Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Взаимодействие ДНК — белок при аутоиммунном процессе

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Взаимодействие ДНК — белок при аутоиммунном процессе"



' 5 ' :

" ' 4 российская академия наук институт молекулярной биологии

им. В. А. ЭНГЕЛЬГАРДТА

На правах рукописи УДК 577.083.3

ГОЛОЛОБОВ ГЕННАДИЙ ВИКТОРОВИЧ

Взаимодействие ДНК — белок при аутоиммунном процессе

03.00.03 —-йолекулярная биология

автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва — 1992

Работа выполнена в группе химических основ биокатализа Института Молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта

Научный руководитель: канд. хим. наук А. Г. Габибов Научный консультант: доктор хим. наук, проф. Г. И. Яковл

Официальные оппоненты: доктор хим. наук, С. Н. Кочетков

канд. хим. наук, А. А. Комиссаров

Ведущая организация: Институт биохимии им. А. Н. Баха Р

дании Специализированного . совета по защите докторских ; сертаций Д 002.79.01 при Институте Молекулярной Биоло им. В. Л. Энгельгардта РАН по адресу. П79Я4, Москва В-; ул. Вавилова, 32.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Инстит; Молекулярной Биологии им. В. А. Энгельгардта.

Реферат разослан «/¿? » 1992 г.

Ученый секретарь Специализированного совета канд. хим. наук ИПЫН,

Защита состоится

часов на з;

. - ! ■ГЪ | ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

туалькость проблемы. 3 последние годы з' биокатализе о^зошли революционные изменения. Наряд/ с развитием й_Щ^6нннх биохимических энзиыологических .исследования едметом пристального- взимания биохимиков ' стали талитические РНК (рибозимы) и каталитические антитела бзимы). Изучение этих новых объектов сулит значительный огресс в фундаментальных областях - исследовании механизма тализа физиологически важных реакция и практической > ласти - создании навык устойчивых биокатализаторов, особных включать и выкдочать з^в^яиие процессы та<5олизма.

За зоемя, прошедше доел« открытия новых охатализаторов. появилось иного яссявдозанзй яапрзчя-нк'.-;

выяснение- механизма нзаикодействия яиокгчтазизатора бстратом и субстратной ся^ий^ячнесгя. При исследовани: аммодействия субстратов и р'лбозиыов в основном еыяснен-• просы. связанные • гзаиью действием металлов, ролью рвичном и гт&ри'-ич*! структуры нуклеиновое кислоты з ханизме ¿атг-лчтического . расщепления. Исследованию бстратйоя ^леаифичност4 айзимов также посвящено немало сперимеяТальных работ, Лля -этой .цели используется широкий секзл- физико-химическзга ■меггодов, активно применяемых в зимологии, .- / - '

Особе®- - место этом ряду занимает работы-

следованию природных а£зимоа. ТакТ а- самых последних ботах ' группы С.Паула 1Паул,' --1989,] Vисследована ецифичность каталитических' .'аутоаятитея к вазоактивному тес'тиналъному ' пртттаду. Несмотря на обрару.-кение ецифических сайтов разрыва пептадноя связи, авторы едполагают, что имеет место, узнавание на уровне антитело-Лимерная молекула ЕС.Паул', неопубликованные результаты 1.

Об«эктом наших исследования являются антитела к ДНК., о являющее себя при аутоиммунных патологиях. Ранее нами ло »ысказане лоедположчнме о возможности гузастзочания '.. ' ~ .■' ■ • л^лч'-е'.'-'^У" ••."-^цнчмп з

отношении ДНК. при аутоиммунных "патологиях Шустёр и д| Был проведен поиск таких' антител и было показано, чт случае., склеродермы ' антитела, ' связывание . ДНК ябля! антиидиатипическиш антителами к ферменту» определяю! топологическое состояние ДНК. ^ тошжзомеразе Г-(Бронштея др. ]. ' " - ' /Л: ... . - ,

При системной красной волчанке нами' были • обнаруа антитела, способные катализировать гидролиз фосфодиэфир связи ДНК (Шустер и др. ]. Таким образом было обнаружено типа взаимодействия „ антител с ДНК, возникающих аутоиммунном процессе... Однако, неясными остаются вопрос характере такого взаимодействия, о .специфичности связывэ аутоиммунных антител с ДНК и характере и специфично реакции,, .катализируемой , ДНК-антителами. Решение " э вопросов появляется, предметом настоящего диссертационк исследования., .

Цели V . задачи исследования. . -. Ъ задачи', настоя диссертационной работы входила разработка . эффективн метода очистки ДНК-специфических каталитических антител также , дальнейшее рассмотрение •взаимодействия Д специфических аутоантител с ДНК. Предметом особого интер было выяснение субстратной специфичности обнаруженного Д абзиыа, ' исследование сайт-специфичности, . выяснение р -Первичной ; и вторичной . структуры. ,\ДКК в эффекткзно протекания реакции, -а- также выявление .роли . эффектор влияющих на ход,каталитического процесса/ •'■•..'. ... Научная новизна ц -практическая ценность ; исследования. осодеисследования разработан ■ новый эффективный спо очистки каталитических аутоантител, особенно на стад: аффиннмг и• оБыгокозффективн'бя .жидкостной хроматограф: Исследованы закономерности процессов "связывания аутоанти' с ,ДНК при различных аутоиьшунных заболеваниях. Пока: различный характер взаимодействия антител с ДНК .1 склеродерме и системной красной волчанке. Впервые обиару: дэкануклеотидный субстрат, ' подвергающийся гидроли: катализируемому антителами с . высокой эффективное^

ш'дована кинетика процесса, места разрыва- субстрата, гкторы, влиявшие на реакцию. . Демонстрация, субстратной шфичности каталитических ДНК-аутоантител при системной :ноя волчанке может являться практическл полезным гором в исследовании патогенеза аутоиммунных'процессов. збация работы. Материалы диссертации докладывались на:-15 Биохимическом конгрессе, Иерусалим, 1991 г. Международной конференции "Топоизомеразы в химиотерапии", эяа, 1991 г.

Мездународной конференции "Ферменты в ' органическом гезе", Нью Дели, 1992 г.

Семинарах Институтов Пастера», СЕРНА, 'Брюссель, 1991 г., ^Генетика, Москва, 1992 г.

уктура и об ем работы. Диссертация состоит из

пения, обзора литературы, описания материалов и методов, ультатов собственных исследования и их обсуждения, одов и списка цитированной литературы.

Работ.'! содержит страниц машинописного текста,

унков, сдам. тэ^лиа. ■ ^с-яи.-трафия включает

ературных ясточяяког.

- !

МАТЕРИАЛЫ и методы: Об«ектами исследования слу:и!ли - антитела к. днк,, ученные из сывороток крови больных с аутоиммунными олеваниями. "

оротки крови больных с.склеродермой и системной красной чанкой были предоставлены- Институтом девм^тологии АШ сии. * •

окоэффективную ■жидкостную хроматографии . проводили на боре Beckman - • Altex 110А. с использованием колонки ierose 52.

¡инную хроматографию проводили на колонке с привитой к :люлоэе двуцепочечнои ДНК из тимуса теленка !Sigma,США), :онке с ДКК, привитой к целлвлозе глутаровым диальдегидоы и'езно г: г,-достав лена Г. А. Кевине ким, Новосибирский

° Электрофоретическое разделение белков проводили' по метод1, (Laemnll and al.,1970 ! 'в 12,5%полиакриламидном геле, Окрашивание проводили 0,25%■ кумасси G-25C (Serva,Германия).либо серебром (Bio-Bad,Австрия). Синтез высокомеченных фрагментов,ДНК ' осуществляли пс

методикам (Т.Маниатис и др.,1984) с использованием

32

а Р дезокси-и'у-Р'трифосфатов (Ленинград,СССР). Электрофоретическое разделение фрагментов ДНК проводили в 1S агарозном . геле,в 6% акрилашдном геле,6-и,10-и, 15-и процентных акриламидных . гелях,содержащих 6М ыочевину. Агарозные гели окрашивали бромистым зтидием и фотографировали.Гели .содержащие радиоактивно меченные фрагменты ДНК радиоавтографировали с помощью. рентгеновской пленки РМВ-1 (Тасма,СССР). Полученные радиоавтографы сканировали с. помощью лазерного сканнера-. Ultrascarb <LKB, Швеция), скорость реакции определяли' но., соотношению оптической плотности продукта реакции к суммарной оптической плотности субстрата и продукта.

ДНК-связывание топоизомеразы "I, •антиидиотипических антител при ¿ -склеродерме и антител к .ДНК .при' системной красной волчанке определяли .осаздением комплекса белок-ДНК на нитроцеллюлозном фильтре. Использовали: • фрагмент З'-к глобинсвог'о гена, синтетический ■' нуклеотид, 'содераащил камптотецин-независимый консенсус топоизомеразы, .декамерныя олигоНуклеотид, гидролизушийся каталитическими' антителами. Константу связывания определяли по методу, двойных обратных координат ! Диксон и др. ,1982). '

Ингибивование образования ;' ковалентного комплекса топоизомераза-яуклеотидныя- ' консенсус. ■ проводили при инкубациРГ" антиидаотипических антител, толоизомеразы__ и консенсуса с последующим . определением количества образовавшегося ковалентного комплекса при связывании на нитроцеллюлоэноу фильтре в'денатурирующих условиях,.

Определение кинетических параметров реакции гидролиза декамерного олигонуклеотида проводили графически методом Лаянуивера-Барка.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ. ...

Выделение ЛНК-гидролизуремх антител.

В настоящей работе мы предприняли попытку провести выделение' каталитчески активных антител из оСщэго пула ДНК-связываюших антител аутоиыунноя сыворотки. На первом этапе мы, воспользовались стандартным фракционированием сульфатом аммония, широко применяемым для очистки антител, Общая схема выделения вклочала стадии, традиционные для аффинной очистки молекул а именно: аффинную хроматографию на протеин А

сефарозе, и стадию, используемую для очистки ДНК-связываюнглх белков - элюцию аффинно сорбированных фракций с колонки с Привитой нативноя или модифицированной ДНК. Для оценки эффективности используемых методов очистки была введена единица удельной активности, используеиая для оценки удельной активности ферментов рестрикции .Это было связано с относительно невысоким уровне« эндояукле'азноя актизности исследуемых препаратов антителЧ

В Таблице I суммированы данные по удельной актизности препаратов каталитических антител на различных стадиях выделения. 'Как следует из данных' таблицы, для аффинной, хроматографии. ДНК-специфических каталитических антител использовались два носителя: ¿НК-целлолоза с 'нативноя привитой двухцепочечноя ДНК и' целлюлоза с привитой ЛИС, модифицированной глутаровыи диалъдеГидом /любезно -предоставлена Г.А^Невинским, ИБХ СО РАН, Новосибирск/.

После пропускания, антител, содержащих ^ндонуклеазнуо "** активность, через, колонку с нативноя ДНК.; удалось достаточно эффективно, сорбировать Каталитические антитела на аффинном сорбенте. Активность не элпировалась Ш МаС1.. 1М калия-фосфат элгировал примерно ЗОй обиея .активности. Полностью элюировать антитела с нативноя ДНК удалось только с использованием сильного понижения значений рН /до 2-2,5 единиц/ или денатурирующего агента /ЗМ мочевина/. При этой наблюдалась значительная /до ЗОЖ / потеря активности, /см Таблицу I/. Более »Фиктивным оказалось'. использование

Рис. 1,2 .Аффинная хроматография н<* модифицированной -ДНК-целлюлозе-.

3. Линейный градиент КРз от )0кМ- ло 1М 2.. Линейный градиент Ь'аС) от м>мМ'до И<! ■" пунктирная линия - .профиль ¿НК-тилролизующей активности. Лтрих-луяктиг -.профиль градищта. . ..

Таблица Г Очистка каталитических антител.

Стадия очистки Количество белка Общая активность Удельная активность Выход

Протеин А сефароза 2 мг. 100 е 50е/мг.

