Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Взаимодействие аденовирусных онкопротеинов с клеточным белком AUP1 человека

ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Карпишева, Ксения Владимировна

ВВЕДЕНИЕ

ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ РАБОТЫ

ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

I. Общая характеристика аденовирусов.

II. Инфекционный цикл аденовируса.

III. Трансформация клеток, вызванная аденовирусной инфекцией.

IV. Четвертый ранний район аденовируса.

1.E40RF

2. E40RF

3. E40RF3/

4. E40RF

5. E40RF6/

6. E40RF3 и E40RF

V. Белок AUP1 48 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

I. Клеточные линии.

II. Бактериальные штаммы.

III. Плазмиды, использованные в работе.

IV. Анализ взаимодействия белков in vitro.

V. Трансфекция клеток.

VI. Инфекция клеточных культур аденовирусом.

VII. Получение поликлональных антител к Аир I

VIII. Иммунофлуоресценция.

IX. Вестерн-блот и иммуноприципитация. 75 РЕЗУЛЬТАТЫ

I. Клонирование полной последовательности кДНК гена AUP1 человека и сравнение 79 ее с геномной копией.

1. Идентификация Аир 1.

2. Клонирование полной последовательности кДНК гена Аир] человека.

3. Геномная организация гена Aupl человека.

4. Определение молекулярной массы in vitro транслированного белка AUP1.

II. Исследование in vitro взаимодействия белка AUP1 с E40RF3 и с другими 99 вирусными белками.

1. Взаимодействие белка AUP1 с E40RF3.

2. Локализация сайтов взаимодействия белков AUP1 и E40RF3.

3. Исследование in vitro взаимодействия белка AUP1 с аденовирусными 107 белками E40RF6, ElB55kDa, E40RF4/6 и PML, маркером POD.

III. Изучение внутриклеточной локализации белка AUP1.

1. Изучение локализации эндогенного и экзогенного белка AUP1 в различных 113 клеточных линиях человека и крысы.

2. Изучение локализации белка AUP1 в процессе аденовирусной инфекции. 124 ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 129 ВЫВОДЫ 137 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Взаимодействие аденовирусных онкопротеинов с клеточным белком AUP1 человека"

Изучение процессов приводящих к трансформации клетки является одним из приоритетных направлений современной клеточной биологии. Одной из моделей позволяющей выявить механизмы преобразований происходящих в клетке является трансформация клеток с помощью вирусных онкопротеинов, в том числе имеющих аденовирусное происхождение.

В настоящее время аденовирусы являются одними из излюбленных модельных объектов не только в вирусологии, но и в клеточной биологии (Chinnadurai, 1998). Это связано, прежде всего, с относительной простотой и удобством работы с этими вирусами и их геномом, легко поддающимся манипуляциям. Изучение аденовирусов актуально как с точки зрения фундаментальной науки, так и медицины, так как они представляют собой уникальную модельную систему для изучения регуляции синтеза ДНК, клеточной пролиферации, трансформации и апоптоза (Dyson and Harlow, 1992, Morgan, 1993, White and Gooding, 1994, Theodoro and Branton, 1997, Lavoie et al., 2000). Помимо этого, использование аденовирусов как модельных объектов для изучения молекулярных основ биологии вируса и клетки позволило описать явление сплайсинга иРНК. (Shenk, 1996). Первыми вирусами человека, для которых была описана способность вызывать образование злокачественных опухолей грызунов in vivo, также были аденовирусы (Takemori et al., 1968). Отдельную область исследования представляет большое количество работ посвященных аденовирусам, как одному из наиболее перспективных векторов, используемых в генной терапии (Brough et al., 1997, Ramalingam et al., 1999a, Christ et al., 2000).

Из семи транскрипционных единиц, содержащихся в геноме аденовирусов человека, две кодируют белки способные вызвать трансформацию клеток (Е1 и Е4). Подавляющее число работ, посвященных изучению аденовирусных белков, связаны с наиболее известными из них - продуктами Е1А и Е1В транскрипционных единиц первого раннего района которые активно изучаются в связи с их вовлеченностью в процессы онкотрансформации и регуляции апоптоза (White, 1998). Продукты Е1, прежде всего, являются трансактиваторами вирусных и клеточных генов (Neves, 1987; Flint and Shenk, 1989). Кроме того, эти вирусные белки способны связываться и моделировать функции различных клеточных белков, контролирующих движение клетки по клеточному циклу и программируемую клеточную гибель (Whyte et al., 1988). Нарушение в результате этих процессов равновесия между ростом, контролем клеточной пролиферации и целостности генома приводит к появлению опухолевого фенотипа.

Клеточная трансформация, вызванная аденовирусами, инициируется, прежде всего, экспрессией онкогенов, продуктов Е1А, способных иммортализировать клетки. Эти белки взаимодействуют с покет-доменами гипофосфолирированных белков, относящихся к Rb-семейству и к семейству рЗОО/СВР белков-регуляторов клеточного цикла (Chiou et al., 1997, Querido et al., 19976), что приводит, в том числе, к высвобождению и активизации транскрипционных факторов, членов Е2Р/БР-семейства. E2F транскрипционные факторы ответственны за трансактивацию генов регулирующих репликацию ДНК и движение клетки по клеточному циклу (Tamrakar et al., 2000). Их освобождение приводит к переходу клеток из Go в S фазу клеточного цикла. С другой стороны, Е1А стабилизирует опухолевой супрессор р53, что приводит к запуску р53-зависимого апоптоза. Способность Е1А вызывать апоптоз ограничивает его трансформирующий потенциал. Кооперация Е1А с белками клеточного или вирусного происхождения, способными блокировать р53-зависимую клеточную гибель и устраняет ограничение уровня экспрессии Е1А, что приводит к стабильной трансформации клеток. К таким белкам относятся оба продукта аденовирусной транскрипционной единицы Е1В - Е1В 55 kDa и El В 19kDa. Оба белка, ElB19kDa и BCL-2, блокируют апоптоз вызванный р53, TNFa, и Fas-антигеном. Клетки экспрессирующие р53 дикого типа, трансформированные Е1А плюс ElB55kDa, преодолевают р53-завизимый блок клеточного цикла на границе Gj и S фаз.

Популярность Е1А и Е1В оставила в тени другие белки аденовируса, также способные к трансформации клеток. Однако, исследования последних лет показали, что кроме продуктов Е1 в процессе трансформации участвуют продукты Е4. Изучение различных серотипов человеческих аденовирусов показало, что три белка, кодируемые Е4 являются онкопротеинами. Так E40RF1 высокоонкогенного Ad9 является ключевым белком при образовании злокачественных опухолей молочных желез у крыс (Javier et al., 1994) и способен самостоятельно без участия других аденовирусных белков вызывать полную трансформацию клеток (Wiess et al., 1996). Другие два продукта четвертого района - E40RF3 (Е4 - llkDa) и E40RF6 (Е4 - 34 kDa) Ad5 также имеют онкогенный потенциал и способны кооперировать с комплиментарной парой Е1А и Е1В, значительно увеличивая эффективность трансформации в культуре клеток грызунов. Более того, взаимодействуя с белком Е1А по отдельности, E40RF3 и E40RF6 способны приводить к полной трансформации первичных клеток BRK в культуре (Nevels et al., 1999; Nevels et al., 2000). E40RF6, подобно ElB55kDa, связывает клеточный транскрипционный фактор р53 и блокирует его способность активировать транскрипцию клеточных генов (Dobner et al., 1996). Более того, E40RF6 образует комплекс с ElB55kDa, который усиливает протеосомную деградацию р53 и, таким образом, ингибирует р53-зависимые пути апоптоза (Nevels et al., 2000). В отличие от E40RF6, E40RF3 не взаимодействует с р53 и не способен влиять на функции р53 и его стабильность (Nevels et al., 1999). На сегодняшний день нет никаких данных свидетельствующих о непосредственной роли E40RF3 в процессе регуляции апоптоза. Это указывает на возможность существования альтернативных механизмов трансформации клеток вызванной кооперацией E40RF3 и Е1А или на наличие неизвестных на сегодняшний день клеточных мишеней E40RF3 вовлекающие его в уже описанные каскады регуляции апоптоза и иммортализации клеток.

В данном контексте поиск и идентификация клеточных белков, способных взаимодействовать с E40RF3 приобретает особую актуальность, как для лучшего понимания функций этого вирусного белка, так и для описания новых механизмов онкотрансформации клеток. В представленной работе мы предприняли попытку поиска таких клеточных мишеней E40RF3 и обнаружили новый клеточный белок AUP1 (ancient ubiquitous protein 1), способный взаимодействовать in vitro с аденовирусными белками E40RF3 и Е1А, вовлеченными в процессы онкотрансформации.

ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

Целью настоящей работы явилось характеристика гена Aupl человека: определение его полной последовательности, изучение геномной организации; и исследование взаимодействия белков AUP1 и E40RF3 in vitro. Для достижения поставленных целей были выдвинуты следующие экспериментальные задачи:

1. Клонирование полной последовательности кДНК гена Aupl человека и сравнение ее с геномной копией.

2. Исследование in vitro взаимодействия белка AUP1 с E40RF3 и с другими вирусными белками.

3. Изучение внутриклеточной локализации белка AUP1 методом иммунофлюоресценции.

Для этого планировалось: а. Получение поликлональных антител против белка AUP1 б. Получение конструкций, содержащих ген AUP1, слитый с геном красного флуоресцентного белка и изучение локализации экзогенного белка AUP1 после трансфекции таких конструкций в разные клеточные линии; в. Изучение колокализации белка AUP1 с белками аденовируса после инфекции и в линиях, стабильно экспрессирующих гены аденовируса Е1А, ElB-55kDa, E40RF3 с помощью двойного иммунофлюоресцентного окрашивания.

ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

I. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА АДЕНОВИРУСОВ.

Аденовирусы были впервые изолированы и описаны как новые вирусные агенты острой респираторной вирусной инфекции. В 1953 году Роу (Rowe) и соавторы описали спонтанную гибель клеток первичной клеточной культуры человеческих аденоидов (по Shenk, 1996). Причиной гибели клеток был неописанный до этого вирусный агент. Вирус был исследован и получил названия adenoid degeneration (AD), resperatory illnes (RI), adenoidal-pharyngeal-conjunctial (APC), acute resperatory disease (ARD) agents. В 1956 году, после установления факта, что все вышеперечисленные агенты являются родственными, они получили имя adenoviruses, по названию ткани, откуда они были впервые выделены (Shenk, 1996).

Всего описано около 100 вирусов, относящихся к группе аденовирусов, которые инфицируют большое количество различных видов млекопитающих и птиц. Все исследованные вирусы имеют двунитевую линейную ДНК размером около 34-36 kbp, заключенную в белковый капсид икосаэдральной формы от 70 до 100 нм в диаметре. Капсид содержит 252 субъединицы: 240 гексонов и 12 пептонов. Каждый пептон состоит из основания, формирующего поверхность капсида, и из выступающей части - фибриллы, структура которой зависит от серотипа вируса.

Вирион аденовируса содержит ДНК (13% от всей массы) и белок (87% от всей массы) без участков клеточной мембраны или липидов. Выделяют сорок семь серотипов человеческого аденовируса по способности антител связываться с белками капсида и фибрилл, и шесть подгрупп - по способности вируса агглютинировать красные кровяные тельца (табл. 1; Braun et al., 1984, Horwitz, 1996).

Таблица 1. Классификация аденовирусов. По Брауну с соавторами (Braun et al., 1984)

Подгруппа Способность к агглютинации Серотипы

А IV Слабая или отсутствует 12, 18,31

В I Полная агглютинация эритроцитов обезьяны 3,7, И, 14,16,21,34,35

С Ш Частичная агглютинация эритроцитов крысы 1,2, 5,6

D П Полная агглютинация эритроцитов крысы 8, 9, 10, 13, 15, 17, 19, 20, 22-30, 32, 33, 36-39, 42-47

Е III 4

F ш 40,41

Все исследованные аденовирусы имеют сходную организацию генома, общие процессы регуляции экспрессии иРНК и экспрессируют одинаковый набор иРНК. Большинство работ по исследованию структуры и геномной организации аденовирусов выполнены на аденовирусах второго и пятого серотипов (Ad2 и Ad5). Они являются наиболее близкими по организации среди всех аденовирусов и различаются только по генам, которые кодируют фибриллы.

Геном аденовируса представляет собой одну линейную двунитевую ДНК, на концах которой находятся короткие повторы. Эти повторы играют важную роль в репликации аденовирусного генома, так как в этих концевых последовательностях находятся две идентичные точки начала репликации.

Вирусная хромосома содержит пять ранних транскрипционных единиц (Е1А, Е1В, Е2, ЕЗ, Е4), две запаздывающие ранние транскрипционные единицы (IX и IVa2) и одну позднюю единицу (называемую главную позднюю транскрипционную единицу, ГПТЕ), генерирующую пять семейств иРНК (L1-L5; рис. 1) Всего эти единицы кодируют около 40 белков. Все транскрипционные единицы имеют общее для всех аденовирусов расположение на вирусной хромосоме и транскрибируются с помощью РНК-полимеразы II. Исключение составляют гены VA RNA1 и VA RNA2 , кодирующие малые РНК размером около 160 нуклеотидов. Их позиция на хромосоме зависит от серотипа вируса, и они транскрибируются с помощью РНК-полимеразы III (рис. 1).

Первоначально названия транскрипционных единиц отражали фазу инфекции, на которой они экспрессировались, однако дальнейшие исследования показали условность этих названий, так как, например, первый поздний район экспрессируется на ранней фазе инфекции, а четвертый ранний район всю позднюю фазу.

Обе нити аденовирусной ДНК транскрибируются. Они получили названия правосторонней и левосторонней нитей. Правосторонняя нить кодируют Е1А, Е1В, VA РНК, ЕЗ, IX, ГПТЕ; левосторонняя кодирует Е2, Е4, IVa2 (Shenk,1996; рисунок 1).

Рисунок 1. Организация генома аденовируса. Геном аденовируса содержит пять ранних транскрипционных единиц (Е1А, Е1В, Е2, ЕЗ, Е4), две запаздывающие ранние транскрипционные единицы (IX и IVa2) и одну позднюю единицу (называемую главную позднюю транскрипционную единицу, ГПТЕ), генерирующую пять семейств иРНК (L1-L5). транскрибируются с помощью РНК-полимеразы II. Гены VA RNA1 и VA RNA2 кодируют малые РНК размером около 160 нуклеотидов. Их позиция на хромосоме зависит от серотипа вируса (по Shenk, 1996).

IX

Е1А Е1В

L1

L2

L3

L4 L5

ЕЗ J

IVa с

Е2В

Е2А

Е4

Аденовирус является агентом, вызывающим около 5-10% всех острых респираторных заболеваний у детей, при которых возможны осложнения в виде гастроэнтеритов у новорожденных, коньюктивитов и др. (Marshall, Horwitz, 1996). В 1968 году было показано, что аденовирус двенадцатого серотипа (Adl2) способен вызывать малигнизацию клеток у новорожденных хомячков (Takemori et al., 1968). Это был первый случай, когда вирус человека был описан как фактор онкогенеза у грызунов. На сегодняшний день не доказано участие аденовирусов в онкогенезе у человека, однако представители всех групп аденовирусов имеют ярко выраженный трансформирующий потенциал в клеточных культурах и в разной степени выраженный онкогенный потенциал in vivo (таб. 2; Baum et al., 1984).

Таблица 2. Онкогеиный потенциал представителей разных групп аденовирусов.

Подгруппа Группы по гемаглютинации Серотипы Онкогенный потенциал

Опухолеобразование у животных Трансформация клеток в культуре

А IV 12, 18,31 Высокий +

В I 3,7, 11, 14, 16,21,34, 35 +

С III 1,2, 5,6 Низкий или отсутствует +

D II 8,9, 10, 13, 15, 17, 19, 20, 22-30, 32, 33, 3639, 42-49 Низкий или отсутствует (опухоли молочных желез) +

Е III 4 Низкий или отсутствует +

F III 40,41 Неизвестно +

II. ИНФЕКЦИОННЫЙ ЦИКЛ АДЕНОВИРУСА.

Подавляющее большинство работ, посвященных изучению инфекционного цикла аденовируса, выполнены на близкородственных вирусах группы С второго и пятого типов (Ad2 и Ad5; Shenk, 1996). Эти серотипы относительно легко выращиваются в клеточных культурах, и их геном легко поддается манипуляциям, что облегчает создание вирусных мутантов и, следовательно, изучение вирусных генов.

Как и для большинства ДНК-содержащих вирусов, в инфекционном цикле Ad2 и Ad5 выделяются ранняя и поздняя фазы. Точкой окончания ранней и началом поздней фазы считается начало репликации вирусного генома.

Ранняя фаза инфекции характеризуется экспрессией вирусных иРНК ранних районов El, Е2, ЕЗ, Е4 и позднего района L1. Эти транскрипционные единицы кодируют РНК, которые впоследствии подвергаются альтернативному сплайсингу, кодируя множество различных белков. Продукты ранних вирусных генов регулируют транскрипцию и посттрансляционную модификацию вирусных иРНК и иРНК клетки-хозяина, индуцируют прогрессию клеточного цикла и подавляют антивирусные механизмы, такие как программируемая клеточная гибель и иммунный ответ организма хозяина.

Экспрессия ранних генов необходима для создания оптимальных условий окружающей среды для репликации вирусной ДНК, т.е. для экспрессии поздних вирусных генов. В целом ранняя фаза инфекционного цикла не связана с драматическими изменениями в синтезе клеточных белков.

В ходе репликации вирусного генома активируются три поздние транскрипционные единицы: IVa2, pIX, и ГПТЕ. В основном они кодируют структурные белки или белки, вовлеченные в процесс упаковки вирусной ДНК. За исключением IVa2 и pIX, все поздние аденовирусные единицы образуют единую транскрипционную единицу, называемую главной поздней транскрипционной единицей (ГПТЕ). ГПТЕ контролирует главный поздний промотор. Первичный транскрипт ГПТЕ имеет размер около 29000 нуклеотидов и подвергается различному полиаденилированию и альтернативному сплайсингу. В конечном итоге с ГПТЕ транскрибируется 18 цитоплазматических иРНК. Основываясь на использовании общих поли-(А) дополнительных сайтов, выделяют пять групп этих иРНК (LI, L2, L3, L4, L5).

Через несколько часов после начала поздней фазы аденовирусной инфекции происходят необратимые изменения в клеточном метаболизме. Блокируются синтез и ядерный экспорт клеточных иРНК, их трансляция в цитоплазме. Происходит образование вирионов, число которых в клетках HeLa, инфицированных Ад5, может достигать 10000.

В среднем, для клеток HeLa, ранняя фаза занимает 5-6 часов, после чего наблюдается начало репликации вирусного генома. В целом инфекционный цикл аденовируса занимает 20-24 часа (Shenk, 1996).

III. ТРАНСФОРМАЦИЯ КЛЕТОК, ВЫЗВАННАЯ АДЕНОВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИЕЙ.

Классическая концепция вирусного онкогенеза основана на том, что онкогены, кодируемые вирусами, обнаружены и экспрессируются в трансформированных клетках и соответствующих опухолях (Nevis, Vorgt, 1996). Онкогены различных представителей так называемой группы малых ДНК-содержащих опухолеродных вирусов (small DNA tumor virus group), к которым относятся SV40, папиломовирусы и аденовирусы, обнаружены в трансформированных клетках. Аденовирусы человека были отнесены к опухолеродным вирусам из-за их способности вызывать опухоли грызунов (Graham, 1984). Основываясь на типах опухолей, которые вызывают аденовирусы у грызунов и вирусных онкобелках, вовлеченных в этот процесс, можно выделить две группы опухолеродных аденовирусов. Все опухолеродные аденовирусы относящиеся к группам А и В, в основном вызывают саркомы, в то время как два представителя группы D, в целом обладающей невысоким онкогенным потенциалом, Ад9 и Ад 10 вызывают только эстроген-зависимые опухоли молочных желез самок крыс (Javier et al., 1991).

Ключевым белком при образовании злокачественных опухолей молочных желез у крыс является E40RF1 высокоонкогенного аденовируса девятого типа. Он стоит особняком среди всех аденовирусных белков, вызывающих трансформацию клеток (Javier et al., 1994). Главной особенностью E40RF1 Ad9 является то, что он способен самостоятельно, без участия других аденовирусных белков, вызывать полную трансформацию клеток (Wiess et al., 1996), но механизмы, приводящие к малигнизации клеток с помощью E10RF1, остаются малоизученными (Thomas et al., 1999; подробнее - см. главу ElORFl).

Клеточная трансформация, вызванная аденовирусами остальных групп, инициируется белками, продуктами первого раннего района аденовируса (Е1). Для большинства серотипов аденовируса человека трансформация клеток in vitro, ассоциирована, прежде всего, с экспрессией онкогена Е1А, способного иммортализировать клетки. Е1А кодирует два подобных белка E1A12S и E1A13S возникающих в результате альтернативного сплайсинга. Продукты Е1А прежде всего инициируют полную перестройку паттерна экспрессии вирусных и клеточных генов и клеточного метаболизма (Neves, 1987; Flint and Shenk, 1989). Кроме того, они способны физически взаимодействовать с различными клеточными белками и моделировать функции (Whyte et al., 1988). Клеточными мишенями для продуктов первого раннего района аденовирусов являются ключевые клеточные белки, ответственные за контроль целостности генома, движение клетки по клеточному циклу и инициацию программируемой клеточной гибели (апоптоза).

Так, E1A12S и E1A13S взаимодействуют с покет-доменами гипофосфолирированных белков относящихся к Rb-семейству, такими как pRb, pi07 и р130, что приводит к высвобождению и активизации транскрипционных факторов, членов E2F/DP-ceMeflcTBa. E2F транскрипционные факторы отвечают, прежде всего, за трансактивацию генов регулирующих репликацию ДНК и движение клетки по клеточному циклу (Tamrakar et al., 2000). Их освобождение приводит к переходу клеток из Go в S фазу клеточного цикла.

С другой стороны, Е1А стабилизирует опухолевой супрессор р53, что приводит к запуску р53-зависимого апоптоза, и является индуктором р53 независимых путей программируемой клеточной гибили (Debbas and Wite, 1993, Teodoro et al., 1995). Имменно способность El А вызывать апоптоз ограничивает его трансформирующий потенциал (Marcellus et al., 1998). Для полной трансформации клеток и получения стабильных клеточных линий, необходима кооперация Е1А с белками клеточного или вирусного происхождения, способными блокировать программируемую клеточную гибель. Ингибируя способность клетки осуществлять апоптоз, белки, работающие в паре с Е1А, устраняют ограничение уровня экспрессии Е1А, что приводит к стабильной трансформации клеток. К белкам-ассистентам Е1А, имеющим аденовирусное происхождение, относятся оба продукта первой транскрипционной единицы Е1В (Е1В 55kDa и Е1В 19kDa; Samow et al., 1982, Boyd et al, 1994, Teodoro and Branton, 1997) и два белковых продукта четвертой ранней транскрипционной единицы (E40RF6 и E40RF3; Dobner et al., 1996; Nevels et al., 2000) .

Опухолевый супрессор p53 до настоящего момента остается наиболее часто повторяемой мишенью для генетических перестроек обнаружевыемых в опухолях человека (Lavoe et al., 1998). По этому к белкам, способным модулировать активность р53, проявляется повышенный интерес. Результом активного изучения биологии этого белка явилось то, что механизмы р53-завмсимого апоптоза описанны достаточно полно, в то время как альтернативные пути программируемой клеточной гибели исследованы значительно меньше.

Е1В 55kDa способен напрямую связываться с р53 и инактивировать его активность как транскрипционного фактора (Teodoro and Branton, 1997). Другой Е1В белок, ElB19kDa является функциональным и структурным гомологом клеточного антиапоптотического белка BCL-2 (Boyd et al, 1994). Оба белка, ElB19kDa и BCL-2, блокируют апоптоз вызванный р53, TNFa, и Fas-антигеном. Клетки экспрессирующие р53 дикого типа, трансформированные Е1А плюс ElB55kDa, преодолевают р53-завизимый блок клеточного цикла на границе Gi и S фаз.

Огромный пласт исследований посвященных Е1А и Е1В проведенных учеными всего мира за последние десять лет пролил свет на многие фундаментальные механизмы регуляции жизни клетки - движение клетки по клеточному циклу, контроль целостности генома и многие другие. Исследование механизмов запуска и регуляции апоптоза позволило в описать знаменитые опухолевые супрессоры pRb и р53 и их роль в этих процессах (рис. 2; Hashimoto et al., 1991, Morgan, 1993, Teodoro et al., 1995, McCurrach et al., 1997, Prez et al., 1998, Lialo et al., 1999). Все это привело к тому, что аденовирусные белки, кодируемые первой ранней транскрипционной единицей, стали одними из самых популярных модельных объектов для изучения различных вопросов клеточной биологии и на сегодняшний день являются самыми хорошо изученными аденовирусными белками.

Принято считать, что все клетки, трансформированные аденовирусами группы А, В и С содержат фрагмент вирусного генома, включающий в себя первый ранний район 1 (Е1), который кодирует онкопротеины Е1А и Е1В (Shenk, 1996). Однако многочисленные работы показывают, что присутствие продуктов Е1-генов и стабильная их экспрессия не является абсолютной гарантией сохранения трансформированного фенотипа этими клетками (Kuhlmann et al., 1982). С другой стороны, как показали исследования Пфеффер и соавторов, клетки, полученные из индуцированных инфекцией аденовируса двенадцетого типа опухолей грызунов, теряют интегрированные в них копии аденовирусного генома, сохраняя при этом опухолевый фенотип (Pfeffer et al., 1999). Все это служит аргументами в пользу существования альтернативного пути трансформации и поддержания опухолевого фенотипа клеток - так называемого "hit-and-run" механизма. Имменно этот механизм может быть, как предполагают многие авторы, имеет место в процессе трансформации клеток аденовирусными онкогенами in vivo (Pfeffer et al., 1999, Nevels et al., 2001). Суть этой гипотезы заключается в том, что временное присутствие генов Е1 и Е4 может инициировать начало трансформации клеток ("hit"), приводящее к перерождению первичных клеток и приобретению ими опухолевого фенотипа, сопровождающееся потерей всех или части вирусных генов ("run").

То, что помимо белков кодируемых Е1 в процессе аденовирусной онкотрансформации могут участвовать продукты Е4, было обнаружено около двадцати лет назад (Shiroki et al., 1984). Изучение различных серотипов человеческих аденовирусов показало, что три белка, кодируемые Е4

Trans-activation (El A 2B9R) сей death

Рисунок 2. Роль аденовирусных белков Ad2, Ad5 в регулировании апоптоза. Карта генома аденовируса с обозначенными на ней ранними районами и главными белками, вовлеченными в регуляцию апоптоза. OGA - oncogenic generation activity;. cPLA - cytosolic phospholipase A2. AA - arahidonic acid (no Chinnadurai et al., 1999 ). являются онкопротеинами. Помимо E40RF1 Ад9 это E40RF3 и E40RF6. E40RF3 и E40RF6 Ad5 не способны приводить к трансформации клеток самостоятельно. Они могут кооперировать с белками Е1А плюс Е1В, значительно увеличивая эффективность трансформации в культуре клеток грызунов (Nevils et al., 2000). Более того, каждый из этих двух белков, взаимодействуя с Е1А по отдельности способен приводить к полной трансформации первичных клеток BRK в культуре (Nevels et al., 1999; Nevels et al., 2000). Фокусы трансформации, полученные в результате кооперации E40RF3 с Е1А, значительно различаются по своей морфологии от фокусов, полученных в результате кооперации E40RF6 с Е1А. Если фокусы, полученные при участии E40RF3, имеют незначительные изменения в фенотипе клетки, то фокусы, трансформированные E40RF6, имеют радикально измененный фенотип и характеризуются ускоренным ростом (Nevels et al., 1999, Nevels et al., 2000). Наиболее вероятно, что это связано с различием механизмов трансформации вызванной этими белками. E40RF6, подобно ElB55kDa, физически связывается с опухолевым супрессором р53 и блокирует его способность активировать транскрипцию клеточных генов (Dobner et al., 1996, Nevels et al., 1997). С другой стороны, при кооперации E40RF6 с Е1А и Е1В 55kDa, E40RF6 образует комплекс с Е1В 55kDa. Комплекс E40RF6-E1B 55kDa является системным реорганизатором экспорта всех синтезируемых в клетке мРНК, как вирусных, так и клеточных и усиливает протеосомную деградацию р53 (Nevels et al., 1997, Querido et al., 1997a).

E40RF3, в отличие от E40RF6, не взаимодействует с р53 и не способен влиять на функции р53 и его стабильность (Nevels et al., 2000). E40RF3 подобно E40RF6 образует комплекс с Е1В 55kDa, однако это взаимодействие не усиливает, а наоборот, ингибирует способность Е1В 55kDa дестабилизировать опухолевый супрессор р53. Более того, на сегодняшний день нет никаких данных свидетельствующих о непосредственной роли E40RF3 в процессе регуляции апоптоза. Это указывает на возможность существования альтернативных механизмов трансформации клеток с помощью E40RF3 плюс Е1А или наличие неизвестных на сегодняшний день клеточных мишеней E40RF3 вовлекающие его в уже описанные каскады регуляции апоптоза и иммортализации клеток.

Аденовирусная инфекция ни разу не была убедительно связана с онкогенезом у человека, так как ни одно из протестированных новообразований у человека не содержит повторяющихся участков аденовирусного генома. В 1999 году вышла работа, продемонстрировавшая связь Е1А с транслокацией хромосом, приводящих к образованию химерного онкогенного сплавленного белка EWS-FLI1, характерного для саркомы Ювинга (Sancherez-Prieto et al., 1999). Эта работа остается единственной в своем роде и на сегодняшний день не воспроизведенной (Kovar et al., 2000). Однако было показано, что саркомы Ювинга содержат последовательность Е1А гена только в части случаев, но далеко не всегда, а вышеуказанная транслокация является практически облигатной для этой саркомы (Kovar, 1999; De Alava et al., 2000).

Считается установленным фактом, что аденовирус индуцирует повреждение клеточных хромосом и другие мутации генома клетки-хозяина при инфекции (Marengo et al., 1981). Предполагается, что накопление мутаций генома клетки-хозяина становится возможным из-за инактивации механизмов контроля целостности генома. Именно процессы накопления мутаций и перестройка метаболизма клетки, могут служить основой для трансформации клетки и сохранения опухолевого фенотипа после потери вирусных генов.

IV. ЧЕТВЕРТЫЙ РАННИЙ РАЙОН АДЕНОВИРУСА.

Геном аденовируса человека содержит пять ранних транскрипционных единиц. Одна из них - четвертая ранняя транскрипционная единица (Е4) кодирует семь белков (Freyer et al., 1984). Из первичного транскрипта Е4 путем альтернативного сплайсинга получается 18 различных иРНК, которые кодируют семь белков: E40RF1, E40RF2, E40RF3, E40RF4, E40RF6 E40RF4/3, E40RF6/7. Все эти белки за исключением E40RF4/3 были обнаружены в инфицированной клетке. Схематическое расположение последовательностей, кодирующих белковые продукты Е4, показано на третьем рисунке.

Аденовирусы других видов млекопитающих так же имеют район Е4, гомологичный Е4 Ad5 человека. Степень сходства варьирует от практически полного совпадения для бычьего аденовируса Ad2 до сходства только по одному гену E4orf6 для мышиного аденовируса Ad 1 (Leppard 1997).

Вирусы, мутантные по полному району Е4, имеют глобальные дефекты в фенотипе. Такие вирусы характеризуются пониженным уровнем синтеза вирусной ДНК относительно вирусов дикого типа, нарушением укладки и структуры ДНК, ее накопления, синтеза поздних белков и т.д. (Weinberg and Ketner, 1983, Weiden and Ginsberg, 1994). Фенотипический анализ различных мутантов по Е4 показал, что подавляющее число нарушений связанно с двумя белками E40RF3 и E40RF6. Эти белки участвуют в реорганизации клеточного ядра, обеспечивая оптимальные условия для репликации вирусного генома, в регуляции накопления вирусной ДНК, процессинге и транспорте вирусных и клеточных мРНК и локализации вирусных белков (Shenk, 1996). Так E40RF3 является ключевым белком ответственным за реорганизацию PML-онкогенных доменов (PML-oncogenic domens; POD; Carvalho et al., 1995; Doucas et al., 1996) вызывая полную структурную перестройку клеточного ядра и обеспечивая оптимальную ядерную локализацию многих аденовирусных белков, в том числе Е1А и Е1В55кД .

В целом можно сказать, что четвертый район аденовируса кодирует комплекс регуляторных белков для нормального протекания аденовирусной инфекции. При этом белковые продукты Е4 осуществляют как позитивную, так и отрицательную регуляцию основных функций других районов аденовируса и обеспечивают оптимальные условия для функционирования аденовирусных белков. Район Е4 имеет несколько функций, отвечающих за литическую фазу роста в стандартной клеточной культуре. Прежде всего продукты Е4 влияют на паттерн экспрессии генов клетки-хозяина (Ramalingam et al., 19996) и аденовирусов. Попытки определить роль отдельных белков, кодируемых Е4, в этих процессах осложнены тем, что чаще всего это мультифункциональные белки и многие их функции перекрываются. Особенно ярко это свойство выражено для E40RF3 и E40RF6. Так вирус, мутантный по E4orf3 и E4orf6, но содержащий E4orf4 дикого типа, имеет серьезные нарушения укладки вирусной ДНК. Трансфекция в клетки, инфицированные подобным вирусом, плазмиды, содержащей или E40RF3, или E40RF6, восстанавливает уровень репликации вирусной ДНК и ее нормальную укладку.

