Создание новых векторных систем на основе рекомбинантного аденовируса человека с генетически модифицированным капсидным белком IX

Рогожин, Василий Николаевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Создание новых векторных систем на основе рекомбинантного аденовируса человека с генетически модифицированным капсидным белком IX
ВАК РФ 03.01.06, Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации по теме "Создание новых векторных систем на основе рекомбинантного аденовируса человека с генетически модифицированным капсидным белком IX"

РОГОЖИН Василий Николаевич

Создание новых векторных систем на основе рекомбинантного аденовируса человека с генетически модифицированным капсидным белком IX

03.01.06 - биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

06.02.02 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

- 8 ДЕК 2011

Москва-2011

005003778

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии им. К.И. Скрябина» (ФГБОУ ВПО МГАВМиБ) и Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф, Гамалеи» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации (ФГБУ «НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздравсоц-развития России).

Научные руководители: доктор ветеринарных наук, профессор

Белоусова Раиса Васильевна; доктор биологических наук, профессор Народицкий Борис Савельевич

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Тихонов Игорь Владимирович; доктор биологических наук, профессор Шилов Илья Александрович

Ведущая организация: ГУ «Научно-исследовательский институт вирусологии им. Д.И.Ивановского» РАМН.

Защита состоится » скЗХ&Зуьф 2011 года в часов на заседании

диссертационного совета Д 220.042.01 в ФГБОУ ВПО МГАВМиБ по адресу: 109472, Москва, ул. Академика Скрябина, 23. Тел. (495) 377-93-83.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБОУ ВПО МГАВМиБ.

Автореферат разослан 2011 г. и размещен на сайте

http://www.vak.ed.gov.ru.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук,

профессор

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В настоящее время векторные системы на основе рекомбинантного аденовируса человека серотипа 5 (Ад5) являются одними из наиболее широко используемых средств доставки генетической информации в клетки млекопитающих и человека. К преимуществам таких векторов относятся: их способность проникать как в делящиеся, так и в неделящиеся клетки; аденовирусная ДНК не встраивается в геном клетки-хозяина и остается в экстрахромосомной форме; аденовирусы могут быть получены в титре более Ю10 БОЕ/мл, что позволяет использовать их в качестве живых рекомбинантных вакцин; и наконец, обеспечение высокого уровня экспрессии целевого гена в клетке-мишени.

Однако технология получения готового препарата аденовирусного вектора, в целом, а также сама векторная система на основе Ад5, в частности, не лишена недостатков. Наиболее существенными из них являются:

- отсутствие технологически простой и эффективной методики очистки и концентрирования аденовирусного препарата, готового к непосредственному применению в медицине или ветеринарии;

- невысокая эффективность трансдукции данными векторами некоторых типов опухолевых клеток человека и млекопитающих.

Устранение этих недостатков возможно путем конструирования рекомбинантных аденовирусов с модифицированным капсидом. Перспективным направлением модификации капсида аденовируса является модификация минорного кап-сидного белка IX (pIX). Преимущества модификации pIX заключаются в следующем: возможность встраивания к С-концу pIX относительно крупных пептидных фрагментов, высокая структурная совместимость pIX с внедряемыми лигандами, широкий спектр возможных направлений использования модификаций pIX.

Проблема невысокой эффективности проникновения аденовирусного вектора в некоторые типы опухолевых клеток объясняется тем, что первичным рецептором для связывания вириона Ад5 с поверхностью клетки является коксакивирусный-аденовирусный рецептор (CAR), высокий уровень экспрессии которого имеют не все типы опухолевых клеток. В связи с высокими темпами роста количества онкологически больных людей и животных в последние годы, создание аденовирусного

вектора, эффективно доставляющего генетическую информацию в опухолевые клетки с целью противоопухолевой терапии и диагностики, является актуальной научной задачей.

В связи с широким использованием векторов на основе аденовирусов в научной практике и медицинских исследованиях, в настоящее время активно создаются вЬР и вМР производства для получения препаративных количеств аденовируса. В этой связи особенно актуальной является не только задача конструирования и получения рекомбинантных Ад5, но и разработка эффективных методов очистки и концентрирования Ад5.

Существующие сегодня способы очистки рекомбинантных Ад5 обладают следующими недостатками:

- использование для очистки рекомбинантных аденовирусов ионообменной и эксклюзионной хроматографии не позволяет использовать исходный клеточный лизат с аденовирусом, а сам способ очистки является многоступенчатым.

- метод ультрафильтрации не может быть отдельно использован для очистки аденовирусного препарата из клеточного лизата, так как процесс ультрафильтрации не является абсолютным и не позволяет полностью освободиться от массы балластных белков.

В связи с вышеизложенным, наиболее удобным и эффективным представляется способ, позволяющий непосредственно использовать клеточный вируссодер-жащий лизат для очистки аденовирионов и получать чистый препарат аденовируса на выходе, готовый к применению. Разработка такого способа очистки рекомбинантных аденовирусов представляет самостоятельный научный интерес.

Цель исследований - создание рекомбинантных аденовирусных векторов с различными модификациями капсидного белка IX для усовершенствования очистки рекомбинантных аденовирусов и для повышения эффективности проникновения рекомбинантных аденовирусных векторов в опухолевые клетки.

В процессе выполнения работы предстояло решить следующие задачи:

1. Получить капсид-модифицированные вирусные векторы на основе реком-бинантного аденовируса человека 5 серотипа, экспонирующие на поверхности капсида различные углевод-связывающие домены гликозилгидролаз в составе аденовирусного белка IX.

2. Определить способность полученных модифицированных аденовекторов с углевод-связывающими доменами специфически связываться с соответствующими полисахаридными субстратами.

3. Подобрать условия элюирования капсид-модифицированных аденовирусов с углевод-связывающими доменами, адсорбированных на полисахаридном субстрате, и разработать способ аффинной очистки модифицированных аденовирусов с углевод-связывающими доменами в препаративных количествах из культураль-ного препарата на полисахардных носителях.

4. Получить рекомбинантные аденовирусы человека серотипа 5, несущие в составе капсидного белка IX последовательность лейцинового зиппера, способные адсорбировать на поверхности рекомбинантные наноантитела.

5. Определить эффективность доставки генетической информации аденовек-торами с лейциновыми зипперами, нагруженными наноантителами против опухо-леспецифического рецептора СБА, в опухолевые клетки in vitro.

Научная новизна. Впервые получены рекомбинантные аденовирусы человека серотипа 5, несущие в составе капсидного белка IX целлюлозо-связывающие и декстран-связывающие домены. Доказано, что углевод-связывающие домены экспонированы над поверхностью капсидов полученных рекомбинантных аденовирусов, а для аденовируса с целлюлозо-связывающими доменами в составе pIX впервые показана способность специфически связываться с волокнами аморфной целлюлозы.

Разработан новый способ аффинной очистки р1Х-модифицированных аденовирусных векторных систем с целлюлозо-связывающими доменами на целлюлозном носителе. Показана высокая эффективность нового способа очистки аденовекторов в получении чистого, биологически активного препарата аденовируса.

Впервые получены рекомбинантные аденовирусы человека серотипа 5, несу-

щие в составе капсидного белка IX последовательность лейцинового зиппера. На моделях культур клеток аденокарциномы легких человека (линия А549) и карциномы толстой кишки человека (линия 1лт1215) показано, что рекомбинантный аденовирусный вектор, содержащий репортерный ген зеленого флуоресцирующего белка (БОБР), с лейциновыми зипперами в составе белка IX, нагруженный наноан-тителами против опухолеспецифического рецептора СБА, способен к эффективному проникновению в опухолевые клетки человека САЯ-независимым путем.

По результатам работы подана заявка на получение патента Российской Федерации № 2011123472/10(034727) от 09.06.2011 «Способ очистки рекомбинантных аденовирусов млекопитающих и человека» и получено уведомление о положительном результате формальной экспертизы от 05.07.2011 года.

Практическая значимость. Плазмидная технология модификации гена капсидного белка IX аденовируса человека серотипа 5 внедрена в работу лаборатории молекулярной биотехнологии ФГБУ «НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздравсоц-развития России для получения рекомбинантных аденовирусов с различными модификациями белка IX. Коллекция полученных рекомбинантных аденовирусов: Аа5ЕОРР-р1Х-СВО, Аё5ЕОРР-р1Х-БВВ и Ас15ЕОРР-р1Х-21ррег хранится в вирусном музее лаборатории молекулярной биотехнологии ФГБУ «НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздравсоцразвития России.

По результатам научно-исследовательской работы разработаны «Методические положения по использованию аффинной очистки в производстве рекомбинантных аденовирусных векторов с генетически модифицированным капсидным белком IX», утвержденные на заседании секции отделения ветеринарной медицины Российской академии сельскохозяйственных наук «Ветеринарная биотехнология» (протокол № 2 от 20 октября 2011г.), которые могут быть использованы в научных, учебных и производственных целях.

Разработанный способ аффинной очистки векторных систем на основе р1Х-модифицированных рекомбинантных аденовирусов человека серотипа 5 используется в лаборатории молекулярной биотехнологии ФГБУ «НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздравсоцразвития России для очистки препаративных количеств рекомбинантных аденовирусных векторов.

Личный вклад соискателя. Автор непосредственно получил рекомбинант-ные аденовирусные вектора с модифицированным р1Х, разработал и оптимизировал технологию очистки р1Х-модифицированных аденовирусных векторов, исследовал проникающую способность модифицированного аденовектора с лейцино-вым зиппером в составе р1Х в опухолевые клетки человека, проанализировал, обобщил и интерпретировал полученные результаты, сформулировал выводы и рекомендации по дальнейшему применению разработанной технологии очистки и полученных аденовектров. Электронная микроскопия образцов аденовирусов была выполнена совместно с д.б.н. Диденко Л.В., а цитофлуориметрия клеточного материала - совместно с к.б.н. Щебляковым Д.В. (ФГБУ «НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздравсоцразвития России).

Апробация работы. Результаты диссертационной работы были доложены на итоговых конференциях по результатам выполнения мероприятий за 2009 и 2010 годы в рамках приоритетного направления «Живые системы» ФЦП «Исследования и разработка научно-технического комплекса России на 2007-2012 гг.» (Москва, 2009, 2010), Международной научно-практической конференции «Достижения супрамолекулярной химии и биохимии в ветеринарии и зоотехнии» (Москва, 2008), V Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2009), IX Международном аденовирусном съезде (Венгрия, Добогоко, 2009).

Автор является победителем Всероссийского конкурса на лучшую научную работу среди студентов, аспирантов и молодых ученых ВУЗов Минсельхоза РФ по направлению «Биологические науки» (Москва-Брянск-Краснодар, 2011).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 научных работ, в том числе 3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК, 5 - в сборниках международных конференций и конгрессов.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 157 страницах машинописного текста и включает введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение результатов, выводы и список используемой литературы (321 источник, из которых 5 отечественных и 316 иностранных). Работа содержит 9 таблиц и 27 рисунков.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Рекомбинантные аденовирусные векторы, полученные с помощью эффективной технологии, основанной на гомологичной рекомбинации в E.coli, и содержащие модифицированный капсидный белок IX с целлюлозо-связывающими доменами, способны экспонировать их на внешней поверхности капсида и специфически связываться с волокнами аморфной целлюлозы.

2. Новый способ аффинной очистки р1Х-модифицированных аденовирусных векторных систем с целлюлозо-связывающими доменами на целлюлозном носителе позволяет получать чистый, биологически активный препарат аденовируса.

3. Полученные рекомбинантные аденовирусы человека серотипа 5, несущие в составе капсидного белка IX последовательность лейцинового зиппера, способны специфически адсорбировать на своей поверхности рекомбинантные наноантитела с комплементарными последовательностями лейциновых зипперов на С-конце.

4. Рекомбинантный аденовирусный вектор с лейциновыми зипперами в составе белка IX, нагруженный наноантителами против опухолеспецифического рецептора CEA, более эффективно проникает в опухолевые клетки человека in vitro в сравнении с аденовирусом без наноантител на поверхности капсида.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Работа выполнена в период с 2008 по 2011 годы на кафедре ветеринарной вирусологии ФГБОУ ВПО МГАВМиБ и в лаборатории молекулярной биотехнологии ФГБУ «НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздравсоцразвития РФ.

Электронная микроскопия образцов рекомбинантных аденовирусов проводилась совместно с лабораторией анатомии микроорганизмов ФГБУ «НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздравсоцразвития РФ. Скрининг опухолевых клеточных линий на предмет взаимодействия с рекомбинантными анти-СЕА-наноантителами проводился совместно с к.б.н. Тиллиб C.B. (ИБГ РАН).

В работе были использованы рекомбинантный аденовирус человека пятого серотипа Ad5EGFP, который содержал экспрессирующую кассету с репортерным геном зеленого флуоресцирующего белка (EGFP) под контролем промотора цито-мегаловируса человека, предоставленный с.н.с. Логуновым Д.Ю. (ФГБУ «НИИЭМ

им. Н.Ф. Гамалеи» Минздравсоцразвития РФ); лабораторные штаммы Escherichia coli DH5a (для трансформации и наращивания плазмидных конструкций) и BJ5183 (для проведения гомологичной рекомбинации между плазмидами, содержащими гомологичные последовательности нуклеотидов), линии клеток: 293-НЕК (клетки почки эмбриона человека, трансформированные Е1 -областью Ад5), А549 (адено-карцинома легких человека), Liml215 (аденокарцинома толстой кишки человека); плазмидные векторы: pspDBD и рТТЮ, содержащие гены декстран-связывающего домена гликозилгидролазы Lmesenteroides и целлюлозо-связывающего домена гидролазы A.thermophilum, соответственно, предоставлены к.б.н. Луниным В.Г. (ФГБУ НИИЭМ), стандартный плазмидный вектор pBssk SK(+) (Fermentas MBI, Литва), плазмидная система pGEM-T-Easy (Promega, США), pShuttle-CMV-EGFP и pAdEasy-1 (Stratagene, США). Плазмида p#24-ERzipper, содержащая нуклеотидную последовательность лейцинового зиппера, предоставлена к.б.н. Тиллиб С.В. (ИБГ РАН); коммерческие препараты специфических эндодезоксирибонуклеаз рестрикции и других ферментов фирм Fermentas MBI (Литва), Promega (США) и NE BioLabs (США); лабораторные животные: кролики породы Шиншилла, самцы (4 особи) 24-месячного возраста, массой 3,5-4 кг для получения иммунных сывороток.

Плазмидную ДНК очищали набором JETSTAR 2.0 Plasmid Midiprep Kit (Genomed, США). Трансфекцию клеток линии 293-НЕК проводили с применением реагента Metafectene™ Pro (Biontex, Германия). Синтез праймеров был выполнен в ООО «Синтол». Секвенирование генов проводилось в НПФ «Литех». Синтез гена модифицированного капсидного белка IX аденовируса, содержащего в С-концевой последовательности альфа-спиральный спейсер, был выполнен в ЗАО «Евроген».

