Взаимодействие нефтеокисляющих микроорганизмов с хемоорганотрофными бактериями-спутниками, неспособными к окислению углеводородв, в структурированных микробных сообществах (биопленках)

Журина, Марина Владимировна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Взаимодействие нефтеокисляющих микроорганизмов с хемоорганотрофными бактериями-спутниками, неспособными к окислению углеводородв, в структурированных микробных сообществах (биопленках)
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Взаимодействие нефтеокисляющих микроорганизмов с хемоорганотрофными бактериями-спутниками, неспособными к окислению углеводородв, в структурированных микробных сообществах (биопленках)"

На правах рукописи

Журина Марина Владимировна

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ НЕФТЕОКИСЛЯЮЩИХ МИКРООРГАНИЗМОВ С ХЕМООРГАНОТРОФНЫМИ БАКТЕРИЯМИ-СПУТНИКАМИ, НЕСПОСОБНЫМИ К ОКИСЛЕНИЮ УГЛЕВОДОРОДОВ, В СТРУКТУРИРОВАННЫХ МИКРОБНЫХ СООБЩЕСТВАХ (БИОПЛЁНКАХ)

Специальность 03.00.07. - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Москва 2009

003481468

Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институте микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Плакунов В. К.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Романова Ю. М.

доктор биологических наук, профессор Ивановский Р. Н.

Ведущая организация: Кафедра биологии почв почвенного

факультета МГУ

Защита диссертации состоится «30» ноября 2009 года в 14:30 часов на заседании диссертационного совета Д.002.224.01 в институте микробиологии РАН по адресу: 117332, г. Москва, Проспект 60-лет Октября, д. 7, к. 2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института микробиологии РАН.

Автореферат размещен на сайте: http://www.inrrii.ru/dissovet.php Автореферат разослан "_"_ 2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук:

Т.В.Хижняк

Общая характеристика работы

Актуальность темы. В природных экотопах основная часть микроорганизмов существует в виде ассоциаций, определяемых общим термином «биопленки»: пространственно и метаболически структурированных сообществ, заключенных во внеклеточный полимерный матрикс и расположенных на границе раздела фаз [Николаев, Плакунов, 2007]. Между микробными компонентами биопленок существуют многообразные метаболические взаимоотношения, при которых взаимодействие имеет либо односторонний характер, например, потребление кислорода аэробными микроорганизмами, обеспечивает возможность сосуществования анаэробных форм [Costerton et al., 1994], либо наблюдается взаимное положительное влияние компонентов биопленок друг на друга [Wolin, Miller, 1988]. В таких случаях могут устанавливаться взаимоотношения, близкие к симбиозу, при которых образование или потребление какого- либо субстрата в биопленке происходит с большей интенсивностью, чем в случае свободных (планктонных) популяций. Это, например, происходит в рубце жвачных животных в биопленках, состоящих из целлюлолитиков и их спутников, неспособных к гидролизу целлюлозы. Последние потребляют продукты гидролиза, репрессирующие биосинтез целлюлаз, и, таким образом, повышают образование этих ферментов [Weimer, 2003].

Существование близкой ситуации можно предполагать в заводняемых нефтяных месторождениях, где единственным источником углерода служит нефть. Из пластовых вод таких месторождений наряду с нефтеокисляющими микроорганизмами («продуцентами») можно выделить множество хемогетеротрофных аэробных и анаэробных микроорганизмов-спутников (диссипотрофов), которые неспособны утилизировать компоненты нефти, но растут за счет продуктов ее деградации. Однако их влияние на микроорганизмы-нефтеокислители практически не изучено. Между тем, взаимодействия микроорганизмов в биопленках, которые, по данным ряда исследователей, формируются в нефтяном месторождении [Sanders, Sturman, 2005], может существенно влиять на их биогеохимическую активность, особенно в месторождениях с экстремальными условиями среды. Изучение воздействия микроорганизмов-спутников на нефтеокислители важно также при создании препаратов для очистки природных субстратов от нефтяных загрязнений. Поэтому изучение этих взаимоотношений представляет большой научный и практический интерес.

Цель и задачи исследования. Целью диссертационной работы является частичная реконструкция биопленок, характерных для нефтяных месторождений с различными физико-химическими условиями, и изучение взаимодействия их микробных компонентов, связанных трофическими и другими связями. Особое внимание уделено возможности защитного и регуляторного воздействия спутников (неспособных к окислению нефти) на нефтеокисляющие микроорганизмы.

Задачи исследования'.

1. Разработать методы частичной реконструкции биопленок из пластовых вод нефтяных месторождений.

2. Изолировать из реконструированных биопленок чистые культуры нефтеокисляющих микроорганизмов и их спутников, неспособных к окислению нефти. Изучить их физиолого-биохимические свойства и определить таксономическую принадлежность.

3. Изучить характер взаимодействия галотолерантных нефтеокислителей и их галофильных спутников в модельных бинарных биопленках, полученных из пластовых вод с повышенной соленостью.

4. Изучить возможность протокооперативных взаимоотношений между нефтеокисляющими микроорганизмами и их неспособными к окислению нефти спутниками.

Научная новизна. Впервые разработаны методы частичной реконструкции биопленок, содержащих ассоциации нефтеокисляющих микроорганизмов и их бактерий-спутников, неспособных к окислению нефти, из пластовых вод нефтяных месторождений.

Впервые установлено, что галофильный спутник (неспособный к окислению нефти) оказывает защитное действие против осмотического шока на входящий в общую с ним ассоциацию нефтеокислитель.

Впервые расшифрован механизм защитного действия галофильного спутника на нефтеокисляющий микроорганизм, состоящий в образовании осмопротекторного вещества эктоина, обеспечивающего рост нефтеокислителя при ингибиторных уровнях соли.

Впервые показано, что в реконструированных биопленках бактерии-спутники способствуют более полной утилизации углеводородов микроорганизмами-нефтеокислителями.

Научно-практическая значимость. Полученные автором результаты позволяют рекомендовать в случае биотехнологического использования нефтеокисляющих микроорганизмов (например, для повышения нефтеизвлечения или для биоаугментации природных субстратов: воды, почвы в экстремальных условиях и др.) использовать не только смеси нефтеокислителей, как в большинстве препаратов, предназначенных для очистки от нефтяных загрязнений, но и вводить в эти препараты микроорганизмы-спутники, повышающие активность нефтеокислителей и/или защищающие последние от стрессовых факторов среды. Использование дополнительных микробных компонентов, активирующих или защищающих основные микроорганизмы, формирующие такие биореакторы, в ряде случаев может существенно повышать эффективность всего биотехнологического процесса.

«Биотехнология: состояние и перспективы развития». Россия. Москва. 2007; Международной научной конференции «Микроорганизмы и биосфера». Россия. Москва. 2007; IV Молодежной школе-конференции с международным участием: «Актуальные вопросы современной микробиологии». Россия. Москва. 2008.

Публикации. По теме диссертации, опубликовано 7 печатных работ, из них 3 экспериментальных статьи, а также 4 тезисов.

Объём и структура диссертации. Диссертация изложена на 116 страницах машинописного текста и содержит разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты и обсуждение, выводы и список литературы (178 источников). Текст проиллюстрирован 28 рисунками и 7 таблицами.

Благодарности. Автор выражает искреннюю благодарность руководителю работы д.б.н. проф. Плакунову В.К., а также своим соавторам д.б.н., проф. С.С.Беляеву и Е.А.Стрелковой за консультации и помощь в работе; д.б.н. Т.Н.Назиной , к.г-м.н. И.А.Борзенкову, к.б.н. А.Л.Тарасову за предоставление проб пластовой воды, Б.Б.Кузнецову за анализ последовательности генов 16S рРНК, к.б.н. Н.А.Кострикиной за помощь в проведении электронномикроскопических исследований.

Работа проводилась при частичном финансировании в рамках проектов РФФИ 04-04-49118-а, 04-04-49710-а, 07-04-01011-а, а также Соглашения о предоставлении субвенций №01.168.24.049 от 18 августа 2006 года между Федеральным агентством по науке и инновациям и Институтом микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Объекты и методы исследования

Объекты исследования. В работе использованы бактериальные культуры, выделенные из пластовых вод Ромашкинского нефтяного месторождения (республика Татарстан), в которых содержание солей достигает 100 г/л, а также из пластовых вод нефтяного месторождения Даган (КНР) с низкой степенью минерализации (до 6 г/л).

Микроорганизмы изолировали путем промежуточной реконструкции биопленок. К настоящему времени получено 23 ассоциации, из них выделено свыше 100 чистых культур. Все культуры тестированы на возможность использования парафинов, нефтеокисляющие микроорганизмы составляют около 25%. У части культур исследована способность к росту на ряде углеродных субстратов. Изучена возможность взаимного влияния у некоторых культур, выделенных из одних и тех же микроассоциаций. Детальному изучению подвергнуты штаммы нефтеокислителей (2610-1, 14-3 и 44а), а также неспособных к окислению парафинов

хемогетеротрофных бактерии-спутников (21684-1 К, 446 и 45). Некоторые выделенные культуры идентифицированы методами полифазной таксономии.

Методы культивирования. Микроорганизмы поддерживали на скошенной плотной (1,8% агар-агара) среде ПД (1% казаминовых кислот (Difco), 0.5% дрожжевого экстракта (Difco)) или на среде LB (Carl Roth GmbH), pH 7.5-8.0. В случае нефтеокислителей в среду вносили 0.5% гексадекана. Для галотолерантных и галофильных микроорганизмов в среду добавляли 5-10% NaCl. Выращивание проводили во флаконах на 100 мл или в колбах на 250 мл, содержащих соответственно 20 (50) мл жидкой среды. Также использовали минеральную среду М9 (Na2HP04*12H20 - 15г/л, КН2Р04 - 3 г/л, Na2S04 - 0,6 г/л, NH4CI - 1 г/л, pH 7) с добавлением NaCl и/или источников углерода. Культивирование микроорганизмов проводили на качалке при скорости вращения 150 об/мин и температуре 28-29°С. Рост культур измеряли по оптической плотности и сухой биомассе. Измерение условной оптической плотности (светопоглощение + светорассеяние) проводили при длине волны, X = 540 нм, на нефелометре КФК-2-УХЛ 4.2 (Россия).