ДНК-пеллюлоза (нативная) 0,03 г. 34 е 1100е/мг. 342

ЛНК-целлюлотч. 1 модифицированная) . ' 0 ,03?» г . I 82 е 25009/мг. 82%

носителя с модифицированной ДНК. При оптимальных значениях рН 7,0 .активность полностью связывалась с сорбентом. Как следует из данных,; приведенных на Рис 2, элюция градиентом калий-фосфата. обеспечивает разделение каталитической ' : активности на три фракции. -Изучение специфичности и> ; иммунологических характеристик не показало каких-либо , существенных различия меаду -ними. Поэтому элюция линейным градиентом ;NaCl оказалась в этом случае вполне приемлемой. Полученные . препараты каталитических антител характеризовались высокой удельной активностью /см Таблицу I/. Суммарная активность полученного препарата была на 50- .

• 100% выше -исходной, что можно- о0«яснить, разрушением стабильных-комплексов каталитических антигел с природной ДНК при связывание.с ДНК-носителем, ' V;

. Следующим этапом работы явилось изучение ^процессов связывания ДНК-свяэьшаюгох антител е ДНК-различной длинны и состава. »В качестве объектов бнли выбраны,антииднотипические _ДНК-связываюдие антитела к Tops I при' склеродерме и, ДНК-свяэывашаие антителя рри еиетеиногг красной волчанке.

Определение константы связывания акткидиотипи"еских антител к топоизомеразе I с Фрагментом Л -глобинового гена. .

.Антиидиотипические антитела'•при-склеродерме, как было :!.

показано ранее, являются антителами к ДНК. Представлялось ¡

интересным изучить . специфичность их связывания1 с !

последовательностями- ДНК, которые обладают ' повышенной !

•специфичностмб' по■отношению к топбизоыеразе I эукариот. Б ;

качестве модели были выбраны фрагмент А-глобинового гена, ;

содержащий большое количество сайтов топоизомеразы, и |

• синтетический 20-мерный нуклеотид, .содеряаслй ! каш1тоте1шн~независкмии иуклеотидкый' консенсус. Из рис.Э < видно, что в случае фрагмента ЛА-глобинового тена, константы ] связывания антиидиотипических -антител я - топоизомеразы | близки по значению ЛЛ;5л10"10 И 1,3x1О-10 соответственно), i

- Антиидиотипические-: антитела Связываются специфично, добавление 10-50 кратного, избытка тюли-1 dA-T) не оказывгс-т

2рт«10

О А ■■

0.3 •

* 02 -■

0.1

к<л = г.5-10"10 ЕУП » 1Л-10"10

1

4—I—I—I—

Н-1-Р

10

Е-10

Рис.3 . Определение , . коистант-ы диссоциации ' комплексов • топоизомераза-ЛНК. (лин-ия. 1) и антитело-ДНК- (линия 2! в двойных обратных координатах. ДНК. -фрагмент ЛА-глооинового гена !400 пар нуклеотидов).; срм - импульсы/мин, Е -концентрация ДНК> . . •',■..". .-.■■".. *

существенного, влияния на количество связавшегося полинуклеотида, . что говорит о том, . что связывание обусловлено в основном взаимодействием антител с последовательностью основании нуклеиновой кислоты, .а не взаимодействием остатков фосфорной кислоты в полинуклеотиде с положительно заряженными остатками аминокислот антитела по типу поликатион-полианион.

Ингибирование образования -ковалентного »комплекса топоизомеоаза - консенсус антиилиотипическими антителами.

Чтобы уточнить, являются ли места связывания антител и топоизомеразы' общими, был проведен эксперимент по ингибированию образования ковалентного- . комплекса , между топоизомеразоя и консенсусом антиидиотипическими антителами. Известно, что в.-ходе ферментативной . реакции ■ топоизомераза образует ковалентный комплекс с ДНК. .Реакцию можно ' остановить на стадии образования комплекса добавлением специфического ингибитора, алкалоида камптотеиина. При добавлении его в концентрации 20 мкМ до 30% топоизомеразы образует комплекс, тогда как в обычных условиях доля комплекса составляет 3-52. Как видно -из рис, -4, антиидиотипичёские антитела эффективно ингибируют

образование комплекса. Из получения результатов можно сделать вывод, что вариабельные участки антиидиотипических антител структурно -аналогичны участкам топоизомеразы, ответственные за связывание ■ с .ЛНК и . определяющие ее специфичность. ОНутствие каких-либо каталитических функции у антител можно об«яснить тем, что ' связывающий и каталитический центры топоизомеразы" пространственно разнесены, и антиидиотипические антитела не содержат их одновременно. .

Изучйние специфичности, гидролиза. нипкомолекулярных субстратов антителами к ДНК при системнпр-красной волчанке.

Вторым об«ектом исследования-.стали , антитела ,к.:.ДНК при

. Рис.4 Ингибирование образования ковалентного. комплекса топоизомераза-консенсус антиидиотипическими антителами. . срм - импульсы/мин.

системной красной волчанке. Как известно, наличие антител к ДНК является характеристическим признаком этого заболевания. Антитела к ЛИК -обнаруживаются и в крови здоровых доноров, однако они, как, правило, не проявляют ДНК- связывающей активности, т.к. находятся в блокированном состоянии. Наиболее интересным свойством аутоиммунных антител является наличие у них фосфодиэстеразноя активности по отношению к ДНК. Антитела к ДНК при аутоиммунном процессе не обнаруживают высокой специфичности к последовательности ДНК. Можно отметить лишь их различие по взаимодействию с одноцепочечнов и двуцепочечнои матрицей. Это об«ясняется, по-видимому, тем, что основной вклад в связывание антител с ДНК вносит взаимодействие типа полианион-поликатион. Представлялось интересным изучить ссотйошение мевду связыванием ДНК-субстрата антителами и его гидролизом. Ранее какой-либо специфичности к последовательности ДНК при катализе реакции ' разрыва антителами обнаружено не было [Шустер и др.). На рис.5 представлена электрофореграмма продуктов гидролиза антителами олигонуклеотидов различной длины и состава. Из рис.5 видно, что в диапазоне длины от 10- до 30 нуклеотидов не наблюдается каких-либо различий в степени.гидролиза, т.е.. длина олигонуклеотидного субстрата до 10 нуклеотидов не оказывает влияния на' скорость протекания реакции. Анализ продуктов, как представлено на схеме, показывает, что предпочтительнее гидролизуются фосфодиэфирные .связи- в С-С парах. Наиболее эффективно тидролизо^ался тб-мерныи нуклеотяд состава 5'-СССЛАТТССС-З*. Олигонуклеотид самокомплементарен и' может существовать _в двух состояниях - регулярного -дуплекса ' и шпильки. Для выявления оптимального для катализа структурного состояния была изучена концентрационная - и температурная зависимости а так-хе проведен натиБныи электрофорез в полиакриламидном геле. Из представленных зависимостей .скорости .гидролиза олигонуклеотида. отожженного .при ' низких и .высоких .концентрациях, (рис.6) ...видно,... .что * в. солее низких концентрациях олигонуклеотид эффективно гидролизуется, тогда

6 6 ? ? __

1- 1

1 * 33'цц

Ы^-^'-гЪ^Т-у ','Г, ''г.. • • .............. — ■

1Г 3* • ' ^

ъ

Рис .5 Радио ¿<*Тограф продуктов- Дёгра^талитйчесчичи олигонуклеот«^ различно» длины, и состав, каталитически

антителами- " . .

N - контрольная реакция

реакция в присутствии каталитических антител. ■

1, 5' - ¿саааааао; - 3'

2..5' - ТТТССССТТТ - 3*

3,4. 5' -.сссааттссс-- 3'

5.-5' - СССССССТСССТ - 3'

к 5' - ТТТТТТСТТТТССС -3' з- - аааааасаааассс -3

7. 5' - ОСТССССАСТТТССАСССЛССССССС -3' а V - GCTGGGGACTTTCCAGCr.ACGCr.GCC -V

Г!:: ЬЖ^и« -

А/госх 20

15 5

8

10'

Рис.6 скорости- гидролиз суСстрата1 получеН1!ОГО отжйгом . . .

различных концентрациях. Упах • - скорость гидролиза в ■ относительна единицах. - /концентрация субстрата при '

отжиге (М).

при отжиге при высоких концентрациях реакция сильно дленна. Аналогичные выводы следуют и из температурной ¡симости. Нативныи электрофорез показал,' что в диапазоне нитрации, оптимальных для протекания ' реакции, онуклеотид существует в олноцепочечном виде, т.е. [мальным субстратом является шпилечная структура.

»деление констант связывания низкомолекулярного субстрата НК-гидролизуюшими антителами и кинетических параметров

сции ■

Для изучения параметров связывания олигомерного :трата с антителами проводили измерение констант зывания низкомолекулярного субстрата в каталитических и аталитических условиях. Как видно из рис.7 константа, эделенная в некаталитических условиях, равнялась 10 нМ. зделение константы в каталитических условиях по ибированию реакции гидролиза плазмиднргт ДНК дало то же чение. Для сравнения было изучено ингибируюшэе• влияние гих олигонуклб-утидов различной длины на реакцию гидролиза змидноя' "ДНК. Было показано., что все поямнуклеотиды эывают конкурентное ингибируюшэе влияние на деградацио змиды антителами,' что говорит об общем характере их зывания. - ;

Кинетические параметры реакции . гидролиза, комолекулярного субстрата представлены на ряс.9. станта Михаэлиса составила 16' нМ.

'чрнир влияния на реакцию гидролиза низкомолекулярных

1ркторог. .

Для изучения роли основании в катализе было изучено |янис: на ' реакцию низкомолекулярных составлявших шнуклеотида: фосфат-иона, рибо- и

зоксирибонуклоотидтрифосфатов. Как видно из рис.9, фосфат цшгпрт нн! и^ирумпее деист вис при • концентрации 10 йМ. «¡о предположить наличие в антителах аффинной к фосфату

олигонуклеотида в некаталитических условиях, а) Зависимость количества образовавшегося комплекса от концентрации добавленных антител., б) Определение константы связывания антитело-ДНК графическим методом в двойных обратных координатах. !Е1 -концентрация антител, срм - импульсы в минуту.

декамерного ояигонуклеотида каталитическими антителами.. 1Б) - концентрация субстрата (М), V - скорость реакции (относительные единицы).

матрицы, поскольку ингибирование -реакции сульфат-ионом и хлорид ионом наблюдается только при концентрациях 0,3 Ми 0,5 М, соответственно. При концентрации фосфата 1 мМ и ниже наблюдается увеличение скорости реакции. Колоколообразныи характер зависимости говорит о возможном наличии в связывающем центре антител нескольких участков связывания фосфата, один из которых связывает большой субстрат. Фосфат при высоких концентрациях ингибирует реакцию по конкурентному типу.

Влияние на реасыо иоьонук.л^тидч'рифоегагл? носит оолее сложный характер, зирашюсии«- ч в ¿»к?;«*..-ционком и ингибяторном эффектах при различных Аонц^нтраичзх эффектора. 4 Фактором, определяющим эффект возквистрия, является основание нуклеотида.

Изучение влияния металлов_ на ' ДНК.-гидропиауотуш реакцию

• антител. . -

■ : 1 • . ' ■ ■ ■ *

Реакции гидролиза ДНК каталитическими ^ антителами

явдяются металпогЯав'исимыми. Ранее было показано, что Мг?*.'' 2+2+ ■ Са . и Мп необходимы для. осуществления гидролиза..

Добавление ЭЛТА в эквивалентном количестве ■полностью '

ингибирует 'реакции. Наибольшая - эффективность, "' реакции

■ гидролиза ДНК наблюдается в присутствии, ионов магния. Были

описаны примеры ЛНКаз, использующее в каталитическом акте

два иона металла. Один из ник,■ как . правило, выполнял .

координирующую роль, а другой - функцию кислотного

катализатора. При изучении одновременного, влияния на реакцию

пары - обнаружено, что максимальная скорость

гидролиза наблюдается в паре магний-кальции. Присутствие в

реакционной смеси ионов цинка или меди полностью ингибирует

реакции, марганец не оказывает существенного влияния. В

• реакции гидролиза "модельного олигонуклеотида добавление кальция, как видно из рис.П, приводит к увеличению максимальной скорости реакции. Это позволяет' предположить, что связывание кальция вызывает структурные изменения в активном центре антител, что приводит к увеличению скорости

íwc.lO Тлкянж- «алмж* w> ки»т««к»е п.р.иггр* р»»пв» гилролипа ¿«>K&>icpiicró олиггиуклютш».

реакции.'- Роль магния, как кислотного катализатора подтверждается *в эксперименте по ингибированию реакции гидролпЬа фторид- ионом.. Магния служит" координатором .молекулы воды, -являющаяся нуклеофильнш агентом. Фторид-ион, как было показано ранее, способен замечать воду з комплексе магний-вода давая непродуктивный комплекс. Было показано, что фторид-ион ингибирует фосфодиэетеразную реакции

антител при, концентрации 10 кМ, wo хоров» согласуется с . данными по ингибирора..-!»- ЯНКа; а зк'здкухЯеаэиоя активности полимераз.

1

ВЫВОДЫ .

I. Разработан эффективный метод очистки ДНК-специфических, каталитических антител,'основанный на аффинной хроматографии на протеин А сефарозе и модифицированной ДНК-иеляюл6:з$> исследованы биохимические и иммунологические характеристики обнаруженных.природных, ДНК-абзимов. .':. : .

.2. Проведен сравнительный анализ связывания антител' к ДНК при . различных аутоиммунных заболеваниях с. различный модельными ДНК.. Продемонстрирован = различный характер связывания ДНК с антителом при склеродерме и системной « красной волчанке. г

3. Исследованы каталитические свойства антител к JHK при системной красной волчанке по отношению к низкомол&кулярньш • о лигонуклеотидным" ••' субстратам.' , Обнаружен ' декамерныя 'самокомплементарный олигонуклеотид, характеризующийся высокими кинетическими параметрами: Км =■ 16 нМ,

Умакс.=50 фемтамолей/час, определены сайты разрыва.

4. Исследованы кофакторы и эффекторы обнаруженной реакции. Показано, что реакция является Mg2+,Ca2+- зависимой, ионы, цинка и меди полностью ингибируют реакцию. Исследовано влияние; на реакцию фосфат-иона,' фторид-иона и ыононуклеотидтрифосфатов. Показано, что фторид-ион ингибирует реакцию при концентрации 10~2М, фосфат-ион при высоких' концентрациях (10 . иШ конкурентно ингибируют

'■■-ШР''

.кшш, при концентрациях 1мМ ваэывают активаци». На основе :ных по ингибированию реакции фторидом сделано ■дполохение об участии активного комплекса магний-вода в чцествлении нуклеофильного катализа.

1оказано, что ДНК-гидролизуюшие антитегла предпочтительно 1ролизуют фосфодиэфирную связь, образованную G-C парами, ;дпочтительность гидролиза определяется вторичной зуктуроп субстрата.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

А.. М. Шустер, Г.В.Гололобов, О.А.Квашук-, А.Г.Габибов. гиидиотилические и природные каталитически активные гитела. Молекулярная биология, 1991, т.25, вьт.-З, с'.17-

А.М.Шустер, . Г.В.Гололобов , О.А.Кзашук,' А.Э.Богомолова, В.Смирнов, А.Г.Габибов. Взаимодействие каталитически тивннх антител .с ДКК. Докл. Акад. Наук СССР, 1991г.., 319, вып. . , стр.

Г.В.Гололобов, Р.П.Ядав, А.Э.-Богомолова, ЛА.М.Шустер, М.Белостоцкая,""" А.Г.Габибов. 'Выделение и характеристика .талитических антител к- ДНК при системной красной долчанке. ;охимия, 1992, в печати.

. A.M.Shuster, G.V.Gololobôv, O.A.KvashùKv .À.E.Bôgpoelova,-V.SrairnöVi A.G.Gabibov. DNA-hydrolyslns ' autoantibodies. :lenco, 1992, v. , p.

. Shuster' A.M., Gololobov G.V., Kvàshul: O.A., Bogoaolova ,E., Yadav R.P., Smlrnov I.V. and GaMfcov A.G. . Natural" DNA 3zyif.es. Abstracts'of the IÜPAC-NOST International Slmposlun b'Ensyaes In Organic Synthesis, 1992, p.167. .' A.G.Gabibov, A.îJ.Shuster, G.r. Gololobov, O.A.Kvashuk, .I^romova, I.B.Bronsteln. Natural DMA absycss m case of utolnnune pathology ■ and antiIdiotypic antibodies against Dpolsousrase I. Abstracts or International Conference Topoisoœerases in chealotfcerapy", 1991, p.07.