Генно-инженерные манипуляции проводили по стандартным методам, изложенным в руководстве Maniatis, 1982. Все манипуляции, по работе с аденовирусами, проводили согласно Graham&Prevec, 1991.

Статистическую обработку результатов проводили с помощью программы STATISTICA.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Получение рекомбинантных аденовирусов человека серотипа 5,

экспонирующих на поверхности капсида целлюлозо-связывающие (CBD) и декстран-связывающне домены (DBD) в составе белка IX

Для введения на С-конец pIX последовательностей углевод-связывающих доменов - CBD и DBD, использовали синтетическую последовательность pIX с деле-тированным стоп-кодоном и последовательностью длиннейшей а-спирали аполи-попротеина человека Е4 в качестве спейсера, на С-конце которого расположен полилинкер с сайтами для эндонуклеаз рестрикции BamHI, Kpn2I, Notl, HindIII, Asel и Swal, позволяющий осуществлять присоединение целевых последовательностей.

Синтез нуклеотидной последовательности модифицированного pIX выполнен в ЗАО «Евроген». Данная последовательность содержалась в плазмидном векторе pBssk-pIX-mod.

Источниками последовательностей DBD и CBD служили плазмиды pspDBD и рТТЮ, соответственно, предоставленные к.б.н. Луниным В.Г. (ФГБУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи). Используя методы молекулярного клонирования, последовательности DBD и CBD отдельно клонировали в плазмидный вектор pBssk-pIX-mod.

Из полученных плазмидных конструкций выделяли фрагменты модифицированного pIX, содержащего на С-конце последовательность декстран-связывающего (DBD) и целлюлозо-связывающего (CBD) доменов соответственно, которые затем были по отдельности клонированы в вектор pShuttleCMV-EGFP, содержащий фрагменты генома рекомбинантного аденовируса человека серотипа 5 (Ад5). Плазмидные конструкции, содержащие полноразмерный геном Ад5 с модифицированным pIX и репортерным геном зеленого флуоресцирующего белка (EGFP) в составе генома Ад5, получали методом гомологичной рекомбинации в E.coli штамма BJ5183 между полученными плазмидами и плазмидой pAdEasy-1.

Рекомбинантные р1Х-модифицированные Ад5 (Ad5EGFP-pIX-DBD и Ad5EGFP-pIX-CBD) получали в результате трансфекции пакующей линии клеток 293-НЕК соответствующими плазмидами. По результатам ПЦР и рестрикционного анализа полученные аденовирусы содержали ДНК рекомбинантных аденовирусов и не содержали примесей ДНК Ад5 дикого типа.

Определение функциональной активности углевод-связывающих доменов (УСД), находящихся в структуре капсидного белка р1Х рекомбинантных аденовирусов

Расположение УСД фВЭ и СВЭ) над поверхностью капсида Ад5 определяли методом ИФА с использованием предварительно полученных кроличьих сывороток, содержащих поликлональные антитела против 13ВЭ и СВО. Для определения экспонирования ОВО над поверхностью капсида Ас15ЕОРР-р1Х-ВВВ использовали сыворотку, содержащую поликлональные антитела против ОВО; для определения экспонирования СВБ над поверхностью капсида Аё5ЕСРР-р1Х-СВО -сыворотку с антителами против СВО. Результаты эксперимента представлены на рис. 1.

Рис. 1. Анализ экспонирования углевод-связывающих доменов: А - ОВБ на поверхности капсида Ас15ЕСРР-р1Х-ОВО, Б - СВО на поверхности капсида А(15ЕСРР-р1Х-СВВ, методом ИФА. ¡тт - с использованием иммунной сыворотки, к- - с использованием отрицательной сыворотки (р<0,05)

Результаты проведенного анализа продемонстрировали высокий уровень взаимодействия антител иммунных сывороток с соответствующими положительными контролями (БВБтт, СВБтт) и с соответствующими УСД, находящимися в структуре р1Х-модифицированных аденовекторов (АсЮВОшт, АсЮВЭтт), достоверно отличающийся от уровня взаимодействия с немодифицированным

AdSEGFP (AdEGFPimm). Следовательно, в структуре р1Х-модифицированных аденовекторов Ad5EGFP-pIX-DBD и Ad5EGFP-pIX-CBD углевод-связывающие домены расположены над поверхностью капсидов аденовирусов, что делает возможным их взаимодействие со специфическими антителами.

В связи с выгодным расположением УСД в структуре р1Х-модифицированных аденовекторов следующим этапом работы являлось определение способности данных векторов связываться с полисахаридными субстратами за счет взаимодействия с ними с помощью УСД. С этой целью для каждого р1Х-модифицированного аденовируса был выбран определенный набор высокомолекулярных нерастворимых углеводных субстратов: для Ad5EGFP-pIX-DBD - Sephacryl S-200 HR, Sephacryl S-500HR (Pharmacia, Швеция), крахмал (Sigma-Aldrich, США); для Ad5EGFP-pIX-CBD - аморфная целлюлоза (ФГБУ НИИЭМ).

В эксперименте использовали очищенные концентрированные препараты аденовирусов Ad5EGFP-pIX-DBD и Ad5EGFP-pIX-CBD, а также Ad5EGFP в качестве отрицательного контроля опыта. Оценку количества несвязавшегося с субстратом вируса производили спектрофотометрически по поглощению Х=260 нм (максимум поглощения аденовирусной ДНК).

Препараты аденовирусов в количестве 5х 10й вирусных частиц смешивали в 1,5-мл пробирках «Эппендорф» с 0,5 мл растворов соответствующих углеводных субстратов. Инкубировали в течение 2 часов при +4°С для посадки аденовируса на соответствующий субстрат, затем осаждали углеводный носитель центрифугированием 3000 об/мин в течение 7 минут, а надосадочную жидкость, содержащую не связавшийся с субстратом вирус, отбирали для анализа. Осадок носителя ресус-пендировали в 0,5 мл отмывочного нейтрального фосфатного буфера (PBS, рН=7,4), инкубировали при покачивании 30 минут и снова осаждали носитель центрифугированием. Данный этап отмывки проводили 2 раза, отбирая надосадочную жидкость для определения количества несвязавшегося вируса.

Результаты эксперимента показали, что рекомбинантный аденовирус с декст-ран-связывающими доменами в составе pIX, как и контрольный аденовирус Ad5EGFP без модификации pIX, оказался не способен к связыванию с любым из использованных декстрановых носителей и в процессе отмывок был полностью

удален. В то же время, аденовирус, несущий в составе pIX целлюлозо-связывающие домены, показал способность связываться с аморфной целлюлозой, и после двукратной отмывки субстрата 68,0±3,6% аденовируса от исходного количества осталось в осажденном носителе.

Подбор условий элюирования модифицированного аденовируса с целлюлозо-связывающими доменами, адсорбированного на аморфной целлюлозе

Одним из способов, используемых для элюирования CBD-содержащих белков, является добавление к целлюлозному субстрату с адсорбированными на его поверхности белками кислого буферного раствора (рН=2,5-3,0). Такой способ более приемлем для использования в элюировании аденовируса с поверхности аморфной целлюлозы, как более щадящий по отношению к структуре аденовирио-на. Для определения наиболее эффективного буфера для элюирования аденовируса с CBD с целлюлозного носителя были исследованы пять буферных растворов: PBS рН=7,2 и трис-фосфатные буферы рН=5,0/рН=4,0/рН=3,5/рН=3,0. Образцы аморфной целлюлозы с адсорбированным на ее волокнах аденовирусом Ad5EGFP-pIX-CBD после 2 кратной отмывки от не связавшегося вируса смешивали с указанными буферами и инкубировали при покачивании в течение 30 минут. Затем аморфную целлюлозу осаждали центрифугированием, а супернатант добавляли к клеткам 293-НЕК для определения относительного количества элюированного вируса по флуоресценции продукта репортерного гена EGFP (рис. 2).

рН=3,5 рН=3,0

Рис.2. Определение эффективности элюирования аденовируса А(15ЕСРР-р1Х-СЕШ с волокон аморфной целлюлозы на клетках 293-НЕК

Результат эксперимента показал, что наиболее эффективная десорбция р1Х-модифицированного аденовируса Ас15ЕСРР-р1Х-СВО с волокон аморфной целлюлозы наблюдается при использовании в качестве элюирующего раствора трис-фосфатного буфера рН=3,0, о чем свидетельствует флуоресценция наибольшего количества клеток 293-НЕК.

Разработка метода аффинной очистки р1Х-модифицированного

аденовируса с целлюлозо-связывающими доменами в препаративных количествах из культурального препарата с помощью аморфной целлюлозы

Этап 1. Подготовка вирус-содержащего материала.

Подготовительный этап включал стандартные процедуры накопления капсид-модифицированного аденовируса в клетках 293-НЕК, сбора аденовирусного материала и его осветления низкоскоростным центрифугированием.

Этап 2. Непосредственная очистка рекомбинантного капсид-модифицирован-ного аденовируса на целлюлозном носителе.

В качестве носителя для очистки рекомбинантного капсид-модифицирован-ного аденовируса был использован раствор аморфной целлюлозы (приготовленный по методу А.Е. Гурвича). Носитель смешивали с приготовленной вируссодер-жащей суспензией в соотношении: 1 г целлюлозного носителя + 9 мл вируссодер-жащей суспензии. Смесь инкубировали в течение 12 часов при постоянном покачивании при температуре +4°С. Целлюлозный носитель с адсорбированным на нем рекомбинантным капсид-модифицированным аденовирусом осаждали центрифугированием при 4000 об/мин в течение 5 минут. Супернатант удаляли. Сначала осадок аморфной целлюлозы с рекомбинантным капсид-модифицированным аденовирусом промывали нейтральным трис-фосфатным буфером рН=7,2 в объеме 10 мл, а затем снова осаждали центрифугированием 4000 об/мин в течение 5 минут с последующим удалением супернатанта. Промывку повторяли 2 раза. Для окончательной отмывки целлюлозного носителя с рекомбинантным капсид-модифицированным аденовирусом от связавшихся с ним балластных веществ целлюлозный носитель промывали кислым трис-фосфатным буфером рН=4,5 в объеме 8 мл. Затем носитель осаждали и удаляли супернатант. Для элюирования рекомбинантного капсид-модифицированного аденовируса с целлюлозного носителя добавляли кис-

лый элюирующий трис-фосфатный буфер (рН=3,0) в объеме 3,5 мл и инкубировали в течение 30 минут при постоянном покачивании.

Для разделения целлюлозного носителя и рекомбинантного капсид-модифи-цированного аденовируса суспензию центрифугировали, а затем отбирали вирус-содержащий супернатант. Затем раствор нейтрализовали путем добавления карбонатного буфера (рН=9,2) в объеме 3,5 мл для выравнивания рН до значения 7,2.

Аликвоты полученного очищенного рекомбинантного капсид-модифициро-ванного аденовируса отбирали для определения его концентрации и титра, а также для определения чистоты рекомбинантного капсид-модифицированного аденовируса методом высокоэффективной жидкостной хроматографии.

Этап 3. Оценка качества препарата рекомбинантного капсид-модифицированного аденовируса Ас15ЕОРР-р1Х-СЕЮ, полученного в результате очистки на аморфной целлюлозе.

Для оценки качества полученного препарата в очищенном на целлюлозном носителе образце рекомбинантного капсид-модифицированного аденовируса с целлюлозо-связывающими доменами определяли количество физических аденовирусных частиц на выходе (табл. 2) и количество бляшкообразующих единиц (БОЕ) аденовируса (табл. 3). В качестве отрицательного контроля был использован образец немодифицированного аденовируса А<35ЕСРР, прошедший все этапы подготовки и очистки, как и опытный образец.

Таблица 2. Количество физических аденовирусных частиц до и после очистки на аморфной целлюлозе и их выход

Аденовирус Всего вирусных частиц Выход по вирусным частицам, %

До очистки После очистки

Ас15ЕОРР (к-) 6,3 х10и 6х10ш 0,952

Ас15ЕОРР-р1Х-СВО 3,1 хЮ12 2x10й 64,51

Таблица 3. Количество бляшкообразующих единиц аденовируса до и после очистки на аморфной целлюлозе и их выход

Аденовирус Всего БОЕ Выход по БОЕ, %

До очистки После очистки

Ас15ЕОРР (к-) 6,0х10ш 5,25x10" 0,875

Ас15ЕОРР-р1Х-СВО 2,0x10Ш 1,19х10ш 59,5

Выход капсид-модифицированного аденовируса Ас15ЕОРР-р1Х-СВВ, очищенного из культурального препарата с помощью аморфной целлюлозы, составил 64,51% по вирусным (физическим) частицам и 59,5% по бляшкообразующим единицам. Кроме того, выход модифицированного аденовируса Ас15ЕОРР-р1Х-СВО 64,51% по вирусным частицам сравним с таковым при использовании метода очистки путем ультрацентрифугирования в градиенте плотности хлористого цезия.

Затем полученные после очистки образцы рекомбинантных капсид-модифицированных аденовирусов исследовали на чистоту методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. В качестве стандарта чистоты методом ВЭЖХ исследовали капсид-модифицированный аденовирусАс15ЕОРР-р1Х-СВВ, очищенный ультрацентрифугированием в градиенте плотности хлористого цезия (рис. 3).

0,029 A AdSEGFP-plX-CBD (Csa)

260 nm

мч|

к 10,004 А

Рис. 3. Хроматограммы образцов Ad5EGFP-pIX-CBD, очищенных различными способами

Ad5EGFP-pIX-CBD (cellulose) - образец препарата аденовируса, очищенного на аморфной целлюлозе.Ас15ЕСРР-р1Х-СВО (CsCl) - образец препарата аденовируса, очищенного ультрацентрифугированием в градиенте плотности CsCl. А — пик аденовируса; Б, В-сателлитные пики; Г, Д-пики примесей. По оси ординат - оптическая плотность при А=2б0нм (верхняя пара хроматограмм) и при к=280нм (нижняя пара хроматограмм), оптические единицы. По оси абсцисс - время, минуты.

Результаты хроматографии очищенных образцов модифицированного аденовируса АсБЕСРР-рГХ-СВБ показали, что после очистки культурального препарата вируса с помощью аморфной целлюлозы препарат содержит: рекомбинантный аденовирус Ас15ЕОРР-р1Х-СВО, о чем свидетельствует доминантный пик «А» (соотношение А260/А280 = 1,32), а также незначительные примеси: пики «В», «Г», «Д». Пик примесных веществ «В» также наблюдается и в препарате, очищенном с помощью ультрацентри-фугирования в растворе СвО, причем соотношение величины данного пика к пику аденовируса сравнимо в обоих образцах. Пик «Б» является сателлитным и обнаруживается во всех образцах на одинаковом уровне.

Таким образом, по результатам хроматографии можно видеть, что разработанный метод очистки рекомбинантных капсид-модифицированных аденовирусов с целлюлозо-связывающими доменами с помощью аморфной целлюлозы позволяет получать препарат аденовируса, по чистоте сравнимый с образцами рекомбинантных капсид-модифицированных аденовирусов, очищенными ультрацентрифугированием в плотности хлористого цезия.

Получение рекомбинантных аденовирусов человека серотииа 5, экспонирующих на поверхности капсида последовательности лейциновых зипперов в составе белка IX

Для исследования возможности использования р1Х-модифицированных аде-новекторов в качестве платформы для направленной доставки генов в опухолевые клетки был сконструирован рекомбинантный Ад5, несущий на С-конце р1Х последовательность лейцинового зиппера. Лейциновый зиппер - это а-спиральная последовательность, часто встречающаяся в ДНК-связывающих факторах транскрипции. За счет взаимодействия гидрофобных сторон комплементарных последовательностей лейциновых зипперов они способны к димеризации.

В нашей работе для внедрения в структуру р1Х Ад5 мы использовали последовательность лейцинового зиппера ядерного транскрипционного фактора, который регулирует экспрессию гена вителлогенина кур (УВР). Последовательность состоит из 43 а.о. и способна димеризоваться с комплементарной последовательностью зиппера с К(1=1,3х10"11 М. Последовательность зиппера, внедряемого в структуру рГХ условно обозначается как ЕЯ, последовательность комплементарно-

го зиппера - RE.

Зиппер RE содержался на С-конце рекомбинантных наноантител против кар-цино-эмбрионального антигена (СБА), который является опухолеспецифическим мембранным рецептором. Для оценки эффективности проникновения аденовируса Ad5EGFP-pIX-zipper с адсорбированными на его поверхности наноатителами против карцино-эмбрионального антигена (СБА) в опухолевые клетки линий А549 и Liml215 аденовирус предварительно инкубировали с анти-СЕА наноантителами в количественном отношении: 1 вирусная частица к 240 молекулам наноантител. Инкубацию проводили в течение 30 минут при +4°С. Затем смесь аденовируса и наноантител добавляли к клеткам в дозе 500 вирусных частиц на клетку. В качестве контрольных образцов использовали рекомбинантные аденовирусы: Ad5EGFP-plX-zipper и Ad5EGFP, а также Ad5EGFP, инкубированный с анти-СЕА-наноантителами при тех же условиях, что и опытный вирус с зипперами. Результаты эксперимента оценивали по относительному количеству трансдуцированных клеток (EGFP-позитивных) в условиях блокировки рецептора CAR, приняв за 100% - количество клеток, трансдуцированных соответствующими аденовирусами в отсутствии блокады CAR (рис. 4).

А549 Liml215

------SO«

К- AdSKFP AdSESFP-HiAb AiMpper AdMppertntt К- AdSEGFP Ad5E8FP+nAb AdS-ripper AdWppertnAb

Рис. 4. Эффективность проникновения рекомбинантных аденовирусов в опухолевые клетки линий А549 и Liml215 в условиях блокады CAR

К- - интактные (не инфицированные аденовирусом) клетки; Ad5EGFP — рекомбинантный немодифицированный Ад5 с репортерным геном EGFP; Ad5EGFP+nAb-рекомбинантный аденовирус Ad5EGFP, инкубированный с анти-СЕА-наноантителами; Ad5-zipper - рекомбинантный р1Х-модифицированный Ад5 с лещиновыми зипперами; Ad5-zipper+ nAb - рекомбинантный аденовирус Ad5-zipper, инкубированный с анти-СЕА-наноантителами. По оси абсцисс — образцы рекомбинантных аденовирусов. По оси ординат - относительное количество флуоресцирующих (трансдуцированных) клеток. (р<0,05)

Полученные данные свидетельствуют о том, что р1Х-модифицированный аденовирус с ЕЯ-лейциновыми зипперами, инкубированный с анти-СЕА-наноантителами, до 3 раз более эффективно проникает в опухолевые клетки линий А549 и 1лт1215 САЛ-независимым путем, в отличие от немодифицированного вируса Ас15ЕОРР и вируса Ас15ЕОРР-р1Х-21ррег без адсорбции наноантител на поверхности капсида.

Таким образом, полученный наш р1Х-модифицированный аденовирус человека серотипа 5, экспонирующий над поверхностью капсида ЕК-лейциновые зип-перы, способен специфически адсорбировать на своей поверхности наноантитела, содержащие комплементарную последовательность ЯЕ-лейцинового зиппера. Нагруженный таким образом рекомбинантными наноантителами против опухолеспе-цифического рецептора СЕА аденовирус способен эффективно проникать в опухолевые клетки различных типов и обеспечивать экспрессию в них целевой генетической информации.

ВЫВОДЫ

1. Созданные капсид-модифицированные вирусные векторы на основе реком-бинантного аденовируса человека серотипа 5 экспонируют на поверхности капсида целлюлозо-связывающие и декстран-связывающие домены гликозилгидролаз в составе аденовирусного белка IX.

2. Модифицированный рекомбинантный аденовирус с целлюлозо-связываю-щими доменами способен специфически связываться с волокнами аморфной целлюлозы.

3. Оптимальными условиями элюирования капсид-модифицированных аденовирусов являются использование трис-фосфатного буфера с рН=3,0, время инкубирования 30 минут, температура плюс 4°С.

4. Разработанный способ аффинной очистки р1Х-модифицированных аденовирусных векторных систем с целлюлозо-связывающими доменами на целлюлозном носителе позволяет получать чистый, биологически активный препарат реко-бинантного аденовируса с выходом 64,5% по вирусным частицам и 59,5% - по бляшкообразующим единицам.

5. Созданные рекомбинантные аденовирусы человека серотипа 5, несущие в

составе капсидного белка IX последовательность лейцинового зиппера, способны специфически адсорбировать на своей поверхности наноантитела за счет взаимодействия комплементарных последовательностей лейциновых зипперов в составе вируса и наноантител.

6. Рекомбинантный аденовирусный вектор с лейциновыми зипперами в составе белка IX, нагруженный наноантителами против опухолеспецифического рецептора СБА, в 2,8±0,2 раза более эффективно проникает в опухолевые клетки человека линий А549 и 1лт1215 САЯ-независимым путем, в отличие от немодифици-рованного аденовируса Ас15ЕОРР и вируса Аё5ЕОРР-р1Х-г1ррег без адсорбции наноантител на поверхности капсида.

ПРАКТИЧЕСКОЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ НАУЧНЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ

Результаты диссертационной работы используются в научно-исследовательской и производственной работе в лаборатории молекулярной биотехнологии ФГБУ «НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздравсоцразвития России для конструирования аденовирусных векторов с модифицированным капсидным белком IX.

Материалы, изложенные в диссертации, внедрены в учебный процесс и используются при чтении лекций и проведении лабораторных и практических занятий по дисциплинам «Молекулярная биология», «Молекулярная биология вирусов», «Основы генной инженерии», «Генетическая инженерия» со студентами (бакалавры и магистры биологии) ветеринарно-биологического факультета ФГБОУ ВПО МГАВМиБ.

РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ИСПОЛЬЗОВАНИЮ НАУЧНЫХ ВЫВОДОВ

Технология получения аденовирусов с модифицированным геном белка IX может быть рекомендована к использованию в научно-исследовательской работе для получения р1Х-модифицированных аденовирусных векторов.

Разработанная технология аффинной очистки рекомбинантных аденовирусных векторных систем с модифицированным капсидным белком IX может быть рекомендована для использования в лабораторной и производственной практике

для получения чистого биологически активного препарата аденовируса.

Полученный аденовирусный вектор с лейциновыми зипперами в составе кап-сидного белка IX рекомендуется использовать в качестве наноплатформы для экспонирования на своей поверхности различных белковых лигандов за счет их адсорбции через взаимодействие комплементарных последовательностей лейцино-вых зипперов в составе аденовируса и лиганда.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

¡.Эффективный способ доставки гена интерлейкина-2 в гемопоэтические клетки человека с использованием рекомбинантного аденовируса с модифицированным фибером / Рогожин В.Н., Логунов Д.Ю., Щебляков Д.В. и др. // Acta Naturae. -2011.-Т. 3,№3 (10).- С. 104-111.

2. Рекомбинантный модифицированный аденовирус птиц CELO с химерным фибером для эффективной доставки генетической информации в опухолевые клетки человека / Рогожин В.Н., Логунов Д.Ю., Зубкова О.В. и др. // Естественные и технические науки. - 2011. - № 4(54). - С. 139-146.

3. Конструирование рекомбинантного аденовируса человека 5 серотипа с модифицированным капсидом как универсального наноносителя белковых лигандов / Рогожин В.Н., Белоусова Р.В., Логунов Д.Ю. и др. // Ветеринарная медицина. -2011.- №2. -С. 10-13.

4. Разработка кандидатных иммуно-биологических препаратов для профилактики и иммунотерапии опасных вирусных заболеваний (птичий грипп, бешенство) на основе рекомбинантных и капсид-модифицированных рекомбинантных адено-векторов / Шмаров М.М., Седова Е.С., Лысенко А.А., Барыкова Ю.А., Щербинин Д.Н., Богачева Е.А., Верховская Л.В., Рогожин В.Н. и др. // Итоговая конференция по результатам выполнения мероприятий за 2010 год в рамках приоритетного направления «Живые системы» ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы»: сб. тезисов. - М: Федеральное агентство по науке и инновациям. - 2010. - С. 30-31.

5. Разработка кандидатных иммуно-биологических препаратов для профилак-

тики и иммунотерапии опасных вирусных заболеваний (птичий грипп, бешенство) на основе рекомбинантных и капсид-модифицированных рекомбинантных адено-векторов / Шмаров М.М., Седова Е.С., Лысенко A.A., Барыкова Ю.А., Щербинин Д.Н., Янова A.C., Верховская Л.В., Рогожин В.Н. и др. // Итоговая конференция по результатам выполнения мероприятий за 2009 год в рамках приоритетного направления «Живые системы» ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы»: сб. тезисов. - М: Федеральное агентство по науке и инновациям - 2009.- С. 126-127.

6. Genetic targeting of avian adenovirus vectors / Zubkova O.V., Logunov D.Y., Shmarov M.M., Rogozhin V.N. et al. // 9th International Adenovirus Meeting. - Dobogo-ko, Hungary: 2009.-P. 94.

7. Эффективный перенос генетической информации в опухолевые клетки с помощью птичьего аденовирусного вектора с химерным фибером / Зубкова О.В., Логунов Д.Ю., Рогожин В.Н. и др. // Биотехнология: состояние и перспективы развития: сб. научн. тр. - М.: Экспо-Биохим-технологии - 2009. - С. 234-235.

8. Рогожин В.Н., Зубкова О.В., Белоусова Р.В. Создание рекомбинантного модифицированного аденовируса птиц CELO с химерным фибером для эффективной трансдукции клеток млекопитающих // Достижения супрамолекулярной химии и биохимии в ветеринарии и зоотехнии: сб. тезисов. - М.: ФГОУ ВПО МГАВМиБ -2008.-С.38.

Отпечатано в ООО «Компания Спутник+» ПД № 1-00007 от 26.09.2000 г. Подписано в печать 21.11.2011 Тираж 100 экз. Усл. п.л. 1,4 Печать авторефератов (495)730-47-74,778-45-60

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Рогожин, Василий Николаевич

ПРИНЯТЫЕ СОКРАЩЕНИЯ.

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Общая характеристика аденовирусов.

1.1.1. Классификация аденовирусов.

1.1.2. Строение и репродукция аденовирусов.

1.2. Векторы на основе аденовирусов человека серотипа 5.

1.3. Методы конструирования капсид-модифицированных аденовекторов.

1.3.1. Аденовирусные векторы с модифицированными фиберами.

1.3.2. Аденовирусные векторы с модифицированными гексонами.

1.3.3. Аденовирусные векторы с модифицированными белками Illa.

1.3.4. Аденовирусные векторы с модифицированными белками IX.

1.3.4.1. Особенности строения, экспрессии и локализации белка IX.

1.3.4.2. Стратегия генетической модификации белка IX.

1.3.4.3. Получение рекомбинантных аденовирусов человека серотипа 5 с модифицированным pIX и возможные пути применения его модификации

1.4. Углевод-связывающие домены гликозилгидролаз и их практическое применение.

1.5. Наноантитела и их применение в качестве агентов для связывания с опухолеспецифическими рецепторами.

1.5.1. Структурные и биофизические особенности наноантител.

1.5.2. Применение наноантител для связывания с опухолеспецифическими рецепторами.

1.6. Перспективы применения модификации pIX аденовируса углевод-связывающими доменами гликозилгидролаз и наноантителами.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Материалы.

2.1.1. Вирусы и бактериальные штаммы.

2.1.2. Клеточные линии.

2.1.3. Плазмидные векторы.

2.1.4. Ферменты и другие реактивы.

2.1.5. Лабораторные животные.

2.1.6. Лабораторное оборудование.

2.2. Методы.

2.2.1. Подготовка компетентных клеток Е. coli штамма DH5a.

2.2.2. Подготовка компетентных клеток Е. coli штамма BJ5183.

2.2.3. Трансформация компетентных клеток Е. coli штамма DH5a.

2.2.4. Трансформация компетентных клеток Е. coli штамма BJ5183.

2.2.5. Гомологичная рекомбинация в клетках Е. coli.

2.2.6. Выделение аналитических количеств плазмидной ДНК.

2.2.7. Выделение и очистка плазмидной ДНК.

2.2.8. Метод рестрикционного картирования ДНК с помощью специфических эндодезоксирибонуклеаз.

2.2.9. Дефосфорилирование 5'-концов плазмидного вектора.

2.2.10. Фракционирование фрагментов ДНК методом электрофореза в агарозном геле.

2.2.11. Препаративное разделение фрагментов ДНК с помощью гель-электрофореза и их элюирование из агарозного геля.

2.2.12. Лигирование фрагментов ДНК.

2.2.13. Идентификация рекомбинантных клонов.

2.2.14. Полимеразная цепная реакция.

2.2.15. Выделение тотальной ДНК.

2.2.16. Трансфекция культур клеток методом липофекции.

2.2.17. Получение рекомбинантных аденовирусов.

2.2.18. Накопление вирусов.

2.2.19. Очистка и концентрирование аденовирусов.

2.2.20. Выделение вирусной ДНК.

2.2.21. Титрование рекомбинантных аденовирусов.

2.2.22. Иммунизация животных.

2.2.23. Приготовление сыворотки.

2.2.24. Иммуноферментный анализ для доказательства экспонирования углевод-связывающих доменов над поверхностью капсидов р1Х-модифицированных аденовирусов.

2.2.25. Иммуноферментный анализ для доказательства специфического взаимодействия лейциновых зипперов в составе р!Х аденовируса и в молекулах рекомбинантных наноантител.

2.2.26. Определение нуклеотидной последовательности ДНК.

2.2.27. Электрофорез белков в ПААГ-ДСН (РАОЕ^Я).

2.2.28. Оценка термостабильности рекомбинантных аденовирусов.

2.2.29. Определение углевод-связывающей способности рекомбинантных аденовирусных векторов с углевод-связывающими доменами в составе капсидного белка IX.

2.2.30. Проточная цитофлуориметрия.

2.2.31. Электронная микроскопия.

2.2.32. Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ).

2.2.33. Статистическая обработка результатов исследований.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ.

3.1. Получение рекомбинантных аденовирусов человека серотипа 5, экспонирующих на поверхности капсида целлюлозо-связывающие и декстран-связывающие домены в составе белка IX.

3.1.1. Создание плазмидных конструкций, несущих последовательности целлюлозо-связывающего (СВЭ) или декстран-связывающего (БВБ) доменов на С-конце капсидного белка IX Ад5.

3.1.2. Получение плазмидных конструкций, содержащих полноразмерный геном Ад5 и несущих последовательности БВО или СВЭ на С-конце рГХ.

3.1.3. Получение рекомбинантных Ад5 с декстран-связывающими или целлюлозо-связывающими доменами в структуре р1Х.

3.1.4. Изучение физической стабильности рекомбинантных Ад5 с декстран-связывающими или целлюлозо-связывающими доменами в структуре р1Х.

3.2. Определение функциональной активности углевод-связывающих доменов, находящихся в структуре капсидного белка р1Х рекомбинантных аденовирусов

3.2.1. Доказательство экспонирования углевод-связывающих доменов над поверхностью капсида рекомбинантных аденовирусов.

3.2.2. Определение способности р1Х-модифицированных аденовекгоров с углевод-связывающими доменами связываться с соответствующими полисахаридными субстратами.

3.3. Подбор условий элюирования модифицированного аденовируса с целлюлозо-связывающими доменами, адсорбированного на аморфной целлюлозе.

3.3.1. Выбор метода десорбции аденовируса с CBD, связанного с волокнами аморфной целлюлозы.

3.3.2. Подбор условий элюирования модифицированного аденовируса с целлюлозо-связывающими доменами, адсорбированного на аморфной целлюлозе, с помощью кислых буферов.

3.4. Очистка р1Х-модифицированного аденовируса с целлюлозо-связывающими доменами в препаративных количествах из культурального препарата с помощью аморфной целлюлозы.

3.5. Получение рекомбинантных аденовирусов человека серотипа 5, экспонирующих на поверхности капсида последовательности лейциновых зипперов в составе белка IX.

3.5.1. Получение плазмидной конструкции, содержащей полноразмерный геном Ад5 и несущей последовательность ER-зиппера на С-конце pIX Ад5.

3.5.2. Получение рекомбинантного Ад5, содержащего ER-зипперы в структуре pIX и несущего репортерный ген EGFP.

3.6. Определение способности аденовирусного вектора с ER-лейциновыми зипперами специфически адсорбировать на своей поверхности рекомбинантные анти-СЕА-наноантитела.

3.7. Определение эффективности доставки генетической информации аденовекторами с лейциновыми зипперами, нагруженными наноантителами против опухолеспецифического рецептора CEA, в опухолевые клетки CAR-независимым путем.

4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

5. ВЫВОДЫ.

6. ПРАКТИЧЕСКОЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ НАУЧНЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ.

7. РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ИСПОЛЬЗОВАНИЮ НАУЧНЫХ ВЫВОДОВ.

8. СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ.

ПРИНЯТЫЕ СОКРАЩЕНИЯ

293-НЕК - линия клеток почки эмбриона человека, трансформированных Е1областью генома Ад а.о. - аминокислотный остаток

Ад - аденовирус

Ад5 - аденовирус человека серотипа 5 AT - антитело

БОЕ - бляшкообразующая единица ВИЧ - вирус иммунодефицита человека Да - дальтон

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота дНТФ — дезоксирибонуклеозидтрифосфат ДСН - додецилсульфат натрия ИФА - иммуноферментный анализ кДа - килодальтон

МАА - меланома-ассоциированный антиген

ОФЭКТ - однофотонная эмиссионная компьютерная томография п.н. - пара нуклеотидов

ПААГ - полиакриламидный гель

ПЦР - полимеразная цепная реакция

ПЭГ - полиэтиленгликоль

РНК - рибонуклеиновая кислота т.п.н. - тысяча пар нуклеотидов

TP - терминальный белок

УСД - углевод-связывающие домены

ЦПД - цитопатическое действие

ЦСД - целлюлозо-связывающий домен

А549 — клетки карциномы легких человека

ABTS - 2,2-ацидобис-(3-этилбензотиазолин-6-сульфоновая кислота) диаммониевая соль

ВАР - биотин-связывающий пептид

CAD - ферментный комплекс: карбамилфосфатсинтетаза, аспартаттранскарбамилаза и дигидрооротаза

CAR - коксакивирусный-аденовирусный рецептор

CBD - целлюлозо-связывающий домен Anaerocellum thermophilum

CD - кластер дифференцировки

CDR - гипервариабельные участки антитела

СЕА - карцино-эмбриональный антиген

CMV - промотор цитомегаловируса человека

DBD - декстран-связывающий домен Leuconostoc mesenteroides

DEAE - диэтиламиноэтил

EGFP - зеленый флуоресцирующий белок

EGFR - рецептор эпидермального фактора роста

FITC - флуоресцеинизотиоцианат

GLP - надлежащая лабораторная практика

GMP - надлежащая производственная практика

GON - группа из девяти гексонов аденовируса

HLA - главный комплекс гистосовместимости человека hnRNP-K - гетерогенный ядерный рибонуклеопротеин К

HSV-1 - вирус простого герпеса

HVR - гипервариабельный регион

ICTV - Международный комитет по таксономии вирусов Ig - иммуноглобулин

ITR - концевые повторяющиеся последовательности Liml215 - клетки карциномы толстого кишечника человека MUC1 - муциноподобный антиген ORF — открытая рамка считывания PB S - фосфатный солевой буфер рН - водородный показатель pIX - минорный капсидный белок аденовирусов человека

PPGK - полифосфатглюкокиназа

PSA - простатический специфический антиген

RFP - красный флуоресцирующий белок

RGD - трипептид: аргинил-глицил-аспарагиновая кислота sdAb - однодоменное антитело

TCR - Т-клеточный рецептор

VBP - вителлогенин-связывающий белок

VH - вариабельный домен тяжелой цепи антитела

VL - вариабельный домен легкой цепи антитела

VLA-3 - рецептор для фибронектина, коллагена и ламинина zipper - последовательность «лейциновой молнии» транскрипционного фактора VBP

Введение Диссертация по биологии, на тему "Создание новых векторных систем на основе рекомбинантного аденовируса человека с генетически модифицированным капсидным белком IX"

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ

В настоящее время векторные системы на основе рекомбинантного аденовируса человека серотипа 5 (Ад5) являются одними из наиболее широко используемых средств доставки генетической информации в клетки млекопитающих и человека. К преимуществам таких векторов относятся: их способность трансдуцировать как делящиеся, так и неделящиеся клетки [239]; аденовирусная ДНК не встраивается в геном клетки-хозяина и остается в экстрахромосомной форме; аденовирусы могут быть получены в титре более Ю10 БОЕ/мл, что позволяет использовать их в качестве живых рекомбинантных вакцин; и наконец, обеспечение высокого уровня экспрессии целевого гена в клетке-мишени [237].

- отсутствие технологически простой и эффективной методики очистки' и концентрирования аденовирусного препарата, готового к 1 непосредственному применению в медицине или ветеринарии; , "

- невысокая эффективность трансдукции данными векторами некоторых типов опухолевых клеток человека и млекопитающих [253].

Устранение этих недостатков возможно путем конструирования рекомбинантных аденовирусов с модифицированным капсидом. Перспективным направлением модификации капсида аденовируса является модификация минорного капсидного белка IX (р1Х). Преимущества модификации р1Х заключаются в следующем: возможность встраивания к С-концу р1Х относительно крупных пептидных фрагментов, высокая структурная совместимость р1Х с внедряемыми лигандами, широкий спектр возможных направлений использования модификаций р1Х [79].

Проблема невысокой эффективности проникновения аденовирусного вектора в некоторые типы опухолевых клеток объясняется тем, что первичным рецептором для связывания вириона Ад5 с поверхностью клетки является коксакивирусный-аденовирусный рецептор (CAR) [316], высокий уровень экспрессии которого имеют не все типы опухолевых клеток [245, 296]. В связи с высокими темпами роста количества онкологически больных людей и животных в последние годы, создание аденовирусного вектора, эффективно доставляющего генетическую информацию в опухолевые клетки с целью противоопухолевой терапии и диагностики, является актуальной научной задачей.

В связи с широким использованием векторов на основе аденовирусов в научной практике и медицинских исследованиях, в настоящее время активно создаются GLP и GMP производства для получения препаративных количеств аденовируса. В этой связи особенно актуальной является не только задача конструирования и получения рекомбинантных Ад5, но и разработка эффективных методов очистки и концентрирования Ад5.

Существующие сегодня способы очистки рекомбинантных Ад5 обладают следующими недостатками:

- в результате очистки аденовируса ультрацентрифугированием в градиенте плотности хлористого цезия получаемый вирусный препарат содержит высокие концентрации хлористого цезия (3.13-3.17 М), несовместимые для применения животным и человеку вследствие его токсичности [106]; использование для очистки рекомбинантных аденовирусов ионообменной и эксклюзионной хроматографии не позволяет использовать исходный клеточный лизат с аденовирусом, а сам способ очистки является многоступенчатым [35, 220];

В связи с вышеизложенным, наиболее удобным и эффективным представляется способ, позволяющий непосредственно использовать клеточный вируссодержащий лизат для очистки аденовирионов и получать чистый препарат аденовируса на выходе, готовый к применению. Разработка такого способа очистки рекомбинантных аденовирусов представляет самостоятельный научный интерес.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

Целью исследований являлось создание рекомбинантных аденовирусных векторов с различными модификациями капсидного белка IX для усовершенствования очистки рекомбинантных аденовирусов и для повышения эффективности проникновения рекомбинантных аденовирусных векторов в опухолевые клетки.

В процессе выполнения работы предстояло решить следующие задачи:

1. Получить капсид-модифицированные вирусные векторы на основе рекомбинантного аденовируса человека 5 серотипа, экспонирующие на поверхности капсида различные углевод-связывающие домены гликозилгидролаз в составе аденовирусного белка IX.

3. Подобрать условия элюирования капсид-модифицированных аденовирусов с углевод-связывающими доменами, адсорбированных на полисахаридном субстрате, и разработать способ аффинной очистки модифицированных аденовирусов с углевод-связывающими доменами в препаративных количествах из культурального препарата на полисахаридных носителях.

5. Определить эффективность доставки генетической информации аденовекторами с лейциновыми зипперами, нагруженными наноантителами против опухолеспецифического рецептора CEA, в опухолевые клетки in vitro.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА

Впервые получены рекомбинантные аденовирусы человека серотипа 5, несущие в составе капсидного белка IX целлюлозо-связывающие и декстран-связывающие домены. Доказано, что углевод-связывающие домены экспонированы над поверхностью капсидов полученных рекомбинантных аденовирусов, а для аденовируса с целлюлозо-связывающими доменами в составе pIX впервые показана способность специфически связываться с волокнами аморфной целлюлозы.

Впервые получены рекомбинантные аденовирусы человека серотипа 5, несущие в составе капсидного белка IX последовательность лейцинового зиппера. На моделях культур клеток аденокарциномы легких человека (линия А549) и карциномы толстой кишки человека (линия Liml215) показано, что рекомбинантный аденовирусный вектор, содержащий репортерный ген зеленого флуоресцирующего белка (EGFP), с лейциновыми зипперами в составе белка IX, нагруженный наноантителами против опухолеспецифического рецептора CEA, способен к эффективному проникновению в опухолевые клетки человека CAR-независимым путем/

По результатам работы подана заявка на получение патента Российской

Федерации № 2011123472/10(034727) от 09.06.2011 «Способ очистки рекомбинаитных аденовирусов млекопитающих и человека» и получено уведомление о положительном результате формальной экспертизы от 05.07.2011 года.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ

Плазмидная технология модификации гена капсидного белка IX аденовируса человека серотипа 5 внедрена в работу лаборатории молекулярной биотехнологии ФГБУ «НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздравсоцразвития России для получения рекомбинаитных аденовирусов с различными модификациями белка IX. Коллекция полученных рекомбинаитных аденовирусов: Аё5ЕОРР-р1Х-СВБ, Аё5ЕОРР-р1Х-ВВБ и АсЬЕОРР-рГХ-^ррег хранится в вирусном музее лаборатории молекулярной биотехнологии ФГБУ «НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздравсоцразвития России. г

По результатам научно-исследовательской работы разработаны «Методические положения по использованию аффинной очистки в производстве рекомбинаитных аденовирусных векторов с генетически модифицированным капсидным белком IX», утвержденные на заседании секции отделения ветеринарной медицины Российской академии сельскохозяйственных наук «Ветеринарная биотехнология» (протокол № 2 от 20 октября 2011г.), которые могут быть использованы в научных, учебных и производственных целях.

Разработанный способ аффинной очистки векторных систем на основе р1Х-модифицированных рекомбинаитных аденовирусов человека серотипа 5 используется в лаборатории молекулярной биотехнологии ФГБУ «НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздравсоцразвития России для очистки препаративных количеств рекомбинаитных аденовирусных векторов.

ЛИЧНЫЙ ВКЛАД СОИСКАТЕЛЯ

Автор непосредственно получил рекомбинантные аденовирусные вектора с модифицированным р1Х, разработал и оптимизировал технологию очистки р1Х-модифицированных аденовирусных векторов, исследовал проникающую способность модифицированного аденовектора с лейциновым зиппером в составе р1Х в опухолевые клетки человека, проанализировал, обобщил и интерпретировал полученные результаты, сформулировал выводы и рекомендации по дальнейшему применению разработанной технологии очистки и полученных аденовекторов. Электронная микроскопия образцов аденовирусов была выполнена совместно с д.б.н. Диденко Л.В., а цитофлуориметрия клеточного материала - совместно с к.б.н. Щебляковым Д.В. (ФГБУ «НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздравсоцразвития России).

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ

Результаты диссертационной работы были доложены на итоговых конференциях по результатам выполнения мероприятий за 2009 и 2010 годы в рамках приоритетного направления «Живые системы» ФЦП «Исследования и разработка научно-технического комплекса России на 2007-2012 гг.» (Москва, 2009, 2010), Международной научно-практической конференции «Достижения супрамолекулярной химии и биохимии в ветеринарии и зоотехнии» (Москва, 2008), V Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2009), IX Международном аденовирусном съезде (Венгрия, Добогоко, 2009).

ПУБЛИКАЦИИ

По материалам диссертации опубликовано 8 научных работ, в том числе 3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК, 5 - в сборниках международных конференций и конгрессов.

ОБЪЕМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ

Диссертационная работа изложена на 157 страницах машинописного текста и включает введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение результатов, выводы и список используемой литературы (321 источник, из которых 5 отечественных и 316 иностранных). Работа содержит 9 таблиц и 27 рисунков.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)", Рогожин, Василий Николаевич

5. ВЫВОДЫ

1. Созданные капсид-модифицированные вирусные векторы на основе рекомбинантного аденовируса человека серотипа 5 экспонируют на поверхности капсида целлюлозо-связывающие и декстран-связывающие домены гликозилгидролаз в составе аденовирусного белка IX.

2. Модифицированный рекомбинантный аденовирус с целлюлозо-связывающими доменами способен специфически связываться с волокнами аморфной целлюлозы.

4. Разработанный способ аффинной очистки р1Х-модифицированных аденовирусных векторных систем с целлюлозо-связывающими доменами на целлюлозном носителе позволяет получать чистый, биологически активный препарат рекомбинантного аденовируса с выходом 64,5% по вирусным частицам и 59,5% - по бляшкообразующим единицам.

5. Созданные рекомбинантные аденовирусы человека серотипа 5, несущие в составе капсидного белка IX последовательность лейцинового зиппера, способны специфически адсорбировать на своей поверхности наноантитела за счет взаимодействия комплементарных последовательностей лейциновых зипперов в составе вируса и наноантител.

6. Рекомбинантный аденовирусный вектор с лейциновыми зипперами в составе белка IX, нагруженный наноантителами против опухолеспецифического рецептора СЕА, в 2,8±0,2 раза более эффективно проникает в опухолевые клетки человека линий А549 и 1лт1215 САЫ-независимым путем, в отличие от немодифицированного аденовируса Ас15ЕОРР и вируса АсІЗЕвРР-рІХ-гіррег без адсорбции наноантител на поверхности капсида.

6. ПРАКТИЧЕСКОЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ НАУЧНЫХ

РЕЗУЛЬТАТОВ

7. РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ИСПОЛЬЗОВАНИЮ НАУЧНЫХ ВЫВОДОВ

Технология получения аденовирусов с модифицированным геном белка IX может быть рекомендована к использованию в научно-исследовательской работе для получения рГХ-модифицированных аденовирусных векторов.

Полученный аденовирусный вектор с лейциновыми зипперами в составе капсидного белка IX рекомендуется использовать в качестве наноплатформы для экспонирования на своей поверхности различных белковых лигандов за счет их адсорбции через взаимодействие комплементарных последовательностей лейциновых зипперов в составе аденовируса и лиганда.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Рогожин, Василий Николаевич, Москва

1. Семихин А.С., Лящук A.M., Мезенцева М.В., Трегубова М.И., Сергиенко О.В., Полетаева Н.Н., Народицкий Б.С., Карягина А.С., Лунин

2. B.Г., Гинцбург А.Л. Получение рекомбинантного интерферона-p человека на основе технологии аффинных доменов // Молекул, генетика. 2009. - № 4.1. C. 38-41.

3. Тиллиб С. В. «Верблюжьи антитела» эффективный инструмент для исследований, диагностики и терапии. // Молекулярная биология. - 2011. -№45(1). - С. 77-85.

4. Хорвиц М.С. Аденовирусы и их репликация. // "Вирусология" под ред.Филдс. Изд.: "Мир". 1989.

5. Acsadi G., Lochmuller Н., Jani A., Huard J., Massie В., Prescott S., Simoneau M., Petrof B. J., and Karpati G. Dystrophin expression in muscles of mdx mice after adenovirus-mediated in vivo gene transfer. // Hum. Gene Ther. 1996. V. 7. P. 129-140.

6. Ahmadvand D., Rasaee M.J., Rahbarizadeh F., Kontermann R.E., Sheikholislami F. Cell selection and characterization of a novel human endothelial cell specific nanobody. //Mol Immunol. 2009. V. 46. P. 1814-1823.

7. Ahmadvand D., Rasaee M.J., Rahbarizadeh F., Mohammadi M. Production and characterization of a high-affinity nanobody against human endoglin. // Hybridoma (Larchmt). 2008. V. 27. P. 353-360.

8. Akalu A., Liebermann H., Bauer U., Granzow H., Seidel W. The subgenus-specific C-terminal region of protein IX is located on the surface of the adenovirus capsid. // J Virol. 1999. V. 73. P. 6182-6187.

9. Anderson C.W. The proteinase polypeptide of adenovirus serotype 2 virions. //Virology. 1990. V. 177(1). P. 259-272.

10. Angeletti P.C., Engler J.A. Adenovirus preterminal protein binds to the CAD enzyme at active sites of viral DNA replication on the nuclear matrix. // J Virol. 1998. V. 72(4). P. 2896-2904.

11. Angelov A., Loderer C., Pompei S., Liebl W. A novel family of carbohydrate-binding modules revealed by the genome sequence of Spirochaeta thermophila DSM 6192. // Appl Environ Microbiol. 2011. P. 17.

12. Arbabi-Ghahroudi M., Desmyter A., Wyns L., Hamers R., Muyldermans S. Selection and identification of single domain antibody fragments from camel heavy-chain antibodies. //FEBS Lett. 1997. V. 414. P. 521-526.

13. Arbabi-Ghahroudi M., Tanha J., MacKenzie R. Prokaryotic expression of antibodies. // Cancer Metastasis Rev. 2005. V. 24. P. 501-519.

14. Armentano D., Sookdeo C., Hehir K., Gregory R., St. George J., Prince G., Wadsworth S.C., Smith A.E. Characterization of an adenovirus gene transfer vector containing an E4 deletion. // Hum. Gene Then. 1995. V. 6. P. 1343-1353.

15. Athappilly F.K., Murali R., Rux J J., Cai Z., Burnett R.M. The refined crystal structure of hexon, the major coat protein of adenovirus type 2, at 2.9 A resolution. // J Mol Biol. 1994. V. 242. P. 430-455.

16. Badger C., Anasetti C., Davis J., Berstein I. Treatment of malignancy with unmodified antibody. // Pathol. Immunopathol. Res. 1987. V. 6. P. 419-^34.

17. Baral T.N., Magez S., Stijlemans B., Conrath K., Vanhollebeke B., Pays

18. E., Muyldermans S., De Baetselier P. Experimental therapy of African trypanosomiasis with a nanobody-conjugated human trypanolytic factor. // Nat. Med. 2006. V. 12. P. 580-584.

19. Bauerschmitz G.J., Barker S.D., Hemminki A. Adenoviral gene therapy for cancer: from vectors to targeted and replication competent agents (review). // Int. J Oncol. 2002. V. 21. P. 1161-1174.

20. Bayer E.A., Chanzy H., Lamed R., Shoham Y. Cellulose, cellulases and cellulosomes. // Curr. Opin. Struct. Biol. 1998. V. 8. № 5. P. 548-557.

21. Beach N., Duncan R., Larsen C., Meng X.J., Sriranganathan, N., Pierson

22. F. Comparison of 12 turkey hemorrhagic enteritis virus isolates allows prediction of genetic factors affecting virulence. // J. Gen. Virol. 2009. V. 90. P. 1978-1985.

23. Belousova N., Korokhov N., Krendelshchikova V., Simonenko V., Mikheeva G., Triozzi P.L. Genetically targeted adenovirus vector directed to CD40-expressing cells. // J Virol. 2003. V. 77. P. 11367-11377.

24. Belousova N., Krendelchtchikova V., Curiel D.T., Krasnykh V. Modulation of adenovirus vector tropism via incorporation of polypeptide ligands into the fiber protein. // J Virol. 2002. V. 76. P. 8621-8631.

25. Benko M., Harrach B. A proposal for a new (third) genus within the family Adenoviridae. // Arch Virol. 1998. V. 143(4). P. 829-837.

26. Berdichevsky Y., Ben-Zeev E., Lamed R., Benhar I. Phage display of a cellulose binding domain from Clostridium thermocellum and its application as a tool for antibody engineering. // J. Immunol. Methods. 1999. V. 228. P. 151-162.

27. Berdichevsky Y., Lamed R., Frenkel D., Gophna II, Bayer E., Yaron S., Shoham Y., Benhar I. Matrix-assisted refolding of single-chain Fv- cellulose binding domain fusion proteins. // Protein Expr. Purif. 1999. V. 17. P. 249-259.

28. Bergelson J.M., Krithivas A., Celi L., Droguett G., Horwitz M.S., Wickham T., Crowell R.L., Finberg R.W. The murine CAR homolog is a receptor for coxsackie B viruses and adenoviruses. // J. Virol. 1998. V. 72(1). P. 415-419.

29. Berkner K.L. Development of adenovirus vectors for the expression of heterologous genes. //Biotechniques. 1988. V. 6(7). P. 616-629.

30. Bett A., Haddara W., Prevec L., Graham F.L. An efficient and flexible system for construction of adenovirus vectors with insertions or deletions in early regions 1 and 3. // Proc Natl Acad Sci USA. 1994. V. 13. № 91(19). P. 8802-8806.

31. Blanche F., Barbot A., Cameron B. Method of separating viral particles. // United States Patent. 2003. N. US 6537793 B2.

32. Blanche F., Cameron B., Barbot A., Ferrero L., Guillemin T., Guyot S., Somarriba S., Bisch D. An improved anion-exchange HPLC method for the detection and purification of adenoviral particles // Gene Therapy. 2000. V. 7. P. 1055-1062.

33. Bond C.J., Marsters J.C., Sidhu S.S. Contributions of CDR3 to VHH domain stability and the design of monobody scaffolds for naive antibody libraries. // J. Mol. Biol. 2003. № 332. P. 643- 655.

34. Boraston A.B., Nurizzo D., Notenboom V., Ducros V., Rose D.R., Kilburn D.G., Davies G.J. Differential oligosaccharide recognition by evolutionarily-related beta-1,4 and beta-1,3 glucan-binding modules. // J. Mol. Biol. 2002. V. 319. № 5. P. 1143-1156.

35. Boraston A.B., Bolam D.N., Gilbert H.J., Davies G.J. Carbohydrate-binding modules: fine-tuning polysaccharide recognitio // Biochem. J. 2004. V. 382. P. 769-781.

36. Both G.W. Ovine atadenovirus: a review of its biology, biosafety profile and application as a gene delivery vector. // Immunol Cell Biol. 2004. V. 82(2). P. 189-195.

37. Boudin M.L., D'Halluin J.C., Cousin C., Boulanger P. Human adenovirus type 2 protein Ilia. Maturation and encapsidation. // Virology. 1980. V. 101(1). P. 144-156.

38. Boulanger P., Lemay P., Blair G.E., Russell W. C. Characterization of adenovirus protein IX. // J. Gen. Virol. 1979. V. 44. P. 783 800.

39. Bramson J.L. Helper-dependent adenoviral vectors containing modified fibre for improved transduction of developing and mature muscle cells. // Hum. Gene Ther. 2004. V. 15. P. 179-188.

40. Breidenbach M., Rein D.T., Everts M., Glasgow J.N., Wang M., Passineau M.J. Mesothelinmediated targeting of adenoviral vectors for ovarian cancer gene therapy. // Gene Therapy. 2005. V. 12. P. 187-193.

41. Brough D.E., Lizonova A., Hsu C., Kulesa V.A., Kovesdi I. A gene transfer vector-cell line system for complete functional complementation of adenovirus early regions El and E4. // J. Virol. 1996. V. 70. P. 6497-6501.

42. Bruder J.T., Jie T., McVey D.L., Kovesdi I. Expression of gp 19K increases the persistence of transgene expression from an adenovirus vector in the mouse lung and liver. // J. Virol. 1997. V. 71. P. 7623-7628.

43. Campos S.K., Barry M.A. Comparison of adenovirus fiber, protein IX, and hexon capsomeres as scaffolds for vector purification and cell targeting // Virology. 2006. № 349. P. 453-462.

44. Campos S.K., Parrott M.B., Barry M.A. Avidin-based targeting and purification of a protein IX-modified, metabolically biotinylated adenoviral vector. // Mol. Ther. 2004. V. 9. P. 942-954.

45. Carter P. Improving the efficacy of antibody-based cancer therapies. // Nat. Rev. Cancer. 2001. V. 1. P. 118-129.

46. Chen H.H., Mack L.M., Kelly R., Ontell M., Kochanek S., Clemens P.R. Persistence in muscle of an adenoviral vector that lacks all viral genes // Proc Natl Acad Sci USA. 1997. V. 4. № 94(5). P. 1645-50.

47. Chen S.H., Shine H.D., Goodman J.C., Grossman R.G., Woo S.L. Gene therapy for brain tumors: Regression of experimental gliomas by adenovirusmediated gene transfer in vivo. II Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1994. V. 91. P. 3054-3057.

48. Chiocca S., Kurzbauer R., Schaffner G., Baker A., Mautner V., Cotten M. The complete DNA sequence and genomic organization of the avian adenovirus CELO // J. Virol. 1996. V. 70. P. 2939 2949.

49. Chu G., Hayakawa H., Berg P. Electroporation for the efficient transfection of mammalian cell with DNA. // Nucleic Acids Res. 1987. V. 15, P. 1311-1326.

50. Clemens P., Kochanek S., Sunada Y., Chan S., Chen H.H., Campbell K., Caskey C.T. In vivo muscle gene transfer of full-length dystrophin with an adenoviral vector that lacks all viral genes. // Gene Ther. 1996. V.3(l 1). P.965-972

51. Colby W., Shenk T. Adenovirus type 5 virions can be assembled in vivo in the absence of detectable polypeptide IX. // J. Virol. 1981. V. 39. P. 977 980.

52. Cortez-Retamozo V., Backmann N., Senter P.D., Wernery U., De Baetselier P., Muyldermans S., Revets H. Efficient cancer therapy with a nanobodybased conjugate. // Cancer Res. 2004. V. 64. P. 2853-2857.

53. Cortez-Retamozo V., Lauwereys M., Hassanzadeh Gh.G., Gobert M., Conrath K. et al. Efficient tumor targeting by single-domain antibody fragments of camels. // Int. J. Cancer. 2002. V. 98. P. 456-462.

54. Crawford-Miksza L., Schnurr D.P. Analysis of 15 adenovirus hexon proteins reveals the location and structure of seven hypervariable regions containing serotype-specific residues. // J Virol. 1996. V. 70. P. 1836-1844.

55. Curiel D. Capsid-modified recombinant adenovirus vectors and methods of use // United States patent № 6555368.

56. Davis G. Structural studies on cellulases. // Biochem. Soc. Trans. 1998. V. 26. P. 167-173.

57. Davison A.J., Benko M., Harrach B. Genetic content and evolution of adenoviruses. // J Gen Virol. 2003. V. 84. P. 2895-2908.

58. Davison A.J., Telford E., Watson M.S., McBride K., Mautner V. The DNA sequence of adenovirus type 40. //J. Mol. Biol. 1993. V. 234. P. 1308-1316.

59. Davison A J., Wright K.M., Harrach B. DNA sequence of frog adenovirus. // J. Gen. Virol. 2000. V. 81. P. 2431-2439.

60. Decanniere K., Muyldermans S., Wyns L. Canonical antigen-binding loop structures in immunoglobulins: more structures, more canonical classes? // J. Mol. Biol. 2000. V. 300. P. 83-91.

61. Desmyter A., Transue T. R., Ghahroudi M. A., Thi M. H., Poortmans F., Hamers R. et al. Crystal structure of a camel single-domain VH antibody fragment in complex with lysozyme. //Nat. Struct. Biol. 1996. V. 3. P. 803-811.

62. Dmitriev I., Kashentseva E.A., Seki T., Curiel D.T. Utilization of minor capsid polypeptides IX and Ilia for adenovirus targeting. // Mol Ther. 2001. V. 3. P. 167.

63. Dmitriev I.P., Kashentseva E.A., Curiel D.T. Engineering of adenovirus vectors containing heterologous peptide sequences in the C terminus of capsid protein IX. // J. Virol. 2002. V. 76. P. 6893-6899.

64. Duff S. E., Li C., Garland J.M., Kumar S. CD105 is important for angiogenesis: evidence and potential applications. // FASEB J. 2003. V. 17. P. 984-992.

65. Dumoulin M., Conrath K., Van Meirhaeghe A., Meersman F., Heremans K., Frenken L.G., Muyldermans S, Wyns L, Matagne A. Single-domain antibody fragments with high conformational stability // Protein Sci. 2002. V.l 1. P.500-515.

66. Eastham J.A., Hall S.J., Sehgal I., Wang J., Timme T.L., Yang G., Connell-Crowley L., Elledge S.J., Zhang W.W. et al. In vivo gene therapy with p53 orp21 adenovirus for prostate cancer. // Cancer Res. 1995. V. 55. P. 5151-5155.

67. Els Conrath K., Lauwereys M., Wyns L., Muyldermans S. Camel singledomain antibodies as modular building units in bispecific and bivalent antibody constructs. // J. Biol. Chem. 2001. V. 276. P. 7346-7350.

68. Enders J.F., Bell J.A., Dingle J.H., Francis T. J., Hilleman M.R., Huebner R.J., Payne A.M. Adenoviruses: group name proposed for new respiratory-tract viruses//Science. 1956. V. 124(3212). P. 119-120.

69. Engelhardt J.F., Ye X., Doranz B., Wilson J.M. Ablation of E2A in recombinant adenoviruses improves transgene persistence and decreases inflammatory response in mouse liver. // Proc Natl Acad Sci USA. 1994. V. 21. № 91(13). P. 6196-6200.

70. Engler J. A. The nucleotide sequence of the polypeptide IX gene of human adenovirus type 3. // Gene. 1981. V. 13. P. 387 394.

71. Ewert S.C.C., Conrath K., Pluckthun A. Biophysical properties of camelid VHH domains compared to those of human VH3 domains. // Biochemistry. 2002. V. 41. P. 3628-3636.

72. Fabry C.M., Rosa-Calatrava M., Moriscot C., Ruigrok R.W., Boulanger P., Schoehn G. The C-terminal domains of adenovirus serotype 5 protein IX assemble into an antiparallel structure on the facets of the capsid. // J Virol. 2009. V. 83(2). P. 1135-1139.

73. Falgout B., Ketner G. Characterization of adenovirus particles made by deletion mutants lacking the fiber gene. // J Virol. 1988. V. 62. P. 622-625.

74. Farkas S. L. et al. Genomic and phylogenetic analyses of an adenovirus isolated from a corn snake (Elaphe guttata) imply a common origin with members of the proposed new genus Atadenovirus. // J Gen Virol. 2002. V. 83(10). P. 24032410.

75. Fessler S.P., Young C.S. Control of adenovirus early gene expression during the late phase of infection. // J. Virol. 1998. V. 72. P. 4049 4056.

76. Furcinitti P.S., van Oostrum J., Burnett R.M. Adenovirus polypeptide IX revealed as capsid cement by difference images from electron microscopy and crystallography. //EMBO J. 1989. V. 8. P. 3563-3570.

77. Gall J., Kass-Eisler A., Leinwand L., Falck-Pedersen E. Adenovirus type 5 and 7 capsid chimera: fiber replacement alters receptor tropism without affecting primary immune neutralization epitopes. // J. Virol. 1996. V. 70(4). P. 2116-2123.

78. Gallichan W.S., Rosenthal K.L. Long-term immunity and protection against herpes simplex virus type 2 in the murine female genital tract after mucosal but not systemic immunization. // J. Infect. Dis. 1998. V. 177. P. 1155-1161.

79. Gao G.P., Yang Y., Wilson J. Biology of adenovirus vectors with El and E4 deletions for liver-directed gene therapy. // J. Virol. 1996. V. 70. P. 8934-8943.

80. Gilkes N.R., Henrissat B., Kilburn D.G., Miller R.J., and Warren R.A. Domains in microbial -l,4-glycanases: sequence conservation, function,'; and enzyme families. //Microbiol. Rev. 1991. V. 55. P. 303-315.

81. Gilkes N.R., Warren R.A., Miller R.J., and Kilburn D.G. Precise excision of the cellulose binding domains from two Cellulomonas fimi cellulases by a homologous protease and the effect on catalysis. // J. Biol. Chem. 1988. V. 263. P. 10401-10407.

82. Glasgow J.N., Mikheeva G., Krasnykh V., Curiel D.T. A strategy for adenovirus vector targeting with a secreted single chain antibody // PLoS One. 2009. V. 4(12). P. 8355.

83. Glotzer J.B., Saltik M., Chiocca S., Michou A.I., Moseley P., Cotten M. Activation of heat-shock response by an adenovirus is essential for virus replication. //Nature. 2000. V. 407(6801). P. 207-211.

84. Goldman M.J., Yang Y., Wilson J.M. Gene therapy in a xenograft model of cystic fibrosis lung corrects chloride transport more effectively than the sodium defect. //Nat. Genet. 1995. V. 9. P. 126-131.

85. Graham F.L. and Prevec L. Manipulation of adenovirus vectors. // Methods in Mol.Biol. 1994. V. 7. P. 109-127.

86. Graham F.L., Smiley J., Russell W.C., Nairn R. Characteristics of a human cell line transformed by DNA from human adenovirus type 5. // J Gen Virol. 1977. V. 36(1). P. 59-74.

87. Graham F.L., Prevec L. Adenovirus-based expression vectors and recombinant vaccines. In "Vaccines: New approaches to immunological Problems" (R.W. Ellis, ed.). P. 363-389. Butterworth-Heinemann, Boston, MA. 1992.

88. Green K.Y., Wold W.S.M. Human adenoviruses: growth, purification and transfection assay. // Methods Enzymology. 1980. V. 80. P. 425-431.

89. Greenberg A.S., Avila D., Hughes M., Hughes A., McKinney E.C., Flajnik M.F. A new antigen receptor gene family that undergoes rearrangement and extensive somatic diversification in sharks. // Nature. 1995. V.374. P. 168-173.

90. Ha J.S., Lee Y.M., Choi S.L., Song J.J., Shin C.S., Kim J.H., Lee S.G. Thermostable beta-glycosidase-CBD fusion protein for biochemical analysis of cotton scouring efficiency. // J Microbiol Biotechnol. 2008. V. 18(3). P. 443-448.

91. Hamers-Casterman C., Atarhouch T., Muyldermans S., Robinson G., Hamers C., Songa E.B., Bendahman N., Hamers R. Naturally occurring antibodies devoid of light chains. //Nature. 1993. V. 363. P. 446-448.

92. Hanahan D. Studies of transformation of Escherichia coli with plasmids. // J Mol Biol. 1983. V.166. P. 557-580.

93. Harmsen M.M., De Haard H.J. Properties, production, and applications of camelid single-domain antibody fragments. // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2007. V. 77. P. 13-22.

94. Harmsen M.M., Ruuls R.C., Nijman I .J., Niewold T.A., Frenken L.G., de Geus B. Llama heavy-chain V regions consist of at least four distinct subfamilies revealing novel sequence features. // Mol. Immunol. 2000. V. 37(10). P. 579-590.

95. Harmsen M., van Solt C.B., Fijten H.P., Van Setten M.C. Prolonged in vivo residence times of llama single-domain antibody fragments in pigs by binding to porcine immunoglobulins. // Vaccine. 2005. V. 23. P. 4926-4934.

96. Harpst J., Ennever J., Russell W. Physical properties of nucleoprotein cores from adenovirus type 5. //Nucleic Acids Res. 1977. V. 4(2). P. 477-490.

97. Hashimoto H., Tamai Y., Okazaki F., Tamaru Y., Shimizu T., Araki T., Sato M. The first crystal structure of a family 31 carbohydratebinding module with affinity to beta-1,3-xylan. // FEBS Lett. 2005. V. 579. P. 4324-4328.

98. Hedley S.J., Auf der Maur A., Hohn S., Escher D., Barberis A., Glasgow J.N., et al. An adenovirus vector with a chimeric fiber incorporating stabilized single chain antibody achieves targeted gene delivery. // Gene Therapy. 2006. V. 13. P. 88-94.

99. Hemminki A., Belousova N., Zinn K.R., Liu B., Wang M., Chaudhuri T.R., et al. An adenovirus with enhanced infectivity mediates molecular chemotherapy of ovarian cancer cells and allows imaging of gene expression. // Mol Ther. 2001. V. 4. P. 223-231.

100. Hemminki A., Wang M., Desmond R.A., Strong T.V., Alvarez R.D., Curiel D.T. Serum and ascites neutralizing antibodies in ovarian cancer patients treated with intraperitoneal adenoviral gene therapy. // Hum Gene Ther. 2002. V. 13. P. 1505-1514.

101. Henning P., Andersson K.M., Frykholm K., Ali A., Magnusson M.K., Nygren P.A., et al. Tumor cell targeted gene delivery by adenovirus 5 vectors carrying knobless fibers with antibody-binding domains. // Gene Therapy. 2005. V. 12. P. 211-224.

102. Hilden L., G. Johansson. Recent developments on cellulases and carbohydrate-binding modules with cellulose affinity. // Biotechnol. Lett. 2004. V. 26. P. 1683-1693.

103. Hitt M.M., Addison C.L., Graham F. L. Human adenovirus vectors for gene transfer into mammalian cells. In "Advances in Pharmacology" (T. August, ed.), V. 40. P. 137-206. Academic Press, San Diego. 1997.

104. Holmes D., Quigley M. A rapid boiling method for the preparation of bacterial plasmids. // Anal Biochem. 1981. V. 114. P. 193.

105. Imler J.L. Adenovirus vectors as recombinant viral vaccines. // Vaccine. * 1995. V. 13. P. 1143-1151.t !

106. Jacobs S.C., Davison A.J., Carr S., Bennett A.M., Phillpotts R., Wilkinson G.W.G. Genome Sequence of Human Adenovirus 4. // National Center for Biotechnology Information, NIH, Bethesda, MD. 2004.

107. Jervis E.J., Haynes C.A., Kilburn D.G. Surface diffusion of cellulases and their isolated binding domains on cellulose. // J. Biol. Chem. 1997. V. 272. №38. P. 24016-24023.

108. Jespers L., Schon O., Famm K., Winter G. Aggregation-resistant domain antibodies selected on phage by heat denaturation. // Nat. Biotechnol. 2004. V. 22. P.1161-1165.

109. Jobling S.A., Jarman C., Teh M.M., Holmberg N., Blake C., Verhoeyen M.E. Immunomodulation of enzyme function in plants by single-domain antibody fragments. // Nat. Biotechnol. 2003. V. 21. P. 77-80.

110. Khazaeli M.B., Conry R.M., LoBuglio A.F. Human immune response to monoclonal antibodies. //J. Immunother. 1994. V. 15. P. 42-52.

111. Konz J.R., Lee A.L., Brian To C.S., Goerke A.R. Method of adenovirus purification // United States patent № 2005/0196854A1.

112. Korokhov N., de Gruijl T.D., Aldrich W.A., Triozzi P.L., Banerjee P.T., Gillies S.D. High efficiency transduction of dendritic cells by adenoviral vectors targeted to DC-SIGN. // Cancer Biol Ther. 2005. V. 4. P. 289-294.

113. Korokhov N., Mikheeva G., Krendelshchikov A., Belousova N., Simonenko V., Krendelshchikova V., et al. Targeting of adenovirus via genetic modification of the viral capsid combined with a protein bridge. // J. Virol. 2003. V. 77. P. 12931-12940.

114. Kovacs E.R., Benko M. Complete sequence of raptor adenovirus 1iconfirms the characteristic genome organization of siadenoviruses. // Infect Genet Evol. 2011. V. 11(5). P. 1058-1065.

115. Krasnykh V., Belousova N., Korokhov N., Mikheeva G., Curiel D.T. Genetic targeting of an adenovirus vector via replacement of the fiber protein with the phage T4 fibritin. // J. Virol. 2001. V. 75. P. 4176-4183.

116. Krasnykh V., Dmitriev I., Mikheeva G., Miller C.R., Belousova N., Curiel D.T. Characterization of an adenovirus vector containing a heterologous peptide epitope in the HI loop of the fiber knob. // J Virol. 1998. V. 72. P. 18441852.

117. Krasnykh V.N., Mikheeva G.V., Douglas J.T., Curiel D.T. Generation of recombinant adenovirus vectors with modified fibers for altering viral tropism. // J. Virol. 1996. V. 70. P. 6839-6846.

118. Krougliak V., Graham F.L. Development of cell lines capable of complementing El, E4, and protein IX defective adenovirus type 5 mutants. // Hum. Gene Ther. 1995. V. 6. P. 1575-1586.

119. Kuo J. Electron microscopy: methods and protocols // Humana press. 2007. (2nd edition) Clifton, NJ.

120. Lange I.G., Daxenberger A., Meyer H.H. Studies on the antibody response of Lama glama-evaluation of the binding capacity of different IgG subtypes in ELISAs for clenbuterol and BSA. // Vet. Immunol. Immunopathol. 2001. V. 83. P. 1-9.

121. Laver W.G., Wrigley N.G., Pereira H.G. Removal of pentons from particles of adenovirus type 2. // Virology. 1969. V. 39. P. 599-604.

122. Le L.P., Everts M., Dmitriev I.P., Davydova J.G., Yamamoto M., Curiel D.T. Fluorescently labeled adenovirus with pIX-EGFP for vector detection. // Mol Imaging. 2004. V. 3. P. 105-116.

123. Lee J., Fenton B.M., Koch C.J., Frelinger J.G., Lord E.M. Interleukin 2 expression by tumor cells alters both the immune response and the tumor microenvironment. //Cancer Res. 1998. V. 58. P. 1478-1485.

124. Legerski R., Robberson D. Analysis and optimization of recombinant DNA joining reactions.//J of Mol Biol. 1985. V. 181.P. 297-312.

125. Lehtio J., Sugiyama J., Gustavsson M., Fransson L., Linder M., Teeri T.T. The binding specificity and affinity determinants of family 1 and family 3 cellulose binding modules. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2003. V. 100. № 2. P. 484-489.

126. Lehtio J., Wernerus H., Samuelson P., Teeri T.T., Stahl S. Directed immobilization of recombinant staphylococci on cotton fibers by functional display of a fungal cellulose-binding domain. // FEMS Microbiol. Lett. 2001. V. 195. № 2. P. 197-204.

127. Levy I., Shani Z., Shoseyov O. Modification of polysaccharides and plant cell wall by endo-l,4-beta-glucanase and cellulose-binding domains. // Biomol. Eng. 2002. V. 19. №1. P. 17-30.

128. Levy I., Shoseyov O. Cellulose binding domains: industrial and biotechnological application. //Biotechnol. Adv. 2002. V. 20. P. 191-213.

129. Li E., Stupack D.G., Brown S.L., Klemke R., Schlaepfer D.D., Nemerow G.R. Association of pl30CAS with phosphatidylinositol-3-OH kinase mediates adenovirus cell entry. // J. Biol. Chem. 2000. V. 275. P. 14729-14735.

130. Li E., Stupack D., Bokoch G.M., Nemerow G.R. Adenovirus endocytosis requires actin cytoskeleton reorganization mediated by Rho family GTPases. // J. Virol. 1998. V. 72. P. 8806-8812.

131. Li E., Stupack D., Klemke R., Cheresh D.A., Nemerow G.R. Adenovirus endocytosis via av integrins requires phosphoinositide-3-OH kinase. // J. Virol. 1998. V. 72. P. 2055-2061.

132. Li E., Brown S.L., Stupack D.G., Puente X.S.,. Cheresh D.A, Nemerow G.R. Integrin avpi is an adenovirus coreceptor. // J. Virol. 2001. V. 75. P. 54055409.

133. Li H.-J. et al. Adenovirus tumor targeting and hepatic untargeting by a CAR ectodomain-anti-CEA bi-specific adapter. // Cancer Res. 2004. V. 67. P. 5354-5361.

134. Liao H., Myung S., Zhang Y.H. One-step purification and immobilization of thermophilic polyphosphate glucokinase from Thermobifida fusca YX: glucose-6-phosphate generation without ATP. // Appl Microbiol Biotechnol. 2011. V. 16. P. 134-140.

135. Linder M., Teeri T.T. The cellulose-binding domain of the major cellobiohydrolase of Trichoderma reesei exhibits true reversibility and a high exchange rate on crystalline cellulose. // Proc Natl Acad Sci USA. 1996. V. 93. №22. P. 12251-12255.

136. Linder M., Winiecka-Krusnell, and Linder E. Use of recombinant cellulose-binding domains of Trichoderma reesei cellulase as a selective immunocytochemical marker for cellulose in protozoa. // Appl. Environ. Microbiol. 2002. V. 68. P. 2503-2508.

137. Liu T.J., Zhang W.W., Taylor D.L., Roth J.A., Goepfert H., Clayman G.L. Growth suppression of human head and neck cancer cells by the introduction of a wild-type p53 gene via a recombinant adenovirus. // Cancer Res. 1994. V. 54. P. 3662-3667.

138. Lutz P., Rosa-Calatrava M., Kedinger C. The product of the adenovirus intermediate gene IX is a transcriptional activator. // J. Virol. 1997. V. 71. P. 5102 -5109.

139. Magnusson M.K., Hong S.S., Boulanger P., Lindholm L. Genetic retargeting of adenovirus: novel strategy employing 'deknobbing' of the fiber. // J. Virol. 2001. V. 75. P. 7280-7289.

140. Maizel J.V., White D.O., Scharff M. D. The polypeptides of adenovirus. II. Soluble proteins, cores, top components and the structure of the virion. // Virology. 1968. V. 36. P. 126-136.

141. Mangel W.F., Baniecki M.L., McGrath W.J. Specific interactions of the adenovirus proteinase with the viral DNA, an 11-amino-acid viral peptide, and the cellular protein actin. // Cell Mol Life Sci. 2003. V. 60(11). P. 2347-2355.

142. Maniatis T., Sambrook J., Fritsch E.F. Molecular Cloning: a laboratory manual // Cold Spring Harbor Laboratory Pr. 1989. 2nd edition.

143. Matsui T., Murayama M., Mita T. Adenovirus 2 peptide IX gene is expressed only on replicated DNA molecules. // Mol. Cell. Biol. 1986. V. 6. P. 4149-4154.

144. Matthews D.A., Russell W.C. Adenovirus core protein V interacts with p32-a protein which is associated with both the mitochondria and the nucleus. // J Gen Virol. 1998. V. 79(7). P. 1677-1685.

145. Matthews D.A., Russell W.C. Adenovirus protein-protein interactions: hexon and protein VI. // J Gen Virol. 1994. V. 75(12). P. 3365-3374.

146. Mattinen M.L., Linder M., Drakenberg T., Annila A. Solution structure of the cellulose-binding domain of endoglucanase I from Trichoderma reesei and its interaction with cello-oligosaccharides. // Eur. J. Biochem. 1998. V. 256. №2. P. 279-286.

147. Meier O., U. F. Greber. Adenovirus endocytosis. // J. Gene Med. 2004. V. 6(1). P. 152-163.

148. Meulenbroek R.A., Sargent K.L., Lunde J., Jasmin B.J., Parks R.J. Use of adenovirus protein IX (pIX) to display large polypeptides on the virion-generation of fluorescent virus through the incorporation of pIX-GFP. // Mol Ther. 2004. V. 9. P. 617-624.

149. Mikolajczyk S.D., Marks L.S., Partin A.W., Rittenhouse H.G. Free prostatespecific antigen in serum is becoming more complex. // Urology. 2002. V. 59. P. 797-802.

150. Morenweiser R. Downstream processing of viral vectors and vaccines // Gene Therapy. 2005. No. 12. P. S103-S110.

151. Muyldermans S. Single domain camel antibodies: Current status. // J Biotechnol. 2001. V. 74. P. 277- 302.

152. Muyldermans S., Atarhouch T., Saldanha J., Barbosa J.A., Hamers R. Sequence and structure of VH domain from naturally occurring camel heavy chain immunoglobulins lacking light chains. // Protein Eng. 1994. V. 7. P. 1129-1135.

153. Nermut M.V. The architecture of adenoviruses. // The Adenoviruses, ed. By H.S. Ginsberg. 1984.

154. Nicklin S.A., Dishart K.L., Buening H., Reynolds P.N., Hallek M., Nemerow G.R., et al. Transductional and transcriptional targeting of cancer cells using genetically engineered viral vectors. // Cancer Lett. 2003. V.201. P. 165-173.

155. Nickiin S.A,. White S.J., Watkins S.J., Hawkins R.E., Baker A.H. Selective targeting of gene transfer to vascular endothelial cells by use of peptides isolated by phage display. // Circulation. 2000. V. 102. P. 231-237.

156. Notenboom V., Boraston A.B., Kilburn D.G., Rose D.R. Crystal structures of the family 9 carbohydrate-binding module from Thermotoga maritima xylanase 10A in native and ligand-bound forms. // Biochemistry. 2001. V. 40. № 21. P. 6248-6256.

157. Nuttall S.D., Krishnan U.V., Hattarki M., De Gori R., Irving R.A., Hudson P.J. Isolation of the new antigen receptor from wobbegong sharks, and use as a scaffold for the display of protein loop libraries. // Mol. Immunol. 2001. V. 38. P. 313-326.

158. Ohno T., Gordon D., San H., Pompiii V. J., Imperiale M. J., Nabel G. J., Nabel E.G. Gene therapy for vascular smooth muscle cell proliferation after arterial injury. // Science. 1994. V. 265. P. 781-784.

159. Olichon A., Schweizer D., Muyldermans S., de Marco A. Heating as a rapid purification method for recovering correctly-folded thermotolerant VH and VHH domains. // BMC Biotechnol. 2007. V. 7. P. 7.

160. Ong E., Gilkes N.R., Miller R.C. Jr., Warren A.J., Kilburn D.G. Enzyme immobilization using a cellulose-binding domain: properties of a beta-glucosidase fusion protein. //Enz. Microb. Technol. 1991. V. 13. №1. P. 59-65.

161. Papanikolopoulou K., Forge V., Goeltz P., Mitraki A. Formation of highly stable chimeric trimers by fusion of an adenovirus fiber shaft fragment with the foldon domain of bacteriophage T4 fibritin. // J Biol Chem. 2004. V. 279. P. 8991-8998.

162. Parks R.J. Adenovirus protein IX: a new look at an old protein. // Mol Ther. 2005. V. 11. P. 19-25.

163. Pawelek J.M., Low K.B., Bermudes D. Bacteria as tumor targeting vectors. //Lancet Oncol. 2003. V. 4. P. 548-556.

164. Pereboeva L., Komarova S., Mahasreshti P.J., Curiel D.T. Fiber-mosaic adenovirus as a novel approach to design genetically modified adenoviral vectors. // Virus Res. 2004. V. 105. P. 35-46.

165. Perez J.M., Renisio J.G., Prompers J.J., van Platerink C.J., Cambillau C., Darbon H., Frenken L.G. Thermal unfolding of a llama antibody fragment: A two-state reversible process. // Biochemistry. 2001. V. 40. P. 74-83.

166. Rade J.J., Schulick A.H., Virmani R., Dichek D.A. Local adenoviral-mediated expression of recombinant hirudin reduces neointima formation after arterial injury. //Nat. Med. 1996. V.2. P. 293-298.

167. Raghothama S., Simpson P.J., Szabo L., Nagy T., Gilbert H.J., Williamson M.P. Solution structure of the CBM10 cellulose binding module from Pseudomonas xylanase A. //Biochemistry. 2000. V. 39. № 5. p. 978-984.

168. Rahbarizadeh F., Ahmadvand D., Sharifzadeh Z. Nanobody; an old concept and new vehicle for immunotargeting // Immunol Invest. 2011. V. 40(3). P. 299-338.

169. Rahbarizadeh F., Rasaee M.J., Forouzandeh-Moghadam M., Allameh A. High expression and purification of the recombinant camelid anti-MUCl single domain antibodies in Escherichia coli. // Protein Expr. Purif. 2005. V. 44. P. 32-38.

170. Ramirez C., Fung J., Miller R.C. Jr., Antony R., Warren J., Kilburn D.G. A bifunctional affinity linker to couple antibodies to cellulose. // Biotechnology (N.Y.) 1993. V. 11. №13. P. 1570-1573.

171. Rapid, single-step purification method for adenovirus vectors using CIM® QA disk monolithic column // BIA Separations GmbH. 2010. Application Note #A022

172. Reese E.T., Sui R.G.H., Levinson H.S. The biological degradation of soluble cellulose derivatives and its relationship to the mechanism of cellulose hydrolysis. // J. Bacteriol. 1950. V. 59. P. 485^97.

173. Rein D.T., Breidenbach M., Wu H., Han T., Haviv Y.S., Wang M., et al. Gene transfer to cervical cancer with fiber-modified adenoviruses. // Int J Cancer. 2004. V. 111. P. 698-704.

174. Rekosh D.M., Russell W.C., Bellet A.J., Robinson A. Identification of a protein linked to the ends of adenovirus DNA. // Cell. 1977. V.l 1(2). P. 283-295.

175. Revets H., De Baetselier P., Muyldermans S. Nanobodies as novel agents for cancer therapy. // Expert. Opin. Biol. Ther. 2005. V. 5. P. 111-124.

176. Rexroad J., Evans R.K., Russell M. Effect of pH and Ionic Strength on the Physical Stability of Adenovirus Type 5 // Pharm. Seien. 2006. V. 95. N. 2. P. 237-247.

177. Ribatti D., Vacca A., Nico B., Sansonno D., Dammacco F. Angiogenesis and anti-angiogenesis in hepatocellular carcinoma. // Cancer Treat. Rev. 2006. V. 32. P. 437-444.

178. Rodrigues E.G., Zavala F., Nussenzweig R.S., Wilson J.M., Tsuji M. Efficient induction of protective anti-malaria immunity by recombinant adenovirus. //Vaccine. 1998. V. 16. P. 1812-1817.

179. Rodriguez-Sanoja R., Oviedo N., Sanchez S. Microbial starchbinding domain. // Curr. Opin. Microbiol. 2005. V. 8. P. 260-267.

180. Rosebrough S.F. Two-step immunological approaches for imaging and therapy. // Q. J. Nucl. Med. 1996. V. 40. P. 234-251.

181. Rotticci-Mulder J.C., Gustavsson M., Holmquist M., Hult K., Martinelle M. Expression in Pichia pastoris of Candida antarctica lipase B and lipase B fused to a cellulose-binding domain. // Protein Expr. Purif. 2001. V. 21. №3. P. 386-392.

182. Rowe W.P., Huebner R., Gilmore L., Parrott R., Ward T.G. Isolation of a cytopathogenic agent from human adenoids undergoing spontaneous degeneration in tissue culture // Proc Soc Exp Biol Med. 1953.V. 84(3). P. 570-573.

183. Ruben M., Bacchetti S., Graham F. Covalently closed circles of adenovirus 5 DNA. //Nature. 1983. V. 13. № 301(5896). P. 172-174.

184. Russell W.C., Kemp G.D. Role of adenovirus structural components in the regulation of adenovirus infection. // Curr Top Microbiol Immunol. 1995. V. 199(1). P. 81-98.

185. Russell W.C., Precious B. Nucleic acid-binding properties of adenovirus structural polypeptides. // J Gen Virol. 1982. V. 63(1). P. 69-79.

186. Russell W.C. Adenoviruses: update on structure and function. // J Gen Virol. 2009. V. 90(1). P. 1-20.

187. Rux J.J., Kuser P.R., Burnett R.M. Structural and phylogenetic analysis of adenovirus hexons by use of high-resolution x-ray crystallographic, molecular modeling, and sequence-based methods. // J Virol. 2003. V. 77. P. 9553-9566.

188. Saban S.D., Silvestry M., Nemerow G.R., Stewart P.L. Visualization of alpha-helices in a 6-angstrom resolution cryoelectron microscopy structure of adenovirus allows refinement of capsid protein assignments. // J Virol. 2006. V. 80(24). P. 12049-59.

189. Sakhuja K., Reddy P.S., Ganesh S., Cantaniag F., Pattison S., Limbach P., Kayda D.B., Kadan M.J., Kaleko M., Connelly S. Optimization of the generation and propagation of gutless adenoviral vectors // Hum Gene Ther. 2003. V. 14(3). P. 243-254.

190. Sakurai F., Mizuguchi H., Yamaguchi T., Hayakawa T. Characterization of in vitro and in vivo gene transfer properties of adenovirus serotype 35 vector. // Mol. Ther. 2003. V. 8. № 5. P. 813-821.

191. Saleemuddin M. Bioaffinity based immobilization of enzymes. // Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 1999. V. 64. P. 203-226.

192. Salone B., Y. Martina, S. Piersanti, E. Cundari, G. Cherubini, L. Franqueville, C. M. Failla, P. Boulanger, I. Saggio. Integrin a3pl is an alternative cellular receptor for adenovirus serotype 5. // J Virol. 2003. V. 77. P. 13448-13454.

193. San Martin C., Glasgow J.N., Borovjagin A., Beatty M.S., Kashentseva E.A., Curiel D.T. et al. Localization of the N-terminus of minor coat protein Ilia in the adenovirus capsid. // J Mol Biol. 2008. V. 383(4). P. 923-934.

194. Sanger F., Nicklen S., Coulson A. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. // Proc Natl Acad Sci USA. 1977. V. 74. P. 5463-5467.

195. Seregin S.S., Hartman Z.C., Appledorn D.M., Godbehere S., Jiang H., Frank M.M., Amalfitano A. Novel adenovirus vectors 'capsid-displaying' a human complement inhibitor. // J Innate Immun. 2010. V. 2(4). P. 353-359.

196. Shayakhmetov D.M., Papayannopoulou T., Stamatoyannopoulos G., Lieber A. Efficient gene transfer into human CD34(+) cells by a retargeted adenovirus vector. // J Virol. 2000. V. 74. P. 2567-2583.

197. Shenk T. Adenoviridae: the viruses and their replication. // Fundamental virology. 1996. V. 3. P. 979-1016.

198. Shoseyov O., Doi R.H. Essential 170-kDa subunit for degradation of crystalline cellulose by Clostridium cellulovorans cellulase. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1990. V. 87. P. 2192-2195.

199. Shoseyov O., Hamamoto T., Foong F., Doi R.H. Cloning of Clostridium cellulovorans endo-l,4-beta-glucanase genes. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1990. V. 169. P. 667-672.

200. Shpigel E., Goldlust A., Efroni G., Avraham A., Eshel A., Dekel M., Shoseyov O. Immobilization of recombinant heparinase I fused to cellulose-binding domain. //Biotechnol. Bioeng. 1999. V. 65. №1. P. 17-23.

201. Shpigel E., Roiz L., Goren R., Shoseyov O. Bacterial cellulose-binding domain modulates in vitro elongation of different plant cells. // Plant Physiol. 1998. V. 117. №4. P. 1185-1194.

202. Simpson H.D., Barras F. Functional analysis of the carbohydrate-binding domains of Erwinia chrysanthemi Cel5 (Endoglucanase Z) and an Escherichia coli putative chitinase. //J. Bacteriol. 1999. V. 181. № 15. P. 4611-4616.

203. Singer B.B., I. Scheffrahn, R. Kammerer, N. Suttorp, S. Ergun, H. Slevogt. Deregulation of the CEACAM expression pattern causes undifferentiated cell growth in human lung adenocarcinoma cells // PLoS One. 2010. № 5. P. 8747.

204. Stevenson S.C., Rollence M., Marshall-Neff J., McClelland A. Selective targeting of human cells by a chimeric adenovirus vector containing a modified fiber protein. // J Virol. 1997. V. 71(6). P. 4782-4790.

205. Stewart P.L., Burnett R.M., Cyrklaff M., Fuller S.D. Image reconstruction reveals the complex molecular organization of adenovirus. // Cell. 1991. V. 67. P. 145-154.

206. Stewart P.L., Fuller S.D., Burnett R.M. Difference imaging of adenovirus: bridging the resolution gap between X-ray crystallography and electron microscopy. // EMBO J. 1993. V. 12. P. 2589 2599.

207. Takayama K., Reynolds P.N., Short J.J., Kawakami Y., Adachi Y., Glasgow J.N., et al. A mosaic adenovirus possessing serotype Ad5 and serotype Ad3 knobs exhibits expanded tropism. // Virology. 2003. V. 309. P. 282-293.

208. Tanaka T., Manome Y., Wen P., Kufe D.W., Fine H.A. Viral vector-mediated transduction of a modified platelet factor 4 cDNA inhibits angiogenesis and tumor growth. //Nat. Med. 1997. V. 3. P. 437-442.

209. Tang J. C-T., Vellecamp G., Bondoc L.L. Methods for purifying viruses. // United States Patent. 2001. N. US 6261823 Bl.

210. Tang Y., Le L.P., Matthews Q.L., Han T., Wu H., Curiel D.T. Derivation of a triple mosaic adenovirus based on modification of the minor capsid protein IX // Virology. 2008. V. 377(2). P. 391-400.

211. Taylor-Papadimitriou J., Burchell J.M., Plunkett T., Graham R., Correa I., Miles D., Smith M. MUC1 and the immunobiology of cancer. // J Mammary Gland Biol. Neoplasia. 2002. V. 7. P. 209-221.

212. Terpe K. Overview of tag protein fusions: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems. // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2003. V. 60. P. 523-533.

213. Thomas D.L., et al. Early region 1 transforming functions are dispensable for mammary tumorigenesis by human adenovirus type 9. // J. Virol. 1999. V. 73. P. 3071-3079.

214. Tomme P., Driver D.P., Amandoron E.A., Miller R.C. Jr., Antony R., Warren J., Kilburn D.G. Comparison of a fungal (family I) and bacterial (family II) cellulose-binding domain. // J. Bacteriol. 1995. V.177. № 15. P. 4356-4363.

215. Tsukimoto K., Takada R., Araki Y., Suzuki K., Karita S., Wakagi T., Shoun H., Watanabe T., Fushinobu S. Recognition of cellooligosaccharides by a family 28 carbohydrate-binding module // FEBS Lett. 2010. V. 584(6). P. 12051211.

216. Ugai H., Wang M., Le L.P., Matthews D.A., Yamamoto M., Curiel D.T. In vitro dynamic visualization analysis of fluorescently labeled minor capsid protein IX and core protein V by simultaneous detection. // J Mol Biol. 2010. V. 395(1). P. 55-78.

217. Vales L.D., Darnell J.E., Jr. Promoter occlusion prevents transcription of adenovirus polypeptide IX mRNA until after DNA replication. // Genes Dev. 1989. V. 3. P. 49-59.

218. Van Tilbeurgh H., P. Tomme, M. Claeyssens, R. Bhikhabhai. Limited proteolysis of the cellubiohydrolase I from Trichoderma reesei. Separation of functional domains. // FEBS Lett. 1986. V. 204. P. 223-227.

219. Vaneycken I., Devoogdt N., Van Gassen N., Vincke C., Xavier C., Wernery U., Muyldermans S., Lahoutte T., Caveliers V. Preclinical screening of anti-HER2 nanobodies for molecular imaging of breast cancer // FASEB J. 2011. V. 25(7). P. 2433-2446. }

220. Veiga E., de Lorenzo V., Fernández L.A. Structural tolerance of bacterial autotransporters for folded passenger protein domains. // Mol. Microbiol. 2004. V. 52. P. 1069-1080.

221. Vellinga J., Van der Heijdt S., Hoeben R.C. The adenovirus capsid: major progress in minor proteins. // J Gen Virol. 2005. V. 86(6). P. 1581-1588.

222. Vellinga J., et al. Spacers increase the accessibility of peptide ligands linked to the carboxyl terminus of adenovirus minor capsid protein IX. // J. Virol. 2004. V. 78. P. 3470-3479.

223. Vigne E., Mahfouz I., Dedieu J.F., Brie A., Perricaudet M., Yeh P. RGD inclusion in the hexon monomer provides adenovirus type 5-based vectors with a fiber knob-independent pathway for infection. // J Virol. 1999. V.73. P. 5156-5161.

224. Vindrieux D., Le Corre L., Hsieh T.J., Metivier R., Escobar P., Caicedo A., Brigitte M., Lazennec G. Coxsackie and adenovirus receptor is a target and a mediator of estrogen action in breast cancer // Endocr. Relat. Cancer. 2011. №18(3). P. 311-321.

225. Volpers C., Thirion C., Biermann V., Hussmann S., Kewes H., Dunant P., et al. Antibody-mediated targeting of an adenovirus vector modified to contain a synthetic immunoglobulin g-binding domain in the capsid. // J Virol. 2003. V. 77. P. 2093-2104.

226. Von Seggern D.J., Chiu C., Fleck S.K., Stewart P.L., Nemerow G.R. A helper-independent adenovirus vector with El, E3, and fiber deleted: structure and infectivity of fiberless particles. // J Virol. 1999. V. 73. P. 1601-1608.

227. Vrati S., Brookes D. E., Strike P., Khatri A., Boyle D.B., Both G.W. Unique genome arrangement of an ovine adenovirus: identification of new proteins and proteinase cleavage sites. // Virology. 1996. V. 220. P. 186-199.

228. Vu K.B.G.M., Wyns L., Muyldermans S. Comparison of llama VH sequences from conventional and heavy chain antibodies. // Мої. Immunol. 1997. V. 34. P. 1121-1131.

229. Wang A.A., Mulchandani A., Clen W. Whole-cell immobilization using cell surface-exposed cellulose-binding domain. // Biotechnol. Prog. 2001. V. 17. № 3.P. 407-411.

230. Wang Q., Greenberg G., Bunch D., Farson D., Finer M.H. Persistent transgene expression in mouse liver following in vivo gene transfer with a dEl/dE4 adenovirus vector. // Gene Ther. 1997. V. 4. P. 393-400.

231. Wang Q., Jia X.C., Finer M.H. A packaging cell line for propagation of recombinant adenovirus vectors containing two lethal gene-region deletions. // Gene Ther. 1995. V. 2. P. 775-783.

232. Ward E.S., Gussow D.H., Griffiths A.D., Jones P.T., Winter G. Binding activities of a single immunoglobulin variable domain secreted from E. coli. // Nature. 1989. V. 341. P. 544-546.

233. Webster A., Leith I.R., Nicholson J., Hounsell J., Hay R.T. Role of preterminal protein processing in adenovirus replication. // J Virol. 1997. V. 71(9). P. 6381-6389.

234. Wickham T.J., Tzeng E., Shears L.L., Roelvink P.W. II, Li Y., Lee G.M., et al. Increased in vitro and in vivo gene transfer by adenovirus vectors containing chimeric fiber proteins. //J Virol. 1997. V. 71. P. 8221-8229.

235. Wickham T.J., Filardo E.J., Cheresh D.A., Nemerow G.R. Integrin avp5 selectively promotes adenovirus mediated cell membrane permeabilization. // J. Cell Biol. 1994. V. 127. P. 257-264.

236. Wickham T.J., Mathias P., Cheresh D.A., Nemerow G.R. Integrins av(33 and avp5 promote adenovirus internalization but not virus attachment. // Cell. 1993. V. 73. P. 309-319.

237. Wiethoff C.M., Wodrich H., Gerace L., Nemerow G.R. Adenovirus protein VI mediates membrane disruption following capsid disassembly. // J Virol. 2005. V. 79(4). P. 1992-2000.

238. Wodrich H., Guan T., Cingolani G., Von Seggern D., Nemerow G., Gerace L. Switch from capsid protein import to adenovirus assembly by cleavage of nuclear transport signals. // EMBO J. 2003. V. 22(23). P. 6245-6255.

239. Wu H., Han T., Belousova N., Krasnykh V., Kashentseva E., Dmitriev I., Kataram M., Mahasreshti P.J., Curiel D.T. Identification of sites in adenovirus hexon for foreign peptide incorporation. // J Virol. 2005. V. 79(6). P. 3382-3390.

240. Wu H., Han T., Lam J.T., Leath C.A., Dmitriev I., Kashentseva E., et al. Preclinical evaluation of a class of infectivity-enhanced adenoviral vectors in ovarian cancer gene therapy. // Gene Therapy. 2004. V. 11. P. 874-878.

241. Wu T.T., Johnson G., Kabat E.A. Length distribution of CDRH3 in antibodies. // Proteins. 1993. V. 16. P. 1-7.

242. Yeh P., Dedieu J.F., Orsini C., Vigne E., Denefle P., Perricaudet M. Efficient dual transcomplementation of adenovirus El and E4 regions from a 293-derived cell line expressing a minimal E4 functional unit. // J. Virol. 1996. V. 70. P. 559-565.

243. Yuanming Zhang and Jeffrey M. Bergelson Adenovirus receptors. // J. Virol. 2005. V. 79. № 19. P. 12125-12131.

244. Zabner J., Chillon M., Grunst T., Moninger T.O., Davidson B.L., Gregory R., Armentano D. A chimeric type 2 adenovirus vector with a type 17 fiber enhances gene transfer to human airway epithelia. //J. Virol. 1999. V. 73(10). P. 8689-8695.,

245. Zhang W., Arcos R. Interaction of the adenovirus major core protein precursor, pVII, with the viral DNA packaging machinery. // Virology. 2005. V. 334(2). P. 194-202.

246. Zuckier L.S., DeNardo G.L. Trials and tribulations: Oncological antibody imaging comes to the fore. // Semin. Nucl. Med. 1997. V. 27. P. 10-29.

Информация о работе

Рогожин, Василий Николаевич
кандидата биологических наук
Москва, 2011
ВАК 03.01.06

Диссертация

Создание новых векторных систем на основе рекомбинантного аденовируса человека с генетически модифицированным капсидным белком IX - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Создание новых векторных систем на основе рекомбинантного аденовируса человека с генетически модифицированным капсидным белком IX - тема автореферата по биологии, скачайте бесплатно автореферат диссертации

Похожие работы