Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Взаимодействие полинуклеотидов с организованными фосфолипидными поверхностями в присутствии ионов металлов как фактора окружающей среды

ВАК РФ 03.00.16, Экология

Автореферат диссертации по теме "Взаимодействие полинуклеотидов с организованными фосфолипидными поверхностями в присутствии ионов металлов как фактора окружающей среды"

шо "ооруьг

АГЕНТСТВО ЕЖШЮРМАТЖ1 И ЭКОЛОГИИ ЧЕЛОВЕКА

На правах рукописи 7ДК 577.115.7:577.323.23:612..

к 7 в и ч к и н вас1ш11 к1адишр0вич

взаж>де:!ств1ш шшкеео'сшов с организованные

фосаолже'щкшш! повшршхтяиг в прнсутстзш ионов металлов как ¿актора окршхж'; срзе1

(03.00.15 - экологая)

диссертация

на соискаязе ученой степекл кандидата фпзико-уате.матическлх наук в форме научного доклада

Москва 1592

Работа выполнена в лаборатория генных лекарственных средств НИИ биотехнологии и: .в лаборатория биофизики ВНИИ прикладной

микробиологии

- доктор химических наук Р.й.Жданов

- кандидат шизико-математичес-ух наук ©.Ш.Йсангалин

доктор физико-математических наук Казанцев 3.§. доктор биологических наук Григорян Г.Л.

доктор химических наук Б.И.Сухоруков

Казанский Государственный университет кафедра прикладной экологии

Еацита диссертации состоится " 4 " декабря I9S2 года в 12 час. 30 мин. на заседании Специализированного Совета Л. 170. 01. 01 при Агентстве биоинформатики и экологии чзлове ЫНО "Форум" по адресу: П7807, Москва, просп. 60-летия Октяг

Автореферат разослан " _4_ " ноября IS92 г.

Ученый секретарь Специализированного Совета доктор физ.мат. наук

Научные руководители Официальные оппоненты:

Научипй консультант: Ведущая организация:

-■ ' ""

'.Й ОБЩАЯ ХАШСГЕИЮаЧША РАШШ

Актуальность теь.ы. Основные молекулы клотки - болки, нуклеиновые кислоты и лиивды взаимодействуют друг о другом, образуя различные комплексы для осуществления клеточных функций. Наименее изученными на • сегодняшний день являются лииид-нуклеиновыо взаимодействия. Существует лшиь ограниченное число донных о взаимодействии фосфолипидов с нуклеиновыми кислотами ( МапеоИ «г «1. 197^,1979;. Сухоруков, 1975,1979), в том число б присутствии ионов металлов (Будаер и др., 1980), (Ыаизоди и др. 1981). Однако такие взаимодействия! могут быть важны при нормировании ДНК-мембрен-ных комплексов, которым отводят важную роль в процессах репликации и транскрипции (ыанзоли и др., 1979; Алесенко, Бурлакова и др., 1981) вирусной и фаговой инцющии, транслокации Д11К через биологические мембраны (Будаер и др., 1985).

Загрязнение окружающей среды промышленными отходами, среди которых немалую долю составляют соли тяжелых металлов, приводит к накоплению их в аявых организмах, что влияет и на ДМ-меыбрсл-ные комплексы клеток. Это влияние моыэт выражаться на плиточном уровне в мутациях, в нарушениях дгерференцировки клеток, в 1« раковом переровдении, в угнетении процессов реплшсацил и гр/шскрн-пции, экспрессии генов,вплоть до гибели клеток.

В связи с этим очевидна важность детального изучония цюа^о-липвд-нуклеиновых взаимодействий на модельной системо, в кина-с*ве которой нами бшт выбрана система - цюсфатидилхолиноиыо цо-закулы - природные и синтетические полинуклеотиды, а также ишю-нгние влияния на эту систому ионов металлов из окрунимаеИ сроды.

Настоящая работа проводилась в соответствии о темами В1111111Ш в 1978-80ГГ. и в соответствии с программой по созданию генных лекарственных средств во ШШ биотехнологии в 1991-92гг.

Цель работы, Основная цель работы заключалась в исследовании роли ионов двухвалентных металлов как ^актора окрунаицой сроды во Езаи'.;одейстБии синтетических подилуглеотидов и природных н/к-лоино:-;щс кислот с ^юоЬолшвдниш везикулами, создании ¡.одели таких взаимодействий, а установлении связи отоА модели о ДИК->.:з:,:бра.ч1Ш!<:и конгелссшм.

Научная нонюнц. 13 работа изучены основные закономерности кашисксообразоъиыл иолднугл еотвдов с оргшшэовытыми ■роыала-

пидными поверхностями в присутствии донов металлов.

В работе впервые показана основная роль ел^шфильщас фасфсиш-нидов: фосфатидилхолина, сфингомиелина н фосфатидилотаноаамина в образовании комплекса:фосфолипидные везикулы - лшшнукдеотид -ионы двухвалентных металлов (Ме^+) (("тройной комплекс") и влия-нио на этот процесс других липидов. Обнаружено существование "тройных комплексов" двух типов (5з зависимости -от информации по-линуклеотида) - с' двух- или трехцепочечной спиралью (комплекс I

1 типа) или с одноцепочечным полинуклеот 'дом (комплекс II типа). Показан кооперативный характер связывания двухвалентных катионов в комплексах фосфсшшидных везикул с двух- и трехспиральными по-линуклеотидами.

Показано, что степень связывания ДИК с фоофодишщными вези-кулш«!и и не зависит от вида ДНК, но пропорциональна константе связывания с фосфадипадаш. Впервые изучена тонкая структура тройных комплексов методом электронной микроскопии (негативный контраст и заиоракивание-скалывание).

Предложена модель тройных комплексов и сделана попытка на эё основе объяснить структуру ящерных конишексов поры, "контактов Байора" и мозосом бактерий. Исследовано изменение вторичной структуры полинуклеотидов и фазового состояыя липидного бислоя при образовании "тройных комплексов". Изучена рель широкого круга ионов моталлов в способности образовывать тройные комплексы или влиять на их образование.. Сделан вывод, что ряд тяжелых и ядовитых моталлов способен разрушать тройные комплексы и нарушать такие функции клеток как роилик^цин >1 транскрипция.

Практическое значение. Выяснение тонкой структуры тройных коииюксов и особенностей их (¿'Ор;<.лрования (.:0x7т использоваться ь генетике и генной икжшорнл в с^яз/. с проблемой экспрессы; генов. Становится ясным, что нормальной окспресс;ш гена он дат-жен быть сьязан с мембраной с образование:.. .ройного ко/.х-юкса меяду ДНК и мембранные фосфолипидаг.ш. Данные о структуре тройных комплексов могут быть использованы в биохимии и биофизике при изучении и анализе клеточной ДНК, поскольку многие свойства ДНК в клетке (суперскрученность, вторичная структура, укладка в ядре и нуклео, иде бактерий) зависят от контактов ДНК с мембраней.

Получившее недавно широкое использование лкпосом в качестве переносчиков в ¡тетку генетического материала дата;о учитывать существование специТпчеоких контактов ме-ду ^сс^олиг.идаг.-: к ДНК,

:начэ это ткет приводить к артефактам в работе. В то же время ;а осново-полученных нами данных существует возможность создания юкторов с использованием лшосом, когда ДНК находится снаружи юсфоляпидаых везикул, что может облегчить еа проникновение в летку. Тройной комплекс I типа предложен в качестве модельной шстемы для кзyqeния влияния факторов окружающей среды на ДНК-■шмбрашша контакты и связанные с ниш функции клеток. "Тройные ¡сшлксц" очень чувствительны к целому ряду внесших воздействий, юобенно к ионам металлов, поэтому могут служить индикатором загрязнения окружающей среды тяжелыми и ядовитым металлами. На ¡той основе возможно создание бпосенсоров нового типа. Некоторые фоблеш репликации и транскришдаи могут быть решены, исходя из федлзгаемой здесь модели тройных комплексов.

Апробация таботы. Основные результаты докладывались на Мек-зународном симпозиуме по бнофззшш нуклеиновых кислот и нухслео-зротеинов, Таллинн, 1981; на конференциях и семинарах во ВНШ лрикладной микробиологии в 1985, 1987, 1989 г., на конференции "Современные направления развития биотехнологии", НПО Биотехнология, 1991; Международной школе-семинаре НАТО/ФЕБО "Достижения в области изучения белок-липидных взаимодействий и дункции рецепторов". Спетсес, Греция, 1992; Семинаре Института молекулярной генетики РАН, Москва, 1992, Межинститутском семинаре "Хромосома" РАН, Москва, 1992.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 12 печат-ешх работ, вклзочая обзорную работу 'Толь мзмбран в организации и экспрессии генома прокариотов и эукариотов" ч.1 и 2. ВИНИТИ, Москва, 1982.

Структура работы. Материалы работы распределены по главам в следующем порядке:

Глава I - экспериментальная часть, в которой излагаются используемые в работе реагенты, приборы и метода эксперимента.

В главе II описывается сущность явления образования комплексов пашшуклаотидов с фосфолипидаыш везикулами и Ме^+. Приведены доказательства существования двух типов таких комплексов.

В главе Ш анализируется методом КД, микрокалориметрин, ЭПР, изменение вторичной структуры полинуклеотида при образовании тройного комплекса и делается вывод о вб частичной деспиралиэа-ции.

В главв ТУ анализируется состояшю фоаТюйшяд-компоавлгы тройного комплекса .о время комплоксообразования.

В глава У приводился ».юдоль "тройных" ксжплоксоб р. дас-тсп расчет диаметра ядэрикх пор, являюпдхся снедсуш&м образования ДНК-мембранных контактов в эукарнотичееких ¿слетках.

Стдаяьно следуют вывода, список работ автора,, кснользспаншх в диссертации.

Диссертация.изложена на 26 страницах шшшовксяого текста автореферата, содержит 9 рисунков и 1 таблицу.

Прлокения» внносишв на защиту

1. Полннуклеотиды образуют два типа "тройиих" комплексов с липосошма из фосфатидилхолина, фосфатядалэяанодамина и офшго-миолшю в присутствии двухвалентных катионов ряда металлов. Кола-лаксы I типе образуются с двух- или трехцепочечныш пслгнуглео™ • тедами, второго типа - с одноцепочечннми полшцтаеотздамп >

2. При образовании "тройных" комплексов первого *та с двух-лли-трехцопочечными иолинуклеотидами происходит локаяьпое нарушение вторичной структуры полинуклеотида и изменение фазового состояния лииздного бяслоя,

3. Двухвалентные катионы Мп2+, са2'*', ш2'1', Со2+, Ре2'*", 2п2+ усиливают взаимодействие полинуклеотидов с фосфолшшдными везикулами пропорционально константе связывания катиона с фосшо-липидами, в то время, как си2+,рь£+,ва2+, са2'*" разрушает "тройной" комплекс, образованный первой группой ионов металлов.

4. Обобщением экспериментальных данных автора и литературных данных является модель "тройных кошлексов", включающая в себя двойную спираль ДНК, низкомолекулярную РНК^ систему из двух близко расположенных липидных бислоов и Мо~+, в результате комп-лексообразования образуются структуры типа ядерных пор или"кон-тактов Байера" в прокариотах.

5. "Тройные" комплексы являются адекватной моделью для изучения действия экологически вредных факторов на ДНК-мембранные контакты в клетке и могут явиться основой для создания биосенсоров нового типа на различные абиотические факторы окружающей среды.

ОСНОВНОЕ СЩЦЖЕИВ РАБОТЫ

lo Зхсгершоитглгпая пасть. Материалы и метода I.I. Роагелтц я катэраалы

Использовали препараты ДНК из спзрш лосося (" siga»", США), »■голе^сяряэя нзспа 2-Т0/, ДНК из E.coli (" Serva", ФРГ), высо-коглолех^уляряую .ГОШ-на шлуса телэш^а ("serra", ФРГ), полпздени-лозая кпслоха (полз А), полиурпдиловоя кислота (пата У) и поли-цитпдаловад кислота (" s.tc-V, США) с .молекулярной массой 15-10^.

Привядал слздутгнпс роагепты: липида - личный левдтш - стандарт. «^сйвгпдлчхолин (l'f.) (35/Í частота) (предприятие "Баолек" Харых-п). т. - - дагаристоал ^юсЗжгадшгхеявп (ДДОХ) (" sorva <5РГ), фосфаги-хчлоерня (J-C); »^иягомеощш (СМ), кпрдимюшш (КД), хояесторип (XQfl), лмяслонсвая кислота (ЛК, "Kouh Light Вели-коСрятекия), ДПКчза Т. (счг'еность 250 I" /от) фосфолилззн С и д, СП0р:.ВДННг СЙТА, тртггоя Х-ЭДО, HEPES (ясо "Serva ФРГ).

Использовашшо СОЛИ, BaClg, %C12, CaClg, MnClg, CoClg.CdC.lg, WcS04, i'oS04, CuSU^ ,/lnSO^, iii {KOyg/ РЬ(СК,ССО)г , бЫЛИ KS8-лпфчкацпя W и "ocre? (Сохзроаятяв). Bes раствори солей (кроне 'PoS04, котор.-ii! готовили в ацетатном буфера pll 5,0) использовали в вдда 0,8 М к9'_»о*шсго раствора в 0,0IM HSFES буфере, рН 7,2. Использовались спиновно зочда: 5- и 16-доксилстэаршоЕыэ кислоты фирмн " sicoa " (США). Для исследований штодом ЭПР спип-мочашшх полшуклоотвдов попользовали поли У и пата А фирм* "Роанпл" (Вокг-рия). Коммерческие препараты освобождались от низкомолекулярных примесей осажденном высокомолекулярной фракции из раствора холод-Hiai атаяолом. Осадок растворяли в 0,001М ЭДТА, подвергали диализу в течение 4-х суток. Молекулярный вес полученных препаратов, определенный седишэнгациошшм методом составляет ~ 50000 дальтон ( — 5з ). Сшш-мечэкная полнурпдаловая кислота была синтезирована Петровым А.И. (1ГГЭБ РАН) пцилировшшем полиуридиловой кислоты кмида з олидоы З-кароокси-2,2,5,б-тотраметилдирролиноксила. Степень модификации полднумоотидов определяли путем сравнения амплптуд центральных нокпонэнтоз спектров З-карбонзл-2,2,5,5 ■ -тотршлетилтшрролиноксилз (0,1 г.й) стандартного раствора и раствора полинуклоотида известной концентрация. Для поли А ока составляла 1,5; доя поли У - 4,2 спиновых мотки на 100 нуклеотидов.

1.2. Методы

1.2.1. Приготовление лилосом

Липосомы получади из суспензии яичного лецитина и других ли~ пидов и их смесей в нереэ -буфере, рН 7,2 с исходной коицентра-цией 10 иг/т путем озвучивания в точение 10-30 минут в зависимости от целей исследования на ультразвуковом дезинтеграторе с внешним охлаждением водой со льдом.-

1.2.2. Спектральные метода

Турбидаметрпческиэ измерения ДНК и лилосом проводили на спектрофотометра Бокглаи-26. Кривые плавлений ДНК, голи А и поли 7 спи шли на спектрофотометре Варвдн-219 (США), в термостатированной ячейке, в кювете с длиной оптического пути I си, объем образца 2 мл. Спектры кругового дихроизма записывали на епектроколяри-метре ¿-500 А (Япония) в кварцевой кювете толщиной I см в объеме 2,0 мл.

