Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Взаимодействие культивируемых мультипотентных мезенхимальных стромальных и иммунокомпетентных клеток человека при разном содержании кислорода

ВАК РФ 03.03.01, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Взаимодействие культивируемых мультипотентных мезенхимальных стромальных и иммунокомпетентных клеток человека при разном содержании кислорода"

На правах рукописи

ГОРНОСТАЕВА АЛЕКСАНДРА НИКОЛАЕВНА

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ МУЛЬТИПОТЕНТНЫХ

МЕЗЕНХИМАЛЬНЫХ СТРОМАЛЬНЫХ И ИММУНОКОМПЕТЕНТНЫХ КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА ПРИ РАЗНОМ СОДЕРЖАНИИ КИСЛОРОДА

03.03.01 - физиология 03.03.04 - клеточная биология, цитология и гистология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 4 МАР 2013

Москва-2013

005050638

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Государственном научном центре Российской Федерации — Институте медико-биологических проблем Российской академии наук.

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор,

член-корреспондент РАН Буравкова Людмила Борисовна

Официальные оппопенты:

доктор биологических наук, профессор, заведующий лабораторией клеточной иммунопатологии и биотехнологии НИИ

морфологии человека РАМН Болтовская Марина Николаевна

кандидат медицинских наук, ведущий научный сотрудник лаборатории метаболизма и

иммунитета ГНЦ-РФ ИМБП РАН Рыкова Марина Петровна

Ведущая организация: Государственное учебно-научное учреждение Факультет фундаментальной медицины Московского государственного университета имени М.ВЛомоносова

Защита диссертации состоится 20 марта 2013 г. в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 002.111.01 в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Государственном научном центре Российской Федерации - Институте медико-биологических проблем Российской академии наук по адресу: 123007, г. Москва, Хорошевское шоссе д.76а.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения науки Государственном научном центре Российской Федерации -Институте медико-биологических проблем Российской академии наук.

Автореферат разослан /% февраля 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук

МЛ. Левинских

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы

Мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки (ММСК) - это малодифференцированные стромальные предшественники, обладающие такими уникальными свойствами как высокая пролиферативная и паракринная активность, способность к мультилинейной дифференцировке (Friedenstein A.J. et al., 1991; Caplan A.I., 1991; Horwitz E.M. et al., 2005). Благодаря этому ММСК обеспечивают замену клеток, погибших естественным путем, и регенерацию поврежденных тканей, а также играют важную роль в поддержании гомеостаза, в частности, формируя гемопоэтическое микроокружение.

Обнаруженная сравнительно недавно способность ММСК модулировать ответ как аутологичных, так и аллогенных иммунных клеток (Bartholomew A. et al., 2002; Le Blanc К. et al., 2004; Rasmusson I. et al., 2003) открывает перспективы для использования мезенхимальных предшественников в терапии аутоиммунных заболеваний и подавлении реакции отторжения трансплантата. Проведены успешные клинические испытания ММСК при лечении болезни Крона, системной красной волчанки, ревматоидного артрита, системной склеродермии (Иванюк Д.И. и др., 2011; Kaplan J.M. et al., 2011). Продемонстрированы положительные результаты при применении ММСК у пациентов с острой реакцией «трансплантат против хозяина» и невосприимчивостью к стероидам (Le Blanc К. et al., 2008; Gonzalo-Daganzo R. et al., 2009).

В настоящее время активно изучаются механизмы реализации иммуномодуляторных свойств ММСК. Показано их влияние практически на все типы иммунных клеток in vitro-, подавление пролиферативной активности Т-, В-клеток и ЕК, замедление созревания ДК, увеличение доли Т-хелперов и регуляторных ДК, снижение цитотоксичности ЕК и CD3+/CD8+ клеток, существенное изменение цитокинового профиля иммуноцитов (Glennie S. et al., 2005; Uccelli A. et al., 2006; Сергеев B.C. 2005). Иммуномодуляторное воздействие ММСК реализуется как через паракринные механизмы, так и посредством физических контактов между клетками, и обусловлено многими факторами, такими как время сокультивирования, соотношение ММСК/лимфоциты, наличие провоспалительных стимулов, микроокружение (Augello A. et al., 2005; Maccario R. et al., 2005; Puissant B. et al., 2005; Mcintosh К. et al., 2006; Corcione A. et al., 2006; Spaggiari G.M. et al., 2006; Ramasamy R. et al., 2008; Magin A.S. et al., 2009; Буравкова Л.Б. и Андреева E.P., 2010; Рубцов Ю.П., 2012).

Одним из важных физических факторов микроокружения является парциальное давление 02. Исследования взаимодействия ММСК и мононуклеаров периферической крови (МНК) in vitro ведутся, как правило, при атмосферной концентрации кислорода (20%), хотя,

как известно, тканевые ниши ММСК характеризуются пониженным содержанием О2 (1-7%). Показано, что in vitro низкое парциальное давление кислорода существенно модифицирует свойства стромапьных клеток, в частности, увеличивает их пролиферативную активность и число КОЕ-Ф, замедляет дифференцировку в остео- и адипогенном направлении, а в хондрогенном - усиливает (Grayson W.L. et al 2007; Fehrer С. et al., 2007; Nekanti U. et al., 2010; Буравкова Л.Б. и др., 2009, 2010, 2012). Вопрос о влиянии напряжения кислорода на иммуномодуляторные свойства ММСК практически не изучен, тогда как пониженная концентрация кислорода характерна для тканей организма (предполагаемого места взаимодействия ММСК и лимфоцитов), и эксперименты, проведенные при таком напряжении кислорода, будут более приближенными к условиям in vivo.

Получение данных об иммуномодулирующих свойствах ММСК при пониженном содержании кислорода позволит существенным образом расширить представления о механизмах взаимодействия стромапьных и иммунокомпетентных клеток и внести значительный вклад в развитие фундаментальных и прикладных исследований в области клеточной физиологии.

Цель и задачи исследования

Целью данной работы являлось изучение иммуномодуляторных эффектов ММСК из жировой ткани человека in vitro в условиях гипоксии.

В соответствии с указанной целью были поставлены следующие задачи - в стандартных условиях (20% 02) и при пониженной концентрации кислорода (5% Ог) оценить:

1) Влияние ММСК на жизнеспособность неактивированных и активированных митогеном мононуклеаров периферической крови человека (МНК);

2) Активацию и субпопуляционный состав МНК при взаимодействии с ММСК;

3) Воздействие ММСК на пролиферативную активность МНК;

4) Цитокиновый профиль МНК при сокультивировании с ММСК;

5) Вклад прямых контактов «клетка-клетка» и паракринной регуляции в реализацию иммуномодуляторных эффектов ММСК.

Научная новизна

Впервые показано, что гипоксия модифицирует иммуномодуляторные свойства ММСК, приводя в большинстве случаев к усилению супрессивного эффекта. Установлено, что выраженность иммуносупрессивного эффекта зависит от фазы роста ММСК: при взаимодействии лимфоцитов с пролиферирующими ММСК происходит усиление иммуносупрессивного эффекта. Изменение иммуномодуляторных свойств стромальных предшественников при гипоксии зависит от наличия/отсутствия контакта между клетками и

фазы роста ММСК. Впервые обнаружен сдвиг цитокинового профиля в кондиционированной среде при сокультивировании ММСК и МНК в сторону противовоспалительного при пониженном содержании кислорода.

Теоретическая и практическая значимость работы Установлено, что in vitro аллогенные ММСК способны эффективно осуществлять иммуносупрессию при различном напряжении О2, в том числе и при пониженном (близком к значениям в тканях организма). Разработаны способы сокультивирования для анализа иммуномодуляторных эффектов ММСК в различном функциональном состоянии (log-фаза/фаза плато). Выявлена зависимость иммуносупрессивных свойств ММСК от их пролиферативной активности. Полученные результаты вносят существенный вклад в представление о том, как будут реализовываться иммуномодуляторные свойства ММСК в условиях, приближенных к физиологическим. Обнаружены индивидуальные отличия иммуносупрессивных эффектов ММСК в зависимости от донора лимфоцитов. На основании полученных данных можно заключить, что введению ММСК in vivo должны предшествовать эксперименты по взаимодействию клеток возможного донора и реципиента in vitro, которые следует проводить при пониженном содержании кислорода.

Положения, выносимые па защиту

1. ММСК обладают выраженными иммуносупрессивными свойствами, которые сохраняются и могут усиливаться при пониженном содержании кислорода

2. Иммуномодулирующие эффекты ММСК зависят от их фазы роста: ММСК в log-фазе обладают достоверно более выраженным антипролиферативным эффектом.

3. При отсутствии клеточного контакта с МНК иммуносупрессивные эффекты ММСК сохраняются, однако при его наличии противовоспалительное изменение цитокинового профиля выражено сильнее.

Апробация работы

Основные результаты и положения диссертации были представлены и обсуждены на XXI съезде Физиологического общества им. И.П. Павлова (Калуга, 2010 г.), IX, X и XI Конференции молодых ученых, специалистов и студентов, посвященной Дню космонавтики (Москва. 2010, 2011, 2012 г.), Всероссийской научной школе молодых ученых, преподавателей, аспирантов, специалистов "Биомедицинская инженерия" (Санкт-Петербург, 2010 г.), III и IV всероссийской научной школе-конференции «Стволовые клетки и регенеративная медицина» (Москва 2010, 2011 г.), III съезде Общества клеточной биологии (Санкт-Петербург, 2012 г.), VII международной конференции «Молекулярная генетика

соматических клеток» (Звенигород, 2011 г.), Шестой Российской конференции с международным участием: «Гипоксия: механизмы, адаптация, коррекция» (Москва, 2011 г.), The World Conference on Regenerative Medicine (Germany, Leipzig, 2011).