Реконструкция биопленок и изолирование чистых культур. Для реконструкции биопленок использовали пробы пластовой воды, хранившиеся при 4-5°С. Стерильные поликарбонатные фильтры Nucleopore (диаметр пор 0.2 мкм, фирма Schleicher & Schuell), помещали на поверхность твердой среды в чашках Петри. Состав среды варьировал в зависимости от поставленной задачи. Для первичной реконструкции биопленок обычно использовали среду М9 с парафинами. На фильтры наносили 25-50 мкл пластовой воды, содержащей суспензию клеток микроорганизмов, вымываемых из нефтяного пласта. Чашки инкубировали при 28-29°С в течение 5-10 суток для формирования биопленок. Биопленки подвергали диспергированию в жидкой среде или в солевом растворе и высевали разведения суспензии на твердые среды различного состава. Полученные колонии («микробиопленки») вновь подвергали диспергированию и рассеву до получения чистой культуры микроорганизма.

Идентификация изолированных чистых культур. Для идентификации культур применяли подходы полифазной таксономии. При проведении физиолого-биохимических тестов использовали среду М9 с тестируемым субстратом. Субстраты (в случае кислот - натриевые соли) вносили в количестве 0,1- 1% (вес/объем). Для галофилов во все среды добавляли 10% NaCl. Результаты учитывали через 5-7 дней после прекращения дальнейшего увеличения оптической плотности культуры. Зависимость роста от pH и температуры изучали на средах LB и М9 с использованием легко усваиваемых субстратов. Для описания других таксономически значимых характеристик использовали стандартные рекомендации [Arahal et al. 2007]. Установление родовой принадлежности исследованных микроорганизмов проводили путем определения частичной последовательности генов 16S рРНК (1000-1300 нуклеотидов) и сравнение их с базой данных (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). Для амплификации и секвенирования

фрагментов генов, кодирующих 16S рРНК, использовали универсальные праймеры: 11F 5 ' -GTTTGATCMTGGCTCAG-3 ' ; 1492R

5'-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3\ Секвенирование проводилось в центре «Биоинженерия» по методу Сэнгера с использованием набора Silver Sequencing («Promega», США) согласно рекомендациям производителя с незначительными модификациями. Анализ нуклеотидных последовательностей генов 16S рРНК осуществляли с помощью базы данных и программного обеспечения GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov).

Микроскопические исследования осуществляли с использованием микроскопа Axio Imager. Dl Carl Zeiss (Объектив: ЕС PLAN - NEOFLUAR lOOx) в фазовом контрасте, а также после окраски флуоресцентными красителями ДАФИ и акридиновым оранжевым и на электронном микроскопе (JEM-100C, «Jeol», Япония) методами негативного контрастирования и ультратонких срезов.

Изучение внутриклеточного пула низкомолекулярных веществ проводили по ранее описанной методике [Bernard et al. 1993] с некоторыми модификациями. Штамм 21684-1К выращивали на среде М9 с фумаратом (в некоторых опытах на среде LB), содержащей 10% NaCl, до начала стационарной фазы. Клетки осаждали центрифугированием (7000xg). Осадок клеток экстрагировали дважды 20-кратным объемом 96% этанола, экстракт высушивали досуха при комнатной температуре. Экстракт растворяли в минимальном объеме 96% этанола и хроматографировали. Использовали пластинки для тонкослойной хроматографии, покрытые слоем из наночастиц силикагеля (HPTLC, fur die Nano-DC, MERCK). Подвижная фаза - смесь н-бутанола, уксусной кислоты и воды в соотношении 12:3:5 (по объему). В качестве свидетелей использовали коммерческие препараты эктоина и глицинбетаина (BioChemika, 99.0%, HPLC), а также хроматографически чистых 1-аминокислот. Визуализацию хроматограммы производили в парах йода, а также нингидрином или изатином. Для количественного определения компонентов цифровые фотографии хроматограмм анализировали с помощью денситометрической программы «Sorbfil TLC Videodensitometer. Version 1.5» (http://www.sorbfil.com).

Исследование состава осмопротекторов нефтеокислителя 2610-1 и галофила 8214 производили аналогичным образом за тем исключением, что культуру 2610-1 выращивали на среде М-9 с гексадеканом, а также на среде LB без добавления соли или в присутствии 5% NaCl, а 8214 - на LB в присутствии 10% NaCl.

Состав и количество осмопротекторов в бинарных биопленках (из культур 21684-1К + 2610-1, а также 8214 + 2610-1) определяли теми же методами после выращивания биопленок на фильтрах на среде LB в присутствии 5-10% NaCl.

Сравнение проводили с монокультурами галофилов, выращенных в тех же условиях. Количество экстракта, наносимого на хроматограмму, нормировали путем пересчета на единицу биомассы галофила-спутника. Для этого культуры с фильтров смывали 96% этанолом и после экстракции эктоина определяли общую сухую биомассу. В случае бинарных биопленок осадок после экстракции эктоина обрабатывали 10 мл дистиллированной воды при pH 8.5 с добавлением 1-2 мг

ДНКазы и 5 мг MgS04.7H20. При этом наступал полный лизис клеток галофила. Остаток после центрифугирования и повторного промывания высушивали для определения сухой биомассы галотолеранта-нефтеокислителя. Биомассу галофила-спутника вычисляли как разность между общей биомассой и биомассой нефтеокислителя. Полноту удаления клеток галофила проверяли в модельных опытах.

Влияние спутника на нефтеокнслитель в смешанных культурах оценивали с помощью модифицированного метода обратных агаровых пластинок. На поверхность твердой среды М9 с н-гексадеканом сплошным газоном высевали нефтеокнслитель совместно с соответствующим ему спутником (в равных количествах). После подращивания снимали стерильным шпателем выросшую биомассу, переворачивали агаровую пластинку и засевали чистую сторону суспензией нефтеокислителя. Контроль - вариант, в котором на первом этапе выращивали один нефтеокнслитель. Через 3 суток выросшие клетки смывали с поверхности твердой среды и измеряли оптическую плотность полученной суспензии. В отдельных опытах определяли также вес сухой биомассы. Другие использованные в этих экспериментах методические подходы изложены в соответствующих разделах «Экспериментальной части» данной работы.

Статистическая достоверность результатов основана на выборе результатов типичного опыта непараметрическим методом сравнения парных данных с учетом «критерия знаков» [D.S.Paulson, Biostatics and Microbiology. 2008].

Результаты и их обсуждение

1.1 Получение и изучение биопленок. В природных экотопах существует равновесие между структурированными сообществами и возникающими в процессе их деградации планктонными популяциями. Поэтому при помещении проб пластовой воды на подходящую поверхность происходит регенерация биопленок из планктонных популяций. Для получения биопленок мы использовали поликарбонатные фильтры, устойчивые к физико-химическим и микробным воздействиям. Ранее эти фильтры использовали другие авторы для получения стационарных биопленок, подвергаемых исследованию с помощью атомной силовой микроскопии [Auerbach et al., 2000]. Отличие наших экспериментов состояло в том, что мы использовали необогащенные пробы пластовой воды, содержащие нативную смесь микроорганизмов, а не суспензию чистой культуры бактерий. Внешний вид биопленок, полученных этим способом из различных проб пластовых вод представлен на рис. 1.

Рис. 1. Примеры биопленок, реконструированных из пластовых вод нефтяных месторождений.

В отличие от бактериальных макроколоний, имеющих гомогенную структуру, полученные биопленки при исследовании в световом микроскопе обнаруживали значительную гетерогенность (рис. 2), обусловленную формированием микроколоний разных микроорганизмов (рис. 2а), образованием межклеточного матрикса, включающего субстраты (в данном случае микрокапли гексадекана) (рис. 26), и наличием внутренних каналов (рис. 2в).

Поскольку единственным источником углерода в использованной питательной среде является гексадекан, первыми начинают размножаться клетки микроорганизмов-нефтеокислителей. Затем вблизи их микроколоний начинается рост зависимых от нефтеокислителей микроорганизмов-спутников. В результате возникают микроассоциации, в которых можно ожидать существования взаимного влияния микробных компонентов друг на друга. При последующем рассеве диспергированных биопленок удалось получить ряд ассоциаций, содержащих 3-7 различных штаммов микроорганизмов. Из них были изолированы чистые культуры. Дальнейшие исследования модельных бинарных биопленок, полученных из этих чистых культур позволили в ряде случаев расшифровать природу их взаимодействий.

Рис.2. Световая микроскопия реконструированных биопленок (фазовый контраст), а - микроколонии разных микроорганизмов;

б - «прилипание» микробных клеток к поверхности капель парафинов; в - внутренние каналы в биопленке.

Самым существенным отличием биопленок от макроколоний является возникновение «биопленочного фенотипа» (обусловленного избирательной экспрессией многих генов), вследствие чего физиолого-биохимические свойства клеток в биопленках существенно отличаются от свойств клеток в макроколониях и суспензионных культурах [Николаев, Плакунов, 2007]. Как показано нами далее, эта особенность проявляется и у культур в реконструированных нами биопленках.

1.2 Физиолого-биохимические свойства и таксономический статус изолированных чистых культур.

Все культуры тестированы на возможность использования парафинов. У части культур исследована способность к росту на ряде углеродных субстратов. У культур, выделенных из одних и тех же микроассоциаций, изучена возможность взаимного влияния. Детальному изучению подвергнуты штаммы нефтеокислителей (2610-1, 143 и 44а), а также неспособных к окислению парафинов хемогетеротрофных бактерий-спутников (21684-1 К, 446 и 45). Часть выделенных культур идентифицирована методами полифазной таксономии.

Штамм 2610-1 - аэробный грамположительный микроорганизм, представленный короткими неподвижными палочковидными и кокковидными клетками (размеры около 1 х 2 мкм). На твердой среде образует круглые блестящие колонии от оранжевого до красного цвета. Спор не образует. Способен утилизировать парафины. Из других источников углерода использует Э-глюкозу, Ь-арабинозу, мальтозу, трегалозу, ацетат, бутират, Ь-серин. Слабый рост отмечен на средах с Ь-рамнозой, глицерином, пропионатом, цитратом, Ь-глутаматом. Не использует О-целлобиозу, О-рафинозу, маннит, формиат, сукцинат и фумарат. Гидролизует крахмал, не гидролизует желатин, не обладает оксидазной и нитратредуктазной активностью, каталазоположителен.

Штамм 21684-1К является аэробным, грамотрицательным микроорганизмом, представлен подвижными клетками палочковидной формы (размеры около 0.8 х 4-6 мкм). На твердой среде формирует круглые слизистые колонии, имеющие светло-бежевую окраску. Спор не образует. Парафины не утилизирует. Использует Э-глюкозу, Ь-арабинозу, мальтозу, трегалозу, маннит, глицерин, ацетат, сукцинат, фумарат, цитрат, Ь-серин, Ь-глутамат. Не использует О-целлобиозу, О-рафинозу, Ь-рамнозу, формиат, пропионат и бутират. Не гидролизует крахмал и желатин. Обнаруживает оксидазную, нитратредуктазную и каталазную активность.

Для определения зависимости роста изучаемых штаммов от содержания №С1 в среде использовали среду ПД (для обоих штаммов) и М9 с гексадеканом (для штамма 2610-1) или глицерином (для штамма 21684-1К). Данные представлены на рис. 3.

Штамм 21684-1К является галофилом, для которого оптимальная концентрация соли - 12%, а минимальная, допускающая рост - 5% (рис. 36). Штамм 2610-1 представляет собой галотолерантный организм, оптимальная концентрация соли для которого 0-2%, а максимальная допускающая рост - 10-12% (рис. За). Диапазоны концентрации соли, допускающие рост обоих штаммов, перекрываются,

что свидетельствует о возможности их сосуществования в одном природном экотопе.

Рис. 3. Зависимость роста изучаемых штаммов от концентрации №С1. а-штамм 2610-1; 1 - среда ПД; 2 - среда М9 с гексадеканом; б - штамм 21684-1К; 1 - среда ПД; 2 -среда М9 с глицерином.

Зависимость роста этих штаммов от рН среды исследовали на среде ПД, начальный рН в которой устанавливали путем добавления НС1 или ИаОН. Результаты представлены на рис. 4.

Зависимость роста изучаемых штаммов от температуры исследовали на среде ПД при рН 8.0. Результаты представлены на рис. 5. Оптимальной температурой для обоих штаммов является диапазон 28-30°С.

Рис. 4. Зависимость роста изучаемых Рис. 5. Зависимость роста штаммов

штаммов от рН среды. 1- штамм 2610-1; от температуры. 1 - 2610-1;

2-штамм 21684-1 К. 2-21684-1К.

Определение частичной последовательности генов 16Б рРНК совместно с определенными нами физиолого-биохимическими характеристиками позволило идентифицировать нефтеокислителей (штамм 2610-1 и штамм 44а) как представителей класса актинобактерий субпорядка СогупеЬаМеппеа рода £>/е/г/а, нефтеокислитель 14-3 как представителя рода Л/голЬсосст« того же класса, галофильный спутник 21684-1К - как представителя рода СИготоИаЬЬа&ег класса гамма-протеобактерий семейства На1отопас1асеае, а спутник 446 отнесен к роду ВгеттИтопаз семейства Саи1оЬас1егасеае класса альфа-протеобактерий. Видовой статус данных культур не определяли.

2.1 Взаимодействие изолированных микроорганизмов в суспензионных культурах и в биопленках. Взаимодействие галотолерантного нефтеокислителя £>/еС/я Бр. и галофильного спутника Скготока\оЪас1ег ер. изучали методом бинарных культур. Схема экспериментов представлена на рис. 6. В случае суспензионных культур (рис. 6а) использовали два варианта жидкой среды: без добавления ЫаС1 (гипоосмотический шок для галофила) и с 15% ЫаС1 (гиперосмотический шок для галотолеранта). Оба варианта засевали обеими культурами. Посевной материал содержал одинаковое количество КОЕ (табл. 1). После инкубации на качалке определяли КОЕ путем высева на те же два варианта твердой среды, селективных для галофила и галотолеранта. Высевы показали наличие жизнеспособных клеток галотолеранта только в среде без добавления соли, а жизнеспособные клетки галофила - только в среде, содержащей 15% №С1 (рис. 6а). Таким образом, в суспензионных культурах защитное действие микроорганизмов не проявлялось ни в условиях гипо-, ни в условиях гиперосмотического шока.

Иная картина наблюдалась при выращивании культур в бинарных биопленках (рис. 66). Культивирование исследуемых штаммов в виде бинарной биопленки приводило не только к сохранению жизнеспособности галотолеранта в присутствии 15% №С1, но и возрастанию численности его клеток на порядок в результате культивирования. Таким образом, в составе биопленки в условиях гиперосмотического шока для галотолеранта галофильный микроорганизм оказывает на него явно выраженное защитное действие, что объясняет причину существования устойчивой ассоциации между этими микроорганизмами. Подобная ассоциация обнаружена и в почвах, загрязненных ароматическими углеводородами [Ананьина и др., 2007].

Каков же может быть механизм защитного действия галофила на галотолерант? Можно предполагать, что галофильный организм выделяет в окружающую среду избыток синтезируемых им осмопротекторных веществ, поглощаемых галотолерантом. В условиях суспензионной культуры защитный эффект не проявляется из-за сильного разбавления осмопротекторов большим объемом жидкой среды. В биопленках же существует более тесный контакт между клетками популяций, и межклеточный матрикс затрудняет диффузию выделяемых веществ за пределы биопленки.

Твердая среда ПД (без добавления №С1) Галотолерант

(а)

Твердая среда ПД (без добавления ЫаС1) Галотолерант

Жидкая среда ПД (без добавления ИаС1) \

Жидкая среда ПД (15% ИаС1)

Твердая среда ПД (15% №С1) Галофил

Твердая среда ПД (15% ИаС1) Галофил

Твердая среда ПД (без добавления №С1) Галотолерант

Твердая среда ПД (15% КаСГ) Галофил

(б)

Твердая среда ПД (без добавления №С1) Галотолерант

Бногшенка на среде ПД (без добавления №С1)

Биопленка на среде ПД (15% ИаС1)

Твердая среда ПД (15% №С1) Галофил

Рис.6. Схема эксперимента по изучению совместного роста исследуемых штаммов в бинарных культурах, а) суспензионные бинарные культуры; б) бинарные биопленки на твердой среде. Примечание: пунктирная линия - отсутствие роста.

Таблица 1. Результаты совместного культивирования галотолераитного (2610-1) и галофильного (21684-1 К) штаммов в суспензионной культуре и в составе биопленок. НО - не обнаруживаются.

Состав среды Условия культивирования КОЕ в бинарной культуре/мл

Исходное Через 7 суток

2610-1 21684-1К 2610-1 21684-1К

Среда ПД без добавления КаС1 Суспензионная культура 1.5 х 107 1.5 х 107 2.5 х 108 НО

Биопленка 1.5 х 107 1.5 х 107 8.3 X 108 но

Среда ПД с 15%ЫаС1 Суспензионная культура 1.5 х 107 1.5 х 107 НО 8.8 х 108

Биопленка 1.5 х 107 1.5 х 107 3.7 х 108 7.6x108

2.2 Идентификация осмопротекторных веществ образуемых галофильным штаммом С11го>по1ш1оЬаМег эр. Для проверки высказанного предположения определяли природу низкомолекулярных веществ внутриклеточного пула этого микроорганизма. Результаты представлены на рис. 7.

Рис. 7. тонкослойная хроматография экстракта клеток С!1готоЬа1оЬас1ег эр.

1 - эктоин;

2 - экстракт клеток + эктоин;

3 - экстракт клеток.

В клеточном экстракте присутствует несколько компонентов. Вещество с Ш7, близким к 0.7 - эктоин, что подтверждает эффект «усиления» пятна при добавлении эктоина к экстракту. Вещество с соответствующим 0.25, представлено глутаматом (или его смесью с глутамином), а в состав веществ, перемещающихся вблизи фронта растворителя, входят ароматические аминокислоты (фенилаланин и тирозин).

2.3 Моделирование защитного действия галофила. Если защитное действие галофила на галотолерант обусловлено выделением в среду осмопротекторов, то вводимый в среду эктоин должен оказывать такой же эффект, как и совместное культивирование этих штаммов. Для проявления эффекта в суспензионных культурах содержание эктоина должно соответствовать его содержанию в бинарных биопленках. Определение этого содержания прямым путем затруднительно, поэтому было изучено действие широкого диапазона концентраций эктоина на рост галотолерантного штамма в присутствии летальной (15%) для него концентрации ЫаС1. Результаты представлены на рис. 8. Эффект эктоина обнаруживается уже при его концентрации 100 мкг/мл, а максимальный эффект проявляется при диапазоне концентраций 500-1500 мкг/мл. Добавление эктоина в концентрации 1000 мкг/мл к контрольной культуре (в отсутствие соли) не оказывало влияния на рост.

Рис. 8. Зависимость роста Dietzia sp. па среде ПД с 15% NaCl (в % к контролю без эктоина) от количества добавленного к среде эктоина.

Определение КОЕ в контрольном варианте и при содержании 1000 мкг/мл эктоина показало, что в контрольном варианте количество жизнеспособных клеток в первые двое суток культивирования сохраняется на уровне засева (около 107 кл/мл), а в дальнейшем существенно снижается, тогда как в присутствии эктоина величина КОЕ на вторые сутки возрастает в 4-5 раз.

Таким образом, в условиях гиперосмотического шока эктоин действительно проявляет защитное действие в отношении галотолерантного нефтеокислителя Dietzia sp.

Чтобы определить, насколько исследованные концентрации эктоина в суспензионной культуре соответствуют его концентрации в бинарной биопленке, использовали литературные данные по внутриклеточному содержанию эктоина у близкого к Chromohalobacter sp. микроорганизма Brevibacterium linens [Bernard et al., 1993]. По данным этих авторов, содержание эктоина в клетках данного микроорганизма составляет около 1 мкмоль/мг сухой биомассы (или 140 мкг/мг) Это соответствует результатам, полученным нами при хроматографическом определении эктоина. По нашим данным, сухая биомасса в использованных нами бинарных биопленках составляет около 5 мг на биопленку при среднем объеме биопленки 0.1 мл. Простой расчет показывает, что концентрация эктоина в биопленке может достигать 1500-3000 мкг/мл (при условии, термодинамического равновесия между внутриклеточными и внеклеточными концентрациями), что соответствует его действующей концентрации в суспензионной культуре. Однако, при тех же условиях биосинтеза и экскреции эктоина в суспензионной культуре (сухая биомасса галофила составляет около 500 мг/л) его концентрация не может превысить 30 мкг/мл, что ниже действующего уровня. Таким образом, концентрация

осмопротектора внутри биопленки может превышать его концентрацию в суспензионной культуре примерно на 2 порядка.

2.4 Природа осмопротекторов образуемых галотолерантным нефтеокислителем 1УШ7,1а яр. При хроматографическом анализе экстрактов клеток галотолерантного нефтеокислителя О'Шг'ш ер. обнаружен основной пик с ЯГ = 0.75, а также значительно менее интенсивные пики с ЯГ = 0.49 и 0.62. (рис. 9). Два последних пика были отнесены к группе кислых аминокислот: аспарагиновой и глутаминовой, что подтверждается усилением этих пиков после добавления стандартных свидетелей. Основной пик по ЯГ не совпадал с пиком эктоина.

Для уточнения природы осмопротектора к экстракту были добавлены как глицинбетаин, так и эктоин (рис.10, рис. 11, рис. 12). На основании эффекта усиления осмопротектор в экстракте штамма Ь/еСи/ ер. идентифицирован как глицинбетаин (рис. 11).

I 1 соо о;

£ 1500

2соо

500

0,0

0.2 0/

0.6

0.8

1.0

кт

Рис. 9. Результаты тонкослойной хроматографии экстракта галотолерантного нефтеокислителя О/е/г/а эр. Основной пик с Ш=0,75.

3 ООО 2 £00

¡2 2 000 и

1 £00 1 ООО ЕС О

1 ..........¡-••/с/ч**'"......... .........!Ц;.....

......1.....

: __________;/.......!......

... ____/..<.......... 1.........

;

0,0

0,2

0,4 0.6

РЛ

Рис. 10. Результаты тонкослойной хроматографии смеси стандартов эктоина (ЯШ),71) и глицинбетаина (Ш=0,76).

3 ООО

2 ЕСО

£ 2 000

| 1 500 К

1 ООО Е00

0.0

0.4 0,6

Р.1

0,5

Рис. 11. Эффект усиления пика с Ш' = 0.75 при добавлении глицинбетаина к экстракту штамма Л/е/гш Бр.

3 ООО 2 SCO

ё 2 COO

1 1 £00

Сч

I ООО £00 о

0,0 0,2 0,4 0,5 0.S 1,0

Рис. 12. Появление пика с Rf = 0.71 при добавлении эктоина к экстракту штамма Dietzia sp.

2.5 Повышение синтеза эктоина в бинарных биопленках. Одним из последствий формирования структурированных микробных сообществ (биопленок) является изменение пула экспрессируемых генов (возникновение «биопленочного» фенотипа). Если в биопленке устанавливаются протокооперативные взаимоотношения между ее микробными компонентами, можно ожидать положительного влияния спутника на нефтеокисляющий микроорганизм в ответ на снабжение спутника продуктами окисления нефти. Как мы показали, галофильный спутник Chromohalobacter sp. оказывает на галотолерантный нефтеокислитель Dietzia sp. защитное действие в условиях гиперосмотического шока, которое обусловлено поглощением осмопротектора (эктоина). Если в условиях гиперосмотического шока для нефтеокислителя Dietzia sp. экспрессируемость генов спутника Chromohalobacter sp., связанных с биосинтезом эктоина, действительно увеличивается, то уровень этого осмопротектора в бинарной биопленке будет выше по сравнению с биопленкой, формируемой одним галофилом. Количественная оценка накопление эктоина - более показательный метод, чем детекция транскрипции или трансляции молекулярно биологическими методами из-за многоступенчатости пути биосинтеза эктоина. Существует множественная регуляция на разных этапах этого пути, в связи с чем активность соответствующих ферментов может ограничиваться или блокироваться. Уровень накопление эктоина дает прямую оценку функционирования этого пути в конкретных физиологических условиях.

Как показал сравнительный хроматографический анализ экстрактов биопленок, сформированных из одного спутника (Chromohalobacter sp.) и из смеси спутника с нефтеокислителем (Dietzia sp.) на среде LB содержащей 10% NaCl, в присутствии нефтеокислителя содержание эктоина увеличивается в 1.3-1.6 раза, (рис. 13-14).

77J\_____

.... „ и / \

—..... ..../.. \

.......... / 7"....... ......\

. У '......... \

0,0 0,2 0,4 0.5 0.S 1,

1 €00 1 400 1 200 á 1 ООО

I soo

£ ÍOD

400 200

Рис. 13. Накопление эктоина в биопленке, сформированной одним галлофилом СЬготока/оЬаМег ер. Площадь пика эктоина - 96307 пикселей.

2 ECO • 2 ООО

§ 1 500 1 ООО ■ SC0-.

Рис. 14. Увеличение накопления эктоина в бинарной биопленке, составленной из нефтеокислителя (Dietzia sp.) и его спутника (Chromohalobacter sp.). Площадь пика эктоина 132856 пикселей.

Механизм этого эффекта, как можно полагать, связан с тем, что часть эктоина, образуемого галофилом Chromohalobacter sp., поглощается галотолерантным нефтеокислителем Dietzia sp., поскольку глицинбетаин и эктоин имеют общую транспортную систему [Onraedt et al., 2006]. Это приводит к снижению внеклеточного уровня эктоина в биопленке и дерепрессирует систему биосинтеза эктоина, как это показано ранее для Chromohalobacter salexigens [Calderón et al., 2004]. Ограниченный масштаб этого повышения определяется количеством эктоина, которое должно накопиться в клетках галотолеранта для осуществления осмопротекции, после чего биосинтез эктоина вновь блокируется включением регуляторного механизма.

/ \

: ' / \

; ; / \

........... i......... •......... < \

, , /

.......Г" " 1 " /"

..................Í................ \.............

0.0 0.2 0.4 0,6 0.8 1.

......---j---.........- 7-V J.......L

- / I........\

^i- л,

0,0 0.2 0.4 0,6 0,3 1.

Было изучено взаимодействие нефтеокислителя с другим галофилом (8214). Штамм 8214 выделен из пластовых вод того же месторождения, что и СИготока!оЬас1ег эр., но отличается от него рядом свойств. Галофил 8214 также реагирует на присутствие £>/е/г/я эр. в бинарной биопленке повышением накопления эктоина и, вероятно, гидроксиэктоина (рис. 15-16).

1 400

1 200 £ 1 ООО-9 Б00-К 600400200 о

Рис. 15. Накопление эктоина в биопленке, сформированной одним галофилом 8214. Площадь пика эктоина - 43143 пикселей.

1 Е00

£ 1 ооо-

с;

5000-

Рис. 16. Увеличение накопления эктоина в бинарной биопленке, составленной из нефтеокислителя (£>/ейг/я ¡р.) и его спутника (8214). Площадь пика эктоина 68631 пиксель.

! А

с.о о.:

—г--0,4

0,6 0,£

Р.!

3.1 Влияние состава реконструированных биопленок на активность нефтеокнсляющнх бактерий

Для скрининга перспективных пар нефтеокислитель-спутник, где спутник активирует нефтеокислитель, использовали метод обратных агаровых пластинок. Результаты типичного опыта представлены в табл. 2.

Возможны следующие механизмы влияния спутников на нефтеокисляющий микроорганизм: 1) выделение спутниками в среду в процессе их роста совместно с нефтеокислителем веществ, активирующих рост нефтеокисляющего микроорганизма; 2) поглощение спутниками из среды метаболитов нефтеокислителя, ингибирующих его рост. Первое объяснение более вероятно, поскольку выращивание нефтеокислителя проводится в отсутствие спутника, а эффект, тем не менее, сохраняется.

Таблица 2. Прирост сухой биомассы культуры нефтеокислителя 44а (в % к контролю без спутников) после культивирования методом переворачивания со спутниками 446 и 45

Культуры Прирост сухой биомассы, %

44а 100

44а + 446 140

44а + 45 139

Чтобы количественно оценить стимулирующий эффект спутника, измеряли остаток углеводородного субстрата в среде после выращивания смешанной культуры. Для этого необходимо использовать жидкие среды. Однако в суспензионных культурах, при совместном выращивании нефтеокислителей со спутниками достоверных различий в количестве остаточного н-гексадекана обнаружено не было, несмотря на то, что смешанная популяция превосходила по биомассе культуру чистого нефтеокислителя. По-видимому, прирост биомассы был обусловлен утилизацией спутником продуктов деградации парафина, недоступных для нефтеокислителя.

Мы предположили, что отсутствие стимуляции нефтеокисляющей способности могло быть обусловлено недостаточной плотностью смешанной популяции в суспензионной культуре, тогда как в биопленках, где вступают в действие «факторы плотности популяции» (quorum sensing) происходит экспрессия генов, информация которых не реализуется в суспензионной культуре [Николаев, Плакунов, 2007].

Поэтому были предприняты попытки имитировать условия, сходные с условиями, существующими в природных биопленках, но позволяющие количественно определять остаточный н-гексадекан. С этой целью мы использовали два подхода. В первом случае биопленки из спутника и нефтеокислителя первоначально формировали на фильтрах на твердой среде М9 с н-гексадеканом, а затем стерильно переносили фильтры в колбы с жидкой средой того же состава. Инкубацию биопленок в жидкой среде в стационарных условиях продолжали в течение двух недель, после чего гравиметрически определяли остаточное количество н-гексадекана. Во втором случае формирование биопленок осуществляли

непосредственно в жидкой среде в присутствии гидрофобного силикагеля (Octadecyl=Si3C)OPoIyol, Serva), на котором адсорбировался внесенный в среду н-гексадекан. Рост микроорганизмов большей частью происходил в объеме силикагеля. Полученные результаты представлены на рис. 17.

Гексадекан. мг

(а)

Гексадекан, мг

(б)

Варианты

Рис. 17. Остаточное количество н-гексадекана на 20 мл культуральной жидкости.

(а) - готовые биопленки в стационарных условиях: 1 - контроль без засева, 2- нефтеокислитель, штамм 44а, 3 - штамм 44а в смеси со спутником 446,4 - штамм 44а в смеси со спутником 45;

(б) - выращивание в присутствии гидрофобного силикагеля: 1 - контроль без засева, 2 -нефтеокислитель, штамм 14-3, 3 - штамм 14-3 в смеси со спутниками 14-1 и 14-2, 4 - штамм 14-3 в смеси со спутником 14-1. При добавлении к штамму 14-3 одного спутника 14-2 результат стимуляции такой же, как и в случае смеси спутников 14-1 и 14-2 (на рисунке не показан).

При сочетаниях нефтеокислителей и спутников, входивших в одну и ту же исходную ассоциацию, наблюдается многократное увеличение потребления н-гексадекана. При этом между некоторыми спутниками (14-1 и 14-2) возникает конкуренция. Таким образом, при данных способах культивирования, имитирующих условия природных структурированных ассоциаций, существенно повышается эффективность утилизации н-гексадекана нефтеокислителем. Химическая природа образуемых спутниками стимуляторов в настоящее время уточняется.

Заключение

В данном исследовании впервые удалось продемонстрировать физиологическую роль галофильного спутника в сообществе с галотолерантным нефтеокисляющим микроорганизмом. Таким образом, раскрыта причина формирования распространенных в природных условиях ассоциаций галофильных (способных к синтезу и экскреции осмопротекторных веществ) и галотолерантных микроорганизмов, поглощающих эти вещества из внешней среды.

