Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение спектра точечных мутаций в гене ФАГ у больных фенилкетонурией в Москве и Московской области

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Изучение спектра точечных мутаций в гене ФАГ у больных фенилкетонурией в Москве и Московской области"



РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК МЕДИКО-ГЕНЕТИЧЕСКИЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР

.", г,

на правах рукописи УДК 575.591

ЧАРИКОВА Елена Владимировна

Изучение спектра точечных мутаций в гене ФАГ у больных фенилкетонурией в Москве и Московской области

03.00.15 - генетика

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 1995 г.

Работа выполнена в Институте молекулярной генетики РАН Директор - член-корреспондент РАН Е.Д.Свердлов

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

Н.А.Чуриков,

доктор биологических наук О.В.Ефграфов.

Ведущее учреждение:

Институт общей генетики им.Н.И.Вавилова РАН

Защита диссертации состоится ^^/Ц^е_

1995 г. в /<£. часов на заседании специализированного Ученого Совета (Д.001.16.01) Медико-генетического научного центра РАМН по адресу: 115478 Москва, ул.Москворечье, д.1.

С д иссертацией можно ознакомиться в библиотеке Медико-генетического научного центра РАМН.

Автореферат разослан " ^/¿¿¿г^^ " 1995 г.

Ученый секретарь Специализированного Совета доктор биологических наук, профессор

Л. Ф. Курило

ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Одной из актуальных проблем ме-щцинской генетики и генетики человека является изучение молекулярных основ моногенных наследственных бо-[езней человека и их распространение в различных регио-iax. В настоящее время описано свыше 1000 наследствен-1ых болезней человека, обусловленных генными мутациями. Классическим примером заболевания, относящемуся к слассу аминоацидурий или нарушений аминокислотного >бмена является фенилкетонурия (ФКУ),имеющая весьма пирокое распространение во всех странах мира. Основой данного наследственного заболевания является поражение ена фенилаланингидроксилазы (ФАГ), что обусловливает гнактивацию фермента фенилаланингидроксилазы и бло-:ирование гидроксилирования фенилаланина, т.е. превращение его в тирозин. Одним из наиболее тяжелых клини-геских симптомов фенилкетонурии является поражение митральной нервной системы, необратимо ведущее к замедлению умственного развития детей, т.е. умственной от-ггалости - олигофрении. Изучение молекулярно-генетичес-:их основ фенилкетонурии весьма актуально для нашей :траны, т.к. частота данного наследственного заболевания олько в Москве и Московской области составляет 1 на >315 новорожденных.

Целью исследования настоящей работы было изуче-ше спектра точечных мутаций в гене фенилаланингидрок-:илазы у больных фенилкетонурией в Московском регио-

Научная новизна. С помощью метода полимеразной 1,епной реакции амплификации с последующей аллель-спе-1;ифической гибридизацией в выборке больных фенилке-онурией из Московского региона в гене фениладанингид-юксилазы (ФАГ) выявлены точечные мутации в 408, 158,

261 кодонах, а также в донорном участке сплайсинга 12 интрона. Выявлена новая точечная мутация, представляющая собой делецию гуанина на стыке сочленения 11 интрона и 12 экзона.

Составлены таблицы мутационных замен аминокислот, возникающих на основе одноступенчатых мутаций, вызываемых изменением одного нуклеотидного основания в кодирующем триплете. Составлены таблицы последствий транзиций и трансверсий в виде аминокислотных замещений. Выведены формулы для подсчета теоретически возможных missense, silent и nonsense мутационных аминокислотных замещений в пептидах.

Практическая значимость. Проведенная работа по выявлению наиболее характерных для Московского региона точечных мутаций в гене фенилаланингидроксилазы может быть использована при тестировании гетерозиготного носительства у родителей и сибсов больных фенилкетону-рией и пренатальной диагностике в клинической практике.

Используя данные составленных таблиц по спектру мутационных аминокислотных замещений возможно предсказание фенотипических вариаций мутационных поражений. Используя выведенные формулы для подсчета missense, silent и nonsense мутационных аминокислотных замещений возможен учет теоретически возможных мутационных замещений в соответствующих пептидах.