Однако в экспериментах in vitro показано, что в процессе репликации аденовирусов непосредственно участвуют три белка: DNA binding protein (DBP), DNA polymerase (AdPol), pereterminal protein (pTP) - продукты второго раннего района (Е2;

Hay et al., 1995). Ни один из белков, кодируемых Е4, не участвует непосредственно в репликации аденовирусов in vitro. В репликации вируса in vivo доказано участие трех белков, кодируемых Е4, - E40RF3, E40RF4 и E40RF6. Это может свидетельствовать о том, что E40RF3 и E40RF6 являются регуляторными белками для этих процессов, но их участие в репликации опосредованно какими-то дополнительными белками.

Определение в течение последних нескольких лет клеточных белков, взаимодействующих с белками, продуктами Е4, показало, что клеточные мишени вирусных протеинов это транскрипционные факторы, участники каскадов передачи сигнала, белки, вовлеченные в репорацию ДНК, регуляцию апоптоза и движения клетки по клеточному циклу (Tauber and Dobner, 2001). Описание этих мишеней позволило не только определить функции вирусных белков, но и детализировать биохимические механизмы контроля этих процессов в клетке.

На сегодняшний день внимание исследователей сфокусировано на двух белках четвертого раннего района - E40RF3 и E40RF6 (Leppard 1997). Из оставшихся пяти белков Е4, наиболее изученными являются E40RF1, E40RF4, E40RF6/7.

Экспрессия мРНК E40RF1 в процессе аденовирусной инфекции наблюдается на поздних стадиях после инфекции. Интересно, что согласно данным, опубликованным к настоящему моменту, экспрессия белка E40RF1 в инфицированных клетках показана только для двух аденовирусов членов группы D Ад9 и Ад26 и вирусы-мутанты других групп по этому району не имеют каких-либо дефектов роста (Thomas et al., 2000). Исследования, проведенные в последние годы говорят о том, что E40RF1 гены различных групп аденовируса человека кодируют функционально родственные белки. E40RF1 групп А, В, С, аденовирусов человека, так же как E40RF1 группы D, способны трансформировать клетки in vitro (Weiss et al, 1997 (а)). Тем не менее, E40RF1 Ад9 представляет особенный интерес.

Способность двенадцатого серотипа аденовируса (Ад12) стимулировать образование злокачественных опухолей in vivo, так же как способность серотипов 2, 5, 12 (Ад2, Ад5, Ад 12) аденовирусов человека, трансформировать клетки in vitro активно изучается последние годы и связывается прежде всего с Е1А и Е1В. Однако девятый серотип аденовируса (Ад9) является исключением.

В целом представители группы D аденовирусов человека не способны вызывать опухолеобразование у грызунов. Однако Ад9, так же относящейся к этой подгруппе, вызывает образование злокачественных опухолей молочных желез у крыс in vivo (Ankerst and Jonsson, 1989, Javier et al., 1992). Как показал сравнительный анализ Ад9 и близкородственного аденовируса Ад26, не способного вызывать опухоли, эти вирусы различаются только по уровню экспрессии E40RF1. Исследования аденовирусов мутантных по различным генам подтвердили, что именно этот белок является ключевым в процессе малигнизации опухолей крыс (Javier et al., 1994) и способен самостоятельно, без участия других белков аденовируса, вызывать полную трансформацию клеток (Wiess et al., 1996).

Известно, что при трансформации аденовирусными белками клеток in vitro, свойства E40RF1 зависят от клеточных линий. В клеточной линии CREF (клеточная линия эмбриональных фибробластов крысы), трансформированной E40RF1, этот аденовирусный онкопротеин локализован во всей цитоплазме и не наблюдается в ядре (Wiess et al., 1996). В той же клеточной линии при совместной трансфекции E40RF1 Ад9, Е1А и Е1В Ад2, E40RF1 влияет на морфологию и увеличивает размеры фокусов при фокусообразовании, вызванном кооперацией Е1А и Е1В Ад2. Однако детальные исследования проведенные Томасом и соавторами (Thomas et al., 1999) показали, что El район не существенен для малигнизации опухолей молочных желез у крыс вызванной Ад9.

Биохимические механизмы осуществления функций E40RF1 до конца не изучены. До сих пор остается открытым вопрос, почему E40RF1 Ад9 способен вызывать только один тип опухолей in vivo - злокачественные опухоли молочных желез у грызунов. Кроме того, опухоли вызванные E40RF1 Ад9 находятся в полной зависимости от наличия эстрогена. При отсутствии этого гормона опухоли не способны к росту и образованию метостаз (Thomas et al., 2001). Исследования Ад9 выявили еще один вирусный белок, свойства которого сильно отличаются у этого серотипа. E40RF3 Ад9 подавляет опухолеобразование вызванное E40RF1 Ад9 (Thomas et al., 2001), в то время как E40RF3 Ад5 является онкопртеином. Предпологается, что это свойство E40RF3 Ад9 напрямую связано с зависимостью опухолей индуцированных Ад9 от эстрогена. Возможно, это связано со способностью E40RF3 реорганизовывать PML онкогенные домены и регулировать гормон-зависимый промотор (Wienzek and Dobbelstein, 2001).

Основываясь на цитоплазматической локализации E40RF1, было высказано предположение, что его трансформирующая способность может быть связана с перестройкой цитоплазматических сигнальных путей регуляции клеточного метобализма (Weiss et al, 1997 (б)). Дальнейшие исследования показали, что С-терминальная часть E40RF1 ответственна за взаимодействие с клеточными белками р220 и р140/р130 in vitro (Weiss and Javier, 1997). Эти два белка были определены как DLG (р140/р130; Lee et al., 1997) и MUPP1 (р200; Lee et al., 2000). Взаимодействие этих белков и белка MAGI-1, родственного DLG, с E40RF1 является, по-видимому, ключевым для трансформации вызванной E40RF1 Ад9 (Lee et al., 2000; Glaunsinger et al., 2000). В клеточных линиях полученных от опухолей молочных желез крыс, индуцированных Ад9, E40RF1 образует комплекс с DLG, MAGI-1 и MUPP1. Анализ аденовирусов девятого типа мутантных по С-терминальному участку E40RF1 показал, что эти вирусы не способны трансформировать клетки и не образуют комплексов E40RF1 с этими клеточными белками (Lee et al., 2000; Glaunsinger et al., 2000). Данное взаимодействие зависит от так называемых PDZ доменов, содержащихся в этих белках. Кроме анализа мутантов по этому домену, не способных связываться с E40RF1, в пользу данного предположения говорит тот факт, что и другие клеточные белки, такие как р 180, р160 и р155 содержащие этот домен, связываются с E40RF1 как in vitro, так и in vivo (Weiss and Javier, 1997). Белки, содержащие PDZ домены, участвуют в передаче клеточного сигнала и способны определять месторасположение белков в плазматической мембране и в районах клеточных контактов (Fanning and Anderson, 1999). Путь клеточной трансформации, использующий взаимодействие онкопротеина с PDZ-содержащими белками приводящий к протеосомной деградации DLG, MAGI-1 и MUPP1 был описан еще для двух онкобелков - для белка Е6 папиломовируса человека и белка Tax вируса Т-клеточной лейкймии первого типа человека (Gardiol et al., 1999).

В отличие от ретровирусов, имеющих высокий трансформирующий потенциал, ДНК содержащие опухолеродные вирусы кодируют онкопротеины имеющие очень невысокий уровень родства с клеточными белками (Morgan and Matthews, 1987, Nevins ang Vogt, 1996). В этом контексте интересной особенностью E40RF1 является то, что этот белок, возможно, является родственным dUTP пирофосфотазе (dUTPases). dUTP пирофосфотаза является ферментом, вовлеченным в биосинтез dTTP и репликацию ДНК как вируса, так и клетки (Weiss et al, 1997 (а)). В пользу возможного родства вирусного и клеточного белка говорят два аргумента. Первый - сходство аминокислотных последовательностей этих двух белков и их предсказываемой структуры. Вторым аргументом является то, что аденовирус CELO птиц имеет ген, кодирующий dUTP пирофосфотазу, локализованный в том же участке вирусного генома, где локализован E40RF1 ген аденовируса человека. Однако E40RF1 не имеет dUTP пирофосфотазной активности и, с другой стороны трансформирующий потенциал не был обнаружен для dUTP пирофосфотазы ни in vivo, ни in vitro. По этой причине, на сегодняшний день ничего нельзя сказать о наличии каких-либо общих функций у этих белков и, по-видимому, аденовирусный белок обладающей родственной структурой, приобрел в процессе эволюции совершенно новые, отличные от dUTP пирофосфотазы, функции и возможности онкобелка (Weiss et al, 1997 (а)).

В настоящее время роль E40RF2 в процессе аденовирусной инфекции практически не изучена. Исследования последних лет показали, что белок E40RF2 находится в цитоплазме через восемь часов после инфекции (Dix and Leppard, 1995). Сравнительный анализ экспрессии E40RF2 аденовирусов девятого и двадцать шестого серотипов при инфекции А549 клеточной линии показал, что через 24 часа после инфекции количество белка E40RF2 Ад9 значительно уменьшается по сравнению с E40RF2 Ад26 (Thomas et al., 2001). Однако функционального значения этого различия пока выявить не удалось.

3. E40RF3/4

Белок четвертого раннего района аденовируса E40RF3/4 представляет собой сплавленный белок из двух участков - 33 N-терминальных аминокислот E40RF3 и 28 С-терминальных аминокислот E40RF4 с теоретически предсказанным весом 7.2 кД. Нозерн блот анализ показал наличие мРНК E40RF3/4, но в очень небольшом количестве, в то время как экспрессия E40RF3/4 на белковом уровне в инфицированных клетках до сих пор не показана.

Для нормального протекания аденовирусной инфекции в клетках человека, необходимо комплексное взаимодействие между индукцией и супрессией различных путей программируемой клеточной гибели (Roulston et al., 1999). Белки первого аденовирусного района являются индукторами как р53 зависимого, так и р53 не зависимого механизмов развития апоптоза (Teodoro et al., 1995). Анализ развития вирусной инфекции в р53 негативных клетках показал, что развитие р53-независимого апоптоза происходит из-за трансактивации E40RF4, непосредственного индуктора этого процесса (Marcellus et al., 1996, Marcellus et al., 1998).

E40RF4, как большинство продуктов четвертого раннего района, мультифункциональный белок. Он регулирует уровень транскрипции как клеточных, так и вирусных белков, модулирует активность и функции некоторых из них и запускает р53-независимый апоптоз (Shitrichman et al., 1999).

E40RF4 является функциональным антогонистом для E40RF3 и E40RF6. Гиперэкспрессия E40RF4 приводит к нарушению уровней репликации и накопления вирусной ДНК. При инфецировании различных клеточных линий аденовирусами с делецией по E4orf3 и E4orf6 генам, но содержащим E4orf4 дикого типа наблюдается аналогичный эффект: резкое снижение уровней репликации и накопления вирусной ДНК. Трансфекция в клетки, инфицированные подобным вирусом, плазмиды содержащей ген E4orf3 или E4orf6, или плазмиды содержащей оба этих гена, приводит к востановлению нормальных уровеней репликации вирусной ДНК и ее укладки.

Известно, что уровень репликации и укладку вирусной ДНК регулируют, прежде всего, гены второго раннего района аденовируса (Е2). E40RF4 ингибирует эти процессы на двух уровнях: непосредственно снижая уровень экспрессии Е2 генов и, возможно, и на стадии трансляции этих белков. Уровень экспрессии и процессинга иРНК продуктов Е2 напрямую зависит от концентрации тотальной иРНК в ядре. E40RF4 способен ингибировать синтез иРНК как клеточных, так и вирусных белков, таких как Е1А, членов семейств jun и fos, и в целом экспрессию района Е4. Регулируя уровень синтеза тотальной иРНК, E40RF4 способен снижать уровень экспрессии и процесинга иРНК района Е2 (Medghalchi et al., 1997). Белки E40RF3 и E40RF6 способны компенсировать этот эффект, однако стимулирующий эффект E40RF3 и E40RF6 на репликацию вирусной ДНК не связан с изменением уровня экспрессии Е2. Возможные механизмы, обуславливающие этот эффект, описаны ниже.

E40RF4 регулирует активность клеточных и вирусных белков путем их фосфорилирования. Он взаимодействует с РР2А - protein phosphatase 2А. Это приводит к изменению уровня фосфорилирования - выборочному гипофосфорилированию некоторых вирусных и клеточных белков, таких как аденовирусный белок Е1А и клеточный транскрипционный фактор c-Fos, что в последствии сказывается на снижениии транскрипциоонной активности API и других клеточных белков, регулирующих транскрипцию клеточных и вирусных генов (Kleinberger, Shenk, 1993). Кроме того E40RF4 является супрессором синтеза белков JunB и c-Fos как на уровне транскрипции этих генов, так и на стадии трансляции белков (Muller et al., 1992).

Дефосфорилируя с помощью РР2А SR-белок, E40RF4 снижает РНК-связывающую активность этого белка и таким образом нарушает нормальное протекание альтернативного сплайсинга иРНК поздних генов в клетках HeLa. Хотя, в отличие от E40RF3, E40RF4 не является жизненно необходимым белком для литической фазы роста аденовируса в клетках HeLa (Halbert et al., 1985) одной из важных особенностей E40RF4 является то, что он играет важную роль на финальной стадии аденовирусной инфекции - при гибели клетки-хозяина. Вирусы, не способные экспрессировать этот белок, отличаются от вирусов дикого типа значительно большей цитотоксичностью (Muller et al., 1992).

Второй механизм отрицательной регуляции транскрипции иРНК с промотора Е2 белком E40RF4 связан с дефосфорилированием комплексом PP2A-E40RF4 транскрипционного фактора АР-1. Промотор Е2 района содержит ATF/CREB связывающий сайт, способный активироваться при взаимодействии с АР-1. Таким образом, инактивируя АР-1, E40RF4 подавляет транскрипцию Е2.

Компенсаторным механизмом этого воздействия E40RF4 для аденовируса дикого типа является активация других сайтов в промоторе Е2 района, т.к. ATF/CREB не единственный сайт активации транскрипции второго раннего района. Район Е4 кодирует белок E40RF6/7, ответственный за активацию двух Е2Р-зависимых промоторов второго раннего района.

Белок E40RF6/7 представляет собой сплавленный белок с молекулярной массой 17 кД, содержащий 58 N- терминальных аминокислот кодируемых шестой открытой рамкой считывания и 98 аминокислот кодируемых седьмой открытой рамкой считывания.

Главным свойством этого аденовирусного белка является его способность модулировать активность клеточных транскрипционных факторов E2F семейства (Huang, Hearing, 1989). Модулируя активность E2F, E40RF6/7 способствует специфическому связыванию E2F с ДНК как вируса, так и клетки-хозяина. E40RF6/7 является мощным активатором работы E2F, причем для этой активации не требуется дополнительных компонентов: E40RF6/7 и транскрипционный фактор E2F образуют стабильный комплекс, способный напрямую связывать ДНК. С другой стороны E40RF6/7 способствует стабилизации ДНК-связывающей формы E2F. Ген E40RF6/7, трансфецированный в неинфицированные клетки, вызывает увеличение экспрессии клеточных генов, находящихся под контролем Е2Р-зависимых промоторов (Schaley et al., 2000).

В процессе развития аденовирусной инфекции E40RF6/7 является функциональным антагонистом E40RF4. Комплекс образованный E2F и E40RF6/7 взаимодействует с двумя Е2Р-связывающими сайтами, которые присутствуют как инвертированные повторы в промоторе второго раннего района аденовирусов. Взаимодействие E2F и E40RF6/7 также блокирует связывание E2F с белком ретинобластомы р105, подавляющее в норме трансактивирующую способность E2F.

Таким образом, E40RF6/7 опосредованно запускает репликацию вирусной ДНК путем активации промотора второго раннего района аденовирусов, критического для вирусной репликации и в целом является активатором как клеточной, так и вирусной транскрипции (Shwamian, Thimmapaya, 1996).

Транскрипционные факторы E2F представляют собой гетеродимеры и контролируют экспрессию клеточных генов вовлеченных в синтез ДНК и движение клетки по клеточному циклу. В инфицированной клетке эти транскрипционные факторы являются основной мишенью для Е1А белков. E40RF6/7 фактически дополняет Е1А и, как показали исследования последних лет, способен увеличить уровень репликации вирусной ДНК при инфекции клеток HeLa аденовирусами дефектными по Е1А (O'Connor and Hearing, 2000). Это свойство E40RF6/7 может быть использовано при создании аденовирусных векторов, не содержащих Е1А, но способных к репликации благодаря E40RF6/7.

Таким образом, можно сказать, что аденовирусы используют как минимум два независимых пути для активации Е2Р-зависимых генов. Е1А белки инактивируют белки Rb семейства - естественные ингибиторы E2F, a E40RF6/7 дополняют Е1А, стабилизируя активную форму E2F транскрипционных факторов.

6. E40RF3 и E40RF6

Белок E40RF3 с молекулярным весом 11 кД является одним из самых консервативных белков аденовирусов. Он был первым белком, кодируемым четвертым ранним районом аденовирусов, обнаруженным в инфицированной клетке (Sarnow et al., 1982). Этот полипептид иммунологически одинаков во всех группах аденовирусов и является единственным примером столь консервативного белка среди всех ранних белков аденовирусов (Sarnow et al., 1982). Однако в течение последних десяти лет наибольшее внимание исследователей вызывал другой продукт четвертого раннего района E40RF6. Аденовирусные белки E40RF3 и E40RF6 участвуют в регуляции многих жизненно важных процессов при развитии аденовирусной инфекции и практически полностью компенсируют друг друга. Они участвуют в реорганизации клеточного ядра, обеспечивая оптимальные условия для репликации вирусного генома, в регуляции накопления вирусной ДНК, процессинге и транспорте вирусных и клеточных иРНК, локализации вирусных белков и обладают трансформирующим потенциалом. Кроме того, E40RF3 и E40RF6 независимо усиливают репликацию вирусной ДНК, синтез поздних вирусных белков, подавлении синтеза белков клетки-хозяина и предотвращают образование конкатомерной вирусной ДНК (Brige, Ketner, 1989).

Оба белка, как E40RF3, так и E40RF6, способны кооперировать с Е1А и приводить к полной трансформации клеток. Из фокусов тансформации полученных при кооперации продуктов Е4 и Е1А получены стабильные клеточные линии. Кроме того, E40RF3 и E40RF6 способны усиливать трансформирующий потенциал комплиментарной пары Е1А и Е1В55кД. Эти факты, описанные в 1999 и 2000 году Невилсом и соавторами (Nevels et al., 1999, Nevels et al., 2000), позволили отнести E40RF3 и E40RF6 к онкопротеинам (Boyer et al., 1999).

В подавляющем большинстве случаев E40RF3 и E40RF6 регулируют одни и те же процессы и имеют сходные функции, что затрудняет исследования конкретных свойств E40RF3 и E40RF6. Однако механизмы осуществления функций этих белков различаются. Будучи вовлечены в сходные регуляторные процессы, E40RF3 и E40RF6 модулируют их с разной степенью эффективности. Эти два белка могут компенсировать недостаток экспрессии друг друга в случае использования вирусов-мутантов по E40RF3 или E40RF6 Наряду с этим вирусы, мутантные по одному из генов, все-таки имеют нарушения в стабилизации и созревании иРНК и в других процессах, что свидетельствует о необходимости обоих для оптимального результата (Brige, Ketner, 1989).

Регуляция созревания поздних вирусных иРНК аденовирусными белками

E40RF3 и E40RF6.

Исследования функций E40RF3 и E40RF6 в большинстве работ связаны с анализом вирусов-мутантов по этим генам. Таким методом было показано, что оба белка повышают уровень продукции белков, кодируемых поздними вирусными районами (Sandler, Ketner, 1989). Работая независимо, они способны стабилизировать первичные вирусные иРНК в ядре и, следовательно, увеличивать пул иРНК для созревания и транспорта. Мутанты по одному или обоим вирусным белкам отличаются от аденовируса дикого типа в том числе высоким уровнем деградации вирусных иРНК поздних белков в ядре (Brige, Ketner, 1989).

Повышение уровня продукции белков, кодируемых поздними вирусными районами, достигается также непосредственным участием E40RF3 и E40RF6 в сплайсинге и в транспорте иРНК из ядра в цитоплазму. Последующий анализ показал, что E40RF3 и E40RF6 регулируют сплайсинг иРНК как опосредованно, так и напрямую участвуя в этом процессе.

E40RF3 и E40RF6 работают аналогично клеточным факторам вовлеченным в процесс сплайсинга. E40RF3 участвует в "сшивке" экзонов, в то время как E40RF6 обеспечивает "вырезание" интронов. Оба белка непосредственно участвуют в сплайсинге вирусной ДНК, обеспечивая нормальное протекание этого процесса (Nordqvist et al., 1994). Однако остается вопросом, как белки, выполняющие оппозиционные функции, могут компенсировать недостаток друг друга.

Роль E40RF3 и E40RF6 в транспорте вирусных и клеточных иРНК.

Регуляция транспорта иРНК в процессе развития аденовирусной инфекции, осуществляется тремя вирусными белками: Е1В55кД, E40RF3 и E40RF6. Оба продукта Е4 способны по отдельности связываться с ElA55KDa и изменять его клеточную локализацию - из цитоплазматической в ядерную (Koning et al., 1999). Хотя анализ мутантов по E40RF3 и E40RF6 показал участие обоих белков в транспорте иРНК, роль комплекса Е1В55кД с E40RF3 точно не известна, в то время как работа комплекса Е1В55кД с E40RF6 достаточно полно описана (Imperiale et al., 1995).

E40RF6 образует комплекс с Е1В55кД. Этот комплекс является системным реорганизатором экспорта всех синтезируемых в клетке иРНК, как вирусных, так и клеточных. Он увеличивает уровень экспорта вирусных иРНК из ядра, одновременно подовляя экспорт большей части клеточных иРНК.

При этом клеточная локализация комплекса регулируется обоими белками, несмотря на то, что Е1В55кД способен самостоятельно перемешаться из цитоплазмы в ядро и обратно, независимо от других белков (Kratzer et a.l, 2000). Комплекс Е1В55кД с E40RF6 постоянно переходит из ядра в цитоплазму и обратно. Наличие сигнала ядерной локализации у E40RF6 способствует импорту комплекса в ядро, однако присутствие Е1В55кД модифицирует специфическую последовательность E40RF6, ответственную за нахождение E40RF6 в ядре - сигнал удержания белка в ядре, и приводит к интенсивному экспорту комплекса из ядра (Dobbelstein et al., 1997).

Роль E40RF3 и E40RF6 в репликации и укладке вирусной ДНК.

Оба белка, E40RF3 и E40RF6, играют роль в репликации вирусного генома. Репликация вирусов при дефиците E40RF3 и E40RF6 или отсутствии всего Е4 приводит к понижению уровня транскрипции и образованию конкатомеров ДНК с многочисленными соединениями между двумя концами вирусной ДНК, что не наблюдается у вирусов дикого типа и других мутантов по району Е4.

Репликация вирусного генома сопровождается коренными изменениями морфологии клеточного ядра. E40RF3 и E40RF6 могут оказывать влияние на интенсивность репликации как белки, участвующие в реорганизации клеточного ядра (см. ниже) (Medghalchi et al., 1997). Первоначально считалось, что именно эта способность E40RF3 и E40RF6 обеспечивает нормальное протекание репликации вирусной ДНК, однако эта теория только частично объясняла, почему вирусы, мутантные по E40RF6, имеют структурные нарушения ДНК (Weinberg, Ketner, 1993).

Последующие исследования показали, что у вирусов, дефектных по E40RF3 и E40RF6, в процессе формирования вирусного генома активно работает DNA-depended protein kinase (DNA PK). Так же было показано, что DNA РК участвует в нормальном для лимфоцитов процессе V(D)J рекомбинации, блокируемом E40RF6 в процессе аденовирусной инфекции. Как показали исследования Бойера и соавторов, E40RF3 и E40RF6 блокируют образование конкатомерной вирусной ДНК, ингибируя DNA РК-зависимую репарацию двухнитевых разрывов ДНК (Boyer et al., 1999). Оба вирусных белка способны образовывать комплекс с каталитической субъединицей DNA РК напрямую и инактивировать киназу (Nicolas et al., 2000). Это обеспечивает образование нормальной линейной вирусной ДНК, блокирование V(D)J рекомбинации и образования конкатомеров (Boyer et al., 1999).

Трансформирующий потенциал E40RF3 и E40RF6.

Особый интерес для исследователей представляет трансформирующая способность аденовирусных белков E40RF3 и E40RF6.

Как упоминалось раннее, классическая концепция вирусного онкогенеза связывает процесс трансформации прежде всего с первым ранним районом аденовируса (Е1), и непосредственно с онкопротеинами Е1А и Е1В (Shenk, 1996)

Главные продукты гена Е1А - Е1А 12S h13S взаимодействуют с членами семейств pRb и рЗОО, активизируя прогрессию клеточного цикла. С другой стороны, Е1А запускает программированную клеточную гибель - апоптоз, способствуя стабилизации и активации опухолевого супрессора р53. Оба главных продукта гена Е1В - Е1В 55 и 19кД, по отдельности способны блокировать этот путь апоптоза, что объясняет их способность, кооперируясь с Е1А, трансформировать клетки. Е1В55кД способен напрямую связываться с р53, тем самым ингибируя р53-зависимую транскрипцию (White, 1998).

E40RF3 и E40RF6 обладают трансформирующуей активностью, подобно Е1В55кД. Каждый из них способен инициировать образование фокусов трансформации у первичных клеток BRK1 в присутствии Е1А Ad5 и увеличивать количество фокусов в присутствии Е1А и Е1В55кД (More et al., 1996; Nevels et al., 1997; Nevels et al., 1999).

Фокусы трансформации, полученные в результате кооперации E40RF3 или E40RF6 с Е1А, сильно различаются по своей морфологии. Если фокусы, полученные при участии E40RF3, имеют незначительные изменения в фенотипе клетки, то фокусы, трансформированные E40RF6, отличаются очень сильно и характеризуются ускоренным ростом (Nevels et al., 1998).

E40RF6 имеет более высокий онкогенный потенциал in vivo, чем E40RF3, и способен значительно быстрее ускорять образование злокачественных опухолей у голых мышей (More et al., 1996; Nevels et al., 1997). Наиболее вероятно, что этот процесс обусловлен тем, что E40RF6 связывает клеточный транскрипционный фактор р53 и блокирует его способность активировать транскрипцию (Dobner et al., 1996). Более того, E40RF6 взаимодействует с Е1В55кД, и этот комплекс усиливает протеасомную деградацию р53 (Nevels et al., 2000).

E40RF3 также способен образовывать комплекс с Е1В55кД, но этот комплекс, как и сам белок, не взаимодействует с р53 и не способен влиять на функции р53 и его стабильность (Nevels et al., 1998). Возможно, что трансформирующая способность E40RF3, связана с другой его функцией. E40RF3 является белком, индуцирующим реорганизацию PML онкогенных доменов- POD.

Реорганизация POD E40RF3.

E40RF3 является ключевым белком ответственным за реорганизацию PML-онкогенных доменов (POD; Carvalho et al., 1995; Doucas et al., 1996). Эти домены являются ядерными субструктурами, ассоциированными с ядерным матриксом. Белки, образующие эти динамические образования, участвуют в регуляции клеточного роста и жизненного цикла различных вирусов, в том числе и аденовирусов (Ornelles, Shenk, 1991).

Начальная стадия вирусной инфекции характеризуется появлением небольших по размеру электроно-плотных ядерных включений, так называемых фокусов репликации. Фокусы репликации локализованы очень близко к маркерам POD (Ishov, Maul, 1996) и содержат однонитевые и двунитевые ДНК, вирусные иРНК, как после сплайсинга, так и еще не прошедшие его. Они представляют собой сайты ранней вирусной транскрипции и репликации (Bridge, Pettersson, 1995).

Синтез E40RF3 начинается также на ранней стадии инфекции в этих образованиях и индуцирует реорганизацию POD из сферических или торообразных структур в структуры, напоминающие спикулы, и сам начинает формировать аналогичные структуры (Carvalho et al., 1995; Doucas et al., 1996).

Кроме E40RF3, способного инициировать преобразование POD в спикулообразные структуры, как при инфекции, так и при трансфекции, и являющегося ключевым в этом процессе, другие вирусные белки также могут принимать в нем участие. Возможными учасниками этого процесса являются белки Е1В-55кД (Carvalho et al., 1995) и Е1А (Doucas et al., 1996).

Так El А и Е1В-55кД способны взаимодействовать с интактными POD (Carvalho et al., 1995) и колокализуются с реорганизованными в процессе вирусной инфекции компонентами POD (Doucas et al., 1996). Однако колокализация El А с компонентами этих ядерных структур строго зависима от присутствия E40RF3 (Koning et al., 1999). Взаимодействие компонентов POD с Е1В-55кД также нуждается в кооперации с E40RF3 (Leppard and Everett, 1999).

Вирусы, мутантные только по E40RF3, не способны к реорганизации POD вообще (Carvalho et al., 1995; Doucas et al., 1996).

Белки, входящие в состав POD, этих мультибелковых образований, играют роль в большинстве жизненно важных процессов для клетки. Именно со способностью реорганизовывать POD большинство исследователей связывают трансформирующую активность E40RF3 (Nevels et al., 1998; Nevels et al., 2000).

Однако биохимические механизмы, обуславливающие этот процесс, не известны. Для E40RF3 не показано взаимодействие с каким-либо из входящих в состав POD белков. Предполагается, что это взаимодействие опосредованно какими-то белками (белком). Характеристика белка AUP1, как гипотетической клеточной мишени для E40RF3 являлось одной из целей представленной работы.

V. Белок AUP1

Первое сообщение об Aupl было опубликовано Дженгом и соавторами в 1996 году (Jang et al., 1996). Они клонировали последовательность кДНК нового мышиного гена Aupl и дали ему имя ancient ubiquitous protein 1- "древний вездесущий белок 1", так как из-за близости гипотетических аминокислотных последовательностей Aupl и F44b9.5 Caenorhabditis elegans- 35% аминокислот (АК) являются идентичными.

Ген был локализован на 6-ой хромосоме мыши. Полученная последовательность имела длину 1490 нуклеотидных пар и кодировала одну открытую рамку считывания для 410 АК с предполагаемым молекулярным весом белка порядка 46кД (Jangetal., 1996).

В той же работе, по результатам анализа базы данных всех доступных последовательностей EST (express sequence tag) ДНК человека NCBI (National Center for Biotechnology Information, DNA sequence database, an annotated collection of all publicly available DNA sequences) Национальных институтов здравоохранения США (National Institutes of Health, NIH), опубликованных к 1996-му году, было выделено 19 близких последовательностей EST. На основании этих 19 последовательностей EST была создана предполагаемая последовательность гена Aupl человека. Используя полученные последовательности, Дженг и сотрудники определили место локализации гена Лир/ человека на второй хромосоме в районе 2р13 (Jang et al., 1996).

Участок мышиной хромосомы, рядом с которым был локализован мышиный ген Aupl, mnd2 район, имеет высокую частоту рекомбинации (Bashir et al., 1996) и аутосомальный рециссив по этому гену характеризуется нейромышечными дистрофиями различной степени тяжести (Jones et al., 1993). Однако уже в первой работе Дженга и в последующей публикации Уэбера было достоверно показано, что Aupl находится в участке mnd2 района шестой мышиной хромосомы, не участвующем в рекомбинации и не играет никакой роли в ассоциированных с этой перестройкой заболеваниях (Jang et al., 1996; Weber et al., 1998).

На второй человеческой хромосоме ген Aupl локализован в участке 2р13.1. Этот район второй человеческой хромосомы ассоциирован с тремя тяжелыми заболеваниями - болезнью Паркинсона и двумя типами мышечных дистрофий - the limb-girdle muscular dystrophies type 2B (LGMD2B) и Miyoshi miopathy (MM). Ha сегодняшний день показано, что оба заболевания, связанные с мускульными расстройствами, вызываются мутацией в одном и том же гене. Этот ген был клонирован и получил имя дисферлин (disferlin- DYSF; Weiler et al., 1999),

В случае с болезнью Паркинсона участок второй хромосомы 2р13.1 ассоциирован с аутосомальной доминантной формой болезни Паркинсона, наиболее характерной для датских и немецких семей. Но гены (ген) обуславливающие эту форму болезни Паркинсона, неизвестны. Однако фактов или гипотез связывающих их с Aupl с болезнью Паркинсона, кроме локализации его в том же районе, не обнаружено (de Silva et al., 2000).

Таким образом, за пять лет, прошедших с момента клонирования кДНК Aupl мыши в 1996 году, ни функции, ни какие либо дополнительные характеристики Aupl не были определены. Обобщая известную на начало работы информацию, можно сказать, что в 1996 г. был клонирован мышиный ген Aupl, предположена последовательность этого гена для человека и определена его хромосомная локализация на шестой хромосоме для мышиного гена и на второй для человеческого. Ни функции, ни какие либо дополнительные характеристики Aupl были не известны.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

I. Клеточные линии.

В представленной работе использовались следующие клеточные линии: HeLa Клеточная линия карциномы шейки матки человека

MCF7 Клеточная линия карциномы молочных желез человека. Содержит р53 дикого типа. (Soule et al., 1973) HI299 Клеточная линия карциномы легких человека, р53-негативная

Mitsudomi et al., 1992). BRK1 Первичная клеточная линия почечного эпителия 6-7 дневных крысят (Nevels et al., 1997а) АВ38 Клеточная линия, полученная путем трансформации BRK1 плазмидами, содержащими первый ранний район аденовируса и стабильно экспрессирующая Е1А и Е1В. (Enter, не опубликовано) 293 Клеточная линия, полученная путем трансформации аденовирусом пятого серотипа (Ad5) первичной клеточной линии эмбрионального почечного эпителия человека. Стабильно экспрессируют продукты генов Е1А, Е1В и E40RF3 (Graham et al., 1977).

Все использованные в работе клеточные культуры выращивали в стандартных условиях в термостате при 37°С, 7% С02, в среде DMEM с 10% сывороткой (fetal calf serum, FCS). Для выращивания AB38 в среду добавляли селективный агент - G418 в концентрации 500 мг/мл.

II. Бактериальные штаммы.

Используемые в работе бактерии перечислены в таблице 3.

Таблица 3. Список использованных бактерий.

Бактерии Штамм Назначение

E.coli DH10 Клонирование генов

E.coli Toppl Экспрессия белков

E.coli Topp2 Экспрессия белков

E.coli ТоррЗ Экспрессия белков

E.coli Topp4 Экспрессия белков

E.coli Topp5 Экспрессия белков

E.coli Торрб Экспрессия белков

E.coli XL 1-Blue supercompetent cells Репарация плазмид содержащих точечные разрывы.

III. Плазмиды, использованные в работе.

В работе использовали плазмиды из коллекции лаборатории доктора Т. Добнера (Т. Dobner), института медицинской микробиологии и гигиены, стандартные вектора фирмы In Vitrogen и полученные в ходе работы конструкции.

1. Плазмиды из коллекции доктора Т. Добнера.

1.1. Вектора, использованные в работе. pGAD GH Вектор pGAD GH (In Vitrogene), используется для продукции сплавленного белка, содержащего последовательность, способную взаимодействовать с активайионным доменом GAL4 (аминокислоты 768-881). Этот вектор содержит ряд уникальных рестрикционных сайтов в 3' участке последовательности, активирующей GAL4. Сплавленный белок, находящийся в этой плазмиде под ADH1 конститутивным промотором, способен экспрессироватьзя в дрожжевой системе. pGAD GH так же содержит клонированный в него сигнал ядерной локализации, обеспечивающий всем белковым продуктам, синтезированных с этого вектора, ядерную локализацию в дрожжевой клетке. Вектор используется при работе с дрожжевой двугибридной системой. pcDNA3-flu

PGEX-4T-2 рсЗ-RFP pSPORT VP16

Вектор pcDNA3 (In Vitrogene), содержит T7 промотор и клонированную в лаборатории д-ра Добнера в вектор последовательность, кодирующую участок белка гемагглютинина человека (YPYDVPDYA; HA-tag). Наличие Т7 промотора дает возможность использовать эту конструкцию для трансляции in vitro. HA-tag последовательность является мишенью для моноклональных антител (3F10), что позволяет использовать данную плазмиду для трансфекции с последующей иммунофлуоресценцией или для иммунопреципитации.

Вектор для экспрессии GST-сплавленных белков. Содержит последовательность, кодирующую белок GST и следующий за ним сайт для клонирования вставки.

Вектор рсЗ (In Vitrogene) с клонированной в него последовательностью, кодирующей красный флюоресцирующий белок (red fluorescent protein; RFP). Наличие последовательности RFP позволяет использовать данную плазмиду для трансфекции и последующей прямой иммунофлуоресценции, без использования антител. Вектор для клонирования кДНК копий генов.

1. 2 Плазм иды, кодирующие белки, способные активировать транскрипцию GAL4 в дрожжевой двугибридной системе при взаимодействии с ACE4QRF3. pGADGH-3.1 Последовательность 3.1 из библиотеки кДНК эмбрионального мозга человека, клонированная в вектор pGAD GH (InVitrogene). Содержит около 700 нуклеотидов и имеет 98% гомологии с С-терминальным участком гена Aupl человека. pGADGH-11.2 Последовательность 11.2 из библиотеки кДНК эмбрионального мозга человека, клонированная в вектор pGAD GH (InVitrogene). Содержит около 700 нуклеотидов и имеет 100% гомологии с С-терминальным участком гена Aupl человека. pGADGH-12.1 Последовательность 12.1 из библиотеки кДНК эмбрионального мозга человека, клонированная в вектор pGAD GH (InVitrogene). Содержит около 700 нуклеотидов и имеет 98% гомологии с С-терминальным участком гена Aupl человека. pGADGH-15.1 Последовательность 15.1 из библиотеки кДНК эмбрионального мозга человека, клонированная в вектор pGAD GH (InVitrogene). Содержит около 700 нуклеотидов и имеет 98% гомологии с С-терминальным участком гена

Aupl человека. pGADGH-22.1 Последовательность 22.1 из библиотеки кДНК эмбрионального мозга человека, клонированная в вектор pGAD GH (InVitrogene). Содержит около 700 нуклеотидов и имеет 100% гомологии с С-терминальным участком гена Aupl человека. pGAD GH-40.2 Последовательность 40.2 из библиотеки кДНК эмбрионального мозга человека, клонированная в вектор pGAD GH (InVitrogene). Содержит около 700 нуклеотидов и имеет 98% гомологии с С-терминальным участком гена Aupl человека.

1.3 Плазмиды использованные в работе для получения in vitro транслированных белков. pcDNA3-flu-E4orf3 Ad5 Полная последовательность гена E4orf3 Ad5, клонированная в вектор pcDNA3 с HA-tag. Использовали для получения in vitro транслированного белка E40RF3 Ad5. pcDNA3-flu-E4orf3 Ad9 Полная последовательность гена E4orf3 Ad9, клонированная в вектор pcDNA3 с HA-tag. pcDNA3-flu-E4orf3 Adl2 pcDNA3-flu-E4orB Ad40 pcDNA3 -flu-ANE4orf3 Ad5 pcDNA3-flu-ACE4orf3 Ad5 pcDNA3-flu-E4orf3 L80A Ad5

Использовали для получения in vitro транслированного белка E40RF3 Ad9. Полная последовательность гена E4orJ3 Adl2, клонированная в вектор pcDNA3 с HA-tag, использовали для получения in vitro транслированного белка E40RF3 Ad 12. Полная последовательность гена E4orf3 Ad40, клонированная в вектор pcDNA3 с HA-tag, использовали для получения in vitro транслированного белка E40RF3 Ad40. Нуклеотидная последовательность, кодирующая белок E40RF3 Ad5 без последних 28 АК, клонированная в вектор pcDNA3 с HA-tag. Использовали для получения in vitro транслированного белка -AN E40RF3. Нуклеотидная последовательность, кодирующая белок E40RF3 Ad5 без первых 28 АК, клонированная в вектор pcDNA3 с HA-tag. Использовали для получения in vitro транслированного белка DCE40RF3. Нуклеотидная последовательность, кодирующая белок E40RF3 Ad5 с аминокислотной заменой лейцин на аланин в 80 позиции, клонированная в вектор pcDNA3 с HA-tag. Использовали для получения in vitro транслированного белка. pcDNA3-flu-E4orf3 Y40A Нуклеотидная последовательность, кодирующая Ad5 белок E40RF3 Ad5 с аминокислотной заменой на аланин в 40 позиции, клонированная в вектор pcDNA3 с HA-tag. Использовали для получения in vitro транслированного белка. pcDNA3-flu-E4orD НР55/56А Нуклеотидная последовательность, кодирующая Ad5 белок E40RF3 Ad5 с аминокислотной заменой на аланин в 56 позиции, клонированная в вектор pcDNA3 с HA-tag. Использовали для получения in vitro транслированного белка. pcDNA3-flu-E4orf3 L72/73A Нуклеотидная последовательность, кодирующая Ad5 белок E40RF3 Ad5 с аминокислотной заменой лейцин на аланин в 73 позиции, клонированная в вектор pcDNA3 с HA-tag. Использовали для получения in vitro транслированного белка. pcDNA3-flu-E4orf6/7 Ad5 Нуклеотидная последовательность, кодирующая белок E40RF6/7, клонированная в вектор pcDNA3 с HA-tag. Использовали для получения in vitro транслированного белка. pcDNA3-flu-E 1В 55 кД Ad5 pcDNA3-flu-ElA Ad5 pcDNA3 -flu-PML

PcDNA3 E4orf3 Ad5

Нуклеотидная последовательность, кодирующая белок Е1В - 55кД, клонированная в вектор pcDNA3 с HA-tag. Использовали для получения in vitro транслированного белка. Нуклеотидная последовательность, кодирующая белок Е1А 12S, клонированная в вектор pcDNA3 с HA-tag. Использовали для получения in vitro транслированного белка.

Нуклеотидная последовательность, кодирующая белок PML, клонированная в вектор pcDNA3 с HA-tag. Использовали для получения in vitro транслированного белка.

Полная последовательность гена E4orf3 Ad5, клонированная в вектор pcDNA3 без HA-tag, использовали для получения in vitro транслированного белка E40RF3.

2. Плазмиды, полученные в процессе работы.

2.1. Стратегия клонирования

Для получения определенной последовательности (вставки) в векторе, необходимом для работы, вектор и вставку анализировали на наличие общих рестрикционных сайтов позволяющих вставить последовательность (вставку) в определенный участок вектора, не повредив последнюю. Если сайт, необходимый для рестрикции, в векторе был не единственным, то нежелательные сайты инактивировали путем направленной точечной мутации определенного нуклеотида. Если же необходимые сайты отсутствовали, то их создавали с помощью ПЦР со специальными праймерами на концах вставки, имеющими на конце необходимую последовательность. После чего вектор и вставку нарабатывали в бактериальной культуре в большом объеме, разрезали необходимыми ферментами и лигировали. Продуктами лигазной реакции трансформировали Е. coli. Полученные правильные клоны сохраняли в глицериновой культуре и использовали в дальнейшей работе.

Полученные плазмиды проверяли рестрикционным анализом и позитивные клоны (т.е. клоны содержащие вектор и вставку правильных размеров) отправляли на сиквенирование. Сиквенирование производилось службой сиквенирования института. Смесь для сиквенирования ДНК 0.85-0.5 мкг

Праймер 6-10 пикограмм

Вода до объема 7 мкл

2.2. Плазмиды полученные в работе.

А. Клонирование полной последовательности Aupl в вектор pSPORT.

Для получения полной последовательности кДНК гена Aupl человека, с помощью рестрикционных ферментов Mlul и BspEl были разрезаны два клона, полученных в Гайдельберге (Германия) при тестировании библиотеки кДНК эмбрионального мозга человека - клон DKFZp415B1538Q2 (1) и DKFZp415I2266Q2 (5). Сшив полученные последовательности - начало первой последовательности и вторую часть 5-й последовательности, получили полную последовательность кДНК гена человека Aupl.

Для переклонирования полной последовательности Aupl из вектора pSPORT в вектора pcDNA3-RFP, pcDNA3-flu и pGEX-4T-2 были получены ПЦР-продукты, содержащие полную последовательность Aupl с необходимыми рестрикционными сайтами на концах. Для вектора рсЗ-RFP - Nhel и Kpnl, для pcDNA3-flu и pGEX-4T-2 - EcoRl и Xhol, VP16-AUP1 - Nhel. Праймеры для ПЦР:

Для вектора рсЗ-RFP: 5' GGGGTACCATGGAGGTTCCCTCAGGGC3', 5'CTAGCTAGCGTCAGCCTCCTGGGCTCGTC 3'

Для векторов pcDNA3-flu и pGEX-4T-2: 5'GGAATTCTGGAGCTTCCCTCAGGGCCG 3', 5' CCGCTCGAGTCAGTCAGCCTCCTGGGCTC 3' Для вектора VP 16-AUP1:

5' CTAGCTAGCGGAACTTCCCTCAGGGCCG 3' 5 'CTAGCTAGCGTCAGCCTCCTGGGCTCGTC 3'

Условия ПЦР: 95°C 30 секунд 95°C 30 секунд

62°C 1 минута x 45 циклов

72°С 2 минуты 72°С 7 минут 4°С

Полученные ПЦР-продукты сиквенировали и после подтверждения правильности полученной последовательности клонировали в соответствующие вектора. Б. Плазмиды для получения GST-сплавленных белков.

Для получения GST-сплавленных белков последовательности, кодирующие полную аминокислотную последовательность белка AUP1 (AUP1), белок, содержащий последние 200 АК AUP1 (AUP1-11.2) и белок, включающий в себя последние 140 АК AUP1 без 50 С-терминальных АК (AUP 1-22.1), клонировали в вектор pGEX-4T-2 по рестрикционным сайтам EcoRl и Xhol. В. Плазмиды для иммунофлуоресценции.

Для определения клеточной локализации AUP1, полная последовательность кДНК Aupl была клонирована в вектор рсЗ-RFP по Nhel и Kpnl рестрикционным сайтам.

Г. Плазмиды для получения in vitro транслированного белка и иммунопреципитации.

Последовательности, кодирующие AUP1 и AUP1-11.2 были клонированы в pcDNA3-flu плазмиду по рестрикционным сайтам EcoRl и Xhol. Т.к. рестрикционный сайт EcoRl в pcDNA3-flu плазмиде не был единственным, лишний сайт был инактивирован методом направленных точечных мутаций.

2.3. Метод внесения направленных точечных мутаций.

Для инактивации дополнительного рестрикционного сайта EcoRl в векторе pcDNA3-flu использовали метод внесения направленных точечных мутаций с помощью Quik Change Site-Directed Mutagenesis Kit фирмы Stratagene.

С помощью специальных полученных нами праймеров для ПЦР, содержаюших необходимую нам замену, поставили ПЦР (Смесь для ПЦР: 5 мкл 10х буфер; 50 нг ДНК; 6 пг праймер 1; 6 пг праймер 2; 1 мкл dNTP-mix; вода до 50 мкл; 1.5 U Pfu DNA polymerase).

Условия ПЦР 95°С 30 секунд 95°С 30 секунд

55°С 1 минута х 18 циклов

68°С 11 минут 4°С

Продукты ПЦР подвергли рестрикции специальным рестрикционным ферментом Dpnl, узнающим метилированные сайты ДНК, т.е. разрезали плазмиды, выделенные из бактерий и не содержащие мутацию. После чего полученным ПЦР-продуктом трансформировали суперкомпетентные клетки XLl-Blue supercompetent cells. Использовали этот штамм Е. Coli, т.к. после трансформации в XLl-Blue supercompetent cells в этих клетках происходит репарация плазмид, часто содержащих точечные разрывы после ПЦР.

Полученные клоны анализировали с помощью сиквенирования.

Таблица 4. Список полученных плазмид. вектор вставка Назначение Бактерии, которые были трансформированы

PcDNA3-flu mut Вектор с инактивированным одним из двух рестрикционных сайтов EcoRl. Для клонирования в него по сайтам EcoRl и Xhol. DH10

PcDNA3-flu Aupl 11.2 Трансфекция, иммунофлуоресценция, Иммунопреципитация DH10

PcDNA3-flu Aupl FL Трансфекция, иммунофлуоресценция, Иммунопреципитация DH10

PgEX-4T-2 Aupl 22.1 Трансляция GST-сплавленого белка ТоррЗ, Торрб, Торр5, DH10

PgEX-4T-2 Aupl 11.2 Трансляция GST-сплавленого белка ТоррЗ, Торрб, Торр5, DH10

PGEX-4T-2 Aupl FL Трансляция GST-сплавленого белка Toppl, Торр2, Торр4, ТТррЗ, Торр5, DH10.

Pc3-RFP Aupl FL Трансляция RFP-сплавленого белка DH10

PSPORT Aupl FL Клонированная полная последовательность гена Aupl DH10

VP16 Aupl FL DH10

IV. Анализ взаимодействия белков in vitro.

Для исследования in vitro связывания белков in vitro транслированный белок с

Л с метионином, содержащим радиоактивный изотоп серы S , инкубировали с другим очищенным и сорбированным на глютатион-сефарозе GST-сплавленным белком. После двух часов инкубации на качалке в специальном буфере, белок сорбированный на глютатион-сефарозе, осаждал и промывали 5-7 раз в специальных буферах для удаления несвязанного с ним радиоактивного белка. При этом in vitro транслированный белок, связавшийся с GST-сплавленным белком, оставался в эппендорфе. Если взаимодействие было, то после белкового фореза на ренгеновской пленке появлялся банд соответствующий размеру in vitro транслированного белка.

Для определения in vitro взаимодействия AUP1 с белками аденовируса и маркером POD PML, а так же локализации участков белка, ответственных за этот процесс, использовали GST-сплавленные белки AUP1, AUP1-11.2, AUP 1-22.1, и in vitro транслированные белки: E4orf3 wt, Ad5, PML, E4orf6/7 Ad5, E4orf3 Ad9, E4orf3

Ad5, E4orf3 Ad 12, E4orD Ad40, ANE4orf3 Ad5, ACE4orf3, pcDNA3-flu-E4orf3 Ad5, E4orf3 Y40A Ad5, E4orf3 HP55/56A Ad5, E4orf3 L72/73A Ad5, E1B 55 кД Ad5, E1A Ad5.

Белки транслировали in vitro с помощью TNT Т7-связывающей системы с использованием лизатов ретикулоцитов (Promega). Белки транслировали с pcDNA3 плазмиды содержащей в качестве вставки кДНК необходимого белка. Для радиоктивного мечения добавлялся метионин, содержащий радиоактивный изотоп серы S35.

1. In vitro трансляция белков с 835-метионином.

Для in vitro мечения белков 835-метионином в TNT-системе (Promega) в смесь, в состав которой входили pCi 358-метионина, 1 мкл Т7- РНК-полимеразы, 25 мкл лизата ретикулоцитов, 2 мкл TNT-буфера, 1 мкл смеси всех аминокислот без метионина и вода до 50 мкл, добавляли 2мкг ДНК - плазмиды, содержащей соответствующий ген.

Полученную смесь инкубировали 1,5 часа при 30°С. Полученный белок хранили при -20С. Для проверки эффективности реакции 1 мкл in vitro транслированного белка кипятили 5 мин при 95°С в 10 мкл 2х буфера Леммли. Полученную пробу наносили на 15% SDS-гель. После фореза по Леммли гель инкубировали 40-60 мин. в растворе салицилата Na (80 г салицилата Na на 0.5 л) для усиления сигнала, высушивали и помещали с ренгеновской пленкой на -80°С сроком на 12 часов. Полученные пленки проявляли на аппарате Kodak.

2. Получение GST -сплавленных белков.

Для получения белков сплавленных с глютатион-8-трансферазой (GST-сплавленых белков) последовательности, их кодирующие, клонировали в вектор pGEX-4T-2. Этот вектор содержит ген, кодирующий GST под IPTG-зависимым промотором. Клонирование производили в строго определенный сайт для сохранения правильной рамки считывания.

Вектором pGEX-4T-2 со вставкой AUP1 трансформировали бактерии Е. coli Toppl, Торр2, ТоррЗ, Торр4, Торр5, Торрб. Для определения штамма бактерий, в котором GST-AUP1 экспрессируется лучше всего, экспрессия этих белков тестировали в малом объеме.

Для этого 5 мл ночной культуры разбавляли LB в 10 раз и брали две аликвоты по 5 мл от каждого штамма. Бактериальную культуру выращивали до оптической плотности 0.6-0.8 OD после чего для индукции синтеза GST-сплавленного белка в одну пробу добавляли IPTG до конечной концентрации 0.001М. Интактную пробу использовали как отрицательный контроль.

Обе пробы выращивали 3-4 часа на качалке при 37°С, после чего 1 мл суспензии центрифугировали при 6000 об./мин. Полученный осадок кипятили при 95°С 5 мин в 2х буфере Леммли. Аликвоту полученной пробы наносили 12% SDS-гель.

Гель окрашивали по Кумасси 10 мин и дифференцировали в смеси ледяной уксусной кислоты и этанола.

По результатам белкового фореза оценивали уровень экспрессии GST-сплавленого белка. Для дальнейшей работы использовали клон с наибольшим уровнем экспрессии.

Для получения белка в больших количествах, к 100 мл ночной культуры добавляли 0.9 л LB с ампицилином и выращивали до оптической плотности 0.6-0.8 OD после чего для индукции синтеза GST-сплавленного белка добавляли IPTG до конечной концентрации 0.001М. Культуру выращивали 3-4 часа на качалке при 37°С, после чего центрифугировали при 6000 об./мин 10 мин.

Полученный осадок промывали 20 мл охлажденного PBS с ингибитором протеаз и замораживали на -80°С.

3. Получение GST-сплавленного белка сорбированного на глютатион сефарозе.

Для абсорбции GST-сплавленного белка промытый PBS бактериальный осадок размораживали на льду. Для выделения белка лизировали клеточные стенки бактерий (добавляли небольшое количество лизоцима, растворенного в 0.5 мл PBS с ингибитором протеаз) и разрушали ДНК с помощью ДНК-азы 1 (1мг/мл) с добавлением 130 мкл 1М MgC12 и 13 мкл МпС12. Перемешивали и оставляли на льду на 10 мин.

Для полного разрушения всех мембранных структур клетки, раствор сонифицировали три раза по 1 мин.

После сонификации для очистки суспензии в нее добавляли 10 мл раствора 0.5 мл 5М NaCl (до конечной концентрации 0.5 М) и Тритон-Х-100 (до конечной концентрации 1%), оставляли на 10 мин на льду и центрифугировали 30 мин при 15000 об ./мин.

В полученный супернатант добавляли 0.75 мл глютатион-сефарозы, трижды промытой в 10 мл PBS с 0.5М NaCl и 1% Тритоном-Х-100. После инкубации 2-4 часа на качалке при 4С промывали охлажденным PBS с ингибитором протеаз, центрифугировали 2 мин при 2000 об./мин. Осадок ресуспендировали в 1 мл смеси PBS-глицерин 1:1 и аликвоты замораживали на -80°С.

Для определения концентрации полученного белка одну из проб размораживали на льду, дважды промывали охлажденным PBS с ингибиторами протеаз, добавляли 80 мкл 2х буфера Леммли, кипятили 5 мин при 95°С, и наносили аликвоту на 12% гель. Для определения концентрации белка на тот же гель наносили различные концентрации контрольного белка - бычьего сывороточного альбумина. Для экспериментов по in vitro связыванию белков использовали одинаковое количество GST-сплавленных белков.

4. In vitro связывание белков.

Смесь для in vitro связывания, содержащую in vitro транслированный белок, инкубировали 2 часа в NETN-буфере (20 mM Tris/HCl рН 8, lOOmMNaCl, ImM EDTA, 0.5% объем/объем NP40) при 4С на качалке с GST-сплавленым белком AUP1 11.2, AUP1 22.1 или полной последовательностью AUP1, сорбированными на глутатионсефарозе. После инкубации GST-сплавленый белок, абсорбированный на глутатион-сефарозе, осаждался и промывался последовательно NETN-буфером, DAlOO-буфером (HEPES - 1.19 г; MgC12 - 0.15 г; NaCl - 2.92 г; вода - до 0.5л), дважды ЭА500-буфером (HEPES - 1.19 г; MgC12 - 0.15 г; NaCl -14.6 г; вода - до 0.5л) и один раз DA1 ООО-буфером (HEPES - 1.19 г; MgC12 - 0.15 г; NaCl - 29.2 г; вода - до 0.5л) для удаления радиоктивного белка не связанного с GST-сплавленным белом абсорбированном на глютатион сефарозе. При необходимости количество промывок увеличивалось.

Полученный осадок кипятили 5 мин. при 95°С в 20 мкл 2х буфере Леммли и наносили половину объема на 15% гель. После фореза по Леммли гель инкубировали 40-60 мин. в растворе салицилата Na для усиления сигнала, высушивали и помещали с ренгеновской пленкой на-80°С сроком 12-48 часов. Полученные пленки проявляли на аппарате фирмы Kodak. При образовании комплекса GST-сплавленный белок- in vitro транслированный белок на полученной пленке проявлялся банд, по молекулярной массе соответствующий in vitro транслированному белку.

V. Трансфекция клеток.

Трансфекцию клеток проводили кальций-фосфатным методом. Смесь для трансфекции содержала 10% 2.5М СаС12, плазмиду (концентрация зависила от конкретной плазмиды), ssDNA, воду. При непрерывном встряхивании ее добавляли в равный объем 2xHEBS (50 mM HEPES/NaOH рН 7.05; 105 шМ Na2HP04; 300 тМ NaCl) стерильно и оставляли на 15 мин. За это время клеткам меняли среду. В свежую среду добавляли преципитат и оставляли как минимум на 15 часов.

VI. Инфекция клеточных культур аденовирусами.

Инфицирование клеточных культур HI299 и MCF7 проводили пятым серотипом аденовируса дикого типа. Инфицирование клеточных культур HI299 и MCF7 проводили пятым серотипом аденовируса дикого типа. В клетки, находящиеся в 3 мл среды без сыворотки, капали 5 мкл очищенного вируса и оставляли в термостате на один час, после чего добавляли среду с 10% сывороткой до нормального объема. Через 24 часа после инфекции клеток линии MCF7 количество инфицированных клеток составлял около 60-70 процентов.

VII. Получение поликлональных антител к Aupl

Получение GST-Aupl для иммунизации.

GST-Aupl, сорбированный на глютатион-сефарозе, инкубировали с избытком свободного глютатиона 2-4 часа на качалке при 4С. Поученный комплекс GST-Aupl сорбированный на свободном глютатионе, очищали от глютатион-сефарозы тремя последовательными центрифугировали при 4° С и 2500 об/мин.

Полученный супернатант помещали в специальную рамку, боковые стенки которой представляли собой мембрану с порами, достаточными для прохождения глютатиона, но не пропускающие GST-Aupl (Promega). Рамка помещалась в 5-10 литров PBS и ставилась на магнитную мешалку на 24-28 часов в хладотермостат при 4°С. После этого оценивали концентрацию GST-Aupl, оставшегося в рамке. Для этого аликвоту 5-15 мкл GST-Aupl наносили на 12% гель с различными концентрациями BSA. Полученным белком GST-Aupl иммунизировали кролика. Иммунизация кролика.

Для получения поликлональных антител к Aupl иммунизировали кролика GST-Aupl-11.2-сплавленным белком (GST-Aupl). Для этого GST-Aupl в адъюванте фирмы Sigma вводили внутримышечно кролику трижды с интервалом две и четыре недели соответственно. Перед каждой иммунизацией и через месяц после последней у кролика брали кровь. Через четыре часа после забора крови, ее центрифугировали 510 мин при 15000 об/мин. Полученную сыворотку аликвотировали и хранили на -80°С.

VIII. Иммунофлуоресценция.

Клетки, используемые для иммунофлуоресценции, выращивали в стандартных условиях непосредственно на предметном или покровном стекле. Клетки фиксировались и окрашивались по следующему сценарию:

1. Препараты из чашек Петри промывали однократно PBS.

2. Фиксировали 25 мин в 100% метаноле при -20° С.

3. Сушили 10 мин на столе

4.1 Для окраски только DAPI, растворы инкубировали 0.5 часа в растворе DAPI, после чего отмывали 3 раза по 5 мин в PBS-0.1%Tween и заключались.

4.2 Для окраски DAPI и AT инкубировали препараты 1 час в 5% молоке. 4.2.1 Инкубировали в первых AT 1 час.

4.2.2 Отмывали три раза по 10 мин в PBS-0.1 % Tween

4.2.3 Инкубировали во вторых AT 1 час

4.2.4 Отмывали три раза по 10 мин в PBS-0.1% Tween 5. Заключение.

Препараты анализировали с помощью микроскопа фирмы Лейка (DMR-Leica) и камеры Olympus АХ70. Полученные картинки окрашивали и совмещали с помощью компьютерных программ (MetaView- Software-Paket).

В работе использовались следующие антитела:

Антитела (AT) Рабочая концентрация

Кроличьи поликлональные AT анти-AUP 1 (получены в ходе работы) 1:300

Мышиные моноклональные AT анти-PDI 55 кД (маркер аппарата Гольджи; StressGene) 1:80

Мышиные моноклональные AT анти-Р-СОР 110кД (маркер эндоплазматического; ретикулума StressGene) 1:40

Крысиные моноклональные AT анти-Е4огО (Получены по заказу д-ра Добнера в лаборатории д-ра Крамер, Мюнхен, Германия) 1:1

Моноклональные мышиные AT анти- Е2А-72кД (В6). (Получены по заказу Добнера в лаборатории д-ра 1:100

Крамер, Мюнхен, Германия)

Моноклональные AT анти-Е1А 55 кД. (Получены по заказу Добнера в лаборатории д-ра Крамер, Мюнхен, Германия) 1:100

Моноклональные AT анти-р53 (StressGene) 1:100

Вторые AT - FITC - анти-мышиные (Dianova) 1:100

Вторые AT - FITC - анти-кролик (Dianova) 1:100

Вторые AT - FITC - анти- крысиные (Dianova) 1:300

Вторые AT - TR- анти-кроличьи (Dianova) 1:100

Вторые AT - TR- анти- крысиные (Dianova) 1:100

Вторые AT - TR - анти- мышиные (Dianova) 1:100

IX. Вестерн-блот и иммуноприципитация. А. Получение белковых лизатов

1. Клетки, выращенные в чашках Петри, отмывали от остатков среды охлажденным PBS.

2. Добавляли 200-1000 мл охлажденного NP-40 (0.15% v/v NP-40; 50 mM Трис/HCl рН8; 150 шМ NaCl; 5 mM EDTA) с ингибитором протеаз (Roche).

3. Снимали клетки стерильным шпателем и полученную суспензию помещали в чистый эппендорф.

4. Сонифицировали.

5. Центрифугировали 5 мин при 14000 об./мин 4°С

6. Измеряли концентрацию белка в супернатанте с помощью специального реагента фирмы Roche.

Б. Белковый форез по Леммли.

На 12-15% акриламидный SDS-гель наносили 20-40 мкг белка. Форез проходил при 15 мА в разделяющем и при 20-40 мА в концентрирующем геле.

Из геля белки переносили на нитроцеллюлозную мембрану в буфере Towbin при 400 мА. Полученную мембрану хранили в PBS при 4С от нескольких часов до суток.

В. Вестерн-блот:

1. Нитроцеллюлозную мембрану с перенесенными на нее белками, инкубировали в 5% молоке 1 час или 15-18 часов (ночь).

2. Отмывали от молока дважды по 5 мин в PBS-0/l%Tween.

3. Инкубировали в первых AT 1 час.

4. Отмывали трижды по 10 мин в PBS-0/l%Tween.

5. Инкубировали во вторых AT 1 час

6. Отмывали трижды по 10 мин в PBS-0/l%Tween.

7. Проявляли с помощью кита фирмы Roche.

8. Закладка пленки на срок от 2-3 секунд до 10 минут в зависимости от интенсивности сигнала.

9. Проявка пленки на аппарате фирмы Kodak. Антитела, используемые для вестерн-блота:

- Преиммунная сыворотка кролика, разведение 1:1000, 1:300.

- Поликлональные AT анти-AUPl-GST (Сыворотка кролика через 7 недель после иммунизации), разведение 1:1000, 1:300.

- Поликлональные AT анти-AUPl-GST (Сыворотка кролика через 7 недель после иммунизации), разведение 1:1000, 1:300.

-Вторые AT против кролика (Dianova), разведение 1:5000

Г. Метод иммунопреципитации белков.

1. Раствор белка G (30 мг белка G на 1 мл PBS) промывали три раза буфером NP40 (состав см. выше) осаждая 3 мин при 6000 об/мин.

2. Антитела инкубировали 2-4 часа с белком G. (Концентрация антител 0ю5-5 мг/мл или 20-100 мкл сыворотки кролика на одну реакцию)

3. Готовили свежий клеточный лизат в NP40 буфере (см. выше)

4. Измерение концентрации белка в клеточных лизатах (с помощью набора Sigma по стандартному протоколу).

5. Инкубировали комплекс G белок-антитела с клеточным лизатом 15-20 часов.

6. Промывали 3-5 раз буфером NP40, интенсивно перемешивая перед очередной промывкой.

7. Кипятили в 2х буфере Леммли при 95° С 5 мин.

8. Ставили форез по Леммли.

9. При иммунопреципитации in vitro транслированного белка после форезфа по Леммли гель инкубировали 40-60 мин. в растворе салицилата Na для усиления сигнала. Сушили под вакуумом и помещали с ренгеновской пленкой на -80°С, сроком на 12 часов. Полученные пленки проявляли на аппарате Kodak.

РЕЗУЛЬТАТЫ

I. Клонирование полной последовательности кДНК гена AUP1 человека и сравнение ее с геномной копией.

1. Идентификация Aupl.

При поиске кДНК новых клеточных белков способных взаимодействовать с аденовирусным онкопротеином E40RF3 в лаборатории доктора Добнера (Dr. Dobner) было обнаружено пятнадцать клонов из библиотеки кДНК плаценты человека (Library Human Placenta cDNA; Clontech) способных взаимодействовать с белком аденовируса пятого типа E40RF3 несущем С-терминальную делецию (29 аминокислот; AC E40RF3 Ad5) в двугибридной дрожжевой системе. Шесть из пятнадцати клонов содержали последовательности, кодирующие С-терминальный участок белка AUP1 человека. Для анализа использовали ДС E40RF3 Ad5, так как полная последовательность E40RF3 сама по себе является мощным активатором транскрипции у дрожжей (Карпишева и др., 2001(2)).

Проведенный нами анализ позитивных клонов показал, что все шесть клонов содержат последовательности, имеющие от 98% до 100% гомологии с 3'-концевым участком гена Aupl. Определение нуклеотидной последовательности осуществлялось с помощью стандартного праймера GAL4 AD для сиквинирования последовательностей, клонированных в pGAD GH (GAL4 AD Sequencing Primer; InVitrogene). Размер полученных последовательностей состовлял около 800 нуклеотидных пар. Четыре клона (3.1, 12.1, 15.1, 40.1) содержали разное количество точечных мутаций, один клон (22.1) имел дополнительную последовательность и последний (11.2) был полностью идентичен С-терминальному участку гена Aupl.

Проведенные исследования показали, что дополнительная последовательность в 22.1 представляет собой представляет собой участок 10-го интрона гена Aupl. Для дальнейшей работы нами были выбраны две последовательности - Аир1-\\2 (11.2) и Аир 1-22А (22.1), так как эти последовательности не содержали точечных мутаций по сравнению с З'-концом человеческого гена Aupl, предсказанного Дженгом и сотрудниками (рис. 3; Jang et al., 1996).

Рисунок 3. Схематическое изображение последовательностей 3.1, 11.2,12.1, 15.1, 22.1 и 40.2, кодирующих белки, активирующие транскрипцию в двугибридной дрожжевой системе при взаимодействии с AC E40RF3 Ad5, и последовательности, предсказанной Дженгом - AUP1 1996 (Jang et al., 1996). Пять последовательностей в разной степени идентичны 3'- концевому участку Aupl. Четыре клона содержат разное число точечных мутаций (указано стрелками), два - 11.2 и 22.1 - идентичны 3'- концевому участку Aupl. Уголком показан участок десятого интрона тепа. Aupl, отсутствующий во всех последовательностях, исключая 22.1. В дальнейшей работе использовались последовательности кДНКЛмр1,11.2 и 22.1 (выделены жирным шрифтом).

AUP1

11.2

40.2

22.1

15.1 3.1

12.1

Заключение Диссертация по теме "Гистология, цитология, клеточная биология", Карпишева, Ксения Владимировна

выводы

1. Ген Aupl локализован на хромосоме 2 человека, содержит 3047 пар оснований и кодирует одну открытую рамку считывания, содержащую 1230 нуклеотидов с первым ATG на позиции 5630 геномной последовательности АС005041.2 и стоп-кодоном TGA на позиции 8500. Ген содержит 12 экзонов и 11 интронов. Последовательность гена Aupl и белка AUP1 человека имеет 90% и 82% гомологии с геном Aupl и белком AUP1 мыши и крысы на нуклеотидном и аминокислотном уровне соответственно.

2. Белок AUP1 содержит 410 аминокислот и имеет размер 45kDa. Экспрессия этого белка показана для всех протестированных линий человека и крысы. Эндогенные и экзогенные белки AUP1 имеют цитоплазматическую локализацию в протестированных клеточных линиях крысы (BRK1, АВТ, АВ38) и человека (MCF7, 293, Н1299) и не ассоциированы с аппаратом Гольджи и эндоплазматическим ретикулумом.

3. Белок AUP1 способен связываться in vitro с белками E40RF3 Ad5, Ad40 и Ad9 и Е1А и не взаимодействует in vitro с белками E40RF3 Adl2, E40RF6, ElB-55kDa, E40RF4/3 и клеточным белком PML. Для взаимодействия белка AUP1 с E40RF3 Ad5 важны последние 50 аминокислот в С-терминальном участке AUP1 и центральные 50 аминокислот E40RF3. При взаимодействии AUP1 с Е1А определяющим является N-терминальный участок Aupl.

4. При аденовирусной инфекции и через 6, 16, 24 и 48 часов после инфекции в клетках MCF7 и HI299 и в клеточных линиях, стабильно экспрессирующих вирусные белки E4orf3, Е1В, E1A (293, АВТ, AB38), использованные нами подходы не выявили совместной локализации AUP1 с E40RF3 и продемонстрировали цитоплазматическую локализацию AUP1.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Карпишева, Ксения Владимировна, Санкт-Петербург

1. Карпишева К.В., Тойба Б., Кислякова Т.В., Добнер Т. Новый клеточный белок человека AUP1. I. Взаимодействие с аденовирусными белками E40RF3 и Е1А in vitro. Цитология, 2002а, 44(5), 486-495.

2. Карпишева К.В., Тойба Б., Кислякова Т.В., Добнер Т. Новый клеточный белок человека AUP1. II. Клонирование кДНК гена AUP1, определение его геномной организации и первичная характеристика белка AUP1 человека. Цитология, 20026,44(6), 541-543.

3. Карпишева К.В., Тойба Б., Кислякова Т.В., Добнер Т. Новый клеточный белок человека AUP1. Ш. Локализация в различных клеточных линиях человека и крысы. Цитология, 2002в, 44(7), 637-642.

4. Adams MD, Kelley JM, Gocayne JD, Dubnick M, Polymeropoulos MH, Xiao H,

5. Merril CR, Wu A, Olde В., Moreno RF. Complementary DNA sequencing: expressed sequence tag and human genome project // Science, 1991, v. 252, p. 16511656.

6. Ankerst J. and Jonsson N. Adenovirus type 9-iduced tumogenesis in the rat mammary gland related to sex hormonal state // J. Nat. Cancer Inst., 1989, v. 81, p. 294-298.

7. Bashir R., Keers S., Strachan Т., Passos-Bueno R., Zatz M., Weissenbach J., Le Paslier D., Meisler M., Bushby K. Genetic and physical mapping at the limb-girdle muscular dystrophy locus (LGMD2B) on chromosome 2p.l3 // Genomics, 1996, v. 33 (1), p.46-52.

8. Boyd J., Parmley R., Langevin A., Saldivar V. Neuroblastoma presenting as acute monoblastic leukemia // J. Pediatr. Hematol. Oncol., 1996, v. 18 (2), p. 206-212.

9. Boyd J. Adenovirus E1B 19 кД and Bel-2 proteins interact with a common set of cellular proteins // Cell, 1994, v. 79 (6), 1121-1124.

10. Boyer J., Rohleder K., Ketner G. Adenovorus E4 34кД and E4 11кД inhibit double strand break repair and phisically associated with the celluler DNA-dependet protein kinase // Virology, 1999, v. 263(2), p. 307-312.

11. Braun S. Adenoviridae // In: Principles and practice of infectious diseases, 2 ed. NY, 1984,1353-1361.

12. Brige E., Ketner G. Redundant control of adenovirus late gene expression by early region4 // J. Virol., 1989, v. 263, p. 307-312.

13. Bridge E, Pettersson U. Nuclear organization of replication and gene expression in adenovirus-infected cells // Curr Top Microbiol Immunol., 1995, v. 199, p. 99-117.

14. Brough D.E., Hsu C., Kulesa V.A, Lee G.M., Cantolupo L.J., Lizonova A., Kovesdi I. Activation of trnsgene expression for high level of persistent transgene expression from adenovirus vectors in vivo // J. Virol., 1997, v. 363, p. 9206-9213.

15. Carvalho Т., Seeler J., Ohman K., Jordan P., Petterson U., Akusjarvi G., Carmo Foseca M., Dejean A. Targeting of adenovirus E1A and E40RF3 proteins to nuclear matrix-associeted PML-bodies // J. Cell. Biol., 1995, v. 131, p. 45-56.

16. Cathomen T, Weitzman MD. A functional complex of adenovirus proteins E1B-55kDa and E4orf6 is necessary to modulate the expression level of p53 but not its transcriptional activity// J Virol, 2000,v. 74, p. 11407-12.

17. Chinnadurai G. Control of apoptosis by human adenovirus genes // Seminars in Virology, 1998, v. 8, p. 399-408.

18. Chiou S.-K., White E. рЗОО binding by E1A cosegregates with p53 indaction but is dependable for apoptosis // J.Virol., 1997, v. 71, p. 3515-3525.

19. Debbas M., White E. Wild-type p53 mediates apoptosis by E1A, which is inhibited by E1B//Genes Dev., 1993, v. 7, p. 546-554.

20. Dix I., Leppard K. Expression of adenovirus type 5 E4 Orf2 protein during lytic infection//J. Gen. Virol., 1995, v. 76, p. 1051-1055.

21. Dix I., Leppard K. Regulated splicing of adenovirus type 5 E4 transcripts and regulated cytoplasmic accumulation of E4 mRNA // J. Virol., 1993, v. 67, p. 32263231.

22. Dyson, N., Harlow E. Adenovirus E1A targets key regulators of cell proliferation // CancerSurv., 1992, v. 12, p. 161-195.

23. Dobbelstein M., Roth J., Kimberly W., Levine A., Shenk T. Nuclear export of the E1B 55кД and E4 34кД adenoviral oncoproteins mediated by a rev-lake signal sequence // EMBO J., 1997, v. 16, p 4276-4284.

24. Dobner Т., Horikoshi N., Rubenwolf S., Shenk T. Blockage by adenovirus E4orf6 of transcriptional activation by the p53 tumor suppressor // Science, 1996, v. 272, p. 1470-1473.

25. Doucas V.The promeilotic (PML) nucler compartment and transcription control // Biochem. Pharmacol., 2000, v. 60, 1197-1201.

26. Doucas V., Ishov A., Romo A., Jugulon H., Weitzman M., Evans R., Maul G. Adenovirus replicaition is coupled with the dramatic properties of the PML nucler structure // Genes. Dev., 1996, v. 10, p. 196-207.

27. Doucas V., Tini M., Egan D., Evans R.M. Modulation of CREB biding protein function by the promeilotic (PML) oncoprotein suggests a role for nucler bodies in hormon signaling // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1999, v. 96 p. 2627-2632.

28. Enter C. Unpublished data.

29. Everett R.D., Earnshaw W.C., Pluta A.F., Stensdorf Т., Ainsztein A.M., Carmena M., Ruchaud S., Hsu W.L., Orr A. A dinamic conection between centromers and ND10 proteins // J. Cell Sci., 1999, v. 112, p. 3443-3454.

30. Everett R.D., Lomonte P., Stensdorf Т., Driel R., Orr A. Cell cycle regulation of PML mpdification and ND10 composition // J. Cell Sci., 1999, v. 112, p. 4581-4588.

31. Fanning A. and Anderson J. PDZ domains: fundamental building blocks in the organization of protein complexes at the plasma membrane //j. Clin. Invest., 1999, v. 103, p. 767-772.

32. Ferbeyre G., Stanchina E., Querudo E., Baptiste N., Prives C., Lowe S.W. PML is induced by oncogenic ras and promotes premature senescence // Genes and Develop., 2000, v. 14, p. 2015-2027.

33. Flint J, Shenk T. Adenovirus E1A protein paradigm viral transactivators // Annu Rev Genet, 1989, v 23, p.141-61.

34. Freyer G., Katoh Y., Roberts R. Characterization of the major mRNAs from adenovirus 2 early region 4 by cDNA cloning and sequencing // Nucleic. Acid Res., 1984, v. 12, p. 3503-3519.

35. Ganzalez IL, Sylvester JE. Incognito rRNA and rDNA in databases and libraries// Genome Res., 1997, v.7, p. 65-70

36. Gardiol D., Kuhne C., Glaunsinger В., Lee S.S., Javier R.T., Banks L. Oncogenic human papillomavirus E6 oncoproteins taget the discs large tumour suppressor for proteosom-mediated degradation // Oncogene, 1999, v. 18 (46), p. 5487-5496.

37. Gemund C, Ramu C, Altenberg-Greulich B, Gibson TJ. Gene2EST: a BLAST2 server for searching expressed sequence tag (EST) databases with eukaryotic gene-sized queries // Nucleic Acids Res., 2001, v 29(6), p. 1272-1277.

38. Glaunsinger В., Lee S.S., Thomas M., Banks L., Javier R.T. Interaction of the PDZ-protein MAGI-1 with adenovirus E4-ORF1 and high-risk papillomavirus E6 oncoproteins // Oncogene, 2000, v. 19 (46), p. 5270-80.

39. Glos V, Kreinkamp HJ, Hausmann Y, Richter D. Charakterization of the 5'- flaking promoter region of the rat somatostatin receptor subtype 3 gene // FEBS Lett, 1998, v. 440, p. 33-37

40. Graham F. Transformation by and oncogenicity of human adenovirus // In: Ginsberg H. (Ed.). The Adenoviruses, 1994, Plenum Press, New York, p. 339-398.

41. Graham F., Smiley J., Russell W., Nairn R. Characteristics of a human cell line transformrd by DNA from human adenovirus type 5 // J. Gener. Virol., 1977, v. 36, p. 59-72.

42. Grimwade D. The patogenesis of acute promyelotic leukamia // British J. of Hemat., 1999, v. 106,p.591-613.

43. Hashimoto S, Ishii A, Yonehara S. The Elb oncogene of adenovirus confers cellular resistance to cytotoxicity of tumor necrosis factor and monoclonal anti-Fas antibody // Int Immunol, 1991, v. 3(4), p. 343-51.

44. Hess J.L., Korshmeyer S.J. Life, death and nuclear spots // Nature genetics, 1988, V. 20. p. 220- 222.

45. Horridge J., Leppard K. RNA-biding activity of the E1B 55-kilodalton protein from human adenovirus type 5 // J. Virol., 1998, v.72, p. 9374-9379

46. Horwitz M.S. Adenoviruses// In: Fields B.N., Knipe D.M., Howeley P.M. (ed.), Fields of Virology, 1996, vol 2, Lippincott, Pholadelphia, PA, p. 2149-2171.

47. Imperiale M.J., Akcusjarvi G., Leppard K.N. Posttranskriptional control of adenovirus gene expression // In: W.Doerflaer and Bohm (ed.), The moleculer repertoire of adenovirus, Springer, Berlin. 1995, p. 131-171.

48. Hashimoto S., Ishii A., Yonehara S. Tumor induction by human adenovirus type 12 in hamsters: loss of the viral genome from adenovirus type 12-induced tumor cells is compatible with tumor formation // EMBO J., 1982, v. 1(1), p. 79-86.

49. Halbert D., Cutt J., Shenk T. Adenovirus erly region 4 encodes functions required for efficient DNA replication, late gene expression and host cell shutoff // J. Virol., 1985, v. 56, p. 250-257.

50. Hay R., Freeman A., Leith I., Monaghan N.,Webster A. Molecular interactions during adenovirus DNA replication // Curr. Top. Microbiol. Immunol., 1995, v. 199(11), p. 31-48.

51. Hilton AA, Slavin AJ, Hilton DJ, Bernard CC. Characterization of cDNA and genomic clones ecoding human myelin oligodendrocyte glicoprotein // J Neurochem., 1995, v. 65, p. 309-318

52. Horwitz A., Marshall S. Adenovuses // Fields Virology, third edition edited by B. N. Fields, D. M. Knipe, et al., 1996, Chapter 68, p 2149-2176.

53. Huang M., Hearing P. Adenovirus early region 4 encodes two gene products with redundant effects in lytic infection // J. Virol., 1989, v. 63, p. 2605-2615.

54. Jang W., Weber J., Bashir R., Bushby K., Meisler M. Aupl, a novel gene on mouse chromosome 6 and human chromosome 2pl3 // Genomics, 1996, v. 36(2), p. 366368.

55. Javier R. Adenovirus type 9 E4 open reading frame 1 ecodes a transforming protein required for the producion of mammary tumors in rats // J. of Virol., 1994, v. 68, p. 3917-3924.

56. Javier R., Raska J., Macdonald G., Shenk T. Human adenovirus type 9-induced rat mammary tumors // J. of Virol., 1991, v. 65, p.3192-3202.

57. Javier R., Raska J., Shenk T. Requirement for adenovirus type 9 E4 region in production of mammary tumors // Science, 1992, v. 257, p. 1267-1271

58. Jones J., Albin R., Feldman E., Simin K., Schuster Т., Dunnick W., Collins J., Chrisp C., Taylor В., Meisler M. mnd2: a new mouse model of inherited motor neuron disease // Genomics, 1993, v. 16(3), p. 669-677.

59. Kleinberger Т., Shenk T. Adenovirus E4orf4 protein binds to protein phosphatase 2A, and the complex down regulates ElA-enhanced junB transkription // J. Virol., 1993, v. 67, p. 7556-7560.

60. Koning C., Roth J., Dobbelstein. Adenovirus type 5 E4orf3 protein relieves p53 inhibition by ElB-55-кД oncoprotein // J. Virol., 1999, v.73, p. 2253-2262.

61. Kozak M. Interpreting cDNA sequences: some insights from stadies on translation // Mamm Genome, 1996, v. 7, p. 563-574

62. Kratzer F., Rosorius O., Heger P., Hirschmann N., Dobner Т., Hauber J., Stauber R. The adenovirus type 5 E1A55K oncoprotein is highly active shuttle protein and shutting is independent of E4orf6, p53 and Mdm2 // Oncogine, 2000, v. 19, p. 850857.

63. Kovar H. E1A and the Ewing tumor translocation // Nat Med., 1999, v. 5(12), p. 1331.

64. Kovar H, Fallaux F., Pribill I., Jugovic D., Bartl S., Ambros P., Aryee D., Wiegant J., Hoeben R. Adenovirus El A does not induce the Ewing tumor-associated gene fusion EWS-FLI1 // Cancer Res., 2000, v. 60(6), p. 1557-1560.

65. Kuhlmann I., Achten S., Rudolph R. Doerfler W. Tumor induction by human adenovirus type 12 in hamsters: loss of the viral genome from adenovirus type 12-induced tumor cells is compatible with tumor formation // EMBO J., 1982, v. 1(1), p. 79-86.

66. Lavoie JN, Champagne C, Gingras MC, Robert A. Adenovirus E4 open reading frame 4-induced apoptosis involves dysregulation of Src family kinases // J Cell Biol., 2000, v. 150(5), p. 1037-56.

67. Lavoie J.N., Nguyen M., Marcellus R.C., Branton P.E., Shore G.C. E4orf4, a novel adenovirus death factor that induces p53-independent apoptosis by pathway that is not inhibited by zVAD-fmk // J. Cell Biol., 1998, v. 140, p.637-645.

68. Lee S.S., Glaunsinger В., Mantovani F., Banks L., Javier R.T. Multi-PDZ domein protein MUPP1 is a cellular target for both adenovirus E4 ORF1 and high-risk papillomavirus type 18 E6 oncoproteins // J. of Virol., 2000, p. 9680-9693.

69. Lee S.S., Weiss R.S., Javier R.T. Binding of human virus oncoproteins to hDlg/SAP97, mammalian homolog of the Drosofila discs large tumor suppressor protein // Protoc. Natl. Acad. Sci. USA, 1997, v. 94, p. 6670-6675.

70. Leppard E4 gene function in adenovirus, adenovirus vector and adenoassociated virus infections // J. of General Virology, 1997, v. 78, p. 2131-2138.

71. Leppard K., Everett R. The adenovirus type 5 Elb 55 кД and E4 Orf3 proteins associete in infected cells and affect ND10 components // J. of General Virology, 1999, v. 80, p. 997-1008.

72. Liang F, Holt I., Pertea G, Karamycheva S, Salzberg SL, Quackenbush J. Gene index to human genome: an assessment of the nature of higththroughput EST sequence data // Genome Res., 2000, v. 6, p. 829-845

73. Lialo D., Yu A., Weiner A. Coexpression of the adenovirus 12 E1B 55 кД oncoprotein and cellular tumor suppressor p53 is sufficient to induce metaphase fragility of the human RNU2 // locus. Virology, 1999 , v. 254, p. 11-23

74. Maul G.G. Nucler domain 10, the site of DNA virus transcription and replication // BioEssays, v. 20, p. 660-667.

75. McCurrach M., Connor Т., Knudson C., Korsmeyer S., Lowe S. bax-deficiency promotes drug resistans and oncogenic transformation by attenuation p53-dependent apoptosis // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1997, v. 94, p. 2345-2349.

76. Marcellus R.C., Lavoe J.N., Boivin D., Shore G.C., Ketner G., Branton P.E. The early region 4 protein of human adenovirus type 5 induces p53-independent cell death by apoptosis // J. Virol., 1998, v. 72, p.7144-7153.

77. Marcellus R.C., Teodoro J.C., Wu Т., Brough D.E., Ketner G., Shore G.C., Branton P.E. Adenovirus 5 early region 4 is responsible for ElA-induced p53-independent apoptosis // J. Virol., 1996, v. 70, p. 6207-6215.

78. Marengo C., Mbikay M., Weber J., Thirion J. Adenovirus-induced mutations at the hypoxanthine phosphoribosyltransferase locus of Chinese hamster cells // J. Virol., 1981, v. 38(1), p. 184-190.

79. Matera A.G. Nucler bodies: multifaceted subdomains of the interchromatin space // Trends in Cell Biol., 1999, v. 9, p. 302-309.

80. Medghalchi S.,Padmanabhan R., Ketner G. Early region 4 modulates adenovirus DNA replication by two separable mehanisms // Virology, 1997, v. 236, p. 8-17

81. Moore M., Horikoshi N., Shenk T. Oncogenic potential of the adenovirus E4orf6 protein // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1996, v. 93 p. 11295-11301.

82. Morgan E. DNA tumor virus transforming proteins and cell cycle // Cur. Opin. Genet. Dev., 1993, v. 3, p. 63-70.

83. Morgan E. and Matthews M.B. Multiple functional domains in the adenovirus E1A gene// Cell, 1987, v. 48, p. 177-178.

84. Miller C, Gurd J, Brass A. A RAPID aligorithm for sequence database comparisons: application to the identification of vector contamination in the EMBL databases // Bioinformatics, 1999, v. 15, p. 111-121.

85. Muller S., Dejean A. Viral Immediate-erly proteins abrogate the Modification by SUMO-1 of PML and SplOO proteins, correlating with nucler body disruption // J. Virol., 1998, v. 73, p.5137-5143.

86. Muller U., Kleinberger Т., Shenk T. Adenovirus E40RF4 protein reduce phosphorylation of c-Fos and El A proteins while simultaneously reducing the level of AP-1 // J. Virol., 1992, v. 66, p.5876-5878.

87. Nevis, Vorgt, Adenovirus // Fields Virology, third edition edited by B. N. Fields, D. M. Knipe, et al., 1996, Chapter 2, p. 301-343

88. Nicolas A., Munz P., Flck-Pedersen E., Young C. Creation and repeir of specific DNA doubel-strand breaks in vivo following infection with adenovirus vectorsexpressing Saccharomyces cervisiae HO endonuclease // Virology, 2000, v. 266, p. 211-224.

89. Nevels M., Rubenwolf S., Spruss Т., Wolf H., Dobner T. The adenovirus E4orf6 protein can promote E1A/EIB-induced focus formation by interfering with p53 tumor supressor function // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1997, v. 94, p. 1206-1211.

90. Nevels M., Rubenwolf S., Spruss Т., Wolf H., Dobner T. Two distinct activities contribute to the oncogenic potential of the adenovirus type 5 E4orf6 protein // J. Virol., 2000, v. 74,5168-5181.

91. Nevels M., Spruss Т., Wolf H., Dobner T. The adenovirus E4orf6 protein contributes to malignant transformation by antagonizing ElA-induced accumulation of the tumor supressor protein p53 // Oncogene, 1998, v 18, p. 9-17.

92. Nevels M., Tauber В., Kremmer E., Spruss Т., Wolf H., Dobner T. Transforming potential of the adenovirus type 5 E4orf3 protein // J. Virol., 1999, v. 73, p. 15911600.

93. Nevels M., Tauber В., Kremmer E., Spruss Т., Wolf H., Dobner T. "Hit-and-run" transformation by adenovirus oncogenes // J Virol., 2001, v. 75, p. 3089-94.

94. Nordqvist K., Akusjarvi G. Adenovirus erly region 4 stimulated mRNA accumulation via 5' introns // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1990, v. 87, p. 9543-9547.

95. Nordqvist K., Ohman K., Akusjarvi G. Human adenovirus encodes two proteins which have opposite effects on accumulation of alternatively spliced m RNAs // Mol. Cell. Biol., 1994, v. 14, p. 437-445.

96. O'Connor R. and Hearing P. The E40RF6/7 protein functionally compensates for the loss of E1A expression in adenovirus infection // J Virol., 2000, v. 74, p. 5819-5824.

97. O'Connor M.J., Zimmerman H., Nielsen S., Bernard H-U., Kouzarides T. Charactirization of an E1A-CBP interaction defenes a novel transcription adapter motif (TRAM) in CBP/p300 // J Virol., 1999, v. 73, p. 3574-3581.

98. Orlando J.S., Ornelles D.A. An argine-faced amphipathic alpha helih is required for adenovirus tupe 5 e4orf6 protein function // J Virol., 1999, v. 73, p. 4600-4610.

99. Ornelles D., Shenk T. Localization of adenovirus erly region IB 55-kilodalton protein during lytic infection: association with nuclear viral inclusions requires the early region 4 34-кД protein // J Virol., 1991, v. 65, p. 434-429.

100. Prez D., White E. E1B 19 кД inhibits Fas-mediated apoptosis through FADD-depended sequestration of FLICE // J. Cell. Biol., 1998, v. 141, p. 1255-1266.

101. Querido, E., Marcellus R.C., Lai A., Charbonneau R., Teodoro J.G., Ketner G., Branton P.E. Regulation of p53 levels by E1B 55кД protein and E40rf6 in adenovirus-infected cells // J Virol., 1997a, v. 71, p. 3788-3798.

102. Querido, E., Teodoro J.G., Branton P.E. Accumulation of p53 induced by the adenovirus El A protein requires regions involved in the stimulation of DNA synthesis // J. Virol., 19976, v. 71, p. 3526-3533.

103. Quignon F., De Bels F., Koken M., Feunteun J., Ameisen J-C., de The H. PML induces a novel caspase-independent death process // Nature Genet., 1998, v. 63, p. 297-304.

104. Ramalingam R., Rafii S., Worgall S., Brough D., Crystan R. E4-E4+ adenoviral gene transfer vectors function as a "pro-life" signal to promote survival of primary human endotelian cells // Blood, 1999 a, v. 93, p. 2936-44.

105. Ramalingam R., Rafii S., Worgall S., Hacket N., Crystan R. Indaction of endogenus genes following infection of human endotelian cells with an E4-E4+ adenoviral gene transfer vectors // J. Virol, 1999 6, v. 73, p.10183-10190.

106. Roulston A.R., Marcellus R.C., Branton P.E. Viruses and apoptosis // Annu. Rev. Microbiol., 1999 v. 53, p. 577-628.

107. Ruggero, Wang, Pandolfi The puzzling multiple lives of PML and its role in genesis of cancer// BioEssays, 2000, v. 22, p. 827-835.

108. Sandler A., Ketner G. Adenovirus early region 4 is essential for normal stabilyty of late nuclear RNAs // J. Virol., 1989, v. 63, p. 624-630.

109. Sarnow P., Ho S., Williams J., Levine A.J. Adenovirus E1B 55 кД tumor agent and SV40 lardge tumor antigen are fiscally associated with the same 54кД cellular protein in transformed cells // Cell, 1982, v. 28, p. 387-394.

110. Schaley J., O'Connor R. J., Taylor L.J., Bar-Sagi D., Hearing P. Induction of the cellular E2F-1 promoter by the adenovirus E4orf6/7 protein // J. Virol., 2000, v. 74(5), p. 2084-2093.

111. Seeler J-S.,and Dejean A. The PML nuclear bodies:actors or extras? // Curr. Opin. In Genetics and Dev., 1999, v.9, p. 362-367.

112. Shenk T. Adenoviridae: The Viruses and Their Replication // In: Fields Virology, third edition edited by B. N. Fields, D. M. Knipe, et al., 1996, Chapter 67, p.2111-2148.

113. Shiroki K., Hashimoto S., Saito I., Fukui Y., Kato H., Shimojo H. Expression of E4 genes is required for establishment of soft-agar colony-forming rat cells transformsd by the adenovirus 12 El gene // J. Virol., 1984, v. 50, p. 854-863.

114. Soule H., Vazguez J., Long A., Albert S., Brennan M. A human cell line from a pleural effusion derived from a breast carcinoma // J Natl Cancer Inst., 1973, v. 51(5), p. 1409-1416.

115. Sterndorf Т., Grotzinger Т., Jensen K., Will H. Nuclear dots: actors of many stages // Immunobiol., 1997, v. 198, p. 307-331.

116. Takemori N., Riggs J and Aldrich C. Genetic studies with tumorgenic adenoviruses. I. Isolation of cytocidal (cyt) mutans of sdenovirus type 12 // Virology, 1968, v.36, p. 575-586.

117. Tamrakar S, Rubin E, Ludlow JW. Role of pRB dephosphorylation in cell cycle regulation // Front Biosci., 2000, v. 5, p. 121-137.

118. Teodoro, J.G., Branton P.E. Regulation of apoptosis by viral gene products // J.Virol., 1997, v. 71, p. 1739-1746.

119. Teodoro J., Shore G., Branton P. Adenovirus E1A proteins induce apoptosis by both p53-dependet and p53-independent mechanisms // Oncogene, 1995, v. 11, p. 467- 474.

120. Thomas D., Shin В., Jang В., Vogel H., Ross M., Kaplitt M., Shenk. Т., Javier R. Early region 1 transforming functions are dispensable for mammaty tumogenesis by human adenovirus type 9 // Virology, 1999 v. 73, p.3071-3079.

121. Thomas D., Schaack J., Vogel H., Javier R. Several E4 region functions influence mammaty tumogenesis by human adenovirus type 9 // J. Virol., 2001, v. 75, p.557-568.

122. Toeuber В. Unpublished data.

123. Toeuber B. and Dobner T. Molecular regulation and biological function of adenovirus early genes: the E4 ORFs // Gene, 2001, v. 278, p. 1-23

124. Tollefson A.E., Herminson T.W., Lichtenstein D.L., Colle C.F., Tripp R.A., Dmitrov Т., Toth K., Wells C.E., Doherty P.C., Wold W.S.M. Forced degradeition of Fas inhibitors apoptosis in adenovirus infected cells // Nature, 1998, v. 392, p. 726730.

125. Turnell AS, Grand RJ, Gorbea C, Zhang X, Wang W, Mymryk JS, Gallimore PH. Regulation of the 26S proteasome by adenovirus E1A // EMBO J, 2000, v. 19(17), p. 4759-73.

126. Ullmer C., Schmuck K., Figge A., Lubbert H. Cloning and haractirization of MUPP1, a novel PDZ domain protein // FEBS Lett., 1998, v. 424, p. 63-68.

127. Weber J., Jang W., Simin K., Lu W., Yu J., Meisler M. High-resolution genetic, physical, and transcript map of the mnd2 region of mouse chromosome 6 // Genomics, 1998, v. 54(1), p. 107-115

128. Weinberg, Ketner A., Cell line that supports the growth of defective early region 4 deletion mutant of human adenovirus type 2 // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1983, v. 80, p. 5583-5386.

129. Weiden M., Ginsberg S., Deletion of the E4 region of the genome produces adenovirus DNA cocatomers // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1994, v. 91, p. 153-157.

130. Weiss R.S. and Javier R.T. A carboxy-terminal region required by the adenovirus type 9 E4 ORF1 oncoprotein for transformation mediates direct binding to cellular polypeptides // J. virol., 1997, v. 71, p. 7873- 7880.

131. Weiss R., McArthur M., Javier T. Human adenovirus type 9 E4 orfl encodes a cytoplasmik transforming protein capable of increasing the oncogenicity of CREF cells // J. Virol., 1996, v. 70, p. 862-872.

132. Weiss R.S., Gold M.O., Vogel H., Javier R.T. Mutant adenovirus type 9 E4 ORF1 genes define three protein region required for transformation of CREF cells // J. Virol., 1997 (a), v. 75, p. 4385-4394.

133. Weiss R.S., Lee S.S., Prassad B.V.V., Javier R.T. Human adenovirus type 9E4 openg reading fraime 1 genes encode grouthing transforming proteins that may be distantly related to dUTP pyrofosfatase enzymes // J. Virol., 1997 (6), v. 71, p. 1857-1870.

134. Westphal R.S. and Sandres-Bush E. Differnces in agonist-independed and -depended 5-hidroxytryptomine 2C receptor-mediated cell division // Mo;. Pharmacol., 1996, v. 49, p 474-480.

135. White E. Regulation of apoptosis by adenovirus El A and E1B oncogenes // Seminar of Virology, 1999, v. 8, p. 505-5013.

136. White E., Gooding L.R. Regulation of apoptosis by human adenoviruses // In Apoptosis: The Molecular Basis for Cell Death II, 1994, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, p. 111-141.

137. Whyte P., Buchkovich K.J., Horwitz J.M., Friend S.H., Raybuck M., Weinberg R.A., Harow W. Association between an oncogene and antioncogine: the adenovirus E1A proteins bind to the retinoblastoma gene product // Nature, 1988, v. 334, p. 124-129.

138. Wienzek S. and Dobbelstein M. Viral and cellular factors that target the promyelocytic leucemia oncogenic domains strongly activate a glucocorticoid-responsive promoter// J. Virol., 2001, v. 75, p. 5391-5397.