Другой пример положительного воздействия бактерий-спутников на нефтеокислители состоит в том, что, утилизируя образованные микроорганизмами-нефтеокислителями продукты деградации углеводородов, спутники выделяют в среду низкомолекулярные вещества, активирующие рост и окисление углеводородов нефтеокислителями.

На основании полученных результатов мы сделали вывод, что взаимодействия нефтеокислителей и их спутников в изученных нами моделях биопленок близки к протокооперативным: продуценты образуют продукты деструкции углеводородов, которые обеспечивают рост диссипотрофов, а последние выделяют в среду вещества, стимулирующие жизнедеятельность продуцентов или защищающие их от воздействия стрессовых факторов среды. Такого рода микробные взаимодействия микрофлоры нефтяных месторождений обнаружены впервые. Они представляют собой не только несомненный теоретический интерес, но и должны учитываться в мероприятиях по повышению эффективности микробиологических методов нефтеизвлечения, а также при очистке природных субстратов от нефтяных загрязнений.

При использовании биопленок в качестве «биореакторов» введение в их состав дополнительных микробных компонентов, активирующих или защищающих основные микроорганизмы, в ряде случаев может существенно повышать эффективность всего биотехнологического процесса.

Выводы:

1. Впервые разработаны методы частичной реконструкции из пластовых вод нефтяных месторождений микробных биопленок, включающих наиболее тесно взаимодействующие микроорганизмы.

2. Из реконструированных биопленок изолированы чистые культуры нефтеокисляющих бактерий и их спутников, неспособных к окислению парафинов, входящие в одни и те же ассоциации. Определена родовая принадлежность некоторых нефтеокислителей (pp. Dietzia, Rhodococcus) и их спутников (Chromohalobacter, Brevundimonas).

3. Впервые продемонстрирована защитная роль галофильного спутника (<Chromohalobacter sp.) в сообществе с галотолерантным нефтеокисляющим микроорганизмом (Dietzia sp.) в условиях гиперосмотического шока и, таким образом, выявлена причина существования в ряде экотопов ассоциаций галофильных (способных к синтезу и экскреции осмопротекторных веществ) и галотолерантных микроорганизмов, поглощающих эти вещества из внешней среды.

4. Идентифицированы осмопротекторные соединения, образуемые галотолерантным нефтеокислителем Dietzia sp. (глицинбетаин), а также его галофильными спутниками Chromohalobacter sp. и штаммом 8214 (эктоин). Впервые показано, что в бинарных биопленках, включающих нефтеокислитель и спутник, биосинтез эктоина возрастает в 1.25 - 1.6 раза.

5. Впервые изучено взаимодействие изолированных чистых культур нефтеокислителей и их спутников в модельных бинарных биопленках; показано, что оно имеет протокооперативный характер: в ответ на образование нефтеокислителями продуктов деградации парафинов спутники выделяют вещества, стимулирующие активность нефтеокислителей.

Список работ, опубликованных по материалам диссертации: Экспериментальные статьи

1. Плакунов В. К., Журина М. В., Беляев С. С. Устойчивость нефтеокисляющего микроорганизма, Б'шЫа зр. к гиперосмотическому шоку в реконструированных биопленках// Микробиология. 2008. Т. 77. № 5. С. 581-589.

2. Журина М. В., Стрелкова Е. А., Плакунов В. К., Беляев С. С. Влияние состава реконструированных биопленок на активность парафинокисляющих бактерий//Микробиология. 2008. Т. 77. № 5. С. 701-703.

3. Стрелкова Е. А., Журина М. В., Плакунов В. К. Использование реконструированных биопленок для ускорения деградации углеводородов нефти// Вестник биотехнологии и физико-химической биологии им. Ю.А. Овчинникова. 2008. Т. 3. № 4. С. 28-30.

Тезисы докладов

4. Журина М. В., Данцевич О. Н., Плакунов В. К. Получение и состав биопленок, образуемых микроорганизмами-нефтеокислителями и их аэробными хемогетеротрофными спутниками//Н Молодежная международная школа-конференция: «Актуальные аспекты современной микробиологии». Россия. Москва. 2006. Тезисы докладов. С. 81-82.

5. Плакунов В. К., Журина М. В., Безрукова Е .А., Лебедева И. В. Взаимоотношения микроорганизмов нефтяных месторождений в реконструированных биопленках // IV Московский международный конгресс «Биотехнология: состояние и перспективы развития». Россия. Москва. 2007. Тезисы докладов, секция 7. С. 343-344.

6. Журина М. В., Воронина Н. А., Безрукова Е. А., Лебедева И. В., Плакунов В. К. Зависимость способности микроорганизмов к окислению парафинов от состава реконструированных биопленок. Международная научная конференция «Микроорганизмы и биосфера». Россия. Москва. 2007. Тезисы докладов. С. 46.

7. Журина М. В., Стрелкова Е. А., Плакунов В. К. Механизмы взаимодействия нефтеокисляющих микроорганизмов и их спутников в реконструированных биопленках // IV Молодежная школа-конференция с международным участием: «Актуальные вопросы современной микробиологии». Россия. Москва. 2008. Тезисы докладов. С. 87-88.

Заказ№ 115-а/10/09 Подписано в печать 21.10.2009 Тираж 100 экз. Усл. п.л. 1,5

ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30 www.cfr.ru; е-таН:info@cfr.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Журина, Марина Владимировна

оглавление. введение. обзор литературы.и нефтеокисляющ11е микроорганизмы.

Введение.

1.1.1. Характеристика микроорганизмов нефтяных плас гов.

1.1.2. Биологическое и метаболическое разнообразие микроорганизмов нефтяных пластов.

1.1.2.1. Сульфатредуцирующие бактерии.

1.1.2.2. Метапогенные археи.

1.1.2.3. Анаэробные органотрофы с бродильным типом метаболизма.

1.1.2.4. железорндуцирующие бак1ерии.

1.1.2.5. Аэробные органотрофные и нефтеокисляющие микроорганизмы.

1.1.3. Биодеградация компонентов нефти.

1.1.3.1. Факторы, влияющие на процесс биодеградации нефти. биопленки.

1.2.1. Формирование биопленок и регуляция этого процесса.

1.2.2. Видовой состав биопленок.

1.2.3. Типы бактериальных взаимодействий в биопленках.

1.2.4. механизмы бактериальных взаимодействий, характерные для биопленок.

1.2.5. устойчивость биопленок к стрессорам.

1.2.5.1. персис гентность.

1.2.5.2.механизмы формирования клеток-персистеров.

1.2.5.3. Системы токсин-антитоксин и формирование клеток-персистеров.

1.2.6. краткая характеристика лабораторных методов создания биопленок. феномен галофилии.

1.3.1. Явление галофилии: микроорганизмы и механизмы.

1 -3.2.механизмы галоадаптации и осморегулщии.

1.3.3. пуiи синтеза и транспорта некоторых осмолитов.

1.3.3.1 биосинтез глицинбетаина.

1.3.3.2. синтез эктоина и гидроксиэктоина.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Взаимодействие нефтеокисляющих микроорганизмов с хемоорганотрофными бактериями-спутниками, неспособными к окислению углеводородв, в структурированных микробных сообществах (биопленках)"

Актуальность темы. В природных экотопах основная часть микроорганизмов существует в виде ассоциаций, определяемых общим термином «биопленки»: пространственно и метаболически структурированных сообществ, заключенных во внеклеточный полимерный матрикс и расположенных на границе раздела фаз [1]. Между микробными компонентами биопленок существуют многообразные метаболические взаимоотношения, при которых взаимодействие имеет либо односторонний характер, например, потребление кислорода аэробными микроорганизмами, обеспечивает возможность сосуществования анаэробных форм [2], либо наблюдается взаимное положительное влияние компонентов биопленок друг на друга [3]. В таких случаях могут устанавливаться взаимоотношения, близкие к симбиозу, при которых образование или потребление какого- либо субстрата в биопленке происходит с большей интенсивностью, чем в случае свободных (планктонных) популяций. Это, например, происходит в рубце жвачных животных в биопленках, состоящих из целлюлолитиков и их спутников, неспособных к гидролизу целлюлозы. Последние потребляют продукты гидролиза, репрессирующие биосинтез целлюлаз, и, таким образом, повышают образование этих ферментов [4].

Существование близкой ситуации можно предполагать в заводняемых нефтяных месторождениях, где единственным источником углерода служит нефть. Из пластовых вод таких месторождений наряду с нефтеокисляющими микроорганизмами («продуцентами») можно выделить множество хемогетеротрофных аэробных и анаэробных микроорганизмов-спутников (диссипотрофов), которые неспособны утилизировать компоненты нефти, но растут за счет продуктов ее деградации. Однако их влияние на микроорганизмы-нефтеокислители практически не изучено. Между тем, взаимодействия микроорганизмов 4 в биопленках, которые, по данным ряда исследователей, формируются в нефтяном месторождении [5], может существенно влиять на их биогеохимическую активность, особенно в месторождениях с экстремальными условиями среды. Изучение воздействия микроорганизмов-спутников на нефтеокислители важно также при создании препаратов для очистки природных субстратов от нефтяных загрязнений. Поэтому изучение этих взаимоотношений представляет большой научный и практический интерес.

Цель п задачи исследования. Целью диссертационной работы является частичная реконструкция биопленок, характерных для нефтяных месторождений с различными физико-химическими условиями, и изучение взаимодействия их микробных компонентов, связанных трофическими и другими связями. Особое внимание уделено возможности защитного и регуляторного воздействия спутников (неспособных к окислению нефти) на нефтеокисляющие микроорганизмы.

Задачи исследования:

1. Разработать методы частичной реконструкции биопленок из пластовых вод нефтяных месторождений.

Впервые расшифрован механизм защитного действия галофильного спутника на нефтеокисляющий микроорганизм, состоящий в образовании осмопротекторного вещества эьсгоина, обеспечивающего рост нефтеокислителя при ингибиторных уровнях соли.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены на II Молодежной международная школе-конференции: «Актуальные аспекты современной микробиологии». Россия. Москва. 2006; IV Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития». Россия. Москва. 2007; Международной научной конференции «Микроорганизмы и биосфера». Россия. Москва. 2007; IV Молодежной школе-конференции с международным участием: «Актуальные вопросы современной микробиологии». Россия. Москва. 2008.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Журина, Марина Владимировна

Выводы

3. Впервые продемонстрирована защитная роль галофильного спутника (Chromohalobacter sp.) в сообществе с галотолерантным нефтеокисляющим микроорганизмом (Dietzia sp.) в условиях гиперосмотического шока и, таким образом, выявлена причина существования в ряде экотопов ассоциаций галофильных (способных к синтезу и экскреции осмопротекторных веществ) и галотолерантных микроорганизмов, поглощающих эти вещества из внешней среды.

Заключение

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Журина, Марина Владимировна, Москва

1. Николаев Ю. А., Плакунов В. К. Биопленка «город микробов» или аналог многоклеточного организма? // Микробиология. 2007. Т. 76. № 2. С. 149-163.

2. Wolin M. J., Miller T. L. Microbe-microbe interactions // The rumen microbial ecosystcm / Ed. HobsonP. N. NY: Elsevier Science Publ., 1988. P. 121-132.

3. Weimer P. J. Cellulose degradation by ruminal microorganisms // Crit. Rev. Biotechnol. 2003. V. 12, P. 189-223.

4. Sanders P. F., Sturman P. J. Biofouling in oil industry // Petroleum microbiology / Eds. Olivier В., Magot M. Washington: ASM Press, 2005. P 171-198.

5. Donlan R. M., Costerton J. W. Biofilms: survival mechanisms of clinically relevant microorganisms. // Clin. Microbiol. Rev. 2002. V. 15. № 2. P. 167-193.

6. Розанова E. П., Кузнецов С. И. Микрофлора нефтяных месторождений. М.: Наука. 1974. 198 с.

7. Magot M., Ollivier В., Patel B.K.C. Microbiology of petroleum reservoirs // Antonie van Leeuwenhoek. 2000. V.77. P. 103-116.

8. Розанова Е. П., Назина Т. Н. Углеводородокисляющие бактерии и их активность в нефтяных пластах. // Микробиология. 1982. Т. 51. С. 342-348.

9. В.Розанова Е. Н., Беляев С. С., Иванов М. В., Мац А. А., Кулик Е. С., Мамедов Ю. Г. Микробиологические методы повышения нефтеотдачи пластов. // Обзор Информ. Сер. Нефтепромысловое дело. М.: ВНИИОЭНГ. 1987. 44 С.

10. Jinfeng L., LijunM., Bozhong М., Rulin L., Fangtian N., Jiaxi Z. The field pilot of microbial enhanced oil recovery in a high temperature petroleum reservoir// Petrol. Sci. Engin. 2005. V. 48. P. 265-271.

11. Тарасов А. Л., Борзенков И. А., Милехина E. И., Беляев С. С., Иванов М. В. Динамика микробных процессов в пластовых водах Ромашкинского нефтяного месторождения // Микробиология. 2002. Т. 71. №6. С. 849-857.

12. Назина Т. Н., Григорьян А. А., Шестакова Н. М., Бабич Т. Л., Ивойлов В. С., Циньсян Фенг., Фангтиан Ни, Джинциан Ванг, Уехие Ше, Тингшен Сиан, Жибин Луо, Беляев С. С., Иванов М. С.98

13. Микробиологические исследования высокотемпературных нефтяных пластов залежи Кондиан в связи с испытанием биотехнологии повышения нефтеизвлечения // Микробиология. 2007. Т. 76. № 3. С. 329-339.

14. П.Розанова Е. П. Микробиология и биогеохимия нефтяных месторождений. Докл. дисс. докт. биол. наук. М: ИНМИ РАН, 1991. С. 49.

15. Розанова Е. П., Худякова А. И. Новый бесспоровьтй термофильный организм, восстанавливающий сульфаты, Desulfovibrio thermophilus nov. sp. //Микробиология. 1974. Т. 43. С. 1069-1073.

16. Розанова Е. П., Назина Т. Н., Кулик Е. С., Сомов Ю. П. Микробиологическое образование метана из гексадекана // Микробиология. 1985. Т. 54. С. 555-560.

17. Розанова Е. П., Назина Т. Н., Галушко А. С.Выделение нового рода сульфатвосстанавливающих бактерий и описание нового вида этого рода Desulfomicrobium apsheronum gen. sp. Nov. // Микробиология. 1988. Т. 57. С. 634-641.

18. Назина Т. Н., Иванова А. Е., Голубева О. В. Распространение сульфат- и железоредуцирующих бактерий в пластовых водах ромашкинского нефтяного месторождения. // Микробиология. 1995. Т.64. С. 245-251.

19. Назина Т. Н. Микроорганизмьгнефтяных пластов и использование их в биотехнологии повышения нефтеотдачи. Дисс. док. биол. наук. М.: 2000. 67с.

20. Назина Т. Н., Розанова Е. П. Термофильные сульфатвосстанавливающие бактерии из нефтяных пластов. // Микробиология. 1978. Т. 47. С. 142-148.

21. Бердичевская M. В. Влияние продолжительного заводнения нефтяного месторождения на развитие биоценоза и активность пластовой микрофлоры. // Микробиология. 1982. Т. 51. № 1. С. 146151.

22. Милехина Е. И., Борзенков И. А., Миллер Ю. М. Углеводородокисляющая микрофлора заводняемых нефтяных месторождений Татарии с различной минерализацией пластовых вод. //Микробиология. 1991. Т. 60. С. 747-756.

23. Juhasz A. L., Naidu R. Bioremediation of high-molecularweight polycyclic aromatic hydrocarbons: a review of the microbial degradation of enzoa.pyrene. // Int. Biodet. Biodegad. 2000. V. 45. P. 57-88.

24. Smith M. R. The biodegradation of aromatic hydrocarbons by bacteria. // Biodegrad. 1990. V. 1. P. 191-206.

25. Sutherland J. B. Detoxification of polycyclic aromatic hydrocarbons by fungi. // Ind. Microbiol. 1992. V. 9. P. 53-62.

26. Watlcinson R. J., Morgan P. Physiology of aliphatic hydrocarbon-degrading microorganisms. // Biodegrad. 1990. V. 1. P. 79-92.

27. Benedik M. J., Gibbs P. R., Riddle R. R., Wilson R. C. Microbial denitrogenation of fossil fuels. // Trends Biotechnol. 1998. V. 16. P. 390395.

28. Bressler D. C., Norman J. A., Fedorak P. M. Ring cleavage of sulfur heterocycles: how does it happen? // Biodegrad. 1998. V. 8. P. 297-311.

29. Bressler D. C., Fedorak P. M. Bacterial metabolism of fluorene, dibenzofuran, dibenzothiophene, and carbazole. // Can. Microbiol. 2000. P. 397-409.

30. Кгорр К. G., Fedorak P. М. A review of the occurrence, toxicity and biodegradation of condensed thiophenes found in petroleum. // Can. Microbiol. 1998. V. 44. P. 605-622.

31. May S. Applications of oxidoreductases. // Curr. Opin. Biotechnol. 1999. V. 10. P. 370-375.

32. Wentzel A., Ellingsen Т. E., Kotlar H-K., Zotchev S. В., Throne-Hoist M. Bacterial metabolism of long-chain n-alkanes. // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2007. V .76. P. 1209-1221.

33. Mauersberger S., Ohkuma ML, Schunck W.-H., Takagi M. Candida maltosa In: Nonconventional Yeasts in Biotechnology (Wolf, K., Ed.), A Handbook. Springer, Berlin, Heidelberg, New York. 1996. P. 411-580.

34. Tanaka A., Fukui S. Metabolism of n-alkanes In: The Yeasts (Rose, A.H. and Harrison, J.S., Eds.), Second ed, Academic Press, London. Metabolism and Physiology of Yeasts, 1989. V. 3, P. 261-287.

35. Buhler M. Schindler J. Aliphatic hydrocarbons In: Biotechnology (Rehm, H. and Reed, G., Eds.), Verlag Chemie, Weinheim. Biotransformation. 1984. V. 6a, P. 329-385.

36. Widdel F., Rabus R. Anaerobic biodegradation of saturated and aromatic hydrocarbons. // Curr. Opin. Biotechnol. 2001. V. 12. P. 259-276.

37. Fickers P., Benetti P.-H., Wache Y., Marty A., Mauersberger S., Smit M.S., Nicaud J.-M. Hydrophobic substrate utilisation by the yeast Yarrowia lipolytica, and its potential application. // FEMS Yeast Research. 2005. V. 5. P. 527-543.

38. Ulrich А. С., Guigard S. E., Foght J. M.,Semple К. M., Pooley K„ Armstrong J. E., Biggar. K. W. Effect of salt on aerobic biodegradation of petroleum hydrocarbons in contaminated groundwater // Biodegrad. 2009. V. 20. P. 27-38.

39. Кузнецов A. E, Градова H. Б. Научные основы экобиотехнологии, M., 2006. С. 47-68.

40. Huesemann М. Н. Predictive model for estimating the extent of petroleum hydrocarbon biodegradation in contaminated soils. // Environ. Sci. Technol. 1995. V. 29. P. 7-18.

41. Bruheim P., Bredholt H., Eimhjellen K. Bacterial degradation of emulsified crude oil and the effect of various surfactants. // Can. Microbiol. 1997. V 43. P. 17-22.

42. Bruheim P., Eimhjellen K. Chemically emulsified crude oil as substrate for bacterial oxidation: differences in species response. // Can. Microbiol. 1998. V. 44. P. 638-646.

43. Burd G., Ward O. P. Bacterial degradation of polycyclic aromatic hydrocarbons on agar plates: the role of biosurfactants. // Biotechnol. Technol. 1996. V. 10. P. 371-374.

44. Burd G., Ward O. P. Energy-dependent production of particulate biosurfactant by Pseudomonas marginalis. // Can. Microbiol. 1997. V. 43. P. 391-394.

45. Rosenberg E. Biosurfactants. // Prokaryotes. 2006. V. 1. P. 834-849.

46. Banat I. M. Biosurfactant production and possible uses in microbial enhanced oil recovery and oil pollution remediation. // Biores. Technol. 1995. V. 51. P. 1-12.

47. Zhang L, Keller J, Yuan Z. Effects of long-term pH elevation on the sulfate-reducing and methanogenic activities of anaerobic sewer biofilms. // Wat. Res. 2009. V. 43 (9). P. 2549-2557.

48. Van Loosdrecht M. С. H. Bacterial Adhesion. Wageningen, 1988. P. 200.

49. Раилкин А. И. Процессы колонизации и защита от биообрастания. 1998. Спб.: Изд-во С-Петербург. ун-та. С. 72.

50. Звягинцев Д. Г. Взаимодействие микроорганизмов с твердыми поверхностями. // 1973. Изд-во МГУ. С 17.

51. Далин М. В., Фиш Н. Г. Адгезины микроорганизмов. // Итоги науки и техники. ВИНИТИ. //Микробиология. 1985. 16. С. 3-107.

52. Dunny М. W. Bacterial adhesion: seen any good biofilm lately? // Clin. Microbiol. Rev. 2002. V. 15. P. 155-166.

53. Zhou M., Wu H. Glycosylation and biogenesis of a family of serinerich bacterial adhesins. //Microbiol. 2009. V. 155. P. 317-327.

54. Северина JI. О. Бактериальные S- слои. // Микробиология. 1995. Т. 64. N. 6. С. 725-733.

55. Da Re S., Le Que're' В., Ghigo J.-M., Beloin C. Tight modulation of E. coli bacterial biofilm formation through controlled expression of adhesion factors // Appl. Environ. Microbiol. 2007. V. 73. P. 3391-3403.

56. Burshard R. P., Sorongon. M. L. A gliding bacterium strain inhibits adhesion and motility of another gliding bacterium strain in marine biofilm. // Appl. Environm. Microbiol. 1998. V. 64. P. 4079-4083.

57. Marchall К. C. Mechanisms of bacterial adhesion at solid-water interfaces. Eds. Savage D.S., Fletchetr M. NY L: Plenum press. 1985. P.133-155.

58. McEldowney S., Flethcher M. Effect of pH, temperature and growth condition on the adhesion of a gliding bacterium and three nongliding bacteria topolysterenc. //Microbiol. Ecol. 1988. V. 16. P. 183-195.

59. La Paglia C., Hartzell P. Stress-induced production of biofilm in the hyperthermophilc Archaeoglobus fiilgidus. II Appl. Environ. Microbiol. 1997. V. 63. P. 3158-3163.

60. Busalmen J. P., dc Sanchez S. R., Influence of pH and ionic strenght on adhesion of a wild strain of Pseudomonas sp. to titanium. // Ind. Microbiol. Biotechnol. 2001. V. 26. P. 303-308.

61. Van Schic P. M., Fletcher M. Adhesion of biodegradative anaerobic bacteria to solid surfaces. // Appl. Environ. Microb. 1999. V.65. P. 50825088.

62. O'Toole G. A., Kolter R. Flagellar and twitching motility are necessary for Pseudomonas aeruginosa biofilm development. // Mol. Microbiol. 1998 V. 30. P. 295-304.

63. Nuccio S-P., Braumer A. J. Evolution of the chaperone / usher assembly pathway: fimbrial classification goes greek. // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2007. V. 71. N4. P. 551-573.

64. Prigent-Combaret С., Vidal О., Dorell С., Lejeunf P. Abiotic surface sensing and biofilm-depcndent regulation of gene expression Esherichia coli. H Bacteriol. 1999. V. 181. P. 5993-6002.

65. Fronzes R., Remaut H., Waksman G. Architectures and biogenesis of non-flagellar protein appendages in gram-negative bacteria. // EMBO 2008. V. 27. P. 2271-2280.

66. White A. P., Gibson D. L, Collinson S. K., Banser P. A.,'Kay W. W. Extracellular polysaccharide associated with thin aggregative fimbriae of Salmonella enterica serovar enteritidis. // Bacteriol. 2003. V. 185. P. 5308- 5407.

67. Budzig J. M., Sheewind O. Pili prove pertinent to enterococcal endocarditis. // Clin.Invest. 2006. V. 116. P. 2582-2584.

68. Pratt L. A., Kolter R. Genetic analysis of Escherichia coli biofilm formation: roles of flagella, motility, chemotaxis and type I pili. // Mol. Microbiol. 1998. V. 30. P. 285-293.

69. Watnick P. I., Kolter R. Steps in the development of a Vibrio cholerae biofilm. // Mol. Microbiol. 1999. V. 34. P. 586-595.

70. Brand S. S., Vile A., Friedman L., Kolter R. Biofilms: the matrix revisited. // Trends Microbiol. 2005. V. 13. P. 20-26.

71. Sutherland I. W. Biofilm exopolysaccharides: a strong and sticfy framework. // Microbiology (UK). 2001. V. 147. P. 3-9.

72. Пиневич А. В. Микробиология. Биология прокариотов. Учебник 2 изд. СПб., Изд-во С.-Петерб. ун-та. 2007. Т. 1. С. 301.

73. Davey М. Е., О'Toole G. A. Microbial Biofilms: from Ecology to Molecular Genetics. // Microbiol. Molec. Biol. Rev. 2000, V. 64. P. 847867.

74. Webb J. S., Thompson L. S., James S., Charlton Т., Tolker-Nielsen Т., Koch В., Givskov M., Kjellerbcrg S. Cell death in Pseudomonas aeruginosa biofilm development. // Bacteriol. 2003. V. 185. P. 4585-4592.

75. Wijman J. G. E., de Leeuw P. P. L., Moezelar R., Zwietering M. H., Abee T. Air-liquid interface biofilm of Bacillus cereus: formation, sporulation and dispersion. // Appl. Environ. Microbiol. 2007. V. 73. P. 1481-1488.

76. Дуда В. И. Особенности цитологии спорообразующих бактерий // Успехи микробиологии. 1982. Т. 17. С. 87-117.92Jefferson К. К. What drives bacteria to produce a biofilm? // FEMS Microbiol. Lett. 2004. V. 236. P. 163-173.

77. Kuchma Sh. L., Connolly J. P., О'Toole G. A. A Three-Component regulatory System Regulates Biofilm Maturation and Type III Secretion in Pseudomonas aeruginosa. II Bacteriol. 2005. V. 187. P. 1441-1454.

78. Davies D. G., Parsek M. R., Pearson J. P., Iglewski В. H., Costerton J. W., Greenberg E. P. The involvement of cell-to-cell signals in the development of a dacterial biofilm. // Sci. 1998. V. 280. P. 295-298.

79. Николаев Ю. А., Паников H. С. Внеклеточная протеаза как регулятор адгезии Pseudomonas fluorescens. II Микробиология. 2002. Т. 71. № 5, С. 629-634.

80. Bockelman U., Szewzyk. U., Grohmann E. A new enzymatic method for the detachment of particle associated soil bacteria. // Microbiol. Meth. 2003. V. 55. P. 201-211.

81. Davey M. E., Caiazza N. C., O'Toole G. A. Phamnolipid surfactant production affects biofilm architecture in Pseudomonas aeruginosa PAOI. //Bacteriol. 2003. V. 185. P. 1027-1036.

82. Allan V. J. M., Callow M. F„ Macaskie L. E., Paterson-Beedle M. Effect of nutrient limitation and phosphate activity of Citrobacter sp. // Microbiol. 2002. V. 148. P. 277-288.

83. Kolenbrander P. E., Andersen R. N., Blehert D. S., Egland P. G., Foster J. S., Palmer R. J. Communication among oral bacteria. // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2002. V. 66. P. 486-505.

84. Rickard A. H., Gilbert P., High N. J., Kolendranden P. E., Handley P. S. Bacterial coaggregation: an integral process in the development of multi-species biofilms. // Trends Microbiol. 2003. V. 11. P. 94-100.

85. Dalwai F., Spratt D. A., Pratten J.Use of quantitative PCR and culture methods to characterize ecological flux in bacterial biofilms. // Clinic. Microbiol. 2007. V. 45. P. 3072-3076.

86. Odenyo A. A., Makie R. I., Stahl D. A, White B. A. The use 16S rRNA-target oligonucleotide probes to study competition between ruminal cellulitic bacteria. // Appl. Environ. Microbiol. 1994. V. 60. P. 3688-3696.

87. Lewis P. M. A note on the continious flow culture of mixed populations of Lactobacillus and Streptococcus. // Appl. Microb. 1967, V. 30. P. 406-409.

88. Siebel M. A., Characklis W. G. Observation of binary population biofilms. // Biotech. 1991. V. 37. P. 778-789.

89. Sturman P. G., Characklis W. G. Interspicies competition in colonized porous pellet. //Wat. Res. 1994. V.28. P. 831-839.

90. Lee. W., Lewandowski Z., Morrison M., Characklis W. G. Corrosion of mild steel underneath aerobic biofilms containing sulfate reducing bacteria. // Biofoul. 1993. V. 7. P. 197-239.

91. Eldowney S., M. Fletcher. 1987. Adhesion of bacteria from mixed cell suspension to solid surfaces. // Arch. Microb. V. 148, P. 57-62.

92. Kolenbrander P. E. Surface recognition among oral bacteria. // CRC Crit. Rev. Microb. V. 17, P. 137-159.

93. Gilbert P., Das J., Foley I. Biofilm susceptibility to antimicrobials. // Adv. Dent. Res. 1997. V. 11. P. 160-167.

94. Simmons W. L., Dybvig K. Biofilms Protect Mycoplasma pulmonis Cells from Lytic Effects of Complement and Gramicidin. // Infect. Immune. 2007. V. 75. P. 3696-3699.

95. L. Zhang, T.-F. Mah. Involvement of a Novel Efflux System in Biofilm-Specific Resistance to Antibiotics. // Bacterid. 2008. V. 190. № 13. P. 4447-4452.

96. Bigger J. W. Treatment of staphylococcal infections with penicillin. // Lancet. 1944. P. 497-500.

97. McDermott W. Microbial persistence. // Yal. Biol. Med. 1958. V. 30. P. 257-291.

98. Плакунов В. К. Дифференциальная чувствительность синтеза бактериальных белков к антибиотикам. // Антибиотики. 1971. № 6. С. 766.

99. Плакунов В. К., Козырева Л. Ф. О различной чувствительности синтеза бактериальных белков in vivo к антибиотикам. // Микробиология. 1971. Т. 40. В. 6. С. 981-987.

100. Плакунов В. К., Козырева Л. Ф. О причинах «остаточного» роста Staphylococcus aureus в присутствии «бактериостатических» концентраций антибиотиков-ингибиторов белкового синтеза. // Микробиология. 1971. Т. 40. В. 2. С. 311-316.

101. Aridesi J. N, Zahller E, Roe F., Stewart P. S. Role of nutrient limitation and stationary phase existence in Klebsiella pneumonia biofilm resistance to ampicillin and ciprofl oxacin. // Antimicrobiol. Agents Chemother. 2003. V. 47. P. 1251-1256.

102. Levin B. R., Rozen D. E. Noninherited antibiotic resistance. // Nat. Rev. Microbiol. 2006. V. 4. P. 556-562.

103. Hall-Stoodley L., Costerton J.W., Stoodley P. Bacterial biofilms: from the natural environment to infectious diseases. // Nat. Rev. Microbiol. 2004. V. 2. P. 95-108.

104. Lewis K. Persister cells, dormancy and infectious disease. // Nat. Rev. Microbiol. 2007. V. 5. P. 48-56.

105. Lewis K. Multidrug tolerance of biofilms and persister cells. // Springer-Verlag Berlin, Heidelberg. T. Romeo (ed.), Bacterial Biofilms. Current Topics in Microbiology and Immunology. 2008. P.322.

106. Jayaraman R. Bacterial persistence: some new insights into an old phenomenon. // Biosci. 2008. V. 33. P. 795-805.

107. Sharma A. M., Yadav S. Biofilms: microbes and disease. // Brazil. Infect. Diseas. 2008. V. 12. P.526-530.

108. Black D. S., Kelly A. S., Madris M. Moyed H. S. Structure and organization of hip, an operon that affects lethality due to inhibition of peptidoglycan synthesis. //Bacterid. 1991. V. 173. P. 5732-5739.

109. Wolfson J. S., Hooper D. C., McHugh G. L., Bozza M. A., Swartz M. N. Mutants of Escherichia coli K12 exhibiting reduced killing by both quinolone and beta-lactam antimicrobial agents. // Antimicrob. Agents Chemother. 1990. V. 34. P. 1938-1943.

110. Keren I., Shah D., Spoering A., Kaldalu N., Lewis K. Specialized persister cells and mechanism of multidrug tolerance in E. coli. H Bacteriol. 2004. V. 186. P. 8172-8180.

111. Shah D., Zhang Z., Kodursky A., Kaldalu N., Kurg K., Lewis K. Persisters: a distinct physiological state of E. coli. H BMC Microbiol. 2006. V. 6. P. 53.

112. Balaban N. Q., Merrin J., Chait R., Kowalik L., Leibler S. Bacterial persistence as a phenotypic switch // Science. 2004. V. 305. P. 1622-1625.

113. Spoering A. L., Vulic M., Lewis K. GlpD and PlsB participate in persister cell formation in Escherichia coli. II Bacteriol. 2006. V. 188. P. 3494-3497.

114. Li Y., Zhang Y. Pho U is a persister switch involved in persister formation and tolerance to multiple antibiotics and stresses in Escherichia coli. // Antimicrob. Agents Chemother. 2007. V. 51. P. 2092-2099.

115. Hayes F. Toxins-antitoxins: plasmid maintenance, programmed cell death and cell cycle arrest. // Sci. 2003. V. 301. P. 1496-1499.

116. Gerdes K., Christensen S. K., Lobner-Olessen A. Prokaryotic toxin-antitoxin stress response loci. // Nat. Rev. Microbiol. 2005. V. 3. P. 371382.

117. Pedersen K., Christensen S. K. Gerdes K. Rapid induction and reversal of a bacteriostatic condition controlled by the expression of toxins and anti-toxins. //Mol. Microbiol. 2002. V. 45. P. 501-510.

118. Van Melderen L., De Bast M.S., Bacterial toxin-antitoxin systems: more then selfish entities? // PLoS Genetics ( www.plosgenetics.orgV 2009. V. 5. Issue 3. el000437.

119. Fozo E. M., Hemm M. R., Storz G. Small toxic proteins and the antisense RNAs that repress them. // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2008. V. 72. P. 579-589.

120. Vazquez-Las lop N., Lee H., Neyfakh A. A. Increased persistence in Escherichia coli caused by controlled expression of toxins or other unrelated proteins. // Bacteriol. 2006. V.188. P. 3494-3497.

121. Korch S. B, Henderson Т., Hill Т. M. Characterization of the hipA7 allele of Escherichia coli and evidence that high persistence is governed by (p) ppGpp synthesis. // Mol. Microbiol. 2003. V. 50. P. 1199-1213.

122. Korch S. В., Hill Т. M. Ectopic over expression of wild type and mutant hip A genes in Escherichia coli: effects of macromolecular synthesis and persister formation. // Bacteriol. 2006. V. 188. P. 38263836.

123. Hansen S., Lewis K., Vulic M. The role of global regulators and nucleotide metabolism in antibiotic tolerance in E. coli. // Antimicrob. Agents Chemother. 2008 V. 52(8). P. 2718-2726.

124. J. H. Merritt, D. E. Kadouri, G. A. O'Toole. Growing and Analyzing Static Biofilms. // Current Protocols in Microbiol. 2005. 1B.1.1-1B.1.17 http: // media, wile v. com/ С urrentProtoco ls/0471729248/0471729248-sampleUnit.pdf

125. Cholodny, N. Uber eine neue Methode zur Untersuchung der Bodenmikro flora. // Archives Mikrobiologie. 1930. V. 1(4). P. 620-652.

126. DasSarma S. Arora P. Halophiles. 2001. Encyclopedia of life sciences. / Nature Publ. Group.http:// zdna2. umb i. umd. edu/~dassarma/halophiles.pdf

127. Oren A. Microbial life at high salt concentrations: phylogenetic andmetabolic diversity. // Saline Systems. 2008. V 4:2.http ://www. salines vstems. org/content/4/1 /2

128. Brown A. D. Halophilic procariotes. // Encyclopedia of Plant Phisiology. Berlin, Springer-Verlag, 1983. V. 12, P. 137-162.

129. Larsen H. Biochemical aspects of extreme halophilisms. // Ad. Microb. Physiol. 1967. V. 1. P. 97-132.

130. Арзуманян В. Г., Воронина Н. А., Плакунов В. К. Степень галофильности Rhodococcus erythropolis и Halobacterium salinarum определяется парциальным давлением кислорода. // Микробиология. 2000. Т. 69. № 2. С. 290-292.

131. Ventosa A., Nieto J. J., Oren A. Biology of moderately halophilic aerobic bacteria. // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 1998. V. 62. № 2. P. 504544.

132. O'Sullivan E., Condon S. Intracellular pH is a major factor in the introduction of tolerance to acid and other stresses in Lactococcus lactis. II Appl. Environ. Microbiol. 1997. V. 64. P. 4210-4215.

133. Oren A. Bioenergetic aspects of halophilism // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 1999. V. 63. № 2. P. 334-348.

134. Кашнер Д. Жизнь микроорганизмов при высоких концентрациях солей и растворённых веществ: галофильные бактерии. // Жизнь микробов в экстремальных условиях. М.: Мир. 1981. С. 365-426.

135. Reed R. Н., Warr S. R. С., Kerby N. W., Stewart W. D. P. Osmotic shocldncluced release of low molecular weight metabolites from free-living and immolitized cyanobacteria. // Enzym. Microbiol. Technol. 1986. V. 8, P. 101-104.

136. Roberts M. F. Organic compatible solutes of halotolerant and halophilic microorganisms. // Saline Systems. 2005. 1:5 http ://w w w. salinesy stems. org/content/1 /1 /5.

137. Nyyssola A., Kerovuo J., Kaukinen P., von Weymarn N., Reinikaiuem T. Extreme halophiles synthesize betaine from glycine by methylation. // Biol. Chem. 2000. V. 275. P. 22196-22201.

138. Rozwadowski K. L., Khachatourians G. G., Selvaraj G. Choline oxidase, a catabolic enzyme in Arthrobacter pascens, facilitates adaptation to osmotic stress in Escherichia coli. 11 Bacteriol. 1991. V. 173. P. 472478.

139. Rozwadowski K. L, Khachatourians G. G, Selvaraj G. Choline oxidase, a catabolic enzyme in Arthrobacter pascens, facilitates adaptation to osmotic stress in Escherichia coli. H Bacteriol. 1991. V. 173. P. 472-478.

140. Nyyssola A., Leisola M. Actinopolyspora halophila has two separate pathways for betaine synthesis. // Arch. Microbiol. 2001. V. 176. P. 294300.

141. Nyyssola A., Kerovuo J., Kaukinen P., von Weymarn N., Reinikainen T. Extreme halophiles synthesize betaine from glycine by methylation. // Biologic. Chem. 2000. V. 275. N. 29. P. 22196-22201.

142. Nyyssola A., Reinikainen T. Leisola M. Characterization of glycine sarcosine N-methyltransferase and sarcosine dimethylglycine N-methyltransferase. // Appl. Environ. Microbiol. 2001. V. 67. N. 5. P. 2044-2050.

143. Lai M.-C., Yang D.-R., Chuang M.-J. Regulatory factors associated with synthesis of the osmolyte glycine betaine in the halophilic methanoarchaeon Methanohalophilus portucalensis. II Appl. Environ. Microbiol. 1999. V. 65. P. 828-833.

144. Robinson P. M., Roberts M. F. Effects of osmolyte precursors on the distribution of compatible solutes in Methanohalophilus portucalemis. II Appl. Environ. Microbiol. 1997. V. 63. P. 4032-4038.

145. Bestvater Т., Louis P., Galinski E. A. Heterologous ectoine production in Escherichia coli: by-passing the metabolic bottle-neck. // Saline Systems. 2008. V. 4. P. 12.

146. Canovas D., Borges N., Vargas C., Ventosa A., Nieto J. J., Santos H. Role of Ny-acetyldiaminobutyrate as an enzyme stabilizer and an intermediate in the biosynthesis of hydroxyectoine. // Appl. Environ. Microbiol. 1999. V. 65. P. 3774-3779.

147. Bernard Т., Jebbar M., Rassouli Y., Hindi-Kabbab S., Hamelin J., Blanco C. Ectoine accumulation and osmotic regulation in Brevibacterium linens. //Gen. Microbiol. 1993. V. 139. P. 129-136.

148. Paulson D. S. Biostatics and Microbiology. 2008. Springer Science+Business Media. LLS. USA.

149. Auerbach I. D., Sorensen C., Hasma H. G., Holden P. A., Physical morphology and surface properties of unsaturated Pseudomonas putida biofilms. // Bacteriol. 2000. V. 182. № 13. P. 3809-3815.

150. Ананьина JI. H., Плотникова Е. Г., Гавриш Е. Ю., Демаков В. А., Евтушенко Н. И. Salinicola socius gen. nov., sp. nov., умеренно галофильная бактерия из утилизирующей нафталин микробной ассоциации. // Микробиология 2007. Т. 76. № 3. С. 369-376.

151. Onraedt A., De May М., Walcarius В., Soetaert W. Transport kinetics of ectoine, an osmolite produced by Brevibacterium epidermis. H Biotechnol. Lett. 2006. V. 28. P. 1741-1747.

Информация о работе

Журина, Марина Владимировна
кандидата биологических наук
Москва, 2009
ВАК 03.00.07

Диссертация

Взаимодействие нефтеокисляющих микроорганизмов с хемоорганотрофными бактериями-спутниками, неспособными к окислению углеводородв, в структурированных микробных сообществах (биопленках) - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы