Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение взаимодействия РНК-полимеразы с нуклеиновыми кислотами на разных стадиях транскрипционного цикла

ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Изучение взаимодействия РНК-полимеразы с нуклеиновыми кислотами на разных стадиях транскрипционного цикла"

004&ие

На правах рукописи

ЧЛЕНОВ Марк Михайлович

Изучение взаимодействия РНК-полимеразы с нуклеиновыми кислотами на разных стадиях транскрипционного цикла

(03.01.03 - молекулярная биология)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук.

- 2 2т

Москва-2010

004615690

Работа выполнена в Лаборатории молекулярной генетики микроорганизмов Отдела молекулярной генетики клетки Учреждения Российской академии наук Института молекулярной генетики РАН, а также в лабораториях Института Ваксмана (Пискатавей, США), Научно-исследовательского Института здравоохранения (Нью Йорк, США) и Рокфеллеровском университете (Нью-Йорк, США)

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

доктор биологических наук Северинов Константин Викторович

доктор биологических наук Миронов Александр Сергеевич

доктор химических наук Сергиев Петр Владимирович

Учреждение Российской академии наук Институт Молекулярной Биологии им. В.А.Энгельгардта РАН

Защита диссертации состоится 16 декабря 2010 года в И часов 00 мин. на заседании Диссертационного совета Д002.037.01 при Учреждении Российской академии наук Институте биологии гена РАН по адресу: 119334, Москва, ул. Вавилова, д. 34/5

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждении Российской академии наук Институте молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН по адресу: 119991, г. Москва, ул. Вавилова, д. 32.

Автореферат разослан «12» ноября 2010 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, л

канд. фарм. наук ^//Э Л'С'Грабовская

Общая характеристика работы

Актуальность темы. В прокариотической клетке транскрипция генов осуществляется большим мультисубьединичным ферментом ДНК-зависимой РНК полимеразой (РНКП), имеющим массу около полумиллиона дальтон. Выделяют две основные формы этого фермента: каталитически активный кор-фермент, образованный четырьмя субъединицами (ассР|3') и осуществляющий синтез РНК-продукта, и полноразмерный холофермент, состоящий из кор-фермента и ассоциированного с ним ст-фактора, необходимого для узнавания промоторной последовательности транскрибируемого гена. Процесс клеточной транскрипции условно можно разделить на несколько основных этапов: (1) узнавание промоторной последовательности ДНК холоферментом РНКП и образование инициаторного комплекса с ним, (¡1) диссоциация сигма фактора и продуктивный синтез м-РНК кор-ферментом РНКП и (ш) терминация, сопровождающаяся высвобождением синтезированного РНК-продукта и диссоциацией транскрипционного комплекса.

На каждом их этих этапов РНКП образует многочисленные контакты как с одно-, так и с двуцепочечными последовательностями нуклеиновых кислот. Хотя в последние годы, благодаря успешной кристаллизации как самого кор-фермента РНКП, так и его комплексов с ДНК фрагментами, удалось достичь определенных успехов в понимании устройства элонгационного комплекса, структура и механизм образования инициаторных комплексов по прежнему остаются малоизученными. Альтернативным подходом к получению информации о строении ДНК-белковых комплексов является метод ковалентных химических сшивок и картирование районов взаимодействий, а так же точечный мутагенез. Большинство современных моделей, описывающих вероятное устройство элонгационного комплекса, используют в качестве своей основы структуры термофильных ферментов, в то время как наиболее изученным с биохимической точки зрения, является фермент из Е.соИ. Роль определенных доменов РНКП Е.соП. во взаимодействии с одно- и двунитевыми фрагментами нуклеиновых кислот, и отсутствующих в термофильных РНКП, была неоднократно описана в литературе. Получение структурной информации об этих участках позволило бы получить более полную картину устройства элонгационного комплекса.

Цель работы и задачи исследования. Целью данной работы являлось изучение взаимодействий РНКП с нуклеиновыми кислотами на стадиях промоторного и элонгационных комплексов. Для этого ставились следующие задачи:

1) Откартировать участки холофермента РНКП, вовлеченные во взаимодействие с промоторным фрагментом на стадии открытого комплекса.

2) Охарактеризовать свойства РНКП Е.соИ с летальной мутацией в р-субъединице, оказывающей значительное воздействие на формирование промоторного комплекса.

3) Получить структуру большого неконсервативного домена р'-субъединицы РНКП Е.соИ, вовлеченного во взаимодействие с передним дуплексом ДНК в элонгационном комплексе.

Научная новизна и практическая ценность работы: С помощью серии олигонуклеотидов, имитирующих последовательность матричной и нематричной цепей /ас-промотора с введенными в них сшивающими группами, впервые удалось достаточно точно откартировать участки холофермента РНКП, вовлеченные в формирование промоторного комплекса. Нами было показано, что холофермент способен специфично узнавать и связываться только с последовательностью нематричной цепи промотора, в то время как взаимодействие с матричной цепью имеет неспецифичный характер и неустойчиво к высокой концентрации соли. Взаимодействие кор-фермента как с матричной, так и нематричной цепями промотора так же неустойчиво к высокой концентрации соли и не сиквенс-специфично. Результаты картирования ДНК-белковых комплексов указывают на то, что основной процент химических сшивок в промоторном комплексе происходит между вторым и третьим консервативными районами о-фактора и нематричной цепью промотора на всем ее протяжении от -14 до -3 позиции относительно точки начала транскрипции. Минорные сшивки двумя крупнейшими субъединицами кора и нематричной цепью промотора были также откартированы в данной работе.

Детальное изучение ¡п-уИго свойств РНКП с летальной мутацией АкУ в Р-субъединице позволило выявить новый промоторный комплекс, сочетающий в себе нестабильность «закрытого комплекса» с расплетенностью цепей промотора, характерной для «открытого комплекса». Являясь чувствительным к конкурент ДНК - гепарину и даже низкой концентрации соли, промоторный комплекс, образуемый мутантной РНКП обладает способностью расплавлять цепи промотора даже при нулевой температуре, когда комплекс дикого типа полносты закрыт. Таким образом, мутация в этом районе РНКП разобщает дв взаимосвязанных свойства промоторных комплексов дикого типа - устойчивое! к гепарину и чувствительность к низкой температуре. Мы полагаем, что эт мутация позволяет «запереть» процесс узнавания промотора в одном \ промежуточных промоторных комплексов, формируемым РНКП в процесс перехода от закрытого комплекса к открытому. На основании этих результате нами была предложена модель взаимодействия этого участка Р-субъединицы ДНК в промоторном комплексе.

Впервые удалось закристаллизовать и определить трехмерную структур фрагмента Р'-субъединицы РНК-полймеразы Е.соИ с большим разрешением (2

А). Было установлено, что 188-членный неконсервативный домен (НКД) (3'-субъединицы состоит из бета-складок и включает в себя два отдельных субдомена (А и В), соединенных линкером. Каждый из этих субдоменов представляет описанный ранее мотив, обозначаемый как гибридный сэндвич-барел (ГСБ) и состоящий из серии антипаралельных бета-слоев. Анализ распределения поверхностного заряда НКД Р'-субъединицы выявил существенную ассиметрию зарядов на поверхности этого фрагмента. Наложение полученной структуры на модель элонгационного комплекса Тещ позволило объяснить ранее описанные в литературе экспериментальные данные, касающиеся роли данного участка РНК-полимеразы в процессе клеточной транскрипции. Построенная нами обновленная модель элонгационного комплекса РНК-полимеразы Е.соН, содержащая в себе структуру НКД Р'-субъединицы, дает возможность объяснить роль данного участка в стабилизации транскрипционного комплекса, его паузировании и в процессе терминации, а также каталитической активности фермента.

Структура и объем работы. Данная диссертация изложена на 106 страницах текста, включающего в себя литературный обзор, методологическую секцию, результаты и обсуждение, выводы и список цитируемой литературы, содержащий 101 англоязычных и 3 русскоязычных публикаций. Работа содержит 17 рисунков и 2 таблицы.

Список сокращений:

РНКП - ДНК-зависимая РНК- полимераза

УФ - Ультрафиолет

ПААГ - Полиакриламидный гель

ОТСВА - 2-нитро 5-тио-циапобензойная кислота

НКД - Неконсервативный домен

ГСБ - Гибридный сэндвич бэррел

Содержание работы

Глава 1. Изучение ДНК-белковых взаимодействий в промоторном комплексе с помощью олигонуклеотидов с фотохимическими сшивающими группами.

Для узнавания промоторного фрагмента ДНК и формирования с ним промоторного комплекса, РНКП должна находиться в форме холофермента, состоящего из каталитически активного кора и а-субединицы. Последняя играет в этом процессе ключевую роль, на что указывают следующие наблюдения: (1) наличие мутаций в а-субединице, приводящих к потере способности РНКП связываться с промотором и плавить двуцепочечную ДНК, (2) химические сшивки из промоторных фрагментов, приходящиеся преимущественно нао-субъединицу и (3) неспособность кор-фермента специфически связываться с промоторным участком. При этом, не ассоциированная с кором о-субъединица, сама по себе не способна взаимодействовать с промотором, ввиду автоингибиторного свойства ее консервативного домена 1 (Dombroski et al., 1993). Связывание с кор-ферментом приводит к разблокировке а-субединицы, высвобождая ее ДНК-связывающие участки для узнавания промоторных последовательностей. Несмотря на основную роль, которую о-субъединица играет в узнавании и связывании промоторного фрагмента, большие субъединицы кора также участвуют в этом процессе. На это указывает серия мутаций в р и Р'- субъединицах (в том числе и исследованных в данной работе) приводящих к дестабилизации промоторного комплекса (Martin et al., 1992, Bartlett et al., 1998).

Для изучения взаимодействия РНКП с расплетенными цепями промотора в открытом комплексе, мы использовали одноцепочечные олигонуклеотиды, имитирующие матричную и нематричную цепи LacUl'5 промотора, в последовательности которых были введены фото-активируемые сшивающие реагенты. Для картирования полученных ДНК-белковых сшивок, мы использовали метод ограниченного химического расщепления белковой молекулы, разработанный в лаборатории Грачева и позволяющий устанавливать места контактов с высокой точностью (Grachev al., 1989). Шесть азидо-фенацильных групп были синтезированы и введены в положения -14, -13, -12, -9, -5, -3 олигонуклеотида, содержащего последовательность нематричной цепи, и три - 12, -9, -3 - в матричной. Кроме этого, мы синтезировали гибридный олигонуклетид нематричной цепи с фотохимической группой в позиции -12, в котором адениновые остатки его консервативного участка были заменены на остатки гуанина.

Общее распределение фотохимических сшивок из матричного и нематричного олигонуклеотидов в субъединицы РНКП

Картирование ДНК-белковых контактов между радиомеченными олигонуклеотидами, содержащими фотохимические группы, и РНКП проводили согласно процедуре, описанной ранее (]Мис11ег е1: а1., 1997, Мг^еу е! а1., 1998). После облучения УФ, сшитые ДНК-белковые комплексы разделяли на денатурирующем ПААГ и визуализировали на приборе Р1108р1юг1п^ег.

Рис 1. ДНК-белковые взаимодействия РНКП с матричными и нематричпыми олигонуклеотидами. Рентгенограммы денатурирующих 11ААГ гелей, содержащие ДНК-белковые сшивки между субъединицами (А) холофермента и (В) кор-фермента и матричными, нематричными и гибридными олигонуклеотидами LacVV5 промотора в присутствии 100 и 500 мМ NaCl. Консервативный промоторный ТАТА-мотив в районе -10 положения относительно начала транскрипции выделен прямоугольником на фоне последовательности нематричного нуклсотида. Звездочками обозначены положения фотохимических групп.

Как видно из Рис 1, холофермент и кор-фермент PHKII взаимодействуют и образуют фотохимические сшивки с одиоцепочечными олигонуклеотидами LacUVS промотора на всем протяжении от -14 до -3 положения относительно начала 1ранскрипции, образуя как мажорные, так и минорные ДНК-сшивки со своими субъединицами, и особенно с ст-субъединицей. Контакты, образуемые кор-ферментом с обеими цепями промотора в присутствии 100 мМ NaCl, не отличаются друг от друга в зависимости от положения фотохимической метки в

пришиваемом олигонуклеотиде (Панель В, верхняя рентгенограмма). При повышении концентрации соли в реакционном буфере до 500 мМ, кор-фермент теряет способность взаимодействовать с однонитевыми промоторными олигонуклеотидами (Панель В, нижняя рентгенограмма). Взаимодействие холофермента РНКП с теми же олигонуклеотидами, в отличие от кора, напротив, имеет ярковыраженный сиквенс-специфичный характер (Рис 1, панель А). В реакциях, проведенных в буфере с 100 мМ ЫаС1, четко прослеживается разница в интенсивности и распределении фотохимических сшивок в субъединицы холофермента РНКП, в зависимости от позиции сшивающего реагента на изучаемом олигонуклеотиде (Панель А, нижняя рентгенограмма, дорожки 5-10). При проведении тех же реакций между холоферментом и олигонуклеотидами в условиях 500 мМ №С1, картина пришивок претерпевала существенные изменения (Панель А, нижняя рентгенограмма). Контакты холофермента РНКП с матричным олигонуклеотидом 1ас11¥5 промотора полностью пропадают в условиях данного эксперимента, независимо от позиции фотохимической группы (Рис 1, нижняя рентгенограмма, дорожки 1, 2 и 3). Взаимодействия холофермента с нематричными олигонуклеотидами не только оставались устойчивыми к высокой концентрации соли, но и сохраняли в целом картину распределения сшивок в субъединице РНКП, наблюдаемую в буфере, содержащем 100 мМ МаС1 (нижняя рентгенограмма, дорожки 5-10). При этом, сшивки из позиций -14, -13 и -12, приходятся преимущественно в о-субъединицу, а из позиций -5 и -3 также и в две большие субъединицы кор-фермента. Сшивка из нематричного олигонуклеотида с фотохимической группой размещенной в -12 положении (внутри ТАТА-мотива, являющегося основной детерминантой узнавания промоторной последовательности), не обладает устойчивостью к высокой концентрации соли, что, вероятно, вызвано нарушением узнавания связывающей детерминанты промотора, из-за введения в ее состав азидофенацильной группы. Гибридный нематричный олигонуклеотид с измененной последовательностью своего ГАТА-мотива также теряет способность взаимодействовать с холоферментом в 500 мМ №С1 (нижняя рентгенограмма, дорожка 4).

Инкубирование олигонуклеотидов обеих цепей промотора со свободной а-субъединицей не приводило к появлению фотохимических сшивок, как в низкой, так и в высокой концентрации соли (данные не приводятся), что хорошо согласуется с ранее описанными в литературе экспериментами (ВотЬговМ сЧ а1., 1993)

В качестве дополнительного эксперимента, мы также изучили взаимодействия кор-фермента Гад РНКП, ассоциированного с о70 Е.соН, с олигонуклеотидами 1ас111'5 промотора, содержащими фотоактивные группы в тех же положениях, что и в экспериментах с ферментом из Е.соН. Полученные нами данные совпадают с распределением фотохимических сшивок в субъедицы холофермента из Е.соН (результаты не приводятся), что позволяет преположить универсальность природы данного взаимодействия.

Следующим шагом в изучении взаимодействий субъединиц полимеразы с нематричной цепью промотора было картирование ДНК-белковых контактов с помощью ограниченного химического расщепления белковых молекул.

Картирование контактов субъединиц РНКП с олигонуклеотидамп нематричной цепи Ьас11У5 промотора.

Для картирования фотохимических сшивок, субъединицы РНКП провзаимодействовавшие с радиоактивно-меченными олигонукяеотидами вырезали из первичного денатурирующего полиакриламидного геля (ПААГ), лиофилизировали и обрабатывали С МБ г. расщепляющего полипептидную цепь по метиониновым, и ЫТСВА - по цистеиновым остаткам. Продукты расщепления разделяли на градиентном денатурирующем ПААГ высокого разрешения. При подборе условий, когда на одну молекулу белка приходится один или менее актов расщепления, в полученном наборе пептидов, размер наименьшего фрагмента соответствует ближайшему от N или С-конца аминокислотному остатку, около которого произошла фотохимическая сшивка.

Пришивки в а-субъединицу

Результаты картирования 5 мажорных полос, соответствующих пришивкам ст-субъединицы и нематричного олигонуклеотида из позиций -14, -13, -12, -5 и -3 относительно транскрипционного старта, позволили определить 2 участка этой субъединицы, участвующих во взаимодействии с одионитевой промоторной ДНК. Сшивки из положений -14, -13 и -12 были откартированы нами с помощью СМВг, в район между метионинами 413 и 456. Как видно из рентгенограммы продуктов расщепления этой ДНК-белковой сшивки на Панеле В, последняя радиомеченная полоска па дорожке 2 и 3 соответствует остатку метионина 413. Следующий по счету метиониновый остаток первичной последовательности ст-субъединицы - это метионин 456, которого не видно на данном геле. Из результатов этого расщепления мы заключили, что сшивка из -13, а также -14 и -12 (результаты не приводятся) приходится в 43-аминокислотный район между вышеупомянутыми метиониновьгми остатками.

Картирование мажорных полос сшивок в о-субъединицу из положений фотоактивных групп, помещенных в -5 и -3 положение относительно начала транскрипции, позволило нам определить расположение ДНК-белковых контактов в район, располагающийся между метиониновыми остатками 379 и 413 (Рис.2 Панель В).

Кроме мажорной сшивки в а-субъединицу из положения -13, на рентгенограмме ПААГ можно видеть дополнительные минорные полосы, соответствующие сшивкам в ту же субъединицу, но обладающие меньшей силой

сигнала (Рис. 2, Панель Г). Из-за присутствия в первичной структуре а-субъединицы двух находящихся вплотную друг к другу остатков триптофана, придающих абнормальную мобильность продуктам расщепления, нам не удалось провести точную идентификацию фрагментов расщепления минорной сшивки. Однако, наличие коротких продуктов, содержащих радиоактивную метку, указывает на то, что минорная сшивка приходится на N или С-концевой район а-субъединицы. Так как четвертый консервативный район, прилегающий к С-концу этой субъединицы участвует в узнавании и связывании с -35 консервативным элементом промотора (Gross et al., 1992), мы полагаем, что минорная сшивка из -13 положения относительно точки начала транскрипции приходится на N-концевой район а-субъединицы.

Рис.2 Картирование контактов с-cyfvi,единицы с нематричной цепью LacUV5 промотора. Первичная структура 613 -аминокислотной ст-субъединицы

изображена в виде черного прямоугольника с консервативными районами, выделенными белым цветом. Ожартированный участок фотохимической сшивки отмечен : вертикальной стрелкой (панель А). Теоретический набор продуктов расщепления ст-субъединицы со сшивкой из -13 а положения по остаткам метионина показан | на панеле Б. Рентгенограмма

денатурирующего ПААГ с продуктами расщепления мажорных ДНК-белковых сшивок из позиций -13 и -14 с помощью CNBr приведена на панеле В. Картирование минорной сшивки ст-субедишщы из позиции -13 немапричного нуклеотида LacUV5 изображена на панеле Г. В качестве маркера молекулярной массы использовался набор определенных фрагментов расщепления мажорной сшивки ст-субединицы из -13 положения относительно начала точки начала транскрипции.

Пришивки в Р-субъединицу

Солеустойчивые сшивки между (3-субъединицей РНКП и

фотохимическими группами, введенными в -5 и -3 положение нематричпой цепи Ьас1ГУ5 промотора, были картированы внутри только одного района (3-субединицы.

Как видно из результатов на Рис.3, Панель Г, ДНК-белковая фотохимическая сшивка из -3 (а также из -5 положения; результаты не приводятся) приходится на самый Ы-конец Р-субъединицы. Первый метиониновый остаток этой субъединицы имеет порядковый номер 124. Размер самой легкой полосы на ПААГ (Панель Г, правая рентгенограмма, дорожка 3)

соответствует пептиду Ы-Мет124. Из этого следует, что контакт с ДНК из -3 положения происходит в пределах этого района.

Расщепление ДНК-белковых сшивок из -3 и -5 положения по остаткам цистеина при помощи ЫТСВА также выявило картину полос, характерную для № конца р-субединицы (Рис.3, Панель Г, левая рентгенограмма). Первый цистеиновый остаток этой субъединицы находится в ее первичной структуре на расстоянии 87 аминокислотных остатка от И-конца. Размер самой легкой из полос, полученных в результате расщепления ДНК-белковой сшивки по остаткам цистеина, соответствует пептиду М-Цис87. Таким образом, при помощи ЫТСВА, удалось более точно очертить границы района Р-субединицы, контактирующего с -3 и -5 положением нематричной цепи ЬасЦУ5 промотора.

Для подтверждения наблюдаемых результатов, мы провели исчерпывающую реакцию расщепления полученной сшивки с помощью СЫВг в течение 12 часов. Как видно из результатов на Рис. 3, Панель Д, практически весь радиоактивный сигнал накапливается в полосе, соответствующей пептиду Ы-Мет124 (Панель Д, дорожка 2), что подтверждает вышеописанные результаты о расположении фотохимической сшивки из -3 и -5 положений нематричной цепи в этот участок Р-субединицы РНКП Е.соН.

♦, i.

Рис.З Картирование контактов ß-»от субъедшшцы с нематричной цепью LacUV5 промотора. Первичная структура 1342-аминокислотной ß-субъединицы изображена в виде черного

прямоугольника. Консервативные

районы выделены белым цветом и обозначены латинскими буквами. Определенные в этой работе места ДНК-белковых сшивок в ß-субъединице показаны черными вертикальными »4*- • стрелками. Теоретический набор IIIS» продуктов расщепления ß-субъедишщы с сшивкой из -3 положения по остаткам

____________ ___метионина показан на панеле Б. а по

остаткам цистеина - на панеле В. Рентгенограмма денатурирующего ПААГ с продуктами расщепления ДНК-белковых сшивок из позиции -3 с помощью CNBr и NTCBA приведена на панеле Г. В качестве маркера молекулярной массы использовали описанный ранее набор продуктов расщепления ДНК-белковой сшивки ß-субъединицы, приходящейся в район 1273. Продукты полного расщепления ДНК-белковой сшивки из -3 положения с помощью CNBr показаны на Панеле Д (дорожка 2). В качестве маркеров использовали набор ограниченного расщепления по метионинам ДНК-белковой сшивки, находящейся на N-конце (Панель Д, дорожка 1) и С-конце (Панель Д, дорожка 3) ß-субъединицы.

Анализ распределения фотохимических пришивок в субьединицы холофермента РНКП.

Полученные нами результаты аналитических сшивок между матричной и нематричными цепями промотора и РНКГ1 E.coli указывают на то, что контакты кор-фермента с обеими цепями промотора, а также холофермента с матричной цепью, имеют неспецифический характер. Природа взаимодействий холофермента РНКП с нематричной цепью не только обладает устойчивостью к высокой соли, что указывает на специфичность данных контактов, но и обладает ярковыраженным регистром. Свободная ст-субъединица, не связанная с кор-ферментом, не способна связываться с промоторными цепями.

В проделанной работе мы откартировали несколько участков контактов субъединиц РНКП с нематричной цепью LacUVS промотора, ст-субъединица образует специфические контакты с нематричной цепью промотора на всем протяжении от -14 до -3 положения относительно начала транскрипции. Участки ст-субъединицы, вовлеченные в эти взаимодействия, были определены нами как Мег379-Мет413 и Мет413-456. Оба этих фрагмента первичной структуры о-субъединицы являются частью двух а-спиралей. вероятно взаимодействующих с -10 ТАТА-мотивом (Malhotra et al, 1996). Мутации в этих районах имеют негативный эффект на процесс узнавания промотора холоферментом РНКП (Siegele et al., 1989). Таким образом, полученные результаты хорошо согласуются с ранее описанными в литературе биохимическими и структурными данными.

Кроме сшивок из нематричной цепи промотора в ст-субъединицу, представляющих их себя основные продукты фотохимической реакции облучения промоторных комплексов, мы также определили участки взаимодействия ß-субъединицы кор-фермента с промоторной ДНК. Хотя интенсивность этого сигнала составляла менее 10% от уровня наблюдаемого для ст-субъединицы, его солеустойчивость и воспроизводимость у РНКП из различных видов позволила нам судить об его специфичности. Район ß-субъединицы, контактирующий с -5 и -3 положением нематричной цепи был определен нами, как N-конец - цистеин 87. Моделирование расположения нематричной цепи промоторного фрагмента относительно кор-фермента РНКП проведенное позже в лаборатории Ибрайта (Naryshkin et al., 2000) находится в полном соответствии с полученными нами данными по контактам с ß и ст-субъедшшцами.

Глава 2. Мутации С-консервативного района ß-субъединицы E.coli и их эффект на взаимодействие РНКП с промоторной ДНК

Консервативный район С является одним из девяти участков первичной структуры ß-субъединицы, чьи аминокислотные последовательности проявляют высокую степень гомологии с аналогичными последовательностями РНКП других представителей живого мира, включая высших эукариот. На своем N-конце этот участок граничит с большим неконсервативным районом, присутствующим также и у других представителей прогеобактерий, но обладающим низкой гомологией или отсутствующим у эубактерий, археобактерий и эукариот, а на своем С-конце - с районом, содержащим мутации устойчивости к рифампицину. В том же С-концевом районе, находящемся на пространственной модели РНКП в непосредственной близости к активному центру фермента, были картированы места фотохимических сшивок из 5'-конца инициаторного нуклеотида.

Одной из задач проделанной работы являлось детальное исследование мутаций С-консервативного района ß-субъединицы и их эффекта на образование промоторного комплекса. Основным предметом изучения являлась рецессивная мутация ARV. представляющая из себя делецию десяти консервативных аминокислотных остатков С-района (Martin et al., 1992). Данная мутация обладает летальным фенотипом и образует in vitro крайне нестабильный комплекс с промотором, обладающим чувствительностью к полианиону гепарину. Однако, элонгациоиный комплекс PHKII с мутацией ARV практически не отличается по своей процессивности и стабильности от комплекса образованного РНКП дикого типа, подчеркивая таким образом непосредственную роль данного участка в процессе стабилизации промоторного комплекса. Для дальнейшего прояснения свойств этого участка С-консервативного района ß-субъединицы, нами была сконструирована мутация QH6, в которой удаленные консервативные аминокислотные остатки ARV были заменены вставкой из восьми произвольных аминокислот. Фенотип полученного мутанта не отличается от РНКП дикого типа, что указывает на то, что длина удаленного участка С-консервативного района ß-субъединицы играет более важную роль в стабилизации промоторного комплекса, чем его аминокислотный состав.

Для более подробного изучения роли С-консервативного района в формировании и стабилизации промоторного комплекса, в проделанной работе мы исследовали две другие мутации ß-субъединицы РНКП E.coli: Д(186-433) и 4348 (R454H), влияющие на образование промоторного комплекса, а также свойства РНКП из Bacillus Subtilis.

Определение границ промоторного комплекса РНКП с мутацией ARV

В проделанном нами эксперименте промоторный комплекс, образованный РНКП с мутацией ARV, сравнивался с комплексами, образованными ферментами дикого типа и мутантными РНКП А(186-433) и QH6.

Рис 4. Эндонуклеазный (А) и перманганатный (Б) футприит промоторных комплексов, PHKII с мутациями С-консервативного района и его окрестностей. Рентгенограмма

продуктов реакций перманганатного и эндонуклеазного футпринтов между J 06-нуклеотидным Г7А2 промоторным фрагментом и мутантными РНКГ1, разделенных на 6% денатурирующем ПААГ. Первая дорожка на обеих панелях, содержит продукты реакции расщепления Т7А2 промотора по гуанодиновым и аненозиновым остаткам. 2,3,4 и 5 дорожки на обеих панелях - РНКП с мутациями: ARV, ОН6, А(186-433) и дикого типа, соответственно. Шестая дорожка содержит продукты футпринтинга Т7А2 промоторного фрагмента в отсутствии РНКП.

В промоторном комплексе дикого типа, РНКП почти полностью экранирует область от положения -40 относительно точки начала транскрипции до приблизительно +20 положения от расщепления эндонуклеазой DNAseL Этот практически сплошной 60-нуклеотидный «след» прерывается только в так называемом гиперчувствительным положении промотора, в районе -25-30, где, как полагают, происходит его резкий изгиб. Расплавленный участок ДНК, образуемый ферментом дикого типа на Т7 А2 промоторе при 37 иС. включает в себя область от тимина -15 до тимина -3, относительно начала транскрипции.

Мутация Д( 186-433), удаляющая из РНКП почти весь неконсервативный район 1 р~субъединицы. приводит к появлению укороченного футпринта. в котором защита ферментом двуцепочечной ДНК не распространяется на ее передний дуплекс (Sevennov et al, 1997). Расплавленная область промотора, образуемая этим мутантом, также имеет укороченные размеры своего переднего участка и не включает в себя остатки тимина в положении -7, -5, -4 и -3. Как видно из Рис. 4 (Панель А, дорожка 2).

Промоторный комплекс, образованный РНКП с мутацией ARV, обладает схожим с РНКП Д( 186-433), укороченным футпринтом. Однако результаты данного эксперимента указывают и на то, что, несмотря на схожесть. РНКП ARV не способна обеспечить полное экранирование промоторного фрагмента, что, вероятно, вызвано высоким уровнем ее диссоциации из комплекса с ДНК.

ï а » 4 s в

1 г s 4 а в

Использование 10-кратного избытка РНКП с мутацией ARV, по сравнению с другими РНКП, не помогло компенсировать ее очевидный дефект связывания промоторного фрагмента. В реакции перманганатного футпринтинга на Рис. 4, панель В, дорожка 2, мы показали, что РНКП с мутацией ARV образует укороченный расплавленный участок 17А2 промотора, идентичный с РНКП Д( 186-433).

Производная мутации ARV - Г2Н6, содержащая вставку из восьми произвольных аминокислот вместо удаленных ARV - 10, формирует неотличимый от РНКП дикого типа эндонуклеазный футпринт и «транскрипционный пузырь» на Т7А2 промоторе. Эти данные хорошо коррелируют с полученными ранее результатами по исследованию фенотипа данной мутации, указывающими на его схожесть с РНКП дикого типа.

Изучение чувствительности промоторного комплекса РНКП ARV к низкой температуре

Изучение границ промоторного комплекса, образуемого РНКП с мутацией ДRV показало, что он обладает укороченным футпринтом и «транскрипционным пузырем» своей передней части, непосредственно прилегающим к точке начала транскрипции. Схожим укороченным футпринтом обладает и РНКП А( 186-433), известная тем, что она способна расплавлять промоторную ДНК при 0 °С и даже отрицательной температуре (Зеуеппоу е1 а1., 1997), при которой комплекс образованный РНКП дикого типа находится в закрытом состоянии. Учитывая схожесть футпринтов РНКП Д(186-433) и ЛRV, большой интерес для нас представляло определение состояния промоторного комплекса последнего при низкой температуре.

Как видно из Рис. 5, «транскрипционный пузырь», образуемый РНКП, имеет укороченные размеры при 37 °С (Рис. 5 дорожка 2) и, при этом, способен плавить промоторную ДНК при нулевой температуре (Рис. 5, дорожка 5), при которой комплекс образованный РНКП дикого типа остается закрытым (Рис. 5, дорожка 3).

Рис. 5 Перманганатный футпринт РНКП с мутацией ARV при низкой температуре. Рентгенограмма 6% денатурирующего ПААГ с продуктами реакции перманганантного футпринтинга между РНКП и Т7А2 промотором. Первая дорожка содержит продукты расщепления Т7А2 промотора по остаткам гуанина и аденозина, последняя -футпринт Т7А2 промотора, не взаимодействующего с РНКП.

Дорожки 2 и 3 содержат комплекс фермента дикого типа при 37°С и 0°С, 4 и 5 - мутанта ARV, при тех же температурах, соответственно.

Полученные результаты указывают на дополнительную схожесть РНКП с мутацией ARV, на РНКП Д(186-433), проявляющуюся не только в границах образуемых ими промоторных комплексов, но и их способности оставаться открытыми при низких температурах.

Изучение свойств промоторных комплексов РНКП с точечной мутацией 4348 и РНКП Bacillus Subtilis

Точечная мутация 4348, отобранная в результате поиска протеотрофов на штаммах дефектных в синтезе ppGpp, приводит к формированию нестабильного открытого комплекса на рибосомалыюм промоторе rrnB Pl(Bartlett et al., 1998). Данная мутация представляет собой замену высококонсервативного остатка лизина 454 на гистидин и находится на расстоянии всего 10 аминокислотных остатков от мутации ARV. Исследование свойств РНКП 4348 в экспериментах in vitro показало, что мутантный фермент требует значительно более высокой концентрации нуклеотидов для перехода в стадию элонгации, по сравнению с РНКП дикого типа. РНКП с мутацией 4348, подобно РНКП ARV, обладает пониженной константой связывания с промоторным фрагментом, и образованный ей мутантный комплекс быстро диссоциирует в присутствии гепарина.

РНКП Bacillus Subtilis, несущая в своем гомологичном районе, прилегающем к С-консервативному участку, 90-аминокислотную вставку, также образует нестабильный промоторный комплекс. В дополнение к этому наблюдению, в экспериментах in vitro было показано, что РНКП Bacillus Subtilis образует укороченный «транскрипционный пузырь», по своим размерам очень похожий на РНКП Д(186-433) E.coli (Whipple et al., 1992)

Ввиду похожих свойств обоих мутантов ARV и 4348 и РНКП Bacillus Subtilis, а также близости их расположения в первичной структуре ß-субъединицы, их промоторные комплексы были исследованы нами на устойчивость к низким температурам. Как видно из рисунка 6 (Панель А), размер «транскрипционного пузыря» мутанта 4348 при температуре 37 °С (дорожка 5) не отличим от того, который образует фермент дикого типа (дорожка 2 и 3). Как и было показано раньше, промоторный комплекс мутантного фермента диссоциирует в присутствии гепарина (дорожка 6). Однако, в отличие от мутанта ARV, РНКП 4348 не способна плавить промоторную ДНК при нулевой температуре (дорожка 7). РНКП Bacillus Subtilis также образует гепарин-чувствительный, укороченный промоторный комплекс (Рис. 6, Панель Б, дорожки 4 и 5), не остающийся открытым при 0 °С (дорожка 6). Таким образом, полученный результат свидетельствует о том, что холодоустойчивость

промоторных комплексов не связана напрямую с С-консервативным районом ß-субъединицы и его окрестностей. А Б

Рис. 6 Влияние гепарина и низкой температуры на образование промоторного комплекса Р1ШП с мутацией 4348 (Панель А) и РНКП Bacillus Subtilis (Панель Б). Рентренограмма продуктов реакций перманганантного фугпринтирга промоторных комплексов мутантов РНКП E.coli: ARV, 4348, Л(186-433) и РНКП Bacillus Subtilis (B.s.), образованных при 37 °С и О °С, в присутствии и отсутствии гепарина. Дорожка №1 на панеле А содержит продукты расщепления Т7А2 промотора по остаткам гуанидина и аденозина, дорожка №11 - продукты перманганантного футпринга Т7А2 промотора не находящегося в комплексе с РНКП.

Структурный контекст мутаций промоторного комплекса и предполагаемый механизм их воздействия на ДНК-белковые взаимодействия.

Изученная в данной работе РНКП с мутацией АЯУ позволяет разобщить два основных свойства промоторного комплекса: устойчивость к гепарину и высокой концентрации соли и чувствительность к понижению температуры.

Наложение мутаций, воздействующих на формирование ДНК-белковых взаимодействий промоторного комплекса, на Зх-мерную структуру РНКП Тад, позволяет пролить свет на возможный механизм их действия (Рис. 7). В структуре РНКП 7й£7, имеющей форму клешни краба, верхняя часть фермента построена практически полностью из (З-субъединицы, в которой находятся мутации, исследованные в данной работе. В свою очередь, сама |3-субъединица содержит две четкие доли - переднюю и заднюю, образующие контакты с передним и задним дуплексом промоторной ДНК. Передняя доля |3-субъединицы состоит из неконсервативного района 1 и частично захватывает К-концевую часть консервативного района С, включающего в себя район мутации ДЯУ. Задняя доля

содержит в себе оставшуюся часть консервативного района С, а также консервативный район Б.

А Б В

Рис. 7 Структурный контекст мутаций РНКП, влияющих на процесс образования нромоторного комплекса. Панели А, Б и В содержат Зх-мерную структуру кор-фермента РНКП Taq, изображенную ввиде ленточной модели (Zhang et al., 1999). Димер а и р-субъединицы выделены синим цветом, )?' - зеленым, со - желтым., Последовательности РНКП Taq, гомологичные изученным в данной работе мутациям р-субъединицы РНКП E.coli, обозначены следующим образом: Д(186-433) выделена желтым цветом, ARV выделена красным цветом, a R454H изображена в виде голубой объемной модели. Аминокислотные остатки РНКП Taq, соответствующие S531, А532 и Т563 РНКП E.coli, представлены в виде розовых объемных моделей.

Согласно предложенному нами механизму образования ДНК-белковых контактов внутри промоторного комплекса, обе доли Р-субъединицы взаимодействуют с промоторным фрагментом ДНК, находясь в тесной координации друг с другом. Роль задней доли сводится к облегчению формирования ст-субъединицей изначального «транскрипционного пузыря» и стабилизации его задней границы в районе ТАТА-последовательности. В нашей моделе, взаимодействия задней доли Р-субъединицы с промоторным фрагментом обладают устойчивостью к низким температурам. Захлопывание задней доли Р-субъединипы в данной конформации приводит через аллостерический механизм к взаимодействию передней доли с промоторным фрагментом, что, в свою очередь, вызывает дальнейшее увеличение «транскрипционного пузыря» в сторону точки начала транскрипции.

Захлопывание передней доли Р-субъединицы чувствительно к низким температурам. Наша модель постулирует наличие двух возможных стабильных конформации взаимодействий обеих долей: обе доли раскрыты, что соответствует закрытому промоторному комплексу, и обе доли захлопнуты - конформация соответствующая открытому промоторному комплексу.

Мутация Д(186-433) удаляет практически всю переднюю долю ß-субъединицы (Рис. 7), а мутация ARV разрушает аллостерический механизм взаимодействия обеих долей. В результате, промоторный комплекс, образованный мутантными РНКП, поддерживается вместе только за счет взаимодейтвия задней доли ß-субъединицы с промотором. Для такого комплекса характерна устойчивость к низкой температуре и лишь частичное расплетание промоторного фрагмента.

Промоторный комплекс, образованный РНКП дикого типа, а также мутантом Д(186-433), обладает устойчивостью к гепарину, так как взаимодействия задней доли ß-субъединицы с промотором не оказываются затронутыми. Однако, единичная точечная замена R454H (Рис. 7), приходящаяся на участок, соединяющий обе доли ß-субъединицы, приводит к появлению чувствительности промоторного комплекса к гепарину. Схожий эффект наблюдается и в случае точечных мутаций аминокислотных остатков S531, А532 и Т563, находящихся на трехмерной моделе РНКП Taq в непосредственной близости с мутацией R454H (Рис. 7). Таким образом, мутации в этом районе, вероятнее всего, приводят к ослаблению взаимодействий задней доли ß-субъединицы с промоторным фрагментом, делая весь комплекс чувствительным к конкуренту ДНК. Делеция ARV расположена на Зх-мерной моделе вплотную к линкеру, соединяющему обе доли. Очевидно, что подобное расположение данной мутации оказывает эффект на ДНК-белковые контакты обеих долей, придавая мутантному промоторному комплексу одновременно чувствительность к гепарину, вызванную ослаблением контактов с ДНК задней доли, и укороченный размер «транскрипционного пузыря», вызванный нарушением взаимодействий передней доли с промоторным участком, прилегающим к точке начала транскрипции.

Таким образом, предложенная нами модель ДНК-белковых взаимодействий в промоторпом комплексе позволяет объяснить разобщение его двух основных свойств - устойчивости к гепарину и низким температурам - с помощью мутации в консервативном районе С ß-субъединицы РНКП.

Глава 3. Структура и функции НКД ß'-субъедшшцы PHKII E.coli

Кор-фермент РНКП E.coli содержит в последовательности своей ß'-субъединицы большую вставку, встречаемую лишь у небольшого количества других представителей грамм-негативных бактерий. Первичная последовательность этого 188-аминокислотного фрагмента, называемого неконсервативным доменом (НКД), расположена между двумя высококонсервативными районами G и G', играющими одну из ключевых ролей в процессе синтеза м-РНК (Epshtein et al., 2002). Многочисленные биохимические данные указывают на то, что аминокислотные замены и делеции в этом домене

воздействуют на процесс паузирования, терминации и общей стабильности элонгационного комплекса, но не приводят к нарушению основных каталитических функций РНКП in vitro (Zakhrova et al., 1998).

Структура РНКП E.coli, на которой было описано большинство биохимических свойств этого фермента, не определена к настоящему времени с достаточно высоким разрешением, позволяющим обнаружить расположение НКД. Наиболее изученные в структурном плане РНК-полимеразы термофильных бактерий Thermus aquaticus (Тaq) и Thermus thermophiliis (Tth) не содержат в своем составе последовательность, гомологичную НКД E.coli. а вместо несут короткий, неструктурированный линкер длиной в 15 аминокислотных остатков, называющийся G или триггер-петлей и соединяющий высококонсервативные районы G и О". Путем наложения структуры фермента из E.coli на высокодетальную структуру ферментов термофильных бактерий, становится возможным идентифицировать основные структурные мотивы РНКП E.coli, вовлеченные в катализ. К сожалению, такой подход не позволяет выявить положение НКД Р'-субъединицы, ввиду отсутствия соответствующей ему электронной плотности на общей карте РНКП E.coli. Задачей данной работы являлось: клонирование, экспрессия, кристаллизация, определение трехмерной структуры НКД и ее моделирование в общем контексте элонгационного комплекса.

Кристаллизация и разрешение структуры НКД р'-субъедииицы E.coli

Фрагмент гена гроС, содержащий последовательность НКД (аминокислотные остатки 944-1129) был клонирован в экспрессионный вектор рЕТ-15Ь, экспрессирован в штамм BL-21(DE3) и очищен методами высокоэффективной жидкостной хроматографии. Полученный высокоочшценный препарат НКД был успешно закристаллизован с помощью коммерческих наборов, методом диффузии паров летучих веществ. Оптимизация формы кристаллов достигалась с помощью органических микродобавок. Картины дифракции рентгеновских лучей замороженными кристаллами НКД были получены на синхротронном ускорителе Брукхэйвенской Национальной Лаборатории. Проблему фаз разрешили благодаря аномальным сигналам рассеяния рентгеновских лучей остатками селено-метионинова, введенными в кристаллы НКД. Для построения трехмерной структуры белка использовали программы SOLVE/RESOLVE и О.

Общая архитектура молекулы НКД Р'-субъединицы РНКП E.coli.

Разрешенная структура 188-аминокислотного НКД р'-субъединицы состоит из двух гибридных сэндвич-барел доменов (ГСБа и ГСБб), соединенных линкером. ГСБа содержит аминокислотные остатки 944-1022, а ГСБб - 1023-1130.

Структура НКД состоит практически полностью из анти-параллельных (5-слоев и выступающих из них неструктурированных петель. ГСБа содержит одну такую 17-членную петлю - А1, а ГСБб - две: 33-членную петлю Б1 и 15-членную петлю Б2. Гомологичные домены у других прокариот иногда содержат дополнительные вставки или делении, которые всегда располагаются в составе петель, таким образом, не нарушая основной тип укладки и структуру ГСБ.

Д I Петля 61

V с

ГСбй ГС56 ГС£й ГСБб

Рис. 8. Структурная модель НКД Р'-субъединицы РНК-полимеразы Е.соИ. Полипептидная цепь представлена в виде цветной ленты. Полученная структура состоит из двух предсказанных ранее гибридных сэндвич-барел доменов (ГСБа и ГСБб), соединенных линкером, и построена практически полностью аз р-слоев и выступающих наружу петель. Треонин 1068 петли Б1 является мишенью протеин-киназы ОрО.7 бактериофага Т7.

Петля А1

Петля 51

Исследование поверхностного распределения заряда НКД Р'-ПШООШПШП выявило значительную асимметрию. Одна из сторон этого фрагмента несет сильно отрицательный заряд, в целом характерный для поверхности РНК-полимеразы, а другая - положительный, обычно присущий ДНК-связывающим областям фермента.

Построение модели элонгационного комплекса с учетом структуры НКД р'-субъединицы.

В качестве исходной модели элонгационного комплекса E.coli была использована гомологичная структура Tag РНКП, находящейся в комплексе с синтетическим ДНК-РНКовым гибридом, построенным из олигонуклеотидов (Korzheva et al, 2000). Данная модель не содержит в структуре своей Р'-субъединицы участка, гомологичного НКД E.coli. Вместо этого, два высоко консервативных района G и G' Tag полимеразы соединены гибкой 15-членной петлей, не видимой в структуре фермента из-за своей подвижности. В РНКП E.coli, НКД Р'-субъединицы соединяется с G и G1 районами посредством двух подвижных линкеров. Наличие этих двух линкеров, способных растягиваться на 25 - 30 А, подразумевает определенную подвижность НКД, в результате чего его

структура не отслеживается разрешения (Darst et al, 2002)

на модели структуры PHKI1 E.coli низкого

Рис. 9 Структурная модель элонгационного комплекса Е.соО, содержащая НКД субъединицы. Кор-фермент РНКП изображен в виде объемной модели. Аминокислотные остатки, несущие положительный заряд, выделены синим цветом, отрицательный заряд -красным, а нейтральные - белым. Молекула двуцепочечной ДНК представлена ленточно-палочной моделью синего цвета. НКД Р"-субъединицы выделен зеленым цветом. Его аминокислотные остатки, участвующие в реакциях химического «сшивания», показаны красным цветом. Два изображения модели элонгационного комплекса повернуты по отношению друг к другу на 90°.

В построенной нами моделе НКД (З'-субъединицы отводится важная роль в стабилизации контактов РНКП с молекулой ДНК, а также с элонгационным фактором ОгеВ. ГСБб мотив НКД, вместе с другими участками фермента, участвует в образовании плотного зажима, практически полностью обхватывающего передний дуплекс ДНК. Одним из подтверждений подобного расположения НКД является тот факт, что деления в этом домене вызывает значительную дестабилизацию элонгационного комплекса, делая его чувствительным к конкуренту связывания ДНК - гепарину (АгГятоуЙсЬ е1 а]., 2003). Подобное построение также позволяет объяснить роль НКД на процесс паузирования, зависящий от прочитываемой РНКП последовательности (АгЫтоуМг й а1., 2000).

Кроме паузирования, в литературе подробно описана роль НКД Р'-субъединицы в процессе терминации. В этом районе фермента были картированы 13 аминокислотных замен, вызывающих нарушение узнавания терминаторных последовательностей (\Veilbaecher й а1., 1994). Так как терминация транскрипции тоже зависит от последовательности переднего дуплекса ДНК, можно предположить, что модификации аминокислотных остатков ГСБб, вызывающие ослабление его контактов с ДНК, способны оказывать существенное влияние на этот процесс. Возможным доказательством этому служит фосфорилирование треонина 1068, расположенного в том районе ГСБб, который согласно нашей модели, контактирует с передним дуплексом ДНК. Внесение негативного заряда в этот участок НКД посредством фосфорилирования треонинового остатка протеинкиназой бактериофага Т7, вызывает дестабилизацию взаимодействия ГСБб с ДНК и вызывает преждевременную терминацию клеточной транскрипции.

Расположение ГСБа в непосредственной близости от вторичного канала РНКП хорошо согласуется с данными химического «сшивания», позволяющими картировать этот район НКД в непосредственной близости от 3'-конца РНК, «арестованного комплекса». Данный комплекс образуется из элонгационного комплекса, когда РНК-полимераза, в процессе процессивной транскрипции, откатывается назад, выпуская растущий 3'-конец РНК из своего активного центра. Синтезированная м-РНК в подобном комплексе выходит из вторичного канала РНК-полимеразы, где и происходит ее взаимодействие с ГСБа. Предложенное расположение ГСБа в моделе элонгационного комплекса позволяет также объяснить его экранирование, элонгационным фактором СгеВ при обработке элонгационного комплекса гидроксильными радикалами (Ьар1епко й а1„ 2003).

Предложенная нами модель элонгационного комплекса также проливает свет на влияние НКД на основные каталитические функции РНКП. В силу близости расположения N и С-концов НКД к двум а-спиратям консервативных районов О и С, можно предположить, что элонгационные факторы, взаимодействующие с НКД, способны через него аллостерически воздействовать на активный центр фермента. Подобные сигналы потенциально могут передаваться от последовательности переднего дуплекса ДНК, с которым взаимодействует ГСБб. Свидетельством в пользу возможности такого атлостерического регулирования является связывание моноклональных антител с НКД, которое приводит к значительному уменьшению константы связывания нукеозидтрифосфата, входящего в активный центр фермента (Ьар1епко й а1., 2003).

Суммируя полученные результаты, можно заключить, что ГСБа мотив НКД Р'-суб},единицы является частью вторичного канала РНКП, с которым взаимодействует 3'-конец м-РНК «арестованного транскрипционного комплекса», а ГСБв, вместе с другими структурными элементами РНКП, формирует участок плотного связывания с передним дуплексом ДНК.

Выводы

1) С помощью серии олигоиуклеотидов, имитирующих последовательность матричной и нематричной цепей Ьас11У5 промотора с введенными в них фотохимическими сшивающими группами, впервые с достаточной точностью откартированы участки холофермента РНКП, вовлеченные в формирование промоторного комплекса.

2) Описан новый тип промоторного комплекса, сочетающий в себе нестабильность «закрытого комплекса» с расплетенностью цепей промотора, характерной для «открытого комплекса».

3) Впервые определена трехмерная структура фрагмента р'-субъединицы РНК-полимеразы Е.соН с большим разрешением.

4) На основании полученной структуры НКД Р'-субъединицы, построена обновленная модель элонгационного комплекса РНК-полимеразы Е.соН, позволяющая объяснить роль данного участка в стабилизации транскрипционного комплекса, его паузироваиии и в процессе терминации, а также каталитической активности фермента.

Список работ, опубликованных автором по теме диссертации.

Nechaev, S., Chlenov, M., Severinov, K. (2000) Dissection of two hallmarks of the open complex by mutation in an RNA polymerase core subunit. J.Biol Chem. 275(33): 25516-25522

Chlenov, M., Masuda, S., Murakami, K., Nikiforov, V., Darst, S., Mustaev, A. (2005) Structure and function of lineage-specific sequence insertions in bacterial RNA polymerase P'-subunit. J.Mol. Bio. 353, 138-154

Напечатано с готового оригинал-макета

Издательство ООО "МАКС Пресс" Лицензия ИД N 00510 от 01.12.99 г. Подписано к печати 09.11.2010 г. Формат 60x90 1/16. Усл.печл. 1,0. Тираж 100 экз. Заказ 504. Тел. 939-3890. Тел./факс 939-3891 119992, ГСП-2, Москва, Ленинские горы, МГУ им. М.В. Ломоносова, 2-й учебный корпус, 627 к.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Членов, Марк Михайлович

Введение.

Обзор литературы.

Общее строение бактериальной РНК-полимеразы.

Структурные элементы кор-фермента.

Неконсервативные домены больших субъединиц кор-фермента РНКП.

Основные этапы прокариотической транскрипции.

Взаимодействия холофермента РНКП с однонитевыми фрагментами ДНК. .26 . Взаимодействие холофермента РНКП с гибридным промоторным фрагментом, имитирующим открытый комплекс.

Материалы и Методы.

Питательные среды и антибиотики:.

Получение компетентных клеток и их трансформация.

Ферменты, использованные для клонирования.

Полимеразная Цепная Реакция (ПЦР).

Очистка фрагментов ДНК.

Электрофорез белков и нуклеиновых кислот.

Нативный электрофорез ДНК в агарозном геле.

Денатурирующий электрофорез ДНК и РНК.

Нативный электрофорез белков и белок-ДНКовых комплексов.

Денатурирующий электрофорез белков в ПААГ.

Клонирование и очистка белков.

Очистка и выделение РНКП.

Клонирование и экспрессия большого неконсервативного домена РНКполимеразы.

Очистка НКД (3 '-субъединицы.

Клонирование и очистка РНКП с мутациями в (3 -субъединице.

Клонирование и очистка НКД (3 '-субъединицы Е.соИ.

Перманганатный и эндонуклеазные футпринты.

Химические сшивки и картирование.

Получение ДНК-матрицы с фотоактивной сшивающей группой.

Фотоактивная ковалентная ДНК-белковая сшивка.'.

Картирование ДНК-белковых сшивок.

Кристаллизация и разрешение структуры НКД (3 '-субъединицы Е.соИ. Кристаллизация белка.

Сбор данных рассеяния.

Построение трехмерной модели структуры НКД.

Результаты и обсуждение.

Изучение ДНК-белковых взаимодействий в промоторном комплексе с помощью олигонуклеотидов с фотохимическими сшивающими группами. .48 Общее распределение фотохимических сшивок из матричного и нематричного олигонуклеотидов в субъединицы РНКП.

Картирование контактов ст-субъединицы с олигонуклеотидами нематричной цепи ЬасиУ5 промотора.-.

Картирование контактов ¡3 - су бъ единицы с олигонуклеотидами нематричной цепи ЬасиУ5 промотора.

Картирование контактов ß '-субъединицы с олигонуклеотидами нематричной цепи LacUV5 промотора.

Анализ распределения фотохимических пришивок в субъединицы холофермента РНКП.

Мутации С-консервативного района ß-субъединицы E.coli и их эффект на взаимодействие РНКП с промоторной ДНК.

Мутации консервативного района С ß-субъединицы E.coli.

Определение границ промоторного комплекса РНКП с мутацией DRV. 71 Изучение чувствительности промоторного комплекса РНКП DRV к низкой температуре.

Изучение свойств промоторного комплекса РНКП с точечной мутацией

4348.

Структурный контекст мутаций промоторного комплекса и предполагаемый механизм их воздействия на ДНК-белковые взаимодействия.

Структура и функции НКД ß'-субъединицы РНКП E.coli.

Мутации и делеции НКД ß'-субъединицы E.coli.

Получение кристаллов НКД ß'-субъединицы E.coli.

Сбор данных рассеяния.

Построение трехмерной модели структуры НКД.

Общая архитектура молекулы НКД ß '-субъединицы РНКП E.coli.

Построение модели элонгационного комплекса с учетом структуры НКД ß

-субъединицы.

Выводы.