Основные положения, выдвигаемые на защиту:

1. В выборке больных фенилкетонурией из Московского региона выявлены точечные мутации в 408, 158, 261 кодонах и донорном участке сплайсинга 12 интрона гена фенилаланингидроксилазы.

2. Идентифицирована новая точечная мутация в гене

|эенилаланингидроксилазы у больного фенилкетонурией, федставляющая собой делецию гуанина на стыке сочле-1ения 11 интрона и 12 экзона.

3. Секвенированы З'-конец 11 интрона и 5'-конец 12 гнтрона гена фенилаланигидроксилазы человека.

Апробация работы. Материалы диссертационной ра-юты представлялись на первой и второй Всесоюзных конференциях "Геном человека" (1990, 1991 г.г.), лаборатории семинарах Иститута молекулярной генетики РАН.

Публикации. По материалам диссертации опублико-ано 5 работ.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 52 страницах машинописного текста, состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и

1етоды, результаты и обсуждение, выводы.Указатель лите->атуры содержит 228 наименований, в том числе 226 инос-ранных библиографических источников. Диссертация ил-юстрирована 11 рисунками, 8 схемами, 8 таблицами.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В работе представлены результаты анализа спектра [утационных поражений гена фенилаланингидроксилазы кг основе обследования группы больных фенилкетонури-й. Взятие крови у больных, биохимический и клиничес-:ий анализы, на основе которых ставился диагноз фенил-:етонурии, были проведены в Институте педиатрии и деткой хирургии МЗ РФ и Научно-исследовательском ин-титуте педиатрии РАМН.

Термостабильную ДНК-полимеразу из ТЬеггпш Шег-юрЫ1и5 любезно предоставил проф.Е.И.Шварц (ЛИЯФ м.Б.П.Константинова). Олигонуклеотидные праймеры и

зонды синтезированы в Институте биоорганической химии им.М.М.Шемякина и Институте молекулярной генетики. Работа по секвенированию ДНК проведена в группе синтеза и анализа генетического материала ИМГ РАН.

ДНК из лейкоцитарной суспензии венозной крови выделяли по методике Кап (1987). Энзиматическую амплификацию ДНК проводили по методу Saiki (1988). Амп-лифицированные фрагменты ДНК проверяли электрофо-ретически. При проведении работы геномную ДНК больных амплифицировали по 5, 7 и 12 экзонам гена ФАГ. Пробы амплифицированных фрагментов ДНК переносили на нейлоновые мембранные фильтры "Hybond N" фирмы "Amersham" с помощью Manifold. Дот-блот гибридизацию амплифицированных фрагментов ДНК с аллель специфическими олигонуклеотидными (ACO) зондами проводили по методикам Nicoloso (1989) и Kazazian (1989). Зонды радиоактивно метили по 5'-концу, используя полинуклеотид-киназу фага Т4 и 32Р гамма-АТФ. Амплифицированный фрагмент ДНК по 12 экзону гена ФАГ клонировали в плаз-миде pTZ 19, предварительно расщепленной Smal. Трансформацию клеток E.coli штамма TG-1 проводили в присутствии СаС12. Отбор рекомбинатных клонов вели на селективной среде McConkey с ампициллином (50 мкг/мл). Плаз-мидную ДНК выделяли по модифицированной методике Birboim, Doly (1979). Для проведения секвенирования ДНК плазмиды переводили в одноцепочечную форму, используя фаг М13 К07 (Maniatis, 1989). Первичную последовательность нуклеотидов исследовали с использованием модифицированного метода Сэнгера (Sanger et al., 1977) с применением флуоресцентно окрашенных универсальных прай-меров фага М13. Секвенирование проводили на автоматическом секвенаторе фирмы Applied Biosystems модели 340 А. Чтение нуклеотидной последовательности флуоресцентно окрашенных полос велось с помощью программы ABI version 1.30 software.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Детекция точечных мутаций в гене ФАГ, локализованных в 5, 7 и 12 экзонах.

Была обследована группа из 31 ребенка с классической формой фенилкетонурии с целью определения гено-гипа, т.е. выявления точечных мутаций в гене фенилала-шнгидроксилазы.

Исследуемая группа больных фенилкетонурией детей троходила курс лечения диетотерапией в психоневрологи-1еском отделении Института педиатрии Российской Академии медицинских наук. Данной группе детей был поставлен диагноз классической формы фенилкетонурии на эснове проведенных исследований, включая клинические эсмотры, анализ аминокислот в сыворотке крови, спинномозговой жидкости и моче, а также количественное опре-*еление содержания патологических метаболитов фенила-тнина и тирозина в биологических жидкостях до и после диетотерапии. У больных оценивались следующие параметры - размеры окружности головы, врожденные рефлексы, состояние черепно-мозговой иннервации, моторное раз-штие и двигательная сфера ребенка (тонус и сила мышцы, состояние сухожильных, надкостничных и кожных рефлексов, координация), состояние вегетативно-трофической сферы, тазовые функции, характер судорожных параксиз-лов. Высшие мозговые функции изучались психологом-*ефектологом по методикам, разработанным во ВНИИ дефектологии РАПН. Исследовалась эмоциональная сфера, мвыки, сон, интересы, внимание, память, речь, контакт, интеллектуальное развитие.

Представляло интерес выявить генетические повреж-1ения в гене ФАГ, фенотипически проявляющиеся у дан-

ной группы больных ФКУ. На первом этапе изучения генотипа данную группу больных детей тестировали на наличие наиболее распространенных точечных мутаций, характерных для Европейской части Земного Шара. Это мутации, локализованные в 408 кодоне 12 экзона и донорном участке сплайсинга 12 интрона. При детекции данных мутаций амплифицировали субгеномный фрагмент ДНК размером 245 пар оснований, соответствующий 12 экзону с фланкирующими интронными последовательностями. Вышеуказанные мутантные локусы лежат в данном фрагменте на расстоянии 93 пар оснований друг от друга.

В качестве праймеров использовали 20-членные синтетические олигонуклеотиды:

5'- ATGCCACTGAGAACTCTCTT - 3' (гомологичен смысловой цепи ДНК) и 5'- AGTCTTCGATTACTGAGAAA - 3' (комплементарен смысловой цепи).

Были проанализированы 62 хромосомы 31 пациента из 30 неродственных семей. У десяти детей образцы амп-лифицированной ДНК гибридизовались с мутантным-408 олигонуклеотидным зондом и не гибридизовались с нор-мальным-408 зондом. Для аллель-специфической олигонук-леотидной гибридизации использовали 21-звенные зонды, позволяющие выявить транзицию С - Т в первом положении 408 кодона 12 экзона. Нормальный 408-зонд

(5'- CACAATACCTC*GGCCCTTCTC - 3') гомологичен смысловой цепи ДНК, мутантный-408 зонд

(5'- GAGAAGGGCCA*AGGTATTGTG - 3') комплементарен смысловой цепи. Зонды симметричны по длине относительно точки мутации. Полученные экспериментальные данные с ACO гибридизацией позволяют сделать заключение о том, что данная группа ФКУ больных детей содержит один и тот же мутантный

отель в гомозиготном состоянии.

Амплифицированные фрагменты геномной ДНК дру-их десяти больных детей фенилкетонурией гибридизова-[ись как с мутантным-408 и нормальным-408 зондами, так [ с мутантным и нормальным зондами к донорному участ-:у сплайсинга 12 интрона (рис. 1). Для аллельспецифичес-:ой гибридизации по донорному участку сплайсинга ис-юльзовали 21-звенные олигонуклеотиды, выявляющие ранзнцшо G-A в каноническом динуклеотиде G*T - А*Т. 1ормальный - IVS-12 зонд

(5'- АААТТАСТТАС * TGTTAATGGA - 3') :омплементарен смысловой цепи ДНК, мутантный IVS-12 онд

(5'- TCCATTAACAA*TAAGTAATTT - 3') омологичен смысловой цепи. С помощью методов

мплификации и аллельспецифической гибридизации с шигонуклеотидньши ДНК-зондами стало возможным [роизвести дифференциацию полиаллельных мутаций гена С>АГ. Данная группа больных детей представляет собой етерозиготных компаундов, обладающих двумя различными 1утантными аллелями - (408/IVS-12).

Среди остальных одиннадцати ФКУ больных в пяти лучаях амплифицированые фрагменты ДНК по 12 экзону .авали положительную гибридизацию как с мутантным-08, так и с нормальным-408 зондами (рис. 2 А; пациенты ,б,в,г,д), т.е. являлись гетерозиготами по мутантному 408 ллелю.

Геномную ДНК этих одиннадцати ФКУ больных де-ей тестировали на наличие точечной мутации в 158 кодо-ie, локализованной в пятом экзоне. Для амплификации ¡ятого экзона гена ФАГ использовали олигонуклеотидные :раймеры:

экзон 12, кодон 408

норм, зонд

сплайсинговая мутация (IVS-12)

норм, зонд

ФКУ больные (408/IVS-12) контроль

Рис.1. Тестирование мутаций (408aiB tip и IVS-12) в гене ФАГ с помощью ACO гибридизации.

5А (5'- TGTCTCTTTTCTCCTAGGGT - 3') и

5Б (5'- GCAGACTTACTGGCGGTAGT - 3'). !ри детектировании мутации использовали синтетические нигонуклеотидные 21-звенные зонды, позволяющие яявить точечную мутацию G - А во втором положении 58 кодона (CG*G - CA*G). Нормальный-158 зонд 5'- CGTGCAAGACG*GAAGCAGTTT - 3') »мологичен смысловой цепи ДНК, мутантный-158 зонд 5'- AACTGCTTCT*GTCTTGCACGG - 3') эмплементарен смысловой цепи ДНК. При дот-блот [бридизации пять образцов амплифицированной ДНК по этому экзону гибридизовались как с мутантным-158, так с нормальным-158 зондами,т.е. являлись гетерозиготами э мутантному-158 аллелю (рис. 2 Б; пациенты г,д,е,ж,з). реди этих пяти больных детей, несущих мутантный-158 [лель в гетерозиготном состоянии, у двоих из них [ациенты г,д) была выявлена также положительная [бридизация с мутантным-408 зондом. Следовательно, двое КУ больных детей представляют собой компаундных терозигот по данным мутантным аллелям - 408/158.

Среди изучаемой группы детей с фенилкетонурией лли выявлены еще два типа компаундных гетерозигот: 1) Ï8/X - 3 пациента (е,ж,з); 2) 408/Х - 3 пациента (а,б,в), :е вторая мутация не была выявлена.

Среди спектра точечных мутаций в гене ФАГ ДНК ФКУ шьных детей скринировалась и на наличие точечной му-ции, локализованной в седьмом экзоне в 261 кодоне. иплификацию седьмого экзона проводили с помощью эаймеров:

^ (5'- TCTTCTTTTCATCCCAGCTTGCAC - 3') и 3 (5'- CAGTACTCACGGTTCGGGGGT - 3') . •лигонуклеотид

i' - TGGCCTTCCG*AGTCTTCCAC - 3') мологичный смысловой цепи служил нормальным-261

А. экзон 12, кодон 261

норм, зонд

мут. зонд

а б в г д

Б. экзон 5, кодон 158 норм, зонд ¡I

мут. зонд

г д е ж з

В. экзон 7, кодон 261

норм.зонд

мут. зонд

и к ФКУ больные

Контроль

Рис.2. Аллель специфическая гибридизация Амплификацию проводили по 12, 5 и 7 экзонам. Дот-блот гибридизацию проводили с ACO зондами

зондом, а олигонуклеотид

( 5 ' - AGTGGAAGACTT*GGAAGGCCA 3 ' ) ___________________________

комплементарный смысловой цепи - мутантным-261 зондом, что позволило выявлять транзицию G - А во втором положении 261 кодона (CG*A - СА*А). На рис. 2 В (пациенты и,к) представлен радиоавтограф аллель-специфической гибридизации с нормальным-261 и мутантным-261 зондами. Двое ФКУ больных детей являются компаундными гетерозиготами, несущими мутантный 261 аллель.

Идентификация новой точечной мутации в гене ФАГ.

У одного исследуемого больного фенилкеггонурией была идентифицирована новая точечная мутация. Как сообщаюсь в предыдущем разделе у этого ФКУ больного ранее была выявлена точечная мутация в 408 кодоне. Для выявления второй мутантной аллели геномную ДНК данного зольного амплифицировали по 12 экзону с фланкирующими интронными последовательностями. Амплифицирован-ный фрагмент клонировали и затем секвенировали.

Данные секвенационного анализа позволили локализовать новую точечную мутацию, представляющую собой целецию гуанина на стыке сочленения 11 интрона и 12 эк-зона. На рис. 3 и 4 представлены данные секвенационного шализа.

Делеция гуанина в этом локусе может приводить к двум различным последствиям. В первом случае делецию гуанина можно рассматривать как мутацию в 400 кодоне, представляющую собой делецию 3-го основания кодирующего триплета (AGG-AG_). Кодон 400 (AGG), кодирующий ар-тшин, в норме расчленяется одиннадцатым интроном по типу 11, т.е. вклинивается между вторым и третьим нукле-угидными основаниями кодирующего триплета. Первое и

Л Т ТГ.Т ССОД С С А А А С; Т Т С ТЛА С Л Г; С А А Л А С С А С А С С Г, Т ТС.

I 11111111 МШ !! I ишшшшшш II!

Рис.3. Данные автоматического ДНК-секвенирования фрагмента гена ФАГ (апИвепве ДНК) больного ФКУ.

Точечная мутация (делеция гуанина) указана стрелкой.

SEQ1C 1 tgccgatcattaatgagctggacgacaggttccgactgaaagcggggagt NOR 0 --------------------------------------------------

SEQ1C 51 gagcgacgaattaatgtagttagctcactattaggcaccccaggctttac NOR 0 --------------------------------------------------

SEQ1C 101 actttatgcttccggctcgtatgttgtgtggaattgtgagcggataacaa NOR 0 --------------------------------------------------

SEQ1C 151 tttacacaggaaacagctatgaccatgattacgcaagctctaatacgact NOR 0 --------------------------------------------------

5EQ1C 201 cactataggaaagcttgatgcctgcaggtcgactctagaggatccatgcc NOR 0 --------------------------------------------------

5EQ1C 251 actgagaactctcttaagactacctttctccaaatggtgcccttcactca

NOR 0--------------------------------------------------

интрон 11 экзон 12

thr leu leu pro gln tyr

3EQ1C 301 agccTGTGGTTTTGGTCTTAG. - A ACT TTG CTG CCA CAA TAC

NOR 0----TGTGGTTTTGGTCTTAG. G AAC TTT GCT GCC АСА ATA

arg'00 asn phe ala ala thr ile

leu gly pro ser gln phe ala thr thr tyr thr pro lys

3EQ1C 340 CTC GGC CCT TCT CAG TTC GCT ACG ACC TAC АСА CCT AAA

NOR 37 CCT CGG CCC TTC TCA GTT CGC TAC GAC CCA TAC ACC CAA

pro arg pro phe ser val arg tyr asp pro tyr thr gln

gly leu arg ser trp thr ile pro ser ser leu arg phe

3EQ1C 380 GGA TTG AGG TCT TGG АСА ATA CCC AG С AG С TTA AGA TTT

NOR 76 AGG ATT GAG GTC TTG GAC AAT ACC CAG CAG CTT AAG ATT

arg ile glu val leu asp asn thr gln gln leu lys ile

экзон 12 интрон 12

trp leu ile pro leu thr

3EQ1C 420 TGG CTG ATT CCA TTA АСА .GTAAGTAATTtacaccttacgaggc

NOR 115 TTG GCT GAT TCC ATT AAC А ,GTAAGTAATT—

leu ala asp ser ile asn ser

3EQ1C 464 cactcggtttctcagtaatcgaagactggtaccacc

NOR -------------------------------------

Рис. 4. Секвенированная последовательность фрагмента гена ФАГ, включающая 12 экзон и фланкирующие

интронные последовательности (строчными буквами обозначена идентифицированная последовательность З'конца 11 интрона и 5'конца 12 интрона)

второе нуклеотидные основания кодирующего триплета "AG" локализуются в конце 11 экзона перед "GT" каноническим динуклеотидом 5'-донорного участка сплайсинга 11 интрона. Третье основание "G" 400 кодона локализуется в начале 12 экзона, вслед за "AG" каноническим динуклеотидом З'-акцепторного участка сплайсинга 11 интрона. В норме данная нуклеотидная последовательность показана ниже:

11 экзон 11 интрон 12 экзон

GTA AG gtgaggtggt.....tgtggttttggtcttag G AAC

arg400 arg400

В результате выявленной точечной мутации (делеции гуанина в третьем положении кодирующего триплета аргинина) происходит сдвиг рамки считывания аминокислотной последовательности фенилаланингидроксилазы при трансляции, начиная с 12 экзона. Следовательно, при трансляции 400 кодона аргинин считывается с "AG" нуклеоти-дов 11 экзона и захватывает вследствие делеции гуанина следующий нуклеотид - аденин "А" из следующего кодирующего триплета "ААС",соответствующего аспарагину.-Вследствие делеции гуанина 400 кодон (AGG345) приобретает следующий нуклеотидный состав - AGA, что также соответствует аргинину. Однако вслед за аргинином в синтезируемую полипептидную цепь на место аспарагина (ААС35") встраивается треонин (ACT11"). Вследствии сдвига рамки считываня последовательность всех аминокислот, кодируемых 12 экзоном, оказывается искаженной. На рис. 4 представлены аминокислотные последовательности фенилаланингидроксилазы, кодируемые 12 экзоном в норме и в случае описываемой мутации, делеции гуанина в 400 кодоне. Искаженный синтез аминокислотной последовательности фермента фенилаланингидроксилазы вследствие сдвига рамки считывания, начиная с 400 кодона, затраги-

экзон 12

А. (норма)

интрон 12

экзон 13

ААС A gtaagtaatt

gttgtttttctttgtag GT GAA

ser

ser

Б. (последствие мутации в 400 кодоне)

экзон 12

интрон 12

экзон 13

ACA gtaagtaatt

gttgtttttctttgtag GTG val

asn

В. Транслируемая последовательность аминокислот 13 экзона в норме (nor) и вследствие мутации arg400 кодона (mut)

ser glu ile gly ile leu cys ser ala leu gin lys ile lys stop юг GT GAA ATT GGA АТС CTT TGC AGT GCC CTC CAG AAA ATA AAG TAA nut GTG AAA TTG GAA ТСС TTT G CA GTG CCC TCC AGA AAA TAA AGT AA

val lys leu glu ser phe ala val pro ser arg lys stop

Рис. 5. Изменение генетической информации 13 экзона вследствие мутации в 400 кодоне

вает не только 12 экзон, а также распространяется и на следующий 13 экзон. Аминокислотные последовательности ФАГ, кодируемые 13 экзоном в норме и в случае описываемой мутации представлены на рис.5. Кроме искаженной последовательности аминокислот синтезируемый пептид будет на два аминокислотных остатка короче вследствие возникновения преждевременного терминирующего кодона, т.е. будет включать в свой состав только 449 аминокислот. Синтезируемый пептид с искаженной последовательностью аминокислот не будет обладать ферментативной активностью, т.к. данные изменения локализуются в области активного центра фермента.

С другой стороны идентифицированную делецию гуанина можно рассматривать и как место локализации деле-тированного гуанина в каноническом "АС' динуклеотиде 3'-акцепторного участка сплайсинга 11 интрона. Фрагмент данной выявленной нуклеотидной последовательности можно представить как:

3'конец интрона 11 : 5'конец экзона 12

С.ААС.ТТТ.......

В этом случае делеция гуанина теоретически будет приводить к неверному сплайсированию мРНК и синтезу дефектного фермента ФАГ.

Следовательно, выявленная мутация в то же время является и сплайсинговой мутацией.

Данная точечная мутация (делеция гуанина) на стыке сочленения 11 интрона и 12 экзона в клетках печени больного ФКУ теоретически может реализоваться мозаично двумя вариантами: 1) как мутация в 400^ кодоне со сдвигом рамки считывания; 2) как сплайсинговая мутация в "АО" каноническом 3'- акцепторном участке сплайсинга 11 интрона.

__________Чтобы подтвердить достоверность выявленной мута-

цш было проведено скринирование 21 рекомбинантного слона с помощью дот-блот гибридизации с ACO зондами. Хля этой цели было проведено выделение плазмидной ДНК 13 ремомбинантных клонов бактерий. Были синтезирова-ш соответствующие зонды, позволяющие выявить данную мутацию. Данные дот-блот гибридизации позволили сде-[ать заключение о том, что описываемый ФКУ больной 1есет данную мутацию в гетерозиготном состоянии.

Так как у этого больного ранее была выявлена точеч-1ая мутация в 408arg"trp кодоне в гетерозиготном состоянии, |,анный пациент является компаундом, т.е. несет два раз-[ичных мутантных аллеля.

Сочетание описываемых мутантных аллелей феноти-шчески реализуется тяжелым течением фенилкетонурии у мблюдаемого пациента. Содержание аминокислоты - фе-шлаланина в спинномозговой жидкости составляло 365 miol/L, в плазме крови - 1468 /miol/L. В контрольной фуппе доровых детей содержание фенилаланина составляло в :пинномозговой жидкости 16 /лио1/Ь, в плазме крови -61,8 miol/L. У данного больного концентрация фенилаланина февышала контрольный уровень приблизительно в 23 раза.

выводы

1. В выборке больных фенилкетонурией из Московского региона в гене фенилаланингидроксилазы выявлены точечные мутации в 408, 158, 261 кодонах и донорном участке сплайсинга 12 интрона со следующими частотами встречаемости соответственно - 56,4%; 8,1%; 3,2% и 16%.

2. В исследуемой выборке больных фенилкетонурией выявилось отсутствие гомозигот по сплайсинговой мутации в 12 интроне.

3. Выявлена новая точечная мутация у больного фенилкетонурией в гене фенилаланингидроксилазы. Данная мутация представляет собой делецию гуанина на стыке сочленения 11 интрона и 12 экзона. Идентифицированная мутация теоретически может реализоваться двумя вариантами:

а) как мутация в 400^ кодоне со сдвигом рамки считывания;

б) как сплайсинговая мутация в "АС каноническом З'-акцепторном участке сплайсинга 11 интрона.

4. Секвенированы З'-конец 11 интрона и 5'-конец 12 интрона гена ФАГ человека.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Чарикова Е.В., Хальчицкий С.Е. "Анализ гена фе-шлаланингидроксилазы у больных фенилкетонурией". -Тервая Всесоюзная конференция "Геном человека", 8-12 |ктября 1990 г., г.Переславль-Залесский, стр. 193-194.

2. Чарикова Е.В., Хальчицкий С.Е., Антошечкин А.Г., Цварц Е.И. "Детектирование различных типов мутаций в ене фенилаланингидроксилазы". - Вторая Всесоюзная конвенция "Геном человека", октябрь 1991 г., г.Переславль-¡алесский, стр. 140-141.

3. Чарикова Е.В., Хальчицкий С.Е., Шварц Е.И.,Ан-ошечкин А.Г. "Идентификация точечных мутаций в гене ¡зАГ в популяции больных фенилкетонурией в Москве и Лосковской области". - В сб. "ДНК-диагностика и меди-:о-генетическое консультирование". Москва, 1995.

4. Charikova E.V., Khalchitskii S.E., Antoshechkin A.G., clvwartz E.I. "Distribution of some point mutations in the phe-ylalanine hydroxylase gene of phenylketonuria patients from le Moscow region". - Human Heredity, 1993, v. 43, p. 24449.

5. Charikova E.V. "Novel mutation identified in the PAH ene". - Human Heredity, 1995, v. 45, p. 130-135.