1.2.3. Дифференциальная сканирующая шщрокагюриметрця

Микрокалоримзтркческие дашше получены с использованием длф-фвренцваяыюго адиабатического сяакцрущэдо шкрлкалоримв-гра ДАСМ-1М (СКБ БП, РАН) пря скорости прогрева I К*шн~- и избыточном давления 1,5 атмосферы. Объем образца в клвете 1,5 см'-'.

1.2.4. Методы магнитного резонанса

Спектры ЭПР двухвалентного марганца, сшн-ыечэнных полаяук-леотидов и кирных кислот регистрировали па рэдаоспактрокэтре "Бг-икиг ек-2оо" с температурной приставкой. Образцы помещали в калиброванные капилляры с запаянным рдон из боросдлннагнаго стекла ("р!аЬег ФРГ), (внутренний диаметр I ш).

Для регистрации спектров ЗПР спин-мечэшнш поли У смешивали с намеченным поли А, в пропорции 1:1 в 0,01М 1;г1в-НС1, рН 7,5. Смесь прогревали.при 40°С в течение 25 минут, затем 10 часов выдерживали при температуре +4°С. К полученному раствору двухспи-рального комплекса поли А • поли У (конечная концентрация 4*10~%) добавляли суспензию фосфолипидкых везикул (I хлг/мл) и инкубировали 15 мин. в буфере 0,1М гг1в-НС1 и 0,0Ш иаС1 СрН 7,5). Фос-фолипидные везикулы метили добавлением I мкл спиртового раствора

спин-мечештой .тарной кислой! к 100 мя<г взвеси.

У,сл'оиня. тегадтратш спектров ЭЛР спин-мечешшх полиадеиило-вой з подаурвдз-яовой кислот г. их комплексов ("елабоишобилизован-шй" спектр) обычно были: развертка 100 о, мощность Р-1-53В , ьмпллтуда модуляция Спектры ЭПР сильной?,мобилизован- '

них стш-*«еток (низко и внеонополыше экстремумы) регистрировали при ¡^=3,^0 и большем усилении Для изучения температурной зависимости спектров ЭПР' спектра за"яснвалп при увеличивающихся тем-ыох'Г,турах, начиная с 10еП чэуоз 2~5°С, точность измерения температуры оила 0,2°С. В стдодычх случаях спектры ЭПР регистрировали при олча'/денш смесей. Оиоятры ЭПР фоефолнпидннх везикул и их комплексов, коченных стда-^ешиги яроизводтигя стеариновой кпелоты, содох»аыгШ нигроуснльшЛ евойо,<и»радтаышагй $рашант в 5-, или Хб-иолакекий углеводородной цсш (5 из , 16 из), регистрировали 1три рассорим ЮОз » Мб бВ.ешднтядэ иодуляцая н »10 или З.га.

Ляя спектров ЭПР одноцепочочиых епкн--иладквнх полпйзягеотдцов зычрсляяеоь значения времени корреляции Те. по (ьоргдулз:

(\fT7I7U -:()

(I)

гделН,1~1Егрш1а етзпотолыюй компонента *тшле?яого спектра ЭШ^ п 1 ^ - ачплчтудч яизкетшыюй и шеокопольной ком-~~ поиент трлплэта;

Для двухцепочанх стш-мечешояс подянуклеотидов и их комплексов вычислялась значения параметра 1+1/1-1 , который использовался затем для построения его температурных зависимостей. Для такпх спектров, содержащих заторможенные кошоненты определялось такте значение константы Для спектров ЭПР фосфэлипвдгже

вззпкул и их ког»агле::сов, мэчешшх пщюсообныш зондаж, определялись ватгтны 2А± и ?Лц а затем вычислялись значения параметра порядка 5 с поправкой на полярность шжроокруяення по фор,туяр.м (Бэрлинер, 1976):

с'_ А'„ - Ах а. _ /<';-А1 . А и ~ •/■/

~ Ана -С^хз я,,* ~ 27^5 Я,;,

А^м'к , а9 = (Ли +АУУ )/з " 26 ^

' ° Д,, в , Л« - ЗУ,* £

/

где 2А// - расстояние мэгкду внеипкии экстремума.™ спектра ОП?, 2Ах - расстояние моэду внутренними зхстрокг/ирт спектра "ПР.

Джа cuoirpoa д'й? ^«оаХолипэдшх веахгкул % иг. шшлехюов, мзпсз-их jCïiSj на осиовэ выеокояашюй îco:oto:îcî;vîî сизктрг. аа^шслялея арзнотр Л/Б.

Дяя *Н-ЯШ? исслойошкеП ;:СПГ1СОО:Й; готовили в 2 О, также как и раствор CoCl'g, хжшчеокаэ едшх-и сйглалоо ïl-mip покэряди в относич-зяыю 2sii-.sïko-.i-ivij» с^льфсната натрия. Измерили?! hpoucussii ГфЕ йош-л-лоЗ гзхэйра-уро па Я^ЯР-спектрофотоматре -

1,2,4. Электронная микроскопия

&iOM-pofUio-j.nH;pocKonii'ïocKco псследогаап» лилось в 'тройкой омиш ко выпроводили шч'одоч нога1'ВЪ1Юх'0 г*оях-расзд>ов:а1Лч уракглащ?— атом с првдеаритгадьной §икеадае5 х-оп-ар-жг.: пл^огпдс:.;.

ри иссдодовшаш мотовок ъамсрагсцла'шЯ'^^гс^м ¡мкзисвс ДШС-яшосоьп' И '""тройном КОИИЛОКС*xol'objwiii I ДО СШч'Я, оДО'А авдлдп 4opii 20 ¡.«шут поело фор^ров^с'г Soceurii^pss

уэ крио^иксс:цЕо осууюсгвлялл в лздрси изд-

ам as м ом до -16У°С. Окол производили коп дгс-г-^шгли 3'10~® торр) и температур© образца -100"<'.;. HsœiiAfiiEis огдтцзе?■>>-сям шютино-углеродной смосыо под углом ЙО0 2 ïevs;i".ïo 2 -3 а и [•ютим углеродом под углом 30е в точоянй 5-6 с» Ройлзкз я а водопровода/^ году п патам пэрзноочлш на йо:ьоу>по!л;ъ 4Cr7î—so!I родовой кислоты для очйсткя от кс{У1вдус?я01'0 кйОДЕвдо* Яосдз -х часовой обработан в этой смэсп реашах иуойкоаяа à ^огшда-овалпой воде и монтировали на опорные 1>егкк, йормлоро--

ой водяожой. Лолучошше. рошшкя цросжтуоэд «w п в.'йтп.-репшоы икроскоце при ускоряющем капрядзшш 60 кв.

