Выявление точечных мутаций в ДНК методом лигирования олигонуклеотидов: селективность этапов гибридизации и лигирования

Кабилов, Марсель Расимович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Выявление точечных мутаций в ДНК методом лигирования олигонуклеотидов: селективность этапов гибридизации и лигирования
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Выявление точечных мутаций в ДНК методом лигирования олигонуклеотидов: селективность этапов гибридизации и лигирования"

На правах рукописи

Х(.4„„„л„тж „ , □□ЗОВ857Э

КАБИЛОВ Марсель Расимович I___

Выявление точечных мутаций в ДНК методом лигирования олигонуклеотидов: селективность этапов гибридизации и лигирования

03.00.04 - биохимия

Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Новосибирск - 2007

Работа выполнена в Институте химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН

Научный руководитель:

к.х.н. Пышный Дмитрий Владимирович

Официальные оппоненты: д.б.н., проф. Зенкова Марина Аркадьевна

к.х.н. Ошевский Сергей Иванович

Ведущая организация:

Институт белка РАН

Защита состоится «Ц» мая 2007 г. в II30 часов на заседании диссертационного совета Д 003.045.01 при Институте химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН по адресу: 630090, Новосибирск-90, пр. Лаврентьева, 8

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке

Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН

Автореферат разослан « Ц » апреля 2007 г. Учёный секретарь диссертационного совета

д.х.н.

Фёдорова О.С.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Развитие методов секвенирования ДНК привело к накоплению колоссального объёма информации, как о первичной структуре нуклеиновых кислот различных биологических объектов, так и о полиморфизмах в генетическом материале. По изменению первичной последовательности НК уже сейчас можно судить о наличии некоторых генетических заболеваний или предрасположенности к ним, о лекарственной устойчивости различных патогенных микроорганизмов и вирусов, вызывающих такие социально значимые заболевания как туберкулез, гепатиты, СПИД и др. Все это свидетельствует о необходимости развития технологий достоверного выявления точечных мутаций, что позволит расширить сферы применения персонифицированного подхода к профилактике и лечению различных заболеваний.

Селективность большинства методов детекции точечных мутаций в генетическом материале обеспечивается ферментами, обладающими способностью различать полностью комплементарные комплексы и комплексы, содержащие даже одиночный мисматч. Так, например, ДНК-лигазы способны дискриминировать наличие некомплементарной пары вблизи одноцепочечного разрыва (ника) в ДНК-дуплексе, что нашло применение в методе OLA (oligonucleotide ligation assay). Однако в литературе отсутствует систематическая информация об эффективности дискриминации лигазой мисматчей в нике в зависимости от типа нуклеотидов.

Многие методы выявления точечных мутаций, как и OLA, содержат этап гибридизации олигонуклеотидных зондов с НК-мишенью, который в некоторых случаях может быть использован для обеспечения дополнительной селективности. Однако в настоящее время отсутствует общепринятое описание селективности гибридизации как количественного параметра.

Цели и задачи исследования

Целью данной работы являлось систематическое исследование селективности метода ферментативного лигирования олигонуклеотидов и разработка на основе метода нового подхода к выявлению точечных мутаций в ДНК.

В ходе исследования решались следующие задачи:

- разработка нового подхода к выявлению точечных мутаций в ДНК;

- анализ влияния различных параметров на селективность гибридизации зонда с анализируемой ДНК при выявлении в ней точечных мутаций;

- создание систематической базы данных, описывающей эффективность дискриминации ДНК-лигазой фага Т4 любых одиночных мисматчей вблизи сайта лигирования;

- разработка программного обеспечения для выбора олигонуклеотидных зондов, обеспечивающих наибольшую селективность выявления точечных мутаций методом ферментативного лигирования.

Научная новизна и практическая ценность работы. Предложен новый подход к выявлению точечных мутаций в ДНК, основанный на отделении продукта гомофазного ферментативного лигирования от исходного меченого зонда на капроновой мембране после УФ-облучения реакционной смеси. Предложенный подход может быть использован при параллельном анализе точечных мутаций с помощью метода ферментативного лигирования олигонуклеотидов.

Проведено исследование селективности метода ферментативного лигирования олигонуклеотидов на этапе гибридизации зондов с анализируемой ДНК и на этапе их лигирования. Показано, что наиболее адекватным описанием селективности гибридизации зонда с анализируемой ДНК при выявлении в ней точечных мутаций является функция селективности, представляющая отношение степеней ассоциации комплексов зонда с нормальной и мутантной ДНК. Предложен способ оценки максимума температурной зависимости функции селективности гибридизации. Можно ожидать, что полученные результаты будут использованы не только для повышения селективности OLA, но и ряда других методов, содержащих этап гибридизации.

Проведенные исследования показали, что эффективность дискриминации мисматча ДНК-лигазой фага Т4 существенно зависит от нуклео-тидного состава субстратного комплекса вблизи одноцепочечного разрыва. На основании полученных результатов была сформирована базы данных факторов дискриминации мисматчей.

Разработан алгоритм выбора олигонуклеотидных зондов для метода лигирования олигонуклеотидов. На основе этого алгоритма и полученных данных по селективности гибридизации и лигирования создано программное обеспечение, которое может быть использовано для разработки тест-систем на основе метода ферментативного лигирования.

Публикации и апробация работы. По материалам диссертации опубликовано 6 печатных работ. Результаты работы были представлены на конференции Millennium Conference on Nucleic Acid Therapeutics (Clearwater Beach, США, 2000), конференциях молодых ученых СО РАН, посвященных М.А. Лаврентьеву (Новосибирск, 2003 и 2004); 29th FEBS Congress (Варшава, Польша, 2004), 20th IUBMB International Congress of Biochemistry and Molecular Biology and the 1 Ith FAOBMB Congress (Киото, Япония, 2006), международной конференции "Физико-химическая биология", посвященной 80-летию академика Д.Г. Кнорре (Новосибирск, 2006).

Структура и объём работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, изложения результатов и их обсуждения, экспериментальной части, выводов и списка цитированной литературы. Работа изложена на 116 страницах, содержит 51 рисунок и 8 таблиц. Библиографический список включает 177 литературных источника.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 1. Разработка подхода к выявлению точечных мутаций в ДНК

Нами был предложен новый подход к детекции точечных мутаций в рамках метода ферментативного лигирования олигонуклеотидов, который сочетает в себе преимущества гомофазного варианта проведения реакции и гетерофазного выявления продукта лигирования.

Схема нового варианта выявления специфической последовательности ДНК представлена на рис. 1. На первой стадии проводится лигирова-ние тандема коротких олигонуклеотидов в присутствии термически денатурированного ПЦР-фрагмента. Далее реакционную смесь наносят на капроновую мембрану и подвергают УФ-облучению. При этом в основном происходит иммобилизация протяженной ДНК-матрицы. На стадии отмывки мембраны происходит удаление всех коротких олигонуклеотидов, в том числе меченного биотином, в то время как продукт лигирования удерживается на капроне в результате прочного комплексообразования с иммобилизованной матрицей. Колориметрическое выявление биотинили-рованного продукта лигирования после инкубации с конъюгатом стрепта-видин-щелочная фосфатаза, происходит при добавлении хромогенных субстратов.

тандем олигонуклеотидов биотин

ДНК-лигаза

точечная

замена ДНК матрицы

ДНК-лигаза

УФ облучение, отмывки

щелочная фосфатаза-стрептавидин■

цин—► №

УФ облучение, отмывкн

хромогенные субстраты

капроновая мембрана

мутация норма

Рис. 1. Принципиальная схема анализа ДНК в рамках предлагаемого подхода.

fr(405) ПЦР фрагмент

5' 3'

fr(392) -АААТ АТСАТСТ TTGGTGTTTCCTA-

TATAGTAGAp ACAAAGGAp (Bio)

fr(230) 3' AACCp 5'

13(N)

fr(91)

Рис. 2. Влияние длины анализируемого ПЦР-фрагмента на эффективность его выявления на капроне. Тандем t3(N) лигировали на ДНК-фрагментах различной длины (405, 392, 230 и 91 н.п.). Условия реакции: [fr]=[pNs-Bio]=10"7 М, [pN9]=[pN4]=10'! М, 25 е.а. Т4 ДНК-лигазы, 30 мин, 1=25 "С, 20 мМ трис-НС! рН 7.5, 10 мМ MgCl2, 0.1 М NaCl, 1 мМ АТР. УФ-облучение 2 мин.

Для обеспечения оптимального соотношения специфического и неспецифического сигналов необходимо использовать биотинилированный олигонуклеотид в концентрации, сопоставимой с концентрацией анализируемой ДНК, и оптимизировать время УФ-облучения.

В качестве одного из объектов исследования мы использовали участок гена CFTR человека. Наиболее распространенной мутацией в этом гене является AF508, приводящая к отсутствию фенилаланина в 508-м положении белка CFTR, что является причиной муковисцидоза.

На данной модельной системе исследовали влияние размера ПЦР-фрагмента на интенсивность специфического сигнала, наблюдаемого при проведении анализа с помощью предложенного нами подхода. Для этого проводили лигирование тандема t3(N), 5'-компонент которого биотинили-рован, на ПЦР-фрагментах различной длины от 91 до 405 н.п. Видно (рис. 2), что специфический сигнал присутствует при использовании всех матриц, в то время как без добавления лигазы сигнал в точках практически отсутствует. Интенсивность специфического сигнала зависит от длины используемой матрицы: для ПЦР-фрагмента fir(91) она минимальна, а для fr(230), fr(392) и fr(405) была одинаково высокой.

Выявление тринуклеотидной делец я и AF508, т.е. дискриминацию полноразмерного (230 н.п.) и содержащего делецию (227 н.п.) ПЦР-фрагментов исследовали, используя трёхкомпонентные тандемы t3(N) и t3(A) (рис. 3). Видно, что при лигировании тандемов на комплементарных им матрицам, интенсивность сигналов во всех случаях достоверно больше, чем при лигировании комплексов матрица/тандем, содержащих несоответствия. На этой же системе была смоделирована ситуация выявления гетерозиготы (рис. 3), т.е. наличия в геноме обоих аллелей гена CFTR. При лигировании каждого из тандемов t3(N) и t3(A) в присутствии одно-

£г (230) 5' 3'

-ААААТАТСАТСТТТСатСГТТССТ-

£г(227)

З1

А ТАТАОТАБАр АСАААЕНАр (Вю) ААССр

норма

13 (Ы)

гетерозигота

мутация

13(Д)

^<230)+£г(227)

£г<227)

5' 3'

-ААААТАТСАТТССТСТТТССТА-

ТТТТАТАвТр АСАААвйАр (В1о) 3' ААССр д.

[3(Д)

Рис. 3, Возможность выявления тринуклеотидных делений и вставок. Капрон после проявления продуктов цитирования тандемов гЗ(ТЧ) и ?3{Д) [¡а ДНК-фрагментах длиной 230 и 227 н.п. Условия эксперимента см. рис. ].

временно двух ПЦР-фрагментов. нормального 1х(230) и содержащего делению &(227), наблюдается интенсивное окрашивание капрона.

Возможность выявления однонуклеотидных замен исследовали на втором модельном объекте - ПЦР-фрагменте 135 н.п,, соответствующем участку гена епх ВИЧ-1, лигируя на нём тандем трёх олигонуклеотидов

(рЫ к+рЫ^пХ)+рТМ я'{ В ¡о)}. Было проведено лигирование 13 комплексов, 12 из которых содержали мисматчи в сайте связывания центрального тетрамера. Интенсивная окраска наблюдается только в случае использования тетрануклеотида рСАОС, полностью комплементарного анализируемому ДНК-фрагменту (рис. 4). При использовании тетрамеров с однонуклеотидной заменой интенсивность окрашивания хотя и зависит от типа мисматча, однако во всех случаях во много раз слабее, чем в случае образования совершенного комплекса. Значения факторов дискриминации (ФД), определенные

ДНК-фрагмант

ЧАУ ССТАСТТССТССДССТСССТ/^ рСЗСМССАДЯ рТССАОЗСА-Ыо

рСДСС рн4 № рСДСХ Х=Д,С,Т

рМ, (ЗХ) , Х=А,С,Т

рНд(2Х) , Х=С,С,Т

рЫ,<Ш, Х=А,С,Т

Рис, 4. Возможность детекции однонуклеотидных замен в сайте связывания центрального тетрамера. Выявление на капроне продуктов цитирования тандемов рМ$+рГ^(пХ)+рМ$'{Вю) на ПЦР-фрагментах (135 н.п.). Условия эксперимента см. рис. I.

по соотношению интенсивности окрашивания пятен, соответствующих комплементарному и некомплементарному продуктам дотирования, варьируют в интервале от 5 до 38. Предлагаемый метод позволяет тестировать ожидаемые однобуквенные несоответствия между последовательностью тетрамера и сайтом его связывания в анализируемой ДНК.

Таким образом, разработан новый подход к колориметрическому выявлению точечных мутаций с помощью Т4 ДНК-лигазы. Подход основан на отделении тандема коротких олигонуклеотидов от комплекса продукта лигирования с анализируемой ДНК длиной более 100 нт. за счет её избирательной УФ-иммобилизации на капроновой мембране. Предложенный подход позволяет с высокой селективностью выявлять в ДНК однонук-леотидные замены, а также гомо- и гетерозиготные варианты тринуклео-тидных делеций/вставок.

2. Селективность гибридизации 2.1. Функция селективности

Метод лигирования олигонуклеотидов включает в себя стадию гибридизации зондов с анализируемой ДНК-матрицей. Использование свойства олигонуклеотидов образовывать менее прочные комплексы при наличии мисматча может в целом увеличить селективность метода.

Рассмотрим вариант гибридизации олигонуклеотидного зонда со смесью двух матриц, из которых одна полностью комплементарна ему, а другая содержит, однонуклеотидную замену. Зонд будет обладать максимальной дискриминационной способностью в том случае, когда равновесная концентрация совершенного комплекса [/л. • /?] будет максимально отличаться от равновесной концентрации несовершенного комплекса . Введем функцию селективности /а, которая является их отношением:

[/ .р] ацС1

/ = —1-— =-—, где а и а - степени ассоциации совершенного и

" [<К1'Р\ ам%

несовершенного комплексов, соответственно, с, и с, - концентрации матриц. Пусть с, = с, , тогда:

(1-1)

Таким образом, функция /а отражает соотношение эффективностей комплексообразования совершенного и мисматч-содержащего комплексов. Условия, в которых /а достигает максимума, и будут условиями,

обеспечивающими максимальную селективность взаимодействия зонда с матрицей.

Степени ассоциации соответствующих комплексов можно выразить через константы ассоциации зонда с матрицами. В случае, когда концентрация зонда значительно превышает концентрацию матриц ср» с<, что

чаще всего и реализуется на практике, функцию селективности можно

представить в виде:

а„

— + с, Км_

(1.2)

+ Ср

К*

Рассмотрим зависимость функции селективности /а (1.2) от температуры на примере зонда I (мисматч С/А, Таблица 1). На рис. 5А для него приведены температурные зависимости степеней ассоциации комплементарного комплекса (аг^ ) и комплекса, содержащего мисматч (аи ), а также функции селективности /а (1.2). Температурная зависимость функции имеет колоколообразный профиль. Температура, при которой /а достигает своего максимума, обозначена как Г я. Как оказалось, описание

Таблица 1. Последовательности комплексов и термодинамические параметры*

№ Комплекс зонд/ДНК-матрица Тип мисматча -д Я, ккал/моль —д S, кал/(моль-К)

I CTAACTAACG GATTGATTGC - 73.0 206.6

CTAACTAACG GATTAATTGC С/А 49.2 144.0

II CTAACTAACGACATC GATTGATTGCTGTAG - 113.5 316.5

CTAACTAACGACATC GATTAATTGCTGTAG С/А 89.7 253.9

III CTAACTAA GATTGATT - 51.8 150.1

CTAACTAA GATTAATT С/А 28.0 87.5

IV CTAACTAACG GATTGATTGC - 73.0 206.6

CTAACTAACG GATTTATTGC С/Т 57.3 169.2

* - энтальпию (дН) и энтропию (дS) комплексообразования рассчитывали по модели ближайших соседей по данным SantaLucia J. Jr., Hicks D, 2004.

функции селективности значительно упрощается, если рассматривать её поведение на определенных температурных участках.

1) При низких температурах ( Т < 14 °С для зонда I) функция 1, т.к.

степени ассоциации зонда с любой из матриц приближаются к единице.

2) При температуре плавления несовершенного комплекса зонда I

(Г = Т* = 21.7 °С) функция /а 2.

3) В области высоких температур (для зонда I Т > 47 °С) функция

/а -> - еХр| _ ~ ТааБ I (рис 5Б), т.е. определяется соотношением " Км \ КГ }

равновесных констант ассоциации совершенного и несовершенного комплексов. (ддЯ =аЯл. — аНм и ааБ =аБм —аБм ). Введем функцию предельной селективности:

Функция зависит только от температуры и типа мисматча. Смысл функции С заключается в том, что она показывает предельное значение, которое может достигать /а при данной температуре. 4) Для расчета температуры , при которой будет наблюдаться максимум функции селективности, получить строгое аналитическое выражение путем решения дифференциального уравнения /а' (Г к ) = 0 невозможно. В связи с этим величину Т^ находили численно, исходя из заданной концентрации зондов и рассчитанных термодинамических параметров ком-плексообразования. Показано, что помимо численного решения, возможна приблизительная оценка Тта . Оказалось, что для всех рассмотренных нами зондов численно рассчитанные значения Г и приблизительно равны Г", т.е. близки к температуре плавления совершенного комплекса. Разность (г^ _ г"') всегда была положительна и варьировала в диапазоне 0.64.9 °С. В среднем г" была меньше Ттт на 3 °С.

С использованием выражения (1.4), далее было показано, что « > где = /а(Тт), а При сравнении этих параметров для всех

зондов, рассмотренных в данной части работы (некоторые представлены в

(1.3).

шах

(1.4)

■ 300 В1

250 я X

200 г Г

1 1

150 Ц

Б 1

р. а.

оо г О

1 1

50 в 1

: 0

юоооо

101)00

Ьт

30 -15 60 Температура, °С

30 45 60 7 5 Теч пера! ура, С

Рис, (А) Температурная зависимость степеней ассоциации совершенно^ и несовершенного комплексов (левая ось) и функции селективности / (правая ось) дня зонда I при с, = 10"' М. (Б) Температурные зависимости функций селективности /я и предельней селективности у'"". Гпв - температура максимума селективности, т " - температура плавления комплементарного комдаекса.

таблица 1). было установлено, что в среднем /а~ на 11% меньше , а

диапазон отклонений значений от Г"' составляет 0.3-23.4%. Кроме

того, пока чано, что при температуре плавления совершенного комплекса функция селективности равняется половине предельной функции селективности.

Л __ -СЮ (1.5)

Использование этого уравнения существенно упрощает количественную оценку селективности того или иного зонда при выявлении точечных мутаций. т.к. для этого необходимо знать только температуру плавления

правильного комплекса 'Г и термодинамический эффект (ььН

связанный с формированием мисматча.

Рассмотрим влияние различных параметров на поведение функции селективности,

2.2. Зависимость селективности от концентрации зонда

Поведение функции селективности / при различных значениях концентрации зонда I (таблица 1) представлено на рис. 6А. При понижении концентрации зонда максимальное значение функции растет и смещается в область низких температур, при этом значения функции при температурах. больших Т , стремятся к . Зонд обладает более высокой

дискриминирующей способностью при использовании его в более низких концентрациях, когда Ттк( находится в области низких температур.

Построив функцию fl" (Т) (1.5) в логарифмической шкале, мы получили зависимость близкую к линейной. Эта "прямая" проходит через температуры плавления зонда I при его различных концентрациях. Как видно, из рис. 6А, "прямая" действительно пересекает кривую fa вблизи максимума. Таким образом, с помощью функции (1.5) можно достаточно

У» шах

точно оценить, какое значение примет Ja при определенном значении

температуры плавления.

Для того чтобы оценить, как меняется значение максимума функции селективности при изменении стабильности комплекса вследствие варьирования концентрации зонда, вернемся к рассмотрению формулы (1.5). Положим, что концентрацию зонда изменили в х раз. Оценим, во сколько раз изменилась максимальная селективность зонда, найдя отношение

//" (хер) к //" (ср):

f*Tm , ДА Н

J (ХСр) лЯ

Ус =—-= * " (1.6).

Видно, что степень изменения fa~ является показательной функцией и зависит не только от кратности изменения концентрации зонда х, но и

от относительного изменения энтальпии при переходе от совершенного к несовершенному комплексу.

Отметим, что при уменьшении концентрации зонда увеличение селективности продолжается до тех пор, пока концентрация зонда не сравняется с концентрацией матрицы, после чего она практически не меняется.

2.3. Изменение селективности при варьировании структуры зонда

Рассмотрим один из частных вариантов изменения структуры зонда, а именно, изменение его длины. В том случае, если зонды достаточно протяженные, можно пренебречь концевым дестабилизирующим эффектом и использовать выражения aFIn « W/AI и aSn « IpaSn для расчета гибриди-зационных свойств среднестатистического зонда длиной lP +1, где дHN и aSn термодинамические параметры формирования усредненного динуклеотидного шага спирали ДНК. Приняв за z число нуклеотидов,

O JO 40 ÍO 60 70 Температура, "С

20 JO JO 50 50 70 Температура, -С

20 30 40 S0 00 70 Температура, С

t0W)0

юооо

30 JO 40 50 ЙО 70 Температура* -.С

1 юооо

а юоо

-о- ¡о(С/А)

frííO'A) lim - - й(СУТ)

-»- £п(С/Т) lim

Рис, 6. Температурная :швисимость функции селективности (А) дня зонда I при изменении ою концентрации от К)"8 до 10 М; (Б) для зондов 1-Ш длимой 10 и 15 пт. при концентрации 10 М, (В) для зондов 1-Ш длиной 8, 10 и 15 нт. с равными

Гтк и концентрациями 2.3* Ю"3, Ш'5 й 1.3" Щ9 М соответственно; ('I') для зоцдац

дискриминирующих) мисматчи С/Л (I) И С/Г (IV), при Концентрациях I0"s и 10"5 М

приходящихся на изменение длины зонда, получим величину г, , харак-

теризуюшую изменение fa ~:

яН i

Таким образом, изменение максимума функции селективности при варьировании длины зонда приблизительно описывается степенной функцией для заданной концентрации зонда. Из у равнения (1.7) видно, что чем больше хлина зонда, тем меньше влияет изменение концентрации на его селективность.

Рассмотрим зависимость функции селективности fa от температуры

при дискриминации одного и того же мисматча С/А зондами I-III (таблица 1) разной длины (8, 10 и 15 нт.) при концентрации каждого 10"5 М (Рис. 6Б). Как и следовало ожидать, укорочение олигонуклеотида приводит к

смещению Тт в область более низких температур, при этом происходит

и у шах

закономерное увеличение значении fa

Интересные результаты получаются при рассмотрении поведения fa для зондов I-III в том случае, когда значение температуры Ттга для всех

них одинакова (рис. 6В). Для этого численно были решены уравнения (1.2) для зондов I и III и найдены соответствующие концентрации. Величина /J™" оказывается тем больше, чем длинней олигонуклеотид. С увеличением длины зонда функция fa будет стремиться к виду: / -> 1 при Т <Т и / /"" при Т > Т .

J а * max Ja Ja Г тах

Следовательно, если рассматривать селективность при Гтах, то, как

было показано она выше для протяженных олигонуклеотидов, однако, её заметного увеличения стоит ожидать лишь при существенном изменении длины зонда.

2.4. Изменение селективности при выявлении различных мисматчей

Очевидно, что эффективность дискриминации мисматча существенно зависит от величины его дестабилизирующего эффекта в комплексе зонд-матрица. Рассмотренное ранее изменение селективности при варьировании концентрации и длины зонда происходит исключительно в пределах

(1.3). Увеличение предельной селективности гибридизации зонда

может быть достигнуто путем изменения ааН и даS, например, за счет изменения типа формируемого мисматча или модификации зонда.

На рис. 6Г приведены температурные зависимости функций fa и

для одного и того же зонда (ср = 10~5 М и ср = 10~8 М), рассчитанные для случая выявления двух различных мисматчей С/А и С/Т (таблица 1,1 и IV). Видно, что при значениях Гти « 45 °С (ср=10"5М) максимумы функций fa (С/А) и fa (С/Т), характеризующие эффективность дискриминации этих мисматчей, практически совпадают. При снижении концентрации зонда (Ср=10"8М) происходит снижение Ттях до 30 °С, и /гтах при этом различаются уже более чем в 2 раза. Таким образом, эффективность дискри-

минации мисматчей может существенно изменяться при изменении значения , т.е. мисматчи, равнозначные при одной температуре, становятся существенно различимыми при другой.

Для предварительной оценки того, какой из мисматчей будет дискриминироваться с большей эффективностью, нет необходимости сразу анализировать зависимости /а от температуры, а можно использовать

/I" (Г), что позволяет оценить при искомой температуре гибридизации в соответствии с (1.5). По расположению "прямых" (Т) относительно друг друга для каждого типа мутаций можно оценить максимум селективности в различных системах и при различных температурах.

Таким образом, нами были рассмотрены некоторые теоретические аспекты селективности гибридизации олигонуклеотидных зондов с НК.

Предложенные в данной работе функции селективности /а и , позволяют оценивать эффективность дискриминации зондом в структуре анализируемого сайта изменений любой природы (мисматч, вставка, неканоническое основание, ненуклеотидная вставка и др.). Стоит отметить, что полученные результаты могут быть использованы не только при выборе зондов для метода лигирования, но и в других подходах, точность которых может зависеть от гибридизации олигонуклеотидов.

3. Селективность лигирования 3.1. Дизайн субстрата

ДНК-лигаза образует фосфодиэфирную связь в одноцепочечном разрыве ДНК (нике) между нуклеотидами, несущими З'-ОН и 5'-фосфат. В отсутствие мисматчей или других нарушений структуры вблизи сайта лигирования фермент формирует ковалентную связь независимо от нуклео-тидов, расположенных в нике. В то же время, эффективность действия ДНК-лигазы меняется в зависимости от типа нуклеотидов, фланкирующих одноцепочечный разрыв, однако исчерпывающей информации об этом влиянии в литературе не представлено. В связи с этим одной из задач данной работы было систематическое исследование способности ДНК-лигазы фага Т4 дискриминировать все возможные одиночные мисматчи в сайте лигирования.

Для возможности проведения такого рода исследований были сформулированы критерии, которым должен был отвечать субстрат: 1) размер ДНК-субстрата не должен быть меньше сайта связывания фермента (>14-16 н.п.);

2) нуклеотидная последовательность ДНК-комплекса должна быть гетерогенной (GC состав около 50%, отсутствие гомонуклеотидных повторов);

3) отсутствие побочных внутри- и межмолекулярных комплексов, чтобы обеспечить однозначность образования субстратного ДНК-дуплекса;

4) для удобства анализа физико-химических характеристик субстратов необходимо, чтобы температуры плавления совершенных комплексов компонентов олигонуклеотидного тандема (субстрата) были близки;

5) субстратные комплексы должны быть стабильными при температуре наиболее эффективного действия Т4 ДНК-лигазы.

Учитывая вышеперечисленные критерии, с помощью разработанной нами компьютерной программы на базе Visual Basic for Application были выбраны модельные комплексы, представляющие собой комплексы 20-мерной матрицы (mVZ) с парой декануклеотидов, которые отличались сочетанием оснований вблизи одноцепочечного разрыва Y/pX:

исходная структура

NNNNNNNNY NNNNNNNNZVNNNNNNNN 3- pXNNNNNNNN

отбор

выбранная структура

GATTGATTGY

CTAACTAACZVCATCATATC 3' pXGTAGTATAG

N/N - любая комплементарная пара

Для подтверждения адекватности выбора модельной системы с термодинамической точки зрения был проведен анализ стабильности ДНК-дуплексов с помощью метода термической денатурации. Плавление как комплементарных, так и содержащих мисматчи комплексов проводилось в условиях, соответствующих по концентрациям соли условиям реакции лигирования (10 мМ MgCl2, 0.1 М NaCl). Диапазон температур плавления 16 комплементарных комплексов составил 39.2 - 44.9 °С (таблица 2).

Далее было рассмотрено влияние двух типов мисматчей на стыке дуплексных структур на термостабильность тандемных комплексов на примере формирования: mGG/GpC - минимальный дестабилизирующий эффект и mTG/C-pG - максимальный дестабилизирующим эффектом. Температуры плавления этих несовершенных комплексов составили 43.5 и 35 °С соответственно. Проведенный термодинамический анализ показал,

Таблица 2. Температуры плавления 16 комплементарных комплексов (5-10"6 М каждого

комплекс mGG* mGA mGT mGC mAG mAA mAT mAC mTG mTA mTT mTC mCG mCA mCT mCC

т т Im , °с 42.9 41.5 41.9 44.1 40.6 39.2 40.1 412 41.3 39 5 41.9 42 2 43.9 42 0 43.0 44.9

* 5'-шУ2-3' - матрица, ^ - за Тт принимали значение температуры, при которой дифференциальная кривая денатурации комплекса достигает своего максимума

что при 25 °С все совершенные и несовершенные субстратные комплексы в рамках выбранной модельной системы должны быть практически полностью ассоциированы, что позволило исключить влияние эффективности гибридизации на характеристики лигирования различных субстратов.

3.2. Факторы дискриминации мисматчей при лигировании

Первоначально было продемонстрировано, что в выбранных условиях

{\dsDNA- тск] = 2- Ю^М, [АТР]= Ю^Ми I = 10мин ) зависимость степени лигирования от времени линейна, что позволяет определять значения начальной скорости ферментативной реакции близкой к Утах, кинетические параметры которой в этом случае характеризуют формирование фосфодиэфирной связи в нике. В этих условиях было проведено лигиро-вание совершенных комплексов, содержащих 16 возможных типов одно-цепочечных разрывов (Рис. 7 А). Оказалось, что выходы продуктов лигирования большинства комплексов близки, и в среднем составляют 61 %. Исключениями являются ники Т*рА (тТА) и Т*рв (тСА), для которых наблюдались самые низкие выходы реакции (20% и 40% соответственно) (Рис. 7Б). Все 16 типов одноцепочечных разрывов можно поделить по типу нуклеотида - донора 5'-фосфата ("Р"-компонент) на 4 группы (Х*рС, Х*рТ, Х*рА и Х*рО). Видно явное "выпадение" в каждой группе ников с Х=Т: скорости лигирования этих ников в группе были минимальными.

Таким образом, проведен полный анализ зависимости эффективности действия ДНК-лигазы от типа нуклеотидов вблизи одноцепочечного разрыва в совершенном ДНК-дуплексе. Показано, что эффективность лигирования совершенных субстратных комплексов под действием ДНК-лигазы фага Т4 слабо зависит от нуклеотидного состава вблизи ника, но в ряде случаев наблюдается существенное снижение выходов продуктов реакции.

Было исследовано лигирование всех 96 комплексов, содержащих одиночный мисматч в нике, т.е. по 48 комплексов, имеющих несовершенную пару в структуре "ОН"- и "Р"-компонентов субстрата ("ОН"- и "Р"-мисматчи соответственно). ДНК-лигаза с большей эффективностью дискриминирует наличие "ОН"-мисматча, чем "Р"-мисматча. В связи с этим лигирование комплексов, содержащих "Р"-мисматчи, проводилось в тех же условиях, что и совершенные комплексы, а для комплексов, содержащих "ОН"-мисматчи, были выбраны другие условия. На Рис. 7В и Г приведены результаты лигирования комплементарных и содержащих мис-матчи комплексов матриц тТв и шАв в условиях лигирования комплексов с "ОН"-мисматчами (30 мин при повышенной концентрации Т4 ДНК-лигазы).

А Г

Х'рС

Х'рТ

х>л

Х'рС

СТА G С Т A GCTA G С TAG

iZnA G-T

ciev

G-T

TiG Т/Т те: G/G G/A G)T

щ Ф m

'' СГ AACTAA CG-TCATC АТАТС ''GATTGATTGX pYGTAGTATAG

C'pT

G--A

X'pT G-A

X*pC X*pT X*pA X*pG crpyitrypa nil tin

А/С А/Л AJC G/G G/A G/T

J'CT A ACTA Л CG--ACATCATATC S'G ATTG ATTGX pYGTAGTATAG

Рис. 7. Лигярование комплементарных и содержащих мисматчи комплексов. Элек-трофореграммы разделения в 20%-ном денатурирующем ПААГ продуктов лигирования (А) 16 комплементарных комплексов (1=!0 мин. 0.25 е.а, Т4 ДНК-лигазы) и комплексов матриц mTG (В) и mAG (Г), комплементарных и несовершенных, содержащих "Р1- и "ОН"-мисматчи (t=.10 мин, 1.25 е.а. Т4 ДНК-лигазы). (Б) Усредненные выходы лигирования со стандартным отклонением для 16 комплементарных комплексов. Условия эксперимента: rN2o]=[Nio]=4-lO'6 М, [|32Р|МШ]=2-1(Г" М, 20 мМ трис-11С1 рН 7.5. 10 мМ MgCl2, 0.1 MNaCl. 0.1 мМ ATP.

Для оценки эффективности дискриминации мисматча ДНК-лигазой используют фактор дискриминации, который является отношением выходов продуктов лигирования комплементарного комплекса и комплекса, содержащего мисматч. В нашем случае этот параметр представляет собой отношение скоростей лигирования полностью комплементарного и несовершенного комплекса. В результате сравнительного анализа эффектив-ностеЙ лигирования 96 несовершенных комплексов для каждого типа мисматча был получен соответствующий фактор дискриминации, В среднем "ОН"-мисматчи дискриминируются в 23 раза лучше, чем "Р"-мисматчи. В некоторых случаях несовершенные комплексы, содержащие несоответствия со стороны "Р"-компонента, лигируются даже лучше, чем соответствующие комплементарные комплексы.

На Рис. 8 приведены факторы дискриминации для "ОН"- и "Р"-мисматчей, которые были получены при усреднении четырех значений.

соответствующих типу соседней к мисматчу комплементарной пары по нику. Анализ диаграммы показывает, что между значениями факторов дискриминации "ОН"- и "Р"-мисматчей наблюдается хорошая корреляция, которая нарушается только в случае 5 типов "ОН"-мисматчей. Это mG/G, mG/A, m A/G, шА/А (четыре Pu/Pu) и шС/С мисмат-чи, факторы дискриминации для которых в среднем в 3.5 раза выше. Наличие корреляции между факторами дискриминации неожиданно, т.к. "ОН"- и "Р"-мисматчи, скорее всего, должны влиять на разные этапы ферментативного катализа. В целом мисматчи типа Pu/Pu и гомо-Ру/Ру максимально дискриминируются как в случае "ОН"-, так и в случае "Р"-мисматчей. Возможным объяснением всплеска эффективности дискриминации Pu/Pu и С/С может являться тот факт, что пространственная структура дуплекса с несовершенными парами оснований такого типа наиболее сильно отклоняется от канонической структуры двойной спирали, т.е. комплементарной пары типа Ри/Ру, что и влияет на селективность ДНК-лигазы.

Проведенные исследования показали, что эффективность дискриминации мисматча ДНК-лигазой фага Т4 существенно зависит от нуклео-тидного состава в одноцепочечном разрыве. Полученные результаты были использованы для формирования базы данных факторов дискриминации мисматчей, которая может быть использована при выборе зондов для метода лигирования олигонуклеотидов. Это позволяет выбрать наиболее выгодные структуры совершенного и несовершенного ников, обеспечивающие наилучший фактор дискриминации при лигировании. Для выбора длины олигонуклеотидов и концентрационных условий, в которых бы наблюдалась наибольшая селективность при гибридизации, необходимо использовать результаты, описанные в разделе 2. Таким образом, получены данные, необходимые для создания программного обеспечения, производящего выбор тандемов олигонуклеотидов, которые обеспечивают максимальную селективность при их использовании в качестве зондов для анализа полиморфных сайтов в ДНК методом лигирования олигонуклеотидов.

Тип мисчатч*

Рис. 8. Усредненные по соседней комплементарной парс факторы дискриминации для 12 типов "Р"- и "ОН"-мисматчей.

4. Программа для выбора максимально селективных зондов

Селективность метода лигирования олигонуклеотидов зависит от особенностей протекания этапа гибридизации, т.е. образования субстратного ДНК-комплекса, и этапа ферментативного образования фосфодиэфирной связи.

Выбор структуры высокоселективных зондов для анализа ДНК методом лигирования является многопараметрической задачей и требует строгого согласования экспериментальных ограничений, например, гибриди-зационных свойств олигонуклеотидных зондов. Решение задач такого рода весьма затруднено при отсутствии программного обеспечения, позволяющего провести анализ тестируемой последовательности ДНК и получить количественные характеристики выбираемых зондов, основанные на четких критериях.

В настоящей работе был разработан алгоритм выбора структуры тандемов олигонуклеотидов, который был реализован на Visual Basic for Application в Microsoft Office Excel. Исходными данными для программы являются последовательности нормальной и мутантной матрицы, их концентрации, концентрации компонентов тандема, а именно (для двухком-понентного тандема), зонда, в сайте связывания которого располагается предполагаемая замена, и эффектора - олигонуклеотида с повышенной относительно зонда гибридизационной способностью. При этом необходима также информация о возможном диапазоне температур проведения анализа и о минимально допустимых степенях ассоциации комплекса зонда и эффектора с матрицей.

Программа позволяет производить расчет термодинамических характеристик двух- и трехкомпонентного тандемов, соответствующих анализируемым вариантам ДНК, и отбирать те из них, которые обладают высокими значениями селективности гибридизации (анализ функции селективности) для заданных концентрационных и температурных условий. Далее для выбранных тандемов определяются величины факторов дискриминации лигирования, соответствующие отношению скоростей ферментативного лигирования комплементарных и содержащих мисматч комплексов.

В результате выдаются варианты тандемов, оптимальные концентрации их компонентов, температуры плавления комплексов, значения факторов селективности гибридизации и лигирования. На основании представленных количественных характеристик можно произвести рациональный выбор тандема олигонуклеотидных зондов, что существенно упрощает разработку новых систем анализа точечных мутаций в ДНК методом ферментативного лигирования олигонуклеотидов.

выводы

1. В рамках метода лигирования олигонуклеотидов предложен новый подход к колориметрическому выявлению точечных мутаций с помощью ДНК-лигазы фага Т4. Подход основан на отделении тандема коротких олигонуклеотидов от комплекса продукта лигирования с анализируемой ДНК длиной более 100 нт. за счет её избирательной УФ-иммобилизации на капроновой мембране. Показано, что предложенный подход позволяет с высокой селективностью выявлять в ДНК однонук-леотидные замены, а также гомо- и гетерозиготные варианты тринукле-отидных делеций/вставок.

а) Показано, что наиболее адекватным способом количественной оценки селективности гибридизации зонда является расчет функции селективности (ФС), представляющей собой отношение степеней ассоциации комплексов зонда с нормальной и мутантной ДНК. Проведен анализ ФС и впервые показано, что температура, при которой достигается максимум ФС, несколько превышает температуру плавления комплементарного комплекса. Показано, что для зондов, отличающихся по длине, максимальное значение ФС для заданной температуры выше при использовании более длинного зонда. Впервые получены уравнения, позволяющие оценить степень изменения величины максимума ФС при варьировании концентрации зонда, его длины или типа точечной мутации в ДНК.

б) С использованием ДНК-лигазы фага Т4, при лигировании всех 96 вариантов одиночных мисматчей вблизи одноцепочечного разрыва ДНК экспериментально определены факторы дискриминации (ФД), представляющие собой отношение скоростей лигирования комплементарного комплекса и комплекса, содержащего несовершенную пару оснований. Максимальные ФД наблюдаются для гомопуриновых и го-мопиримидиновых мисматчей. ФД мисматчей, расположенных с 5'-стороны от одноцепочечного разрыва, в среднем в 23 раза выше, чем ФД аналогичных мисматчей с З'-стороны.

3. Разработан алгоритм предварительной оценки селективности выявления точечных мутаций в известных последовательностях ДНК методом лигирования олигонуклеотидов. Создано программное обеспечение, использующее данный алгоритм для нахождения структуры двух- или трехкомпонентного тандема, который бы обеспечивал в заданных экспериментальных условиях максимальную селективность выявления мутации.

Основные результаты диссертации изложены в следующих работах:

1. Кабилов М.Р., Пышный Д.В., Дымшиц Г.М., Гашникова Н.П., Покровский А.Г., Зарытова В.Ф., Иванова Е.М. Новый подход к выявлению анализируемой последовательности ДИК путем УФ-иммобилизации ее гибридизационного комплекса с высокоспецифичным зондом, образующимся при лигировании тандема коротких олигонуклеотидов в растворе. Молекулярная биология. 2002. Т. 36. С. 424-431.

2. Кабилов М.Р., Пышный Д.В., Дымшиц Г.М., Зарытова В.Ф., Иванова Е.М. Выявление тринуклеотидной делеции AF508 в гене CFTR человека путем УФ-иммобилизации на капроне комплекса ПЦР-фрагмента с высокоспецифичным зондом. Молекулярная биология. 2003. Т. 37. С. 793800.

3. Пышный Д.В., Кабилов М.Р., Ломзов A.A., Иванова Е.М. "Эффективность взаимодействия пар оснований в точке одноцепочечного разрыва двойной спирали ДНК". Материалы III конференции молодых ученых, посвященной М.А. Лаврентьеву. Часть II. Науки о жизни, науки о Земле, экономические науки, гуманитарные науки. Новосибирск. 2003. С. 7-11.

4. Kabilov М., Pyshnyi D., Dymshits G., Zarytova V., Ivanova E. A new approach to revealing point mutations in DNA analyzed by colorimetric detection. Nucleosides, Nucleotides & Nucleic Acids. 2004. V. 23. P. 1023-1030.

5. Пышный Д.В., Кабилов M.P., Ломзов A.A., Пышная И.А., Скобельцына Л.М., Зарытова В.Ф., Иванова Е.М. Составные олигонуклеотидные зонды как инструменты диагностики ДНК. Материалы IV конференции молодых ученых, посвященной М.А. Лаврентьеву. Часть II. Гуманитарные науки, науки о жизни, науки о земле, экономические науки. Новосибирск. 2004. С. 148-152.

6. Кабилов М.Р., Малышев Б.С., Пышный Д.В. Рациональный дизайн зондов для выявления точечных мутаций методом лигирования олигонуклеотидов. Сборник трудов международной конференции "Физико-химическая биология" посвященной 80-летию академика Д.Г. Кнорре, Новосибирск. 30 июля - 3 августа. 2006. С. 38-39.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Кабилов, Марсель Расимович

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ б 1. ПРИНЦИПЫ СЕЛЕКТИВНОСТИ В МЕТОДАХ ВЫЯВЛЕНИЯ

ТОЧЕЧНЫХ МУТАЦИЙ В НК (обзор литературы)

1.1. Детекция известных мутаций

1.1.1. Рестрикционный анализ

1.1.2. Аллель специфичная гибридизация

1.1.3. Методы выявления мисматчей в дуплексе олигонуклеотид/ДНК

1.1.3.1. Химическая реакция

1.1.3.2. ДНКзимы

1.1.3.3. Flap-эндонуклеозы

1.1.3.4. Методы лигирования

1.1.3.5. Методы, основанные на использовании ДНК-полимераз

1.2 Детекция новых мутаций

1.2.1. Конформационный анализ

1.2.1.1. Конформационный полиморфизм одноцепочечной ДНК

1.2.1.2. Полиморфизм длин фрагментов при действии эндонуклеазой Cleavase I

1.2.2. Гетеродуплексный анализ фрагментов ДНК 23 1.2.2.1 Физико-химические методы

1.2.2.2. Методы химического расщепления гетеродуплексов

1.2.2.3. Методы детекции, основанные на использование мисматч узнающих белков

1.3 Методы секвенирования

1.3.1. Секвенирование при синтезе

1.3.1.1. Секвенирование по Сэнгеру

1.3.1.2. Секвенирование при полимеризации

1.3.2. Секвенирование при расщеплении

1.3.2.1. Химическое расщепление

1.3.2.2. Экзонуклеазное расщепление 36 1.4. Заключение

2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

2.1. Исходные материалы

2.1.1. Реактивы и препараты

2.1.2. Буферы и растворы

2.1.3. Праймеры

2.2. Основные методы 40 2.2.1 Синтез и выделение олигонуклеотидов

2.2.2. Получение и выделение ПЦР-фрагментов

2.2.3. Метод лигирования олигонуклеотидов

2.2.4. УФ-иммобилизация и колориметрическое выявление на капроне 43 2.2.5 Исследование термической денатурации 44 2.2.6. Расчет термодинамических параметров комплексообразования 44 3. ВЫЯВЛЕНИЯ ТОЧЕЧНЫХ МУТАЦИЙ В ДНК МЕТОДОМ ЛИГИРОВАНИЯ ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ: СЕЛЕКТИВНОСТЬ ЭТАПОВ ГИБРИДИЗАЦИИ И ЛИГИРОВАНИЯ (результаты и обсуждение)

3.1. Разработка подхода к выявлению точечных мутаций

3.1.1. Концепция метода

3.1.2. Оптимизация условий анализа

3.1.2.1. Подбор концентрационных условий

3.1.2.2. Влияние дозы УФ-облучения на эффективность выявления ДНК

3.1.2.3. Эффективность лигирования тандемов олигонуклеотидов на различных ДНК-матрицах

3.1.2.4. Влияние длины ПЦР-фрагмента на эффективность его колориметрического выявления

3.1.3. Колориметрическое выявление точечных мутаций

3.1.3.1. Детекция тринуклеотидной делеции и вставки модель CFTR)

3.1.3.2. Детекция однонуклеотидных замен (модель ВИЧ-1) 63 3.2.Селективность гибридизации

3.2.1. Описание модели

3.2.2. Анализ функции селективности

3.2.3. Изменение селективности при варьировании концентрации зовда

3.2.4. Изменение селективности при варьировании структуры зонда

3.2.5. Изменение селективности при выявлении различных мисматчей

3.2.6. Анализ полученных результатов

3.3. Селективность дотирования

3.3.1. Дизайн модельной системы

3.3.2. Термическая стабильность модельных дуплексов

3.3.3. Лигирование комплементарных комплексов

3.3.4. Дискриминация одиночных мисматчей вблизи одноцепочечного разрыва

3.4. Программа для выбора максимально селективных зондов 98 ВЫВОДЫ 103 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 104 ПРИЛОЖЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

В настоящей работе использованы символы и сокращения структурных компонентов нуклеиновых кислот и их производных в соответствии с рекомендациями Комиссии по номенклатуре Международного союза чистой и прикладной химии (IUPAC) и международного союза биохимиков (IUB), а также следующие обозначения:

ДНК дезоксирибонуклеиновая кислота дцЦНК двуцепочечная ДНК

N нуклеотидное звено

ПЦР полимеразная цепная реакция е.а. единица активности фермента о.е. оптические единицы

ВЭЖХ высокоэффективная жидкостная хроматография

ПААГ полиакриламидный гель трис трис-(гидроксиметил)-аминометан

Taq полимераза ДНК-зависимая ДНК-полимераза Thermus aquaticus

SNP Single Nucleotide Polymorphism (однонуклеотидный полиморфизм)

OLA Oligonucleotide Ligation Assay (метод лигирования олигонуклеотидов)

LNA замкнутая (locked) нуклеиновая кислота

PNA пептидил нуклеиновая кислота а степень ассоциации олигонуклеотидов в дуплексной форме fa функция селективности гибридизации

Тт температура плавления (температура, при которой степень ассоциации комплекса олигонуклеотидов равна 0.5)

Тпих температура, при которой функция селективности достигает максимума

BCIP 5-бром-4-хлор-3-индолилфосфат динатриевая соль

NBT нитротетразолиевый синий

DMFA диметилформамид

DMSO диметилсульфоксид

EDTA этилендиаминтетрауксусная кислота

DTT 1,4-дитиотреитол

SDS додецилсульфат натрия

Префикс "d" опущен при написании структуры олигодезоксирибонуклеотидов, нуклео-тидных пар для краткости написания опущен.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Выявление точечных мутаций в ДНК методом лигирования олигонуклеотидов: селективность этапов гибридизации и лигирования"

Развитие методов секвенирования ДНК привело к накоплению колоссального объёма информации, как о первичной структуре нуклеиновых кислот различных биологических объектов, так и о полиморфизмах в генетическом материале [1]. Наличие точечных мутаций позволяет судить о предрасположенности или присутствии генетических заболеваний, как моногенной, так и полигенной природы [2]. Мутации подобного типа часто являются причинами лекарственной устойчивости различных патогенных микроорганизмов и вирусов [3, 4], вызывающих, например, такие социально-значимые заболевания как туберкулез, гепатиты, СПИД и др. Все это свидетельствует о необходимости развития технологий достоверного выявления точечных мутаций, что позволит приблизиться к реализации персонифицированного подхода в профилактике и лечении различных заболеваний.

Описаны различные подходы выявления точечных мутаций в генетическом материале. Наиболее распространенными среди них являются аллель-специфичная ПЦР, TaqMan [5-7], минисеквенирование [8] и лигирование набора олигонуклеотидов [9,10]. Во всех этих подходах селективность выявления обеспечивается за счет ферментов, обладающих способностью различать полностью комплементарный комплекс и комплекс, содержащий мисматч. Так, ДНК-лигазы способны дискриминировать наличие некомплементарной пары вблизи одноцепочечного разрыва в ДНК-дуплексе, что нашло применение в подходе OLA (oligonucleotide ligation assay). Наличие мисматча существенно снижает эффективность формирования фосфодиэфирной связи, т.е. образование продукта лигирования позволяет судить о присутствии специфической последовательности ДНК. Однако в литературе отсутствует систематическая информация об эффективности дискриминации мисматчей в нике в зависимости от типа нуклеотидов.

С другой стороны большинство методов выявления точечных мутаций [5, 7, 9, 11-14] содержит этап гибридизации олигонуклеотидных зондов с НК-мишенью, который может быть использован для обеспечения дополнительной селективности выявления. Тем не менее формальное определение селективности гибридизации как количественного параметра до сих пор не нашло широкого применения.

Цели и задачи исследования:

В ходе исследования решались следующие задачи:

- разработка нового подхода к выявлению точечных мутаций в ДНК;

- создание систематической базы данных, описывающей эффективность дискриминации ДНК-лигазой фага Т4 любых одиночных мисматчей вблизи сайта лигирова-ния;

1. ПРИНЦИПЫ СЕЛЕКТИВНОСТИ В МЕТОДАХ ВЫЯВЛЕНИЯ ТОЧЕЧНЫХ МУТАЦИЙ В НК (обзор литературы)

Большинство методов выявления точечных мутаций включают несколько этапов: амплификацию, селективное получение специфического продукта и его детекцию. Первый этап - это амплификация исходного нуклеотидного материала (геномной ДНК или РНК), количества которого, как правило, не хватает для анализа из-за недостаточной чувствительности большинства методов. На втором этапе проводят селективную реакцию, продукт которой позволяет судить о том содержит ли последовательность точечную мутацию или нет. И последний этап - это детекция специфического сигнала от продукта, полученного в результате селективной реакции, при его отделении, если необходимо, от исходной метки. Следует отметить, что возможны как совмещения некоторых этапов, например амплификации и селективной реакции, так и отсутствиенеко-торых из них, кроме второго этапа, который присутствует во всех случаях.

Данный обзор посвящен рассмотрению принципов, используемых в различных методах выявления точечных мутаций в НК, на основе которых происходит образование специфического продукта, свидетельствующего о наличии или наоборот отсутствии замены. Под селективностью понимается способность различения схожих нуклео-тидных последовательности, отличающихся друг от друга точечной мутацией. Селективная реакция может иметь совершенно разную природу, например, физико-химическую, ферментативную или химическую, при этом может происходить изменение массы, конформации, флуоресценции и т.д.

1Л. Детекция известных мутаций

Представленные в этой части литературного обзора методы применяются в случае, когда известна первичная последовательность анализируемого сайта, тип и локализация выявляемой точечной мутации.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Кабилов, Марсель Расимович

выводы

1. В рамках метода лигирования олигонуклеотидов предложен новый подход к колориметрическому выявлению точечных мутаций с помощью ДНК-лигазы фага Т4. Подход основан на отделении тандема коротких олигонуклеотидов от комплекса продукта лигирования с анализируемой ДНК длиной более 100 нт. за счет её избирательной УФ-иммобилизации на капроновой мембране. Показано, что предложенный подход позволяет с высокой селективностью выявлять в ДНК однонуклеотидные замены, а также гомо- и гетерозиготные варианты тринуклеотидных делеций/вставок.

2. Впервые проведено систематическое исследование селективности этапа гибридизации зондов с ДНК и этапа образования фосфодиэфирной связи при выявлении точечных мутаций в ДНК методом ферментативного лигирования олигонуклеотидов. а) Показано, что наиболее адекватным способом количественной оценки селективности гибридизации зонда является расчет функции селективности (ФС), представляющей собой отношение степеней ассоциации комплексов зонда с нормальной и мутантной ДНК. Проведен анализ ФС и впервые показано, что температура, при которой достигается максимум ФС, несколько превышает температуру плавления комплементарного комплекса. Показано, что для зондов, отличающихся по длине, максимальное значение ФС для заданной температуры выше при использовании более длинного зонда. Впервые получены уравнения, позволяющие оценить степень изменения величины максимума ФС при варьировании концентрации зонда, его длины или типа точечной мутации в ДНК. б) С использованием ДНК-лигазы фага Т4 при лигировании всех 96 вариантов одиночных мисматчей вблизи одноцепочечного разрыва ДНК экспериментально определены факторы дискриминации (ФД), представляющие собой отношение скоростей лигирования комплементарного комплекса и комплекса, содержащего несовершенную пару оснований. Максимальные ФД наблюдаются для гомопури-новых и гомопиримидиновых мисматчей. ФД мисматчей, расположенных с 5'-стороны от одноцепочечного разрыва, в среднем в 23 раза выше, чем ФД аналогичных мисматчей с З'-стороны.

1.4. Заключение

Как следует из приведенного литературного обзора, разработка методов выявления точечных замен в ДНК [6, 122, 123] является в настоящее время одним из бурно развивающихся направлений. Условно методы выявления могут быть разделены на три группы. В первую попали методы, детектирующие наличие известных мутаций (RFLP и гибридизационный анализ). Данные методы получили наибольшее распространение и продолжают развиваться. Во вторую группу можно объединить методы, направленные на идентификацию как известных, так и неизвестных мутаций. Часть из этих методов позволяет лишь судить о наличии мутации, но ни о положении, ни об её типе (SSCP, CFLP, НА, DGGE, TGGE, DHPLC, MutS,H,L система). Другие позволяют локализовать её, не говоря о типе (РНК и ДНК-эндонуклеазы). Третьи могут ответить на все эти вопросы (ССМ, ДНК-гликозилазы). Использование перечисленных выше подходов всегда требует знание первичной последовательности, т.е. первоначального секвенирования. В третий блок входят методы секвенирования, дающие полную информацию о нуклеотидной последовательности анализируемой ДНК и использующиеся для выявления новых SNP.

Выявление известных точечных мутаций, ассоциированных с определенным фенотипом, является наиболее востребованным, что отражается на количестве предлагаемых методов их детекции. Для описанных в литературе методов, как правило, показана только принципиальная возможность выявления мутации. Отсутствие систематических данных по селективности методов затрудняет их сравнение между собой, а с другой стороны усложняет или вовсе не позволяет их использование при разработке новых тест-систем.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Исходные материалы 2.1.1. Реактивы и препараты

В работе были использованы следующие реактивы и ферменты: полинуклеотид-киназа Т4, ДНК-лигаза фага Т4, конъюгат стрептавидин-щелочная фосфатаза, любезно предоставленный M.JI. Филипенко (ИХБФМ СО РАН), Taq ДНК-полимераза (ИХБФМ СО РАН), протеиназа К (Медиген, Россия), ДНК фага X гидролизованную Hind Ill-фрагментов (Сибэнзим, Россия), хромогенные субстраты BCIP и NBT ("Molecular probes", США), Tween-20 (Fisher, США), капроновая мембрана (Hiiu Kalur, Эстония) DMFA, NaCl, N-гидроксисукцинимидный эфир биотина ("Molecular Probes", США)

ПЦР-фрагменты гена env ВИЧ-1/bru (180 н.п.) и ВИЧ-1/rf (180 н.п.) были любезно предоставлены Гашниковой Н.П. (ФГУН ГНЦ ВБ "Вектор").

Кровь больного муковисцидозом (гомозигота по deIF508) предоставлена отделением пульмонологии (МДКБСП №3, г. Новосибирск).

2.1.2. Буферы и растворы

Название Состав

Буфер ТЕ 50 мМ трис- НС1 рН 8.3,0.1 мМ EDTA

Буфер ТВЕ 50 мМ трис-борат, рН 8.3,50 мМ борная кислота, 0.1 мМ EDTA

Буфер ligA 20 мМ трис-HCl рН 7.5,10 мМ MgCl2,0.1 М NaCl, 10 мМ DTT, 1 мМ АТР

Буфер ligB 20 мМ трис-HCl рН 7.5,10 мМ MgCl2,0.1 М NaCl, 10 мМ DTT

Буфер ПЦР 67 мМ трис-HCl рН 8.9, 16 мМ (NH4)2S04, 1.5 мМ MgCl2, 85 мкг/мл BSA, 0.01% Tween-20,5 мМ DTT

Буфер АР-7.5 20 мМ трис-HCl рН 7.5,100 мМ NaCl, 2 мМ MgCl2

Буфер АР-9.5 20 мМ трис-HCl, рН 9.5,100 мМ NaCl, 2 мМ MgCl2

Буфер АРТ-7.5 20 мМ трис-HCl, рН 7.5,100 мМ NaCl, 2 мМ MgCl2,0.5 % Tween-20

Буфер D ЮмМ трис-EDTA рН 7,0.4 М NaCl, 0.3% SDS

Буфер Т ЮмМ какодилат NapH 7.5,0.1 М NaCl, 10 мМ MgCl2,

P-pNBT 75 мг/мл в 70% водном DMFA

Р-р BCIP 50 мг/мл в 50% водном DMFA

2.1.3. Праймеры

Праймеры для получения ПЦР-фрагментов гена env ВИЧ-1

С01 ACAATTATTGTCTGGTATAG прямой

С02 AGGTATCTTTCCACAGCCAG обратный

Праймеры для получения ПЦР-фрагментов гена CFTR человека

Pi TGCCTGGCACCATTAAAG прямой

Р2 GGAGGCAAGTGAATCCTG прямой рЗ GGGTAAGCTACTGTGAATGGAT обратный р4 CAATGGTTATTTATATGGCAGC обратный рб TTCCTGGATTATGCCTG прямой

Р7 GCATGCTTTGATGACGC обратный

2.2. Основные методы

2.2.1. Синтез и выделение олигонуклеотидов

Синтез олигодезоксирибонуклеотидов проводили на автоматическом синтезаторе ASM-700 (Biosset, Россия) с использованием стандартных синтонов (Glen Research, США) для фосфитамидитного протокола.

Выделение олигодезоксирибонуклеотидов и их производных после полного деблокирования проводили ионообменной и обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографией на хроматографе ("Waters", США) на колонках 3.9x300 мм. Для ионообменной хроматографии использовали носитель Полисил СА-500 (12мкм) (ФГУН ГНЦ ВБ "Вектор", Россия) и градиент концентрации КН2РО4 от 0 до 0.3 М (рН 6,5) в 30% ацетонитриле. Обращенно-фазовую хроматографию проводили на колонке с носителем LiChroprep RP-18 (10 мкм) ("Merck", Германия) в градиенте концентрации ацетонитрила от 0 до 20% (30%) в водном растворе UCIO4 (50 мМ).

Концентрирование растворов олигонуклеотидов и их производных после хро-матографического выделения проводили на вакуумном ротационном испарителе Rota-vapor RE120 (Bichi, Швейцария) при давлении 10-15 мм рт.ст.

Определение концентрации олигонуклеотидов проводили спектрофотометри-чески на приборе "Милихром 4", Россия, используя суммарные величины молярных коэффициентов поглощения faeo) моно- и динуклеотидов на длине волны 260 нм [124].

УФ-спектры записывали на спектрофотометре UV-2100 ("Shimadzu", Япония).

5'-32Р-Меченые олигонуклеотиды получали по методу [125], используя [у-32Р] АТР (ИХБФМ СО РАН). Меченую ДНК выделяли при помощи электрофореза в 20%

РОССИЙСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ БИБЛИОТЕКА

ПААГ и элюировали из геля буфером ТЕ.

Биотинилированные по 3'-концу дезоксирибонуклеотиды синтезированы по методу, описанному в работе [126]. 5'-конец биотинилировали, исходя из олигонуклео-тидного производного, несущего на 5'-концевом фосфате остаток 1,3-диамино пропана по тому же методу [126].

Элекгрофоретический анализ олигонуклеотидов проводили в денатурирующем (7 М мочевина) 20% ПААГ (акриламид / КК'-метиленбисакриламид 30:1), используя ТВЕ буфер.

2.2.2. Получение и выделение ПЦР-фрагментов

Подбор праймеров для гена CFTR осуществлялся с помощью программы Gene Runer 3.05 (Hastings Software, США). Уникальность выбранных праймеров проверялась в поисковой программе BLAST на сайте http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/. Анализ показал отсутствие высокой гомологии с какими-либо другими известными участками генома человека.

Выделение геномной ДНК из крови проводили следующим образом: к 1 мл крови и/или кровяному сгустку добавляли 1 мл бидистиллированной (б/д) воды, перемешивали, центрифугировали 4 мин при 4000 об/мин ("Eppendorf" 5415С, Германия) и удаляли супернатант. Осадок ядерных элементов ресуспендировали в 1 мл буфера D и добавляли 40 мкг протеиназы К. После перемешивания раствор инкубировали 2 часа при 65°С, затем при 37°С в течение ночи, периодически встряхивая. К раствору добавляли 500 мкл 5 М NaCl, перемешивали и центрифугировали при 14000 об/мин в течение 5 минут ("Eppendorf 1547, Германия). Супернатант переносили в новую пробирку и добавляли 0.5 объема изопропанола, пробирки встряхивали, выдерживали 5 мин при комнатной температуре и центрифугировали при 14000 об/мин 5 минут. Осадок ДНК последовательно промывали 70% и 96% этанолом, сушили на воздухе при комнатной температуре и растворяли в б/д воде.

Полимеразную цепную реакцию проводили в 10 мкл смеси, содержащей ПЦР буфер, по 0.2 мМ каждого dNTP, по 2 мкМ прямого и обратного праймеров, 1 мкг геномной ДНК или 0.01 мкг ПЦР-фрагмент, 1.5 е.а. Taq полимеразы. Термоциклирование проводили на амплификаторе "Mastercycler 5330 plus" ("Eppendorf", Германия) по программе: 25-30 циклов (94 °С - 1 мин, 52 °С - 45 с, 72 °С -1 мин).

ПЦР-фрагмент ВИЧ-1 Ibru (135 н.п.) получали реамплификацией ПЦР-продукта ШЧ-МЪги (180 н.п.). ДНК-фрагменты гена CFTR 567 (1463-2029) и 564 н.п. (дикий и мутантный типы) получали, проводя ПЦР с геномной ДНК. ПЦР-фрагменты длиной 91(1615-1705), 230(1625-1854), 392(1463-1854), 405(1625-2029) п.н. и 88,227, 389 и 402 п.н. получали реамплификацией ПЦР-фрагментов 567 и 564 п.н., соответственно.

Осаждение ПЦР-фрагментов: при необходимости раствор ПЦР-фрагментов предварительно концентрировали добавлением н-бутанола. Далее проводили осаждение, добавляя 1/3 объема насыщенного раствора ацетата аммония и 3.2 объема 96 % этилового спирта. Реакционную смесь выдерживали при -20 °С в течение 12 ч, далее центрифугировали при 14000 об/мин в течение 15 мин. Осадок ДНК последовательно промывали 70% и 96% этанолом, сушили на воздухе при комнатной температуре и растворяли в б/д воде.

Препаративная наработка и выделение ПЦР-фрагментов: после проведения ПЦР в 10 пробирках по 50 мкл, реакционную смесь (500 мкл) концентрировали до объёма 100 мкл н-бутанолом и ДНК-фрагменты осаждали этанолом. Полученный осадок растворяли в 20 мкл, и ДНК-фрагменты разделяли в нативном 10% ПААГ, после чего визуализовали их в УФ-свете с помощью хроматографической пластины DC-Alufolien Kieselgel 60 F254 ("Merck", Германия) и вырезали части геля, содержащие требуемый ампликон. ДНК-фрагменты элюировали из геля тремя порциями по 200 мкл буфера ТЕ в термошейкере "Thermomixer compact" ("Eppendorf1, Германия) при 45 °С, 1400 rpm. Элюент объединяли, концентрировали н-бутанолом и ДНК осаждали этанолом. Осадок ДНК растворяли в воде и определяли концентрацию спектрофотометрически по поглощению раствора на 260 нм.

Анализ продуктов ПЦР проводили с помощью электрофореза в нативном 10% ПААГ (акриламид / ИД-метиленбисакриламид 30:1), используя буфер ТВЕ. В качестве маркеров длины использовали ДНК-фрагменты 100 - 1000 н.п. Ml5 ("Сибэнзим", Россия).

Секвенирование ПЦР-фрагментов проводили в центре коллективного пользования ИХБФМ и ИЦиГ СО РАН на автоматическом секвенаторе ABI PRISM 310 Genetic Analyzer. Реакционная смесь объёмом 5 мкл содержала ПЦР-фрагмент 10*7 М, праймер 2-10"7 М, 2 мкл BigDye Terminator Mix (флуоресцентно меченные дидезокси-нуклеотидтрифосфаты, дезоксинуклеотидтрифосфаты, AmpliTaq ДНК-полимераза).

2.2.3. Метод лигирования олигонуклеотидов

Лигирование на ПЦР-фрагментах: Перед смешиванием всех компонентов реакции, ПЦР-фрагмент и олигонуклеотиды прогревались в общей смеси до 100 °С 5 мин. после чего раствор помещался в лёд. Конечная реакционная смесь объёмом 10-30 мкл содержала олигонуклеотиды (10'5 М), биотинилированный олигонуклеотид (10*7М), ДНК-матрицу (10*7 М), 25 е.а. Т4 ДНК-лигазы, буфер ligA. Лигирование стандартно проводили при 25°С в течение 30 мин, если не оговорено иначе.

Лигирование на коротких ДНК-матрицах: Реакционная проба (10 мкл), содержала 2-10'5 М декануклеотида, З'-нуклеотид которого входил в ник, 410"6 М дека-нуклеотида, 5'-нуклеотид которого входил в ник, 20-мерную ДНК-матрицу (4-Ю^М), 0.25 е.а. Т4 ДНК-лигазы, 0.1 мМ АТР, буфер ligB. Лигирование проводили при 25°С в течение 10 мин, если не оговорено иначе.

Электрофоретический анализ продуктов лигирования проводили в денатурирующем (20%) или нативном ПААГ (10-15%). После авторадиографирования геля на рентгеновскую пленку "Curix" ("Agfa", Бельгия), пленку сканировали на приборе UMAX PowerLook 1000 (Германия). Количественную оценку результатов проводили с помощью программы "Gel-Pro Analyzer 4.0" ("Media Cybernetics", США), которая позволяет оценивать интенсивность окраски каждой из полос в шкале серых тонов. Степень образования продуктов реакции рассчитывали как отношение интенсивностей в полосах, соответствующих продукту реакции к исходному радиоактивно меченному олигонуклеотиду.

Активность Т4 ДНК-лигазы определяли, принимая за 1 е.а. количество фермента, необходимое для того, чтобы обеспечить лигирование 50% Hind Ill-фрагментов ДНК фага X за 30 мин при 16 °С в 20 мкл реакционной смеси при концентрации ДНК

0.3 мкг/мкл.

2.2.4. УФ-иммобилизация и колориметрическое выявление на капроне

Реакционную смесь (3-7 мкл) после проведения лигирования наносили на капроновую мембрану, помещенную на лист бумаги (Whatman ЗММ), пропитанный 3 М NaCl, и облучали УФ-светом (две ртутные лампы низкого давления (ЭДБ-30, Россия)) с расстояния 17 см. Мембрану отмывали буфером АРТ-7.5 2 раза по 10 мин.

Колориметрическое выявление продуктов лигирования проводили, выдерживая мембрану с конъюгатом стрептавидин-щелочная фосфатаза (1 мкг/мл буфера АР-7.5) 30 мин. Мембрану отмывали буфером АРТ-7.5 3 раза по 5 мин и буфером АР-9.5 5 мин. Реакцию проявления проводили, выдерживая капрон с хромагенными субстратами (1 мл АР-9.5 + 4 мкл р-ра NBT + 8 мкл р-ра BCIP) в течение 10-20 мин и останавливали промывкой б/д водой. Окраску в точках нанесения регистрировали на сканере (Mustek), интенсивность окрашевания пятен оценивали в шкале серых тонов по величине интегральной оптической плотности (IOD) с помощью программы Gel-Pro Analyzer 4.0 ("Media Cybernetics", США).

2.2.5. Исследование термической денатурации

Исследование термической денатурации олигонуклеотидных дуплексов проводили в буфере Т при концентрации олигонуклеотидных компонентов 5*10"6 М каждого на установке с терморегулируемой оптической кюветой на базе УФ-детектора жидкостного хроматографа "Милихром" (Научприбор, Россия) не менее чем на четырех длинах волн в диапазоне 230-290 нм. Регистрацию кривых плавления в многоволновом режиме проводили с пошаговым автоматическим переключением монохроматора. Время интегрирования сигнала на каждой длине волны не превышало 1.2 с. Каждая кривая плавления состояла из набора не менее чем 600 температурных значений оптической плотности с частотой 10 точек/°С.

2.2.6. Расчет термодинамических параметров (энтальпии д# и энтропии aS) Расчет дHN и дSN для комплементарных ДНК комплексов:

Термодинамические характеристики дHN и дSN в 1 М NaCl для комплементарных комплексов были рассчитаны с использованием параметров SantaLucia J. для модели ближайших соседей [127]. Для расчетов термодинамических параметров комплек-сообразования среднестатистического олигомера длины / +1 (без учета концевых эффектов) использовались выражения: д HN»lp&HN (1.1)

Sn*IpaSn (1.2) где дЯ^=-8.36 ккал/моль энтальпия, а д5л,=-22.4 кал/(моль*К) энтропия формирования среднестатистического динуклеотидного шага спирали ДНК, полученные при усреднении параметров [127].

Расчет д Ни и д Нм для ДНК комплексов, содержащих мисматч:

Термодинамические характеристики дЯм и дЯм в 1 М NaCl для комплексов, содержащих одиночные мисматчи, рассчитывали, исходя из параметров формирования динуклеотидного шага спирали ДНК, полученных в работах [127-132]. Параметры ддЯ и ддS рассчитывали как разницу соответствующих значений, полученных для комплементарного и содержащего одиночный мисматч дуплексов: ддЯ =aHn -дНи и

ДД|S —&Sf/ —aSи

Величины ддЯи ддS для каждого типа мисматча X/Y (таблица 1) усредненного по окружению рассчитывали по дд H(X/Y) =

2>Я r NXN} кN'YN'J и ДДS(X/Y)=дд S

NXN

N'YN' п п

Среднестатистическая дестабилизация дуплекса при наличии одиночного мисматча характеризуется величинами ддЯ=-16.4 ккал/мольи дд5=-41.2 кал/(моль*К). Соотношение среднестатистических энтальпий комплексообразования и дестабилизации, таким образом, составляет дд Н -16.4 я д Ни -8.36

1.3)

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Кабилов, Марсель Расимович, Новосибирск

1. www.ncbi.nlm.nih.gov/proiects/SNP/

2. Hirschhom J.N., Daly M.J. Genome-wide association studies for common diseases and complex traits//Nat. Rev. Genet. 2005. V. 6 P. 95-108

3. Newton C.R., Graham A., Heptinstall L.E., Powell S.J., Summers C., Kalsheker N., Smith J.C., Markham A.F. Analysis of any point mutation in DNA. The amplification refractory mutation system (ARMS) //Nucleic Acids Res. 1989. V. 17 P. 2503-2516

4. Whitcombe D., Newton C.R., Little S. Advances in approaches to DNA-based diagnostics // Curr. Opin. Biotechnol. 1998. V. 9 P. 602-608

5. Кофиади И.А., Ребриков Д.В. Методы детекции однонуклеотидных полиморфизмов: аллель-специфичный ПЦР и гибридизация с олигонуклеотидной пробой // Генетика 2007. V. 26 Р. 22-32

6. Chen X., Zehnbauer В., Gnirke A., Kwok P.Y. Fluorescence energy transfer detection as a homogeneous DNA diagnostic method // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 1997. V. 94 P. 10756-10761

7. Barany F. Genetic disease detection and DNA amplification using cloned thermostable ligase // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 1991. V. 88 P. 189-193

8. Nelson N.C., Hammond P.W., Matsuda Е., Goud A.A., Becker М.М. Detection of all single-base mismatches in solution by chemiluminescence // Nucleic Acids Res. 1996. V. 24 P. 4998-5003

9. Kalinina O., Lebedeva I., Brown J., Silver J. Nanoliter scale PCR with TaqMan detection // Nucleic Acids Res. 1997. V. 25 P. 1999-2004

10. Горбунов В.Н., Баранов B.C. Введение в молекулярную диагностику и генотера-пию наследственных заболеваний // Санкт-Петербург: "Специальная литература" 1997.

11. Friedman К.J., Highsmith W.E., Jr., Prior T.W., Perry T.R., Silverman L.M. Cystic fibrosis deletion mutation detected by PCR-mediated site-directed mutagenesis // Clin. Chem. 1990. V. 36 P. 695-696

12. Rohlfs E.M., Learning W.G., Friedman K.J., Couch F.J., Weber B.L., Silverman L.M. Direct detection of mutations in the breast and ovarian cancer susceptibility gene BRCA1 by PCR-mediated site-directed mutagenesis // Clin. Chem. 1997. V. 43 P. 2429

13. Southern E.M. Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis//J. Mol. Biol. 1975. V. 98 P. 503-517

14. Conner B.J., Reyes A.A., Morin C., Itakura K., Teplitz R.L., Wallace R.B. Detection of sickle cell beta S-globin allele by hybridization with synthetic oligonucleotides // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 1983. V. 80 P. 278-282

15. Lilley D.M., Wilson T.J. Fluorescence resonance energy transfer as a structural tool for nucleic acids // Curr. Opin. Chem. Biol. 2000. V. 4 P. 507-517

16. Cardullo R.A., Agrawal S., Flores C., Zamecnik P.C., Wolf D.E. Detection of nucleic acid hybridization by nonradiative fluorescence resonance energy transfer // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 1988. V. 85 P. 8790-8794

17. Bonnet G., Tyagi S., Libchaber A., Kramer F.R. Thermodynamic basis of the enhanced specificity of structured DNA probes // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 1999. V. 96 P. 6171-6176

18. Maskos U., Southern E.M. Parallel analysis of oligodeoxyribonucleotide (oligonucleotide) interactions. I. Analysis of factors influencing oligonucleotide duplex formation // Nucleic Acids Res. 1992. V. 20 P. 1675-1678

19. Relogio A., Schwager C., Richter A., Ansorge W., Valcarcel J. Optimization of oli-gonucleotide-based DNA microarrays // Nucleic Acids Res. 2002. V. 30 P. e51

20. Roberts R.W., Crothers D.M. Specificity and stringency in DNA triplex formation // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 1991. V. 88 P. 9397-9401

21. Bonnet G., Tyagi S., Libchaber A., Kramer F.R. Thermodynamic basis of the enhanced specificity of structured DNA probes // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 1999. V. 96 P. 6171-6176

22. Tsourkas A., Behlke M.A., Rose S.D., Bao G. Hybridization kinetics and thermodynamics of molecular beacons//Nucleic Acids Res. 2003. V. 31 P. 1319-1330

23. Livshits M.A., Ivanov I.B., Mirzabekov A.D., Florent'ev V.L. DNA sequencing by hybridization with an oligonucleotide matrix (SHOM). The theory of DNA elution after hybridization. //Mol. Biol. (Mosk) 1992. V. 26 P. 1298-1313

24. Dai H., Meyer M., Stepaniants S., Ziman M., Stoughton R. Use of hybridization kinetics for differentiating specific from non-specific binding to oligonucleotide microarrays // Nucleic Acids Res. 2002. V. 30 P. e86

25. Parinov S., Barsky V., Yershov G., Kirillov E., Timofeev E., Belgovskiy A., Mirzabekov A. DNA sequencing by hybridization to microchip octa-and decanucleotides extended by stacked pentanucleotides // Nucleic Acids Res. 1996. V. 24 P. 2998-3004

26. Pyshnyi D.V., Lokhov S.G., Podyminogin M.A., Ivanova E.M., Zarytova V.F. A new strategy of discrimination of a point mutation by tandem of short oligonucleotides // Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids 2000. V. 19 P. 1931-1941

27. Maldonado-Rodriguez R., Espinosa-Lara M., Loyola-Abitia P., Beattie W.G., Beattie K.L. Mutation detection by stacking hybridization on genosensor arrays // Mol. Bio-technol. 1999. V. 11 P. 13-25

28. Maldonado-Rodriguez R., Beattie K.L. Analysis of nucleic acids by tandem hybridization on oligonucleotide microarrays // Methods Mol. Biol. 2001. V. 170 P. 157-171

29. Pyshnyi D.V., Pyshnaya I., Levina A., Goldberg E., Zarytova V., Knorre D., Ivanova E. Thermodynamic analysis of stacking hybridization of oligonucleotides with DNA template // J. Biomol. Struct. Dyn. 2001. V. 19 P. 555-570

30. Pyshnyi D.V., Goldberg E.L., Ivanova E.M. Efficiency of coaxial stacking depends on the DNA duplex structure // J. Biomol. Struct. Dyn. 2003. V. 21 P. 459-468

31. Pyshnyi D.V., Ivanova E.M. The influence of nearest neighbours on the efficiency of coaxial stacking at contiguous stacking hybridization of oligodeoxyribonucleotides // Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids 2004. V. 23 P. 1057-1064

32. Ratilainen Т., Holmen A., Tuite E., Nielsen P.E., Norden B. Thermodynamics of sequence-specific binding of PNA to DNA // Biochemistry 2000. V. 39 P. 7781-7791

33. Mouritzen P., Nielsen A.T., Pfundheller H.M., Choleva Y., Kongsbak L., Moller S. Single nucleotide polymorphism genotyping using locked nucleic acid (LNA) // Expert. Rev. Mol. Diagn. 2003. V. 3 P. 27-38

34. Wang S., Friedman A.E., Kool E.T. Origins of high sequence selectivity: a stopped-flow kinetics study of DNA/RNA hybridization by duplex- and triplex-forming oligonucleotides //Biochemistry 1995. V. 34P. 9774-9784

35. Narayan C.C., Eric Т.К. Very High Affinity DNA Recognition by Bicyclic and Cross-Linked Oligonucleotides //J. Am. Chem. Soc.; 1995. V. 117 P. 10434-10442

36. Guo Z., Liu Q., Smith L.M. Enhanced discrimination of single nucleotide polymorphisms by artificial mismatch hybridization // Nat.Biotechnol. 1997. V. 15 P. 331-335

37. Pyshnaya I.A., Pyshnyi D.V., Lomzov A.A., Zarytova V.F., Ivanova E.M. The influence of the non-nucleotide insert on the hybridization properties of oligonucleotides // Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids 2004. V. 23 P. 1065-1071

38. Pyshnyi D.V., Lomzov A.A., Pyshnaya I.A., Ivanova E.M. Hybridization of the bridged oligonucleotides with DNA: thermodynamic and kinetic studies // J. Biomol. Struct. Dyn. 2006. V. 23 P. 567-580

39. Ellington A.D., Szostak J.W. Selection in vitro of single-stranded DNA molecules that fold into specific ligand-binding structures // Nature 1992. V. 355 P. 850-852

40. Cairns M.J., King A., Sun L.Q. Nucleic acid mutation analysis using catalytic DNA // Nucleic Acids Res. 2000. V. 28 P. E9

41. Долинная Н.Г., Грязнова О.И., Соколова Н.И., Шабарова З.А. Химические реакции в двуспиральных нуклеиновых кислотах II. Введение точечных модификаций в сахаро-фосфатный остав ДНК // Биорган. химия 2006. V. 12 Р. 921-928

42. Xu Y., Kool Е.Т. High sequence fidelity in a non-enzymatic DNA autoligation reaction // Nucleic Acids Res. 1999. V. 27 P. 875-881

43. Landegren U., Kaiser R., Sanders J., Hood L. A ligase-mediated gene detection technique // Science 1988. V. 241 P. 1077-1080

44. Wu D.Y., Wallace R.B. The ligation amplification reaction (LAR)~amplification of specific DNA sequences using sequential rounds of template-dependent ligation // Genomics 1989. V.4P. 560-569

45. Harada K., Orgel L.E. Unexpected substrate specificity of T4 DNA ligase revealed by in vitro selection //Nucleic Acids Res. 1993. V. 21 P. 2287-2291

46. James K.D., Boles A.R., Henckel D., Ellington A.D. The fidelity of template-directed oligonucleotide ligation and its relevance to DNA computation // Nucleic Acids Res. 1998. V. 26 P. 5203-5211

47. Tsytovich A.V., Dolinnaia N.G., Shabarova Z.A. T4-DNA ligase: substrate properties of synthetic DNA-duplexes with structural anomalies. // Mol. Biol. (Mosk) 1988. V. 22 P. 690-699

48. Shilov I.A., Koroleva O.N., Drutsa V.L. Features of connecting short oligonucleotides with phage T4 DNA ligase. // Mol. Biol. (Mosk) 1993. V. 27 P. 647-654

49. Barany F. Genetic disease detection and DNA amplification using cloned thermostable ligase // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 1991. V. 88 P. 189-193

50. Chen X., Livak K.J., Kwok P.Y. A homogeneous, ligase-mediated DNA diagnostic test // Genome Res. 1998. V. 8 P. 549-556

51. Tang Z., Wang K., Tan W., Li J., Liu L., Guo Q., Meng X., Ma C., Huang S. Realtime monitoring of nucleic acid ligation in homogenous solutions using molecular beacons // Nucleic Acids Res. 2003. V. 31 P. el48

52. Stewart J., Kozlowski P., Sowden M., Messing E., Smith H.C. A quantitative assay for assessing allelic proportions by iterative gap ligation // Nucleic Acids Res. 1998. V. 26 P. 961-966

53. Liu Q., Thorland E.C., Heit J.A., Sommer S.S. Overlapping PCR for bidirectional PCR amplification of specific alleles: a rapid one-tube method for simultaneously differentiating homozygotes and heterozygotes // Genome Res. 1997. V. 7 P. 389-398

54. Nazarenko I.A., Bhatnagar S.K., Hohman R.J. A closed tube format for amplification and detection of DNA based on energy transfer // Nucleic Acids Res. 1997. V. 25 P. 2516-2521

55. Holland P.M., Abramson R.D., Watson R., Gelfand D.H. Detection of specific polymerase chain reaction product by utilizing the 5'—3' exonuclease activity of Thermus aquaticus DNA polymerase // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 1991. V. 88 P. 7276-7280

56. Lee L.G., Connell C.R., Bloch W. Allelic discrimination by nick-translation PCR with fluorogenic probes//Nucleic Acids Res. 1993. V. 21 P. 3761-3766

57. Heid C.A., Stevens J., Livak K.J., Williams P.M. Real time quantitative PCR // Genome Res. 1996. V. 6 P. 986-994

58. Orita M., Iwahana H., Kanazawa H., Hayashi K., Sekiya T. Detection of polymorphisms of human DNA by gel electrophoresis as single-strand conformation polymorphisms // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 1989. V. 86 P. 2766-2770

59. Rossetti S., Englisch S., Bresin E., Pignatti P.F., Turco A.E. Detection of mutations in human genes by a new rapid method: cleavage fragment length polymorphism analysis (CFLPA) // Mol. Cell Probes 1997. V. 11 P. 155-160

60. White M.B., Carvalho M., Derse D., O'Brien S.J., Dean M. Detecting single base substitutions as heteroduplex polymorphisms // Genomics 1992. V. 12 P. 301-306

61. Myers R.M., Maniatis Т., Lerman L.S. Detection and localization of single base changes by denaturing gradient gel electrophoresis // Methods Enzymol. 1987. V. 155 P. 501-527

62. Ke S.H., Wartell R.M. Influence of nearest neighbor sequence on the stability of base pair mismatches in long DNA; determination by temperature-gradient gel electrophoresis //Nucleic Acids Res. 1993. V. 21 P. 5137-5143

63. Guldberg P., Guttler F. A simple method for identification of point mutations using denaturing gradient gel electrophoresis // Nucleic Acids Res. 1993. V. 21 P. 22612262

64. Liu W., Smith D.I., Rechtzigel K.J., Thibodeau S.N., James C.D. Denaturing high performance liquid chromatography (DHPLC) used in the detection of germline and somatic mutations//Nucleic Acids Res. 1998. V. 26 P. 1396-1400

65. Hecker K.H., Taylor P.D., Gjerde D.T. Mutation detection by denaturing DNA chromatography using fluorescently labeled polymerase chain reaction products // Anal. Biochem. 1999. V. 272 P. 156-164

66. Novack D.F., Casna N.J., Fischer S.G., Ford J.P. Detection of single base-pair mismatches in DNA by chemical modification followed by electrophoresis in 15% poly-acrylamide gel // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 1986. V. 83 P. 586-590

67. Cotton R.G., Rodrigues N.R., Campbell R.D. Reactivity of cytosine and thymine in single-base-pair mismatches with hydroxylamine and osmium tetroxide and its application to the study of mutations // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 1988. V. 85 P. 43974401

68. Verpy E., Biasotto M., Meo Т., Tosi M. Efficient detection of point mutations on color-coded strands of target DNA // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 1994. V. 91 P. 1873-1877

69. Ren J., Ulvik A., Refsum H., Ueland P.M. Chemical mismatch cleavage combined with capillary electrophoresis: detection of mutations exon 8 of the cystathionine beta-synthase gene // Clin. Chem. 1998. V. 44 P. 2108-2114

70. Lambrinakos A., Humphrey K.E., Babon J. J., Ellis T.P., Cotton R.G. Reactivity of potassium permanganate and tetraethylammonium chloride with mismatched bases and a simple mutation detection protocol // Nucleic Acids Res. 1999. V. 27 P. 1866-1874

71. Lishanski A., Ostrander E.A., Rine J. Mutation detection by mismatch binding protein, MutS, in amplified DNA: application to the cystic fibrosis gene // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 1994. V. 91 P. 2674-2678

72. Wagner R., Debbie P., Radman M. Mutation detection using immobilized mismatch binding protein (MutS) // Nucleic Acids Res. 1995. V. 23 P. 3944-3948

73. Ellis L.A., Taylor G.R., Banks R., Baumberg S. MutS binding protects heteroduplex DNA from exonuclease digestion in vitro: a simple method for detecting mutations // Nucleic Acids Res. 1994. V. 22 P. 2710-2711

74. Smith J., Modrich P. Mutation detection with MutH, MutL, and MutS mismatch repair proteins // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 1996. V. 93 P. 4374-4379

75. Beaulieu M., Larson G.P., Geller L., Flanagan S.D., Krontiris T.G. PCR candidate region mismatch scanning: adaptation to quantitative, high-throughput genotyping // Nucleic Acids Res. 2001. V. 29 P. 1114-1124

76. Xu J.F., Yang Q.P., Chen J.Y., van Baalen M.R., Hsu I.C. Determining the site and nature of DNA mutations with the cloned MutY mismatch repair enzyme // Carcinogenesis 1996. V. 17 P. 321-326

77. Maulik G., Botchway S., Chakrabarti S., Tetradis S., Price В., Makrigiorgos G.M. Novel non-isotopic detection of MutY enzyme-recognized mismatches in DNA via ultrasensitive detection of aldehydes // Nucleic Acids Res. 1999. V. 27 P. 1316-1322

78. Chakrabarti S., Price B.D., Tetradis S., Fox E.A., Zhang Y., Maulik G., Makrigiorgos G.M. Highly selective isolation of unknown mutations in diverse DNA fragments: toward new multiplex screening in cancer // Cancer Res. 2000. V. 60 P. 3732-3737

79. Myers R.M., Larin Z., Maniatis T. Detection of single base substitutions by ribonucle-ase cleavage at mismatches in RNA.-DNA duplexes // Science 1985. V. 230 P. 12421246

80. Шабарова 3.A., Богданов A.A. Химия нуклеиновых кислот и их компонентов // Москва: издательство "Химия" 1978.

81. Youil R., Kemper B.W., Cotton R.G. Screening for mutations by enzyme mismatch cleavage with T4 endonuclease VII // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 1995. V. 92 P. 8791

82. Del T.B., Jr., Poff H.E., III, Novotny M.A., Cartledge D.M., Walker R.I., Earl C.D., Bailey A.L. Automated fluorescent analysis procedure for enzymatic mutation detection // Clin. Chem. 1998. V. 44 P. 731-739

83. Mashal R.D., Koontz J., Sklar J. Detection of mutations by cleavage of DNA hetero-duplexes with bacteriophage resolvases // Nat. Genet. 1995. V. 9 P. 177-183

84. Howard J.T., Ward J., Watson J.N., Roux K.H. Heteroduplex cleavage analysis using SI nuclease // Biotechniques 1999. V. 27 P. 18-19

85. Oleykowski C.A., Bronson Mullins C.R., Godwin A.K., Yeung A.T. Mutation detection using a novel plant endonuclease // Nucleic Acids Res. 1998. V. 26 P. 4597-4602

86. Sanger F., Nicklen S., Coulson A.R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 1977. V. 74 P. 5463-5467

87. Smith L.M., Sanders J.Z., Kaiser R.J., Hughes P., Dodd C., Connell C.R., Heiner C., Kent S.B., Hood L.E. Fluorescence detection in automated DNA sequence analysis // Nature 1986. V. 321 P. 674-679

88. Bowling J.M., Bruner K.L., Cmarik J.L., Tibbetts C. Neighboring nucleotide interactions during DNA sequencing gel electrophoresis // Nucleic Acids Res. 1991. V. 19 P. 3089-3097

89. Yamakawa H., Ohara О. A DNA cycle sequencing reaction that minimizes compressions on automated fluorescent sequencers // Nucleic Acids Res. 1997. V. 25 P. 1311-1312

90. Louis J.R., Robert J.L. Nondestructive laser vaporization of high molecular weight, single-stranded DNA // J. Am. Chem. Soc.; 1991. V. 113 P. 9665

91. Edwards J.R., Itagaki Y., Ju J. DNA sequencing using biotinylated dideoxynucleotides and mass spectrometry // Nucleic Acids Res. 2001. V. 29 P. El04

92. Hyman E.D. A new method of sequencing DNA // Anal. Biochem. 1988. V. 174 P. 423-436

93. Ronaghi M., Uhlen M., Nyren P. A sequencing method based on real-time pyrophosphate // Science 1998. V. 281 P. 363,365

94. Garcia C.A., Ahmadian A., Gharizadeh В., Lundeberg J., Ronaghi M., Nyren P. Mutation detection by pyrosequencing: sequencing of exons 5-8 of the p53 tumor suppressor gene // Gene 2000. V. 253 P. 249-257

95. Nordstrom Т., Ronaghi M., Forsberg L., de F.U., Morgenstern R., Nyren P. Direct analysis of single-nucleotide polymorphism on double-stranded DNA by pyrosequencing // Biotechnol. Appl. Biochem. 2000. V. 31 ( Pt 2) P. 107-112

96. ИЗ. Четверин А.Б., Четверина E.B. Научные и практические приложения молекулярных колоний // Молекулярная биология 2007. V. 41 Р. 284-296

97. Mitra R.D., Shendure J., Olejnik J., Edyta K.O., Church G.M. Fluorescent in situ sequencing on polymerase colonies //Anal. Biochem. 2003. V. 320 P. 55-65

98. Seo T.S., Bai X., Kim D.H., Meng Q., Shi S., Ruparel H., Li Z., Turro N.J., Ju J. Four-color DNA sequencing by synthesis on a chip using photocleavable fluorescent nucleotides // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 2005. V. 102 P. 5926-5931

99. Maxam A.M., Gilbert W. A new method for sequencing DNA // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S. A 1977. V.74P. 560-564

100. Ohara R., Tanaka A., Ohara O. Automated fluorescent DNA sequencing by a simplified solid-phase chemical sequencing method // Biotechniques 1997. V. 22 P. 653-656

101. Isola N.R, Allman S.L., Golovlov V.V., Chen C.H. Chemical cleavage sequencing of DNA using matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry // Anal. Chem. 1999. V. 71 P. 2266-2269

102. Eigen M., Rigler R. Sorting single molecules: application to diagnostics and evolutionary biotechnology// Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 1994. V. 91 P. 5740-5747

103. Nie S., Emory S.R. Probing Single Molecules and Single Nanoparticles by Surface-Enhanced Raman Scattering // Science 1997. V. 275 P. 1102-1106

104. Landegren U., Nilsson M., Kwok P.Y. Reading bits of genetic information: methods for single-nucleotide polymorphism analysis // Genome Res. 1998. V. 8 P. 769-776

105. Kwok P.Y. Methods for genotyping single nucleotide polymorphisms // Annu. Rev. Genomics Hum. Genet. 2001. V. 2 P. 235-258

106. Ed.G.D.Fasman Handbook of biochemistry and molecular biology: Nucleic Acids // Cleveland: CRC Press 1975. V. 1 P. 589

107. Berkner K.L., Folk W.R. Polynucleotide kinase exchange reaction: quantitave assay for restriction endonuclease-generated 5'-phosphoroyl termini in DNA // J. Biol. Chem. 1977. V. 252 P. 3176-3184

108. Горожанкин A.B., Иванова E.M., Кобец Н.Д. Синтез олигодезоксириботимиди-дата, содержащего алкилирующую группу и остаток биотина, для направленной модификации хроматина // Биоорган, химия 1993. V. 19 Р. 81

109. SantaLucia J., Jr. A unified view of polymer, dumbbell, and oligonucleotide DNA nearest-neighbor thermodynamics // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 1998. V. 95 P. 1460-1465

110. Allawi H.T., SantaLucia J., Jr. Thermodynamics and NMR of internal G.T mismatches in DNA // Biochemistry 1997. V. 36 P. 10581-10594

111. Allawi H.T., SantaLucia J., Jr. Nearest-neighbor thermodynamics of internal A.C mismatches in DNA: sequence dependence and pH effects // Biochemistry 1998. V. 37 P. 9435-9444

112. Allawi H.T., SantaLucia J., Jr. Nearest neighbor thermodynamic parameters for internal G.A mismatches in DNA // Biochemistry 1998. V. 37 P. 2170-2179

113. Peyret N., Seneviratne P.A., Allawi H.T., SantaLucia J., Jr. Nearest-neighbor thermodynamics and NMR of DNA sequences with internal A.A, C.C, G.G, and T.T mismatches // Biochemistry 1999. V. 38 P. 3468-3477

114. Allawi H.T., SantaLucia J., Jr. Thermodynamics of internal C.T mismatches in DNA // Nucleic Acids Res. 1998. V. 26 P. 2694-2701

115. Калачиков С.М., Адаричев В.А., Дымшиц Г.М. Иммобилизация ДНК на микропористых мембрана с помощью УФ-облучения // Биоорган, химия 1992. V. 18 Р. 52-62

116. Pyshnyi D.V., Lokhov S.G., Podyminogin М.А., Ivanova E.M., Zarytova V.F. A new strategy of discrimination of a point mutation by tandem of short oligonucleotides // Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids 2000. V. 19 P. 1931-1941

117. Saiki R.K., Walsh P.S., Levenson C.H., Erlich H.A. Genetic analysis of amplified DNA with immobilized sequence-specific oligonucleotide probes // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 1989. V. 86 P. 6230-6234

118. Pyshnyi D.V., Lokhov S.G., Podyminogin M.A., Ivanova E.M., Zarytova V.F. A new strategy of discrimination of a point mutation by tandem of short oligonucleotides // Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids 2000. V. 19 P. 1931-1941

119. Riordan J.R., Rommens J.M., Kerem В., Alon N., Rozmahel R., Grzelczak Z., Zielenski J., Lok S., Plavsic N., Chou J.L.,. Identification of the cystic fibrosis gene: cloning and characterization of complementary DNA // Science 1989. V. 245 P. 10661073

120. Kerem В., Rommens J.M., Buchanan J.A., Markiewicz D., Cox Т.К., Chakravarti A., Buchwald M., Tsui L.C. Identification of the cystic fibrosis gene: genetic analysis // Science 1989. V. 245 P. 1073-1080

121. Цитович A.B., Долинная Н.Г., Шабарова 3.A. Т4-ДНК-лигаза: субстратные свойства синтетических ДНК-дуплексов со структурными аномалиями // Молекуляр. биол. 1988. V. 22 Р. 690-699

122. Vessman J., Stefan R.I., Van Staden J.F., Danzer K., Lindner W., Burns D.T., Fajgelj A., Muller H. Selectivity in analytical chemistry // Pure and Applied Chemistry 2001. V. 73 P. 1381-1386

123. SantaLucia J., Jr., Hicks D. The thermodynamics of DNA structural motifs // Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 2004. V. 33 P. 415-440

124. Monia B.P., Johnston J.F., Ecker D.J., Zounes M.A., Lima W.F., Freier S.M. Selective inhibition of mutant Ha-ras mRNA expression by antisense oligonucleotides // J. Biol. Chem. 1992. V. 267 P. 19954-19962

125. Hearst J.E. A photochemical investigation of the dynamics of oligonucleotide hybridization//Annu. Rev. Phys. Chem. 1988. V. 39 P. 291-315

126. Shortreed M.R., Chang S.B., Hong D., Phillips M., Campion В., Tulpan D.C., An-dronescu M., Condon A., Hoos H.H., Smith L.M. A thermodynamic approach to designing structure-free combinatorial DNA word sets // Nucleic Acids Res. 2005. V. 33 P. 4965-4977

127. Jacobsen N., Bentzen J., Meldgaard M., Jakobsen M.H., Fenger M., Kauppinen S., Skouv J. LNA-enhanced detection of single nucleotide polymoiphisms in the apolipo-protein E // Nucleic Acids Res. 2002. V. 30 P. elOO

128. Jacobsen N., Fenger M., Bentzen J., Rasmussen S.L., Jakobsen M.H., Fenstholt J., Skouv J. Genotyping of the apolipoprotein В R3500Q mutation using immobilized locked nucleic acid capture probes // Clin. Chem. 2002. V. 48 P. 657-660

129. Seela F., Peng X., Li H. Base-pairing, tautomerism, and mismatch discrimination of 7-halogenated 7-deaza-2'-deoxyisoguanosine: oligonucleotide duplexes with parallel and antiparallel chain orientation//J. Am. Chem. Soc. 2005. V. 127 P. 7739-7751

130. You Y., Moreira B.G., Behlke M.A., Owczarzy R. Design of LNA probes that improve mismatch discrimination // Nucleic Acids Res. 2006. V. 34 P. e60

131. Livshits M.A., Mirzabekov A.D. Calculation of kinetics of hybridization of DNA with oligonucleotides fixed in a gel layer. // Mol. Biol. (Mosk) 1996. V. 30 P. 11581164

132. Shuman S. Vaccinia virus DNA ligase: specificity, fidelity, and inhibition // Biochemistry 1995. V. 34 P. 16138-16147

133. Aoi Y., Yoshinobu Т., Tanizawa K., Kinoshita K., Iwasaki H. Ligation errors in DNA computing // Biosystems 1999. V. 52 P. 181-187

134. Bhagwat A.S., Sanderson R.J., Lindahl T. Delayed DNA joining at 3' mismatches by human DNA ligases // Nucleic Acids Res. 1999. V. 27 P. 4028-4033

135. Tong J., Barany F., Cao W. Ligation reaction specificities of an NAD(+)-dependent DNA ligase from the hyperthermophile Aquifex aeolicus // Nucleic Acids Res. 2000. V. 28 P. 1447-1454

136. Gupta N.K., Ohtsuka E., Weber H., Chang S.H., Khorana H.G. Studies on polynucleotides. LXXXVII. The joining of short deoxyribopolynucleotides by DNA-joining enzymes // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 1968. V. 60 P. 285-292

137. Olivera B.M., Lehman I.R. Enzymic joining of polynucleotides. 3. The polydeoxyade-nylate-polydeoxythymidylate homopolymer pair // J. Mol. Biol. 1968. V. 36 P. 261274

138. Koroleva O.N., Drutsa V.L. Controlled ligation of oligodeoxyribonucleotides of DNA-ligase of the T4 phage. //Mol. Biol. (Mosk) 1988. V. 22 P. 1632-1641

139. Shilov I.A., Koroleva O.N., Drutsa V.L. Features of connecting short oligonucleotides with phage T4 DNA ligase. // Mol. Biol. (Mosk) 1993. V. 27 P. 647-654

140. Cai L., Ни C., Shen S., Wang W., Huang W. Characterization of bacteriophage T3 DNA ligase // J. Biochem. (Tokyo) 2004. V. 135 P. 397-403

141. Odell M., Shuman S. Footprinting of Chlorella virus DNA ligase bound at a nick in duplex DNA // J. Biol. Chem. 1999. V. 274 P. 14032-14039

142. Doherty A.J., Dafforn T.R. Nick recognition by DNA ligases // J. Mol. Biol. 2000. V. 296 P. 43-56

143. Ng P.S., Bergstrom D.E. Protein-DNA footprinting by endcapped duplex oligodeoxyribonucleotides //Nucleic Acids Res. 2004. V. 32 P. el07

144. Koo H.S., Crothers D.M. Calibration of DNA curvature and a unified description of sequence-directed bending // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 1988. V. 85 P. 1763-1767

145. Wu D.Y., Wallace R.B. Specificity of the nick-closing activity of bacteriophage T4 DNA ligase // Gene 1989. V. 76 P. 245-254

146. Lehman I JR. DNA ligase: structure, mechanism, and function // Science 1974. V. 186 P. 790-797

147. Nilsson S.V., Magnusson G. Sealing of gaps in duplex DNA by T4 DNA ligase // Nucleic Acids Res. 1982. V. 10 P. 1425-1437

148. Rossi R., Montecucco A., Ciarrocchi G., Biamonti G. Functional characterization of the T4 DNA ligase: a new insight into the mechanism of action // Nucleic Acids Res. 1997. V. 25 P. 2106-2113

149. Raae A. J., Kleppe R.K., Kleppe K. Kinetics and effect of salts and polyamines on T4 polynucleotide ligase // Eur. J. Biochem. 1975. V. 60 P. 437-443

150. Варфоломеев С.Д., Гуревич К.Г. Биокинетика. Практический курс // М. : Фаир-Пресс 1999.

151. Cherepanov A.V., de V.S. Kinetics and thermodynamics of nick sealing by T4 DNA ligase // Eur. J. Biochem. 2003. V. 270 P. 4315-4325

152. Pyshnyi D.V., Goldberg E.L., Ivanova E.M. Efficiency of coaxial stacking depends on the DNA duplex structure // J. Biomol. Struct. Dyn. 2003. V. 21 P. 459-468

153. Pyshnyi D.V., Ivanova E.M. The influence of nearest neighbours on the efficiency of coaxial stacking at contiguous stacking hybridization of oligodeoxyribonucleotides // Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids 2004. V. 23 P. 1057-1064

154. Nelder J.A., Mead R. A simplex method for function minimization // Computer Journal 1965. V. 7 P. 308-313

Информация о работе

Кабилов, Марсель Расимович
кандидата биологических наук
Новосибирск, 2007
ВАК 03.00.04

Диссертация

Выявление точечных мутаций в ДНК методом лигирования олигонуклеотидов: селективность этапов гибридизации и лигирования - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы