Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Взаимодействие ДНК - белок при аутоиммунном процессе

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Взаимодействие ДНК - белок при аутоиммунном процессе"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ им. В. А. ЭНГЕЛЬГАРДТА

На правах рукописи УДК 577.083.3

ГОЛОЛОБОВ ГЕННАДИЙ ВИКТОРОВИЧ

Взаимодействие ДНК — белок при аутоиммунном процессе

03.00.03 — молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ

Москва — 1992

Работа выполнена в группе химических основ биокатализа Института Молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта

Научный руководитель: канд. хим. наук А. Г. Габибов Научный консультант: доктор хим. наук, проф. Г. И. Яковлев

Официальные оппоненты: доктор хим. наук, С. Н. Кочетков

канд. хим. наук, А. А. Комиссаров

Ведущая организация: Институт биохимии им. А. Н. Баха РА

дании Специализированного совета по защите докторских ди

им. В. Л. Энгельгардта РАН по адресу: 117984, Москва В-33 ул. Вавилова, 32.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Институ Молекулярной Биологии им. В. А. Энгельгардта.

Защита состоится

часов на зас

сертаций Д 002.79.01 при Институте Молекулярной Биолоп

Реферат разослан

Ученый секретарь Специализированного совета

. '"•г • .'}

■ ' ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. В последние годы з' биокатализе произошли революционные изменения. Наряду -с развитием традиционных .биохимических энзимологическях .исследования предметом пристального взимания биохимиков • стали каталитические' РНК. (рибозимы) и каталитические антитела (абзимы). Изучение этих новых об«ектоэ сулит значительный прогресс в фундаментальных областях — исследовании механизма катализа физиологически важных реакции и, практической > области - создании новых устойчивых биокатализаторов, способных включать и выключать з^иегейшие процессы метаболизма.

За время, прошедшее после" открытия новых биокатализаторов, появилось много исследования направленных на выяснение- механизма взаимодействия биокатализатора с субстратом и субстратной сгг4цж$ичнс??и. При исследовании взаимодействия субстратов и рибозимов в основном выяснен'.! вопросы. связанна«? ■ с" . ззаимодеястзиэд металлов, ролью первичном- и -вторимструктуры нуклеиновое кислоты в механизме каталитического' . .-расщепления. Исследованию субстратной Специфичност$ абзимов также посвящено немало экспериментальных■работ,зтой" .цели используется широкий арсенал- физико-химических методов, активно лрименяемых , в энзтгологаи. , . . ■ .

Особое'-". место в этом ряду занимают работы-, по. исследованию природных,- айзттоа, Так,, в., .самых последних заботах- - группы С .Паула 1Паул,' --1969»] ,-'исследована :пецифичность каталитических^ аутоантител к вазоактивному штестинальному' ~ петгшду^ Несмотря • аа -обнаружение :пецифических сайтов' .разрыва пептидной • связи, авторы тредполагают, что имеет место, узнавание на.уровне антитела-толимерная молекула IС.Паул'; неопубликованные результаты 1,

Об«ектом наших исследовании являются. антитела к ДНК, 1роявляющие себя при аутоиммунных »патологиях. Ранее нами ¡ылп зысказано предположение г, возможности существования

- -С . .-'. -- --: Т'.ЛПТ " 7Н у Ц',< ЯМ'Л

отношении ДНК.при аутоиммунных патологиях Шустёр и др.] Был проведен поиск таких- антител и было показано, что ; случае склеродермы антитела, связывающие ДНК являете: антиидиотипйческими антителами к ферменту,, определяющем; топологическое состояние ДНК - топоизомеразе I {Бронштейн 1

При системной красной волчанке нами : были • обнаружен] антитела, способные катализировать гидролиз фосфодиэфирно; связи ДНК [Шустер и др. ]. Таким образом было обнаружено дв; типа взаимодействия , антител с ДНК, возникающих, пр: аутоиммунном процессе. Однако, неясными остаются вопросы'■< характере такого взаимодействия, о .специфичности связывание аутоиммунных антител с ДНК и характере .и специфичност; реакции, катализируемой ДНК-антителами. • Решение эти вопросов и является предметом настоящего диссертационног исследования., •

Цели и . задачи исследования. -'. В -.задачи-, настояще диссертационной -работы входила разработка эффективног метода очистки ДНК-специфических каталитических антител, также .дальнейшее рассмотрение взаимодействия ДНК специфических аутоантител с ДНК. Предметом особого интерес .было выярнение субстратной специфичности обнаруженного ДНК абзима, 'исследование саят-специфичности, выяснение рол первичной , и , ^втр!Я1чной. >/структеть1. ;/дак в, эффектнвност протекания- ^реакции, а также выявление .. .роли 'эффекторов влияших на ход каталитического процесса.' ,..;:

Научная новизна' и. практическая ценность исследования. ходе исследования разработан - новый эффективный спосо очистки -катздитических аутоантителп особенно на стадия •аффиннве* и -;.высокоэффективная жидкостной хроматографии Исследованы закономерности процессов .связывания аутоантите с ДНК при различных аутоиммунных заболеваниях. Показ? различный характер взаимодействия .антител с ДНК пр склеродерме й системной красной волчанке. Впервые обнаруже декануклеотидный субстрат," подвергающийся гидролизу катализируемому антителами с У высокой эффективностью

. - - - >

сследована кинетика процесса, места разрыва- субстрата, ффекторы, влияющие на реакцию.. Демонстрация- субстратной лецифичности каталитических ДНК-ауто'антител при системной расноя. волчанке может . являться практически полезным актором в исследовании патогенеза- аутоиммунных процессов. пообация работы. .Материалы диссертации докладывались на:. 15 Биохимическом конгрессе, Иерусалим, 1991 г. . Международной конференции "Топоизомеразы в химиотерапии", агояа, 1991 г. "

Международной конференции "Ферменты в' органическом интезе", Нью Дели, 1992 г.

. Семинарах Институтов Пастера, СЕРИА, "Брюссель, 1991 г., НИИГенётика, Москва, 1992 г.

труктура и об ем работы. Диссертация состоит из

ведения, обзора литературы, описания материалов и методов, езуЛьтатов собственных исследований и их обсуждения, ыводов и списка цитированной литературы.

Работа- содерлдат страниц' машинописного текста,

исункоп, схем. тзл-лий. .' гелиография • включает

итературных ИСТОЧНИКОВ- •• ,

: у

МАТЕРИАЛЫ И методы: 0б«ектами .исследования служили - антитела к. ДНК,, элученные из сывороток крови больных с аутоиммунными аболеваниями. . -

ь!воротки крови вольных с склеродермой и системной красной элчанкой были предоставлены- Институтам ревматология АМН зссии. , "'.. . • ; ' '

¿сокоэффективнуа жидкостнур хроматографио проводили на риборе Beclman - Altex 110А с использованием колонки jtperose 12.

{¡финнур хроматографии проводили на колонке с привитой к зллюлозе двуцепочечнои ДНК. из тимуса теленка (Sigma,США), элонке с ЛИС, привитой к целлюлозе глутаровым диальдегидом то'езно ггседоставлека Г.А.Кевинским, Новосибирский

* Электрофоретическое разделение белков■ проводили; по методу (Laemmli and al. ,19*701 ПГ" 12,5%полиакриламидном геле.: Окрашивание . проводили . -0,25%- кумасси G-250 (Serva,Германия),либо серебром (Bio-Bad,Австрия). Синтез высокомеченных фрагментов ДНК . осуществляли по методикам (Т.Маниатис и др.,1984) с использованием' а Р дезокси-и'. у-Р трифосфатов (Ленинград.СССР). ■ Электрофоретическое разделение фрагментов ДНК проводили в 1% агарозном . геле,в 6% акриламидном геле,6-и,10-и,15-и . процентных , акриламидных . гелях,содержащих ' 6М .мочевину. ■ Агарозные гели окрашивали бромистым этидием и-: фотографировали.Гели ■ .содержащие .радиоактивно -меченные фрагменты ДНК радиоавтографировали с помощью. рентгеновской 1 пленки РМВ-1 . (Тасма,СССР). . Полученные радиоавтографы/ сканировали с помошью лазерного' сканнера, Ultrascan <LKB,'; Швеция), скорость реакции . определяли' - по, соотношению '. оптической плотности продукта реакции к суммарной оптической плотности субстрата и продукта.

ДНК-связывание топоизомеразы I, ■ антиидиотипических .•■ антител при г.-склеродерме и антител к .ДНК при' системной красной волчанке определяли .осаждением комплекса белок-ДНК ; на нитроцеллюлозном фильтре. Использовали: • фрагмент 3'-А ! глобиновог'о гена, синтетический нуклеотяд, '-содержащий камптотецин-независимыя консенсус"топоизомеразы, декамерный олигоНуклеотид, гидролизуюшийся каталитическими- антителами. ; Константу связывания определяли ' по' иетоду ' двойных обратных • координат'(Диксон и др.,1982 i.

Мигрирование образования.- ковалентного комплекса топоизомепаза-иуклеотидныя ' , консенсус. ■ проводили . . при инкубация"* антиидиотипических " антител, топоизомеразы,_ и консенсуса с последующим - определением количества образовавшегося ковалентного комплекса при связывании на нитроцеллюлоэном фильтре в денатурирующих условиях,,

Определение кинетических -параметров реакция гидролиза декаыерного олигонуклеотида_ проводили графически методом Лайнуивера-Бэрка.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ. ...

Выделение ДНК-гидролизуюших антител. ' ;. ;

В настоящей работ© мы предприняли попытку провести выделение каталитчески активных антител из общэго пула ДНК-связывающих антител аутоимунной сыворотки. На первом этапе мы. воспользовались стандартным фракционированием сульфатом аммония, широко применяемым для очистки антител. Общая схема выделения включала стадии, традиционные для аффинной очистки молекул а именно: аффинную хроматографию на протеин А

сефарозе-, и стадию, используемую для очистки ДНК-связываюшх белков - элюцию аффинно сорбированных фракция с колонки с привитой нативной или модифицированной ДНК. Для оценки эффективности используемых методов очистки была введена единица удельной активности, испЬльзуеыая для оценки удельной активности ферментов рестрикции .Это было связано с относительно невысоким • уровнем эндонуклеазной актазности исследуемых препаратов антител*

В Таблице I суммированы данные по удельной активности препаратов каталитических антител на различных стадиях выделения. 'Как следует из данных' таблицы, для аффинной, хроматографии. ДНК-специфических каталитических антител использовались два носителя;ДНК-целлюлоза с нативноя привитой двухиепочечноя ДНК и целлюлоза с привитой ДНК, . модифицированной. глутаровда '"ди альдегидом /любезно -предоставлена Г.А.Невинским, ИБХ СО РАН, Новосибирск/.

После пропускания, антител, содержащих ондонуклеазную активность, через, колонку с нат-ивноя ДНК; удалось достаточно эффективно, сорбировать "каталитические антитела на аффинном-сорбенте. Активность не злюировалась ГМ МаС1.. 1М калии-фосфат элюировал примерно 308 общая .активности. Полностью элшровать антитела с нативноя ДНК удалось только , с использованием сильного понижения значений рН /до 2-2,5. единиц/ или денатурирующего агента /ЗМ мочевина/. При этом наблюдалась значительная /до .30« / потеря активности /см Таблицу Л/. Более эффективным оказалось' использование

г

Рис Л,2 Лффинная хроматография на модифицироьянной ДНК-целлюлозе.

1. Линейный градиент КИ от )0мМ- до 1М

2._ Линеиныя- градиент от ЧшМ ли ЗМ -"■ Пунктирная линия - профиль .ЛНК-гидролизу&щеи'активно'-ти. Штрих-пунктир ,-, профиль градиента.

Таблица 1 Очистка каталитических антител.

Стадия очистки Количество белка Общая активность Удельная активность Выход

Протеин А сефароза 2 мг. 100 е 50е/мг.

ДНК-целлюлоза ¡нативная) 0,03 г. 34 е 1100е/мг. 34%

ЛНК-целлюлоза. (модифицированная ) . • 0,033 г. ! 82 е 2500е/мг. 82%

носителя с модифицированной ДНК. Бри оптимальных значениях рН 7,0 активность полностью ' связывалась с -сорбентом. Как следует из данных,".приведенных на Рис 2, элюция градиентом калия-фосфата. обеспечивает разделение каталитической '; активности на три фракции, -Изучение специфичности и- ; иммунологических характеристик не показало каких-либо , существенных различий между -ними. Поэтому элюция линейным градиентом ;ИаС1 оказалась в этом случае вполне приемлемой. Полученные;. препараты каталитических антител характеризовались высокой удельной активностью /см Таблицу ' I/. Суммарная • активность полученного препарата была на 50-100Х выше исходной, что можно ■ обвяснить разрушением стабильных -комплексов каталитических антител с природной ДНК при связывание с ДНК-носителем, ■»";

Следующим этапом работы ввилось изучение ^процессов связывания ДНК-связывающих антител е ДНК-различной длинны и состава. !В качестве об«ектов били еибраны антиидиотипические ДНК-связываюдие антитела - к Торе I при .склеродерме и. ДНК-сзязываювде антитела рри еиетемной. красной волчанке.

Определение константы связывания антиидиотипических антител к топоизомераэе I с фрагментом ЯА-глобинового уен^. .

/■Антиидиотипические антитела -при склеродерме, как было

показано ранее, являются антителами к ДНК. Представлялось |

интересным изучить специфичность их связывание с !

последовательностями • ДНК, которые обладают ' повышенной !

специфичностью' по-отноиению к топЗизомеразе I эукариот. Е ; качестве модели были выбраны фрагмент /Л-глобинового гена,

содержащий большое количество сайтов топоизомеразы, и |

синтетический 20-ыерный нуклеотид, , содержащий |

камптотецин-независимыа нуклеотидныя консенсус. Из рис.3 |

видно, что в случае фрагмента лЛ-глобинового тена, константы |

связывания антиидиотипических -антител • ..и топоизомеразы 1

близки по значению ¡2.5х10-10 и 1.3x10"10 соответственно). ;

Антиидиотипические ^антитела связываются специфично, ! добавление 10-50 -кратного, избытка поли-, I йА-Т) не оказывает

срт»10 0.4

0.3

* 0.2

0.1

1М 1 = 2.540 ВДБЕ =» 1.3-10

^-1-|-1-1-

10

1

2-10 а

Рис.3 Определение- . .константы диссоциации ' комплексов 'топоизомераза-ЛНК (литая '1! и антитело-ДНК (линия 2) в двойных обратных координатах. ДНК - фрагмент ХА-глосинового гена <400 пар нуклеотидов)-., срм — импульсы/мин, Е -концентрация ДНК> • .. . - . '

. Рис,4 Ингабирование образования ковалентного комплекса топоизомераза-консенсус антиидиоткпическими антителами, срм - импульсы/мин.

системной красной волчанке. Как известно, наличие антител к ДНК является характеристическим признаком этого заболевания. Антитела к ДНК -обнаруживаются и в крови здоровых доноров, однако они, как. правило, не проявляет ДНК- связывающей активности, т.к. находятся в блокированном состоянии. Наиболее интересным свойством аутоиммунных антител является наличие у них фосфодиэстеразнои активности по отношению к ДНК. Антитела к ДНК при аутоиммунном процессе не обнаруживают высокой специфичности к последоваггельности ДНК. Можно отметить лишь их различие по взаимодействию с одноцепочечной и двуцепочечной матрицей. Это об«ясняется, по-видимому, тем, что основной вклад, в связывание антител с ДНК вносит взаимодействие типа полианион-поликатион. Представлялось интересным изучить . соотношение мезду связыванием ДНК-субстрата антителами и его гидролизом. Ранее какой-либо специфичности к последовательности ДНК при катализе реакции разрыва антителами обнаружено не было (Шустер и др.). На рис.5 представлена электрофореграмма продуктов гидролиза антителами олигонуклеотидов различной длины и состава. Из рис.5 видно,, что б диапазоне длины от 10- до 30 нуклеотидов не наблюдается каких-либо; различия в степени.гидролиза, т.е. длина олигонуклеотидного субстрата, до 10 нуклеотидов не оказывает влияния на" скорость протекания реакции. Анализ-продуктов, как представлено на схеме, показывает, что предпочтительнее гидролизуются фосфодиэфирные связи в С-С парах. Наиболее эффективно гидролизов_злся 10-мерный' нуклеотид состава 5• -СССААТТСС£;-3'-. Олигояуклеотид самокомплементарен и' может существовать ...в двух состояниях - регулярного дуплекса и шпильки. Для выявления оптимального для катализа структурного состояния была изучена концентрационная и температурная зависимости а так-же проведен нативный электрофорез- в полиакриламидном теле. Из- представленных; зависимостей .скорости гидролиза олигонуклеотида, отожженного при низких и высоких концентрациях 1рис-6) ...видно, что в более низких концентраииях .олигонуклеотид эффективно гидролизуется, тогда ;

Рис 5 Радиоавтограф продуктов деградации олигонуклеотиЦ# различной длины, и составу каталитическими

антителами.

N - контрольная реакция

и'- реакция в присутствии каталитических антител. ■

1. 5' - ¿СААААААСС - 3' ; " - •

2.-5' - ТТТССССТТТ - 3'

3,4. 5* - СССААТТССС - 3' _

5. 5* - ¿ССССССТСССТ - 3' ■ . -

6 5' - ТГТТТТСТТТТССС -3' " 3'— ААААААСААААССС -3' 7. 5' - ССТССССАСТТТССАСССАССССССС -3'

р. 5- - ССТССССАСтССАССПАСаССССС -У V - ССАССССТСАААССТСССТСССССис -о

9 V - ТАГААГ.ССАСТТТССаСТССиСАСТТТССАСССАСС -3'

Угоа* 20

15

10.

£

п

I |

10

Рис.6 Скорости гидролиза субстрата, полученного отжигом при различных концентрациях. . Угоах • - скорость .гидролиза в", относительных единицах. [Б] - концентрация субстрата при отжиге <М).

:ак при отжиге при высоких концентрациях реакция сильно 1амедленна. Аналогичные выводы следуют и из температурной 1ависимости. Нативныя электрофорез показал,1 что в диапазоне :онцентраций, оптимальных для протекания реакции, |лиг0нукле0тид существует в одноиепочечном виде, т.е. 1птимальным субстратом является шпилечная структура.

)пределение констант связывания ниэкоыолекулярного субстрата I ДНК-гидролиэующими антителами и кинетических параметров >еакции. '

Для изучения параметров связывания олигомерного : убстрата ' с антителами проводили измерение констант :вязывания низкомолекулярного субстрата в каталитических и ^каталитических. условиях. Как видно из рис.7 константа, >пределенная в некаталитических условиях, равнялась-10 нМ. )пределение константы в каталитических условиях по 1нгибированию реакции гидролиза плаамидноя ДНК дало то жэ значение. Для сравнения было изучено ингибирующее влияние хругих одигонуклц>тидов различной длины на реакцию, гидролиза 1лазмиднся 'ДНК. Было показано., что все полинуклеотиды жазьшают. конкурентное ингибируюшэе влияние на деградацию члазмиды антителами,' что говорит об общем характере' их :вязывания. ;

Кинетические параметры реакции ' гидролиза, низкомолекулярного субстрата представлены на рис.9. Константа Ми-хаэлиса составила 16' нМ.

Изучение ■ вмания на реакцию гидролиза низкомолекулярных яафвкторог. •

Для изучения роли основания в катализе было изучено влияние на реакцию низкомолекулярных составляющих пилинуклоотида:' фосфат-иона, риоо- и

дезоксирибонуклсотидтрифосфдтов. Как видно из рис.9, фосфат оказывает ингисНфуияре действие при • концентрации 10 ОМ. ' Можно предположить наличие в антителах аффинной к фосфату

-I

) •

Й 3. 10

1 срп

. 6 'У

Ч

2 У

5 - А .ни

Рис.7 Определение константы связывания $екамерного олигонуклеотида в некаталитических условиях, а) Зависимость количества образовавшегося комплекса от концентрации добавленных антител., б) Определение константы связывания антитело-ДНК графическим методом в двойных обратных координатах. ГН1 -концентрация антител, срм - импульсы в минуту.

декамерного олигонуклеотида каталитическими антителами. "151 - концентрация субстрата (М), V - скорость реакции I относительные единицы),."'.

матрицы, поскольку ингибирование -реакции сульфат-ионом и хлорид ионом наблюдается только при концентрациях 0,3 М и 0,5 м, соответственно. При концентрации фосфата 1 мМ и ниже наблюдается увеличение скорости реакции. К.олоколообразныи характер зависимости говорит о возможном наличии в связывавшем центре антител' нескольких участков связывания фосфата, один из которых связывает большой субстрат, фосфат при высоких концентрациях ингибирует реакцию по конкурентному типу.

Влияние ь.ч реакции иононуялн>1клтрифос©&т-?? носит более сложный характер, Быра-*а«ш>и»: ч в ч;-тив<»ционном и ингибиторном эффектах при различных концентрациях эффектора. Фактором, определяющим эффект воздействия, лВЛй».-гся основание нуклеотида.

Изучение влияния металлов, на ' ДНК.-г ид до л и з у юту ю реакцию

антител. •

———. л

Реакции гидролиза ДНК каталитическими > антителами

являются металло^ависимыми. Ранее было показано, что '

2+2+

Са и Мп необходимы для. осуществления гидролиза.. Добавление ЭДТА в эквивалентном . количестве полностью '< ингибирует реакцию. Наибольшая/ эффективность реакции гидролиза ДНК наблюдается в присутствии ионов магния. Были описаны примеры ДНКаз, использующее в каталитическом акте два иона, металла. Один из них, как. правило, выполнял координирующую роль, а . другой - функцию ' кислотного катализатора. При изучении одновременного влияния на реакцию пары обнаружено, что максимальная скорость

гидролиза наблюдается в паре магний-кальции. Присутствие в реакционной смеси ионов цинка.или меди полностью ингибирует реакцию, марганец не оказывает существенного влияния. Б реакции гидролиза модельного олигонуклеотида. добавление кальция, как видно из рис.11, приводит к увеличению максимальной скорости реакции. Это позволяет предположить, что связывание кальция вызывает структурные изменения в активном центре антител, что приводит к увеличению скорости

jur .10 ÏJi»«H*r- hmmih« на кии**«*«**» трыггри рмхвю гиаролкза iPKAWpwero ряигриукяютш».

реакции. ■ Роль магния, как кислотного катализатора подтверждается "в эксперименте по ингибированию реакции гидролиза фторид- ионом. Магнии служит' координатором .молекулы воды, 'являющейся нуклеофильным агентом. Фторид-ион, как было показано ракее> способен замещать воду в комплексе ыагния-вода давая непродуктивный комплекс. Было показано, что фторид-ион ингибирует фосфодизетеразную реакцию

антител при. концентрации 10 мМ, что хорошо согласуется с данными по ингибировзи-лю ЛНКаз и экэскукяеазнои активности полимераз. .

I

ВЫВОДЫ . ^

1. Разработан эффективный метод очистки ДНК-специфических каталитических антител,'основанный на аффинной хроматографии на протеин А сефарозе и модифицированной ДНК-ЦёЛДюйоз&, исследованы биохимические и иммунологические характеристики обнаруженных природных ДНК-абзимов.

,2; Проведен сравнительный анализ связывания антител' к ДНК при . ра-зличных аутоиммунных заболеваниях с .различными модельными ДНК.. Продемонстрирован различный характер связывания ДНК с. антителом при склеродерм© и системной < красной волчанке. - -

3. Исследованы каталитические свойства антител к ДНК при системной красной волчанке по отношению к низкомолекулярным олигонуклеотидным" ■ субстратам. Обнаружен ' декамерныи

"самокомплементарный олигонуклеотид, характеризующийся высокими кинетическими параметрами: Км = 16 нМ,

Ума'кс.=50 фемтамолеа/час, определены сайты разрыва.

4. Исследованы кофакторы и эффекторы обнаруженной реакции» Показано, что реакция является Мй2'ь,Са2+- зависимой, ионы цинка и меди полностью ингибируют реакцию. Исследовано влияние;' на реакцию фосфат-иона, фторид-иона и мононуклеотидтрифосфатов, . Показано, что фторид-ион ингибирует реакцию при концентрации 10~2М, фо'сфат-ион при высоких' концентрациях (10 . мМ) конкурентно ингибируют

:1х>-

гакцио, при концентрациях 1мМ вазывают активацию. На основе ïhhhx по ингибированию реакции фторидом сделано редположение об участии активного комплекса магния-вода в ¿уществлении нуклеофильного катализа.

.Показано, что ДНК-гидролизуюшие антитела предпочтительно адролизуют фосфодиэфирную связь, образованную G-C парами, редпочтительность гидролиза определяется вторичной груктуроя субстрата.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ. А..М. Шустер, Г.В.Гололобов, О.А.Квашук, А.Г.Габибов. итиидиотипические и природные каталитически активные ртитела. Молекулярная-биология, 3S91, т.25, вып. 3, с'. 174. ' ■ . ',..-• . - A.M.Шустер, .Г.В.Гололобов,. О.А.Квашук,' А.Э.Богомолова, .В.Смирнов, • А.Г.Габибов. Взаимодействие каталитически, ктивных антител ;с -ДНК. Докл. Акад. Наук СССР, 1991г-, .319, выпSB, стр jS~Oi-t -/Sv'£

. Г.В.Гололобов, ' Р.П.Ядав, . А.Э.-Богомолова, "A.M.Шустер, .М.Белостоцкая," А.Г.Габибов. "Выделение и характеристика аталитйчвских антител к-ДНК.при. системной красной волчанке, иохимия, .3992, в печати. '

. A.M.Shuster, G.Y.Gololobóv, O.A.Kvashuk, Ä.E.Bogofflolova, ,V.Smlrnöv," A.G.Gabibov. DNA-hydrolysing autoantibodies, cience, 1992, v. " . , -p.

. Shuster A.M., Go lo lobo v G.V., Kvâshuk O.A., Bcgosolova .E,, Yadav 8.P. , Sralrnov I.V. and Gábibov A.G,. Natural' DNA bzyáes.- Abstracts' of the IUPAC-NOST International Simposium n 'Епгузгег in Organic Synthesis, 1932, p. 167.

A.G.Gabibov, A.M.Shuster, G.VlGololobov, O.A.Kvashuk, .I,-Cromova, I.B.Bronsteln. Natural DNA abzyaes in cose оГ utoinnuna pathology • and ant iIdiotypic antibodies against opoisomsrase I. Abstracts of International Conference Topoisoserases in cheniotberapy", 1991, p.57.