2, Образование комплексов оштетичзм01£"полйну1;лэоч,^>в и Ж с фосфолипшцшми возикулами в присутствии конов двухяайвнт--хг. металлов ("тройные комплекец")

2.1. Два типа "тройных комплексов". Турбхцдогатрнческие данные

Характерной особенностью образования"трошшч ког.шлекссв"явл.ч-гся значительное увеличение светорассеяния (мутности) суспензия ¡шосом комплексообразования, наблюдаемое в нашем случае с помо-ью спектрофотометра при длине волны 600 км. На рис Л показана ависимость изменения мутности системы полинуклеотэды-{ФХ)- лило<-эмы при добавлении 5 мл iïg'"1". Если система полшуклзотэды-липо-эмы тлеет поглощение kQ при длине волны 600 им, то яоеле добав-

яе5Ш к аай дг^зилшшшх"катионов и быстрого перемешивания(2 с.) чсрз:; 5-10 ьугиссуь возрастает до значения А,{. Отношение & = А^ЛЦ шкет ^растеризовать яокялзксообраэсвзгаю, поскольку аря одиаййетоз »логиюстн л времени озвушвагяш липосом ость вали-чена ьоатоатая л интервале А0 ст 0,05 до 0,20, Как видно из •].'ПС.1 поли У з пола Ц на пжзняхи мутности суспензии липосом посл< добаняокяя /А-М» поли А вызывал наибольшее увеличение л. до 1,2, однако доззатепие пол; У к поли А в присутствия Ма*""1" уве-дязтазяло -I до 10-12. ¡Х-от «акт мод от свидехельствовать о важной ро:-}]; лпчральноЗ сткпесуры пайЯдтг?.П90тядов в такого рода взаи-Да&глъитияы'о, одасцбпочэчкзе поли У и поли Ц не вы-гич&за ух!э:£2=энзя А . Пола А * волн У, могущий существовать как а дсоньой так и в акдэ тройной спирали вызывает увеличэ1.ле вфянсств оусп5Н"Тг51 взносе». Поли А может при рЯ 5,0 образовывать ;.зой;Г-!о епкрзля, по пун нейтрализм рН их, пс-видимому, очень [лаао, тгсэтс*;у уве.1ачс1<;|е л незначительно.

Образованна "'громкого комплекса" из лмпооом с различным липи-дшш состохсйд с оу^арлс!! концентрацией лияидоя 5С0 мкг/мл при 1«нцэятрацид ДЛЯ 20 шср/ни, 3 Ш привало к значениям «г,

дяя ФХ и Су1 равя-ч» 5,1 и 0,7 соответственно. Было обнаружено, что ¿йшссог-зл из отркцателню .заряаешшх яштдов /КЛ, ФС/ под влиянием попов -улз в кездэитращш I агрегировали ми сливались

в отсух'стъпо Д11К- завивая значительное увеличение «£ . Предотвратить этот процесс и з то аа время понят г. влияние указанных лиии-доз на образование "тройного • кошт-елса" оказалось возможным при нзе сг.;егЕ1г.ан?а? с &Х. в слодукаих соотиошэгашх ФХ:Х0Л (3:1), ФХ:ФЭ (3:1), (2:1), $Х:КЛ (3:1), <РХ:ЛК (5:1).

Для перзчйелэшшг: сносей кояушн следующие значения «с 2,2; 5,0; 5,8; -1,5? 8,0. Но припздонных данных следует, что липосомн, лрлготозглошгас ля ^л, С?-1 и ФЭ, способны формировать изучаемые нам ьо:.чш',т;сы с ,ц?ПС я На2*«, Добавка дозтих лнпздов к данным трем гднлзт но процесс ко-,гсшоксообразоваггоч, глзывая увеличение или укол злотые , Ото [.:0:.г.0т и«е-1ь ваяхео значение при образовании

О 1

шлиажсов Ш!К-ьдаибрйяы--Мб в бактериях яля о эукзряотах, создавая вог.хи.<хос?ъ для рзгуляцни отого .процесса л клеточном цп:у:е и других фчоио-чюгв'«сеиду процессах. По данный турбпдамотрпи комл-лэис ДЖплйнос<»м~И{52+ разругаемся ДККззой I, фосфолшагой О, спсршщшюм, тр!«оаон Х-100, ЭДТА, 0,34 1ЬС1,0,2М КС1, вогакокзем рН до 3,5. Создмвгюя, шггеркалкрутоге между основа шуедя ДНК та-

Асов

t,0

О, S

г, or, а У

ЯдлиД

I I l,.J......J

а)

Рис.la. Кинетика взаимодействия нолиадодиловой (поли А) к иоляуршшловой (полк У) кислот (20 мкг/ш) с (рас-¡Тягидалхоачгтовымл ($Х)~ липооомаш (концентрация фх - 20q тг/т) ыыкс1,, (Ö I«), (0,0.ШНЕ?Щ, 0,01.М ïfaCl , PH 7,2)

s

tf s ~h сДЛК, «кг/мл

Рис.16. -Завпсымосгп сгепеин агрэ-i-an&E язпосом («С) от времени СЗВуЧИЕйНИЯ ¿ШГ'ОСОы

(i) при 0Tp,v И 20 ШГ/Ш

да

з оз Сд^щ щш концентрация лшшдов 200 лжг/ш в озчучиршпш в точение 5мим, (2) и 20 ms (3)

Рис.2. Графики Ск&тчарда для (I) .íitfJCnñ fEM7ça теленка (200 ьпсг/кч) к комплексов (2) ДШ^Х)~вэгш<7ян-

- . (3) поет А-(ФХ)-Г,9-

эикулн - ма8'*. Концентрация поли А - 200 шг/ки, фосфатидшгходшна в везикулах - 2,5 шумя. в ли ыМ trls-HCl, 10 M'v¡

На Ol, pH 7,2.

19 как бромистнй этидяй, актиномицин Д, акридиновый оранжевый лене разрушали "тройной комплекс", что подтверждает важную роль ?орпчной структуры ДНК в образовании "тройного комплекса".

2.2. Связывание ионов марганца /Мп2+ / с полинуклеотидами и ФХ-везикулами. Метод ЭПР

Используя катионы ыю2+ в качестве парамагнитного зонда, мы ¡следовали его связывание с ДЕК и другими полинуклеотидами и в ■ройном кошлексе" о фосфатидилхолиновыми липосомами. Спектр ЭПР |ргаща при связывании с полинуклеотидами уширяется и по ампли-|де сигнала ЭПР можно определить концентрацию свободного марганца ¡пг+]сво<5. Результаты опытов представлены на рис.2 в виде графи->в Сквтчарда. Уравнение Скэтчарда имеет вид:

(е "9 ={мп} связ./£р] суы., индексы означают свободный, связан-¡й и суммарный соответственно. Р сум. - суммарная концентрация юфатов /оснований/ яолинуклеотидов, п - число фосфатов /осно-ишй/ вовлеченных в связывание ионом мп +,Ка - константа связы-1ния. В отсутствие конкуренции в соответствии с уравнением /I/ >8фик А^свой. 011 ^ должен быть линейнш. Если график Скэт-фда нелинеен, то это означает, что макромолекула имеет центры ¡язквания более чем одного типа.

Результаты, лрэдетавленные на рис.2 в координатах Скэтчарда вдзтельствуют о значительных различиях в связывании Ып2+ со юбоджми полинуклеотидами и полинуклеотидами в составе "трой-к комплексов". .График Скэтчарда для ДНК и поли А имеет вид, по-ьзяшшй на рис.2 кривая I и свидетельствуют о наличии двух'цект-1В связывания ып2+. В случае о поли Л в "тройной комплексе" :ривая 3) график почти линейный, что говорят о преимущественном ¡язивашш с центрами одного типа в полинуклеотиде, по-видимому, фосфатами. "Горб" на графике Скэтчарда в случае образования !сй!шх комплексов"с ДНК (кртаая 2) свидетельствует о кооператив-м взаимодействии меззду цэнтргмц связнванйя Ип2+ (КанторвШим-л, 1985).

В соответствии с различиями в связывании Нп2+ в "тройном кодексе" с ДНЯ и поли л, а тахзз на основании данных турбздв-триз мо-но продпололэть суздествоиакне "тройных комплексов" двух нов.

Комплекс первого типа образуется при взаимодействии Мо^+-лп-посомы с нативной ДНК или другими двух или трехспиральными поли-нуклеотидами и характеризуется увеличением мутности суспензии липосом в процессе коыплексообразования.

Комплекс второго тша образуется при взаимодействии с липосомаш и одноцепочечными полинуклеотидами, В результате взаимодействия между фосфатами липидов к полинуклеотидов через мостик происходит, по-видимому, адгезия полянуклеотэдной цепи к поверхности липосомы. Поскольку форма и размер липосом при этом не меняются, а размер (длина) синтетических полинуклеотидов намного меньше высокомолекулярной ДНК, чтобы связывать вместе разные липосомы, то светорассеяние системы практически не меняется (рис.1).

Из анализа рис.2 (кривая 2) следует, что по мере формирова-•ния "тройного комплекса" связывание мп2+ с нативной ДИК приближается к связыванию мп2'1" с пояи А в "тройном комплекса" (рис.2, кривая 3). -г

Можно предположить появление в двойной спирали ДНК одноце-почечных участков при образовании "тройных комплексов".

Однако, для такого вывода нам необходимо, исслздозать независимыми методами конформационнне изменения нолннуклеотвдов в "тройном комплексе". ^

3. Состояние полинуклеотидной компоненты в "тройном комплексе"

3.1. Изменение конформацда ДНК в "тройном комплексе" по данным кругового дихроиздоа.

Одним из ценных методов для получения информации о вторичной структуре ДНК является круговой дихроизм (ВД). При изучении "тройных комплексов" он оказывается полезен еще и потому, что спектры КД в достаточно широких пределах не зависят от светорассеяния суспензии липосом. Спектры КД ДНК в составе "тройного комплекса" представлены на рис.З.

Как видно из рис.З (I) добавление липосом к ДНК не влияет на • спектр КД последней, не отличаясь от контроля (кривая I). Ионы îùg2+ в концентрации 5тм понизят примерно на 15$ амплитуду положительной полосы спектра 1<Д (кривая 2). Дальнейшее повышение концентрации iig2+ ко изменяет спектр КД. Добавле1ше не к комплексу ДНК- вдвое меньшего количества липосом чем в контроле уменьшает амплитуду как положительной, так и отрицательной полос? спектра КД ~ на 20% (кривая 3). Добавлоние лхшосом к тройней/

комплексу до уровня в контроле усиливает этот эффект, (едз.шая 4). Объяснять этот результат можно суперпозицией двух процессов, протекающих, на наш взгляд, одновременно. Во-первых - это адге.здя ДНК к поверхности лшосогд, приводящая к уменьшению её концентра-' щш в свободном С0СТ0Я1И1И в раствора. Во-вторых, с учетом влияния Ид1* на максимум спектра при 279 нм, очевидно относительное увеличение интенсивности положительного максимума спектра КД ДНК в "тройном комплексе" по сравнению с контролем. Это монет свидетельствовать о частичном расплетании цепей ДНК в "тройном комплексе", что подтверждается ни»е данными микрокалориметрии и Ып2+--ЭПР {сходство кривых 2 и 3 на рис.2 при > 0,4 свидетельствует о налички в двойной спирали ДНК одноцепочечных участков).

«

Рис.З. Спектры кругового дихроизма (I) ДНК из спермы лосося

• (2'10'Д, С = 20 мкг/мл) и комплексов (X) ДНК-{ФХ)-бози-кулы (200 мкг/мл), (2) ДНК 5 мМ MgCl , (3) ДНКЧФХ}-в0-зикулы (100 мкг/глл)-HgCl? (5 нк), f4) ДШЯЯО-вези-кулн (200 мкг/мл)- MgGl2C5 мМ), 0,01М НЕ?ЕЗ "О,QILí

NaClg, рн 1,2.

Таблица I. Значения температуры плавления псдинуклеотодоб и лшш-дов в "тройном комплексе" по данным ыпкрокалориметрии

дик мг/мл мМ дмфх мг/ш т пш. ДНК г" Т пл. дш>х поли А' поли У мг/ш - кй мМ Лецитин мг/мл Т пл. поли поли

0,30 - - 83,5 - 0,15 - - 44,6

- - 0,30 - 23,6 0,15 2,5 - 76,5

0,50 5,0 - 85,5 - 0,15 5,0 - 80,5

0,50 10,0 - 86,5 - 0,15 - 1,0 43,3

0,32 - 0,30 84,0 23,0 0,15 ' 2,5 0,25 76,0

0,32 5,0 0,30 86,2 23,5 0,15 2,0 0,50 76,2

3.2. Изменение конформационных состояний синтетических поли-нуклеотидов и ДНК в "тройном комплексе" по данным микрокалориметрш

Значения температуры плавления пояннуклеотидов и лшшдов, полученные с помощью дифференциальной сканирующей микрокалориметряи приведены в таблице I. Как видно из таблицы, добавление лжшдов к ДНК и к поли А*поли У понижает температуру плавлении ( Т пл.) полинуклеотида примерно на 0,5—1,ОК. То же самое можно ыаблвдать и при добавлении липидов к системе полинуклеотцд- Ме2'1'. Небольшие изменения Т пл. пшшнуклеотидов в "тройном комплексе" могут свидетельствовать о локальном характере нарушений восформации поли-нуклеотвда, распространяющемся на его отдельные участки, вне которых структура полинуклеотида остается неизменной. В'комплексе Ма2+— ДНК-ДМФХ плавление ДНК начинается уже при Зб°С (рис.4). Увеличение теплоемкости в интервале 36-80°С можно объяснить тем, что вначале плавятся АТ богатые, наиболее активние в комплексооб--разовашш с липидаыи, участки ДНК (по данным МапйоН, 1979) тогда как при температуре 80-85°С плавятся оставшиеся неразрушенными ГЦ--богатые области ДНК. "За счет этого эффекта, а также из-за злия-ния %2+, пик плавления ДНК сдвигается в сторону более высоких температур.

3.3. Конформацйонные изменения пата А'поли У в "тройном комплексе . Метод спиновых меток.

Для получения конформационных изменений пелинуклеотидов в системе поли А* поли У - фосфолишщные везикулы - Ме наш била измерена температурная зависимость параметра спектра ЭПР

этого комплекса, с нспояьясЕавсзм еапн-яочзпного аналога паяя У* (рис.5). Как' видно из рисунка, добавление фосфатидилхолиновнх везикул к поли А'полп У* привода? к сдвигу в сторону высоких-температур излома на кривой (250С — 33°С). Это может свидетельствовать об "ншобилизыщи" спиновой метки и образовании -лссоциата деке в отсутствие Добавлению зае ионов еще болс-о сдвл-

Рис.4. Термограшы (I) ДНК из спермы лосося (300 мкг/мл); (2) система ШС-ДМФХ-везикулы (320 мкг/гля): ('3) система ДНК-ДМФХ-Еозш:ули-5 ыМ мяс1„, 0,01М меркз, рН 7,2. 2

- 65.0

-60.0

Рис.5. Тешературная зависимость параметра Амах< для систем

(I) поли А.спин-ме-ченний полз У(поли У"); (2) (Щ-вези- * хулы-пали А. поли У

(3) (фх}-в93ш<улн-полл

А-поли

(2,5 мЫ); конпент- , рация (поли А) и „„ Тполя У)-0,000114 =0,3 С лшшда в (гЙ0-везя-кулах:0,01М *Пв-НС1, рН7,&.

гает температуру точки излома кривой (3) в сторона более высоких физиологических температур. Температуры излома не связины прямо с Т пл. палинуклеотида, но с изменением микроокрукения спиновой метки и могут свидетельствовать об образовании комплекса мззду поли А " псши У* и ФХ-везикулами в присутствие ионов . Данные микрокалориметрии в целом подтверждают данный вывод, хотя метод Э11Р выявляет более существенные различия комплексов с üg2+ и беа. Ms2+.

Для создания модели "тройных комплексов" необходимо также представлять какие изменения происходят при комплексообраэовшши с фосфолипидной компонентой.

4. Состояние фосфолипидной компоненты в "тройном комплексе"

4.1. Состояние липидного бислоя по данным микрокалорлмэтрпи

Как видно из таблицы 1'и рис.4. Т^ липосом из ДМФХ при об- . разовании комплекса с ДНК и Mg2+ повышается на 0,5°С.

В то лее время форма пика плавления лнпида несколько деформируется в сторону более высоких температур, что макет свидетельст-'вовать о появлении новой фазы в структуре липидного бислоя. Зтнх явлений не наблвдается при взаимодействии ДМФХ с ДНК. По данным калориметрии рис.4 кривая 2 лшщдная и ДНК-овал компоненты плавятся независимо друг от друга. Незначительные изменении в лидид-ной фазе могут свидетельствовать о локальном взаимодействии мааду полинуклеотидом и поверхностью липосомы. Более дотальную информацию о характере изменений в липидном бислое при образовании "тройного комплекса" дает метод спиновых зондов.

4.2. Коифорыациокные свойства ^.осфодшщцного бислоя в "тройном комплексе". ЭДР гидрофобных спиновых зондов.

Для. изучения поведения лииидов в составе липидного бислоя при образовании "тройного комплекса" использовались сшш-ыеченаые нир-ные кислоты, 5-доксилстеариноьая кислота и 16-доксилстеариновая кислота. Kai; следует из рис. 6. при образовании "тройных комплексов", наблвдается скачкообразное изменение актпвациоиных параметров вращательной диффузии спинового зонда для 5-доксилстеарино-вой кислоты. too указывает на чувствительность локального окружения спиновой метки к образованию "тройного комплекса". Анализ спектров ЗПР 16-доксилстеариновой кислоты показал, что изменение параметров отих спектров не регистрирует образования комплексов

о

-О, У о

0.30

-г

,<■» 9

2.0

• 9 ---

„¿й-г

3.3

Г

3.1

1 , ■ , ,',',,* *

7

Рис.6. Температурная зависимость параметра упорядоченности о Фл-везЕсул, спин-меченных 5-доксилстеариновой кислотой (ФХ* ). I) ФХ*-везикулы; 2) ФХ*-везикулы-поли А'поли У; 3) ФХ*-везикулы-поли Л*пали •У-Мд2+ 2,5 мМ: л п пт он 7; С пали Л. ноли У ~ 10" "М.

0,01 •сгз.о-нс!, ОЛФХ)- X мг/мл.

I и II тиноз, так как течка перегиба температурной зависимости параметров Л/В и спектра ЗНР находится при одной и той пэ температуре (рис.7). ,

Эти данные свидетельствуют о том, что во взаимодействии ыозду пояйнуклостадом и фссфолииидеми участвуют группировки ьйлази ис~

вврхностн лишдаюго бкслоя. В делом это соответствует и данным микрокалориметрии (рис.4), где показана относительная неизменность кривых плавления лшшдов в "тройном комплексе". В то же врэш это на\исключает быстрых изменений в конформации липвдного бислоя при образовании "тройного комплекса". Например, слияние липосом или частичного слияния бислоев о восстановлением в конечном итоге структуры липидного бислоя. Поэтому да1шые ЭПР в используемом нами временном режиме могут эти изменения просто не обнаруживать, поскольку они протекают значительно быстрее. То же самое относится к микрокалориметрии. Хотя при.большой временной ввдервкэ комплекса (сутки) незначительные нарушения в липидном бкслое могут накапливаться и в конце концов их ыоано обнаруаить как в ШР-спектрах зондов, так и в микрокалориметрни (Баягави и др. 1989).

В частности остается невнясненнш вопрос о том, происходит ли слияние липосом при образовании "тройных комплексов", или имеет место их агрегация. Прояснить этот вопрос возможно удастся с помощью методов оптической й электронной микроскопии.

4.3. апектроняо-микроскопическое изучение "тройных комплексов'

Первоначально для исследования "тройных комплексов" мы использовали обычный микроскоп или же флуоресцентный микроскоп при окраске красителями ДНК или липидов. Наблюдаемые картины позволяли предположить, что наряду с агрегацией липосом при образовании "тройных комплексов" происходит их слияние, поскольку из первоначально невидимых липосом 300-500 нм образовывались липосомы 3-10 ¿им и более. Наблвдалось образование гигантских плоских структур типа лент и спиралей, хотя тонкая структура этих образований автору до сих пор не ясна.

Метод негативного контраста в электронной микроскопии на над взгляд подтверждает версию о полном или частичном слиянии липосом. Отдельных липосом в "тройном комплексе" почти не обнаруживается, в то се время из этих данных нельзя исключить и эффект агрэгвдаи липосом. Наиболее информативным методом изучения поведения липидного бислоя,на наш взгляд(является метод замораживания-травления, поскольку ранее нами было установлено, что замораживание-оттадва-ине не разрушает структуры "тройных компонентов" (по данным тур-биддштрки). Подданным метода заморедивания-скалывания добавление к липосоыаы Мд не изменяло структуры липосом. ДНК тимуса теленка вызывало образование конгломератов липосом не меняя в целом ш размера а формы. Наиболее же значительные изменения в структуре

и шорме лотосом на&вдалссь зтя оСразсаашш "тройного комплекса"

С

Характерными структурами, наблюдаемыми в этом случае, яйля-37Х'СЯ вытянутые эллипсоиды- вращения, перетянутые одним или нескол£-кш® ободксми толщиной 20—10 im. Вследствие гетерогенности размеров диюсем аллшюоидн значительно разлетаются по разг.,еру, но KW6S3? ирз.:ерно одинаковую толщину ободка.

Добэ?та;:~з ЭДГА к "тройному комплексу" приводит его к распаду на овдялъгале лкпосокы. Наблюдаемые изменения липосом при образован« "тройкнх кс:лплоксов", по-иошему миошш, соответствуют пред-лсскипюй модели (рис.9).

Д?*я шсонэшга вопроса происходит ли взаимодействие швду ли-посс:.г«ч в "'rpoiii-io'vi комплексе" по типу дгезии или же по типу . слчлннч (часч-пчиото или полного) нами использовались пузнрькл (Заумна я ТроМяа), содоршщио во внутренней полости скюсь бен-зо;1"Хлорс-Т:огу с плотность» 1,0 г/см3, а на поверхности нонослой липпда (ФК), они- являются прекрасной моделью для изучения взаимо-де&стэтя иоьерхвостой. На ДНК, ни bte2+ ( Mg2+ ) ^ отдель-

ности вызывали елаяния пузырьков (ионослоев ФХ). Только комплекс ДНК + вызывая быстрое слияние пузырьков от 500 А до 5-10 кки» На основания stxec данных можно предположить, что в случае жпоаом происходит если не полное их слияние, то, по крайней мере, чрстичноз, как показано на рис.96. Подтворздением этой точки зрения могут слупить данные %-Я№-спектроскопии.

4.4. Исследование "тройных комплексов" методом *Н-ЯМР

%-сге'ктр фссфатидшпсолиновнх липосом (рис.8) практически на меняется при образовании "тройных ксотиексов" с участием щг+ таи Са^г. Использование ко парамагнитных катионов, например Со^+, способных как и jag4"'1" образовывать "тройной комплекс" позволяет изучать некоторые особенности поведения лил^ного бислоя при комплексов оазова.нии.

о,

При концентрации Со ^<1 «41 происходит упшреиие сигналов групп tr1' -(СКЧ)3 фос^атздаиолина, принадлежащих только внешнему слою Л1шосом (рис.86). При ковдентрации Со2+ = I м.Ч наблюдается полное ушрение сигналов от внутренних и внешних 'слоев липосом (рио.бв), что может свидетельствовать о проникновении Со^+ во внутрь липосом. Перестройки липидного бислоя, происходящие при этом процессе можно интерпретировать как частичное слияние липосом в условиях in vitro (рис.96).

m

X

Рис,В «

Споетпн Н-ЯМР ©-»заику (с.) ; J^IK-t/X- «aívücy.iru-;оtЬ Сось(б) и ]}М~ФХ-иС1Шкуд 5 rèi С,o£Un) Û.OIH tr-ic ■O.OJM St?Cis pH 7,2, y С (фуО в везикулах 10 кум .ДНК- I мг/мл

±

±

¡■*аа1 i. i лвдакяяжг X

Г,0 5,0 '/,0 5,0 2,0 10 -Ш.

Ряс.8. Модель образования ДНК-шыбранних коми

лсесов.

а) лмпссош и двонн спкрапь ДНК шкду ньдоа ;

о) частичное- синяки липосом н частичное распЕзтонио ДНК при обраковстти "троййо. комплекса"; в) полнor слнгшяе

липосоу-

ОпЦ

ult

Дм паяного слигааш кужшг, пс-видадаму, дополнительные уело вия (наличие осмотического градиента, определенная, скорее всег низкая концентрация при больших концентрациях Кз2+ процессы адгезии между ДНК и ЛЕПсйй.;агш могут пелнсстыо подавлять слияние). '

o» 1Чж«*язрп®. Род*> исша н додоль "тройных кета-

ли'ссрз

5.1. С&дко пршщшш <?ргарзщзл "тройных комплексов" •

Тя&щ&п яояученч?® но исздедозашго "троигьж иоыпжек-

з ослопу моделл твкчх зодолекоов должны лочь следутхцпе по- п?п обрэзсвежгк "трехного комплекса" двойная ила тройная ¡-•¿хг.г чскгааушюотода в лохаямкпс участках деспиралнзуотся (рас-.зся);

• го .г.;/' , з утгстказс прспаходкт частичное пару-

rv "; --rjy.'- л;:.:"г.гого осгтлоя;

- г--- ; по"поэ слияние ^nnoccv: и зспо 'г::.

- вгайкодепстг;;* ос};щес?вллзтеч кегду чу-'^зстидо:-"-, гдц понн служат :.:остл~

i-; íт '~•■

чр:-,??;'.1 п?лш педель "тро'лых -•.сгяшкооп'' у-птсизт всм-•млзквж» .Tf¿:3uo к ксяот caica, по озбэ объяснить многие струпурц i^. происходите внутри хмзтки. Ccí«.:anc^r.9rtTi»to а "тропок вошяексе" кскот происходить, на . "i: зяг.чкд, олС-^ГуГ-цтм обрессгл. Известно, что везикулц из нейтраль-

ф^холитилов воледстнко сл отташшздая отделе ни друг от сута гаостсян^згс 20--30 А0, Пеокслъку толщена двойкой спнротст днк ютпълчот 20 л, то контакт г.'еяду ляяовсшмк черен ТЩК,

■".ход'З'^'с-'-.'я >.'олсду ttK.-.'Л, iTi^n отсм образованно дата нобольного :соя-змга фосфатзка лдшхдоэ я обо«;.« цепями ДПК через тестик

(на рзелъность гшта Еза^к-двйствий указывают предварптель-ЫЭ деашнз •ÍK-WypbO И °'Р-ЛМР сиелтрссхозш!) mcwst достаточно ос-сбать взаимодействие- ке-?ду цешши ДНК (Н~овязи и стэкянг), при-одя ^локальному - в несколько нар оснований, расплетанию цепей ПК. Эте з свок очередь позволит еадл нескольким .¡юсфгеам обенх опей сстуиить « контакт с фосфата*.« лкитаос и приедет к еце сщьте'иу расплетаний двойной сиг.роли. Поскольку взажодойствдо езду .ШЖ и бислоем распространяется по спирали ато дол&но рнэодкть к сблк;тенз1о бяслсев лшоаоа и в конечном счете к as ентекту, что, как noíiaraw, достаточно для слияния липосом. аялкэйииЗ ход событий изобрз:пен на рис.9. Возможно частичное лияние двух лшюсом с обпазоврлЕеы между ними липкдного бислоя ободком одноцепочочной J5JK, опонсыешзцим зону слияния (рнс.9в).

Попытаемся найти аналогию полученных in vit.ro структур "тройного комплекса" с существующими клеточными структурами in vivo .. Предполагают, что местами взаимодействия ДНК с мембранами являются"ядерные поры, "контакты Байера" в грамстрзцательннх бактериях и мезосомы в грамполсшителышх бактериях. Отлична модельной ситуации от ситуации in vitro, по-видимому, в организации ДНК в клетке в виде петлевых доменов, а также в отсутствии факторов, липидов, белков и пизкомолекулярянх лигаадов, вызывающих слияние мембран,помимо процесса образования "тройного комплекса". Исходаой формой образования ДНК-мембраниых контактов in viva являются, по последним дшпш, нэ плоские мембраны, как полагали раньше, а мембранные везикулы, из которых формируется ядерная оболочка, мезосомы и "контакты Байера". Прокялюстрирусы процесс образования ядерных пор, каким он нам представляется в свете описанных выше данных. Исходным моментом образования ядерной поры возьмем стадию образования "тройного комплекса", изобретшую на рис.9 (4). Предполагая возможность спонтанного слияния везикул, ыокно ожидать слияние окру&алдах "тройной комплекс" вэзикул друг с другом и с центральной везикулой. В итоге образуется структура (рис.9 (5), напоминающая ядерную- пору с центральной гранулой и диафрагмой, затягивающей отварстиа поры. Подобные структуры, сливаясь с себе подобными и другнш везикулами, ¡иогут сформировать целостную ядерную оболочку. В качестве ДНК служит дэкомпактизкру-кщаяся в интерфазе ДНК хромосом. Классическая структура, ядзрныг. пор, набЛццаемая методом тонких срезов, негативного контраста е т.п., по-видимому, образуется во время процедуры фиксации препаратов для электронно-микроскопического исследования. Метод замо-ракивания-скалывания, по-видимому,' является наиболее сохраняшам реальную структуру перового комплекса, поскольку многократное замораживание-оттаивание не разрушает "тройной комплекс". Восьмикратную симметрии ядерных пор можно'объяснить участием октаметрз гистонов, связавшегося с периферией поры или слиянием восьми везикул со структурой, изображенной на рис.9 (4) или участием белков ядерной ламинн. В свето вышеизложенного, ядерные поры н*> . только и не столько аппарат для транспорта веществ через ядорнур мембрану, сколько механизм, обеспечивающий эффективную работу генетического аппарата. Участки расплетания двойной спирали ДНК могут обеспечивать преимущество в инициации репликации и транскрипции. Ыембранное окружение может эффективно влиять на работу •ферментов матричного синтеза а некоторых других (метилазы, кук-

леазы и т.п.).

5.2. Голь ионов металлов как фактора окружающей среды в

образовании "тройных комплексов" и их функции в кЛЙЪка

Кат: било сказано выше, мы исследовали целый ряд двухвалентных катионов металлов на предает их участия в образовании "тройник комплексов". Для этого мы использовали метод турбидиметрии, взяв для оценки ззаншдействия параметр Л . Обнаружено, что ионы Cu2+ РЬ2'1" в концентрации 4 мЫ при добавлении их к липосомам из ФХ без ДНК вызывали увеличение мутности суспензии липосом. Для других катионов, добавленных в концентрации 4 м'Л к липосоыам и ДПК был получен, еледущгй ряд значений (указан в скобках) Ня(3,9). 3,7), Са(3,7), ^(3,6), Iii(.,4), Sr(3,0), Zn(2,7), ifcU,f>), Ba(1,2).

Ламп обнаружена коррадвщия кооффйциента JL. для катионов, об-рэзукцкх "тройной комплекс" и констант связывания этих катионов е ФХ-явдосомаьш.

Галм образом, можно утверждать, что все исподьзовшшге нами котисны, кроме за2*, Си£+, Pb2+, С42* могут с высокой эффективностью образовывать "тройные комплексы". Концентрация болышшетва по отих катионов э клетке, кремо Mg~+, довольно незначительна ( <1 ?/.М). Однако :tx роль на образование "тройных комплексов" яельзч отрацзть. Возчюжо даапно влипшем на "тройные комплексы" обйяпклзтея рол*, некоторых адкрозломентов в жизнедеятельности клетки. В то ле время попадания в среду обитания живых организме» многих тязкедцг. металлов £ гогютествэх заведомо превышающих , фрзиаиог'ггчекке. mcwot негативно сказаться на образовании "трой™ нес комплексов". Высокая чувствительность "тройных комплексов" ко многлч ректорам окруяакшй среды могст сделать их чувствительна! элементе*« в биосенсорах иопего типа, где можно будет тестировать не только канцерогены и аутзгоны, но •: вообще болыпшютво агентов, пресно злиящах на хксое, то с-сть наличие абиогенных факторов. 3 связи' с у¿еличивисщшся загрязненном окружающей среди актуальным является изучение влияния таких факторов не только на литые объекты, но и напАНие сложные комплексы,как ДНК-мембранные комплексы, рибосомы, ядерный матрикс и т.п. Используя "тройные комплексы" в качестве модели ДНК-мембранных контактов возможно выявление адаптационных способностей живого к негативным факторам окружающей среды. ,

основные вывода

1. Обнаружены два типа "тройню« комплексов": фосфолишздные везикулы поллнуклеотдцы - двухвалентные катионы (¡«;a?jr). Комплексы I типа образуются при участии двух- иле трехцепочечных поликукнео-тадов (ДНК, поли А" 2 поли У), кошлексн II тин а образуются с о.ц-ноцепс i емкими п олинукле отвдами.

2. В комплексе I типа взаимодействие псшшуклчотцда с фоофо-липидиой везикулой протекает по типу адгезии со отабшшзацкой его вторичной структуры к одновременным расплетанием локелх.ш.к участков палинуклеотидной опирали при её нахождении мелсду двумя эояи-кулоыи. Образование комплексов I тина еопровсе&аится увелкадккек светорассеяния суспензии липосом, вызванного агрегацией и чаоткч-ЯШ4 слиянием фосфолкпидгак вогкиул.

3. Комплексы II типа образуются одиоцепочечныда полинуете оти-дами, взаимодействие которых с фосфсшшадшаи иззккулаш протекает путем адгезии и не сопровождается изменением светорассеяния суспензии липосом.

4. Выявлены три типа фосфолинидов - фосфатадилхолик, фосфати-дилэтг,нола'.«ш и сфингоыиолин, способные образовывать"тройкш комплексы" и показана роль других .лыпидов в ксмгаексообразов&чик.

5. Обнаружен ряд двухвалентных ионов металлов, способных фор;..; ровать "тройные комплексы"! ша и двухвалентные катионы, разрушающие или ингибкруицие образование таких комплексов. Степень связывания ДНК с фосфолипвдными везикулами пропорциональна константе связывания Ме^+ с фосфолшпдным бислоеы. Связывание í,te^+ в "тройном комплексе" носит кооперативный характер.

6. В комплоксообразовашш участвуют поверхностные группы фос-фолипвдного бислоя, причем внутренний области бислоя но подвержены структурным изменениям цри образовании "тройных комплексов" I типа. В то ке время возможны обратимые перестройки структуры бислоя, приводящие к увеличению проницаемости бислоя для ионов металлов.

7. На основании совокупности данных, полученных в работе, предлскена модель образования "тройных комплексов" I тша, заключающаяся в слиянии двух липосом при нахождении между шши поли-нуклеотидной спирали, которая.локально расплетается в процессе ко;.-длексообразования.

8. "Тройной комплекс" I типа предложен как модельная системе для изучения влияния факторов окружающей среды на ДНК-момбрашшо

коптам:к. На основа "тройных комплексов" возыояно создание био~ сексоров нового типа для анализа загрязнения окружающей среды тггтеднш и токсачяыш металлаки, а также другими абиотичесТйш веществами.

список ешл, оггуежковжпя по теме щхшщи

1= Сухоруков Б.И., Кувпчкин В.В., Шабарчина Л.И. О структуре п функциях контакта ДНК - мембрана вклетке.//Биофизика, т.ХХУ, вып.i860, С.270-275.

2. Кувичклн В.В. Роль мембран в оргаиизащш и экспрессии генома прокариотов и зу^араотов. 4Л ДНК-мембранные комплексы: дан-hlt9 о стручтуря и //Рукопись, депонированная в ДОШЛИ, 21-99 82. |\!сс1жа, 1982»

3. йувичкзи В.В. Рель мембран в организации к экспрессии ге-неча прокариотов и эукариотез. Количественная модель ДНК-мембран-пнх гсонтактов. Гуяогокж, депенаровашал з ВИНИТИ. 2388-82. Москва, 1982,

4.- E.I.SulriiorulMV, V,V.Kuviohkin, Ii.I.Sbabarcliina //rtructuro "inn functional pocalaritleo of DJiA-membrano contacts). Postal1 presented at the Symposium Biophysioa of Nucleic Acids and liuclooproteins, Tallin, 1901, in Studta biophysica 190?, V.67,

a 2/3 P.265-266.

5. Кувпчкин В.В. Теоретическая модель ДНК-мембранных контак-гов.//Биофизика, 1983, т.ХХУШ, вып.5. С.771-775.

6. Г„"вичкин В.В., Сухомудрешсо А.Г. Взаимодействие природных и синтетических полкнуклеотидов с липосомелш в присутствии двухвалентных катионов. Биофизика, 1987, т.ХХХП, вып.4, С.628-633.

7. Кувичкян В.В., Волкова Л.А., Нарылиаша Е.П., Исангалин Ф.Ш. Исследование взаимодействия ислинуклеотидов с фосфатидилхолиновы-ми лкпосомаыи и двухвалентными катионами методами ЗПР и ПМР. Биофизика, 1:389, т.ГХХ1У, вьш.З, С.405-409.

8. Кувичкш В.В. Ультраструктурное исследование комплексов ДНК-липоссмы - Mg2+.//Биофизика, 1990, т.35, выи.2, С.256-262.

S. Артсмоьа Л.Г., Кувичкин В.В.., Е^анов Р.П. Изучение взаимодействия полинуклеотидсв и препаратов ДНК с липосомаш методом светорассеяния л магнитного резонанса./Дезисы докладов конферен- ' ции "Современные направления развития биотехнологии". (Р.Г.Вася-лов, ред.), Москва, IS9I, с.6.

10. IiXaHos Р.И., Кувичкин В.В. О механизме экспрессии функ-

ционалъных генов при прямом безвекторном пероносо.//Таы жз, С.21.

11. Kuvitchkin V.V. Investigation of the complex DiiA-p'aaspha-tidyl choline-liposome-Mg2+. in Abstract book of 3th European Congress on Cell Biology, 1990. Ftrenze, Italy, Academic Press, loneUnea

12.Zhdanov R.I. and ICuvichkin V.V. Specific DNA-membrane contacts and their part as initial event in gsno expression. Membrane-DHA Reception. In I.A.Gustafsson, K.G.A.V/irtz, eds. "Hew Developments in Lipid-protein interactions and Receptor Function", Plenum H.Y., London, Washington D.C., Boston, 1993 (in press).

Б