Выявление возбудителя вирусной диареи КРС с помощью полимеразной цепной реакции и генотипирование изолятов, циркулирующих на территории Российской Федерации

Шульпин, Михаил Иванович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Выявление возбудителя вирусной диареи КРС с помощью полимеразной цепной реакции и генотипирование изолятов, циркулирующих на территории Российской Федерации
ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Выявление возбудителя вирусной диареи КРС с помощью полимеразной цепной реакции и генотипирование изолятов, циркулирующих на территории Российской Федерации"

На правах рукописи

/¡/3

ШУЛЫ1ИН Михаил Иванович

ВЫЯВЛЕНИЕ ВОЗБУДИТЕЛЯ ВИРУСНОЙ ДИАРЕИ КРС С ПОМОЩЬЮ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ И ГЕНОТИПИРОВАНИЕ ИЗОЛЯТОВ, ЦИРКУЛИРУЮЩИХ НА ТЕРРИТОРИИ РОССИЙСКОЙ

ФЕДЕРАЦИИ

03.00.06 «Вирусология»

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Владимир - 2004

Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении «Федеральный центр охраны здоровья животных», г. Владимир.

Научный руководитель - доктор ветеринарных наук, профессор МИЩЕНКО Владимир Александрович.

Официальные оппоненты:

- Стрижаков Александр Анатольевич, доктор биологических наук, профессор (ВНИИВВиМ, г. Покров);

- Щербаков Алексей Владимирович, кандидат биологических наук (ФГУ ВН11ИЗЖ, г. Владимир).

Ведущая организация - Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности (ВНИТИВП, г. Щелково).

Защита состоится " £ (п " октября в 10 часов на заседании диссертационного совета Д220.015.01 при ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» по адресу: 600901, Г.Владимир, п.Юрьевец, ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных»

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных»

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук,

старший научный сотрудник

Г.М. Семенова

2005-4

13642 1. Общая характеристика работы

Актуальность темы. Вирусная диарея (ВД КРС) - заболевание КРС, преимущественно молодых животных, характеризующееся широким спектром клинических проявлений, способное протекать в различных формах, как в острой с летальным исходом, так и в латентной - вызывая у животного сероконверсию без каких-либо клинических проявлений. Возбудителем данного заболевания является вирус вирусной диареи КРС (по международной номенклатуре имеет название bovine viral diarrhea virus - BVDV), который относится к роду Pestivirus семейства Flaviviridae. Вирус характеризуется высокой устойчивостью во внешней среде, что способствует его широкому распространению. Статистические данные показывают, что потери в животноводстве от вирусной диареи КРС в мировой экономике составляют несколько десятков млн. долларов в год.

Постановка диагноза и оценка роли инфекции вируса ВД КРС включает эпизоотологический анализ, определение клинических признаков заболевания, оценку результатов патологоанатомических исследований и идентификацию вируса. Клинически вирусная диарея КРС может проявляться в виде эрозивно-язвенных воспалений слизистых оболочек ЖКТ, ринитом, воспалением лимфоузлов, лихорадкой, лейкопенией, диареей, стоматитом, у коров возможны аборты. При эрозивных поражениях вирусную диарею необходимо дифференцировать от таких заболеваний как чума КРС, ящур, злокачественная катаральная горячка, везикулярный стоматит, инфекционный ринотрахеит, катаральная лихорадка овец, стоматиты другой этиологии. При диарейном синдроме это заболевание дифференцируют от сальмонеллеза, гельминтоза, дизентирий, вызванных другими вирусными патогенами (рота-, корона-, парво-, энтеровирусы). В случае выявления клинических признаков заболевания, сходных с инфекцией вируса ВД КРС, необходимо подтверждение диагноза с помощью лабораторных методов.

На данный момент разработано значительное количество лабораторных методов выявления вируса ВД КРС и антител против него. Относительно новым и перспективным направлением в лабораторной диагностике является применение полимеразной цепной реакции (ПЦР). Методы, основанные на ШДР превосходят на несколько порядков иммунологические

специфичности. Применение ПЦР позволяет получить однозначный результат в течение нескольких часов, что становится важным при остром течении заболевания, когда оно может за 2-3 дня привести к летальному исходу. Также одним из значительных преимуществ ПЦР-диагностики является независимость от клеточных культур, поскольку нередки случаи контаминации вирусом ВД КРС сывороток крови КРС и самих клеточных культур, применяемых в вирусологических лабораториях. Секвенирование амплифицированных фрагментов вариабельных участков генома и сравнительный анализ с банком нуклеотидных последовательностей вируса позволяет проводить штаммовую дифференциацию и с максимальной точностью определять изменения происходящие на уровне генома В начале 90-х г, при вспышках вирусной диареи КРС в США и Канаде с выраженными признаками тромбоцитопении и сильными геморрагическими поражениями по всему организму животных, была выявлена генетически отличная от референтных штаммов группа изолятов. Вследствие этого было предложено разделить штаммы вируса ВД КРС на 2 генотипа, при этом референтные штаммы отнесли к первому генотипу, тогда как представителей новой группы- ко второму. Были выявлены антигенные отличия между представителями разных генотипов и показана возможность ускользания ряда представителей второго генотипа от вируснейтрализующих антител, выработанных против вакцинных штаммов, что приводит к неэффективности вакцинации, вследствие чего могут возникать эпизоотии вирусной диареи КРС. Ввиду новых данных об эпизоотологии заболевания возникает необходимость изучения генетической гетерогенности изолятов вируса ВД КРС, циркулирующих на территории Российской Федерации, и их генотипирование.

Таким образом, актуальной задачей является разработка методов на основе ПЦР, позволяющих выявлять широкий спектр штаммов и изолятов вируса ВД КРС, как первого, так и второго генотипов в различных биологических материалах от больных животных и определять их штаммовую принадлежность. Важное значение имеет осуществление контроля с помощью методов, основанных на ПЦР, над контаминацией данным вирусом клеточных культур и компонентов ростовой среды, применяемых в вирусологических лабораториях.

Цель и задачи исследования. Цель данных исследований заключалась в разработке метода выявления и штаммовой дифференциации вируса ВД КРС с помощью ПЦР, нуклеотидного секвенирования и сравнительного анализа нуклеотидных последовательностей, а также в изучении распространенности данного вируса в животноводческих хозяйствах Российской Федерации.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие

задачи:

- разработать на основе ПЦР метод выявления вируса ВД КРС в различных вируссодержащих образцах;

- разработать метод определения генотипа и штаммовой принадлежности выявляемых изолятов вируса ВД КРС, используя нуклеотидное секвенирование амплифицируемой области генома;

- изучить распространенность вируса ВД КРС в животноводческих хозяйствах Российской Федерации;

- провести анализ нуклеотидных последовательностей амплифицируемой области генома полевых изолятов и вакцинных штаммов вируса ВД КРС;

- провести генотипирование выявленных изолятов вируса ВД КРС и определить генетическое разнообразие данного вируса в Российской Федерации;

- создать базу данных нуклеотидных последовательностей амплифицируемой области генома вируса ВД КРС.

Научная новизна исследования. Разработан метод выявления вируса ВД КРС в различных образцах на основе ПЦР.

Разработан метод определения генотипа и штаммовой принадлежности выявленных изолятов вируса ВД КРС.

Определены нуклеотидные последовательности 5'-нетранслируемой области генома изолятов вируса ВД КРС, выявленных в патологическом материале на территории Российской Федерации в течении 2000-2003 гг. и двух отечественных вакцинных штаммов.

Проведено генотипирование полевых изолятов и определен спектр субгенотипов, циркулирующих на территории европейской части Российской Федерации.

Создана база данных нуклеотидных последовательностей 5'-нетранслируемой области генома вируса ВД КРС.

Практическая значимость исследований. Разработан метод выявления вируса ВД КРС, который позволяет с помощью ПЦР обнаруживать геном вируса в различных вируссодержащих образцах, а также проводить генотипирование и штаммовую дифференциацию на основе определения и сравнительного анализа первичной структуры фрагмента 5'-нетранслируемой области генома вируса ВД КРС. Метод прошел комиссионное испытание, одобрен ученым советом, утвержден директором ВНИИЗЖ и в настоящее время применяется в диагностических исследованиях.

С помощью разработанного метода проведен анализ фрагмента 5'-нетранслируемой области генома 25 изолятов вируса ВД КРС, выявленных в различных образцах патологического материала от животных на территории Российской Федерации в 2000-2003 г.г., а также двух отечественных вакцинных штаммов.

Создана база данных нуклеотидных последовательностей позволяет проводить штаммовую дифференциацию вируса ВД КРС вновь выявленных полевых изолятов.

Публикация научных работ. По теме диссертации опубликовано 7 научных работ.

Апробация работы. Результаты диссертации доложены и опубликованы в материалах научно-практической конференции «Болезни сельскохозяйственных животных вирусной и других этиологии и меры борьбы с ними», Иркутск 2001 г.; Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы болезней молодняка», Воронеж 2002 г.; конференции молодых ученых «Актуальные проблемы патологии свиней, крупного и мелкого рогатого скота», Владимир 2002 г.; IV Всероссийской научно-практической конференции «Генодиагностика инфекционных заболеваний», Москва 2002 г.; Международной научной конференции молодых ученых «Проблемы мониторинга и генодиагностики инфекционных болезней животных», Владимир 2004 г.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 132 страницах компьютерного текста и содержит следующие разделы: введение, обзор

литературы, результаты собственных исследований и их обсуждение, заключение, выводы, практические предложения. Список литературы включает 213 источников. Работа иллюстрирована 13 рисунками и 8 таблицами. Положения, выносимые на защиту

- Метод выявления вируса ВД КРС с помощью амплификации фрагмента 5'-

нетранслируемой области генома.

- Результаты выявления вируса ВД с помощью ПЦР в пробах патологического

материала, полученных из различных хозяйств Российской Федерации.

- Метод определения генотипа и штаммовой дифференциации полевых изолятов

вируса ВД КРС, выявленных в патологическом материале от больных животных и вакцинных штаммов.

- Результаты выявления вируса ВД КРС в клеточных культурах и сыворотках

крови.

- База данных нуклеотидных последовательностей 5'-нетранслируемой области

генома полевых изолятов вируса ВД КРС, выявленных в 2000-2003 гг. и вакцинных штаммов вируса ВД КРС.

2. Собственные исследования Материалы. В данной работе использовано 25 изолятов, выявленных в

различных образцах патологического материала, 4 вакцины против вирусной

диареи КРС отечественного производства. При оптимизации разработанного

метода использовали изолят МДБК/ВНИИЗЖ/06.00, который выявлен в

персистентно инфицированной вирусом ВД КРС культуре клеток МДБК.

В работе были использованы реактивы производства Promega, Serva, Esso, a

также отечественные реактивы марки "о.с.ч.".

Методы. В зависимости от вида исследуемого материала выделение

суммарной РНК проводили по модифицированному методу О.Г.Грибанова (1997

г.), либо по модифицированному методу P. Chomezynski (1987 г.).

Реакцию обратной транскрипции и ПЦР проводили в одной пробирке.

Реакционную смесь инкубировали при 50°С 20 мин. После этого смесь прогревали

при 94°С в течение 3 мин. Затем проводили 30 циклов реакции при следующем

режиме: 94°С в течение 30 с, 50°С- 30 с, 72°С - 30 с. Для проведения второй

амплификации, температурный режим реакции имел следующий вид: денатурация

при 94°С - 30 с, отжиг праймеров 58°С - 30 с, элонгация 72°С - 30 с. Анализ продуктов реакции осуществляли после 25 циклов в 2% агарозном геле. Наличие фрагмента ДНК длиной 170 п.н. свидетельствовало о присутствии в исследуемом материале РНК вируса ВД КРС.

Очистку продуктов реакции от непрореагировавших праймеров и dNTP проводили с помощью наборов "Magic PCR Preps DNA Purification System". Реакцию секвенирования проводили с помощью набора "fmol DNA Cycle Sequencing System", согласно инструкции.

Для анализа установленных нуклеотидных последовательностей использовали пакет прикладных программ «BioEdit», версия 5.0.6. (Т. Hall, North Carolina State University, Department of Microbiology, 2001 г.). Для графического построения дендрограмм применяли программу «TreeView», версии 1.5.2. (D.M. Roderic, 1998). Анализ предполагаемых вторичных структур проводили с помощью пакета прикладных программ «PCGENE» версии 5.15. (A. Bairoch, University of Geneva, 1988 г.).

3. Результаты собственных исследований и их обсуждение Подбор праймеров для амплификации фрагмента генома вируса ВД КРС

Анализ ряда научных работ, посвященных изучению молекулярно-биологических свойств вируса ВД КРС показал, что для выявления генома данного вируса чаще используется 5'-нетранслируемая область (5'-НТО). Данная область генома содержит как вариабельные участки, так и сайты с высокой степенью консервативности. Консервативные участки позволяют подобрать универсальные праймеры, специфичные широкому спектру штаммов и изолятов, как первого, так и второго генотипа вируса ВД КРС. А посредством сравнительного анализа первичной структуры данной области можно определять генотип изолята, и проводить штаммовую дифференциацию. Однако, при анализе профиля вариабельности 5'-НТО генома вируса ВД КРС было показано, что число фрагментов, характеризующихся минимальной степенью вариабельности и теоретически применимых в качестве мест посадки праймеров, ограничено и не все консервативные участки соответствуют требованиям, предъявляемым к местам

посадки праймеров. Вследствие этого, в 5'-НТО можно выделить только 4 потенциальных места посадки праймеров.

Для амплификации 5'-НТО генома вируса ВД КРС был выбран ряд праймеров (рис. I.), описанных в работах .Г.В.Каг (НСУ9-12) в 1993 г. и 1.Р.Ш(1ра& (ВБ1-4) в 1995 г. Из этой группы олигонуклеотидов предполагалось подобрать праймеры, наиболее эффективные для амплификации фрагмента 5'-НТО генома вируса ВД КРС, поскольку методы, предложенные данными авторами, на наш взгляд, не оптимальны для индикации генома данного вируса в патологическом материале.

Рис.1. Схема локализации праймеров на 5'-НТО генома вируса ВД КРС, использованных при выборе наиболее эффективных пар праймеров

Дополнительно на участки аналогичные праймерам НСУ9 и НСУ11 были рассчитаны 2 более специфичных праймера РУ1 и РУ2, соответственно. Для этого был проведен сравнительный анализ 5'-НТО 80-ти штаммов и изолятов вируса ВД КРС, как первого, так и второго генотипа. На основе полученных данных рассчитали первичную структуру новых праймеров (РУ1 и РУ2).

Таким образом, для эксперимента были подобраны 4 пары праймеров для первой амплификации и две - для пе$1е(1-ПЦР. Праймеры ВБ2 и ВБ3 не использовались в эксперименте, поскольку с их помощью амплифицируется слишком короткий фрагмент, и данная пара имеет выраженную специфичность ко второму генотипу. Праймеры ВБ1 и НСУ10 полностью соответствовали друг другу и в дальнейшем использовались под одним обозначением - НСУ10.

Результаты проведенных реакций, в которых использовали различные сочетания этих пар, отображены на рис. 2. Как видно на электрофореграмме, все использованные комбинации праймеров позволяют синтезировать специфичный фрагмент ДНК длиной около 110 п.н. Однако количество и специфичность продукта реакции было неодинаковым. Минимальный выход продукта наблюдался

при использовании набора праймеров, применяемых для выявления генома всех пестивирусов (дорожка 1: HCV9/HCV12; HCV10/HCV11). Это подтверждает наше предположение о том, что универсализация праймеров HCV11 и HCV9 снижает чувствительность реакции выявления генома вируса ВД КРС. В дальнейшем замена этих праймеров на олигонуклеотиды, рассчитанные на взаимодействие только с геномом вируса ВД КРС, приводила к увеличению количества синтезируемого продукта реакции (дорожки 2-7). Максимальный выход продукта наблюдался при использовании праймеров PV1 - HCV12 в первой реакции, и HCV10 - PV2 - во второй (дорожка 8). Таким образом, мы получили наиболее эффективное сочетание праймеров для детекции генома вируса ВД КРС.

Рис.2. Электрофореграмма продуктов Nested-ПЦР с различными парами праймеров:

1-HCV9/HCV12;HCVЮ/HCV11;

2 - HCV9/HCV12; HCV10/PV2;

3 HCV10/HCV11;

4 - HCV9/BD4; HCV10/PV2;

5 - PV1/BD4;

6 - PV1/BD4; HCV10/PV2;

7 - PV1/HCV12; HCV10/HCV11;

8 - PV1/HCV12; Ж^10/^2; 9-Маркер PUC19Hae Ш.

Выявление генома вируса ВД КРС в патологическом материале

С использованием разработанного метода в период с 2000 по 2003 гг. нами проведены исследования патологического материала, поступившего из 94 животноводческих хозяйств 21 региона РФ. Для исследований, как правило, поступал патологический материал от животных с клиническими признаками заболеваний, сходных с инфекцией вирусом ВД КРС. С помощью амплификации 5'-НТО геном вируса ВД КРС был выявлен в материале, поступившем из 34 животноводческих хозяйств, что составило примерно 35% от общего числа. Геном вируса ВД КРС выявили в материале, поступившем из Владимирской, Вологодской, Ивановской, Московской, Нижегородской, Тамбовской, Тульской, Ярославской областей а также Краснодарского края.

Наибольшее количество проб для исследований было получено из хозяйств Владимирской, Московской и Нижегородской областей. Так из Владимирской области нами исследован материал, присланный из 31 животноводческого хозяйства, расположенных в 10 районах. Результаты исследований показали, что в 16 из них (52%) у поголовья циркулирует вирус ВД КРС. Для некоторых хозяйств отбор и исследование патологического материала проводили неоднократно, что позволило получить более объективную картину об эпизоотической ситуации в данных стадах. Так в СПК им. В И. Ленина Собинского района отбор материала проводили 8 раз с интервалом примерно в полгода. В данном хозяйстве наблюдаются массовые заболевания скота различных возрастных групп, характеризующиеся поражением органов ЖКТ и дыхательных путей. В результате исследований вирус ВД КРС выявили в шести случаях. Это свидетельствует о персистентной инфекции данным вирусом поголовья данного хозяйства.

Из Нижегородской области к нам был прислан материал для исследования из 19 животноводческих хозяйств 9 районов. Результаты исследований показали, что в материале из 7 хозяйств (37%) выявили геном вируса ВД КРС, при исследовании патологического материала, присланного из 8 хозяйств 6 районов Московской области, геном вируса ВД КРС был выявлен в материале только из одного хозяйства.

В остальных регионах Российской Федерации исследования ограничивались в основном одним, максимум 6 (Краснодарский край) хозяйствами. Но даже такое мозаичное исследование дает достаточно объективное представление о широком распространении вируса ВД КРС, по крайней мере, в европейской части РФ, поскольку из восточной части страны нами исследован материал только из одного хозяйства Тюменской области. Ранее, в 1986-2000 гг., проводились эпизоотологические исследования по вирусной диареи КРС на территориях Урала и Сибири. По данным института экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока (ИЭВСиДВ) и Свердловской научно-исследовательской ветеринарной станции (НИВС), антитела к вирусу ВД КРС выявляли в сыворотках крови от животных из Свердловской, Курганской, Новосибирской областей, Алтайского и Красноярского края. Уровень серопозитивности в хозяйствах при этом колебался от 20 до 90%.

Таким образом, с помощью полученных данных было показано, что на территории Российской Федерации вирус ВД КРС распространен практически повсеместно. При этом следует отметить, что с момента первого описания в нашей стране случая вирусной диареи КРС в 1967 г. по данным, предоставляемым в МЭБ, заболевание в СССР регистрировалось в единичных случаях на ограниченных территориях, либо вовсе отсутствовало. С 1995 года в бюллетене МЭБ перестали публиковать данные по заболеваниям животных списка С. Сомнительно, что широкое распространение вируса произошло в наше время. По-видимому, это противоречие связано с развитием лабораторных методов выявления возбудителя данного заболевания.

По данным J.С.Baker (1987 г.) вирусной диареей обычно болеют животные в возрасте до двух лет, при этом наиболее часто в возрасте от 6 до 12 месяцев. При выпойке молозива, содержащего антитела против вируса ВД КРС, теленок приобретает пассивный иммунитет, защищающий его от инфекции в течение первых месяцев жизни.

По полученным нами данным, при исследовании патологического материала от животных с поражением органов желудочно-кишечного тракта и дыхательных путей, частота выявления вируса ВД КРС у телят (до 6 мес.) и молодняка (с 6 до 18 мес.) существенно не отличалась и составляла 39% и 43% соответственно (табл.1). У взрослых животных также выявляли геном вируса ВД КРС. но значительно реже, только в 18 % случаев. При этом в одном случае у животного наблюдались диарея, а при вскрытии гиперемия кишечника. В остальных случаях у коров наблюдались нарушения репродуктивных процессов.

Следует отметить, что в 60% случаев выявления генома вируса ВД КРС в исследуемом материале были обнаружены и другие вирусные этиологические агенты заболеваний КРС в различных сочетаниях (рис.3). Чаще при исследовании патологического материала вместе с геномом вируса ВД КРС выявляли геном рота-и коронавирусов. Реже, вместе с геномом вируса ВД КРС были выявлены вирусы инфекционного ринотрахеита-пустулезного вульвавагинита (ИРТ), парагриппа-3 и герпеса КРС четвертого типа.

Таблица 1

Частота выявления вируса ВД КРС в патологическом материале от животных различных возрастных групп с поражением органов желудочно-кишечного тракта и дыхательных путей

Возрастная группа Количество обследованных животных Количество животных, у которых выявлен вирус ВД КРС Процентное отношение, %

Телята (до 6 мес.) 103 40 38,8

Молодняк (с 6 до 18 мес.) 14 6 42,9

Взрослые (от 18 мес.) 27 5 18,5

В большинстве случаев вирусная диарея КРС протекает в латентной форме, за исключением случаев болезни слизистой, при которой летальность достигает 80100%. Однако, субклиническое течение инфекции, вследствие способности вируса к индукции у макроорганизма временной лейкопении и дисфункции нейтрофилов, может быть осложнено суперинфицированием другими этиологическими агентами.

Ранее проводились исследования заболеваний КРС, вызванных ассоциативно протекающими инфекциями бактериальными и вирусными патогенами, которые включали вирус ВД КРС. При этом наблюдали, что в различных сочетаниях ассоциативная инфекция приводит к различным клиническим проявлениям. Так, наиболее остро протекающие респираторные заболевания наблюдали при смешанной инфекции вируса ВД КРС с вирусом ИРТ или респираторно-синцитиальным вирусом, а также с Pasterella haemolytica. При энтерических инфекциях наиболее тяжело протекали заболевания, вызванные смешанной инфекцией вируса ВД КРС с ротавирусом или Salmonella spp. При этом выраженность клинических признаков не зависела от того, был ли вирус ВД КРС цитопатогенным, либо нецитопатогенным. Менее выраженное клиническое проявление вызывало коинфицирование вирусами ВД КРС и герпеса КРС типа 4 и парагриппа-3. Авторы данных работ не утверждали, что ассоциативные инфекции являются ключевым фактором в развитии острых форм вирусной ВД КРС. Однако,

существует тенденция к более тяжелому протеканию данного заболевания при кои суперинфицировании такими патогенами, как ротавирус и вирус инфекционного ринотрахеита.

41%

1 2 3 4 5 6

Рис.3. Диаграмма, показывающая уровень частоты выявления вируса ВД КРС в сочетании с другими вирусными этиологическими агентами заболевании КРС. 1 - только ВД КРС; 2 - ВД КРС и ротавирус КРС; 3 - ВД КРС и коронавирус КРС; 4- ВД КРС и вирус ИРТ; 5 - ВД КРС и вирус герпеса четвертого типа; 6 - ВД КРС и вирус ПГ-3.

Вирус ВД КРС выявляли во внутренних органах павших и вынуждено убитых животных, таких как легкие, трахея, селезенка, лимфатические узлы (мезентериальные, средостенные, бронхиальные), тонкий и толстый отделы кишечника, а у больных животных - в смывах со слизистой оболочки носовой полости, влагалища и в фекалиях. Чаще всего вирус ВД КРС выявляли в легких, чуть реже в слизистой кишечника и его содержимом, а также в носовых истечениях. При этом у исследуемых животных могла наблюдаться патология органов ЖКТ и/или дыхательных путей. Также, нами показано, что с помощью разработанного нами метода можно проводить контроль спермы, применяемой для искусственного осеменения.

Из 34 случаев инфекции вируса ВД КРС в 13 случаях (38%) вирус выявлен в материале от животных с респираторными заболеваниями, в 12 случаях (35%) -при диареином синдроме, в 7 случаях (21%) - при смешанной клинической картине и в 2 случаях (6%) от животных с репродуктивными заболеваниями.

По результатам исследования патологического материала можно сказать, что вирус ВД КРС распространен на территории европейской части Российской Федерации достаточно широко. Геном данного вируса выявляется среди животных

с поражениями органов желудочно-кишечного тракта и органов дыхания до 18 месяцев с одинаковой частотой, составляющей примерно 40%. При этом геном вируса ВД КРС может выявляться во всех отделах кишечника, в том числе в его содержимом и фекалиях, в лимфоидных органах (лимфатических узлах и селезенке), в органах дыхательных путей, носовых смывах и истечениях, а также в смывах со слизистой влагалища у коров и сперме быков-производителей.

Выявление контаминации вирусом ВД КРС клеточных культур

При использовании клеточных культур в вирусологии для продуцирования вирусов или иных целей перед исследователями постоянно возникает проблема их контаминации посторонними агентами. Наиболее частым источником контаминации является сыворотка крови КРС, которая применяется как компонент среды для роста клеток. При внесении в культуру клеток многие изоляты вируса ВД КРС способны реплицироваться без видимых отклонений в физиологии и метаболизме клеток. При этом нельзя говорить о «безвредности» данной контаминации, поскольку негативное действие агентов, контаминируюших культуру клеток может выражаться во взаимном влиянии метаболических процессов с самыми разнообразными последствиями. Посредством пассирования изучаемого вируса агенты, контаминирующие культуру клеток попадают в расплодку вируса, создавая трудности' в музейной работе, получении антисывороток, искажая результаты серологических исследований, а также, вследствие интерференции вирусов, препятствуют получению ожидаемых вирусных продуктов с необходимой чистотой и концентрацией.

Нами тестировались зарубежные и отечественные клеточные культуры, применяемые в нашем учереждении для продуцирования различных вирусов (табл.2). С помощью разработанного нами метода исследованы такие культуры клеток, как ППК, КГ-91, КСТ, ПТ, Ма-104, MARK-145, MDBK, ВНК-21, VERO.

Результаты исследований показали, что все тестированные клеточные культуры, которые имеют происхождение от различных внутренних органов парнокопытных животных, содержали в себе вирус ВД КРС. Такие клеточные культуры, как ВНК-21, MARK-145, давали отрицательный результат ПЦР во всех повторах. Клеточная культура VERO тестировалась 3 раза с интервалом примерно в год, и в первых двух случаях результат был отрицательный, а в последнем -

положительный. Культура клеток Ма-104, происходящая от клеток почки макаки-резус, при двукратном исследовании дала положительный результат реакции. Характерной особенностью представителей рода пестивирусов является то, что данные вирусы способны реплицироваться in vitro только в клетках парнокопытных. Вряд ли мы столкнулись со случаем долговременной контаминации клеток гетерогенного животного (VERO, Ма-104), скорее всего, это результат заноса вируса в клеточную культуру с котаминироваиной сывороткой крови.

Таблица 2

Результаты исследования контаминации вирусом ВД КРС клеточных

культур

Культура клеток Происхождение Результат исследования

ппк Клетки почки свиньи Положительный

КГ-91 Клетки гонады козы Положительный.

КСТ Клетки коронарных сосудов сердца плода коровы Положительный.

ПТ Клетки почки теленка Положительный.

ВНК-21 Клетки почки сирийского хомяка Отрицательный

MARK-145 Клетки почки африканской зеленой мартышки Отрицательный

Ма-104 Клетки почки африканской зеленой мартышки Положи гел ьный.

MDBK Клетки почки КРС Положительный.

VERO Клетки почки африканской зеленой мартышки ОтрицатУположит.

Также нами тестировались сыворотки крови КРС, применяемые для культивирования клеток. Из 10 исследованных образцов различных производителей в 5 случаях выявляли геном вируса ВД КРС.

Таким образом, на основе полученных данных можно сказать, что контаминирование культур клеток вирусом ВД КРС является актуальной

проблемой, поскольку на примере наших исследований показано, что фактически все клеточные культуры, имеющие происхождение от внутренних органов парнокопытных содержат данный вирус. При этом показано, что вирус способен персистировать в данных клеточных культурах довольно длительное время. Для остальных клеточных культур остается опасность заноса вируса ВД КРС с клеточной ростовой средой, содержащей в своем составе сыворотку крови КРС.

Генотипировяние и анализ нуклеотидных последовательностей изолятов вируса ВД КРС, выявленных на территории Российской Федерации Прежде чем проводить сравнительный анализ и определение генотипа и штаммовой принадлежности вновь выявленных изолятов вируса ВД КРС, первоначально, необходимо было провести анализ нуклеотидных последовательностей 5'-НТО генома различных штаммов и изолятов вируса ВД КРС, опубликованных в EMBL.

С помощью компьютерных программ были проанализированы последовательности 160 различных штаммов и изолятов вируса ВД КРС. На рис. 4 отображено генетическое отличие данных штаммов и изолятов. Необходимо отметить, что для построения дендрограммы использовали выравнивание последовательностей только 40 изолятов, однако представленные штаммы достаточно полно отображают генетическое разнообразие, характерное для 5'-НТО генома вируса ВД КРС. Остальные штаммы и изоляты давали более мелкую дихотомию представленных ветвей. Кроме вируса ВД КРС в дендрограмму внесены данные по другим представителям рода: вирусу КЧС (штаммы Brescia, Alfort, Shimen) и вирусу ПБО (штамм Х818).

Данная дендрограмма наглядно демонстрирует высокую степень генетической вариабельности не только всего рода пестивирусов, но и вируса ВД КРС. На дендрограмме достаточно четко определено положение первого и второго генотипа. При этом отличие между генотипами так же отчетливо, как и референтных штаммов вирусов ВД КРС, КЧС и ПБО, и составляет около 30%. Поэтому, применяя сравнительный анализ первичной структуры 5'-НТО исследуемого изолята с нуклеотидными последовательностями из банка данных, нетрудно определить отношение его к тому или иному генотипу.

Наиболее полное исследование по генетическому типированию и классификации штаммов и изолятов вируса ВД КРС, были проведены 8. "УПсек с соавт. (2001 г.). В данной работе проведен сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей изолятов, выделенных на территориях европейских стран с последовательностями штаммов и изолятов вируса ВД КРС, зарегистрированными в ЕМБЬ, из США, Канады, Новой Зеландии и Мозамбика. В данной работе авторами предлагается деление первого генотипа на 11 групп. Обширные исследования нолевых изолятов вируса ВД КРС показали, что второй генотип встречается спорадически и еще недостаточно данных для дифференциации на субгенотипы.

Рис.4. Дендрограмма, построенная на основе гомологии нуклеотидных последовательностей 5'-НТО генома штаммов и изолятов вируса ВД КРС первого (ВД КРС-1) и второго (ВД КРС-2) генотипов, а так же ряда штаммов вирусов КЧС и ПБО.

Разработанный нами метод индикации и штаммовой дифференциации вирхса ВД КРС на основе ПЦР и секвенирования амплифицированных фрагментов кДНК был использован для исследования 24 изолятов вируса ВД КРС, выявленных

в 2000-2002 гг. в образцах патологического материала, присланного из животноводческих хозяйств различных регионов России.

Нуклеотидные последовательности 5'-НТО генома выявленных изолятов вируса ВД КРС сравнили между собой и с последовательностями, опубликованными EMBL. Полученные данные представлены на рис.5 в виде дендрограммы. Результаты сравнительного анализа показали, что все выявленные нами изоляты относятся к первому генотипу и имеют от 10 до 18% отличий от таких референтных штаммов, как NADL, Oregon и Osloss, в то время как уровень отличий от штаммов второго генотипа Waters и 890 составляет около 30%.

1е

Рис.5. Дендрограмма, отражающая уровень нуклеотидных отличий фрагмента 5'-НТО генома штаммов и изолятов вируса ВД КРС. №1-43, 70-первичная структура 5-НТО штаммов и изолятов получена из EMBL. №44-69 первичная структура 5-НТО изолятов, выявленных нами на территории России.

Среди исследованных изолятов вируса ВД КРС отсутствовали представители второго генотипа. При теоретической разработке метода индикации генома вируса ВД КРС праймеры рассчитывались с учетом нуклеотидных последовательностей штаммов первого и второго генотипов. Однако на данный момент мы не имеем в своем распоряжении представителей второго генотипа, что не позволило провести лабораторную апробацию данного метода для обоих

44-Собинский/Бабаево/09 00

45-Собинский/Бабаево/П 01

46-Балахнимский/Исток/09 00

47-Суэдальский/Фетинино/09 02

48-Богородский/Хвощевский/ОЗ 02

49-Собинский/Куриловское/04 00

50-Переславский/Ленина/05 02

51-Собинский/Ленина/ОЗ 01

52-Собинский/Ленина/04 00

53-Селивановский/Мир/07 01

54-Вологодский/Надеево/04 02

55-Вологодский/Надеево/Ю 02

56-Муромский/Нива/11 02

57-Ярослааская/Некрасовсков/04 02

58-Гулькевичевский/Н -Родина/06 02

59-Тэмбовский/Пригородное/ОЗ 01 вО-Г-Посадский/Петровский/10 02 81-Ю -Польскии/Сласское/03 00

62-Ю -Польский/Спасское/02 02

63-Коломенский/Сергеевское/Ю 02

64-Тривак/01 01

65-Уренский/04 00 бв-Вирусвакцина/02 01

67-Суздальский/Владимирское/ОЗ 01

68-Дубенский/Воскресенский/ОЗ 02 в9-Собинский/Бабаево/08 01

генотипов. Поэтому мы не можем утверждать, что на территории Российской Федерации отсутствует вирус ВД КРС второго генотипа, но и не исключаем его крайне редкую встречаемость, что характерно для данного генотипа на других, более изученных территориях.

Согласно классификации, предложенной в 2001 г. 8. УПеек с соавт., все выявленные нами изоляты можно отнести к трем субгенотипам: 1а, 1Ь и К К с>бгенотипу 1а относятся изоляты, выявленные во Владимирской, Нижегородской, Тамбовской, Ярославской областях, а также в Краснодарском крае. Гомология между изолятами данной группы колеблется от 89 до 95%. К субгенотипу 1Ь принадлежит только один из выявленных нами изолятов -Коломенский/Сергеевское/10.02. Данный изолят имеет 96% сходства с последовательностью штаммов Овквв и 97% с штаммами N¥-1 и 1ЬЬС.

Большая часть выявленных нами изолятов сходны с представителями группы И". Данные изоляты имеют около 18% нуклеотидных отличий от референтных штаммов первого генотипа и формируют обособленную группу. Изоляты данной группы ранее выделены в Австрии, Венгрии, Италии, Словакии. Среди российских представителей данного субгенотипа большую часть составляют изоляты, выявленные на территории Владимирской области, а также изоляты, выявленные в патологическом материале, присланном из хозяйств Вологодской, Ивановской, Нижегородской и Тульской областей. Поскольку в данных регионах выявляли и изоляты субгенотипа 1а, то, скорее всего, нет географического разделения в циркуляции этих генетических вариантов вируса ВД КРС. Доказательством этому служит то, что изоляты Ю.-Польский7Спасское/03.00 и Ю.-Польский/Спасское/02.02, выявленные в одном хозяйстве с разницей в 2 года, относятся к субгенотипу 1а и И, соответственно.

Таким образом, изоляты, относящиеся к субгенотипу 1а ^АБЬ-подобные) составляют примерно 30% от всех выявленных нами изолятов. Суб генотип 1Ь (Овк^-подобные) оказался самым бедно представленным субгенотипом в России. За все время исследований нам удалось выявить только один изолят, относящийся к данному субгенотипу. И большая часть, порядка 70%, выявленных нами изолятов относится к недавно описанной группе 1И. Представленные данные о генетических особенностях полевых изолятов вируса ВД КРС могут послужить основой для

изучения антигенных отличий, что будет иметь практическое значение для повышения эффективности вакцинации и, следовательно, контроля над данным заболеванием.

Один из важных моментов в штаммовой дифференциации - это способность отличать вакцинный вирус, циркулирующий некоторое время после вакцинации, от полевых изолятов. Для этого необходимо было получить информацию о первичной структуре 5'-НТО генома вакцинных штаммов, применяемых в нашей стране. В мире существует множество препаратов для специфической профилактики против вирусной диареи КРС. Однако в Российской Федерации, на данный момент применяется относительно узкий спектр вакцин и в малом числе животноводческих хозяйств. В случае, если хозяйство, присылающие на исследование патологический материал, практикует в стадах вакцинацию, мы просили их присылать и образцы используемых вакцин. Таким образом, к нам поступило 4 вида вакцин против вируса ВД КРС:

- «Комбовак» - инактивированная комбинированная вакцина против инфекционного ринотрахеита, ПГ-3, вирусной диареи, респираторно-синцитиальной, рота- и коронавирусной болезней телят производства НПО «Нарвак»;

- «Тривак» - поливалентная сухая ассоциированная вакцина против ПГ-3, инфекционного ринотрахеита и вирусной диареи производства ВИЭВ;

- Вирусвакцина против диареи КРС производства ВИЭВ;

- Инактивированная вакцина против ИРТ и вирусной диареи КРС производства ФГУ «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии им. К.И. Скрябина»

Нами проанализированы данные вакцины, применяемые в скотоводческих хозяйствах. К сожалению, геном вируса ВД КРС был выявлен только в живых вакцинах «Тривак» и Вирусвакцине. В остальных вакцинах геном не выявлялся, что, по-видимому, является следствием инактивации вируса.

В дальнейшем были определены нуклеотидные последовательности 5'-НТО генома вируса ВД КРС, выявленные в вирусвакцине и вакцине «Тривак». Данные последовательности сравнили с выявленными нами изолятами и последовательностями, зарегистрированными в ЕМБЬ. Сравнительный анализ

показал, что данные вакцинные вирусы относятся к первому генотипу, но к разным субгенотипам. Так, вакцинный штамм, применяемый для изготовления вирусвакцины (ВИЭВ), относится к субгенотипу 1а, имея 89% и 92% сходства нуклеотидной последовательности с референтными штаммами Oregon и NADL, которые также используются за рубежом в качестве вакцинных штаммов. Вирус из ассоциированной вакцины «Тривак», относятся к субгенотипу If и, вероятно, имеет происхождение от полевого изолята, выделенного на территории России.

Таким образом, анализ первичной структуры 5'-НТО выявленных нами нзолягов показал, что все они относятся к первому генотипу. Сравнительный анализ показал, что часть изолятов, в том числе и вакцинный штамм вирусвакцины, относятся к субгенотипу 1а, тогда как большая часть изолятов и штамм, использующийся для производства трехвалентной вакцины «Тривак» относится к субгенотипу If. Кроме этого, выявлен один изолят, который был отнесен к субгенотипу 1b. Было показано отсутствие корреляции между географией выделения изолятов и их принадлежностью к тому или иному субгенотипу.

Анализ предполагаемой вторичной структуры фрагмента 5'-НТО

выявленных изолятов вируса ВД КРС В отличие от белков для нуклеиновых кислот существуют относительно простые правила .комплементарного взаимодействия. Это делает возможным предсказание вторичной структуры РНК на основании ее первичной структуры.

В молекулярной биологии пестивирусов большой интерес представляет изучение вторичной структуры 5'-НТО генома, поскольку РНК пестивирусов не содержит на 5'-конце характерную для клеточных мРНК cap-структуру. В работе Т. Poole с соавт. (1995 г.) показано, что альтернативой данной структуре является сайт связывания с рибосомой (IRES), находящийся в 5'-НТО. В дальнейшем, в работе S.K. Chon с соавт. (1998 г.) были определены границы данного сайта и было показано, что на эффективность репликации вируса большое влияние оказывает сохранение вторичной структуры данной области генома. При этом для внутренней инициации трансляции РНК наибольшее значение имеет домен D. Данный домен занимает около 70% 5'-НТО (с 139 по 361 н.) и сохраняет высокую степень консервативности среди всех пестивирусов. Домен D, предположительно, образует

сложную вторичную структуру, состоящую из 6 субдоменов в виде шпилек с АО от -73 до -83 ккал/Моль у различных штаммов, (рис.6)

Амплифицируемый нами фрагмент включает в себя полностью 3 субдомена (Б3-5) и большую часть (70%) субдомена Б2. Точная роль каждого из данных субдоменов в репликации вируса не известна, но при исследовании данных участков генома с помощью метода бицистронных конструкций было показано, что при делении субдоменоп Б3, Б4 или Б5 способность сайта связываться с рибосомной субъединицей 408 резко снижается, и выход репортерных белков уменьшается на 90%, тогда как при делении Б2 субдомена выход продукта снижается на 60%.

При сравнительном анализе нуклеотидных последовательностей, формирующих субдомен Б3, выявлен высоко консервативный фрагмент ОООСА*ОССС. Энергия термодинамического равновесия (Дв) составляет -3,7 ккал/Моль. При этом ООО и ССС образуют спираль шпильки, тогда как СА*О-петлю. В позиции обозначенной * может располагаться либо Т, либо С нуклеотид.

Рис.6. Предполагаемая вторичная структура домена Б штамма КАБЬ.

Субдомен Б4, локализованный с 267 по 290 н., по сравнению с Б3-субдоменом более вариабелен. При этом в противоположность субдомену Б3,

максимальная консервативность наблюдается в области петли шпильки (консенсусная последовательность GGGGT). Возможные замены локализованы в области спирали, но, как правило, это не приводит к появлению боковых петель, и количество неспаренных нуклеотидов в спирали не превышает двух пар. Энергия AG субдомена D4 у выявленных нами изолятов колеблется от -14,8 до - 11,2 ккал.

Субдомен D2 локализован с 192 н. по 246 н. Нами определена нуклеотидная последовательность фрагмента данного субдомена у выявленных нами изолятов вируса ВД КРС, начиная с 206 н., который включает в себя наиболее вариабельную часть, а также консервативный З'-конец. При анализе предполагаемой вторичной стр\ктуры на интервале с 206 по 226 н. было выявлено, что, несмотря на высокую степень вариабельности, структура данного фрагмента субдомена D2 у выявленных нами изолятов сходна со структурами референтных штаммов, описанными в работах зарубежных авторов. Далее, на интервале с 227 по 246 н. последовательность имеет высокую степень консервативности. К сожалению, мы не имеем информации о последовательности 5'-конца данного субдомена на интервале, соответствующем последовательности штамма NADL 192-206 н. у выявленных нами изолятов. Однако, проведя анализ последовательностей, представленных в EMBL, было выявлено, что данный участок 5'-НТО имеет высокую степень консервативности. Поэтому мы предполагаем, что субдомен D2 у выявленных нами изолятов повторяет структуру референтных штаммов.

При сравнительном анализе нуклеотидных последовательностей было показано, что субдомен D5 расположен в одном из самых вариабельных участков 5"-НТО (294-313 н.). В данном субдомене нет консервативных позиций. Тем не менее почти все выявленные нами изоляты на данном участке геномной РНК сохраняют способность к формированию шпилечной структуры. За исключением двух выявленных нами изолятов и вакцинного штамма, которые на данном участке генома имеют последовательность с положительным значением AG. Это может проявляться в нестабильности вторичной структуры данного субдомена, либо вовсе в ее отсутствии. В ходе анализа последовательностей 5'-НТО штаммов и нзолятов вируса ВД КРС, представленных в международной базе данных EMBL, также были выявлены штаммы, которые имеют последовательность соответствующую субдомену D5, со значением AG близким к нулю.

Вопрос о вторичной структуре одноцепочечных РНК и в наше время остается темой для споров. Так и в случае с 5'-НТО геномной РНК пестивирусов нет общепринятой схемы, отображающей вторичную структуру данного участка. В работах различных авторов описывается 4 домена. Однако, организация данных доменов, даже у одного и того же штамма NADL у различных авторов представлена по-разному. И только в случае с организацией домена D, все авторы единодушны. Однако, в ходе сравнительного анализа фрагмента данного домена было показано, что у ряда выявленных нами полевых изолятов, а также у штаммов и изолятов, представленных в EMBL, в IRES формирование субдомена D5, вследствие положительного значения AG на данном участке РНК, маловероятно. Это противоречит правилу, выведенному C.R. Woese (1975 г.) и S. Osaewe (1976 г.), в котором указывается на то, что функционально эквивалентные молекулы РНК должны обладать одинаковой вторичной структурой, несмотря на различие в первичных структурах. Вероятно, способность взаимодействия с компонентами трансляции, несмотря на отсутствие функционально важного субдомена, сохраняется за счет третичной структуры.

Таким образом, в ходе анализа предполагаемой вторичной структуры фрагмента 5'-НТО генома вируса ВД КРС было показано, что у выявленных нами изолятов нуклеотидная последовательность на данном участке формирует вторичную структуру, сходную со структурой референтных штаммов, за исключением изоляюв Коломеиский/Сергсепскос/Ю 02, Ю.-Польский/ Спасское/03.00, а также вакцинного штамма вирусвакцины (обозначен Вирусвакцина/02.01), у которых, вследствие положительного значения AG, по-видимому, не образуется функционально важный субдомен D5. У выявленных нами изолятов значения AG субдомена D3 составляет -3.7 ккал/Моль, а субдомена D4-14,8--1,2 ккал/Моль.

4. Выводы

1. Разработан метод выявления и штаммовой дифференциации вируса ВД КРС с помощью амплификации и секвенирования фрагмента 5'-нетранслируемой области генома. Сконструированы праймеры, подобраны условия выделения суммарной РНК, оптимальные концентрации компонентов реакционной смеси, а также температурно-временной режим проведения реакции.

2. Проведен анализ патологического материала из 94 животноводческих хозяйств 21 региона Российской Федерации. Вирус ВД КРС выявлен в материале из 34 хозяйств 10 регионов, что свидетельствует о широком распространении вируса на территории страны.

3. Установлено, что с помощью разработанного метода вирус ВД КРС обнаруживается у инфицированных животных в легких, трахее, селезенке, лимфатических узлах, тонком и толстом отделах кишечника, в смывах со слизистой оболочки носовой полости, влагалища и в фекалиях. Показана возможность выявления вируса в сперме инфицированных быков.

4. Исследования по выявлению вируса ВД КРС у животных различных возрастных групп показали, что частота выявления вируса ВД КРС у телят (до 6 мес.) и молодняка (с 6 до 18 мес.) существенно не отличается и колеблется в пределах 40%. У взрослых животных вирус ВД КРС выявляли в 18 % случаев.

5. Показано, что в 38% случаев вирус ВД КРС выявлен у животных с респираторной клиникой, в 35% - у животных с кишечными заболеваниями, в 21°о случаев - при смешанной клинической картине и в 6% случаев - при репродуктивной патологии КРС.

6. Установлено, что в 60% случаев вирус ВД КРС в патологическом материале присутствует в ассоциации с другими вирусными этиологическими агентами заболеваний КРС в различных сочетаниях. Чаще при исследовании патологического материала в ассоциации с вирусом ВД КРС выявляются рота- и коронавирусы.

7. На наличие вируса ВД КРС тестировали 15 культур клеток и 10 коммерческих образцов сыворотки крови КРС. Показано, что все исследованные культуры, имеющие происхождение от внутренних органов парнокопытных животных контаминированы пестивирусами. В сыворотках крови, ВД КРС выявлен в 5 обрзцах.

8. Определены нуклеотидные последовательности фрагмента 5'-нетранслируемой области генома у 25 выявленных изолятов и двух вакцинных штаммов вируса ВД КРС.

9. Создана база данных нуклеотидных последовательностей отечественных и зар>6ежных штаммов и изолятов вируса ВД КРС, позволяющая проводить

сравнительный анализ и определять штаммовую принадлежность вновь выявленных изолятов.

10. Установлено, что все выявленные изоляты относятся к первому генотипу. Большая часть изолятов (около 70%) относится к субгенотипу И, 30% - к субгенотипу 1а (НАВЬ-подобные), и только один изолят был отнесен к субгенотипу 1Ь (Овк^-подобные). Вакцинные штаммы, применяемые для изготовления вирусвакцины и ассоциированной вакцины «Тривак» относятся к субгенотипам 1 а и 1И, соответственно.

11. Показано, что нуклеотидная последовательность на исследованном участке 5'-нетранслируемой области генома у выявленных нами изолятов может формировать вторичную структуру, сходную со структурой референтных штаммов, за исключением некоторых изолятов и штаммов, у которых, вследствие положительного значения АО, по-видимому, не образуется функционально важный субдомен Б5.

4. Практические предложения

Для использования в практической работе предлагается:

- Метод выявления и штаммовой дифференциации вируса ВД КРС с помощью амплификации и секвенирования фрагмента 5'-НТО генома. Метод одобрен ученым советом и утвержден директором ВНИИЗЖ. Метод может быть использован для выявления вируса ВД КРС в различных образцах от больных и подозреваемых в заболевании животных. Метод выявления вируса ВД КРС применим для контроля биологических препаратов (сывороток крови КРС, культур клеток, спермы быков-производителей и др.) на возможную контаминацию вирусом ВД КРС.

- Банк нуклеотидных последовательностей фрагмента 5'-НТО генома полевых изолятов вируса ВД КРС, включающий в себя и 2 вакцинных штамма предлагается для изучения распространенности генотипов и субгенотипов вируса ВД КРС.

Список научных работ, опубликованных по материалам диссертации 1. Шульпин М.И., Мищенко В.А., Аянот П.К. Выявление маркера вируса диареи КРС у животных различных возрастных групп // Актуальн. пробл. болезней

молодняка: Матер, междунар. научно-практ. конф. - Воронеж. - 2002. - С. 648650.

2. Шульпин М.И., Мищенко ВА., Аянот П.К. Индикация генома вируса диареи КРС с помощью амплификации 5-нетранслируемой области // Актуальн. пробл. патологии свиней, крупного и мелкого рогатого скота: Матер, конф. молодых >ченых. - Владимир. - 2002. - С. 113-119.

3. Шульпин М.И., Мищенко В.А., Аянот П.К. Генотипирование полевых изолятов вируса диареи КРС, циркулирующих на территории Российской Федерации // Генодиагностика инфекц. заболеваний: Сб. тез. 4-й Всерос. науч.-практ. конф. -М.,2002.-С. 381-383.

4. Шульпин М.И., Мищенко В.А., Аянот П.К. Выявление маркера вируса диареи КРС//Ветеринарный консультант-2003. -№1.-С. 7.

5. Шульпин М.И., Аянот П.К., Мищенко В.А. Индикация вируса диареи КРС, генопширование и филогенетический анализ изолятов, выявленных на территории Российской Федерации // Вопросы вирусологии - 2003. - №5. - С. 41-46.

6. Шульпин М.И., Аянот П.К., Мищенко В.А. Распространение вируса диареи КРС в регионах Российской Федерации // Проблемы мониторинга и генодиагностики инфекционных болезней животных: Матер, междунар. науч. конф. молодых ученых. - Владимир. - 2004. - С. 5-8.

7. Шульпин М.И., Аянот П.К., Мищенко В.А. Анализ нуклеотидных последовательностей 5'- нетранслируемой области генома изолятов вируса диареи КРС // Проблемы мониторинга и генодиагностики инфекционных болезней животных: Матер, междунар. науч. конф. молодых ученых. -Владимир. - 2004. - С. 69-73.

РНБ Русский фонд

Отпечатано на полиграфической базе ФГУ ВНИИЗЖ. Тираж 90 экз., сентябрь 2004.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Шульпин, Михаил Иванович

1. ВВЕДЕНИЕ.

2.0Б30Р ЛИТЕРАТУРЫ.

2.1. Историческая справка о вирусной диарее КРС.

2.2. Классификация вируса вирусной диареи КРС.

2.3. Эпизоотологические и клинические характеристики заболевания.

2.4. Морфологические и физико-химические свойства вириона.

2.5. Геном вируса вирусной диареи КРС.

2.6. Протеины вируса вирусной диареи КРС.

2.7. Репликация вируса вирусной диареи КРС.

2.8.1. Проникновение вируса в клетку.

2.8.2. Трансляция генома вируса вирусной диареи КРС.

2.8.3. Процессинг полипротеина.

2.8.4. Репликация генома вируса вирусной диареи КРС.

2.8.5. Сборка вирионов и отпочковывание их от клетки.

2.9. Цитопатогенные штаммы вируса вирусной диареи КРС.

2.10. Диагностика вирусной диареи КРС.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Выявление возбудителя вирусной диареи КРС с помощью полимеразной цепной реакции и генотипирование изолятов, циркулирующих на территории Российской Федерации"

Актуальность темы. Вирусная диарея (ВД КРС) - заболевание КРС, преимущественно молодых животных, характеризующееся широким спектром клинических проявлений, способное протекать в различных формах, как в острой с летальным исходом, так и в латентной - вызывая у животного сероконверсию без каких-либо клинических проявлений. Возбудителем данного заболевания является вирус вирусной диареи КРС (по международной номенклатуре имеет название bovine viral diarrhea virus -BVDV), который относится к роду Pestivirus семейства Flaviviridae. Вирус характеризуется высокой устойчивостью во внешней среде, что способствуют его широкому распространению. Статистические данные показывают, что потери в животноводстве от ВД КРС в мировой экономике составляют несколько десятков млн. долларов в год [106].

Постановка диагноза и оценка роли инфекции вируса ВД КРС включает определение клинических признаков заболевания, эпизоотологический анализ, идентификацию вируса и оценку результатов патологоанатомических исследований. Клинически ВД может проявляться в виде эрозивно-язвенных воспалений слизистых оболочек ЖКТ, ринитом, воспалением лимфоузлов, лихорадкой, лейкопенией, диареей, стоматитом. У коров возможны аборты. При эрозивных поражениях ВД необходимо дифференцировать от таких заболеваний как чума КРС, ящур, злокачественная катаральная горячка, везикулярный стоматит, инфекционный ринотрахеит, катаральная лихорадка овец, стоматиты другой этиологии. При диарейном синдроме это заболевание дифференцируют от сальмонеллеза, гельминтозов, дизентирий, вызванных другими вирусными патогенами (рота-, корона-, парво-, энтеровирусы). [112] В случае выявления клинических признаков заболевания сходных с инфекцией вируса ВД КРС, необходимо подтверждение диагноза с помощью лабораторных методов.

На данный момент разработано значительное количество лабораторных методов выявления вируса ВД КРС и антител против него.

Относительно новым и перспективным направлением в лабораторной диагностике является применение полимеразной цепной реакции (ПЦР). Методы, основанные на ПЦР превосходят на несколько порядков иммунологические тесты по чувствительности и специфичности. Применение ПЦР позволяет получить однозначный результат в течение нескольких часов, что становится важным при остром течении заболевания, когда оно может за 2-3 дня привести к летальному исходу. Также одним из значительных преимуществ ПЦР-диагностики является независимость от клеточных культур, поскольку нередки случаи контаминации вирусом ВД КРС сывороток крови КРС и самих клеточных культур, применяемых в вирусологических лабораториях [30]. Секвенирование амплифицированных фрагментов вариабельных участков генома и сравнительный анализ с банком нуклеотидных последовательностей вируса позволяет проводить штаммовую дифференциацию и с максимальной точностью определять изменения происходящие на уровне генома.

В начале 90-х г., при вспышках ВД в США и Канаде с выраженными признаками тромбоцитопении и сильными геморрагическими поражениями по всему организму животных, была выявлена генетически отличная от референтных штаммов группа изолятов. Вследствие этого было предложено разделить штаммы вируса ВД КРС на 2 генотипа, при этом референтные штаммы отнесли к первому генотипу, тогда как представителей новой группы-ко второму. Были выявлены антигенные отличия между представителями разных генотипов и показана возможность ускользания ряда представителей второго генотипа от вируснейтрализующих антител, выработанных против вакцинных штаммов, что приводит к неэффективности вакцинации, вследствие чего могут возникать эпизоотии ВД. Ввиду новых данных об эпизоотологии заболевания возникает необходимость изучения генетической гетерогенности изолятов вируса ВД КРС, циркулирующих на территории Российской Федерации, и их генотипирование.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

- разработать на основе ПЦР метод выявления вируса ВД КРС в различных вируссодержащих образцах;

- изучить распространенность вируса ВД КРС в животноводческих хозяйствах Российской Федерации;

- создать базу данных нуклеотидных последовательностей амплифицируемой области генома вируса ВД КРС.

Научная новизна исследования. Разработан метод выявления вируса ВД КРС в различных образцах на основе ПЦР.

Определены нуклеотидные последовательности 5'-нетранслируемой области генома изолятов вируса ВД КРС, выявленных в патологическом Ш материале на территории Российской Федерации в течение 2000-2003 гг. и двух отечественных вакцинных штаммов.

Разработан метод определения генотипа и штаммовой принадлежности выявленных изолятов вируса ВД КРС.

Создана база данных нуклеотидных последовательностей 5'-нетранслируемой области генома вируса ВД КРС.

Практическая значимость исследований. Разработан метод выявления вируса ВД КРС, который позволяет с помощью ПЦР обнаруживать ф геном вируса в различных вируссодержащих образцах, а также проводить генотипирование и штаммовую дифференциацию на основе определения и сравнительного анализа первичной структуры фрагмента 5'-нетранслируемой области генома вируса ВД КРС. Метод прошел комиссионное испытание, одобрен ученым советом, утвержден директором ВНИИЗЖ и в настоящее время применяется в диагностических исследованиях.

С помощью разработанного метода проведен анализ фрагмента 5'-нетранслируемой области генома 25 изолятов вируса ВД КРС, выявленных в различных образцах патологического материала от животных на территории * Российской Федерации в 2000-2003 г.г., а также двух отечественных вакцинных штаммов.

Созданная база данных нуклеотидных последовательностей позволяет проводить штаммовую дифференциацию вируса ВД КРС вновь выявленных полевых изолятов.

Публикация научных работ. По теме диссертации опубликовано 7 научных работ.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 132 страницах компьютерного текста и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, результаты собственных исследований и их обсуждение, заключение, выводы, практические предложения. Список литературы включает 213 источников. Работа иллюстрирована 13 рисунками и 8 таблицами.

Заключение Диссертация по теме "Вирусология", Шульпин, Михаил Иванович

6. ВЫВОДЫ

1. Разработан метод выявления и штаммовой дифференциации вируса ВД КРС с помощью амплификации и секвенирования фрагмента 5'-нетранслируемой области генома. Сконструированы праймеры, подобраны условия выделения суммарной РНК, оптимальные концентраций компонентов реакционной смеси, а также температурно-временной режим проведения реакции.

5. Показано, что в 38% случаев вирус ВД КРС выявлен у животных с респираторной клиникой, в 35% у животных с кишечными заболеваниями, в 21% случаев при смешанной клинической картине и в 6% случаев - при репродуктивной патологии КРС.

9. Создана база данных нуклеотидных последовательностей отечественных и зарубежных штаммов и изолятов вируса ВД КРС, позволяющая проводить сравнительный анализ и определять штаммовую принадлежность вновь выявленных изолятов.

10. Установлено, что все выявленные изоляты относятся к первому генотипу. Большая часть изолятов (около 70%) относится к субгенотипу 1f, 30% - к субгенотипу 1а (NADL-подобные), и только один изолят был отнесен к субгенотипу 1Ь (Osloss-подобные). Вакцинные штаммы, применяемые для изготовления вирусвакцины и ассоциированной вакцины «Тривак» относятся к субгенотипам 1а и 1f, соответственно.

11. Показано, что нуклеотидная последовательность на исследованном участке 5'-нетранслируемой области генома у выявленных нами изолятов может формировать вторичную структуру, сходную со структурой референтных штаммов, за исключением некоторых изолятов и штаммов, у которых, вследствие положительного значения AG, по-видимому, не образуется функционально важный субдомен D5.

7. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Для использования в практической работе предлагается:

- Банк нуклеотидных последовательностей фрагмента 5-НТО генома полевых изолятов вируса ВД КРС, включающий в себя и 2 вакцинных штамма предлагается для изучения распространенности генотипов и субгенотипов вируса ВД КРС.

5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В результате анализа нуклеотидных последовательностей 5-НТО генома штаммов и изолятов вируса ВД КРС было показано, что данная область генома содержит как вариабельные участки, так и сайты с высокой степенью консервативности. Консервативные участки позволяют подобрать праймеры, универсальные для широкого спектра штаммов и изолятов, как первого, так и второго генотипа вируса ВД КРС. А посредством сравнительного анализа первичной структуры данной области можно определять генотип изолята и проводить штаммовую дифференциацию. Однако, анализ профиля вариабельности 5'-НТО генома вируса ВД КРС показал, что число фрагментов, характеризующихся минимальной степенью вариабельности и теоретически применимых в качестве мест посадки праймеров ограничено, и не все консервативные участки соответствуют требованиям, предъявляемым к местам посадки праймеров. Вследствие этого, в 5-НТО можно выделить только 4 потенциальных места посадки праймеров.

В результате проведенных исследований были подобраны условия выделения суммарной РНК для выявления вируса ВД КРС методом ПЦР из небольших количеств вируссодержащего материала. Апробацию метода и подбор оптимальных концентраций компонентов реакционной смеси, а также оптимизацию температурно-временного режима реакции проводили с помощью изолята МДБК/ВНИИЗЖ/06.00, который является персистентным контаминантом культуры клеток МДБК. В дальнейшем при адаптации ПЦР для выявления генома вируса ВД КРС была показана возможность проведения реакции обратной транскрипции и амплификации в одной пробирке.

С помощью разработанного метода выявления генома и штаммовой дифференциации вируса ВД КРС в период с 2000 по 2003 гг. нами проведены исследования патологического материала, поступившего из 94 животноводческих хозяйств 21 региона РФ. Для исследований, как правило, поступал патологический материал от животных с клиническими признаками заболеваний, сходных с инфекцией ВД КРС. Геном вируса ВД КРС выявили в материале, поступившем из 34 животноводческих хозяйств. Таким образом, примерно в 35% хозяйств, в которых проводились исследования материала на наличие вируса ВД КРС, выявлялся геном данного вируса. Геном вируса ВД КРС выявили в материале, поступившем из Владимирской, Вологодской, Ивановской, Московской, Нижегородской, Тамбовской, Тульской, Ярославской областей, Краснодарского края.

Наибольшее количество проб для исследований было получено из животноводческих хозяйств Владимирской, Московской и Нижегородской областей. Так, нами исследован материал, присланный из 32 хозяйств расположенных в 10 районах Владимирской области. Исследования показали, что в 16 хозяйствах (50%) в поголовье циркулирует вирус ВД КРС. Из Нижегородской области к нам был прислан материал для исследования из 21 животноводческого хозяйства 9 районов. Результат исследования показал, что в материале из 7 хозяйств (33%) выявили геном вируса ВД КРС. Из Московской области - из 8 хозяйств 6 районов, геном вируса ВД КРС был выявлен только в одном случае (12%). В остальных регионах РФ исследования ограничивались в основном одним, максимум 6 (Краснодарский край) хозяйствами. Но даже такое мозаичное исследование дает достаточно объективное представление о широком распространение вируса ВД КРС, по крайней мере, в европейской части РФ, поскольку из восточной части страны нами исследован материал только из одного хозяйства Тюменской области.

При исследовании патологического материала от животных различных возрастных групп с поражением органов желудочно-кишечного тракта и дыхательных путей, было показано, что частота выявления вируса ВД КРС у телят (до 6 мес.) и молодняка (с 6 до 18 мес.) существенно не отличается и составляет 39% и 43%, соответственно. У взрослых животных также выявляли геном вируса ВД КРС, но значительно реже, только в 18% случаев.

Следует отметить, что в 60% случаев выявления генома вируса ВД КРС в исследуемом материале были обнаружены и другие вирусные этиологические агенты заболеваний КРС в различных сочетаниях. Чаще при исследовании патологического материала вместе с геномом вируса ВД КРС выявляли геном рота- и коронавирусов. Реже, вместе с геномом вируса ВД КРС были выявлены вирусы ИРТ, парагриппа-3 и герпеса КРС четвертого типа.

Вирус ВД КРС выявляли во внутренних органах павших и вынуждено убитых животных, таких как легкие, трахея, селезенка, лимфатические узлы (мезентериальные, средостенные, бронхиальные), тонкий и толстый отделы кишечника, а также в смывах со слизистой оболочки носовой полости, влагалища и в фекалиях. Чаще всего вирус ВД КРС выявляли в легких, чуть реже в слизистой кишечника, и его содержимом, а также в носовых истечениях. При этом у исследуемых животных могла наблюдаться патология органов дыхательных путей и/или желудочно-кишечного тракта. Также было показано, что с помощью ПЦР можно проводить контроль спермы, применяемой для искусственного осеменения.

Из 34 случаев обнаружения вируса ВД КРС в 13 случаях (38%) вирус выявлен в материале от животных с респираторными заболеваниями, в 12 случаях (35%) - при диарейном синдроме, в 7 случаях (21%) - при смешанной клинической картине и в 2 случаях (6%) от животных с репродуктивными заболеваниями.

С помощью разработанного нами метода тестировались отечественные и зарубежные культуры клеток: ППК, КГ-91, КСТ, ПТ, Ма-104, MARK-145, MDBK, ВНК-21, VERO. Все тестированные клеточные культуры, которые имеют происхождение от различных внутренних органов парнокопытных животных, содержали в себе вирус ВД КРС. Клеточные культуры ВНК-21 и MARK давали отрицательный результат ПЦР во всех повторах. Исключение составили клеточные культуры Ма-104 и VERO, происходящие от клеток почки макаки-резус и почки африканской зеленой мартышки, давшие положительный результат реакции. Вряд ли мы столкнулись со случаем долговременной контаминации клеток гетерогенного животного, скорее всего, это результат заноса вируса в клеточную культуру с контаминированной сывороткой крови. Также нами тестировались сыворотки крови КРС, применяемые для культивирования клеток. Из 10 исследованных образцов различных производителей в 5 случаях выявляли геном вируса ВД

КРС. Таким образом, на основе полученных данных можно сказать, что контаминация культур клеток вирусом ВД КРС является актуальной проблемой, поскольку на примере исследованных культур показано, что фактически все клеточные культуры, имеющие происхождение от внутренних органов парнокопытных содержат данный вирус. При этом показано, что вирус способен персистировать в данных клеточных культурах довольно долгое время. Для остальных клеточных культур остается опасность заноса вируса ВД КРС с клеточной ростовой средой, содержащей в своем составе сыворотку крови КРС.

Был проведен сравнительный анализ 160 нуклеотидных последовательностей 5'-НТО генома различных штаммов и изолятов вируса ВД КРС, а также последовательностей других пестивирусов, опубликованных в ЕМВЬ. Результат анализа показал высокую степень генетической вариабельности не только всего рода пестивирусов, но и вируса ВД КРС. При этом отличие между генотипами вируса ВД КРС так же отчетливо, как и между референтными штаммами, ВКЧС и ВПБО, и составляет около 30%.

Нуклеотидные последовательности 5-НТО генома выявленных изолятов вируса ВД КРС сравнили между собой и с последовательностями, опубликованными ЕМВ!. Результаты сравнительного анализа показали, что все выявленные нами изоляты относятся к первому генотипу.

Согласно классификации, предложенной в 2001 г. Э. \/Псек с соавт. [198], все выявленные нами изоляты можно отнести к трем субгенотипам: 1а, 1Ь и М. Изоляты, относящиеся к субгенотипу 1а (ЫАОЬподобные) составляет примерно 30% от всех выявленных нами изолятов. Субгенотип 1Ь (С^озв-подобные) оказался самым бедно представленным субгенотипом. За все время исследований нам удалось выявить только один изолят, относящийся к данному субгенотипу. Большая часть, порядка 70%, выявленных нами изолятов относится к недавно описанной группе Н.

Нами проанализированы 4 вакцины, применяемые в животноводческих хозяйствах Российской Федерации: «Комбовак» - инактивированная комбинированная вакцина против инфекционного ринотрахеита, ПГ-3, вирусной диареи, респираторно-синцитиальной, рота- и коронавирусной болезней телят, производства НПО «Нарвак»; «Тривак» - поливалентная сухая ассоциированная вакцина против ПГ-3, инфекционного ринотрахеита и вирусной диареи, производства ВИЭВ; вирусвакцина против диареи КРС, производства ВИЭВ; инактивированная вакцина против ИРТ и вирусной диареи КРС, производства ФГУ «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии им. К.И. Скрябина». Геном вируса ВД КРС был выявлен только в живых вакцинах «Тривак» и Вирусвакцине производства ВИЭВ. В остальных вакцинах геном не выявлялся, что, по-видимому, является следствием инактивации вируса.

В дальнейшем были определены нуклеотидные последовательности 5'-НТО генома вакцинных штаммов, использовавшиеся для производства вирусвакцины и вакцины «Тривак». Данные последовательности сравнили с последовательностями выявленных нами изолятов и последовательностями, зарезервированными в EMBL. Сравнительный анализ показал, что данные вакцинные штаммы относятся к первому генотипу, но к разным субгенотипам. Вакцинный штамм, применяемый для изготовления вирусвакцины (ВИЭВ), относится к субгенотипу 1а. Вирус из ассоциированной вакцины «Тривак» относится к субгенотипу 1f.

В молекулярной биологии пестивирусов большой интерес представляет изучение вторичной структуры 5-НТО генома. Амплифицируемый нами фрагмент включает в себя полностью 3 субдомена (D3-5) и большую часть (70%) субдомена D2. Точная роль каждого из данных субдоменов в репликации вируса не известна, но при исследовании данных участков генома с помощью метода бицистронных конструкций было показано, что при делеции субдоменов D3, D4 или D5 способность сайта связываться с рибосомной субъединицей 40S резко снижается, и выход репортерных белков уменьшается на 90%. В ходе анализа предполагаемой вторичной структуры фрагмента 5'-НТО генома вируса ВД КРС было показано, что у выявленных нами изолятов нуклеотидная последовательность на данном участке формирует вторичную структуру, сходную со структурой референтных штаммов, за исключением изолятов Коломенский/ Сергеевское/10.02, Ю.-Польский/Спасское/ОЗ.ОО, а также вакцинного штамма вирусвакцины, у которых, вследствие положительного значения Лв, по-видимому, не образуется функционально важный субдомен 05. У выявленных нами изолятов значения Дв субдомена 03 составляет -3.7 ккал/Моль, а субдомена 04 -14,8 - -1,2 ккал/Моль.

Таким образом, в результате проведенных исследований разработан и оптимизирован метод выявления и штаммовой дифференциации вируса ВД КРС с помощью амплификации и секвенирования 5'-НТО генома. С помощью данного метода изучено распространение вируса на территории европейской части Российской Федерации, а также генетическое разнообразие циркулирующих изолятов вируса ВД КРС. Проведено генотипирование полевых изолятов, что имеет большое значение для повышения эффективности специфической профилактики ВД.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Шульпин, Михаил Иванович, Владимир

1. Бучнев К.Н., Лопатников Г.И., Увалиев И.У., и др. Вирусное заболевание крупного рогатого скота с поражением слизистых оболочек // Вестник сельскохозяйственной науки 1967. - №7. - С.71-74.

2. Гаврилов В.М., Семенов Б.Ф., Жданов В.М. Хронические вирусные инфекции и их моделирование. М., 1974.

3. Голденкова И.В. Репортерные системы: возможности для изучения различных аспектов регуляции экспрессии генов II Успехи Современной Биологии 2002. - Т.122. - №6. - С.515-527.

4. Грибанов О.Г., Щербаков A.B., Перевозчикова H.A., и др. Простой метод выделения и очистки РНК // Биоорганическая химия. 1997. - Т.23, - №9-С.763-765.

5. Зинковский Ю.В., Колосов С.Н., Дрыгин В.В. Программа построения профиля вариабельности гомологичных последовательностей биополимеров «SQ-MAX» II Всерос. Н.-Пр. Конф: Пробл. Инфекц. Патологии С.-Х. Ж-ных. Владимир, 1997.

6. Коломыцев A.A., Павлов В.Х., Срибный Н.И. и др. Роль супросных маток в эпизоотическом процессе классической чумы свиней II Ветеринария. -1991. №5. - С.30-33.

7. Малахова М.С., Макаров В.В. Вирусы, всречающиеся в клеточных культурах животного происхождения.// Вопр. Вирусологии 1986. - №6 - С. 736-739.

8. Сизова Д.В., Шатский И.Н. Участки внутреннего связывания рибосомы вирусных и клеточных РНК//Мол. Биол.-2000. -Т.34. №2. - С.181-193.

9. Чермашенцев В.И., Сафонов Г.А., Дмитренко В.В., Рудобельский Э.В.

10. Влияние вируса классической чумы свиней на функциональную активность фагоцитов в культуре клеток и организме свиней // Вопросы ветеринарной вирусологии и микробиологии. Тез. докл. Н. Конф. ВНИИВВиМ. Покров.1990. С.95-97.

11. Akkina R.K. Pestivirus bovine viral diarrhea virus polypeptides: Identification of new precursor proteins and alternative cleavage pathways // Virus. Res.1991. V.19. - P.67-81.

12. Akkina R.K., Raisch K.P. Intracellular virus-induced polypeptides of pestivirus border disease virus // Virus. Res. -1990.- V. 16. P.95-103

13. Baker J.C. Bovine Viral Diarrhea Virus: a review // JAVMA 1987. - V.190-P.1449-1458.

14. Baule C., van Vuuren M., Lowings J.P., BeJak S. Genetic heterogeneity of bovine viral diarrhea viruses isolated in Southern Africa // Virus Res. 1997-V.52. - P.205-220.

15. Bazan J.F., Fletterick R.J. Detection of a trypsin-like serine protease domain in flaviviruses and pestiviruses //Virology-1989.-V.171. P.637-639.

16. Becher P., Koenig M., Paton D.J., et al. Further characterization of Border Disease Virus isolates: Evidence for the presence of more than tree species within the genus pestivirus //Virology -1995. V.209. - P.200-206.

17. Becher P., Orlich M., Kosmidou A., et al. Genetic diversity of pestiviruses: identificatioin of novel groups and implication for classification // Virology -1999.- V.262. P.64-71.

18. Becher P., Orlich M., Thiel H.-J. Complete genomic sequence of border disease virus, a pestivirus from sheep // J. Virol. 1998. - V.72. - P.5165-5173.

19. Belak S., Ballagi-Pordany A. Application of the polymerase chain reaction (PCR) in veterinary diagnostic virology // Vet. Res. Commun. 1993. - V.17. -P.55-72.

20. Bielefeldt-Ohman H., Ronsholt L., Bloch B. Demonstration of bovine viral diarrhea virus in peripheral blood mononuclear cells of persistently infected, clinically normal cattle // J. Gen. Virol. 1987. - V.68. - P.1971-1982.

21. Bissey L.L,, Williams A.K., Bolin S., et al. Comparison of cytopathic and noncytopathic isolates of bovine viral diarrhea virus by oligonucleotidefingerprinting //J. Vet. Diagn. Invest. 1991. - V.3. - P.16-21.

22. Bolin S., Moennig V., Kelso G.N., et al. Monoclonal antibodies with neutralizing activity segregate isolates of bovine viral diarrhea virus into groups// Arch. Virol. 1988. - V.99. - P.117-123.

23. Bolin S.R., Littledike E.T., Ridpath J.F. Serologic detection and practical consequences of antigenic diversity among bovine viral diarrhea viruses in a vaccinated herd //Am. J. Vet. Res. 1991. - V.52. - P.1033-1037.

24. Bolin S.R., Matthews P.J., Ridpath J.F. Methods for detection and frequency of contamination of fetal calf serum with bovine viral diarrhea virus and antibodies against bovine viral diarrhea virus // J. Vet. Diagn. Invest. 1991.-V.3.-P.199-203.

25. Bolin S.R., McClurkin A.W., Coria M.F. Effects of bovine viral diarrhea virus on the percentages and absolute numbers of circulating B and T lymphocytes in cattle // Am. J. Vet. Res. 1985. - V.46. - P.884-886.

26. Bolin S.R., Ridpath J.F. Specificity of neutralizing and precipitating antibodies induced in healthy calves by monovalent modified-live bovine viral diarrhea virus vaccines // Am. J. Vet. Res. 1989. - V.50. - P.817-821.

27. Bolin S.R., Ridpath J.F., Black J., et al. Survey of cell lines in the American Type Culture Collection for bovine viral diarrhea virus // J. Virol. Methods -1994.-V.48.-P.211-221.

28. Boulanger D., Dubuisson J., Pastoret P. Studies on the neutralization mechanism of bovine viral diarrhea virus // Second Symposium on Ruminant Pestivirus, Annecy, France, 1992, P. 157

29. Boye M., Kamstrup S., Dalsgaard K. Specific sequence amplification of bovine viral diarrhea virus (BVDV) and hog cholera virus and sequencing of BVDV nucleic acid //Vet. Microbiol. 1991. - V.29. - P.1-13.

30. Brar J.S., Johnson D.W., Muscoplat C.C., et al. Maternal immunity to infictious bovine rhinotracheitis and bovine viral diarrhea viruses: duration and effect on vaccination in young calves //Am. J. Vet. Res. 1978. - V.39.- P.241-244.

31. Braun R.K., Osburn B.I., Kebdrick J.W. Immunologic response of bovine fetus to bovine viral diarrhea virus // Am. Vet. Res. 1973. - V.74. - P.1127-1132.

32. Brock K.V. Diagnosis of bovine viral diarrhea virus infections // Vet. Clin. N. Am. Food Anim. Pract. 1995. - V.11. - P.549-561.

33. Brock K.V., Brain D.I., Rouse B.T., Potgieter L.N.D. Molecular cloning of complementary DNA from a pneumopathic strain of bovine viral diarrhea virus and its diagnostic application // Can. J. Vet. Res. 1988. - V.52. -P.451-457.

34. Brock K.V., Deng R., Riblet S.M. Nucleotide sequencing of 5' and 3' termini of bovine viral diarrhea virus by RNA ligation and PCR // J. Virol. Methods-1992-V.38. P.39-46.

35. Brock K.V., Grooms D.L., Ridpath J.F., Bolin S.R. Changes in levels of viremia in cattle persistently infected with bovine viral diarrhea virus // J. Vet. Diagn. Invest. -1998. V.10. - P.22-26.

36. Brown E.A., Zhang H., Ping L.-H., Lemon S.M. Secondary structure of the 5'nontranslated regions of hepatitis C virus and pestivirus genomic RNAs // Nuc. Acids Res. 1992. - V.20. - P.5041-5045.

37. Brownlie J., Clarke M.C., Howard M.C. Experimental production of fatalmucosal disease in cattle II Vet. Rec. 1984. - V.114. - P.535-536.

38. Bukh J., Purcell R.H., Miller R.H. Sequence analysis of the 5' noncoding region of hepatitis C virus // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1992. - V.89. -P.4942-4946.

39. Chambers T.J., Hahn C.S., Caller R., et al. Flavivirus genome organization, expression, and replication II Ann. Rev. Microbiol. 1990. - V.44. - P.649-688.

40. Chomezynsky P., Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by guanidinum thiocianate-phenol-chloroform extraction // Analyt. Biochem. -1987.- V.11. P.156-159.

41. Chon S.K., Perez D.R., Donis R.O. Genetic analysis of the internal ribosome entry segment of bovine viral diarrhea virus // Virology 1998. - V.251. - P.370-382.

42. Choo Q.L., Richman K.H., Han J.H., et al. Genetic organization and diversity of the hepatitis C virus // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1991. - V.88. - P.2451-2455.

43. Chu H.J., Zee Y.C., Ardans A.A., Dai K. Enzyme-linked immunosorbent assay for the detection of antibodies to bovine viral diarrhea virus in bovine sera//Vet. Microbiol. 1985. - V.10. - P.325-333.

44. Collett M.S. Molecular genetics of pestiviruses // Comp. Immunol. Microbiol. Infect. Dis. 1992. - V.15. - P.145-156.

45. Collett M.S., Larson R., Belzer S.K., et al. Proteins encoded by bovine viral diarrhea virus: The genomic organization of a pestivirus // Virology 1988. -V.165. - P.200-215.

46. Collett M.S., Larson R., Gold C., et al. Molecular cloning and nucleotide sequence of the pestivirus Bovine Viral Diarrhea Virus // Virology.- 1988. -V.168. P.191-199.

47. Collett M.S., Moennig V., Horzinek M.C. Recent advances in pestivirusresearch // J. Gen. Virol. -1989. V.70. - P.253-266.

48. Corapi W., French T., Dubovi E. Severe thrombocytopenia in young calves experimentally infected with noncytopathic bovine viral diarrhea virus // J. Virol.-1989. V.63. - P.3924-3934.

49. Corapi W.V., Donis R.O., Dubovi E.J. Characterization of a panel of monoclonal antibodies and their use in the study of the antigenic diversity of bovine viral diarrhea virus//Am. J. Vet. Res. 1990. - V.51. - P. 1388-1394.

50. Coria M.F., McClurkin A.W. Duration of active and colostrum-derived passive antibodies to bovine viral diarrhea virus in the calf // Can. J. Comp. Med. -1978.- V.42. P.239-243.

51. Coria M.F., Schmerr M.J.F., McClurkin A.W. Characterization of the major structural proteins of purified bovine viral diarrhea virus // Arch. Virol. 1983. -V.76. - P.335-339.

52. Darbyshire J.H. A serological relationship between swine fever and mucosal disease of cattle // Vet. Rec. 1960. - V.72. - P.331-333.

53. De Moerlooze L., Desport M., Renard A., et al. The coding region for the 54-kDa protein of several pestiviruses lacks host insertions but reveals a «zinc finger-like» domain //Virology -1990. -V.177. P.812-815.

54. Deng R., Brock K.V. 5' and 3' untranslated regions of pestivirus genome: Primary and secondary structure analyses // Nucleic. Acids Res. 1993. -V.21.- P.1949-1957.

55. Deng R., Brock K.V. Molecular cloning and nucleotide sequence of a pestivirus genome, noncytopathic bovine viral diarrhea virus strain SD-1 // Virology 1992. - V. 191. - P.867-879.

56. Diderholm H., Dinter Z. Infectious RNA derived from Bovine Virus Diarrhea Virus//Zentbl. Bakteriol. Abt. I. 1966. - V.201. - P.270-272.

57. Domingo E. Genetic variation and quasispecies // Curr. Opin. Genet. Dev. -1992.- V.2. P.61-63.

58. Domingo E., Martinez S.E., Sobrino F., et al. The quasispecies (extremely heterogeneous) nature of viral RNA genome populations: Biological relevance-A review II Gene 1985. - V.40. - P.1-8.

59. Donis R., Corapi W., Dubovi E. Bovine viral diarrhea and their antigenic analyses // Arch. Virol. 1991. -V.3 (suppl.). - P.29-40.

60. Donis R.O., Corapi W., Dubovi E.J. Neutralizing monoclonal antibodies to bovine viral diarrhoea virus bind to the 56K to 58K glycoprotein // J. Gen. Virol.-1988.- V.69. P.77-86.

61. Donis R.O., Dubovi E.J. Characterization of bovine viral diarrhea-mucosal disease virus-specific proteins in bovine cells // J. Gen. Virol. 1987. - V.68.-P.1597-1605.

62. Donis R.O., Dubovi E.J. Differences in virus-induced polypeptides in cells infected by cytopathic and noncytopathic biotypes of bovine virus diarrhea-mucosal disease virus //Virology -1987. V. 158. - P.168-173.

63. Donis R.O., Dubovi E.J. Glycoproteins of bovine viral diarrhea-mucosal disease virus in infected bovine cells // J. Gen. Virol. 1987. - V.68. - P.1607-1617.

64. Donis R.O., Dubovi E.J. Molecular specificity of the antibody responses of cattle naturally and experimentally infected with cytopathic and noncytopathic bovine viral diarrhea virus biotypes // Am. J. Vet. Res. 1987 - V.48. - P.1549-1554.

65. Drummond D.R., Armstrong J., Colman A. The effect of capping and polyadenylation on the stability, movement and translation of synthetic messenger RNAs in Xenopus oocytes // Nucleic. Acids Res. 1985. - V.13-P.7375-7375.

66. Dubovi E.J. Genetic diversity and BVD virus II Comp. Immunol. Microbiol. Infect. Dis. 1992. -V. 15. - P. 155-162.

67. Dufell S.J., Harkness J.W. Bovine virus diarrhea mucosal disase infectionin cattle//Vet. Rec. 1985. -V. 117. - P.240-245.

68. Edwards S. The diagnosis of bovine viral diarhoea mucosal disease in cattle // Rev. Sci. Tech. Off. Int. Epiz. - 1990. - V.9. - P. 115-130.

69. Edwards S., Sands J.J., Harkness J.W. The application of monoclonal antibody panels to caracterize pestivirus isolates from rumenant in Great Britain//Arch. Virol. 1988. -V. 102. - P. 197-206.

70. Eigen M. Self-organization of matter and the evolution of biological macromolecules// Naturwissenschaften 1971. - V.58. - P.465-523.

71. Fenton A., Nettleton P.F., Entrican G., et al. Identification of cattel infected with bovine viral diarrhea virus using a monoclonal antibody captur ELISA // Arch. Virol. 1991. - V.3. - P.169-174.

72. Fernelius A.L., Lambert G., Hemmes G.J. Bovine viral diarrhea virus-host cell interactions: Adaptation and growth of virus in cell lines // Am. J. Vet. Res. -1969. V.30. - P. 1561-1572.

73. Fernelius A.L., Lambert G.f Packer R.A. Bovine viral diarrhea virus-host cell interactions: Adaptation, propagation, modification, and detection of virus in rabbits//Am. J. Vet. Res. 1969. -V.30. - P. 1541-1550.

74. Fernelius A.L., Ritchie A.E. Mixed infections or contaminations of bovine viral diarrhea virus with infectious bovine rhinotracheitis virus.// Am. J. Vet. Res.-1966.-V.27.-P.241-248.

75. Flores E., Donis R. Isolation of a mutant MDBK cell line resistant to bovine viral diarrhea virus infection due to a block in viral entry // Virology 1995. -V.208 - P.565-575.

76. Fox G.E., Woese C.R. 5S RNA secondary structure II Nature 1975. -V.256 - P.505-507.

77. Francki R., Fauquet C., Knudson D., et al. Classification and nomenclature of viruses. Fifth Report of the ICTV. New York, Springer-Verlag, 1991

78. Fredericsen B., Sandvik T., Loken T., et al. Level and duration of serum antibodies in cattle infected experimentally and naturally with bovine viral diarrhea virus//Vet. Rec. 1999. - V.144. - P.111-114.

79. Gillespie J.H., Baker J.A., McEntee K. A cytopathogenic strain of virus diarrhea virus // Cornell. Vet. 1960. - V.50. - P.73-79.

80. Gorbalenya A.E., Donchenko A.P., Koonin E.V., et al. N-terminal domains of putative helicases of flavi- and pestiviruses may be serine proteases // Nucleic. Acids Res. 1989. - V.17. - P.3889-3897.

81. Gorbalenya A.E., Koonin E.V., Donchenko A.P., et al. Two related superfamilies of putative helicases involved in replication, recombination, repair, and expression of DNA and RNA genomes // Nucleic. Acids Res. 1989. -V.17.-P.4713-4730.

82. Grahn T.C., Fahning M.L., Zemjanis R. Nature of early reproductive failure caused by bovine viral diarrhea virus II J. Am. Vet. Med. Assoc. 1984. -V.185.- P.429-432.

83. Greig A., Gibson I.R., Nettleton P.F., Herring J.A. Disease outbreak in calves caused by a mixed infection with infectious bovine rinotracheitis virus and bovine viral diarrhea virus // Vet. Rec. -1981. V.108. - P.480.

84. Greiser-Wilke I., Haas L., Dittmar K., et al. RNA insertions and gene duplications in the nonstructural protein pl25 region of pestivirus strains and isolates in vitro and in vivo // Virology 1993. - V.193. - P.977-980.

85. Greiser-Wilke I., Liebler E., Haas L., et al. Distribution of cytopathogenic and noncytopathogenic bovine virus diarrhea virus in tissues from a calf with experimentally induced mucosal disease using antigenic and genetic markers//

86. Arch. Virol. 1993. -V.7 (suppl.). - P.295-302.

87. Gruber A.D., Greiser-Wilke I.M., Haas L., et al. Detection of of bovine viral diarrhea virus RNA in formalin-fixed, paraffin-embedded brain tissue by nested polymerasr chain reaction // J. Virol. Methods 1993. - V.43. - P.309-320.

88. Gutekunst D.E., Malmquist W.A. Complement-fixing and neutralizing antibody response to bovine viral diarrhea and hog cholera antigens II Can. J. Comp. Med. Vet. Sci. 1964. - V.28. - P.19-23.

89. Hamel A.L., Wasylyshen M.D., Nayar G.P.S. Rapid detection of of bovine viral diarrhea virus by using RNA extracted directly from assorted specimens and a one-tube reverse transcription PCR assay // J. Clin. Microbiol. 1995.-V.33. - P.287-291.

90. Heinz F.X. Comparative molecular biology of flaviviruses and hepatitis C virus // Arch. Virol. 1992. -V.4 (suppl.). - P. 163-171.

91. Hermodsson S., Dinter Z. Properties of bovine virus diarrhea virus // Nature -1962.- V.194. P.893-894.

92. Herting C., Pauli U., Zanomni R., Peterhans E. Detection of bovine viral diarrhea virus using the polymerase chain reaction // Vet. Microbiol. 1991.-V.26. - P.65-76.

93. Hooft van Iddekinge B.J.L., van Wamel J.L.B., van Gennip H.G.P., Moormann R.J.M. Application of the polymerase chain reaction to the detection of of bovine viral diarrhea virus infections in cattle II Vet. Microbiol. 1992. -V.30. — P.21-34.

94. Hori H., Osawa S. Evolutionary change in 5S RNA secondary structure and phylogenic tree of 54 5S RNA species // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1976.-V.76. - P.381-385.

95. Horzinek M.C. Nonarbo togavirus infections of animals: Comparative aspects and diagnosis. In Comparative Diagnosis of Viral Diseases. New York, Academic Press, 1981, p. 442

96. Horzinek M.C., Mussgay M. Studies on the substructure of togaviruses. Effect of urea, deoxycholate and saponin on the Sindbis virion // Arch. Ges. Virusforsch 1971. - V.33. - P.296-318.

97. Houe H. Epidemiological features and economical importance of bovine viral diarrhoea virus infections //Vet. Microbiol. 1999. - V.64. - P.89-109.

98. Howard C.J. Immunological responses to bovine viral diarrhea virus infections // Rev. Sci. Tech. Off. Int. Epiz. 1990. - V.9. - P.95-103.

99. Howard C.J., Clarke M.C., Brownlie J. An enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for the detection of antibodies to bovine viral diarrhoea virus (BVDV) in cattle sera // Vet. Microbiol. 1985. - V. 10. - P.359-369.

100. Howard C.J., Clarke M.C., Brownlie J. Protection against respiratory infection with bovine viral diarrhea virus by passively acquired antibody // Vet. Microbiol-1989. V.19.-P.195-203.

101. Jubb K.V.F. et all. Pathology of Domestic Animals. 3rd. Ed. V.2. Academic Press, N.Y., 1985, p. 95-100

102. Katz J.B., Ridpath J.F., Bolin S.R. Presumptive diagnostic differentiation of hog cholera virus from bovine diarrhea and border disease viruses by using a cDNA nested-amplification approch II J.Clin. Microbiol. 1993. - V.31. - P. 565568.

103. Khudyakov Y.E., Fields H.A., Favorov M.O., et al. Synthetic gene for the hepatitis C virus nucleocapsid protein // Nucleic. Acids. Res. 1993. - V.21.-P.2747-2754.

104. Koonin E.V., Dolja V.V. Evolution and taxonomy of positive-strand RNA viruses: Implications of comparative analysis of amino acid sequences // Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 1993. - V.28. - P.375-430.

105. Kwang J., Bolin S., Littledike E.T. Bovine viral diarrhea serological diagnostic reagents prepared from bacterially expressed recombinant proteins // J. Vet. Diagn. Invest. 1995. - V.7. - P.143-145.

106. Laude H. Improved method for the purification of hog cholera virus grown in tissue culture // Arch. Virol. 1977. - V.54. - P.41-51.

107. Laude H. Non arbo-, togaviridae: Comparative hydrodynamic properties of the pestivirus genus //Arch. Virol. 1979. - V.62. - P.347-352.

108. Lee H.J., Shieh C.K., Gorbalenya A.E., et al. The complete sequence (22 kilobases) of murine coronavirus gene 1 encoding the putative proteases and RNA polymerase // Virology 1991. - V. 180. - P.567-582.

109. Lee K.M., Gillespie J.H. Propagation of virus diarrhea virus of >cattle in tissue culture//Am. J. Vet. Res. 1957. -V. 18. - P.952-955.

110. Lewis T.L., Ridpath J.F., Bolin S.R., Berry E.S. Detection of bovine viral diarrhea virus using sinthetic oligonucleotides // Arch. Virol. 1991. - V.117.-P.269-278.

111. Loan R.W., Storm M.M. Propagation and transmission of hog cholera virus in nonporcine host II Am. J. Vet. Res. 1968. - V.29. - P.807-811.

112. Loneragan G.H., Gould D.H., Mason G.L., et al. Involvement of microbial respiratory pathogens in acute interstitial pneumonia in feedlot cattle // Am. J. Vet. Res. 2001. - V.62. - P.1519-1524.

113. Lopez O.J., Osorio F.A., Donis R.O. Rapid detection of bovine viral diarrhea virus by polymerase chain reaction // J. Clin. Microbiol. 1991. - V.29. - P.578-582.

114. Luther P.D., Stott E.J., Jebbett J. Virus contamination of bovine testis cell cultures // Res. Vet. Sci. 1981. - V.30. - P.251-252.

115. McClurkin A.W., Bolin S.R., Coria M.F. Isolation of cytopathic and noncytopathic bovine viral diarrhea virus from the spleen of cattle acutely and chronically affected with bovine viral diarrhea // J. Am. Vet. Med. Assoc.- 1985.-V.186.-P.568-569.

116. McClurkin A.W., Coria M.F., Cutlip R.C. Reproductive performance of apparently heathy cattle infected with bovine viral diarrhea virus II J. Am. Vet. Med. Assoc. 1979. - V.174. - P.1116-1119.

117. Meyers G., Rumenapf T., Thiel H.J. Molecular cloning and nucleotide sequence of the genome of hog cholera virus II Virology 1989. - V.171. -P.555-567.

118. Meyers G., Rumenapf T., Thiel H.J. Ubiquitin in a togavirus // Nature1989.-V.341.-P.491

119. Meyers G., Tautz N., Dubovi E.J., et al. Viral cytopathogenicity correlated with integration of ubiquitin-coding sequences II Virology 1991. - V.180. -P.602-616.

120. Meyers G., Tautz N., Stark R., et al. Rearrangement of viral sequences in cytopathogenic pestiviruses II Virology 1992. - V.191. - P.368-386.

121. Mignon B., Dubuisson J., Baranowski E., et al. A monoclonal ELISA for bovine viral diarrhoea pestivirus antigen detection in persistently infected cattle // J.Virol. Methods 1991.-V.35.-P. 177-188.

122. Miller R.H., Purcell R.H. Hepatitis C virus shares amino acid sequence similarity with pestiviruses and flaviviruses as well as members of two plant virus supergroups // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1990. - V.87. - P.2057-2061.

123. Moennig V. Dissertation. Hannover, Germany, Veterinary School, 1971

124. Moennig V., Bolin S.R., Coulibaly C.O., et al. Studies of the antigen structure of pestiviruses using monoclonal antibodies II Dtw. Dtsch. Tierarztl. Wochenschr.-1987. V.94. - P.572-576.

125. Moennig V., Frey H.R., Liebler E., et al. Reproduction of mucosal disease with cytopathogenic bovine viral diarrhea virus selected in vitro // Vet. Rec.1990.- V.127. P.200-203.

126. Moennig V., Plagemann P.G. The pestiviruses // Adv. Virus. Res. 1992. -V.41. - P.53-98.

127. Moenning V. Pestiviruses: a review // Vet. Microbiol. 1990. - V.23. - P.35-54.

128. Molla A., Jang S.K., Paul A.V., et al. Cardioviral internal ribosomal entry site is functional in a genetically engineered dicistronic poliovirus II Nature 1992. -V.356. - P.255-257.

129. Niskanen R., Lindberg A., Traven M. Failure to spread bovine virus diarrhoea virus infection from primarily infected calves despite concurrent infection with bovine coronavirus //Vet. J. -2002. V.163. - P.251-259.

130. Nuttall P.A., Luther P.D., Stott E.J. Viral contamination of bovine fetal serum and cell cultures II Nature 1977. - V.266. - P.835-837.

131. Olafson P., MacCallum A.D., Fox A. An apparently new transmissible disease of cattle // Cornell. Vet. 1946. - V.36. - P.205-213.

132. Onyekaba C., Fahrmann J., Bueon L., et al. Comparison of five cell lines for the propagation of bovine viral diarrhea and infectious bovine rhinotracheitis viruses // Microbiologica -1987. V.10. - P.311-315.

133. Paton D.J. Pestivirus diversity// J. Сотр. Patol. 1995. - V. 112. - P.215-236.

134. Paton D.J., Ibata G., Edwards S., Wensvoort G. An ELISA detecting antibody to conserved pestivirus epitopes // J. Virol. Methods 1991. - V.31. - P.315-324.

135. Paton D.J., Lowings J.P., Barrett A.D. Epitope mapping of the gp53 envelope protein of bovine viral diarrhea virus // Virology 1992. - V.190. - P.763-772.

136. Paton D.J., Sands J.J., Lowing J.P., et al. A proposed division of the pestivirus genus using monoclonal antibodies, supported by cross-netralisation assays and genetic sequencing //Vet. Res. 1995. - V.26. - P.92-109.

137. Pellerin C., van den Hurk J., Lecomte J., et al. Identification of a new group of bovine viral diarrhea virus strains associated with severe outbreaks and high mortalities // Virology 1994. - V.203. - P.260-268.

138. Pestova T.V., Hellen C.U., Wimmer E. A conserved AUG triplet in the 5' nontranslated region of poliovirus can function as an initiation codon in vitro and in vivo // Virology 1994. - V.204. - P.729-737.

139. Pestova T.V., Hellen C.U.T. Internal initiation of translation // Virology -1999.- V.258. P.249-256.

140. Peters W., Greiser W.I., Moenning V., Liess B. Preliminary serological caracterization of bovine viral diarrhea virus strains using monoclonalantibodies// Vet. Microbiol. 1986. - V.12. - P.195-200.

141. Plant J.W., Littlejohns I.R., Gardiner A.C., et al. Immunological relationship between border disease, mucosal disease and swine fever // Vet. Record. -1973.-V.92.-P.455.

142. Pocock D.H., Howard C.J., Clarke M.C., et al. Variation in the intracellular polypeptide profiles from different isolates of bovine virus diarrhoea virus // Arch. Virol. 1987. - V.94. - P.43-53.

143. Poole T., Wang C., Popp R., et al. Pestivirus translation initiation occurs by internal ribosome entry // Virology 1995. - V.206. - P.750-754.

144. Porterfield J.S., Casals J., Chumakov M.P., et al. Togaviridae // Intervirology-1978. V.9. - P.129-148.

145. Potgieter L.N.D., McCracken M.D., Hopkins F.M., et al. Experimental production of bovine respiratory disease with bovine diarrhea virus // Am. J. Vet. Res. 1984. - V.45. - P.1582-1585.

146. Potgieter L.N.D., McCracken M.D., Hopkins F.M., Walker R.D. Effect of bovine viral diarrhea virus infection on the distribution of infectious bovine rinotracheitis virus in calves // Am. J. Vet. Res. 1984. - V.45. - P.687-690.

147. Potts B.J., Sawyer M., Shekarchi I.C., et al. Peroxidase-labeled primary antibody method for detection of pestivirus contamination in cell cultures // J. Virol. Method. 1989. - V.26. - P.119-124.

148. Purchio A.F., Larson R., Torborg L.L., et al. Cell-free translation of bovine viral diarrhea virus RNA // J. Virol. 1984. - V.52. - P.973-975.

149. Qi F., Ridpath J.F., Lewis T., et al. Analysis of the bovine viral diarrhea virus genome for possible cellular insertions // Virology -1992. V.189. - P.285-292.

150. Radwan G.S., Brock K.V., Hogan J.S., Smith K.L. Development of a PCR amplification assay as a screening test using bulk milk samples for identifying dairy herds infected with bovine viral diarrhea virus // Vet. Microbiol. 1995. -V.44. - P.77-92.

151. Rebhun W., French T.W., Perdrizet J.A., et al. Thrombocytopenia associated with acute bovine virus diarrhea infection in cattle // J. Vet. Intern. Med. 1989.-V.3. - P.42-46.

152. Ridpath J., Bolin S., Dubovi EM Segregation of bovine viral diarrhea virus into genotypes // Virology 1994. - V.205. - P.66-74.

153. Ridpath J.F., Bolin S.R. The genomic sequence of a virulent bovine viral diarrhea virus from the type 2 genotype: Detection of a large genomic insertion in a noncytopathic bovine viral diarrhea virus //Virology 1995. - V.212. - P.39-48.

154. Ridpath J.F., Lewis T.L., Bolin S.R., et al. Antigenic and genomic comparison between non-cytopathic and cytopathic bovine viral diarrhea viruses isolated from cattle that had spontaneous mucosal disease // J. Gen. Virol. 1991. -V.72. - P.725-729.

155. Ritchie A.E., Femelius A.L. Characterization of bovine viral diarrhea viruses. V. Morphology of characteristic particles studied by electron microscopy // Arch. Virol.-1969.-V.28.-P.369

156. Roberts K.L., Collins J.K., Carman J., Blair C.D. Detection of cattle infected bovin viral diarrhea virus using nucleic acid hybridisation // J. Vet. Diagn. Invest.- 1991. V.3. - P.10-15.

157. Rossi C.R., Bridgman C.R., Kiesel G.K. Viral contamination of bovine fetal lung cultures and bovine fetal serum // Am. J. Vet. Res. 1980. - V.41. -P.1680-1681.

158. Roth J.A., Kaeberbe M., Griffith R.W. Effects of Bovine Viral Diarrhea Virus infection of bovine polymorphonuclear leukocyte function // Amer. J. Vet. Res.-1981. V.42. - P.244-250.

159. Rumenapf T., Linger G., Strauss J.H., et al. Processing of the envelop glycoproteins of pestiviruses // J. Virol. 1993. - V.67. - P.3288-3294.

160. Rumenapf T., Unger G., Strauss J.H., et al. Processing of the glycoproteins of pestiviruses II J. Virol. -1993. V.67. - P.3288-3294.

161. Rychlik W., Rhoads R.I. A computer programm for choosing optimal oligonucleotides for filter hybridization, sequencing and in vitro amplification of DNA // Nucleic Acids Res. 1989. - V.17. - P.8543-8551.

162. Saiki R.K., Delfand D.H., Stoffel S., et al. Primer-directed anzimatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase // Scienc 1988-V.239. - P.487-491.

163. Saitou N., Nei M. The Neighbor-joining method: a new method for reconstructing phylogenetic trees // Mol. Biol. Evol. 1987. - V.4. - P.406-425.

164. Sandvik Т., Krogsrud J. Evaluation of an antigen capture ELISA for detection of bovine viral diarrhea virus in cattle blood samples // J. Vet. Diagn. Invest. -1995. V.7. - P.65-71.

165. Sanger F., Nicklen S., Coulsen A. R. DNA sequensing with chainterminating inhibitors// Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1977. - Vol. 74. - P. 5463-5467.

166. Schmitt B.J., Lopez O.J., Ridpath J.F. et al. Evaluation of PCR for diagnosis of of bovine viral diarrhea virus in tissue homogenates // J. Vet. Diagn. Invest. -1994. V.6. - P.44-47.

167. Schneider R., Linger C., Stark R., et al. Identification of a structural glycoprotein of an RNA virus as a ribonuclease // Science 1993. - V.261-P. 1169-1171.

168. Shannon A.D., Richards S.G., Kirkland P.D., Moyle A. An antigen-capture ELISA detecte pestivirus antigens in blood and tissues of immunotolerant carrier cattle II J. Virol. Methods 1991. - V.34. - P.1-12.

169. Shope R.E., Muscoplate C.C., Chen A.W., Johnson D.W. Mechanism of protection from primary bovine viral diarrhea virus infection. I. The effects of dexamethasone // Can. J. Comp. Med. 1976. - V.40. - P.355-359.

170. Tamura J.K., Warrener P., Collett M.S. RNA-stimulated NTPase activity associated with the p80 protein of the pestivirus bovine viral diarrhea virus // Virology 1993. -V. 193. - P.1-10.

171. Tautz N., Meyers C., Thiel H.J.: Processing of poly-ubiquitin in the polvprotein of an RNA virus II Virology 1993. - V.197. - P.74-85.

172. Tautz N., Thiel H.J., Dubovi E.J., et al. Pathogenesis of mucosal disease: A cytopathogenic pestivirus generated by an internal deletion II J. Virol. 1994. -V.68. - P.3289-3297.

173. Terpstra C. Hog colera: an update of present knowledge // Brin. Vet. J. -1991- V.147. P.397-406.

174. Terpstra C., Wensvoort G. Natural infections of pigs with bovine viral diarrhea virus associated with sings resembling swine fever // Res. Vet. Sci.- 1988. -V.45.-P.137-142.

175. Thiel H.-J., Stark R., Weiland E., et al. Hog cholera virus: Molecular composition of virions from a pestyvirus // J. Virol. 1991. - V.65. - P.4705-4712.

176. Tijssen P., Pellerin C., Lecomite J. Immunodominant E2 (gp53) sequenses of hyghly virulent bovine viral diarrhea group II viruses indicate a close resemblance to a subgroup of bovine diarrhea virus // Virology 1996. -V.217 - P.356-361.

177. Topliff C.L., Kelling C.L. Virulence markers in the 5'untranslated region of genotype 2 bovine viral diarrhea virus isolates // Virology 1998. - V.250. -P.164-172.

178. Torgerson P.R., Dalgleish R., Gibbs H.A. Mucosal disease in a cow and her suckled calf//Vet. Rec. 1989. -V. 125. - P.530-531.

179. Tsukivama K.K., lizuka N., Kohara M., et a1. Internal ribosome entry site within hepatitis C virus RNA//J. Virol. 1992. - V.66. - P. 1476-1483.

180. Vilcek S., Bjorklund H.V., Horner G.W., et al. Genetic typing of pestiviruses from New Zeland // NZ Vet. J. 1998. - V.46. - P.35-37.

181. Vilcek S., Nettleton P.F., Paton D.J., Belak S. Molecular characterization of ovine pestiviruses//J. Gen. Virol. 1997. - V.78. - P.725-735.

182. Vilcek S., Paton D.J., Durkovic B., et al. Bovine viral diarrhea virus genotype 1 can be separated into at least eleven genetic groups // Arch. Virol. 2001.-V.146.- P.99-115.

183. Ward A.C.S. et all. Immunoelectronmicroscopy for rapid detectijn of bovine viral diarrhea virus // 27th Ann. Proc. Amer. Vet. Lab. Diag. 1984. P.59-63.

184. Ward A.C.S., Kaeberle M.L. Use of an immunoperoxidase stain for the demonstration of bovine viral diarrhea virus by light and electron microscopies//

185. Am. J. Vet. Res. 1984. - V.45. - P.165-170.

186. Ward P., Misra V. Detection of of bovine viral diarrhea virus, using degenerate oligonucleotide primers and the polymerasr chain reaction // Am. J. Vet. Res. 1991.- V.52. - P.1231-1236.

187. Warrener P., Collett M. Pestivirus NS3 (p80) protein possesses RNA helicase activity // J. Virol. 1995. - V.69. - P.1720-1726.

188. Weiland E., Stark R., Haas B., et al. Pestivirus glycjprotein which induces neutralizing antibodies forms part of a disulfide-linked heterodimer // J. Virol-1990. V.64. - P.3563-3569.

189. Wellemans G., Opdenbosch E.V. Demonstration of BVD virus (bovine diarrhea virus) in many cell lines II Ann. Rech. Vet. 1987. -V. 18. - P.99-102.

190. Wensvoort G., Terpstra C. Bovine viral diarrhoea virus infections in piglets born to sows vaccinated against swine fever with contaminated vaccine // Res. Vet. Sci. 1988. - V.45. - P.143-148.

191. Wensvoort G., Terpstra C., de Kluyver E. Characterization of porcine and some ruminant pestiviruses by cross-neutralization // Vet. Microbiol. 1989.-V.20. - P.291-306.

192. Wiskerchen M., Collett M.S. Pestivirus gene expression: Protein p80 of bovine viral diarrhea virus is a proteinase involved in polyprotein processing // Virology- 1991. -V. 184. P.341-350.

193. Wray C., Roeder P.L. Effect of bovine viral diarrhea-mucosal disease infection on salmonella infection in calves // Res. Vet. Sci. 1987. - V.42. -P.213-218.

194. Wu D.Y., Ugozzoli W., Pal B.K. et al. The effect of temperature and oligonucleotideprimer length on specifity and efficiency of amplification by the polymerase chain reaction // DNA Cell Biol. -1991. V. 10. - P.374-376.

195. Xue W., Blecha F., Minocha H.C. Antigenic variations in bovine viral diarrhea viruses detected by monoclonal antibodies II J. Clin. Microbiol. 1990. - V.281. P.1688-1693.

196. Xue W., Minocha H.C. Identification of the cell surface receptor for bovine viral diarrhoea virus by using anti-idiotypic antibodies // J. Gen. Virol. 1993. -V.74. - P.73-79.

197. Zingg H.H., Lefebvre D.L., Almazan G. Regulation of poly(A) tail size of vasopressin mRNA// J. Biol. Chem. -1988. V.263. - P.11041-11043.

198. Zuker M. Computer prediction of RNA structure // Methods Enzymol. -1989.- V.180. P.262-288.

Информация о работе

Шульпин, Михаил Иванович
кандидата биологических наук
Владимир, 2004
ВАК 03.00.06

Диссертация

Выявление возбудителя вирусной диареи КРС с помощью полимеразной цепной реакции и генотипирование изолятов, циркулирующих на территории Российской Федерации - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы