Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Выявление, очистка и биологические свойства фактора роста фибропластов из клеток зародышей вьюна MISGURNUS FOSSILIS L.

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Выявление, очистка и биологические свойства фактора роста фибропластов из клеток зародышей вьюна MISGURNUS FOSSILIS L."

УКРАКНСЬКА АКАДЕМ1Я АГРАРНИХ НАУК 1НСТИТУТ Ф1310Л0ГП I Б10Х1МП ТВАРИН

РГ6 ол

'} Яа правах рукопису

якимович

1гор АндрЫович

ВИЯВЛЕННЯ, ОЧИСТКА ТА БЮЛОГ1ЧН1 ВЛАСТИВОСТ1 ФАКТОРА РОСТУ Ф1БРОБЛАСТ1В 3 КЛ1ТИН ЗАРОДК1В В'ЮНА

MISGURNUS Р08511Л5 Ь. 03.00.04 — Б10Х1М1'я

Автореферат дисертацп на здобуття наукового ступеня кандидата бтлопчних наук

ЛЬВ1В- 1994

Робота виконана у в1ддш бшхши кл]тинноТ диференц1ацп В1ддмення регуляторних систем клиник [нституту бюхЬш ¡м. О. В. Палладша АН Украши.

Науковий кер!вшк — доктор бюлопчних наук Р. С. СТОЙКА.

Офщшш опоненти: — доктор бЬлопчних наук, професор I. I. РОЗ-

ГОНК

— доктор бюлопчних наук М. Д. ЛУЦИК.

Пров'щиа установа — 1нстигут експериментальноТ патологи, онколо-

) гп 1 радюбюлогп ¡м. Р. 6. Каведького АН Украши.

Захист дисертадП вщбудетъся « % » 19Э4 р. о

« и год. на засщанш спец1ал13овано1 вчено5 ради Д.020.14.01 при 1нституп фЫолош 1 бюхшп тварин Украшсько! Академи Аграриях Наук за адресою: 290034, м. Льв1в-34, вул. В. Стуса, 38.

3 днсертад1ею можна ознайомитися у б!блютец1 ¡нституту ф1зюлош 1 бюх)мП тварин УААН.

Автореферат роз!сланий « » ¿/Р/гУ_1994 р.

Учений секретар /иг

спец1ал1зовано'1 вчено'1 рада^ ^ КИРИЛ1В

ЭАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОВОТИ

АктуалыЦоть проблеми. Р&гуляЩя прод1ферацН i дифе-ренц1ацП клтш гид час початков их сгад!й ewSpl овального роэвит-ку мае ряд осоСлшзостей у пор!вяянн1 а регуляц1яо цих процео1в .у дорослих орган!гм1в. У цей пер1од роэвитку, коли ц? не сформована нейро^ендокриняа система тварин, вамиау роль в1д1грають пол1пэп-тидн1 фактори росту (ПФР) [Стойка, Кусеяь, 1988; Грунц, 19803.

Вперше думку про те, шр фактор росту фЮробласт1в (ФРО) моде приймаги участь в i иду гад! утворення меэодерми п1д час ембрЮге-неау в амф!б1й, вислсвив' Саек та crti ваз торя [Slack et al., 1987). Згодом, аналогачяий висновок про роль ФРФ було гроблено в результат! дослгдже!» процес1в ембр1онального розвитку у ireaxiB i ссав-Щв CLui, Nicoll, 1988} Olwin et al., 1991 J.

Нев1доmo, чи мЮтигася ФРФ в эародках костистих риб ■ 1 чи кл1тини цих эародк1в в ксмпетенткими до йог о дп. Невивченим эа-лишаеться питания i про особливост! б1олог!чно1 дП ФРФ холоднокровиях хребэтних твариа. Taiti дан! е взллтекми, оск1дьки эародки деяких вид!в риб, поряд is зародками амф1б!й, аикористовуютася як модель для э'ясування закономерностей регуляцП прод1ф9рзЩ1 та дмфврешЦацП кгатик гйд чао ембрЮналытого розвигку [Костомарова, 1974, 1975].

Мета та аавдания дшуЦдження. Головною метоо роботи було встановити, чи можа фактор росту ф!Сроблзст1в впконувати регуля-горну роль у кл1тинах раняхх эародк1в костисткх риб. Для досяг-нення поставлено! мэти у робот1 стзвилиоя raxi основш заедания:

1. виявити у кл1тинах зародкхв в'вна, 1золъовааих на стадit nianbo'i бластул/., поя1пептидшш фактор росту а СР£-под1Сною б!о- • Л0Г1ЧН0Ю aKTHBHiOTD та очистит» ного;

2. вивчити $i3iiKO-xiMi4Hi та СЮлог1чк1 власттаост1 ФРФ а юитин аародкгв в'юна.Г пор1вняти i'x з тагами властивостями основного SPS бикз;

3. виявити та охарактеризувати 'специ$1чн1 р&цэягсри 2Р® у кл!тинах зародк1в в'юна.

Наукова новизна роботи. Показано, ар ка1тини' зародив костисто"! риби в'ша, isojacssHl на стзд1'1 п1экьо! Сласгули, шстйтг

фактори росту, як! аа ф1эико-хп»1чяими (шлекулярна маса, спор!д-к9н1сть до гепарину, поведШка л1д чао íohoo6míhhq"í хроматограф!i на колонщ, ааловнен1Й КМ-сефадексом), ¿мунолоНчнши властивос-тями i аа б1олог1чною активнЮтю в!дносяться до родини СРО.

*"- Э клагин paHHix эародк1в риб вид!лений i чаотково очиц&ний СРФ-под10ний фактор росту в kíjükdotí, достатн!й для досипдження йог о вдзотивостей. Вилвлено а начну под Юн icib бЮлоггчних власти-востей ОРФ з кл1тия аародгав в'юна i оФРФ з мазку бика, який ви-кориотовувався ,íhdhwh доел1дниками п!д чао вивчення ыехан!зм1в гндукцП розвитку меаодерми [Slack et al., 1987, 1989; Ruiz 1 Altaba, Weiton, 19893.

В юПтшшх эародк!в в'юна на стад i "i Шзньо! бластули виявле-Hi BJJooKoa}>iKHi спещЦчи! рецептори ФРФ га вивчен1 1х властивоо-Ш.

Шуксшо-практнчне значения робота. Виявлення ФРФ-под1бних фактор!в росту i специф1чних рецептор!в цих ГйР у истинах варод-к1в костисто'! риОи в'юна дозволяе вапролоаувати 'Цей оО'бкт як авьтернативну експершентаяьну модель для вивчення мол&кулярних мвхан1эм!в 1ндукц11 розвитку мезодерми у тварин.

! Отримаа! результат» дозволяют* поширити на представник1в кпаоу ркО ран1ие эрсблен! висновки щодо рол! окремих ПФР як емб-р1онапьних 1ндуктор1в п!д чао процэс!в розвитку у тварин. Врахо-вуоти щ результате, дод1льно подарити на 1нсж хребетних, а мож-ливо 1 на беэхребетних, доол1джекня, скерован! на е'ясування 6io-лог1чыо! рОЛ1 цих ГЮР.

Осмоли! полот пая, up втасятьая на аатаст.

1. Кд1ткни гародк!в в'юна, 1зольовая1 на стад11 п1энъо: Оластули, п1ддаютьоя регуляторному впливу ФРФ-под1бних фактор1в росту, ockíj&kk вони (Летать ц! бЮрагулятори 'i мають 1к специ-(JiuHi рецептори.

2.. С-РФ-под1(Зн1 Фзкгори росту а КД1Т1Ш paHHix зародив в'юна еа ОЮ1МИ ф1зико-х1ь1чя1аш, 1иушлог1шп»ш влаотивоотями га 6io-гог1чнов аклевнЮто в1дпов!даягь оФРФ бика.

Аиробац1я роОотн та пу6л!кацП. Шгер1али дисертацП доповЬ ааляся та обговорювадиоя на радявсько-фхнському сшлоз!уш з Cío-

лог!ï роэвигку (Суздаль, 1991), VI УкраЗнському С1ох1м1чному э'1'эд1 (КиТв, 1992), нарад! "Б1одог1я кл!тини у культур!" (Санкт-Петербург, 1992), конфер'енц1ях молодих вчених, семШарах' "1" зао1данн1 Вчено'1 ради В1дд1лення регулягорних систем кл1тгоги 1яо-' титуту 6ioxiMi) АН Укра1ни. ^

За матер1алами диоертац1йю5 робота опубл1ковано три статтГ та трое rea допоиiдек.

Структура та об* ей робота. Дисертац1я соадэвться ai вступу,

огляду л!тератури, опису матер!ал1в 1 метоД1в, викладу результа-'

■ et'

tíb доол1длеяня та ïx обговорення, висяовк1в 1 списку цитовзно1

лхтератури (235 джерел). Робота викладена на 147 стор1нках друга-"

tí5-я

ваного тексту, 1гострована 23 малюкками га 1 таблицею.

МАТЕРIАЛИ I МЕТ0Д1 ' 'Kiî

Зарод га! в'ша (Misgumus fossílis L.) на 'стадП п1эяьб£п' бластули (9 годин розвитку при 21°С) отримували sa допомогою ме1- ' тоду, эапропонованого Костомаровой та Нейфахом (1964). Клхтийгй" эародкгв вщгяям викориотовуючи'рекомендац! ï Луцкка 1 сп^вавто-piB СЛуцнк та ÍH., 19833.

Для виявлення ФРВ гйд чао його очистки э кл1тин эародк1в 4 в'юна та дослдаення б1олог1чтах власишоотей цього фактора рос- ' ту у poGoTi вккориотовували ембрЮнальн! фюробласти лШи"'-NIH-3T3 1 S'wiss-ЗТЗ muni та клИини лгяп СНО-719, отришн! г»-'г печник!в китайоького хомячка. Boi üiiiii кл1гин отримували з Bce-'j pOOiÜCbKO'í ксл*кц!3 кл1тинних культур Институт цитолог 1 ГРАН, Санкт-Петербург, Роо1я). Культуру'ф1бробласт!в ©mSpíohíb лвдишг1" отримували зг1дно до эагальновиэнало} методики САдамс, 1QS2JV-Кл1тини вирошувалн у оередовиц! ifza, ыодиф!кованому Дульбекко (середовгаце EWE, Flow Lab., Великобритан1я), доновнс-ному 10 t (за -об'емом) сировагки icpoai плод1в ВРХ (Д1алек, В1лорус1я).

ФГО з kjiítkh эародк!в в'юна вид i ляли зг!дно до методу, зал-ропонованого Гооподаровйчем CSospodarcwlcz, 19873. Кл^ткни гомо-генхаували при 4°С у 20 ил л1зисиого роэчкяу (0.01 м ftyí^p- ' Tpío-HCl, рН 7.2; 1 динатр1ева о1ль вгилеядия^нгетрадц^гату ¡ (Serva, ffiPH); 0.6 мМ фен1лмбтилоульфон1лфгорад (S&rva,.ÎPH); 1 wM '•

Сешашдин (Serva, ФРН); 25 мкг/ил алрогшину (Sipna, США); 25 ыкг/ид лешептину (Serva, ФРН)) у приоутност! i М NaCl. Гомогенат центрифугу в ал и прогягом 40 хв ai швцдк1оэт> 20 ООО об/хв на центрифуг! К-24 (Janetzky, Шмеччйяа). Надосадову рХдкну д!ал1эували через мембрану (Serva,. ФРН), яка аагримуе речовини з м.м. понад 3-5 кДа, лроти 0.1 М Na-фосфатного буферу (рН 7,0) протягом 12 год, Щ та ЕС i. подальш! олерацП виконували при 4°С.

Отршаний екотракт кл!тин наносили на колонку, эаповнену КМ-сефадексш С-50 (Pharmacia, Швец1я) i зр!вновалсену 0.1 М Na-фосфатниы буфером (рН 7.0). Незв'яваяяй матер1ад вшивали а колонки 0.15 М NaCl. Зв'яэан! э кат!овсюбм!нником речовини, едоо-вали за догаиогоютрад!внту концентрацП NaCl в!д 0.15 до 0.6 М. Отримаи! фракц!! д1ад!аували через мембрану (3-5 НДа) проти 0.1 U NaCl в 0.01 М тр1с-НС1 буфер! (рН 7.2). Ал!квота кохно! фракц11 .перевЗряаи на адатнЮть послшовати 1нгеноивн!оть включения Е3Н)-тим1дину в ДНК о i тин л1н!1 NIH-3T3 ва умов "íx суСстратза-лежного роогу.

СракцИ, отриман! п!д чао проживания колонки э кат1онооСы!н-нином о.в м NaCl. об*еднували i наносили на колонку, ааповнену гепарин-оефароаою CL-8B (Pnaraaoia, Ивец!н) 1 эр!вновйхену в 0.0Í Ы буфе pi Tpic-HCl (рН 7.2), Ешоц1ю речовин, що сорбувалиоя на колоши , зд!исгаовали га допомогою аросташэго в!д 0.1 М до 3.0 М град!внту концентрацП NaCl. Отриман! фракц!! д1ал!эувади проти 0.1 М NaCl в 0.01 М тр!о-НС1 буфер! (рН 7.2) 1 визначали в них концентрац1ю 5!яку аа допомогою методу Лоур! CLowry et al., 19513. Е1олог1чку активн!сть■ кожной фракцП перев!рялй, викорис-товуючи як тгаот-систеиу кл!тини д!нП HIH-3T3.

ФракцП з ФРФ-под1бною актган!бтю повторно наносили на колонку а гепарин-сефарозою CL-6B. Речовини, щр ав'язувадяса при цьому, вшивали за допомогою отуШнчатого п1двищення концентрацП НаС1 в ©лиовдоыу буфер1 (0.1, 0.6, 1.1, 1.6 1 3 М NaCl в 0.01 М . буфер! тр1о-НС1, рН 7'.2). Отриман! фракцЛ д!ая!зуваяи проти 0.1 U UaCl в 0.С1 М rpio-KCl буфер! СрН 7.2) ! визначали в них кон- ' центрац!ю бИку за допсшгсю методу JIoypi. Вих1д речовин, щр во-лодиэть р1атстицудюочою активц!сяо, конгродювали, як описано ви-

- Б -

ще.

Електрофоретичне досл1дження отриманого препарату ФРФ в'юна проводили на пластинах пол!акрллалйДЮго гелю (ПААГ, градиент концентрацП акрилам!ду 10-18 X) у присутност! додецилсульфату натр!ю (ДЦС-Na) зг!дно до методу, запропонованога Леши! CLaenmli, 1970]. Б!лков1 фракцН виядляли шляхом íx фарбуваяь'я KyMacci яскраво-Олакитним R-250 (Serva, SPH) эпдно до методу EZehr et al., 1989].

Рютстимулюючу активн!сть препарату ФРФ в'пна досл!джували, . вккористовуючи псевдонормальн! фхбробласти л!н!й Sviiss-ЗТЗ, NIH-3T3 та ф1бробласти ембр!он!в лпдкки за умов моношарово! куль-тури [Brtgstock et al., 1990'; Kaplow et al., 1990]. 1нтенсивн1сть субстратнеэалежнo'i пролафэрац!'! кл1тин л1н11 СНО-719 э ябчш;к1в кэтайського хом'ячка, стимулювало! доол1дкуваякм фактором росту, вкзначали за К1льи!ств утворених ними колоний у нап!вр!дшду культурамному середовид!, щр míctoio 0.33 X агару CRizziro, 1987].

1муно-дот-реакц11 í V.'estern-blot-a-iaiía препарату ФРФ в'юна зд!йсшавали» як описано ЕТсанр и др., 19883. Препарат основного ФРФ э мазку бика i палЛклоналън! антиПлз проти цього фактора росту ж&'язно надан! О. О.Рзряввям i I.А.Ф1латовкм (НЩ мэдичяо! бЮтехнологИ ЮЗР, Рос!я).

Отримання цитозолю кл1тин jíhí'í Swiss-ЗТЗ та визначення йк-tasHocrí Se-Kinasa зд1йсшовали, як описано [Pelech et al., 1986, . Дробот та 1н., 1989]. '

Вплив досл!ддуваних фактор1в -на транспорт Сз21" у кд!ткни вивчаяи за допомагоо аагальнозизнаксго методу CGcnsales efc'al., _ 1989].

Доол1джэння эдатност! ФРФ э клхтин зародк1в в'юна конкурувз-ти з [1гБП-оФРФ эа зв'язування э високоафгнними мэмбрзлними рецепторами ЭД1ЙСНЮВЗЛИ, ВИКОрИСТОВУ»чи wiltkhvi sihí'i Swlss-ЗТЗ [Lee et al., 1989].

Для визначення спец!!ф!чного зв'яэуваная. С1гг;П-оСГФ кл1ттги (2х105 на пробу) з'йродк!э в'шз, 1зольоезн1 на стадИ níi'Hioi бластули, 1нку6увалк у приоутноот! еростаючих кснц.гнгрп.чгй

■СтП-сФРФ протягоы 4-х год при -4°С у роэчин! Стейнберга, який Mioinfl О.Б 7. БОА. Шелл эак!нчення 1нкубац11 клИини проминали 600 мкл роэчину СтейнСерга э 0.5 % БСА. Л1ганд, эв'яэании веспе-циф1чяими гепаринопод1Стши центрами, видадяли 1яку0уванням кл1-тии протягом 1 хв у pcsumii СтейнСерга э додававши гепарину (250 мкг/ил) i проышшшям у двох ем1нах .роэчину Стейнберга в БСА. Ра-д1оактивк!оть в отршаних пробах вюЛрввали на г-л1чкльнику "Сотри Gamma" (LKB, ШеЩя). Неспецифгчне ва'язування виэначали як KijibKiOTb t^n-oCSP®, екстрагованого п!сля гепариновой еко-тракцП 1 7. роэчиноы Тритону Х-100 а кл1тин, що 1нкубувалися у присутноот! 100-кратного надлшку неы1ченого оФРФ. Розрахунок к!лькоог1 центр1в ав'яэування ФРФ i Kd для рецепгоргв цього фактора рооту эдШковали вПдно до методу Скетчарда [Soatchard, 19493.

Boi досл1ди поаторавади не шиае 2-4 pasiB a S-4 паралельнн-ыи екопериментами у кемшоыу вар1анг1. Кояша точка граф1к1в, наве-дених на риоунках, аа ордината г!отограм в1дпов!дав середньому значению М. Середн» похибку т отриманого результату вираховуваяк ва величиною с&редньо! квадратично! похибки б. Прр1вняння двох Шнливях величин ад1йскювали на п!дстав1 покагника в!рог1дност1 р1вн!щ1 t (критер1й Ст'вдевта).,В1ды1нн1оть м!ж величинами ввана-' ли досгов1рною, коли Р<0.05.

РЕЗШТАГИ Д0СЛ1ДНЕНЬ ТА IX 0БГ030РЕНШ

Результат» дойл1джень, проведения а викорисгашшы ранн!Х ва-родк!в ац51б1й, ов!дчать про, ыожлзшу учаоть CPS) у регуляц!'! про-ueciB ем5р1оналъкого розвитку, вокреыа в 1ндукцИ утворейня третього эародкового лютка - ыэзодерия tKlmelmsn, Kirschner, 1В87, 1938; Slack et в!., 1987, ' 1989} Woodiand, Jones, 1988; Uusci et al., 1S903. В яйцзкд1тшах га шбр1овах ш&1б1й 1 птах!в аа допомогоэ антиПл до основного СР£> буди вияхшея! . пол1пептвдн, под1Сн! до GFO st el., 1988; Joseph-Silverstein et al.,

10393.. У л!тераг/р1 e »mos дгш}. про бкопрго1ю «РНК рецептор1в ФРЭ у шцтанах oüöpioais taapim цих кдзо1б ClAisol et al., 1990; Amaya et al., 1891} Olein et al., 19913. Одпак, ш не знайшли ро-

61т, у яких вивчалася присутн1сть ФРФ-под1биих файтор!в росту та ïx рецептор!в у ембр!онах ркб. Кр!м того, б1олог!чн! вяаотивоот! цих фактор!в росту та характеристики ïxnix рецептор1в не досд!д-жувалкоя i у эародках амф1б1и.

1. Внявяекня та очистка ffiPS а кл1тга зарадЦа в'гаи

Вотановлено, що 1 M MaCl в 0.01 M Tpic-HCl буфер! (рН 7.2} екотрагуе з кл!тин зародк1в в'она речовини, тр сгимулиоть синтез ДНК у ф!Сробластах jíhíü NIH-3T3 i Swíss-ЗТЗ, а такод. в et.eplo-' налышх фЮроблаотах додини у первинн1й культур! (рис. 1). Щ ' imíthhhí лшП викориотовувалзюя Сагатьма досл1дника1Д1 пк тест-система для вияаленяя б!олог1чно! активносг1 ФРФ [Rudland et al., 1974; Kaibuch! et al., 1988; Presta et al., 1988; Shipley et al., 1989; Brigstock et al., 1990; Story, 1991]. OcKiJîbra в наша умо-вах найчутлив1шими до д!1 ФВ5 виявилися tori тети л!н11 NIH-3T3 (рио. 1), то ми використовували саме ïx як тест-тетей/ для выявления СРВ в'юна Шд чао його очиотки з екотракту кл1тин аародк1в в'юна.

'Фракц!ояувазня эгадаяого екотракту на колокц!, запавнен!й кат!онообм1нником КМ-сефадекс, виявшзо два п!ки елюцП рвчовин, здатних лосилювати !нтенсивн!отъ биосинтезу ДНК у шитинах л!нП NIH-3T3 (рио. 2). Перший niK спостер!гаеться при низьких концент-рац!ях NaCl (0.2 M), коли э колонки вишгаагться б!льш!сть б!ж!в екотракту. Речовини другого п!ку водод1ЮТь б!лыа н1ж у 2 рази ви-щон MirorsHHO» atcTHBüicTD 1 вимиваються а колонки при 0.6 M NaCl. Необх1дно в!дэначити, ар лодК5н! за характером профш елюцП. Оу-ли отриман! iwamm дося1дниками, ' як1 використовували кат!оносб-míнну хроматограф!» п!д час очистки фзкгор!в росту, щр належать . до родини ara CGospodarayícz, 1987; Thomas, 1SS7; Brlgstock et al., 19903. ЗПдно до ïx даяих, ФРО елеввтьоя при 0.6 M NaCl. Ви-ходячи a цик результат!в, ми в!д1брали для подалыпо1 очистки речовини, шр волод!ди найвищоо опор1днен1стп до гранул КМ-сефад?к-оу.

Одн!ею з характерних особливостей фзхтор!в росту, що належать до родини ®РФ, _е" ïx висока спор!днея!сть до .гепарину CShlr.fi et al., 1984; Vlodavsky et al., 19873. Тому загальяоаиэ'йагии из-

- в -

20 +0 60 во cíeok, икг/ил

Рис. 1. Вплив речовин, щр екстрагуються э кя!тян эародк1в в'юна 1 Ы роэчином MaCl у O.Ol M Tpic-HCl буфер! (pH 7.1), на включения [3Н)-тим1дину в ДНК кл1тин л!н!й NIH-3T3 (©), Swiss-ЗТЗ (•) i вмбр!онадьних ф!Сроблаот1в ладнни (*■).

1С0 150 .200 250 300 оС'ем Оуфэру елюц!!, цд

0.6

0.4 ¡

V/ 2

0.2 о"

0.0

350 «

Рис.' 2. Хроиатогрэф1чне фракц1окування б!лк1в, екотрагованих a (Штин зародк!в в'юна 1 U HaCl, на кодонц!, ааповнен!й катiоно-oSmíkhhkqm КМ-сефадекоои (заштрихована облаоть в!длоа1дае фракц!-йм, а!д!0ранйы для подалако! очистки)

•годом вид1леяня та очистки цих фактор i в е аф1нна хроматограф!« иа ноо1ях, щр м1отять ковалентяо вв'яванки гепарин CGospodarowlcz et al., 1984; Gaspodarowicz, 1987J. Для очистки ¡ÍP3 в'юна ми шпсо-риотовували хроматограф!ю на колонц!, ззловнен!й гепарин-оэфаро-эою CL-6B (риа. 3). Встаяовлено, що певнои б!сшог!чноп активнЮпз волод1ють речовини, як! не опор1днен! до гепарину або слабо эв'я-зуються ним. Сднак, 01льи1сть речовин, здатних поотшзвати 1нтен-ciiBHicTb вшктення С3НЬтим1Дину в ДНК кл!тин л1н!1 NIH-3T3; зв'яэуетьоя гранулами гепарин-сефзрози i вимивазться з колояю! . п!д чао елоцИ роэчиноы 1-2 М NaCl (рис. 3).

3 метою кравдн очистки та концентрування препарату CPS в'юна эд!йснювали повторну хроматограф!» фракц!й, як1 Сули В1д1бран1 э колонки, заповнено! гепарин-сефарозою (рис. 4). Елюц!п рочавин, зв'язаних з гепарином,.проводили за допомогои ступ!нчатого ^движения конце нтрацП MaCl. ' Б!лып1сть речовин, здатних посилювати !нтенсивн10ть включения С3НЗ-тим1дину в ДНК кл1тин л!н1! NIH-3T3, вимиваеться а колонки еяиоючим буфером при концентрадП NaCl б!льтй за 1 М. .0ск1льки найвищою м!тогеняоо акгивн1стю волод!ли речовини, що вимивалися при 1.1 М NaCl, то ми вибрали сама up хроматограЯпчну фракц!» для наступного вивчення б1олог1чних влас' тшз остей (DPS э кя!тин зародк!в в'она.

Електрофоретичяе досл1дження отриыаного нами препарату ФР® в'юна в ПААГ у присутност! ДДС-Na показало, що переважна eviniera б!лк!в, приоутн1х у препарат!, м1грують у зон1 61лк1в -в м.м. 15-16 кДа (рио. б). Викориотовуючи Vest em- blot-анал!з, ми встановили, що самэ з цими С!лками-специф1чно взаемод!ють антит!-ла протк основного ФРФ з мозку бика (рио. 8). За даяими л!терату-, ри м.м. ФРЭ ссавц1в коливавться в межах в1д 14 до 18.Б кДа CGospodarowloz et al., 1970, 1984, 1987; Esch et al., lSS5b; Gímene2-Gallego et al., 1985; Klagsbrun et al., 1987a),

Щоб перев1рити, чи в отриманому нами препарат! 4PS в'сна мЮтяться речовини з ОЮлоПчною активн1стю, в!дм!ннсю В1Д зктив-ност1 ФРФ, ми використали пол!клояадьн1 антит1ла проти оФРЗ з мозку бика. Всганойлено, що ц! аягит!ла в кшцвнграцИ ZOO мкг/мл noBHlóTD пригн!чуюгь оянтез ДНК, !ндукованкй оФРФ з мозку бика, у

1.6-1 1.4 _ 1.2

ч—1 2

50 100 150 200 об'ем буферу елюцП, мл

2 50

Рио. 3. Кроиатограф1чна очистка СРФ а юптин зародкАв в'юна •наколонц1, ааповненХй гепарик-сефароаоа (заштрихована область в1дпов1дае фракц1яи, в!д1брашш для подалыга! очиотки)

70

ео

0 50

» Я X 40

30

£ 20

ч

о . 10

.0

1

1

Д,

1

0,1

0.6 1.1 Ы ЫаС1

1.0

п 'о

я X

ж

п

Рио. 4. Вялив яа включения С3НЗ-пш1дину в ДНК кл1тин л1н11 ШН-ЗТЗ САлкдв, вр едксютьоя при р1ених концентрациях МаС1 в колонки, ваповквно} гегзрия-сефароаоп.

истинах Л1НП М1Н-ЗТЗ (рш. 7,а). Гаага самий ефекг викликало додавання 300 мкг/мл антит1л проти оФРФ з мозку бика до середови-ща, в якоиу 1нкубуЕалися юптики ц1е'1 л1н11, стимульовая! СТО в'юна (рис. 7,6). Ц1 результат« дозволять ствердхувзти, що отри-мзннй нами препарат ФРФ в'юна виявлле лише ФРФ-под1бну рХстстиму-лгаочу, активнЮть, а присутн! в ньому домИлки гнших <51лк1В не впливають на цю активность.

ЩоО п!дтвердити полШептидну природу ФРФ в'юна, дослгдтенб чутлив1сть цього фактора рооту до нагр1вашга 1 д±1 трипсину. Ял видно з даяих, наведених на рио. 8, оФРФ з мозку бика \ ФРФ в'юна втрачають свою рЮтстимулюючу активн!сть цодо кд!тш Д1н11 ШН-ЗТЗ Шсля обробки лреларат!в «их факторов росту трипсином <0. Б мкг/мл) чи 1нкубацП протягом 10 хв при 70°С. Щ дан1 св!д-чать про те, що ФРФ в'юна, так само як 1 ФРЗ> ссавадв, б термода-бгльним пол1пептидом.

Щкаво в1дэначити, що гепарин, да якого фактори росту з ро-дини ФРФ виявляють високу спор1днен1сть, практично не впливзе па матогенну активн1оть о<2РФ а мозку'Сика, але майжв у В раз!в поои-люв таку активнЮть ФРФ в'юна (рис. 9). Кр1м того, у присутност1 гепарину зростае от1йк!отъ ФР5 в'юна та оФРФ а мояку бика до наг-ргвання. Так, нагргвання препаратов цнх фзктор1в росту протягом .10 хв при 70°С у присутност1 гепарину майже не эменауе 1х б!оло-г1чн01 октибност! (рис. 9).

Таким чином, нами впераэ показано, цо кл1тпни зародк1в в'юна м1стять 01орегулятори з ФРФ-под1бною б1олог1чноо ают!вн1сто. За 1мунолог1чнкми та деякими ф1зкко-Х1м1чнкми властивестями щ фак-тори росту подгбн! до основного ФРФ ССЗВЦ1В.

2. Вявчения бгсшлччннх вллспаотстсй СРФ з кл!тин зарода1я

в'шнэ

У наступили сер 11 екслеряменпв ми досл!дили деяк! 01ааог1ч-н1 властивост! СРФ в'юна а пор1 вняли ¡1х г тамши властивостямя оФРФ з мозку бика. 3 Даних, йаводенях на рис. Ю, видно, яо в'юна мае дещо нилчу, н!ж ойЧ> з мозку бика, м1тсгеяну актшшсгь щодо юИткн М1Н-ЗТЭ, 3»11з5-ЗТЗ та ф1броблаот1в шСрюи!к

людили. МэксималЬае стимудиваши гключэяяя £3Шг ДКК

С га¿¡г

6 М.М.КДА

Г—

:Л • 94

— 67

— 43

— 30

20Л 14.4

/

©12 3 4

Рио. 5. Електрофоретичне ровдыення на пластинах ПААГ у при-сутност! ДДС-Ма б!лкДв фракц1й, отриманих пХд час елюцП колонки, ааповнено! гапарин-сефарозою, 1.1 М НаС1 (дорДжка 11 1), 1.6 М N301 (дор1жка К 2) \ препарату оФРО а мозку бика (дорХжка N 3) Дор1ака N 4 - на01р б1лк1в-иаркер{в

Стьрт -«Й,КДД

—94 •

—67 —43

—50

_20

в'ша-—- «¿г» —--оФРФ

«23 •'..'

Рио. б, Иэз1егп-Ыо1-анал1з б1лкав фракц1й, отриманих п1д • чао влщ11 колонки, еаповнено! гапзрия-сефароаою, 1.1 М Иа01 (до-р!яка Я 1), 1.6 М МаС1 (дор1жкэ Н 2)1 препарату оФРЗ э мозку бика (дор!дка ИЗ). .

й, мкг/мл I? В, икг/ип

Рио. 7. Вшшв пол1каоаальннх гштит!д до оФРФ в ыозку бика на 1лтенсизн!сть включения [3Ш-тгаЛднну в ДНК гел!тш л!н13 ШИ-ЗТЗ, ар стииулювалиоя: А) оФР® з шзку бика; Б) ФР® в'ша

в - у приоутноот! специф!чних аятит!л до оФРЕ; о - у приоут-

Рио. 8. Вшшв тршгонну 1 нагр!вання (70°С, 10 хв) на адат-н!сть оЕРО (10 нг/ыл) 1 ФР® в'она (Б ыкг/мл) Шдвицузати 1нтен-сивн!оть включения С3Н]-тим1дияу в ДНК кл1тин л1нП ШН-ЗТЗ ' 1 - нативн! фактора росту; 2 - фактори росту, оброблен1 трипои-пои; 3 - фактори росту п1оля прогр1ваняя;

ЕШ5 - оФРФ э моаку бика; Б323 - АР® в'юяа; I-1 - у в1доутноот1

фактор!в росту

- 14 - 1

кл1тин п!д д!шо ФРФ в'юна було у 2.6-3 раэи нижчим вхд того, шр спостерзгалося п1д чао д!ï оФРФ. У той самая чао Д1я ФРФ в'юна, як 1 оФРФ, е доэозалежною i досягав насичення при концентрат Ï препарату Б мкг/мл у випадку використання ил iтин л1н!й N1H-3T3 1 Swlss-ЗТЗ 1 1 мкг/мл л!д чао лого дН на фЮроОласти ембр1он1а людини.

У лхтератур! б дат, шр кр!м сткмуляцП оинтезу ДНК у кл!ти-нах-мшенях, оФРФ такая може посилювати суботратнезалежну прал1-ферацш псевдонормам шк кл1тин лхн1Й AKR-2B, NR-6-R i диференц!-йованих хондроцнт1в [Rizzlno, Ruff, 1986; Kato et al., 1987; Takahashi et al. , 1991]. Ми внявили, шр оФРФ з мозку Сипа i СЕРО в'юна 1ндукують утворешш колон!й кл!тиками л!н1'1 CHQ-719 Шд час 1нкуСуван![л цих кд!тш за ушв кап!вр1дкаго культурального сере-доргааэ, пр Mlcïiuio О.ЗЗХ агару. Максимальна кьтькгсть колоний, утворених цими кп!тиками, опостерДгалаояу присутност1 5 нг/мл оФРФ 1 б ыкг/мл препарату ФРВ в'юна (рис. 11). Таким чином, KpiM MiToremoï дП на юитини-мшен!, ФРФ в'ша викликав ще й феноти-щчну трансформац!ю таких клгтин.

Важлив! докази под!вност1. б!олог!чних влаотивостей оФРФ i ФРФ в'юна були отриманх п!д час вивчення впливу цих фзктор!в росту на переб!г деяких метаболхчкж itpoueciB у клтшах. В1домо, до кр1м вшшву на прол!фврац!ю кл!тин-м!шен8Й, фзктори росту а роди-ни ФРФ !ндукуать ряд bmîh у метабол!3mi кл!тин CKaibuchi et al., 1S86; Bouche et al., 1987; Gospodarowioz et al., 1987; Whice et al., 1987; Burgess, Maoiag, 1989; Rifkin, Moscatelli, 19893. Ц1 ефекти оО'еднують терм!ном шсжинна (плейотропна) в1дповхдь кл1-тини CRudland et al., 1974; Cross, Dexter, 19911.

Важливиы регуляторниы механ!змом, який запускае швкдккй синтез нових шИтинних бЬж!в, iндуковании ШР, е фосфорилювання ри-босональиого б1лку S6 CPelech et al., 1S88; ДроСот и др., 1989]. Як видно з рис. 12, у цитоэольн!й фракцП клгтйк л!нП SkIss-ЗТЗ, 1цр перебувалн у фаз! Go, практично не виявляеться актива!сть к!-нази 01.-асу S5. Однак, п!сля обрсСки цих кд1ткн сФРЗ з мозку бика, ОРФ в'юна, ешдермалыпш фактором росту -та, особлив о, 10 X оиро-ватта кров! ЕРХ актива!сть £8-к1нааи аначно.apooras. Сл!д в!д-

о 400-

о /

тн Л50-

300-

X

§ чН 250-

200-

ч 150-

1=Г

•г» 100-

1 50-

го 0^

1

1 -2 3

Рйо. 9. Впдив гепарину на б!олог1чну активнЮть оФРЭ (10 нг/ил) I ФРЗ> в'вна (5 мкг/ил)

1 - натаян! факгори росту; 2 - у приоутност! гепарину; 3 - Шелл прогр1вання у приоутноот1 гепарину

ЕЗЗ — оФРФ а мозку бика; ИЕЯ - в'юна; СПЗ. - у вхдоутноот1 фактор!в росту

100

0.2

0.1 1.0 10.0100

1.0

. 0.1 1.0 10.0 1С0

о 4>{")>»г/лл О-О

10.0 0.2 1.0 10.0 еГО в'юна, цкг/мл в-°

1,0 10.0 100

0.2

1.0

10.С

Рис. 10. Вплив СРВ в'юнз (о) 1 оФРЭ з мозку бика (о) на 1Н-теисивнЮть включения . С3НЗ-тищдину у ДНК кл1твя: А)лШя ШН-ЗТЭ; В) Л1нЗя 51»1Э5-ЗТЗ; В) ф'1Сроблаоти ембр1онз людини

-16 - ^ аначити, шр активнЮть Цього ферменгу у клгтинах, стимульованих ФРФ в*юна i оФРФ з моэку Снка, s ыайхэ однаковою, 1 отановить пркОлизно БО X в1д активяост!, up crrocxepirasTbca п!д чао д11 пи-рогатки кров!. Наведен! результата вказують на те, щр ФРФ в'юна 1 сФРО э моэку бика можуть под!бно регудювати активн1оть б!лок-син-теэуючого апарагу кл!тин-м!шеней.

Ваштивими внутр1шгьокл1тиннйми госередникаии у передач! ре-гуляторного сигналу в1д рецептор!в, аайнятих гормоном або пол1-пеггеиднш фактором росту, до вкутр^пньоыитшших ефекторних систем в !они кадьц!ю СТеппермен, Тепяермен, 1S89]. Ми доел!дои вгшга оФРФ i ФРФ в'юна на ввидкхоть транспорту Са2'*' у кл1тини. Вотановлено, кр ФРФ в'юна виюшкае значне посилення транспорту [45Саг+1 у ф!броблаоти л!н!1 NIH-3T3 (риот 13). Цей ефект, так само як i ефект, викликаний д1ею оФИ>, характеригувться дезозалеж-HioTD' 1 наоичуван!отю. Динам1ва пронгаснення Саг+ у кл!тини, на як! д!яли ФРФ в'юна, 6 под!Снов до динам!ки проникнення цих ioHiB, щр опоотер1галаоя при викориотанн! оФРФ э мозку бика '(рио. 1.4). Проте максималъний^ефект п!д чао дП ФРФ в'юна виявлябться дещр niaalme, Hi* при дП сСРФ - через 60 хв у першому випадку ! через 30 хв у другому.

■ На п1дотав! результатов цього фрагменту дослхджень ми ароби-ли висновок, • що за б!олог!чноо акгивнгсто ФРФ з кл!тин зародк!в в'юна под1бний до о&РФ э моэку бика. Цей висновок е важливиы, ос-к!льки у бШ>шЬот! роб!т по досшдхенно андукцН роэвитку меэо-, дерми викориоТовували сане оФРВ ссавц!в CSlaok et al., 1987; Ruiz . < i Altaba, Mstlton, 19S0; Slack et al., 19891.

3. Вилалешш та доал1дюння апецм$1чша! рецепторiBfiP® у кл1таиах зародаis в'юна Мета наотупного етапу наш! роботи полягада у виявленн1 спе-цкф!чник penenropiB ФРВ у кд!тинах зародк1в в'пна, !зольованих на отадИ п!зньо1 блаотули. 3 даних, наведених на рио. 15, видно, шр : ФРФ э кл!тин эародк!в'в'юна конкуруе э [1г5П-оОРЗ> за зв'язування з рецепторами остаанього на поверхн! кл1тин Л1нп Swiss-ЗТЗ.• Це яёредбачае тюд1бн1оть будови рецептор-эв'яэуючих домен!в обох фактор!в росту i ыоллив1сть використання ними сп!льких високоспе-

ОФРФ, НГ/МЛ о—о 0.01 0.10 1.00 10.00

1.0 • 10.0 0Р2 в'юна, мкг/мл'

Рио. 11. Валив ФРФ в'юна (•) 1 сФРФ э ыоэку бика "(о) на 1н-теноивн1сть суботрзтнезалежно! прол1ферзц11 кл!тин Л1н14 СНО-719

° 1 2345(2345

■ Рио. 12. Вплив 10 нг/мл оФРФ (2), 5 мет/мл ФРФ в'юна (3), 10 нг/«л ЕФР (4) 1 10 7. сироватки кров1 пдод!в ВРХ (5) на актйвйоть к1каэи б1лгсу 36 в ¡штинах л1нИ Э»1§3-ЗТЗ 1 - при в1даутност1 фактор1в росту

Рио. 13. Вшшв оФРФ (•) 1 ФРФ в'юна (о) на 1нтенаивн1оть транспорту 45Саг+ у кл1т!гни л!нП ШН-ЗТЗ . ю - при в17ругнсют1 фактор1в рооту"

Рио. 14. Вшшв тривалост^ 1НкубацП кд1тин л1Ш М1К-ЗТЗ з оФРФ (10 нг/ил, ) 1 ФРФ в'ша (Б ыкг/мд, ) на 1нтеноивн1сть транспорту 45Са2+ у ц1 кл1тини.

I 10 100 1000 нг/мл

Рио. 15. Зв'яэуаання С1г513-оФРФ з моэку бикз э! специф1чни-ш рецепторами кл1тии Л1н11 5И1зб-ЗТЗ у приоутност!-' нем!ченого оФРЭ з мозку Сика (в) 1 ФРЭ в'юна (о)

- 19 -

циф!чних рецептор!в кд1тия-ы1теией.

Встановлено, щр кл!тшш зародк1в в'юна також здатн1 специ-ф!чно зв'язувати С12б1]-оФРЭ (рко. 1В). Нашченна центр!в зв'язу-ваиня ФВВ цих кл!тия дооягаеться при концентрацП рад!оактивно м1ч0ного фактора росту, р1вн!й 15 лМ у розрахунку на 10® кл1тин. Це а!дпов1дае данкм, як! були отрнман! при под!бяому даол1дженн1 кд!тин зародк1в амф!С1й X.laevls CSlaok et al., 19893. У приоутност 1 100-кратяого надлншку неученого оФР® 8в'язування С12313-оФР® кл! тинами зародк1в в'юна практично в!дсутнв, щр сз!д-чить про нпсоку опециф!чя!сть центр!в зв'язувати ФРФ.

Граф!к, побудозаяий у координатах Схэгчарда .па Шдстав! цих дшшх, вказуе на 1сяуваяня из поверхМ Штин зародк1в в'юа одного кдасу в;1сок0гф!пш« ценгр!в гв'яеусзшя (ряс. 17). KIzhkIots таких центр!в становись прибдлгко 83 гно. у розрахунку на одну кл1тину зародкз. Це з1дпов!даз )йльшзт1 рэцептор!в ФРЭ у плазма-тпчних мембранах норыалыпи кд1гин ссавц1в, дэ у валекност! в1д типу кл1тини иарахоауеться 20-100 тио. рецептер1в ФРФ на кл1тину CGospodarowicz et al., 1987; Burgess, f.fsoisj, 1980J.

Уявна константа дисоц!ац!1 (ВД для взаемодИ щи рэцептор1в з о$РЯ> стаяовить 1.2 кМ. Ця величина дойр nepennays значения. Kd. розраховане для висюкоаф1нних рецехгтор1в Ш5 кл1т;т есавц!в. Так, показано, що nifl чао взаеыодП таких рецептор!а в юкдаы ФРО !х Ка становить БО-БОО пМ, а п!д чао взаЕШдП 3 оФРЭ - 20-200 пМ tSchreiber at al., 1985; Кал et al., 1S88j Kurokawa et al.,1089; Mansscn et al., 13893. Вхдносяо низьку спор!днен1оть до л1гапду р®цептор1а ФРФ кл1тин ззродк!в в'сна нгата пояснити отруктуршши особливостяш! цих рецептор!в у пор1вняий1 8 рецепторами ®Р® у tuiTimax ссавц1в. Ц1 осоСливоот! иовуяь вумовлявати в ищу спор!д-нен!оть в1дпов!дних рецептор1в кл!иш зародк!й в'юна по в!дйошн-!Ю до ендогепних СР»-под1бши фактор1в рооту, як це було показано ран1шэ для ЕЙР-подЮяих пол11Гбптад1й (Mesieno st al., 19853.

На п1дстав1 отришних ревудьтаг1в цожна зробити висновок, до 1сл1т1Шн зародк1в в'юпа на отад11 nisaiol Оластули мЮтять ФРФ-по-д!бн! фактор« рооту, та високо£$1нн! рецэптори, здатн1 еа'язувати Щ фактора. Отяе, у кл!тгаш зароди!п в'юна !онув регуляторна

РИО. 18.':

5 10 15

[1г533-оФРФ, кМоль

10 15 20 25 J0

125-

ав'язанкп С 13-ойРФ. Рис 17 ! вМоль/гхЮ^ КЛ1ТИН

го о

Рис. 18. А. Спедаф1чне зв'язування с12513-оФРФ кд!тинами вародгав в'юна; Б. 1нП0ування зв'язування С1£5П-оФРФ кл i тинами зародк1в в'юна у присутност! (■+) 100-крахного надлгапку нем!ченого сФГФ

Рис. 17Граф1к Скетчарда для даних, отриманих п1д час досл1дження специф1ч-ного зв'язування [12511-оФРФ котиками зародк1в в'юна

-л

сиотема, у як!й эад1яний ФР8>, 1 ця система ноже пргашата участь у контрол! процес18,/що в1дСуваиъся п1д чао еьйр1 опального розвит-ку риб.

Ключова роль фактор1ъ росту 9 родини ФРФ у продесах 1ндукц11 утворення ыезодерми була вперпе виявлена п1д чао вивчевяя молеку-лярних иехан18м!в регулядИ еибр1онального розвитку аиф!б!й Х.1аву1з СБ1аск еЬ а1., 19871. Эг!дно до трисигяальНо! модел1 1н-дукц11 утворення меэодерми, ц! фзктори росту забезпечують виник-нення вентрального сигналу ГХ1тпе1шап, К1Г5оЬпег, 1988; МаиПапй, Лопеэ, 19883. Можна припуотяти, щр ФРФ виковуе под1бну роль 1 в процесах 1ндукц11 утворення ыеэодерми в ембр!он1в риб." На користь такого припущення ов1дчать такоя дан1 про виявлення у. зародках в'вна на ранн1х стад1ях розвитку фактор1а росту а ввастивоотямя ТФР-8 СФедишин та 1н., -10903. Ботановлево, щр ТФР-&2 прийиав учаоть.у форнувавн! дорэального сигналу п1д чао 1ндукц12 утворення мезодерми в ембрЮнах У. 1аеу1з ГК1те1вш, ИгесЬпег, 19873. Отжв, отриман1 нами результата ов1дчать про те, щр ФРФ-под1бн1 фактори росту можуть в1д1гравати важляву роль у регудяцЛ проце-о1в розвитку ембр!ов1в не лише амф1б!й, птах1в 1 ооавц!в, ала й коотиотих риб.

ВИСНОЕКЙ

1. Юптини зародкхв koothctoï риби в'юна (Misgumus fossills L.), 130люван1 на стадП nismoï блзотули, М1стять фактор (и) рооту, под1бню"! до ФРФ. Дей фактор(и) вщглено га чао г/сов о очищено. Його б1олог1чка активн1оть 1нг16уегься слецифхчкими алтит1ла-ми проти оФРФ э моэку бика.

2. За М1тогенною активн1спо ФРФ в'юна под1бний до оФРФ э моэку бккз. Bîh доэоэалежно стимулюв включения [3Н)-тш1дину в ДНК ф!бробласт1в лШй NIH-3T3, Swiss-ЗТЗ та ф1бробласт1в ембрЮ-hîb людини.

3. ФРФ в'юна i оФРФ викликають год!бн1 smîhh у метабол!зм1 кл1тш-м1Ееней: сткмулиоть транспорт Юн1в Caz+ у кл1тини, поси-люють поглинання кл1тинаш глюкоэи, 1ндукують зростання активнос-т1 S6-KiHa3H у кл1тияэх.

4. ТФР-8 iHriCys оуботратнезалежний1 piCT . кл!тин л!нП СНО-719, хндукоЕанм"! ФРФ э bwiiTHii зародк!в в'юна або оФРФэ.мозку бика. 1нсул1н, навпаки, поошаое такт pic? клхтин л1нП СНО-719, г'кдукованкн ФРФ в'юна, або оФРФ бика.

5. Гепарин не лише п!двиЕуе здатк1сть ФРФ в'юна стимулювати бгооинтеэ ДНК у KiiTiraax-мЮенях, але й еахшцзе цей фактор росту в1д тепловс'1 1нактивацП.

д. ФРФ з юитга зародк!в в'юна викориотовуе сп!льнх э оФРФ ссавц!в спецкф!чн1 рецептор» raiтин ссавц1в.

7. Кл1тини зародк1в в'вна, 1?ольобзн1 на стадп п1аньо! бластули, спецкф!чно зв'язують [125И-оФРФ. Анал1з, проведений э використанням координат Скетчарда, вказуе на Юнування одного клаоу центр!в зв'яэувзння ФРФ у к1лькост1 8.3х104 на кл!пжу при KJ 1.2 HM.

. 8. ОРФ ад!йонве рег/дягорн! функцП п!д час ембр1онаш>ного РОЭВИТКУ КОСТИСТПХ рИб, ОСКШКИ КЛ1ТИНИ ÏXHÎX ЗЗрОДК1В м1стягь цей фактор росту та його специф1чя1 рецептори.

СПИСОК РОБ1Т, ОПУБЛ1КОВАНИХ ПО ТЕШ ДИСЕРТАЦ11

1. Stoika R.S., Sushel'nitskii S.I., Yakimovich I.А., Fedishin Ya.Ya., Kusen* S.I. The factors with the properties of transforming growth factor-9 and fibroblast growth factor in the early loach embryos // Abstr. Soviet-Finnish Symposium on Developmental • Biology "Signal molecules and cell differentiation", Suzdal' (1991). - Онтогенез. -1991. - т.22, N 4. - о.407.

2. Якимович I.А., Стойка Р.С., Кусень С.И. Виявлення та характеристика речовин з властивостями фактора росту ф1бробласт!в у кл!тинах зародк1в костисто! риби в'юнз // VI Укра1нсъкш1 Gicxi-Mi4HHii з'"1эд. Теаи допов1дей. 4.1. - Шв.: УСТА, 1992. - с.236.

" 3. Якимович И.А., Стоика Р,С. Изучение биологических свойств фактора роста фиСроблаатов из клеток зародышей костистой рыбы вьюна // Тезисы совещания "Биологш клетки в культуре", Санкт-Петербург (1992). - Цитология. - 1992. - т.34, N 9. - с. 122-123.

4. ЯкимовичИ.А., Стойка Р.С., Кусень С.И. Выявление и характеристика веществ со свойствами фактора роста фибробластов в клетках зародышей выояа // Онтогенез. - 1992. - т.22, N 3. -0.237-241.

б. ЯкимовичИ.А., Стойка P.O., Кусень СЛ. Влияние основного фактора роста фибробластов и его сочетаний о трансформирующим фактором роста типа з и инсулином на субатраг-независимую пролиферацию клеток линии СНО-719 из яичников китайского хомячка // Экспериментальная онкология. - 1993. - т.15, N 4. - с.69-61.

в. Сушельницкий С.И., ЯкимовичИ.А., Стойка Р.С., Кусень С.И. Синергизм стимулирующего влияния трансформирующего фактора роста 3 и инсулина на субстратнезависимую пролиферацию клеток линии СНО-719 // Цитология. - 1993. - т.35, N 8. - Q.47-51. '

ВЫЯВЛЕНИЕ, ОЧИСТКА И БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА

ФАКТОРА РОСТА ФИБРОЕЛАСТОВ 113 КЛЕТОК ЗАРОДИМ ВЬЮНА Mistmws FVSSILIS L.

Резюме

Показано, что полипетидные вещества, экстрагированные и очищенные из клеток зародышей вьюна, изолированных на отадии поздней бластулы, обладают свойствами, характерными для фактора роста фибробластоа (ФРО). Их молекулярная маса, определенная о помощью электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсуль-фата натрия, составляет 15-16 кДа. Эти вещества связываются гепа-рин-сефарозой и инактивируются антителами против основного ФРФ быка. Они индуцируют синтез ДНК в «ышиных фибробдастак линий NIH-3I3 и Swiss-ЗТЗ, а также в фиброблаотах эмбрионов человека в условиях их роста в монослойной культуре. ФРФ-подобные факторы роста .из клеток вародышей вьюна стимулируют субстратневависиыую пролиферацию клеток линии СНО-719 иа яичника китайского хомячка в полужидкой культуральной среде, содержащей 0.33 X агара. Обнаружено, что клетки зародышей вьюна имеют центры специфического овя-аывания С125П-оФР5. Полученные результаты свидетельствуют о том, что подобные факторы роста могуг выполнять важные регулятор-ные'функции не только в эмбрионах млекопитающих и амфибий, но также и в эмбрионах костистых рыб.

THE DETECT 1011, PURIFICATION, AMD BIOLOSICAL PROPERTIES .

OF FIBROBLAST GROWTH FACTOR FROM THE EMRYONIC CELLS OF THE LOACH MISGUfifiVS FVSSILIS L.

Summary

The polypeptide substances vthioh had been exstracted and purified from the cells of the .loaah embryos at the late blastula stage were shown to possess the properties characteristic for the fibroblast growth factor (FGF). Their rcolecular weight is 15-18 kDa (according to SDS-PAAG electrophoresis). They bind with heparin-sepharose and are inactivated with the antibodies against bovine basic FSF. They induce DMA synthesis in NIH-3T3 and Swiss-3T3 lines of mouse fibroblasts and In human embryonic fibroblasts grown in monolayer culture. The anchorage-independent proliferation of Chinese hanster ovary cells of СЮ-719 line grown in the semisolid culture medium which contained 0.33 7. agar is also stimulated by FGF-like growth factors from the loach embryonic cells. The' sites which сэп specifically bind r125I]-tasic FGF were detected in these cells. The obtained results allow to consider that FSF-like growth factors can play an important reg-ulatory role not only in the marmalian and amphibian embryos but also in the embryos of the teleost fishes.