сульфата аммония. Способность надосад-ка взаимодействовать с нДНК говорит о том, что не весь Х-ком-понент, ответственный за первичное взаимодействие с ДНК, связывается с Поскольку в этих экспериментах использовали соосадитель в концентрации 1,6 мг/мл, т.е. в количестве, достаточном, чтобы связать весь "адаптер" (см. рис. 5), то есть основания считать, что Х-компонент не является гомогенным, а состоит, по крайней мере, из двух (или более) субпопуляций: одна из них в отсутствии нДНК способна связываться с напрямую с образованием комплекса, который осаждается в полунасыщенном растворе сернокислого аммония (и способен в дальнейшем связывать нДНК), а другая образует комплекс с нДНК, с которым впоследствии взаимодействуют Эти данные также дают основания полагать, что и способные входить в комплексы, определяемые в ТФ, представлены как минимум двумя субфракциями, различающимися по специфичности. Одна из них способна распознавать промежуточный компонент непосредственно,' а другая - его комплекс с нативной ДНК.

Закономерности образования ДНК-белковых комплексов, изученные в ТФ, были также характерны и. для систем, в которых использовались з^ человека. С помощью ИФА было показано, что -Х-компонент создает условия, необходимые для связывания не-фракционированных человека с иммобилизованной ДНК (рис. 6), причем этот эффект практически не был выражен для челове-. ка, и, следовательно, з^, способные к такому взаимодействию, могут представлять собой ПААт.

Исследования показали также, что реакция образвания комплексов, содержащих и ДНК, протекала одинаково успешно как через предварительное связывание Iв с Х-компонентом и последующим взаимодействием с ДНК, так и по пути реакции с кош-

Объем раствора белка в лунках, мкл

Рис. 6. Влияние раствора белков, полученного после ионообменной хроматографии на способность Ig человека связываться с иммобилизованной ДНК в ИФА. I - раствор белков, полученный после ионообменной хроматографии (Ig удалены); 2 - смесь '(I) с 50 мкг/мл раствора Ig человека. Концентрация добавляемого белка 108 мкг/мл. Для выявления связавшихся Ig был использован коныогат, специфичный к Ig человека.

лексами ^компонент - ДНК и в гомогенных (ТФ), и в гетерогенных (ИФ / условиях.

5. Влияние сыворотки крови здоровых людей на связывание белок - нативная ДНК.

Исследования показали, что компоненты интактной СК здоровых людей ингибируют связывание с нативной ДНК. Этот эффект проявляли все исследование СК и их смеси (пулы), давая ста-

ы о

о

о

а а

с

ll.ll 11.М

Время элюции, мин

о о о. £ 43

и

Рис. 7. Хроматограмма разделения смеси СК методом высокоэффективной жидкостной хроматографии на гельфиль-трационных колонках и способность индивидуальных фракций ингибировать связывание белок-ДНК в тесте по Фарру (в % от исходной СК). 1-6 - основные фракции'компонентов СК. !•'- - ингибирущая способность в % от исходной СК.

тистически неразличающиеся значения титров при 50% ингибирова-ния 1:52±2 и 1:62±9 соответственно.

При попытке выявить фактор-сыворотки, ответственный за ингибирование было показано, что этой способностью обладает наиболее высокомолекулярная фракция сыворотки крови (рис. 7).

Отдельные эксперименты показали,, что. фактор СК, ответственный за ингибирование связывания с нДНК в ТФ, не относится к сывороточной ДНК и не является ХйМ, липопротеидом низкой плотности или термолабильным компонентом системы комле-мента. Доказано, что ингибирукяций эффект фактора ■ СК связан именно с блокированием • белкового компонента системы Тц -Х-компонент - нДНК, а не с блокированием 3Н-ДНК.

Полученные данные дают основания считать, что Х-компо-нент, ответственый за образование комплексов, содержащих и нДНК, находится в СК в скрытом (замаскированном) состоянии.

Поскольку из данных литературы известно, что в случае аутоиммунного процесса одним из важнейших способов гуморальной регуляции являются антиидиотипические Ат (Сажина Е.Г.и др., 1988; ¿бгпе.1974; На1регп а1.,1984), ТО можно полагать, ЧТО система регуляции активности ПААт, реагирующих с ДНК, отличается от действующей при аутоиммунной патологии, причем эту функцию может выполнять фактор, присутствующий в каждой СК здорового человека.

- 23 -Выводы

1. С помощью ионообменной хроматографии на сильном ани-онообменнике из препаратов гаммаглобулинов (или иммуноглобулинов) человека была изолирована фракция, содержащая компоненты, способные связываться с нативной ДНК с высокой авидностью.

2. Для образования комплексов некоторых иммуноглобулинов с нативной ДНК, определяемых с помощью метода Фарра и иммуно-ферментного анализа, -необходимо присутствие дополнительного промежуточного фактора-посредника (Х-компонента) неиммуногло-булиновой природы.

3. Для образования опосредованных промежуточным фактором комплексов иммуноглобулинов с ДНК имеет значение не только заряд молекулы, но и структурные особенности ДНК.

4. Промежуточный компонент имеет молекулярную массу меньше, чем у 73 иммуноглобулинов и способен образовывать самостоятельные комплексы с нативной ДНК, которые не осаждаются в полунасыщенном растворе сульфата -аммония.

5. Промежуточный компонент или его комплекс с нативной ДНК взаимодействует с иммуноглобулинами различного происхождения - бычьими или человеческими. Поскольку этот эффект практически не выражен для ДО человека, то иммуноглобулины, способные к такому взаимодействию, могут быть отнесены к природным аутоантителам.

6. Промежуточный компонент является негомогенным и состоит как минимум из двух фракций. Одна из них способна связываться с (бычьими) иммуноглобулинами непосредственно, а другая - в виде комплекса с нативной ДНК. Это же дает основания полагать, что иммуноглобулины, способные входить в тройной комплекс, представлены как минимум двумя субпопуляциями, различающимися по специфичности. Одна из них способна распознавать промежуточный компонент непосредственно, а другая - его комплекс с нативной ДНК

7. Реакция связывания промежуточного компонента с нативной ДНК ингибируется соединениями, присутствующий в сыворотке крови здоровых людей. Сывороточные соединения, обуславливающие' ингибируюидай эффект, принадлежат-к высокомолекулярным сывыоро-точным компонентам.

8. Взаимодействие антител с антигеном может модулироваться не только с помощью антиидиотипических антител, но и с помощью других компонентов сыворотки крови неиммуноглобулино-вой природы.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Взаимодействие иммуноглобулинов с заряженными биополимерами: значение в регуляции гуморального иммунитета/ А.М.Пове-ренный, Г.М.Ротт, Н.И.Сулаева, И.В.Леках, В.К.Подгородни-ченко, Е.Л.Насонов, Л.Цебецауэр, В.А.Насонова./.-// Молекулярная биология. - 1989. - Т.23. - С.153-164.

2. Полианионы ингибируют взаимодействие аутоантител с различными клеточными белками/ Ю.Б. Грязнова, А.Е.Кабаков, Л.Н. Бровкина, Е.Л.Насонов, A.M.Поверенный./.-// Бюл. эксп.биол. мед. - 1990. - Т.7. - G.II7-I2I.

3. Первичное взаимодействие с ДНК "скрытых высокоавидных антител" из препаратов гаммаглобулина, вероятно, определяется присутствием кофактора/ A.M.Поверенный./.-// Бюлл. эксп. биол. мед. - 1993. - N 6. - С. 624-625.

4. Polyanions inhibit binding of human autoantibodies to certain oellular proteins/ A.E.Kabakov, Y.B.Griaznova, A.M.Poverenny./.-// Immunology Letters. - 1990. - T. 26. -P. 221-226.

5. Hidden high-avidity anti-DNA antibodies ooour in normal human gammaglobulin preparations/ A.E.Kabakov, A.M.Pover'en-ny./.- // Immunology Letters. - 1992. г V. 34. - P. 1-6.