По теме диссертации опубликовано 14 печатных работ, в том числе 3 статьи в журналах из перечня ВАК РФ, 2 статьи в сборниках, 9 тезисов докладов.

Диссертация апробирована на заседании секции «Космическая физиология и биология» Ученого совета Федерального государственного бюджетного учреждения науки «Государственный научный центр Российской Федерации - Институт медико-биологических проблем Российской академии наук» 24.10.2012 г.

Связь работы с научными программами Работа выполнена при поддержке программ ОБН РАН и ОФФМ РАН.

Струю-ура и объем диссертации Диссертация состоит из глав: «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы исследований», «Результаты и обсуждение», «Выводы» и «Список литературы». Текст диссертации изложен на 121 странице, содержит 26 рисунков и 15 таблиц. Список литературы состоит из 185 цитируемых источников, из которых 20 - на русском и 165 - на иностранном языке.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследований

ММСК выделяли из стромально-васкулярной фракции жировой ткани человека по

стандартной методике (Zuk P. et al. 2001) с нашими модификациями (Буравкова JI. Б. и др.,

2009) и культивировали в среде а-МЕМ, с 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС,

HyCione, США), 2 мМ L-глугамина (ПанЭко, Россия), и 1% пенициллина/стрептомицина

(Gibco, США) в условиях 5% С02, 37°С, 100% влажности при 20% и 5% кислорода. Для

экспериментов использовали клетки 2-4 пассажей.

МНК выделяли из периферической крови здоровых добровольцев на градиенте плотности (р=1,077, Гистопак, Sigma-Aldrich, США) согласно инструкции производителя. Для каждого донора был определен субпопуляционный состав лимфоцитов, показатели которого находились в пределах клинической нормы. Выделенные клетки культивировали в среде RPMI 1640 (Биолот, Россия) с 2 мМ L-глугамина; 1% пенициллина/стрептомицина (Gibco, США), 5% инактивированной ЭТС. Для активации Т-клеток в среду добавляли фитогемагглютинин (ФГА) (Sigma, США) в конечной концентрации 10 мкг/мл. Сокультивирование МНК и ММСК проводили в трех вариантах: «монослой», «трансвелл» и «смешанная культура», (рис. 1). В вариантах «монослой» и «трансвелл» МНК сокультивировапи с ММСК, достигшими 80% конфлуентности и прошедшими фазу

активного деления. В первом случае МНК физически контактировали с ММСК. Во втором варианте, чтобы исключить клеточный контакт, ММСК и МНК разделяли полупроницаемой мембраной-вставкой «трансвелл» (диаметр пор 0,4 мкм) (Costar, США). «Смешанная культура» представляла собой измененную классическую модель взаимодействия лимфоцитов донора и реципиента «смешанная культура лимфоцитов» (CKJ1). В модифицированной нами модели СКЛ в качестве клеток-индукторов использовали не аллогенные МНК, а суспензию аллогенных ММСК. В этом варианте взаимодействие МНК и ММСК начиналось одновременно с их адгезией к пластику и последующей активной пролиферацией. Таким образом, в экспериментах использовали стромальные предшественники, находившиеся в разном физиологическом состоянии. В вариантах «монослой» и «трансвелл» ММСК были в предмонослое и практически не делились, находясь на плато кривой роста, а в смешанной культуре - клетки активно пролиферировали (Log-фаза или фаза экспоненциального роста). Каждый эксперимент воспроизводился 4-7 раз с дублированием аналитических измерений.

Л

«монослои»

неакгивированные МНК

мнк+ммск

активированные

ФГА-МНК

ФГА-МНК+ММСК

«трансвелл» V [72

«смешанная культура»

•Морфология •Жизнеспособность

• Активация

•Пролиферативная активность •Субпопуляционньш состав

• Цитокиновый профиль

МЯК гймск

Рис. I. Структура исследования

Клетки культивировали 72 часа при 20% и 5% 02, после чего методом проточной цитофлуориметрии (EPICS XL, Beckman Coulter; FACS Calibur, Becton Dickinson, США) определяли:

• Пролиферативную_активность МНК с помощью 5,6-

карбоксифлуоресцеиндиацетат-сукцинимидил эфира (CFSE, Invitrogen, США) -внутриклеточного ковалентно связывающегося красителя. МНК окрашивали CFSE (5 мкМ/мл) по стандартной методике (Suva D. et al., 2007), затем клетки культивировали в монокультуре или с ММСК;

• Субпопуляционный состав и активацию МНК с помощью окрашивания антителами против CD3, CD69, CD45/CD14, CD3/CD19, CD3/CD4, CD3/CD8, CD3/16+56, CD3/HLA-DR, CD3/CD25, CD90, CD105, CD73, мечеными FITC и РЕ, использовали соответствующий изотипический контроль IgG (Immunotec (Франция);

• Жизнеспособность МНК, используя набор AnnexinV-FITC/PI (Immunotec (Франция);

• Содержание цитокинов в среде культивирования с помощью набора FlowCytomix human Thl/Th2 11 Plex (Bender MedSystems, Австрия), который позволяет выявлять в образцах содержание 11 цитокинов (IL-lß, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12p70, IFN-y, TNF-cc, TNF-ß) одновременно.

Морфологический анализ. Для выявления поверхностных антигенов МНК окрашивали живые клетки, внутриклеточных - фиксированные ледяным метанолом. Препараты анализировали с помощью флуоресцентного микроскопа (Leica DM5000B, Германия). Также совместно в профессором С.В.Буравковым на базе Института морфологии человека РАМН использовали электронную сканирующую (СЭМ) (S-500, Hitachi, Япония) и дифференциальную интерференционную микроскопию (DIC) (Olympus 1X81, Япония). Статистическую обработку результатов проводили с использованием программы "Statistica 7.0" для WinXP. Достоверность различий оценивали с помощью непараметрического критерия Манна-Уитни (уровень значимости р=0,05).

Результаты исследования и их обсуждение

Морфологическая характеристика МНК, сокульпшеируемых с ММСК при различной концентрации кислорода

После 72 часов сокультивирования ФГА-МНК прочно адгезировали к ММСК, как при 20%, так и при 5% О2, в случае неактивированных МНК такие клетки были единичны. С помощью DIC и СЭМ показано, что активированные МНК не только прикреплялись к ММСК, но распластывались на них и трансмигрировали в субстромапьное пространство (рис. 2а,б,в). ФГА-МНК, расположенные на ММСК группами и поодиночке, имели многочисленные микроскладки на поверхности, что свидетельствовало об их активации и взаимодействовали со стромальными клетками с помощью отростков (рис. 26,в).

Прикрепившиеся ФГА-МНК экспрессировали общий лейкоцитарный антиген CD45, большинство из них были СОЗ-положительными. Идентифицированы С014+-моноциты, часть из которых имела антиген макрофагов провоспалительного фенотипа CD68, также были обнаружены С0206+моноциты (антиген макрофагов антивоспалительного фенотипа).

изменялось во всех вариантах эксперимента как при 20%, так и при 5% Ch. Концентрация кислорода не влияла на жизнеспособность нестимулированных и ФГА-активированных

мнк.

Информация о влиянии пониженного содержания кислорода на жизнеспособность МНК довольно противоречива. Так, выявлено увеличение доли живых клеток среди нестимулированных лимфоцитов после культивирования при 5% О2 (Krieger J.A. et al., 1996), отсутствие изменений при 2% (Naldini A. et al.,1999; 1997) и 1% (Conforti L. et al., 2003) и даже индукция апоптоза при 1% О2 (Sun J. et al., 2010). Жизнеспособность активированных МНК возрастала при 5% 02 (Krieger J.A. et al., 1996), не изменялась в 2% (Naldini A. et al., 1999), а при 1% О2 снижалась (Sun J. et al., 2010). На основании приведенных данных, можно предположить, что влияние гипоксии на жизнеспособность МНК определяется ее выраженностью. Возможно, благодаря тому, что в наших исследованиях концентрация кислорода была близкой к физиологическим значениям в тканях, она не оказала воздействия на лимфоциты.

Ранее влияние ММСК на жизнеспособность МНК изучалось только при стандартной концентрации кислорода (20%). Установлено, что ММСК поддерживают жизнеспособность нестимулированных и не влияют на активированные Т-лимфоцигы при культивировании их на монослое (Benvenuto F. et al., 2007), что согласуется с нашими результатами. В то же время, в других вариантах взаимодействия, использованных в настоящей работе, («смешанная культура» и «грансвелл»), ММСК не влияли на жизнеспособность неактивированых МНК. Вероятно, способность ММСК поддерживать нестимулированные лимфоциты зависит от их физиологического состояния, в частности, пролиферативной активности. Наличие контактов, по-видимому, также играет важную роль.

Таким образом, ММСК не влияют на жизнеспособность МНК и ФГА-МНК, а в состоянии монослоя даже поддерживают неактивированные лимфоциты вне зависимости от концентрации кислорода в среде.

Активация МНК

Одним из проявлений иммуносупрессивного эффекта ММСК может быть их влияние на активацию МНК (Le Blanc К. et al., 2004; Cappellesso-Fleury S. et al., 2010; Kronsteiner B. et al., 2011). Для того, чтобы охарактеризовать активацию, мы определяли среди CD3+ лимфоцитов изменение доли клеток, несущих следующие маркерные молекулы: CD69 -мембранный белок С-типа, ранний маркер активации, CD25 - низкоаффинный рецептор к интерлейкину-2 (ИЛ-2), ранний маркер активации, HLA-DR - антиген главного комплекса гистосовместимости II класса (МНС II), поздний маркер активации.

Варианты эксперимента С037С069\% С037С025", % СОЗ7НЬА-ОЯ\ %

20% 02 5% 02 20% 02 5% 02 20% 02 5% 02

Монокультура МНК 4±2,0 3±1,0 6±1,0 6±0,6 1,6±0,6 1,6±0,7

«Монослой» 26±1,0 * 20±0,1 *," 6±0,1 6±0,7 1,2±0,5 0,9±0,4

«Трансвелл» 11±1,0 V* 10±3,5 V* 5±0,3 6±0,4 1,7±0,4 1,7±0,6

«Смешанная культура» 18±1,0 *, *** 16±1,0 6±0,6 5±0,6 1±0,2 1,4±0,8

* - достоверное отличие от монокультуры лимфоцитов (р<0,05)

** - достоверное отличие варианта «трансвелл» от других вариантов (р<0,05)

*** - достоверное отличие варианта «смешанная культура» от других вариантов (р<0,05)

* - достоверное отличие от значения при стандартной концентрации кислорода (р<0,05)

Процент активированных Т-клеток среди нестимулированных МНК был незначительным. Присутствие ММСК не влияло на долю С025- и НЬЛ-ОЯ-положителыплх Т-клеток вне зависимости от модели сокультивирования и напряжения кислорода (табл. 3). В случае антигена С069, напротив, процент положительных клеток увеличивался во всех вариантах эксперимента (табл. 3), Эффект не был одинаковым: при 20% О2 на монослое доля С069+ Т-клеток была самой высокой, в «смешанной культуре» она была меньше, самая слабая активация выявлена при использовании разделяющей мембраны (р<0,05). Полученные данные подтверждают сделанное нами ранее предположение о том, что ММСК в фазе роста обладают более высокой иммуносупрессивной активностью, что позволяет им в некоторой степени нивелировать эффект увеличения СО69+ Т-лимфоцитов, по сравнению с монослоем. По-видимому, в отсутствие физического контакта не происходит такой активации, как при непосредственном взаимодействии клеток. Возможно, клеточный контакт оказывает дополнительное стимулирующее влияние на лимфоциты наряду с паракринными факторами. При 5% Ог доля СИ69+ Т-клеток в варианте «монослой» была примерно на 20% ниже, чем при атмосферном 02 (р<0,05). Можно предположить, что при 5%СЪ ММСК несколько «сглаживали» эффект активации Т-клеток, это еще раз подтверждает стимуляцию супрессивных свойств ММСК при гипоксии в состоянии монослоя, выявленную ранее при изучении антипролиферативного эффекта. В других вариантах сокультивирования содержание кислорода не влияло на активацию по маркеру С069.

Таким образом, ММСК могут провоцировать активацию нестимулированных лимфоцитов по маркеру С069, что подтверждает ранее полученные результаты в стандартных условиях (20% 02) (Magm А.Б. е1 а1., 2009). Этот эффект опосредуется растворимыми факторами и клеточными контактами, его выраженность зависит от концентрации Ог в среде.

После стимуляции ФГА доля С025, С069 и НЬЛ-ОЯ-положительных Т-клеток существенно возрастала, причем содержание кислорода не влияло на степень активации лимфоцитов в монокультуре. После взаимодействия с ММСК процент клеток, положительных по ранним маркерам, дополнительно увеличивался, хотя эффект проявлялся не во всех вариантах сокультивирования.

□ -20%02

-5%0,

с03+/с069+

100

I

«монослой» «смешанная культура»

срз+/с069+

И-

«монокультура» «трансвелл»

Б ДО - 20%02 А • -5%0;

Рис. 3. Доля СЭ69+ Т-клеток в монокультуре и после сокультивирования. А. В вариантах «монослой» и «смешанная культура», представлено изменение в процентах, доля С069+ клеток в монокультуре ФГА-МНК принята за 100% * - достоверное отличие от монокультуры лимфоцитов, р<0,05. Б. По варианту «трансвелл» данные представлены в сравнении с монокультурой, по каждому донору (п=5-10).

Активация по маркеру СП69 возрастала при непосредственном контакте (рис. ЗА), при 5% Ог эффект был несколько ниже. Возвращаясь к ранее описанной активации Т-клеток по СБ69 для нестимулированных МНК, можно предположить, что ММСК сохраняют способность активировать лимфоциты по этому маркеру и в случае ФГА-МНК, причем, эффект дополнительно возрастает при прямом клеточном контакте. При отсутствии непосредственного контакта доля С069-положительных Т-клеток увеличивалась после сокультивирования с ММСК только в стандартных условиях (20%02) (рис. ЗБ).

Экспрессия антигена С025 повышалась после сокультивирования с монослоем ММСК, содержание кислорода не влияло на этот эффект (рис. 4А). В «смешанной культуре» выраженная активация была только при 20% Ог. В варианте «трансвелл» активация несколько возрастала при стандартной концентрации кислорода, и не изменялась в гипоксии (Рис. 4Б).

После 72 часов взаимодействия ММСК не стимулировали пролиферацию неактивированных лимфоцитов и ингибировапи клеточное деление ФГА-МНК как при атмосферной, так и при пониженной концентрации Ог (табл. 2).

При стандартных условиях (20%0г) наибольший антипролиферативный эффект установлен в «смешанной культуре» (р<0,05). В других вариантах снижение пролиферации было примерно одинаковым, хотя в «монослое» эффект был несколько больше, чем в «трансвелле». Эти данные позволяют сделать вывод, что подавление пролиферации МНК может зависеть от физиологического состояния ММСК (монослой уэ. растущая культура).

Таблица 2. Пролиферативная активность ФГА-МНК при сокультивировании с ММСК

Варианты эксперимента Снижение,%, 20% 02 Снижение,%, 5%02

«Монослой» -29 ±4 1 * -52 ±6 1 V*

«Трансвелл» - 22 ± 5 1 * -15 ± 2 1 *

«Смешанная культура» -48± 13 1 *•*** -48± 14 1 *

* - достоверное отличие от монокультуры ФГА-МНК, р<0,05

** - достоверное отличие от показателя при 20% О2, р<0,05

*** - достоверное отличие от варианта «монослой» при 20% О2, р<0,05

Принимая во внимание одинаковую величину ингибирования пролиферативной активности ФГА-МНК в вариантах «трансвелл» и «монослой», можно предположить, что в том случае, когда ММСК находятся в состоянии монослоя для проявления иммуносупрессивного эффекта достаточно одних только растворимых факторов.

Пониженная концентрация кислорода (5% О2) не оказывала воздействия на антипролиферативный эффект ММСК в «смешанной культуре» и при использовании мембраны. Однако, в варианте «монослой» снижение пролиферации МНК было более значимым (р<0,05) по сравнению с 20% О2 и находилось на уровне «смешанной культуры». Можно предположить, что гипоксия способна потенцировать иммуносупрессивный эффект ММСК.

Способность ММСК подавлять пролиферацию лимфоцитов in vitro хорошо изучена в стандартных условиях культивирования (20% О2) и продемонстрирована многими исследователями при активации МНК митогенами, аллоантигенами, антителами CD3 и CD28, и аллогенными лимфоцитами в СКЛ (Nauta A.J. and Fibbe W.E. 2007; Siegel G. 2009; Le Blanc К. 2006; Сергеев B.C. 2005; Puissant В. et al., 2005; Kronsteiner B. et al., 2011). Полученные нами данные подтверждают, что ММСК эффективно подавляют пролиферацию активированных лимфоцитов. Кроме того, мы обнаружили, что супрессивный эффект может зависеть от физиологического состояния ММСК в момент взаимодействия, а также впервые показали, что пониженное содержание кислорода не только не снижает

иммуносупрессивный эффект ММСК, но даже стимулирует его, когда ММСК находятся в состоянии монослоя.

Известно, что ММСК способны подавлять пролиферативную активность Т-клеток и при бесконтактном взаимодействии (Kronsteiner В. et al., 2011). Антипролиферативный эффект по данным одних исследователей выражен слабее, чем при наличии клеточного контакта (Jarvinen L. et al., 2008; Suva D. et al., 2008), а других - остается на таком же уровне (Puissant В. et al., 2005; Yang S.H. et al., 2009).

Таким образом, в присутствии ММСК пролиферативную активность ФГА-МНК снижается. Этот эффект опосредуется как за счет растворимых медиаторов, продуцируемых ММСК, так и с помощью непосредственных контактов «клетка-клетка». При пониженном содержании кислорода ММСК, в зависимости от их физиологического состояния, сохраняют и даже усиливают свои антипролиферативные свойства.

Субпопуляционный состав МНКпри сокультивировании с ММСК

Поскольку различные популяции иммунных клеток тесно взаимодействуют между собой, их соотношение является результатом баланса их взаимовлияний. Оно может изменяться при внешнем воздействии, например, при добавлении в культуру ММСК. Поэтому важно охарактеризовать влияние ММСК не только на отдельные типы иммунных клеток, но и на изменение соотношения популяций в целом.

