Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Взаимодействие окисленной цитохром С оксидазы в гидроперекиселем

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Взаимодействие окисленной цитохром С оксидазы в гидроперекиселем"

МОСКОВСКИ ОРДЕНА ЛЕНИНА. ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛВДШ И ОРДЕНА IРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕШИИ УНИВЕРСИТЕТ - шэни М.В.ЛОМОНОСОВА

Биологически* факультет

На правах руг.шнси УДК 577.152.193.1

ПЩДШЕР Каро.ча

ВЗАШСДЕИСГБЙЕ ОКИСЛЕННОЙ 1ЩТОХРОМ С ОКСЩМЗЫ С ГИДРОПЕРЕКИСИ!

03.00.01 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ ДИССЕРТАЦИИ НА СОИСКАНИЕ УЧЕНОЙ СТЕПЕНИ КАНДИДАТА БИОЛОГИЧЕСКИХ НАУК

Москва - 1993 г

Л

л А^ i/ ла

У

Работа выполнена з лаборатории бкогкзргег,;^-: и зчзнчос-ккх методов НИН Зэзико-Химической Биологии- »д.:. А. Е.Еалсьзрского МГУ.

Научный рукойодателгь: акадеиак Российской ¿каденш Наук прсфзссор Е.П.Схулачез Официальные оппоиеагы: доктор биолоплесккс ¡¡аут;

р.А.гвчгаъскля

кандидат Оиэло.гичссгао: ■■»ау:: К.М.А'ДОЕЕй

Ведущая организация: Институт биофизики РАН (Пда:ю)

/ f" / ^ Защита ссстоктсг "А" 1993 года с ^_часов

на заседании специаижзкрованного совета Д.053.05.32 по адресу:

Москва 119839, Лгнкнскке горы, Биологический факультет «ГУ.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке

Биологического факультета МГУ,

Автореферат разослан "2, & " ¿'Пг'срИ 1593 г-

Ученый секретарь

специализированного совета ^___.___

кандидат биологических наук В.НЛейкнн

ХАРАКТЕРИСТИКА РаБОТЫ.

.^Т2альность_под0лега. Одтам из главных процессов жизнедеятельности организмов является получение энергии из окружающей среда и трансформация этой энергии з легко используемые Формы. Большинство зукорлотов а аэроОннх прокариотов обзспзчявает себя энергией при помощи окислительного фосфорогарования. Согласно хсниоско'лиеской гипотезе синтез АТ5 и окисление субстратов дыхательной цепью сопряжены ь-езду собой через промежуточный этап преобразования энергии в форму (электрохимический протонный грздгект).. Участки дыхательной цепи китохсдцркй, в которых осуществляется генерация .называются пунктами энергетического сопряжения.

Третьим пунктом энергетического сопряжения и концевым йер-кзнтом дыхательной цепи является цитсхргмкссидаза - важнейший фзркгнт аэробного ¡¿етвболетма эукарЁот и многих бактерий, катали-зирюты пэрзнос электронов от цитохрома с на галекулярннй кислород с образованней вода. 3 состав этого фер^нта входят два г«ма -з н с3 - и два иона леди - с-^ и сав. Гек цатсяроиа а3 и сив находятся в тяетоп контакте друг с другом и фунгахпощи^ кск единый №с.поро,трздртстазяа1 центр фермента. Гедавое геле ¿о цчтохроет ад, в зтжгаге от цстскрока п, способно взаимодействовать с зкгогеккьми гагачдеми, в тек числе с кислородом. Исследование реакции а3 с гагаздака является одним из традиционных подходов, позволяющих голучить информации о строении координационной сферы активного центра, а такте о юхенизме работы этого гемопротеида.

В настоящей работе исследовалось взаимодействие выделенной дктолроноксидазы, солвбилизированной в растворе детергента с пере-огсьв водорода (Н202) и алкилгидроперзкискма. Перекись водорода гак лиганд гема а^ особенно интересна, поскольку целый ряд данных тсазивает на то, что она является интермедаатом цитохрококсидазнсй

реакции. 00 этон свидзтельстьувт спектрсфоточетрические исследования гаме тики окисления палностьп восстановленной игтояромсхсидазы в условиях низка температур, а та:с« данные о спектральных катер-кедаатах, образующихся пр-д гнзргозашсимсм обращении рзахцяи восстановления кислорода.

Цельу ра&очъ" Сию изменив иктервдгагсБ, возюиаядо: ара взаимодействии выделенной цктохромоксидаэы с пгрскисьп Еодсрода к алкил-гидроперекисями для шяснзюш структуры и стешш» прстснироэак-косл- проквзттс!1ннз: продуктов цитохромоксидазной регкцки. Крота •тоге, в зада*? работа входила характеристика услезий вогникнозг-1эя, стабильности я сеойств вогнихаяивх интеркоддатсв , а тькжз сравнение ик с комплексами, колучейна.2 щж азехмсдзйстаии с Н20?/ Наутаэя ноаизна раЗотя. Впервые проведено подробное исследованы связьшш-ия алзши^вдропершгасей (метил- и зтотвдкпереяаси) с цитохром с оксядазой сс-рдыа С;и:?.. Сущес^вешсм ноши рззугътатш работа лзявется то, что в результате взаимодействия аякилпщропе,'-р&кисей с шяокрококсидазсй; шс и з случае Н202> образуются как перекисный, так и оксоферрмаьнай интеркедаатн, подобные тек, которые были шяв::ены з ходе окисления поднося-» восстановленной цито-хромокевдазн кислородом.

Показано, что концентрации перзкисп, необходимые для образования перажяюго и оксофзррклыюго комплексов возрастам в ряду й202 < меоон < еъоон « тарт-бугагоиропарекись и составляет 3 икМ, 10 ж?.', 150-300 Ж.М и > 3,5 (¿,1 для Н2С2> меоок, бъсои и иар^уталподюпервгися соответственно. Исследована кинетика связывания гидроперекисей и определена констента скорости связывания кавдоя из них с цитохромоксидазой. Константа скорости образования перекисного комплекса составляет около 1СОО М-1с-1 для Н202 , около 80 М-1с-1 для меоон и примерно 40 (Г^с-* дай Etooн. Констента не зависят от рН.

Методом МВД установлено, что, вопреки распространенной точке зрения, железо гена а^ при взаимодействии с перекиси»водорода не переходит з кизкоепкновое (б = 1/2) состояние, а скорее всего

Получение да:те заставляют предполагать, что "Р" и "f" интеркедиато не является конечными продуктами реакции цитохром-окевдазы с Н202 ii гидроперекисями. В присутствии цитохроноксидазы и избытка Н202, по-Биданому, протекает следупцая цепь превращений, названная накш "катаназнын циклом" цитохромоксидазы:

В ходе каталазного цикла устанавливается стационарное соотношение концентраций окисленной формы фермента (Ох) и интерне днатов Риг. Подобный цикл реакций ног бы лежать в основе присущей штохреа-оксидазе небольшой каталазной активности.

Практическое значение работа. Полученные результаты существенно дополняет современные знания о свойствах цитохром с окевдазы и о механизме катализируемого ею восстановления кислорода. Они ксгут найти применение в исследованиях гезюпротеидов дыхательной цепи. Полученные данные позволяет; лучше понять механизм взаимодействия кислорода с активным центром терминальных оксидаз и помогают более подробно исследовать структуру и свойств«» сбразуодсся интермедиа-тов.

Апробация работы. Результаты диссертасисжой работы были изложены на теоретическом семинаре отдела б;:оэпзргетики НИИ Зезико-хикичесхой биологии iri. А.Н.Белогерского МГУ (Москва, 1993), на v Созетско-Зйбйцарскон симпозиуме "Бкохопкестае мепЗраны. Структура и функции" (Рига, ISS3), на Международном симпозиуме "Molecular

orgeniaation of biological structure" (КОСХВЗ, I98S) И H8 19-Й

реализуется промежуточное спиновое состояние (s = 3/2).

¥>2 Ох —^

н2о

н20

конференции FEBS (l9-th FEBS Meeting, Rooe, 1989).

Публикации. 5to материалам исследования опубликованы 3 печатное

работы.

Структура дзсоертгащи: Текст диссертации состоит из введения, обзора литераторы, описания материалов и методов исследования, изложения резузьтатов, их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Лзссеруация иллюстрирована I таблицей и 16 рисунками. МАТЕРИАЛЫ й МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Эксперименте Гфоюдоись на цитохрсмоксэдвсе, вдцеленней из митохондрий сзщца быка, солвбшкзированкой в прзеутекгш детергента, а так» на 5ергзнте, встроенной з ксафону азолекткюгах протсолипосак.

Цктохром с оксидазу шделяли из митохондрий сердца бшеа по методу Фаулера s др. iFowier et ai.,1962) с послсдунцей доочисткоа ПО Мак Леннану 2 ДО. (Mac Lea^an <st al.,lS65). ОЧЭДЗНШЭ фЗрМеКТ обладал актпвшетьэ 100 - 200 с-1. Степень чистота препарата цктохром с окешкза определяли по содерханш) гека а в пересчете на иг белка. Концентрации гека определяли по разностному спектру поглощения в «-облести воссгановленого датиокитом фар«нта относитзлько окисленного, асссльзуя коэффициент молярной зкетопеции ¿E£05-G30 = 13,5 НМ"1 CH_I (Kicholls et al., 1976).

Концентрада <?елка в препаратах определяли биуретозам методом.

ЦктохрокюзхэдЕзные азолзктпноЕые прзгеслшосока получали диализным методом.

Ошты по ксследованио связгтаяня гадросерзиЕсей прободались в средах, содзрвднх 50 ¡дМ буфер (мез-кон, гка 6,i;. hops-kok, Рка

7,2;HEPES-KOH, pIC 7,5; ТрИС-КС1, р!С S,3; CHES-HC1, рК 9,3 В & & &

зависимости от требуемого рН), 0,5% тайна 80, 0,5 мМ ЭДГА и 100 мкМ феррицианнда (для поддержания фзрг-энта в окнслэннон состоя-

НИИ).

Оптические измерения проводитесь на деухлучезах/дзухволновнх

спектрофотометрах Aminco DW-2000_U (США) И Hitachi 557, Ü-3-100

гм

(Япония; в стандартных кюветах с оптическим путем 10 мм при 27°С.

Запись спектров МКД и КД проводилась созмэстно с А-М.Арутпня-нок на лире Грефе hi фир№ job in у von в стандартных кюветах с спгсческим путем 5 мм при 25°С. Спектр МВД определяя!, егштая друг из друга спектры, полученные в прямом ;; сбрягном поле (Н » 0,7 Тл), а cneirrp КД - прямой записьп без магнзтного поля. Для контроля спгктр КД мояно пояуить тскже, суккируя агктри, полученные в пряном и обратной полз.

Компьютерная обработка данных проводилась с япмодью программ

SLM Spectrum Processor (ПрИЛОЖЗНИОЙ К СПеКТрОфОТСМеТрУ DW 2000), Еерсия 1.1а И Glii (Scientific Graphic Interactive Management

Systsm, версия 2.0). Автором последней является А.ХДрачез из Института фигико-хиляческой биологии км. А.Н.Езлоэерского.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЯНДОВАНШ 4.1. Спектральные с&айп^Ва кояаекссб ьрмограяоксидазн с ъврояеретжеи

Порши суцеетвеквкм результатом данной работа яиаязтея установление того фжта, что 8лхилгкдроЕерс:а1са реагирует с окисленной цитохромоксидасой, образуя те ке ксдаяексы. что и верекиоь водорода. На ркс.1 предстгзлзнн разностные спектра поглжгнкя, возникающее пря доОазлгнн:! к сгсхгесюг цэтогромешгдазе EjOg (А), неооа (К) и Etoci! (?)• Влдно» что во зсех трзх случаев ет&щяается сходная карткга образован:« дзут. спсктралыгас клиермедкатов - перекис-::ого и оксофс-ррильмогс.

При добгкгешя низких (нзкромэляршх) концентраций соответст-зущей перекиси образуется комплекс, характоризущгася в а-области двумя максимумами поглощения - при 607 им и « S70 т. Яри это»! в

Рис. I. Спектральные изменения цатохромоксадазы, вызванные добавлением перекиси водорода (А), металтидроперекиси (Б) и зтилгядро-перекиси (Б). В образце и кгаете сравнения - 1,1 ккМ цитохрсмокси-даза в буфере, рй 8,0, В образец добавлены: Н202 - 40 мкМ (А I) и 3 (А 2), МеООН - 40 мхЫ (Б I) и 1,3 кМ (Б 2), еш - 0,7 (В I) и 6 нМ (В 2). Спектры заш:сывали через 5 игн посла добавления лиганда.

области Соре сюыетричшй разностный спектр относительно свободного фермента ьнее? мигануы при 412-413 кн и максимум при 436 нм. Такая форма сзектра характерна для длинсволнового сдвига ^-полосы фермента. Действительно, в абсолютном спектре поглощения добавление Н202 иди злкшшщроперэкисей вызывает сдвиг пика от 423 нм к 428 нм.

Увеличение концентраций гидроперекисей до ышшеюлярных вызывает дальнейшие спектральные изменения в видкдаа об лести: б разностном спектре увзличквегтся амплитуда гика 570 да с одновременным смещением его максимума к » 580 нм и уменьшается так при 607 нм (см. рис.1).

Действие кгкиозы

Поскольку перекись водорода является сильным окислителен, ваяно было прозеркть обратимость ее воздействия на спектральные свойства цитохромоксидазн. Было показано, что визнтаеные добавлением Е^02 спектра ль: аде изменения полностьа обращается каталвзой. При этом картина исчезновения оксофзррнльного ксглолакса зависит от количества добавляемой кагалагн. При действии низких концентраций катэлагч (2 й!) удается каблэдать обременив рзгзарш с регистрацией на прокеязгпянон стале пергкксного комплекса и псследугдим его распадом, что сшдзтслъствует об обратимости эзргхояа дарекксного комплекса в окссфгррилькнй под действием внссжиг концгнтраций Н202 (гк. рлс.2). При увеличении концентрации катзлазн до 10-20 кМ иабдадегтея ре спад окссферрияьного когшизхсг Сзэ обрггозакдя пере-кнекого 1здкр:»:здЕгта.

Било ¡гстгнозггко, что спектрижше ответы, внкзваемке добав-ленизн к пзлохрашездазе алхилтидропзрзотсей, не зависят от присутствия катадазн, взятой в коцзнтрашях, котсрне даггостьп подеэ-ляит ответа, шглвгз;^ з^ (сд.ркс.З). Позгояу деоетаке мгосп и еъоон шльэя сбьяскоть прРС5СЬ2 ейрткгюн годтаода, как это имело кь-ло, КЕлржэр, на пачрлшнвд зтаьз работа с гйерг-будатадрогере-юакэ (нетаубежовжкге даыые Щздмейер и Зйгодгпюй). 4.2. Определение пгргк'яюго тяиекса

ПроБедеко исаведоЕгяаз срочности связывания с выделенной [татсрегакевдазой з раствора детзргэкгэ. На рис. 4А приведены тапкчше кринке татоозазг-'д цитохрекокидазв перекись» водорода в

5?0 583 847

Рнс. 2. Обрещзвие кател&зой СЕбюфадьннх измзнзшзп, шзгаышх 11^. В образце и хагзтс срашогпк 1,5 цетохрокэксздаза в основной среда, рН 8,0, содергсщзй суперокгаддасмутазу (10 ккт/мл). После эгжсн кулевой (атржоБЗЯ линия) В обрагец

добавлена Н^ кз^лрздаз 5 (I) и зотзм :ш?аяаза в конечной коицаотрацяа 4 Спактры рагасгре^тсгааа чврпз сладзпзд» иктервалн врзнзЕа даслз добамвНЕЯ кэ^элобн: 2 (2), 6 (3), 13 (4) к 50 (5) ига.

разных условиях, а на ркс. 4Б показана ликзаркззащя зтах кршых в координатах Диксона. Еолученнея таким образом констента диссоциации при рН 8,0 соптгзляет 2 к-й.!- что точно соответствует Ка пере-кисгюго комплекса оксадззи, встроенной в аротесшшосома.

aa/jan~). 4-

[BCOHJ.ra.M

Рис. 3. Устойчивость к катзлазе спехтрглькс т:згйский цитохром-сксздвен, вызаггег-чх ешон. Цтасхрококсвдсса (1,1 пхМ) в буфере, pH 8,0. Рвзиосжз cnsicrpu запхснвгли через 5 íctí после добавления EtoDH. По оси ср,т.зшг - аниктуда разностных сэзекгров при 576 нм откеслтелк» дакна-взяна 650 raí. I - без кгтал-зн; 2 - в присутствии 10 ни катетагн

- Fehscí в непбй гргше било ГБйденэ, что ЕреягЕнпубация нито-хромоксадазы в раствора с ОДГА бякй&т на ряд свотйет фермента к в топ таслс i:z характер сайхтраалт-д '¿з«£ненуй, возезкеотмх при

БЗа£К0ДЗЙС2Е1Я С рядом латандо? (K^stantinov et al., 1989). оЧЧО

кггзрзсйо сребрить, '-ак прзднзкубадяя ф^рмгкта дз^сгсует не его роол-™, с пепзккс1-ь нодорода. Оказелось, что еста проводить опыты без Tssrjdavís, то к?сто сэдсвзмш» еншгния ашдитуя»

жэгвигхго HzQr> оязсам («д. рис. 1А). Во гее такая •¡кшитуда яоизт оа'лгш:а с тем, доая5здзд.^йетвувдая с H^&j. í54 в с.*у>жч япзде*рттезькой ^¡убгаця. Чти касается

Kd: то ^wsfPcvEoro злкжкя väncyö&isa на ее Егтя»г5ну обнаружено

не была.

Рис. 4. Влияние рН на Кд пэреккского комплекса цитохром с оксзда-зы. Цитохромоксвдаза в соответстаувдем требуемому рН буфзре. Измерения проводили щи рН 8,0 (0,0) и 6,6 (л). (О .А) - фериент прединкубировала в течзниз 100 иин при необходимом рН; (О) - баз прединкубеции. Разностный спектр записывали черзз 4-5 мин по&ке очередной добавки перекиси водорода.

А: кривые зависимости величины спектральных ответов в полосе Соре от концентрации K20g.

Б: Линеаризация тех хе кривых в координатах Диксона.

месон и Etoou связывастся с цитохроиокскдазой с КЙНЬЕШЛ сродствон чен Hg02. Ссответстэанно дая образования перзкаского когахлекса требуются более Еысокие концентрации этих гидроперекисей

(СМ.рИС.5). ОНИ Возрастай1 В рЯДУ Н202 < МеООН < EtOOH « шерш-бутилгидроперекись и для полунаксннального выхода интермедиа-та Р равны примерно 3, 10 и » 150 - 300 нкМ и > .3,5 мЫ соответст-зенно. В то же время при - взаимодействшг алкзагидроперекисей с

- п -

метмиоглобином такой разницы не наблюдается. Лиганд Цитохромоксидаза

Величина спектральных изменений с50

Метмиоглобин Сзд, МКН CgQ, мкМ

üAj/tcog], 45 - 50 45-50 35-40

rW I

(436-412) (425-407)

НООН МоООП

10

3

< I

6

EtOOH

150-300 < I

Это позволяет предположить, что различная реакционная способность исследованных перзкгзсей в отношении цитохроноксидазн обусловлена стеритесетш згтрудонияни и уменьшается по мере увеличения размера молекулы лиганда. Подобная зависимость наблюдалась ранее для реакции цятсхромоксвдазы с алкилизоцианидани (-уаюапкно.огилэтз).

Ркс. 5. СрашеКЕЗ 3®ЗКТИИ30СТИ Н202 (I), МеООН (2) И EtOOH (3) в отновзнки образозшдая кислородных интергадиатов цитозронсксадазы. В образце и кггете сравнивая 1,1 ккМ цитохромоксидаза в буфере, pH 8,0. Разностные спектры рзгастряровалн через 3 мин после добавления перекиси. Величина нзмекегай поглощения нормирована на макси-малыэй ответ в присутствии нзсздэдего избытка соответствующей перзкхси.

АА/ААвшх (435-411)ям

О

SO 100 159 ¡Парэкись]. мкМ

4.3. Исследование .кинетики оСржоваяия шщхсЗита "Р"

Иреястационарная кинетика образование пгрзкисного комплекса Оюа исслгдозаш С ПОМОЩЬЮ прнсгаки Торрес?-Пт.' К Amir.cc ВИ-?оооТ1,, позволяющей регистрировать переходные процессы после быстрого сиеаившшя гидроперекиси с пслнзсхьь сяг:зл£Жой цотохроа-оксидазой. Скорость образования когяггг:;са ггзкзргш! в области Соре при длинах волн 435-412 км, Полученные зкгазргментелъше кр;же

I, ж ЕЯ, ¡Л

Рас. 6. Кгаегака «вясяагшгя яззкагздхяя^кжа: с вззохшюксица-

ьоа. йтка^ржаксьт^га (1,8 ий!) <з 0«®зр8, 3.0. Сзгигрммиа отеет рзгасвдровш» ноя <35 ж />12 1»:. А: Зхаврзоктакьииз гдягэяг. В обр^.&сд до.?ишг?но 50 (I), 31 (2),

Ш (3), 340 (4) а 583 (5) ^ООН-

3; кривая гкшисаыол-й езерссщ ргакд?* от ¡гь^шл^^ро-

пэрзгскс а

разлагали на экспоненты с ш-шья программы gim (см. Материалы и Н5ТОДЫ), ИСПОЛЬЗУЯ фучгсшв f(a,x) = А * (l-e-1"4) (ГДе Д

максимальная амплитуда ответа, к • константа скорости и t - врекя; в оператор? nir«g (келинзйнзя регрессия). Было найдено, что ре&к-цкл хорссо описцваотся уравнением первого порядке. Скорость процесса Есзрастает с угеетпенпем коицеигрзтдна гидроперекисей, причеп зависшюстъ яшшется линэйпэй по ке^ЬЕЗЯ мерз до I кН длл Н202 и МеООН и до 4 Ш для Etcoa. Константа скорости связывания при рН 8,0 составляет около ICCQ М-1 с"1 для &,02 . около 80 М-1 с-1 дан iieOOH (pi!c,6) К ЬрЖЗрЬО 40 ДЛЯ StOOH.

4.4, р£-эа&тьх)с>гь спсщхмыш игхеяеяя. в разностная cnsuppa

пгргишюго яылплеиса

Бета ясатдозана рП-сгвясжость спектральных изменений, вызываемых пгрзгжеьа водорода. Спектры поглощения записывали после добазленкя в опнтгзув к=г»ту наенщаащзй концентрации Н2С2. Эта концзитошлет составляла ¿СО нкЫ в об-ласк: рН 6,0-7,0 и 40 мкМ при рИ >7,0. Было нгйзеко, что ферма ®'РН№е:.юго перекисыэ водорода егтзк-грального отгзта з сблеста Cops нз загасит от рН в области 6,2 -8,0 , ко з ввдзыэа области сэдествзнио зависит от рН: в щелочной области н^блэдаегся прткмрщгственный рост амплитуды макспмуги 607 ш по отнокекш к полосе 570 нм. Видно (рис. 7), чтовзлаяина оу (точнгз М^ / [ш3]) возрастает в i раза прн изконэетп рЯ от 6,0 до 7,8 -. а зтгеп еикодэт на плато. Группа, кот'ро.чкруга.-эя переход «езду Форгаки с высокой и низкой ОЕсгишздкга up:-; 507 нм (гврзкнейнм и окс-о^йррт'льгки комплексами), »кое? рК около 7,0 , сходакв я&наыг был?! получены на протеолипосо-маз: (v72sdina at *i.,isas).

Несмотря на то. ччо а: гиктуда спектральные изменений, зизы-зегилх вз&'зэдеЗствчек Бвдедмняся цдасхрсжксдазы в растворе детергента с пэрзккеью Бо.цоро.па, в видимей области зависит от рН,

величина Кй не зависит от рН: так например, Кй для взаимодействия выделенной оксидазы с Н202 при рН 6,6 составляет 2-4 мкМ, а при рН 8.0 «. 2 мкМ.

Ае, мМ"1ся1

4-

(60?'551])ки ,

Т0 0

Ш

6.0 7.0 Е.0 рМ

Рис. 7, рН-зависикость кптенсшности етектрьзышх пзкененкй при 607 нм комплекса даозфокэксидаш с Е,02. Образец ..и кявета сравнения содержи I ккМ цитохрошгссадазы в соответствующем буфере. В образец добавлено 400 ы<М (рН 6-7) либо 40 кай (рК > 7) И202> Разностные спектра запнсгнк черэз 4-5 кзн после доОевззяая пзрзккси.

4.5. Исследование отж-ясисй и ¿згюяс¡о-ояшчеигоА стидхост пергкисного и о:ха^грриыого яо/лгдасоб шмсх^логил^сж Длиноволковый сдаг полога Соре гскопротеидоЕ при связывании сильных шггакдоБ как цравило сопряжен с переходов гекэвого яелеза ИЗ ШСОКССШШОБОГО СОС^ОШКЯ Б ВКЗКОСИШОВОе. ПОСКОЛЬКУ з нашем

- is -

случае имел место батохромныя сдвиг ^-полосы поглощения цлтохром-оксидазы под действием Н?02, было интересно выяснить сопровождается як он изменением спжссого состояния генового железа цито-хрома Сд (железо гема а всегда находится в низкоспиновсм состояшш).

Сднкм из наиболее надожшх методов изучения спинового состояния генопротеидов является спектроскопия ЩД, Окисленное (Fe3f) Бысокостжовые гемопротгиды не щхшвляэт существенной кагкитноол-тичесхой активности в полоса Соре, тогда как ж нязкосииноше комплексы с лигандами тша шшигда даат интенсивные сигналы тапз А. По данным ряда авторов игзезстно, что цианид как сильный лиганд вызывает переход железа теме Oj из еусокосгокового в нкзкоспиноЕое состоя>Ж2. В спектре 1йЩ этот переход сопровоздается удвоением амплитуды эффекта в области Сере по сражении с исходным спектром окисленной гоггохрсмоксидазы, обусловязпгалм вкладом низкоспинобого гема цитохрома с.

На pic. 8А представлена спзктры МВД окисленной оксядазы к комплекса цитохронсксидазы с Н202. Видно, что как в случае пере-кисного, так и оксофзррильного комплексов спектр пало отличается от исходного спектра окисленной оксидазы. Это означает, что Н202 хотя и язляется достаточно сальным лигандом (Кд ~ 2 мкМ), тем на менее ке вызывает перехода железа гема а3 из Еысокосшшоеого (s = 5/2) в низкосшшовое (s = 1/2) состояние. Для контроля к цитохром-оксидззз был добавлен цианид. Как видно, этот лиганд в соответствии с литературными данными шзывает удвоение емшштудн сигкалз МКД 420-435 нн (ск. рис. 8Б). Аналогичные данные были получена с перекисным комплексом, образующимся при взаимодействии окисленной цитохромоксидазы с СО. Учитывая, что по данным спектроскопии комбинационного рассеяния а3 перекисного интермедиата нз является бысокоспиновым (s = 5/2),представляется возможным, что при связы-

вании Н202 железо геиа а3 переходит в редко реализуицееся промежуточное спиновое состояние (б = з/2), которое катодом МКД ке обнаруживается.

-5

А.-10

38 10

-10 -30

Рис. 8. Сектры МКД цитохромоксидазы. р полосе Соре. Цитохромоксида-зг (6 мй!) в стагщартнс!'. буфере рН 8,0 без феррициахшда. Спектр окисленной оксадазы обозначен пунктирной линией. Сштвой линией обозначен спектр оксидазы после добавления 40 кк& перзкиси водорода (А) пли 5 ¡.¡.; изазэда (Б).

Вместе с тем, дзпше ВД позволяя? сделать вквод о тем, что, несмотря на слабое нзиекеше спзктра «лД Бзаидадеестназ го3+ ге*;а

03 с 1^02 в данных условиях итеет г:еста. В присутствии - пэрзкяси (40 мкШ спектр ЦД цптохгсиокспгает в области Соре прзтердазазт длипоеолкогнй сдгаг. »¿засямуы при э-гсм сдзигается не - 2 нм.

При образованж оксо&зррильного комшзкса, вызванном добавязназм

4 Н?02, сгдаиг увеличивается, достигая ирвмерно 5 и:. Форм спектра при этом существенно не меняется.

ОБСУЖДЕНИЕ

Структура перекисного ингернедиата цитохроыохсидззы остается загадкой. Бользшнством авторов ранее предполагалось, что перекись в таком комзлехсе занимает костаковое положение: н

Ге3+ о

азч г ' 4 си2 + • гда

0 а3

Н

ге3 ь - гемозсе желесо цитохрона си аз а

Си2* - кон кзди кпслородредуктазкого центра аз

При этом ионы Н+ кояекулы перзкиси могут либо непосредственно быть свягекшаи с кислородом, либо находиться на олнжайших протоназдеп-торшх группах белка.

Однако на основан®! полученных результатов о связывают ад-кнлгкдрозерекксей возникли серьезнее сошзная в огносзнки постулированной вше I .г-^-пвроксо-косткссЕой структур« в перехзкном когашексз. Более реальной здесь могла бы бнть коотиковая связь 11-1,1-пероксо-типа:

ре3+ ч г Си2 + 3 о а3 I

0 , где

1

я

ке3* - гемовое аелезо гена си аз 3

си2+ - ион меда кислородрздуктазного .центра

я - ила Н+ или ашшльнея группа в зависимости от используемой гидроперекиси

Нельзя тгхяе исклхчнть, что частично восстановленные кислородные интерхэдиагы в каталитическом цикле цитохрошксидазы остается связанными только с ионом железа гека

Кроме того обсуждается вопрос, связывается ли перехись в ионизированном состоянии или нет. Распространена точка зрения о том, что связызается дважды ионизированная перекись водорода. Однако в соответствии с полученными данными о связызаиии алкилгид-роперекисеа перзкась кз мсетт связыватся г. деаядш ионизированной форкз, так как в гидроперекиси один водород замзщен на алкилькую грушу. Кроме того было установлено, что Кд не зависит от рН в интервала от 6 до 9 и следовательно при связывании перекиси водорода протоны не освобождаются в среду. Ввиду этого ггрздаагается следующий вариант структуры перэкисвого антермздиата:

Ке3+ - О" С«2+

чо

I

в

Свдищ/рз оксоферрилыюго ксшиексс

Что касается оксоферрилъного коишзхса, то в отношении его структуры ннения сходятся и строзние этого интеркздиата представляется следящим-образок: о2" .

а3

Можно предполагать, что в ходе образования этого соединения из первоначального перекпсчого комзгекоа происходит восстаноЕИтельное расщепление кислородного юстака. Один из атомов кислорода, пред-полсзитзльно связанный с си . при этом образует молекулу воды, а

другой, координированный с геком, - радакал ОН', который является настолько илшшм окислителем, что оттяпвает электрон с генового аелеза, перевода погледай в фзрркльное состояние.

Дда списания жызюдегсязая пзреаиск водорода с олнслеккой цитохром с оксвдззой предлагается следующий цикл:

Н2°2 Н2°2 >Н+ К2°2 °2

3 а3 2 2 \ а3 \ в3

н2о . н20

Ох----------- Р ------------------- К---------------— Ох

12 3

Стадия I: обратная реакция Н202 со свободным окяслгннкн фгрмзнтом

с сЗразосэниен перекисного комплекса Стадия 2: воссгакоадение Р избытком перекиси до сксофзррильного кншлег.са

Ст?дая 3: восстйногт.енке г с образованием свободного окисленного фйркенга, который можзт связщвть Н,02 и тем сами

зшясзть цпсл.

.¡Терзал стадая протекает довольно быстро (дая К202 кч. около Т т т

Ю М *) и ее? равновесие обычно едвннуто з сторону образования Р (К^ составляет около 3 ь-ийС и почти не зависит от рЯ).

Образование на второП стада супероксадного радикала недавно к зело прямое подтверждение (кг^пгапко л1. Вторая и тре-

тья стадии протекая? сучастгзнно медленнее, потому что окисление К202 до 02 термодинамически нешгодко. Можно предполагать, что соотношение зйехтнвнкх констант скоростей п/илк равновесия стадий 2 и 3 определяет соотношение стационарных концентраций иггермедаа-тоз р и к при заданных условиях (тазах как рН, концентрация Н202 и т.п.),

Каблвдаемая нами рй-зависимость • полоса 607 км в разностном спектре при одновременном отсутстгн! суцествеяннх издакешей в полосе Соре моззт означать рН-зазисиай переход интернедиатя Р в р, если прзлполегать, что дгге при низких концентрациях Н202 или алниггадроперекшгя уст&навливазтся некоторое стэшонгрное откоге-нкз между Р и ?, которое зависит от рН, вида перекиси и ее концентрации.

- 20 -внзода

1. Впервые проведено сравнительное исследование связывания перекиси водорода и алкклгидроперекксей с щтохром с оксндазой сердца быка. Обнаружено, что алкилгадроперблиск, так те как и Н202, способны образовать пэрекисшз к окссферрклыглй ивгорсздиг-ты.

2. Обнаружена рН-зазисшость величины пика 607 км в рнзност-нок спектре ккошлекса цитохромоксидаза с Гс1зкд.н концентрациями перекиси водорода , которая видимо объясняется рН-зезксзиостью стационарного соотнопешш концентраций перзкисного к ексофэрркль-1юго комплексов.

3. Показано, что концентрации псрзккси, несблэдаше для образования пьрекисного и оксофзррильнопо тамплексоз Базрэтягаэт в раду Н202 < меоон < еьоон « яер^утшптидроперекксь. Коз^щаяся веикина Кд составляет 3 мкМ для Н202, 10 ккИ для месэк, 150-300 1лкГ.1 для £10011 и > 3,5 мМ для ие^-бутшащрошрекйси и не зазисат от рН.

4. Определена константа скорости сбязыбенкя г талой из перекисей с цитохроыоксвдазой, сьстшшгя.зя около 1С30 М-1 с"1 для Н202, около 80 для неоон и щаарно 40 для е*.оон.

5. Методом ВД установлено, что зеяззо геме а3 при вза&ю-действии с перекись® водорода не переходит в наэкосьзноаое

(э = 1/2) состояние.

6. На основании полученных результатов ввдшкута гипотеза о каталазкок цакле цитохрококсндазн и иргдлоязна новая структура перекисного китераздкета фзт-кзнта.

сг&со;: вакя, оптеашгованинк по rs!s даме.

1. Енгоияя Х.В.,. fôzuçjas?3p К., Коксггжгашез А.л. Взажлз-дейстша окпслзвко« щпюзфг^дассядаЕа с пщр^рбкисяга // Биол.

- IKS. - 7.9, й 7. - C.S77-S32

2. Vj-gccijpi T.У,, Kon^t.inti r>ov Л.Л., Popova E.Yu., ïïchmid-i28.ijr К. ¿.yecfci-*! i^stcbí líty of ir-olr.tcí cyfcochrone oxidase. Abstract boa!' Synpos. "Moiecul&r org&nisiation of bialogicp.I í;tT*ictur-j". t.'osecw, june 19-24 19fi9.p.£3 j

3j j.iov Л.Л. . Vjr^odina T.V., íchuidiiaici- ¡C. Оку-gEn

íPÓGí-asdr-at тз of oytc.ch.ví.'£e oxidaos: i'uaoiicm о Г itrrio «aspe Г/Xiîi H„G... rtbsórscts uí 13-tb FE3S rbetir c. Rosa, ju.ly 1989.

o 4

Til ?.!• L

СПИСОК HСТШЬЗЖЕл СХЖРлЦЕШЕ!;

- TpíHcweMrtpewaa разность злак'хрохи-отзск» потенцкалоз иона водорода, месон - датиы-адрспс-реиюь, EtooH - эттидропзрзмкь.

- нагшша кр^тоЕой дароязм,. НД - кругоеой дахроизч, mc*>s -з-(^-мс!^ол1тао)ззрс-пансуль(Зог:оЕзя кислота, ches

2-(к-1Ц1клогексилек1ио)зтансульфс1:ован кислота, kefeü г-окскзти^шеразш-«-г-зтансульфонов,зя кислота, mes 2-(ы-;-юр;юл5Н!о)этансугю1рош%ая кислота, Тркс - 2-ашшо-2(окс:55&тл)-1,з-Г)ххзпан.диол. ЭДТА - этанзндашлштетрауксусг.ая КИСЛ0ТС