Среди CD45+ клеток оценивали долю CD3+, CD19+, CD(16+56)+ и CD14+ (T-, B-лимфоцитов, ЕК и моноцитов, соответственно), а также соотношение субпопуляций Т-лимфоцигов CD37CD(16+56)+, CD3+/CD4+, CD3+/CD8+ (Т-ЕК, Т-хелперов, Т-супрессоров/цитотоксических) непосредственно после выделения МНК (0 день) и через 72 часа культивирования. В варианте «монослой» анализировали суспензию клеток над ММСК («монослой-суспензия») и ФГА-МНК, прикрепленных к ММСК («монослой-адгезия»).

После сокультивирования с ММСК доля ЕК, В- и Т-клеток оставалась на уровне монокультуры ФГА-МНК независимо от содержания кислорода. При контактном взаимодействии ФГА-МНК с ММСК установлено трехкратное увеличение доли моноцитов по сравнению с монокультурой. Для клеток, разделенных мембраной, эффект был менее выражен и проявлялся только при 5% 02 (рис. 6А). ММСК не влияли на процент Т-хелперов, обнаружена лишь тенденция к увеличению Т-ЕК, а доля Т-супрессоров-цитотоксических снижалась во всех вариантах сокультивирования, независимо от напряжения кислорода в среде и наличия/отсутствия клеточных контактов (рис. 6Б).

Поскольку после взаимодействия с ММСК доля ЕК и В-,'Т-клеток не изменялась, это позволяет предположить, что ММСК в одинаковой степени снижают пролиферативную

активность всех этих клеток, поэтому соотношение популяций среди С045+ клеток оставалось на уровне монокультуры ФГА-МНК.

:

Рис. 6. Изменение субпопуляционного состава МНК после взаимодействия с ММСК. А. CD14+ , среди 45-положительных клеток и Б. CD8+, среди СОЗ-положительных клеток через 72 часа в монокультуре и при сокультивировании с ММСК, %. 1 - монокультура МНК О день, 2,3 - ФГА-МНК, 4,5 - «монослой-суспензия», 6,7 - «монослой-адгезия», 8,9 -«трансвелл» (п=5). * - достоверное отличие от монокультуры ФГА-МНК (р<0,05). ** -достоверное отличие от значения при 20% Ог в варианте «трансвелл» (р<0,05). # -достоверное отличие от МНК, 0 день.

Доля моноцитов в монокультуре ФГА-МНК была ниже, чем в сокультуре с ММСК, где значения соответствовали показателям для МНК на 0 день (рис. 6А). Из-за прочной и необратимой адгезиии моноцитов к пластику, их невозможно было отобрать для анализа вместе с суспензией остальных клеток. Известно, что ММСК выделяют фактор МСР1 -хемоаттрактант моноцитов (Da Silva Meirelles L. et а!., 2009). Поэтому при прямых межклеточных взаимодействиях адгезия моноцитов может происходить преимущественно на ММСК, что позволяет открепить их при отборе клеток для анализа. В «трансвелле» при 5% Ог доля моноцитов была такой же, как при контактном взаимодействии, а при 20% О2 находилась на уровне монокультуры ФГА. Имеются данные, что гипоксия (5%) модифицирует свойства моноцитов, в частности, увеличивается их способность к фагоцитозу и антиген-презентирующая активность (Pfau J.C. et al., 2004). Кроме того, при этом увеличивается продукция ММСК таких факторов как HGF, VEGF, TGF-ß, bFGF, GM-CSF которые в том числе являются антиапоптотическими (Da Silva Meirelles L. et al.. 2009). Можно предположить, что увеличение доли моноцитов в мембране-вставке при гипоксии

4. ММСК подавляют пролиферативную активность МНК стимулированных ФГА, эффект особенно выражен при взаимодействии с ММСК в фазе экспоненциального роста.

5. При сокультивировании ММСК и ФГА-активированных МНК изменяется субпопуляционный состав Т-клеток за счет снижения доли цитотоксических клеток (CD3VCD84). Эффект не зависит от содержания кислорода.

6. При взаимодействии ММСК и ФГА-МНК происходит смещение баланса цитокинов в сторону противовоспалительного, выраженность которого зависит от фазы роста ММСК и наличия физического контакта между клетками, при 5% О2 этот эффект проявляется сильнее.

7. При 5% Ог усиливается эффект подавления пролиферации ФГА-МНК при взаимодействии их с монослоем ММСК, более выражено увеличение продукции ИЛ-10 и снижение секреции провоспалительных цитокинов.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ

1. Горностаева А.Н., Андреева Е.Р., Андрианова И.В., Буравкова Л.Б. Оценка

иммуносупрессивных эффектов мультипотентных мезенхимапьных стромальных клеток при разном содержании Ог в среде культивирования ZZ Клеточные технологии в биологии и медицине. 2011. №2. С. 92-95.

2. Андреева Е.Р., Григорьева О.В., Андрианова И.В., Горностаева А.Н., Буравкова Л.Б. Взаимодействие стромальных клеток и мононуклеарных клеток крови человека в условиях измененной газовой среды. Ч. I. Иммуносупрессивные эффекты ZZ Технологии живых систем. 2012. Т. 9. № 2. С. 13-18.

3. Горностаева А.Н., Андреева Е.Р., Буравкова Л.Б. Изменение иммуносупрессивной активности ММСК при пониженном напряжении кислорода: непосредственный клеточный контакт и паракринная регуляция ZZ Физиология человека, 2013. Т.39. №2. С.1-12.

4. Андреева Е.Р., Горностаева А.Н., Андрианова Е.В., Григорьева О.В., Буравков C.B., Рылова Ю.В., Буравкова Л.Б. Морфологическая характеристика взаимодействия иммунных и мультипотентных мезенхимапьных стромальных клеток in vitro // Стволовые клетки и регенеративная медицина. Под ред. В.А. Ткачука. - М.: МАКС Пресс. 2011. С.131-144.

5. Горностаева А.Н., Андреева Е.Р., Полиров A.A., Буравкова Л.Б. Ответ лимфоцитов на пролиферативный стимул при сокультивировании с ММСК в условиях изменения

уровня Ог // Стволовые клетки и регенеративная медицина. Под ред. В.А. Ткачука. -М: МАКС Пресс, 2012. С.98-106.

6. Горностаева А.Н. Оценка иммуносупрессивных свойств ММСК - необходимый этап подготовки ММСК для клеточной инженерии // Сборник трудов молодых ученых. Всероссийская научная школа по биомедицинской инженерии «БМИ - 2010». Санкт-Петербург, 2010. С. 6-15.

7. Горностаева А.Н., Андреева Е.Р., Андрианова И.В., Буравкова Л.Б. Эффекты взаимодействия МНК и ММСК при совместном культивировании в условиях гипоксии // Научно-практический журнал «Патогенез». 2011. Т. 9. № 3. С 27.

8. Андреева Е.Р., Григорьева О.В., Горностаева А.Н., Рылова Ю.В., Буравкова Л.Б. Характеристика популяционного состава лимфоцитов и их активации при сокультивировании с мезенхимапьными стромальными клетками И XXI съезд Физиологического общества им. И.П. Павлова. Калуга, 2010. С. 27.

9. Горностаева А.Н. Оценка пролиферации лимфоцитов методом проточной цитофлуометрии с использованием флуоресцентного красителя CFSE // IX Конференция молодых специалистов, аспирантов и студентов, посвященная Дню космонавтики. Москва, 2010. С. 34.

10. Горностаева А.Н. Пролиферативная активность МНК и ММСК при совместном культивировании // X Конференция молодых специалистов, аспирантов и студентов, посвященная 50-летию со дня первого полета человека в космос. Москва, 2011. С. 20.

П.Горностаева А.Н., Андреева Е.Р., Буравкова Л.Б. Мультиплексный анализ цитокинов, продуцируемых ММСК и иммунокомпетентными клетками, при разном напряжении кислорода // Сборник тезисов VII международной конференции Молекулярная генетика соматических клеток. Звенигород. 2011. С 80.

12. Горностаева А.Н., Андреева Е.Р., Буравкова Л.Б. Пролиферативная активность и жизнеспособность лимфоцитов, сокультивируемых с ММСК при различном напряжении Ог // Сборник тезисов IV Всероссийской научной школы-конференции «Стволовые клетки и регенеративная медицина». Москва. 2011. С 25-26.

13. Gornostaeva A.N., Andreeva E.R., Buravkova L.B. Reciprocal interaction effects on MMSCs and PBMCs proliferation and viability // Regenerative Medicine. Leipzig, Germany. 2011. Vol. 6. № 6. (Suppl.2) P. 203.

14. Горностаева А.Н. Прямые клеточные контакты и растворимые медиаторы в регуляции взаимодействия ММСК и иммунокомпетентных клеток при различном напряжении кислорода в среде // XI Конференция молодых специалистов, аспирантов и студентов, посвященная Дню Космонавтики. Москва, 2012. С. 17.

Список используемых сокращений:

ДК - дендритные клетки

ЕК - естественные киллеры

ИДО - индоламин-2,3-диоксигеназа

ИЛ - интерлсйкин

ИФН-у - интерферон гамма

КонА - конканавалин А

ММСК - мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки

MI IK - мононуклеары периферической крови человека

CKJI - смешанная культура лимфоцитов

ФГА - фитогемагглютинин

ФНО-а - фактор некроза опухолей альфа

CD - cluster of differentiation - кластер дифференцировки

CFSE - carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester - карбоксифлуоресцеиндиацетат-сукцинимидил эфир

ICAM - intracellular adhesion molecule - молекула межклеточной адгезии aMEM- минимальная среда Игла (альфа модификация)

Подписано в печать:

12.02.2013

Заказ № 8143 Тираж -100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 wvw.autoreferat.ru