Выявление и идентификация мембранного антигена, ассоциированного с гепатоцеллюлярными опухолями крыс

Тюряева, Ирина Ивановна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Выявление и идентификация мембранного антигена, ассоциированного с гепатоцеллюлярными опухолями крыс
ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Выявление и идентификация мембранного антигена, ассоциированного с гепатоцеллюлярными опухолями крыс"

На правах рукописи

ТЮРЯЕВА Ирина Ивановна

ВЫЯВЛЕНИЕ И ИДЕНТИФИКАЦИЯ МЕМБРАННОГО АНТИГЕНА, АССОЦИИРОВАННОГО С ГЕПАТОЦЕЛЛЮЛЯРНЫМИ ОПУХОЛЯМИ КРЫС

03.00.25 - гистология, цитология и клеточная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт- Петербург 2006

Работа выполнена в Лаборатории цитологии опухолевого роста Института цитологии РАН, Санкт-Петербург

Научный руководитель доктор биологических наук

Вадим Александрович Иванов, Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург

Официальные оппоненты доктор биологических наук, профессор

Виктор Михайлович Михельсон, Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург

доктор медицинских наук, профессор Петр Григорьевич Назаров, Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины РАМН, Санкт-Петербург

Ведущая организация: Научно-исследовательский институт

онкологии им. проф. H.H. Петрова РАМН, Санкт-Петербург

Защита состоится » октября 2006 года в часов на заседании

Диссертационного совета Д.002.230.01 при Институте цитологии РАН по адресу: 194064, Санкт-Петербург, Тихорецкий пр., д. 4

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии РАН

Автореферат разослан «¿23 » сентября 2006 года. Ученый секретарь Диссертационного совета, /

кандидат биологических наук Е.В. Каминская

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Проблемы дифференцировки, дисдифференцировки и пролиферации клеток, являющиеся одними из основных проблем современной биологии, особенно актуальны в области фундаментальной онкологии. При неопластической трансформации в клетке происходят значительные изменения, позволяющие ей приобрести такие свойства, которые предопределяют ее возможность образовать злокачественную опухоль. К таким свойствам относятся самодостаточность в пролиферативных сигналах, нечувствительность к рост-супрессирующим факторам, отсутствие репликативного старения (иммортали-зация), ослабление индукции апотггоза, блокирование клеточной дифференцировки, генетическая нестабильность, изменение морфологии и локомоции, стимуляция неоангиогенеза. Эти события выражаются в становлении нового антигенного спектра малигнизированных клеток. Антигенные отличия злокачественно трансформированной клетки от нормальной -ключевой вопрос иммунологии опухолей. Исследования в этом направлении позволяют выяснять не только механизмы малигнизации клетки, прогрессии опухоли и ускользания ее от иммунного надзора организма, но и вносят существенный вклад в клиническую онкологию. Прежде всего, речь идет об иммунодиагностике опухолей, уже ставшей обязательным компонентом клинической практики. Кроме того, активно развиваются еще две области онкологии - иммунопрофилактика некоторых опухолей вирусной этиологии и иммунотерапия, на которую возлагаются большие надежды, и некоторые противоопухолевые вакцины уже проходят клинические испытания.

Антигенные изменения трансформированных клеток выражаются с одной стороны в утрате или значительном снижении синтеза некоторых нормальных клеточных антигенов, а с другой стороны - в приобретении опухолеспецифических и опухолеассоциированных антигенов. Опухолеспецифические антигены есть результат либо изменения собственного нормального белка (гликопротеина) в результате мутации или пост-трансляционных нарушений, либо являются белками (гликопротеинами) вируса, способствовавшего возникновению данной опухоли. Опухолеассоциированные антигены - это продукты нормального клеточного генома, гены которых были активированы «не в то время или не в том месте». К таким антигенам, например, относятся эмбриоспецифические антигены, в норме характерные только для эмбрионального периода развития, и гетероорганные антигены, т.е. нормальные клеточные антигены, являющиеся специфичными для тканей, негомологичных опухолевой (Фель, Швембергер, 1968). Гетероорганные антигены отражают феномен антигенной дивергенции опухолевых клеток, который был открыт в лаборатории цитологии опухолевого роста Ин-

статута цитологии РАН (Фель и др., 1965) одновременно, но независимо, с зарубежными исследователями (Day, 1965).

Так, в лаборатории цитологии опухолевого роста при исследовании гепатоцеллю-лярных опухолей крыс иммунологическими методами было установлено наличие мембранных опухолсассоциированных антигенов, не свойственных нормальным гепатоцитам, но характерных для нормальных почек интактных крыс (выявлены в базальных мембранах извитых канальцев и на апикальных частях клеток эпителия главных отделов нефрона) (Иванов и др., 1975). Эти гетероорганные антигены выявляются в печени уже в 1-е сут после однократного канцерогенного воздействия на крыс и регистрируются в печени крыс в течение 21-50 сут в зависимости от вида канцерогена (Иванов и др., 1979; Ivanov, Fei, 1980). Антигены почечной специфичности были выявлены в печени эмбрионов крыс и новорожденных крысят (Ivanov et al., 1986), а также обнаруживались в течение 12 сут пролиферативных процессов в печени крыс после операции частичной гепатэктомии (Иванов, Фель, 1979). Методом двойной иммунодиффузии в агаре при использовании иммуносыворотки против «клеточных теней» почек крысы было обнаружено, что один из опухолеассоциированных антигенов гепа-томы Зайдела идентичен одному из органоспецифических антигенов почки. Поэтому келью настоящей работы стала идентификация ассоциированного с гепатоцеллюлярными опухолями крыс гетероорганного антигена, обнаруживаемого на поверхности клеток гепатомы Зайдела крысы с помощью органоспецифической антипочечной иммуносыворотки.

Задачи исследования.

1. Получить специфические иммуносыворотки к исследуемым антигенам.

2. С помощью полученных иммуносывороток охарактеризовать опухолеассоцииро-ванные антигены некоторых гепатоцеллюлярных опухолей и опухолей другого гистогенеза.

3. Выделить мембранный гетероорганный антиген почечной специфичности, обнаруженный ранее на поверхности клеток гепатомы Зайдела крыс.

4. Идентифицировать выделенный опухолеассоциированный антиген.

5. Провести сравнительный анализ двух гепатоцеллюлярных опухолей крыс в отношении исследуемого антигена.

Основные положении, выносимые на защиту.

1. Исследованные гепатоцеллюлярные опухоли крыс характеризуются появлением на клеточной поверхности опухолеассоциированного антигена, свойственного почечной ткани интактных крыс и причастного к процессу пролиферации гепатоцеллюлярных клеток.

2. Анализ опухолеассоциированного мембранного антигена клеток двух гепатоцеллю-лярных опухолей крыс позволил идентифицировать его как белок внеклеточного матрикса -ламинин.

3. Ламинин, синтезируемый клетками гепатомы Зайдела крысы, связывается с клеточной мембраной посредством нескольких ламинин-связывающих белков, одним из которых, на основании данных масс-спектрометрии, является мембранный белок теплового шока ОЯР78.

Научная новизна. Впервые выявлен мембранный гетероорганный антиген почечной специфичности с мол. массой около 200 кДа, ассоциированный с гепатоцеллюлярными опухолями крыс. Впервые этот гетероорганный антиген удалось идентифицировать с помощью метода масс-спектрометрии как ламинин, по составу субъединиц соответствующий ла-минину-8/9. Показана причастность исследуемого антигена к процессу клеточной пролиферации. Впервые исследован репертуар ламинин-связывающих мембранных белков клеток асцитной гепатомы Зайдела крыс. Впервые показано, что одним из ламинин-связывающих белков клеточной поверхности гепатомы Зайдела крыс является мембранно-локализованный белок теплового шока СИР78.

Теоретическое и практическое значение работы. Работа имеет фундаментальную направленность. Результаты работы важны прежде всего для понимания процессов неопластической трансформации клеток и обнаружения тех молекулярно-клеточных механизмов, которые при этом задействованы. Полученные результаты могут быть использованы для изучения механизмов регуляции экспрессии генов при дифференцировке и трансформации клеток. Выявлено одно из проявлений тканеспецифичского механизма неопластической трансформации гепатоцитов, заключающееся в экспрессии ими ламинина. Поскольку данный гетероорганный антиген выявляется в клетках уже в первые сутки после канцерогенного воздействия, задолго до появления опухоли, он может быть использован в качестве маркера дисдифференцировки и малигнизации гепатоцитов. Результаты работы закладывают основу для дальнейшего изучения роли отдельных белков клеточной поверхности, в частности ламинина и СГ<Р78, в процессе неопластической трансформации гепатоцитов. Полученные результаты, возможно, помогут дальнейшему развитию и использованию научно-обоснованных методов борьбы со злокачественными новообразованиями.

Результаты работы используются в лекционном и практическом курсах Кафедры общей и клинической токсикологии Медицинской академии постдипломного образования.

Кроме того, результаты работы включены в курс лекций по цитологии для студентов биолого-почвенного факультета СПбГУ.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на Всероссийском симпозиуме «Биология клетки в культуре» (Санкт-Петербург, 1996, 1998); 7- й Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2003); I Съезде Общества клеточной биологии (Санкт-Петербург, 2003); I Всероссийской конференции «Физиология иммунной системы» и I Всероссийской конференции по иммунотерапии (Сочи, 2003); Международном симпозиуме по биологии клетки в культуре «Стволовые клетки, регенерация, клеточная терапия» (Санкт-Петербург, 2004); II Международном семинаре-школе «Масс-спектрометрия в химической физике, биофизике и экологии» (Звенигород, 2004), Российской конференции по фундаментальной онкологии «Петровские чтения-2005» (Санкт-Петербург, 2005); Международной школе по сравнительной иммунологии "Current trends in comparative immunology", DAAD Summer School on St. Petersburg (Санкт-Петербург, 2005).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 16 работ, из них 5 статей в рецензируемых журналах, а также тезисы 11 докладов на всероссийских и международных симпозиумах, конференциях и школах.

Финансовая поддержка работы. Работа выполнена при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (проекты 96-04-49733, 00-04-49387, 04-0449186), Санкт-Петербургского научного центра РАН (конкурс персональных грантов для студентов, аспирантов, молодых ученых и специалистов в области гуманитарных, естественных, технических и медицинских наук, грант № МОЗ-2.6К-113) и Санкт-Петербургского Научного центра (грант 2005 г.)

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 138 страницах машинописного текста и состоит из глав: Введение, Обзор литературы, Материалы и методы, Результаты, Обсуждение, Выводы и Список цитируемой литературы (содержит 338 публикации). Иллюстративный материал содержит 24 рисунка и 10 таблиц.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Экспериментальные животные, клеточные линии и перевиваемые опухоли. В работе использовали белых беспородных взрослых крыс-самцов массой 120 - 150 г и кроликов-самцов массой 2 - 2.5 кг (питомник «Рапполово», РАМН). Клеточные культуры гепатомы IITC крысы, гепатомы 27 крысы, дифференцирующихся миогенных клеток крысы, фиброб-ластов почек крысы и гепатомы BWTG3 мыши получены из Российской коллекции клеточных культур (Институт цитологии РАН). Из перевиваемых опухолей животных использовали асцитную гепатому Зайдела крысы, рабдомиосаркому РА-2 крысы и гепатому 22а мыши.

Иммунизация кроликов и получение специфических иммуносывороток. Органос-пецифическую антипочечную и опухолеспецифическую (антиопухолевую) иммуносыворот-ки получали путем иммунизации кроликов препаратами «клеточных теней» почек крыс или препаратами плазматических мембран клеток гепатомы Зайдела крыс, соответственно, в смеси с адъювантом Фрейнда, с последующим истощением иммуносывороток гомогенатом печени крысы и выделением фракции иммуноглобулинов С методом аффинной хроматографии на колонке белок А-агароза. (Иванов, 1982, Терюкова, Иванов, 1993). В качестве контроля таким же образом была очищена фракция из нормальной сыворотки интактного кролика. По аналогичной схеме получали антитела против ламинина-1 (за исключением истощения иммуносыворотки гомогенатом печени крысы). Специфичность полученных поли-клональных антител оценивали методом твердофазного иммуноферментного анализа. В дальнейшем все полученные препараты антител (фракции ^С) будем называть иммуносы-воротками.

Приготовление препаратов клеточных мембран и экстрактов периферических белков плазматических мембран клеток. Препараты клеточных мембран почки («клеточные тени») были получены в соответствии с рекомендациями Белошапкиной и Абелева (Ве-ЬвИаркша, АЬе1еу, 1965). Фракцию плазматических мембран клеток гепатомы Зайдела и ге-патоцитов крыс получали по методу Хеффнера и соавторов (НаеПЪег е1 а!.. 1980) с модификацией, заключавшейся в том, что на последнем этапе фракционирование клеточных мембран проводили в градиенте перколла, а не сахарозы. Экстракцию периферических белков клеток проводили в буферном растворе ЗМ КС1 (2ак-Ке]шагк е1 а1„ 1978).

Определение концентрации белка. Концентрацию мембранно-связанного белка и белка в растворе детергента определяли по методу Марквелла с соавторами (Магк\уе11 е1 а!., 1978). Концентрацию белка, экстрагированного 3 М КС1, и белка во фракциях ^С определяли по методу Лоури с соавторами (Ьоиту е1 а1„ 1951).

Твердофазный иммуноферментный анализ. Специфичность полученных иммуносывороток против «клеточных теней» почек крыс и препаратов плазматических мембран клеток гепатомы Зайдела, а также количественные показатели взаимодействия указанных иммуносывороток с мембранными антигенами клеток, уровень сывороточного ламинина и уровень антител в сыворотках и асцитах определяли с помощью твердофазного иммуноферментного метода (Терюкова, Иванов, 1993), проводимого в плоскодонных 96-луночных планшетах для микротитрования (ЬтЬго, США). В качестве вторых антител использовали козьи антитела против кролика, конъюгированные с пероксидазой хрена. После достаточного развития цветной реакции процесс останавливали внесением в лунки по 20 мкл 2.5 М НС1 и оценивали интенсивность окрашивания по оптической плотности растворов в лунках с помощью фото-

метра с вертикальным лучом (ТИеПек МиШзсап, Финляндия) при длине волны 492 нм. В ряде случаев для оценки результатов иммуноферментного анализа был использован индекс взаимодействия иммуносыворотки, который вычисляли как отношение показателя оптической плотности раствора в опытных лунках (при взаимодействии антигенов с иммуносывороткой) к показателю оптической плотности раствора в контрольных лунках (при взаимодействии антигенов с сывороткой интактного кролика).

Иммунофлуоресцентный анализ. Исследование белков клеточной поверхности проводили методом непрямой иммунофлуоресценции. Для этого клетки либо культивировали на покровных стеклах в течение 2 сут в среде ДМЕМ с 10 % сыворотки плодов коровы; либо наносили каплю суспензии, содержащую клетки в концентрации 4-5 млн/мл на предметное стекло и оставляли во влажной камере на 30 мин для прикрепления клеток на стекло с последующим фиксированием клеток 2 %-ным формальдегидом и обработкой иммуносыворотка-ми. В качестве вторых антител использовали ослиную иммуносыворотку против иммуноглобулинов кролика, меченную изотиоцианатом флуоресцеина (ФИТЦ). Клетки перевиваемых опухолей и гепатоциты обрабатывали в суспензии согласно методике Лежневой (Лежнева, 1968).

Оценка пролиферации по включению ,4С-тимидина. Клетки гепатомы НТС в концентрации 120 х 103 клеток/мл, находящиеся в среде Игла с 10 % сыворотки плодов коровы, инкубировали в ССЬ-термостате в течение 20 ч при 37 °С с добавлением либо органоспеци-фической антипочечной иммуносыворотки, либо сыворотки интактного кролика. Затем клетки отмывали средой Игла без сыворотки и инкубировали в среде, содержащей |4С-тимидин (37 кБк/мл) 1 ч при 37 °С, после обрабатывали 5 %-ным раствором трихлоруксусной кислоты и лизировали в 0.1 н КаОН. Радиоактивность полученной кислотонерастворимой фракции измеряли в сцинтилляционном счетчике фирмы Весктап. Во всех сериях опытов для оценки каждого варианта снимали показания для 3 лунок. Значение включения метки в ДНК клеток, культивируемых в присутствии сыворотки интактного кролика, было принято за 100%.

Исследование однократного воздействия на крыс гепатоканцерогена. Гепатокан-цероген 1Ч-диэтилнитрозамин (ДЭНА) растворяли в изотоническом растворе ЫаС1 и вводили крысам внутрибрюшинно из расчета 200 мг на 1 кг массы животного в объеме 1 мл. Контрольным животным вводили внутрибрюшинно по 1 мл 0.15 М ЫаС1. Гепатоциты выделяли согласно методике (Гринчишин и др., 1981) спустя 4 сут после введения гепатоканцерогена.

Электрофоретическое разделение белков и иммуноблотинг. Белки плазматических мембран или белки, выделенные хроматографическими методами, были подвергнуты электрофорезу в 10 или 5 %-ном полиакриламидном геле (ПААГ) в присутствии додецилсульфа-

та натрия (ДСН) (Laemmli, 1970). В качестве маркеров молекулярной массы использовали либо препарат миофибрилл кролика, либо набор маркеров молекулярной массы (Sigma, США). После окончания фореза гель переносили на нитроцеллюлозную мембрану с размером пор 0.45 микрон (Amersham, Швеция) и осуществляли перенос белков в течение 2 ч при напряжении 100-300 В и силе тока 500 мА. Для визуализации белковых полос нитроцеллюлозную мембрану окрашивали Понсо С. Места неспецифического связывания белков нитроцеллюлозой блокировали 3%-ным сухим молоком на 20 мМ Трис буфере с 150 мМ NaCl, рН 7. Далее мембрану инкубировали с иммуносыворотками, в качестве вторых антител использовали козьи антитела против кроличьих IgG, конъюгированные с щелочной фосфатазой (Sigma, США).

Масс-спектрометрический анализ. Белковые полосы, разделенные в 5%-ном ПААГ, были визуализированы окрашиванием Coomassie Brilliant Blue R250, вырезаны из геля и подготовлены для масс-спектрометрического анализа по методу Шевченко и соавторов (Shevchenko et al., 1996). Масс-спектрометрический анализ проводили на масс-спектрометре MALDI TOF Bruker reflex IV в режиме положительных ионов с использованием рефлектро-на. Полученные пептидные спектры обрабатывали с использованием поисковой базы SwissPROT (http://prospector.ucsf.edu).

Аффинная хроматография. Для приготовления аффинной колонки 1.7 г подготовленной CNBr-сефарозы (Sigma) соединяли с 2.1 мг ламинина-1, любезно предоставленного д.б.н., проф. Г.П. Пинаевым (Отдел клеточных культур, Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург). Белки плазматических мембран клеток гепатомы Зайдела лизировали с использованием буферного раствора, содержащего 1 % Тритона Х-100 и протеазы. Связывание мембранных белков с ламинин-сефарозой проводили в объеме (batch method). Связавшиеся с ламинином белки элюировали либо 0.1 М глицином, рН 2.4 с немедленной нейтрализацией фракций 0.5 М NaOH, либо буферным раствором с добавлением 20 мМ ЭДТА.

Статистическая обработка. Для статистической обработки данных была использованы программы Microcal Origin 6.0 и Statistica 6.0. Достоверность различий сравниваемых средних значений оценивали с помощью t-критерия Стьюдента.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Характеристика полученных иммуносывороток. Для проведения работы были получены 2 вида поликлональных иммуносывороток - органоспецифическая иммуносыво-ротка против «клеточных теней» почек крыс и антиопухолевая иммуносыворотка против плазматических мембран клеток асцитной гепатомы Зайдела крыс. Обе иммуносыворотки были истощены гомогенатом печени крысы и их специфичность тестировали методом твер-

дофазного иммуноферментного анализа. Так, антипочечная иммуносыворотка, значительно утратив после истощения способность реагировать с гепатоцитами (приближается к контрольному уровню значений для сыворотки интактного кролика), сохранила при этом высокий уровень взаимодействия с клетками гепатомы, что говорит о наличии на опухолевых клетках антигенов, свойственных нормальным почкам крысы (рис. 1) (Тюряева и др., 2005а).

Обратные разведения сыворотки

Рис. I. Характеристика специфичности истощенной гомогенатом печени крысы антипочечной сыворотки в отношении плазматических мембран клеток крысы.

1 - почка, 2 - гепатома Зайдела, 3 - гепа-тоциты; 4 - 6 - гепатоциты, гепатома Зайдела и почка соответственно с сывороткой интактного кролика.

Иммуносыворотка против препарата плазматических мембран клеток гепатомы Зайдела, истощенная гомогенатом печени, реагировала с гепатоцитами лишь на небольших разведениях иммуносыворотки, тогда как с клетками гепатомы реакция наблюдалась и при разведении 1 : 1280 (рис. 2) (Терюкова, Тюряева и др., 1997).

Рис. 2. Характеристика специфичности антиопухолевой иммуносыворотки в отношении плазматических мембран клеток гепатомы Зайдела (1) и клеточных мембран ге-патоцитов (2) крыс.

100 1000 Обратные разведения сыворотки

Полученные данные позволили заключить, что сыворотки, имеющиеся в нашем распоряжении, являются специфичными: одна — в отношении компонентов клеточных мембран

почек крысьт, т.е. органоспецифической антипочечной, а вторая - в отношении мембранных антигенов, ассоциированных с клетками гепатомы Зайдела, т.е. опухолеспецифической.

Выявление опухолеассоциированных мембранных антигенов гепатомы Зайдела крысы. С помощью опухолеспецифической иммуносыворотки против плазматических мембран клеток гепатомы Зайдела после электрофоретического разделения мембранных белков в 10 %-ном ПААГ и последующего иммуноблотинга было обнаружено, что клетки гепатомы Зайдела характеризуются наличием по крайней мере 10 опухолеассоциированных антигенов с мол. массами около 180, 96, 65, 56, 46, 42, 33, 31, 25 и 22 кДа, при отсутствии взаимодействия иммуносыворотки с белками гепатоцитов интактных крыс (Терюкова, Тюряева и др., 1997). Надо отметить, что наибольшая мол. масса маркера, применяемого в данном исследовании, составляла 94 кДа (фосфорилаза б), поэтому определенная нами мол. масса первого компонента (около 180 кДа) может иметь достаточно большую погрешность.

На рис. 3 показана количественная оценка взаимодействия антиопухолевой иммуносыворотки с препаратами клеточных мембран. Выраженная реакция этой иммуносыворотки с препаратами клеточных мембран почки крысы представила дополнительное доказательство наличия среди опухолеассоциированных антигенов клеток гепатомы Зайдела компонентов, присущих почке крысы (Терюкова, Тюряева и др., 1997).

ж <и

4 о

5 к

во

S 70.

60.

н so

& 40

13 о 30

!> 20'

S 10

Рис. 3. Количественная оценка взаимодействия опухолеспецифической иммуносыворотки с препаратами плазматических мембран гепатоцитов (1), почки («клеточные тени»; 2) и гепатомы Зайдела (3) крыс. Вертикальные отрезки — ошибка среднего.

Путем КС1-экстракции были выделены периферические белки клеточных мембран ряда клеток. Исследование взаимодействия антиопухолевой иммуносыворотки с препаратами периферических белков (рис. 4) позволило сделать следующие выводы: 1) антигенный спектр клеток гепатомы Зайдела крысы по сравнению с гепатоцитами интактных крыс обогащен рядом опухолеассоциированных компонентов, среди которых есть антигены, присущие почкам крыс и являющиеся периферическими белками плазматических мембран клеток; 2) три гепатоцсллюлярные опухоли крысы - гепатома Зайдела, гепатома НТС и гепатома 27 -характеризуются некими общими опухолевыми антигенами; 3) взаимодействие опухолеспе-

цифической сыворотки с препаратами периферических белков культивируемых миогенных клеток крысы, которые являются активно пролиферирующими, но не опухолевыми, предполагает возможную причастность некоторых опухолеассоциированных компонентов к процессу клеточной пролиферации (Терюкова, Тюряева и др., 1997).

Рис. 4. Количественная оценка взаимодействия опухолеспецифической иммуносыворотки с антигенами клеток крыс, экстрагированными 3 М КС1. 1 - гепатоциты; 2 - гепатома Зайдела; 3 - гепатома НТС, 4 - гепатома 27; 5 -фибробласты почки; 6 - миогенные клетки. Вертикальные отрезки - ошибка среднего.

§ » 10 || 8

И 6

г! 4

|| 2

Специфическое свечение, обнаруженное нами методом непрямой иммунофлуорес-ценции с помощью опухолеспецифической иммуносыворотки на поверхности культивируемых клеток гепатомы НТС и 27, а также миогенных клеток крысы, подтверждает локализацию исследуемых опухолеассоциированных антигенов на наружной мембране клеток (рис. 5). При обработке всех исследуемых клеток сывороткой интактного кролика или только ослиной сывороткой против иммуноглобулинов кролика, меченой ФИТЦ, специфического свечения клеточных мембран не наблюдалось (Терюкова, Тюряева и др., 1997).

Рис. 5. Выявление антигенов, ассоциированных с гепатомой Зайдела крыс, на поверхности культивируемых клеток гепатомы НТС (б), гепатомы 27 (в) и миогенных клеток (г) крысы методом непрямой иммунофлуоресценции. а - контроль (клетки НТС с сывороткой интактного кролика).

Таким образом, антигенный спектр клеток гепатомы Зайдела по сравнению с гепато-цитами крыс обогащен рядом опухолеассоциированных компонентов, среди которых есть антигены, присущие почкам крыс и являющиеся периферическими белками плазматических

мембран клеток. Кроме того, гепатомы НТС и 27 крысы характеризуются наличием опухоле-ассоциированных антигенов, иммунологически сходных с гепатомой Зайдела.

Выявление гетероорганных антигенов на поверхности культивируемых клеток и их связь с пролиферативной активностью клеток. Для того чтобы выяснить, являются ли мембранные опухолеассоциированные антигены, присущие почечной ткани, характерной особенностью лишь асцитной гепатомы Зайдела крысы или также присутствуют в других гепатоцеллюлярных опухолях и в опухолях другого гистогенеза, мы тестировали ряд культивируемых клеток с помощью органоспецифической антипочечной сыворотки (Терюкова, Тюряева и др., 1996). На рис. 6 представлены результаты иммунофлуоресцентного анализа, демонстрирующие наличие антигенов почечной специфичности на поверхности трех исследуемых гепатоцеллюлярных опухолей крыс, двух гепатоцеллюлярных опухолей ксеногенно-го вида животного - мышей, а также на поверхности культивируемых миогенных клеток крыс и опухолевых миогенных клеток - рабдомиосаркомы РА-2 крысы.

Рис. 6, Выявление мембранных гетероорганных антигенов, ассоциированных с клетками гепатомы Зайдела, на поверхности культивируемых клеток методом непрямой имму-нофлуоресценции.

а - гепатоциты интактных крыс; б - гепатома НТС крысы; в - гепатома 27 крысы; г — гепатома Зайдела крысы; д - миогенные клетки крысы; е - рабдомиосаркома РА-2 крысы; ж-гепатома В\¥ТОЗ мыши; з - гепатома 22а мыши.

Для того чтобы выяснить возможную связь выявляемых антигенов с пролиферативной активностью клеток, было исследовано влияние органоспецифической антипочечной иммуносыворотки на синтез ДНК в культивируемых клетках гепатомы НТС, регистрируемого по включению 14С-тимидина в клетки, обработанные либо специфической иммуносыво-

роткой, либо сывороткой интактного кролика (Тегуикоуа, ВМпоуа, Туигуасуа с( а1., 1999). Добавление в культуральную среду 390 мкг/мл антипочечной сывороткой снижало синтез ДНК в одном опыте на 23 %, а в другом - на 62 % по сравнению с количеством метки, включившейся при инкубации клеток с нормальной сывороткой кролика, а добавление 520 мкг/мл антипочечной иммуносыворотки приводило к снижению синтеза ДНК на 29 %. Несмотря на неоднородность полученных результатов, снижение синтеза ДНК в клетках в присутствии антипочечной иммуносыворотки может указывать на вовлечение этих антигенов в процесс клеточной пролиферации.

Таким образом, полученные результаты позволяют сделать вывод о том, что в состав плазматических мембран тестируемых гепатоцеллюлярных опухолей включены антигены, являющиеся органоспецифическими для почки крысы. Появление таких гетероорганных антигенов в составе клеточных мембран опухолей, различающихся по своему гистогенезу и этиологии, указывает на закономерный характер этого явления.

Определение молекулярной массы опухолеассоциированного мембранного антигена клеток гепатомы Зайдела, реагирующего с антипочечной иммуносывороткой, и его идентификация (Тюряева и др., 2005а). Мембранные белки клеток гепатомы Зайдела, гепа-тоцитов крыс и почек крыс были разделены электрофоретически в 5%-ном полиакриламид-ном геле и перенесены на нитроцеллюлозную мембрану для иммуноблотинга. Антипочечные антитела выявили в составе плазматических мембран клеток гепатомы Зайдела компонент или два близко расположенных компонента в районе 200 кДа (рис. 7).

Рис. 7. Выявление гетероорганных антигенов в лизатах мембранных белков клеток асцитной гепатомы Зайдела методом иммуноблотинга с помощью антипочечной иммуносыворотки.

1 - мембранные белки почки крысы; 2 - мембранные белки гепатоцитов крысы; 3 - мембранные белки клеток гепатомы Зайдела крысы.

В клеточных мембранах почек несколько белков реагируют с антипочечной сывороткой, тогда как реакции с плазматическими мембранами печени не выявлено. Таким образом, в составе плазматических мембран клеток гепатомы Зайдела был выявлен компонент, отсутствующий в нормальных плазматических мембранах гепатоцитов, но присущий клеточным мембранам почки крысы. По всей видимости, именно этот компонент обуславливает взаимо-

«—105 — 67

действие антипочечной сыворотки с плазматическими мембранами клеток гепатомы Зайде-ла.

Идентифицикация выявленного компонента была проведена методом масс-спектрометрии. Для этого белки плазматических мембран клеток гепатомы Зайдела были разделены в 5 %-ном полиакриламидном геле, визуализованы окрашиванием Кумасси и две белковые полосы, располагающиеся в районе 200 кДа и обозначенные нами номерами I и II (рис. 8), были вырезаны и подвергнуты расщеплению трипсином.

Рис. 8. Электрофоретическое разделение белков фракции плазматических мембран клеток гепатомы Зайдела.

В увеличенном фрагменте рисунка показаны две белковые полосы, подвергнутые масс-спектрометричес-кому анализу и обозначенные нами номерами I и II.

Полученные пептиды анализировали методом масс-спектрометрии. Массы пептидов были использованы для идентификации белков в поисковой базе данных ЗичзбРКОТ. Анализ результатов позволил сделать вывод, что белковая полоса I содержит пептиды р1, р2 и а.4 цепи ламинина (табл. I), а белковая полоса II - пептиды у1 цепи ламинина (табл. 2).

Таблица 1

Результаты масс-спектрометрического исследования белков,

содержащихся в образце I.

Название белка по Swiss-Prot Мол. масса*, Да № no Swiss-Prot Число найденных триптиче-ских пептидов Перекрывание последовательности белка, %

CHAIN 1: Laminin beta-2 chain. - Rattus non'eglcus (Rat) 196476 Р15800 85 48

CHAIN 1: Laminin beta-2 chain. - Mus musculus (Mouse) 196355 Q61292 74 41

CHAIN 1: Laminin beta-1 chain. — Mus musculus (Mouse) 196907 Р02469 67 41

CHAIN 1: Laminin alpha-4 chain. - Mus musculus (Mouse) 201821 Р97927 48 28

* - Указана мол. масса для непроцессированного предшественника

иди 205

Таблица 2

Результаты масс-спектрометрического исследования белка, содержащегося в образце II.

CHAIN 1: Laminin gamma-1 chain. -Mus musculus (Mouse) 177300 Р02468 66 27

*- Указана мол. масса для непроцессированного предшественника

Как видно из данных, приведенных в таблицах 1 и 2, большинство найденных в базе белков принадлежит мыши, потому что именно для этого животного среди грызунов определены пептидные карты для всех известных цепей ламинина, тогда как для крысы определены пептидные карты только для р2 цепи ламинина (база $\у185-Рго1) и нескольких фрагментов ламинина (база ТгЕМВЬ), но гомология ламининов очень высока, поэтому результаты поиска можно экстраполировать и на другие виды животных. Также следует отметить высокий процент перекрывания выявленными в масс-спектре пептидами аминокислотных последовательностей указанных цепей ламинина. Обычно для уверенной идентификации белка методом МА1Х>1-ТОР масс-спектрометрии достаточно 20 %-ного перекрывания его аминокислотной последовательности.

Для подтверждения масс-спектрометрических данных была получена иммуносыво-ротка против препарата ламинина-1. Результаты иммуноблотинга (рис.9) подтвердили данные масс-спектрометрии.

— 67

— 45

12 3 4

Полученные антитела реагировали с 400 кДа, с р1у1 цепями, которые сомигрир кДа, а также с белком, выделяемым вместе

Рис. 9. Иммуноблотинг белков плазматических мембран и препарата ламинина-1 с антиламининовой иммуносы-вороткой.

1 — мембранные белки клеток гепатомь Зайдела; 2 - мембранные белки почек крысы; 3 - мембранные белки гепатоцитов; 4 -ламинин-1.

ламинином-1: а! цепью, имеющей мол. массу ~ овали, образуя широкую полосу на уровне - 200 с ламинином-1, - нидогеном с мол. массой ~ 160

кДа. Субъединицы ламинина обнаруживались и в почечных мембранах, но не мембранах ге-патоцитов. В составе плазматических мембран гепатомы Зайдела обнаруживалось взаимодействие антиламининовой иммуносыворотки с белковой полосой на уровне 200 кДа, подтверждающее наличие в ней субъединиц ламинина.

Наличие и локализация исследуемого антигена на поверхности клеток гепатомы Зайдела подтверждены иммунофлуоресцентным методом, обнаруживающим аналогичное свечение поверхности клеток как при обработке антиночечной иммуносывороткой, так и при обработке антиламининовой сывороткой (рис. 10).

Рис. 10. Иммунофлуоресцентный анализ клеток гепатсмы Зайдела. а - нормальная сыворотка; 6 - антипочечная сыворотка; в - антиламининовая сыворотка.

Тот факт, что антипочечная сыворотка содержит антитела к ламинину, был дополнительно подтвержден электрофоретическим разделением субъединиц ламинина-1 в 5 %-ном полиакриламидном геле с последующим иммуноблотингом, результаты которого показаны на рис. 11 . Антипочечная сыворотка выявляет субъединицы ламинина.

Рис. 11. Органоспецифическая антипочечная им-муносыворотка взаимодействует в иммуноблоте с лами-нином.

1 — белки клеточных мембран почки крысы; 2 — препарат ламинина.

Сравнительный анализ двух мембранных опухолеассоциированных гетероорган-ных антигенов, выявляемых в районе 200 кДа, клеток гепатомы Зайдела и гепатомы НТС. Тестирование белков плазматических мембран клеток гепатомы НТС крысы с помощью антиламининовой иммуносыворотки в иммуноблоте после их электрофоретического

—400кДа

— 200 кДа

— 160 кДа

разделения (рис 12, Л) также обнаружило проявление иммунологической реакции в районе 200 кДа (рис. 12, Б).

кДа 205

116 97,4

Рис. 12. Электрофоретическое разделение мембранных белков клеток гепато-мы Зайдела и гепатомы НТС крыс (А) и выявление в иммуноблоте субъединиц ламинина (Б).

дорожка 1- гепатома Зайдела; дорожка 2 - гепатома НТС.

Методом масс-спектрометрии был проведен сравнительный анализ белковых полос в районе 200 кДа фракций плазматических мембран клеток гепатомы Зайдела и гепатомы НТС. В данном случае мы анализировали фрагменты полиакриламидного геля, содержащие обе белковых полосы - I и И. Примеры полученных МАиМ-ТОН масс-спектров представлены на рис. 13 и рис. 14.

I» «l^

» ffj.P'f I

1800 2000 2200 2400 2600

m/z

Рис. 13. Масс-спектр продуктов трипсинолиза белковых полос, располагающихся в районе 200 кДа после электрофоретического разделения мембранных белков клеток гепатомы Зайдела.

а4, ß I, ß2, 71 - отмечены пептиды а4, ß 1, ß2 и у 1 цепей ламинина; * - отмечены не идентифицированные пептиды.

MMhn

14D0 1600 1800 2000 2200 2400 2600

m/z

Рис. 14. Масс-спектр продуктов трипсинолиза белковых полос, располагающихся в районе 200 кДа после электрофоретического разделения мембранных белков клеток гепато-мы НТС.

а4, ßl, ß2, yl - отмечены триптические пептиды а4, ßI, ß2 и у 1 цепей ламинина; * -отмечены не идентифицированные пептиды.

Массы пептидов были использованы для идентификации белков в поисковой базе данных 5\у1з5Р1ЮТ. Анализ результатов позволил сделать вывод, что, как и в образце мембранных белков в районе 200 кДа клеток гепатомы Зайдела, аналогичный компонент гепато-мы НТС содержит пептиды а4, (51, р2 и цепей ламинина (табл. 3).

Надо отметить, что, несмотря на высокую межвидовую гомологию цепей ламинина, существуют пептиды, характерные именно для данного вида животного. Так, сравнение масс-спектров триптических фрагментов р2 цепи ламинина мыши и крысы обнаружило некоторые различия. Например, пептиды с мол. массой (МН+) 968.49, 1001.53, 1184.59 принадлежат Р2 цепи ламинина мыши, но не крысы. А пептиды с мол. массой (М11+) 974.51, 1063.48, 1456.64 принадлежат Р2 цепи ламинина только крысы. Поэтому ряд не идентифицированных пептидов может принадлежать соответствующим субъединицам ламинина не мыши, а крысы, масс-спектрометрические данные для которой отсутствуют в базах данных.

Таким образом, несмотря на то, что эти две гепатоцеллюлярные опухоли индуцированы разными канцерогенами и по-разному культивируются (гепатома Зайдела - перевиваемая внутрибрюшинно асцитная опухоль, а гепатома НТС - клеточная культура), клетки обеих опухолей инициировали синтез одного и того же мембранного антигена - ламинина 8/9.

Таблица 3

Результаты масс-спектрометрического исследования двух онухоле-ассоциированиых антигенов почечной специфичности

Название белка по Swiss-Prot Число найденных триптических пептидов Перекрывание последовательности белка, %

гспатома Зайдела гепатома НТС гепатома Зайдела гепатома НТС

Laminin beta-2 chain (Rat) 66 73 31 32

Laminin beta-2 chain (Mouse) 62 71 31 31

Laminin beta-1 chain (Mouse) 43 56 20 20

Laminin alpha-4 chain (Mouse) 54 66 28 26

Laminin gamma-1 chain (Mouse) 62 61 26 26

Идентификация ламинип-связывающих мембранных белков клеток гепатомы Зайдела. Поскольку ламинин является белком внеклеточного матрикса и находится в тесной ассоциации с плазматическими мембранами клеток посредством взаимодействия с интегри-новыми и неинтегриновыми рецепторами, то задачей дальнейшего исследования стало определение тех ламинин-связьтвающих белков, которые принимают участие в организации ламинина на поверхности опухолевых клеток, в частности клеток гепатомы Зайдела (Тюряева и др., 20056). Данная работа была выполнена методами аффинной хроматографии и масс-спектрометрии.

Для выделения специфических мембранных компонентов, участвующих в присоединении ламинина к клеточной поверхности, лизат белков плазматических мембран клеток гепатомы Зайдела, был нанесен на колонку с CNBr-ceфapoзoй, связанной с ламинином-1. Основными белками, элюированными с колонки 0.1 М глицином (рН 2.4), оказались компоненты с мол. массами около 80, 67, 60, 55, 52, 48 и 43 кДа (рис 15, А). При выделении мембранных белков на аффинной колонке в присутствии МпСЬ мы ожидали выявить интегриновые рецепторы к ламинину. Однако элюция раствором ЭДТА белков, связавшихся с ламинином, обнаружила лишь один основной компонент с мол. массой около 80 кДа (рис 15, Б, дорожка 1). В высокомолекулярной области, характерной для субъединиц интегринов, можно разли-

чить несколько белковых полос, но они слабо выражены. В последующей фракции белков, элюируемой с колонки 0.1 М глицином (рН 2.4), нами было выявлено несколько компонентов с мол. массой около 80,67, 55,52,43, 37 и 32 кДа (рис 15, Б, дорожка 2).

Рис. 15. Выделение белков плазматических мембран клеток гепатомы Зайдела методом аффинной хроматографии на ла-116 минин-сефарозе.

97,4 А - белки, элюированные с колонки 0.1 М

глицином, рН 2,4, Б - белки, выделенные в присутствии МпС1>: дорожка / - элюция с колонки раствором ЭДТА; дорожка 2 - последующая элюция 0.1 М глицином, рН 2.4

кДа кДа

205 205

116

97,4

I 2

Некоторые из этих компонентов были идентифицированы методом масс-спектрометрии. Полученный пептидный спектр компонента с мол. массой около 80 кДа (рис. 16) соответствует 78 кДа glucose-regulated protein precursor (GRP78); обнаруженные пептиды перекрывают 46 % последовательности белка.

800 1000 1200 1400 1600 1600 2000

Масса к заряду, m/z

Рис. 16. Масс-спектрометрический анализ белка плазматических мембран клеток гепатомы Зайдела с мол. массой около 80 кДа, выделенного на ламинин-сефарозе и идентифицированного как GRP78. Цифрами отмечены сигналы для пептидов GRP78; Кег - привнесенное в пробу загрязнение кератином человека.

Выделенный с помощью аффинной хроматографии компонент с мол. массой около 43 кДа соответствует пептидной карте актина (бета или гамма актинам при одинаковых массах пептидов и одинаковом перекрывании последовательностей белков - 54 %). Пептидный спектр показан на рис. 17. Вероятно, что этот белок выделяется с аффинной колонки, будучи связанным с одним из трансмембранных компонентов, реагирующим с ламинином.

Масса к заряду, m/z

Рис. 17. Масс-спектрометрический анализ белка плазматических мембран клеток гепатомы Зайдела с мол. массой около 43 кДа, выделенного на ламинин-сефарозе и идентифицированного как цитоплазматический актин.

Цифрами отмечены сигналы для пептидов актина; * - пептиды, полученные в результате неспецифического расщепления актина; Тгу - автогидролиз трипсина.

Пептидные карты белков с мол. массами около 67 кДа и 57 кДа отображают, по-видимому, смесь нескольких компонентов. Так, например, в образце с мол. массой около 67 кДа мы обнаружили часть пептидов, характерных для сывороточного альбумина, который, как показано (von der Mark, Risse, 1987; Mecham, 1991), может загрязнять препараты мембран клеток и быть сопутствующим белком, элюируемым с аффинной колонки ламинин-сефароза. Также нами выявлены сигналы, характерные для рецептора ламинина с молекулярной массой 67 кДа (67кДа ЛР), но они слабые по интенсивности относительно всего остального спектра - минорный компонент.

Подводя общий итог полученным результатам, можно сказать, что антигенный спектр клеток гепатоцеллюлярных опухолей по сравнению с гепатоцитами интактных крыс обогащен одним из белков внеклеточного матрикса - ламинином, который синтезируется клетками исследованных гепатом крыс, связывается с плазматической мембраной этих клеток посредством ряда мембранных компонентов и является необходимым, по-видимому, для про-лиферативной активности клеток.

ВЫВОДЫ

1. На клетках гепатоцеллюлярных опухолей Зайдела, НТС и 27 крыс присутствуют мембранные антигены, характерные для почек крыс, не обнаруживаемые в гепаго-цитах интактных животных.

2. Обнаруженные мембранные опухолеассоциированные антигены являются периферическими белками и связаны с пролиферативной активностью культивируемых гепатомных клеток.

3. Выявлен мембранный опухолевый антиген почечной специфичности, ассоциированный с гепатомами Зайдела и НТС крыс.

4. Выделенный антиген, ассоциированный с гепатомами Зайдела и НТС крыс, идентифицирован как белок внеклеточного матрикса - ламинин (а4, (11, (32 и у' цепи ламинина, что соответствует ламинину 8/9).

5. Ламинин, синтезируемый клетками гепатомы Зайдела крысы, связывается с клеточной мембраной посредством нескольких ламинин-связывающих белков, один из которых идентифицирован как белок теплового шока ОЯР78.

ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Н.П, Терюкова, И.И. Тюряева, А.Б. Грандилевская, В.А. Иванов. 1996. Исследование мембранных антигенов опухолевых клеток крыс и гомологичных им дефинитивных тканей с помощью органоспецифической сыворотки против клеточных мембран почки. Материалы Всероссийского симпозиума «Биология клетки в культуре». Цитология. 38 (2): 284-285.

2. Н.П. Терюкова, И.И. Тюряева, А.Б. Грандилевская, В.А. Иванов. 1996. Мембранные гетероорганные антигены опухолей гепатоцеллюлярного и миогенного происхождения. Цитология. 38(10): 1092-1097.

3. Н.П. Терюкова, И.И. Тюряева, А.Б. Грандилевская, В.А. Иванов. 1997. Выявление мембранных опухолеассоциированных антигенов гепатомы Зайдела на поверхности культивируемых клеток крыс. Цитология. 39 (7): 577-581.

4. N.P. Teryukova, G.I. Blinova, I.I. Tyuryaeva, V.A. Ivanov. 1999. Inhibitory Effect of Polyclonal Antibodies against Tumor-Associated Membranous Heteroorganic Antigen MA-50 on DNA Synthesis in Cultured Rat Cells. Experimental Oncology. 21 (2): 146-149.

5. Н.П. Терюкова, И.И. Тюряева, Ю.М. Розанов, Г.И. Блинова, А.Б. Грандилевская, В.А. Иванов. 1999. Использование проточной цитофлуориметрии для количественной оценки связывания органоспецифической антипочеченой сыворотки с поверхностными антигенами некоторых культивируемых клеток и гепатоцитов крысы. Материалы Всероссийского симпозиума «Биология клетки в культуре». Цитология. 41 (3/4): 317-318.

6. И.И. Тюряева, O.A. Черепанова, В.А. Иванов. 2003. Антигенная дивергенция опухолевых клеток: функциональное значение гетероорганных антигенов. В. сб. тезисов 7-й Пущин-ской школы-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века»: 383-384.

7. И.И. Тюряева, В.А. Иванов. 2003. Идентификация гетероорганных опухолеассоцииро-ванных антигенов гепатомы Зайдела крыс. I Съезд Общества клеточной биологии. Цитология. 45 (9): 938.

8. И.И. Тюряева, В.А. Иванов. 2003. Исследование мембранных гетероорганных опухо-леассоциированных антигенов при канцерогенезе. Тезисы I Всероссийской конференции «Физиология иммунной системы» и I Всероссийской конференции по иммунотерапии. International Journal on Immunorehabilitation. 5 (2): 225-226.

9. И.И. Тюряева, В.А. Иванов. 2003. Исследование уровня сывороточного ламинина при опухолевом росте. Тезисы I Всероссийской конференции «Физиология иммунной системы» и I Всероссийской конференции по иммунотерапии. International Journal on Immunorehabilitation. 5 (2): 226.

10. И.И. Тюряева. 2003. Идентификация гетероорганных опухолеассоциированных антигенов гепатомы Зайдела крыс. 8-я Санкт-Петербургская ассамблея молодых ученых и специалистов. В сб. аннотаций работ по грантам Санкт-Петербургского конкурса 2003 г. для студентов, аспирантов и молодых специалистов: 57.

11. Е.П. Подольская, И.И. Тюряева, A.B. Новиков, O.A. Миргородская. 2004. Исследование и идентификация опухолеассоциированных антигенов гепатомы Зайдела крысы методом масс-спектрометрии. Тезисы II Международного семинара-школы «Масс-спектрометрия в химической физике, биофизике и экологии»: 241.

12. И.И. Тюряева, В.А. Иванов. 2004. Пролиферативные процессы в печени и ламинин. Тезисы Международного симпозиума по биологии клетки в культуре «Стволовые клетки, регенерация, клеточная терапия». Цитология. 46 (10): 944.

13. И.И. Тюряева, В.А. Иванов. 2005. Неопластическая трансформация гепатоцитов ассоциирована с синтезом ламинина. Тезисы Российской конференции по фундаментальной онкологии «Петровские чтения-2005». Вопросы онкологии. 51 (1): 24-25.

14. И.И. Тюряева, O.A. Миргородская, O.A. Черепанова, Е.П. Подольская, A.B. Новиков, М.А. Ходорковский, В.А. Иванов. 2005. Выявление и идентификация ламинина в составе плазматических мембран клеток асцитной гепатомы Зайдела крысы. Цитология. 47 (2): 150162.

15. И.И. Тюряева, O.A. Миргородская, O.A. Черепанова, Е.П. Подольская, М.В. Серебрякова, В.А. Иванов. 2005. Взаимодействие ламинина с компонентами плазматических мембран клеток асцитной гепатомы Зайдела. Цитология. 47 (12): 1039-1047.

16. LI. Tyuryaeva. 2005. Hepatocarcinogenesis is associated with laminin synthesis. In abstract book: "Current trends in comparative immunology. DAAD Summer School on St. Petersburg": 28.

СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

Гринчишин В.П., Осипов Л.А., Винарчук М.П. 1981. Выделение гепатоцитов из печени интактных крыс, получавших канцероген. Экспериментальная онкология. 3 (I): 29-33. Иванов В.А. 1982. Антигенные перестройки клеточных структур как следствие первичного действия химических канцерогенов. В кн.: Цитологические аспекты первичного действия химических канцерогенов. Л., Наука, 23—58. Иванов В.А., Белишева Н.К., Якобидзе В.Э., Фель В.Я. 1979. К оценке изменений антигенной структуры печени крыс после однократного канцерогенного воздействия. Цитология. 21 (7): 836-842. Иванов В.А., Фель В.Я. 1979. Исследование мембранных гетсроорганных антигенов регенерирующей печени крыс. Цитология. 21(1): 115-117. Иванов В.А., Фель В.Я., Оленов Ю.М. 1975. О мембранных антигенах клеток асцитной гепатомы Зайдела. Цитология. 17 (1): 2429. Лежнева О.М. 1968. Выявление поверхностных антигенов на живых клетках методом флюоресцирующих антител. В кн.: Иммунохимический анализ. М„ Медицина, 189—201. Терюкова Н.П., Иванов В.А. 1993. Выделение и характеристика мембранных гетероор-ганных антигенов почечной природы, ассоциированных с гепатомой Зайдела. Цитология. 36 (8): 59—63. Терюкова Н.П., Тюряева И.И., Грандилевская А.Б., Иванов В.А. 1996. Мембранные гетероорганные антигены опухолей гепатоцеллюлярного и миогенного происхождения. Цитология. 38 (10): 1092-1097. Терюкова П.П., Тюряева И.И., Грандилевская А.Б., Иванов В.А. 1997. Выявление мембранных опухолеассоциированных антигенов гепатомы Зайдела на поверхности культивируемых клеток крыс. Цитология. 39 (7): 577-581. Тюряева И.И.,. Миргородская О.А, Черепанова О.А, Подольская Е.П., Новиков

А.В., Ходорковский М.А., Иванов В.А. 2005а. Выявление и идентификация ламинина в составе плазматических мембран клеток асцитной гепатомы Зайдела крысы. Цитология. 47 (2): 150-162. Тюряева И.И., Миргородская О.А., Черепанова О.А., Подольская Е.П., Серебрякова М.В., Иванов В.А. 20056. Взаимодействие ламинина с компонентами плазматических мембран клеток асцитной гепатомы Зайдела. Цитология. 47 (12): 1039-Г047. Фель В.Я., Швембергер И.Н. 1968. Морфологическое и иммунологическое изучение ци-тодифференцировки экспериментальных опухолей. Л., Наука, 208 с. Фель В.Я., Швембергер И.Н., Иванов В.А. 1965. К исследованию специфических антигенов, вызванных у крыс введением N-нитроздиэтиламина. Цитология. 7 (3): 416-420. Агар М.А., Lahdenranta J„ Mintz P.J., Hajitou A., Sarkis A.S., Arap W., Pasqalini R. 2004. Cell surface expression of the stress response chaperone GRP78 enables tumor targeting by circulating ligands. Cancer Cell. 6 : 275—284. Beloshapkina T.D., Abelev G.I. Immunohistochemical characteristics of Insoluble Mouse Liver Cell Antigens. 1965. J Folia Biologica. 11 : 472—477. Day E.D. 1965. Antigenic diversion in cancer. Proc. American Assoc. Cancer Res. 6: 13-17. Delpino A., Piselli P., Vismara D„ Vendetti S., Colizzi V. 1998. Cell surface localization of the 78 kD glucose regulated protein (GRP 78) induced by thapsigargin. Mol Membr Biol. 15 : 21—26. Haeffner E.W., Kolbe K., Schroeter D., Paweletz N. 1980. Isolation of a light and a heavy membrane-fraction of the glucogen-free Ehrlich-Lettre substain. Biochem. Biophys. Acta. 603 : 36—51. Ivanov V.A., Kushner V.P., Fel V. Ja. 1986. Antigenic diversion of rat liver cells characteristic of hepatocellular tumors after a single carcinogenic treatment and partial hepatectomy. Acta. Biol. Hudg. 36: 225-227. Ivanov V.A., Fel V. Ja. 1980. On some similarity between membrane antigens of the cell of Zajdela hepatoma and liver of rats subjected to a single 4-dimethylaminoazobenzene injection. Neoplasma. 27: 745-50. Laemmli U.K. 1970. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head bacteriophage T4. 227: 680—685. Little E„ Ramakrishnan M., Roy В., Gazit G., Lee A.S. 1994. The glucose-regulated proteins (GRP78 and GRP94): functions, gene regulation, and applications. Crit. Rev. Eukeryotic Gene Expression. 4: 1—18. Liu C., Bhattacharjee G., Boisvert W„ Dilley R., Edgington T. 2003. In vivio interrogation of the molecular display of atherosclerotic lesion surfaces. Amer. J. Path. 163 : 1859—1871. Lowry O.H., Rosobrough N.J., Farr A.L., Radall R.J. 1951. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J. Biol. Chem. 193: 265-275. Markwell M.A.K., Haas S.V., Bieber L.L., Tolbert N.E. 1978. A modification of the Lowry procedure to simplify protein determination in membrane and lipoprotein samples.Anal. Biochem. 87 : 206—210. Mecham R.P. 1991. Reccptors for laminin on mammalian cells. FASEB J. 5 : 2538—2546. Misra U.K., Gonzalez-Gronow M., Gawdi G., Pizzo S.V. 2005. The role of MTJ-1 in cell surface translocation of GRP78, a receptor for a2-macroglobulin-dependent signaling. J. Immunol. 174:

2092—2097. Munro S., Pelham H.R.B. 1986. An Hsp70-like protein in the ER: identity with the 78 kd glucose-regulated protein and immunoglobulin heavy chain binding protein. Cell. 46 : 291—300. Shevchenko A., Wilm M., Vorm O., Mann M. 1996. Mass spectrometric sequencing of proteins silver-stained Polyacrylamide gels. Anal Chem. 68 : 850—858. Shin B.K., Wang H., Yim A.M., Naour F.L., Brichory F., Jang J.H., Zhao R„ Puravs E„ Tra J., Michael C.W., Misek D.E., Hanash S.M. 2003. Global profiling of the cell surface proteome of cancer cclls uncovers an abudance of proteins with chaperone function. J. Biol. Chem. 278 : 7607—7616. Triantafilou K„ Fradelizi D., Wilson K„ Triantafilou M. 2001. GRP78, a coreceptor for coxsackievirus A9, Interacts with major histocompatibility complcx class I molecules which mediate virus internalization. J. Virology. 77: 2784—2788. Von der Mark K„ Risse G. 1987. Izolation and Characterization of Laminin Receptors. Metods in enzymology. 144 : 490—507. Zak-Nejmark N.. Stenden J., Radzikowski C. 1978. Mammary leukemia (ML) antigen isolated from L 1210 leukemia cells. Int. J. Cancer. 21: 490-495.

Лицензия ЛР №020593 от 07.08.97

Подписано в печать 15.09.2006. Формат 60x84/16. Печать цифровая. Усл. печ. л. 1,0. Тираж 100. Заказ 783Ъ.

Отпечатано с готового оригинал-макета, предоставленного автором, в Цифровом типографском центре Издательства Политехнического университета. 195251, Санкт-Петербург, Политехническая ул., 29. Тел.: 550-40-14 Тел./факс: 297-57-76

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Тюряева, Ирина Ивановна

1. ВВЕДЕНИЕ.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1. Антигенные перестройки опухолевых клеток и методы их выявления.

2.2. Механизмы превращения нормальной клетки в опухолевую.

2.3. Опухолеспецифические антигены

2.3.1. Мутантные антигены.

2.3.2. Вирусные антигены.

2.4. Опухолеассоциированные антигены

2.4.1. Дифференцировочные антигены.

2.4.2. Амплифицированные/гиперэкспрессируемые генные продукты и универсальные опухолевые антигены.

2.4.3. Гетероорганные антигены.

2.5. Антигенные изменения, сопровождающие развитие гепатоцеллюлярных опухолей.

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

4. РЕЗУЛЬТАТЫ

4.1 Характеристика полученных иммуносывороток.

4.2. Выявление опухолеассоциированных мембранных антигенов гепатомы Зайдела.

4.3. Выявление гетероорганных антигенов на поверхности культивируемых клеток и их связь с пролиферативной активностью клеток.

4.4. Идентификация мембранных опухолеассоциированных гетероорганных антигенов 4.4.1. Определение молекулярных масс опухолеассоциированных мембранных белков клеток гепатомы Зайдела, реагирующих с антипочечной иммуносывороткой.

4.4.2. Масс-спектрометрический анализ выявленных опухолеассоциированных гетероорганных антигенов клеток гепатомы Зайдела крыс.

4.4.3. Подтверждение результатов масс-спектрометрического анализа методами иммуноблотинга и непрямой иммунофлуоресценции.

4.4.4. Сравнительный анализ двух мембранных опухолеассоциированных гетероорганных антигенов, выявляемых в районе 200 кДа, клеток гепатомы Зайдела и гепатомы НТС.

4.5 Выявление опухолеассоциированного антигена, идентифицированного как ламинин, на поверхности гепатоцитов крыс после однократного воздействия гепатоканцерогеном ДЭНА.

4.6. Идентификация ламинин-связывающих мембранных белков клеток гепатомы Зайдела.

5. ОБСУЖДЕНИЕ.

6. ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Выявление и идентификация мембранного антигена, ассоциированного с гепатоцеллюлярными опухолями крыс"

Проблемы дифференцировки, дисдифференцировки и пролиферации клеток являющиеся одними из основных проблем современной биологии, особенно актуальны для фундаментальной онкологии. При неопластической трансформации в клетке происходят значительные изменения, позволяющие ей приобрести такие свойства, которые предопределяют ее возможность образовать злокачественную опухоль. Эти события выражаются в становлении новых антигенных свойств ма-лигнизированных клеток, которые в значительной степени определяются антигенами клеточной поверхности.

Поэтому исследования, направленные на выявление опухолевых антигенов и их идентификацию, приводят к пониманию не только клеточных, но и молекулярных механизмов опухолевой трансформации, прогессии опухоли и механизмов избежания опухолью иммунного ответа. Такие исследования являются одним из важнейших и активно разрабатываемых направлений в онкоиммунологии.

В настоящее время в мире накоплен громадный фактический материал об антигенах опухолевых клеток, который нуждается в систематизации, что автор и попытался сделать в главе «Обзор литературы».

Феномен антигенной дивергенции, при котором малигнизированные клетки синтезируют антигены, свойственные нормальным тканям, негомологичным опухоли, является типичным событием при опухолевой трансформации. Исследования этого явления часто носят феноменологический характер, редко доходят до идентификации обнаруженных опухолеассоциированных антигенов, не говоря уже об изучении этого явления в более широком биологическом плане с целью выяснения молекулярных и клеточных механизмов канцерогенеза, задающих направление нарушений дифференцировки трансформированных клеток.

Так, при исследовании гепатоцеллюлярных опухолей крыс иммунологическими методами было установлено наличие мембранных опухолеассоциированных антигенов, не свойственных нормальным гепатоцитам, но характерных для почек ин-тактных крыс (локализация - базальная мембрана извитых канальцев почки и апикальные части клеток эпителия главных отделов нефрона). Обнаруженные антигены также выявлялись в регенерирующей печени крыс после операции частичной гепатэктомии и на гепатоцитах крыс, получавших гепатоканцероген, причем уже спустя 1 сут после однократного применения канцерогена. Однако идентификация опухолеассоциированных антигенов, наличие которых регистрировалось с помощью органоспецифической иммуносыворотки против клеточных мембран («клеточных теней») почек крыс, не проводилась. Поэтому целью настоящей работы стало выявление, определение молекулярной массы и идентификация опухолевых антигенов (-а), ассоциированных с гепатоцеллюлярными опухолями крыс, обнаруживаемых с помощью органоспецифической антипочечной иммуносыворотки.

Конкретные задачи работы.

1. Получить специфические иммуносыворотки к исследуемым антигенам.

2. С помощью полученных иммуносывороток охарактеризовать опухолеас-социированные антигены некоторых гепатоцеллюлярных опухолей и опухолей иного гистогенеза.

3. Выделить мембранный опухолеассоциированный антиген почечной специфичности.

4. Охарактеризовать выделенный опухолеассоциированный антиген и идентифицировать его методом масс-спектрометрии.

5. Провести сравнительный анализ двух гепатоцеллюлярных опухолей крыс в отношении исследуемого антигена.

Положения, выносимые на защиту:

2. Анализ опухолеассоциированного мембранного антигена клеток двух гепатоцеллюлярных опухолей крыс позволил идентифицировать его как белок внеклеточного матрикса - ламинин.

Заключение Диссертация по теме "Гистология, цитология, клеточная биология", Тюряева, Ирина Ивановна

107 6. Выводы

1. На клетках гепатоцеллюлярных опухолей Зайдела, НТС и 27 крыс присутствуют мембранные антигены, характерные для почек крыс, не обнаруживаемые в гепатоцитах интактных животных.

4. Выделенный антиген, ассоциированный с гепатомами Зайдела и НТС крыс, идентифицирован как белок внеклеточного матрикса - ламинин (а4, р1, р2 и у1 цепи ламинина, что соответствует ламинину 8/9).

108

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Тюряева, Ирина Ивановна, Санкт-Петербург

1. Абелев Г.И. 1979. Эмбриональные антигены в опухолях. Анализ в системе альфа-фетопротеина. В кн.: Опухолевый рост как проблема биологии развития. М. Наука, 148-173.

2. Абелев Г.И. 2000а. Иммунология опухолей человека. В кн.: Канцерогенез. М., Научный мир: 333-341.

3. Абелев Г.И. 20006. Механизмы дифференцировки и опухолевый рост. Биохимия. 65 (1): 127-138.

4. Абелев Г.И. 2003. Дифференцировочные антигены в опухолях зависимость от механизмов канцерогенеза и прогрессии (гипотеза). Молекулярная биология. 37 (1): 4-11.

5. Албертс Б., Брей Д., Льюис Дж., Рэфф М., Роберте К., Уотсон Дж. 1986. Молекулярная биология клетки. М., Мир. 2 : 97.

6. Албертс Б., Брей Д., Льюис Дж., Рэфф М., Роберте К., Уотсон Дж. 1994. Контроль генной экспрессии. В сб: Молекулярная биология клетки. М., Мир, 176-253.

7. Гурцевич В.Э. 2000а. Герпесвирусы: вирус Эпштейна-Барр. В кн.: Канцерогенез. М., Научный мир: 193-205.

8. Гурцевич В.Э. 20006. Вирус герпеса человека 8-го типа. В кн.: Канцерогенез. М., Научный мир: 206-217.

9. Дейчман Г.И. 2000а. Антигены опухолевых клеток. В кн.: Канцерогенез. М., Научный мир, 420 с.

10. Дейчман Г.И. 20006. Специфические трансплантационные опухолевые антигены. В кн.: Канцерогенез. М., Научный мир, 420 с.

11. Зильбер Л.А., Абелев Г.И. 1962. Вирусология и иммунология рака. М., Медгиз.

12. Иванов В.А., Белишева Н.К., Якобидзе В.Э., Фель В.Я. 1979. К оценке изменений антигенной структуры печени крыс после однократного канцерогенного воздействия. Цитология. 21 (7): 836-842.

13. Иванов В.А., Фель В.Я. 1979. Исследование мембранных гетероорганных антигенов регенерирующей печени крыс. Цитология. 21(1): 115-117.

14. Иванов В.А., Фель В.Я. 1995. Сравнительное изучение синтеза мембранных гетероорганных антигенов почечной природы на тканевых срезах и изолированных клетках после однократного канцерогенного воздействия на крыс. Цитология. 37(3): 227-31.

15. Иванов В.А., Фель В.Я., Оленов Ю.М. 1975. О мембранных антигенах клеток асцитной гепатомы Зайдела. Цитология. 17(1): 24-29.

16. Киселев Ф.Л. 2000а. Вирус-ассоциированные опухоли человека: рак шейки матки и вирусы папиллом. Биохимия. 65: 79-91.

17. Киселев Ф.Л. 20006. Роль вируса гепатита в развитии рака печени. В кн.: Канцерогенез. М., Научный Мир: 188-192.

18. Киселева Н.П., Киселев Ф.Л. 2000. Эпигенетические изменения и канцерогенез (роль теломеразы и роль метилирования ДНК). В кн.: Канцерогенез. М., Научный Мир: 93-105.

19. Копнин Б.П. 2000а. Опухолевые супрессоры и мутаторные гены. В кн.: Канцерогенез. М., Научный Мир: 75-92.

20. Копнин Б.П. 20006. Мишени действия онкогенов и опухолевых супрессо-ров: ключ к пониманию базовых механизмов канцерогенеза. Биохимия. 65 (1): 5-33.

21. Лазаревич Н.Л. 2004. Молекулярные механизмы прогрессии опухолей печени. Успехи биологической химии. 44: 365-418.

22. Лежнева О.М. 1968. Выявление поверхностных антигенов на живых клетках методом флюоресцирующих антител. В кн.: Иммунохимический анализ. М., Медицина, 189—201.

23. Ровенский Ю.А., Васильев Ю.М. 2000. Морфогенетические реакции клеток и их нарушения при опухолевой трансформации. В кн.: Канцерогенез. М., Научный Мир: 260-283.

24. Рогальский В.Я. 1964. Изучение антигенных различий раковой и нормальной ткани прямой кишки. Бюл. экспер. биологии. 58 (10): 82-84.

25. Татосян А.Г. 2000. Онкогены. В кн.: Канцерогенез. М., Научный Мир: 5774.

26. Терюкова Н.П., Тюряева И.И., Грандилевская А.Б., Иванов В.А. 1996. Мембранные гетероорганные антигены опухолей гепатоцеллюлярного и мио-генного происхождения. Цитология. 38(10): 1092-1097.

27. Терюкова Н.П., Тюряева И.И., Грандилевская А.Б., Иванов В.А. 1997. Выявление мембранных опухолеассоциированных антигенов гепатомы Зайдела на поверхности культивируемых клеток крыс. Цитология. 39 (7): 577-581.

28. Тюряева И.И.,. Миргородская О.А, Черепанова О.А, Подольская Е.П., Новиков A.B., Ходорковский М.А., Иванов В.А. 2005а. Выявление и идентификация ламинина в составе плазматических мембран клеток асцитной гепатомы Зайдела крысы. Цитология. 47 (2): 150-162.

29. Тюряева И.И., Миргородская O.A., Черепанова O.A., Подольская Е.П., Серебрякова М.В., Иванов В.А. 20056. Взаимодействие ламинина с компонентами плазматических мембран клеток асцитной гепатомы Зайдела. Цитология. 47(12): 1039-1047.

30. Фель В .Я., Иванов В.А., Цикаришвили Т.Н., Бахтин Ю.Б., Швембергер И.Н., Оленов Ю.М. 1966. Характеристика гетероантигенов экспериментальных опухолей крыс.//В сб.: Клеточная наследственность и злокачественный рост. М.-Л., 146-153.

31. Фель В .Я., Швембергер И.Н. 1968. Морфологическое и иммунологическое изучение цитодифференцировки экспериментальных опухолей. Д., Наука, 208 с.

32. Фель В .Я., Швембергер И.Н., Иванов В.А. 1965. К исследованию специфических антигенов, вызванных у крыс введением N-нитроздиэтиламина. Цитология. 7 (3): 416-420.

33. Чумаков П.М. 2000. Функции гена р53: выбор между жизнью и смертью. Биохимия. 65 (1): 34-47.

34. Abe К., Murakami S., Mukae N., Mita Т., Hashimoto Y., Isemura M., Shímo-Oka Т., Ii I., Kimata К., Narumi К., Satoh К., Nukiwa Т. 1996. Presence of atypical laminin on the surface of mouse Lewis lung carcinoma cells. Tohoku J. Exp. Med. 180:33-44.

35. Abelev G.I. 1965. Antigenic structure of chemically induced hepatoma. Prog. Exp. Tumor Res. 7: 104-157.

36. Abelev G.I., Eraizer T.L. 1999. Cellular aspects of alpha-fetoprotein reexpression in tumors. Semin. Cancer Biol. 9: 95-104.

37. Abelev G.I., Perova S.D., Khramkova N.I., Postnikova Z.A., Irlin I.S. 1963. Production of embryonal alphaglobulin by transplantable mouse hepatomas. Transplantation. 1:174-180.

38. Abelev G.I., Sell S. 1999. Tumor markers. Introduction. Semin. Cancer Biol. 9:61.65.

39. Albrechtsen R., Wewer U.M., Thorgeirsson S.S. 1988. De novo deposition of laminin-positive basement membrane in vitro by normal hepatocytes and during hepa-tocarcinogenesis. Hepatology. 8 : 538—546.

40. Alison M.R., Poulsom R., Jeffery R., Dhillon A.P., Quaglia A., Jacob J., Novelli M., Prentice G., Williamson J., Wright N.A. 2000. Hepatocytes from non-hepatic adult stem cells. Nature. 406: 257.

41. Ambrosini G., Adida C., Altieri D.C. 1997. A novel anti-apoptosis gene, survival, expressed in cancer and lymphoma. Nat. Med. 3: 917-921.

42. Amenta P.S., Harison D. 1998. Expression and potential role of the extracellular matrix in hepatic ontogenesis: A review. Microscopy Research and Technique. 39: 372—386.

43. Arai H., Saitoh S., Matsumoto T., Makita F., Mitsugi S., Yuasa K., Takagi H., Mori M. 1999. Hypertension as a paraneoplastic syndrome in hepatocellular carcinoma. J. Gastroenterology. 34: 530-534.

44. Arap M.A., Lahdenranta J., Mintz P.J., Hajitou A., Sarkis A.S., Arap W., Pasqalini R. 2004. Cell surface expression of the stress response chaperone GRP78 enables tumor targeting by circulating ligands. Cancer Cell. 6: 275—284.

45. Asplin I.R., Misra U.K., Gawdi G., Gonzalez-Gronow M., Pizzo S.V. 2000. Selective upregulated expression of the alpha 2-macroglobulin signaling receptor in highly metastatic 1-LN prostate carcinoma cells. Arch Biochem. Biophys. 383: 135—141.

46. Aumailley M., Smyth N. 1998. The role of laminins in basement membrane function. J. Anat. 193: 1-21.

47. Badvie S. 2000. Hepatocellular carcinoma. Postgrad. Med. J. 76: 4-11.

48. Baloch Z., Klapper J., Buchanan L., Schwartz M., Amenta P.S. 1992. Ontogenesis of the murine hepatic extracellular matrix: an immunohistochemical study. 1992. Differentiation. 51: 209—218.

49. Bain I., McMaster P. 1997. Benign and malignant liver tumors. Surgery. 15: 169-174.

50. Baldwin R.W., Barker C.R. 1967. Antigenic composition of transplanted rat hepatomas originally induced 4-dimethylaminoazobenzene. Brit. J. Cancer. 21: 338345.

51. Basombrio M.A. 1970. Search for common antigenicity among twenty-five sarcomas induced by methylcholanthrene. Cancer Res. 30: 2458-2462.

52. Basombrio M.A., Prehn R.T. 1972. Studies on the basis of diversity and time of appearance of chemically-induced tumors. Natl. Cancer Inst. Monogr. 35: 117-124.

53. Beloshapkina T.D., Abelev G.I. Immunohistochemical characteristics of Insoluble Mouse Liver Cell Antigens. 1965. J Folia Biologica. 11 : 472—477.

54. Bernal S.D., Speak J.A. 1984. Membrane in small cell carcinoma of the lung defined by monoclonal antibody SMI. Cancer Res. 44: 265-270.

55. Bober F.J., Birk D.E., Shenk T., Raska K. Jr. 1988. Tumorogenicity of adeno-virus-tyransformed cells: collagen interaction and cell surface laminin are controlled by the serotype origin of the El A and E1B genes. J. Virology. 62: 580-585.

56. Bralet M.P., Pichard V., Ferry N. 2002. Demonstration of direct lineage between hepatocytes and hepatocellular carcinoma in diethylnitrosamine-treated rats. Hepatology. 36: 623-630.

57. Brandle D., Brasseur F., Weynants P., Boon T., Van den Eynde B. 1996. A mutated HLA-A2 molecule recognized by autologous cytotoxic T lymphocytes on a human renal cell carcinoma. J. Exp. Med. 183: 2501-2508.

58. Brechot C., Gozuacik D., Murakami Y., Brechot P. 2000. Molecular bases for the development of hepatitis B virus (HBV)-related hepatocellular carcinoma (HCC). Sem. Cancer Biol. 10: 211-231.

59. Buckanovich R., Posner J.B., Darnel R.B. 1993. Nova, the paraneoplastic Riantigen, is homologous to an RNA-binding protein and is specifically expressed in the developing motor system. Neuron. 11: 657-672.

60. Buendia M.A. 2000. Genetics of hepatocellular carcinoma. Semin. Cancer Biol. 10: 185-200.

61. Busso D., Cohen D.J., Hayashi M., Kasahara M., Cuasnicu P.S. 2005. Human testicular protein TPX1/CRISP-2: localization in spermatozoa, fate after capacitation and relevance for gamete interaction. Mol. Hum. Reprod. 11: 299-305.

62. Butterfield L. 2004. Immunotherapeutic Strategies for hepatocellular carcinoma. Gastroenterology. 127: 232-241.

63. Buzyn A., Ostankovitch M., Zerbib A., Kemula M., Connan F., Varet B., Guillet J.G., Choppin J. 1997. Peptides derived from the whole sequence of BCR-ABL bind to several class I molecules allowing specific induction of human cytotoxic

64. T lymphocytes. Eur. J. Immunol. 27: 2066-2072.

65. Cai J.W., Henderson B.W., Shen J.W., Subjeck J.R. 1993. Induction of glucose regulated proteins during growth of a murine tumor. J. Cell Physiol. 154: 229—237.

66. Cambier N., Zhang Y., Vairo G., Kosmopoulos K., Metcalf D., Nocola N., Elefanty A. 1999. Expression of BCR-ABL in Ml myeloid leukemia cells induced differentiation without arresting proliferation. Oncogene. 18: 343-352.

67. Chang C.R., Martin R.G., Livingston D.M., Luborsky S.W., Hu C.-P., Mora P.T. 1979. Relationship between T-antigen and tumor-specific transplantation antigen in simian virus 40-transformed cells. J. Virol. 29: 69-75.

68. Charrad R.-S., Li Y., Delpech B., Balitrand B., Clay D., Jasmin C., Chominne Ch., Smadya-Ioffe F. 1999. Nature Med. 5: 669-676.

69. Chiari R., Foury F., De Plaen E., Baurain J.F., Thonnard J., Coulie P.G. 1999. Two antigens recognized by autologous cytolytic T lymphocytes on a melanoma result from a single point mutation in an essential housekeeping gene. Cancer Res. 59:• 5785-5792.

70. Cho D.-Y., Yang G.-H., Ryu C.J., Hong H.J. 2003. Molecular chaperone GRP78/BiP interacts with the large surface protein of hepatitis B virus in vitro and in vivo. J. Virology. 77: 2784—2788.

71. Choudhury A., Kiessling R. 2004. Her-2/Neu as a Paradigm of a Tumor-Specific Target for Therapy. Breast Disease. 20: 25-31.

72. Chung A.E., Freeman I.L., Braginski J.E. 1977. A novel extracellular membrane elaborated by a mouse embryonal carcinoma-derived cell line. Bioch. Biophys. Res. Commun. 79 : 859—868.

73. Chung A.E., Jaffe R., Freeman I.L., Vergnes J.P., Braginski J.E., Carlin B. 1979. Properties of a basement membrane-related glycoprotein synthesized in culture by a mouse embryonal carcinoma-derived cell line. Cell. 16 : 277—287.

74. Cilensek Z.M., Yehiely F., Kular R.K., Deiss L.P. 2002. A member of the GAGE family of tumor antigens is an anti-apoptotic gene that confers resistance to Fas/CD95/APO-l, interferon-y, taxol and y-irradiation. Cancer Biol. Ther. 1: 380-387.

75. Clement B., Rescan P.Y., Baffet G., Loreal O., Lehry D., Campion J.P., Guil-louzo A. 1988. Hepatocytes may produce laminin in fibrotic liver and in primary culture. Hepatology. 8: 794—803.

76. Collazos J., Diaz F., Genolla J. 1993. Serum concentrations of laminin in cirrhosis of the liver. Gut. 34 : 974—976.

77. Colognato H., Yurchenco P.D. 2000. Form and function: the laminin family of heterotrimers. Dev Dyn. 218 : 213—234.

78. Coulie P.G., Lehmann F., Lethe B., Herman J., Lurquin C., Andrawiss M., Boon N. 1995. A mutated intron sequence codes for an antigenic peptide recognized by cytolytic T lymphocytes on a human melanoma. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 92 : 7976 7980.

79. Cunningham J., Graus F., Anderson N., Posner J. 1986. Partial characterization of the Purkinje cell antigens in paraneoplastic cerebellar degeneration. Neurology. 36: 1163-1168.

80. Daley G., van Etten R., Baltimore D. 1990. Induction of chronic myelogenous leukemia in mice by the P210bcr/abl gene of the Philadelphia chromosome. Science. 247:824-830.

81. Dalmau J., Furneaux H.M., Cordon-Cardo C., Posner J.B. 1992. The expression of the Hu (paraneoplastic encephalomyelitis/sensory neuronopathy) antigen in human normal and tumor tissues. Am. J. Pathol. 141: 881-886.

82. Dalmau J., Furneaux H.M., Gralla R.J., Kris M.G., Posner J.B. 1990. Detection of the anti-Hu antibody in the serum of patients with small cell lung cancer a quantitative western blot analysis. Ann. Neurol. 27: 544-552.

83. Darnell R.B. 1996. Onconeural antigens and the paraneoplastic neurologic dis-ordes: at the intersection of cancer, immunity and brain. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93: 4529-4536.

84. Darnell R.B. 2004. Paraneoplastic neurologic disordes. Arch. Neurol. 61: 3032.

85. Day E.D. 1965. Antigenic diversion in cancer. Proc. American Assoc. Cancer Res. 6: 13-17.

86. Deb S.P. 2002. Function and dysfunction of the human oncoprotein MDM2. Front Biosci. 7:235-243.

87. Delpino A., Castelli M. 2002. The 78 kDa glucose-regulated protein (GRP78/BIP) is expressed on the cell membrane, is released into cell culture medium and is also present in human peripheral circulation. Biosci. Rep. 22: 407-420.

88. Delpino A., Piselli P., Vismara D., Vendetti S., Colizzi V. 1998. Cell surface localization of the 78 kD glucose regulated protein (GRP 78) induced by thapsigargin. Mol Membr Biol. 15:21—26.

89. De Smet C., De Backer O., Faraoni I., Lurquin Ch., Brasseur F., Boonet T. 1996. The activation of human gene MAGE-1 in tumor cells is correlated with genome-wide demethylation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93: 7149-7153.

90. De Smet C., Lurquin C., Lethe B., Martelange V., Boon T. 1999. DNA methy-lation is the primary silencing mechanism for a set of germ line- and tumor -specific genes with a CpG-rich promoter. Mol. Cell Biol. 19: 7327-7335.

91. Devereux T.R., Anna C.H., Foley J.F., White C.M., Sills R.C., Barrett J.C. 1999. Mutation of beta-catenin is an early event in chemically induced mouse hepatocellular carcinogenesis. Oncogene. 18: 4726 -4733.

92. Dorshkind K. 1994. Transcriptional control points during lymphopoiesis. Cell. 79:751-753.

93. Duan Z., Duan Y., Lamendola D.E., Yusuf R.Z., Naeem R., Penson R.T., Seiden M.V. 2003. Overexpression of MAGE/GAGE genes in paclitaxel/doxorubicin-resistant human cancer cell lines. Clin. Cancer Res. 9: 2778-2785.

94. Duvoux C. 1998. Epidemiology and dianosis of HCC in cirrhosis. Ann. Chir. 52: 511-517.

95. Evans J.P. 2001. Fertillin b and other ADAMs as integrin ligands: insights into cell adhesion and fertilization. Bioessays. 23: 628-639.

96. Fausto N. 1999. Mouse liver tumorogenesis: models, mechanisms and relevance to human disease. Semin. Liver Dis. 19: 243-252.

97. Feitelson M., Sun B., Tufan N. L. S., Liu J., Pan J., Lian Z. 2002. Genetic mechanisms of hepatocarcinogenesis. Oncogene. 21: 2593-2604.

98. Finger I.R., Harvey R.C., Moore R.C., Showe L.C., Croce C.M. 1986. A common mechanism of chromosomal translocation in T- and B-cell neoplasia. Science. 234: 982-985.

99. Flisiak R., Wiercinska-Drapalo A., Tynecka E. 2000. Transforming growth factor beta in pathogenesis of liver diseases. Wiad Lek. 53 : 530—537.

100. Fradet Y., Gordon-Cardo C., Thomson T., Daly M.E., Whitmore W.F., Lloyd K.O., Melamed M.R., Old L.J. 1984. Cell surface antigens of human bladder cancer defined by mouse monoclonal antibodies. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 81: 224-228.

101. Fujiwara H., Kikkawa Y., Sanzen N., Sekiguchi K. 2001. Purification and Characterization of Human Laminin-8. Laminin-8 Stimulates Cell Adhesion and Migration through a3pl and a6pl Integrins. J. Biol. Chem. 276 : 17550—17558.

102. Gazit G., Kane S.E., Nichols P., Lee A.S. 1995. Use of the stress-inducible grp78/BiP promoter in targeting high level gene expression in fibrosarcoma in vivo. Cancer Res. 55: 1660—1663.

103. Gaudin C., Kremer F., Angevin E., Scott V., Triebel F. 1999. A hsp70-2 mutation recognized by CTL on a human renal cell carcinoma. J. Immunol. 162:17301738.

104. Ghosh A.K., Steele R., Meyer K., Ray R., Ray R.B. 1999. Hepatitis C virus NS5A protein modulates cell cycle regulatory genes and promotes cell growth. J. Gen. Virol. 80: 1179-1183.

105. Giannelli G., Fransvea E., Bergamini C., Marinosci F., Antonaci S. 2003. Laminin-5 Chains are Expressed Differentially in Metastatic and Nonmetastatic Hepatocellular Carcinoma. Clin. Cancer Res. 9: 3684—3691.

106. Gleiberman A., Abelev G. 1985. Cell position and cell interactions in expression of fetal phenotype of hepatocyte. Int. Rev. Cytology. 95: 229-266.

107. R.T. 2002. HER-2/neu Expression and Gene Amplification in Gastrinomas. Correlations with Tumor Biology, Growth, and Aggressiveness. Cancer Res. 62: 3702-3710.

108. Gold P., Freedman S.O. 1965. Specific carcinoembryonic antigens of the human digestive system. J. Exp. Med. 122: 467-481.

109. Goldfinger L.E., Stack M.S., Jones J.C.R. 1998. Processing of laminin-5 and its functional consequences: role plasmin and tissue-type plasminogen activator. J. Cell Biol. 141:255—265.

110. Gordan J.D., Vonderheide R.H. 2002. Universal tumor antigens as target for immunotherapy. Cytotherapy. 4: 317-327.

111. Gorer P.A. 1956. Some recent work on tumor immunity. Adv. Cancer Res. 4: 149-186.

112. Graus F., Elkon K.B., Cordon-Cardo C., Posner J.B. 1986. Sensory neuronopa• thy and small cell lung cancer. Antineuronal antibody that also reacts with the tumor. Amer. J. Med. 80: 45-52.

113. Greaves M.F., Janossy G. 1978. Patterns of gene expression and the cellular origins of human leukaemias. Biochim. Biophys. Acta. 516: 193-230.

114. Grisham J.W. 1997. Interspecies comparison of liver carcinogenesis: implications for cancer risk assessment. Carcinogenesis. 18: 59-81.

115. Grizzi F., Chiriva-Internati M., Franceschini B., Hermonat P.L., Soda G., Lim S.H., Dioguardi N. 2003. Immunolocalization of sperm protein 17 in human testis and ejaculated spermatozoa. J. Histochem. Cytochem. 51: 1245-1248.

116. Grossman D., Kim P.J., Schechner J.S., Altieri D.C. 2001. Inhibition of melanoma tumor growth in vivo by survivin targeting. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 98: 635-640.

117. Gueguen M., Patard J.J., Gaugler B., Brasseur F., Renauld J.C., Van Cangh P.J., Boon T., Van den Eynde BJ. 1998. An antigen recognized by autologous CTLs on a human bladder carcinoma. J. Immunol. 160:6188-6194.

118. Gure A.O., Wei I.J., Old L.J., Chen Y.T. 2002. The SSX gene family: characterization of 9 complete genes. Int. J. Cancer. 101: 448-453.

119. Habel K.1962. Immunological determinants of polioma virus oncogenesis. J. Exp. Med. 115: 181-193.

120. Haeffner E.W., Kolbe K., Schroeter D., Paweletz N. 1980. Isolation of a light and a heavy membrane-fraction of the glucogen-free Ehrlich-Lettre substain. Bio-chem. Biophys. Acta. 603: 36—51.

121. Hahn W.C., Stewart S.A., Brooks M.W., York S.G., Eaton E„ Kurachi A., Bei-jersbergen R.L., Knoll J.H., Meyerson M., Weinberg R.A. 1999. Inhibition of telom-erase limits the growth of human cancer cells. Nat. Med. 5: 1164-1170.

122. Herbert B.-S., Pitts A.E., Baker S.I., Hamilton S.E., Wright W.E., Shay J.W., Corey D.R. 1999. Inhibition of human telomerase in immortal human cells leads to progressive telomere shortening and cell death. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96: 14276-14281.

123. Himmelweit B. 1957. The collection papers of Paul Ehrlich. Oxford, England, Pergamon.

124. Howe A., Aplin A., Alahari S., Juliano R. 1998. Integrin signaling and cell growth control. Current Opin. Cell Biol. 10: 220-231.

125. Hsu H.C., Jeng Y.M., Mao T.L., Chu J.S., Lai P.L., Peng S.Y. 2000. B-Catenin Mutations Are Associated with a Subset of Low-Stage Hepatocellular Carcinoma

126. Negative for Hepatitis B Virus and with Favorable Prognosis. Am. J. Pathol. 157: 763 -770.

127. Jamora C., Dennert G., Lee A.S. 1996. Inhibition of tumor progression by supression of stress protein GRP 78/BiP induction in fibrosarcoma B/C10ME. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93: 7690—7694.

128. Kamps M.A., Murre C., Sun X.-H., Baltimore D. 1990. A new homeobox gene contributes the DNA binding domain of the t(l;19) translocation protein in pre-B ALL. Cell. 60: 547-555.

129. Kato S., Otsu K., Ohtake K., Kimura Y., Yashiro T., Suzuki T., Akamatsu N. 1992. Concurrent Changes in Sinusoidal Expression of Laminin and Affinity of Hepa-tocytes to Laminin during Rat Liver Regeneration. Exp. Cell Res. 198 : 59—68.

130. Kawakami Y., Fujita N., Matsuzaki Y., Sakurai N., Tsukamoto M., Toda M., Sumimoto H. 2004. Identification of human tumor antigens and its implications for diagnosis and treatment of cancer. Cancer Sci. 95 : 784-791.

131. Kawaguchi T., Ono T., Wakabayashi H., Igarashi S. 1994. Cell surface laminin-like substances and laminin-related carbohydrates of rat ascites hepatoma AH7974 and its variants with different lung-colonizing potential. Clin. Exp. Metastasis. 12: 203-212.

132. Keeney S., Giroux C.N., Kleckner N. 1997. Meiosis-specific DNA doublestrand breaks are catalyzed by Spol 1, a member of a widely conserved protein family. Cell. 88: 375-384.

133. Kew M.C., Leckie B.J., Greff M.C. 1989. Arterial hypertension as a paraneoplastic phenomenon in hepatocellular carcinoma. Arch. Intern. Med. 149: 2111-2113.

134. Khong H.T., Rosenberg S.A. 2002. Pre-existing immunity to tyrosinase-related protein (TRP)-2, a new TRP-2 isoform, and the NY-ESO-1 melanoma antigen in a patient with a dramatic response to immunotherapy. J. Immunol. 168: 951-956.

135. Kim N.W., Piatyszek M.A., Prowse K.R., CB Harley C.B., West M.D., Ho P.L., Coviello G.M., Wright W.E., Weinrich S.L., Shay J.W. 1994. Specific association of human telomerase activity with immortal cells and cancer. Science. 266: 20112015.

136. Kimmins S., Sassone-Corsi P. 2005. Chromatin remodeling and epigenetic features of germ cells. Nature. 434: 583-589.

137. Kinzler K.W., Vogelstein, B. 1998. Landscaping the cancer terrain. Science (Wash. DC). 280: 1036-1037.

138. Klipke M.L. 1974. Antigenicity of murine skin tumors induced by ultraviolet light. J. Natl. Cancer Inst. 53: 1333-1336.

139. Korbling M., Katz R.L., Khanna A., Ruifrok A.C., Rondon G, Albitar M., Champlin R.E., Estrov Z. 2002. Hepatocytes and Epithelial Cells of Donor Origin in Recipients of Peripheral-Blood Stem Cells. N. Engl. J. Med. 346: 738 746.

140. Korner T., Kropf J., Gressner A.M. 1996. serum laminin and hyaluronan in liver cirrhosis: markers of progression with high prognostic value. J. Hepatology. 25 : 684—688.

141. Korsmeyer S.J. 1992. Chromosomal translocations in lymphoid malignancies reveal novel proto-oncogenes. Ann. Rev. Immunology. 10: 785-806.

142. Koshikawa N., Grannelli G., Cirulli V., Miyazaki K., Quaranta V. 2000. Role of cell surface metalloprotease MT1-MMP in epithelial cell migration over laminin-5. J. Cell Biol. 148 : 615—624.

143. Kossa N., Lucero G., Koziner B. 1996. Granulocyte-colony stimulating factor, granulocyte-macrophage colony stimulating factor and interleukin 4 induce differentiation in the U-937 human monocytic leukemia cell line. Leuk. Limphoma. 1-2: 163171.

144. F., Ackermann E.J., Bennett C.F. Rothermel A.L., Plescia J., Tognin S., Villa A., Marchisio P.C., Altieri D.C. 1999. Pleiotropic cell-division defects and apoptosis induced by interference with survivin function. Nat. Cell Biol. 1: 461-466.

145. W.W., Alexandre S„ Cao C„ Lee A.S. 1993. Transactivation of the grp78 promoter by Ca2+ depletion. A comparative analysis with A23187 and the endoplasmic reticulum Ca(2+)-ATPase inhibitor thapsigargin. J. Biol. Chem. 268: 12003—1209.

146. F., Ambrosini G., Chu E.Y. Plescia J., Tognin S., Marchisio P.C., Altieri D.C. 1998. Control of apoptosis and mitotic spindle checkpoint by survivin. Nature. 396: 580-584.

147. G., Miles A., Line A., Rees R.C. 2004. Identification of tumor antigens by serological analysis of cDNA expression cloning. Cancer Immunol. Immunother. 53 : 139-143.

148. G., Zhang X.Y., Fan D.M., Hu J.L. 1994. Detection of antigen specific immune complexes in sera of gastric and esophageal cancer patients. Chin. Med. J. (Engl). 107:189-191.

149. Maecker B., Sherr D.-H., Shen C et al. 1999. Targeting universal tumor antigens with cytotoxic T cells: potential of CYP1B1 for broadly applicable antigen-specific immunotherapy. Blood. 94S: 438.

150. Maher J.J., Tzagarakis C. 1994. Partial cloning of the M subunit of laminin from adult rat lipocytes: expression of the M subunit by cells isolated from normal and injured liver. Hepatology. 19 : 764—770.

151. Malinoff H.L., McCoy J.P. Jr., Varani J., Wicha. 1984. Metastatic potential of murine fibrosarcoma cells is influence by cell surface laminin. Int. J. Cancer. 33: 651655.

152. Mandelboim 0., Berke G., Fridkin M., Feldman M., Eisenstein M., Eisenbach L. 1994. CTL induction by a tumor-associated antigen octapeptide derived from murine lung carcinoma. Nature. 369: 67-71.

153. Mandruzzato S., Brasseur F., Andry G., Boon T., van der Bruggen P. 1997. A CASP-8 mutation recognized by cytolytic T lymphocytes on a human head and neck carcinoma. J. Exp. Med. 186:785-793.

154. Mann K., Deutzmann R., Timpl R. 1988. Characterization of proteolytic fragments of the laminin-nidogen complex and their activity in ligand-binding assays. Eur. J. Biochem. 178:71-80.

155. Markwell M.A.K., Haas S.V., Bieber L.L., Tolbert N.E. 1978. A modification of the Lowry procedure to simplify protein determination in membrane and lipoprotein samples.Anal. Biochem. 87 : 206—210.

156. Martinez-Hernandez A., Amenta P.S. 1993. The hepatic extracellular matrix. II. Ontogenesis, regeneration and cirrhosis. Virchows Arch. A Pathol. Anat. Histopa-thol. 423 : 77—84.

157. Martinez-Hernandez A., Amenta P.S. 1995. Liver regeneration I: The extracellular matrix in hepatic regeneration. FASEB J. 9 : 1401—1410.

158. Masson P., Palsson B., Andren-Sandberg A. 1990. Cancer-associated tumor markers CA 19-9 and CA-50 in patients with pancreatic cancer with special reference to the Lewis blood cell status. Br. J. Cancer. 62: 118-121.

159. Matsumoto S., Yamamoto K., Nagano T., Okamoto R., Ibuki N., Tagashira M., Tsuji T. 1999. Immunohistochemical study on phenotypical changes of hepatocytes in liver disease with reference to extracellular matrix composition. Liver. 19 : 32—38.

160. McCoy J.P. Jr., Lloyd R.V., Wicha M.S., Varani J. 1984. Identification of laminin-like substance on the surface of high-malignant murine fibrosarcoma cells. J. Cell Sci. 65: 139-151.

161. McKeage K., Perry C.M. 2002. Trastuzumab. A Review of its Use in the Treatment of Metastatic Breast Cancer Overexpressing HER2. Drugs. 62: 209-243.

162. Mecham R.P. 1991. Receptors for laminin on mammalian cells. FASEB J. 5 : 2538—2546.

163. Misra U.K., Gonzalez-Gronow M., Gawdi G., Pizzo S.V. 2005. The role of MTJ-1 in cell surface translocation of GRP78, a receptor for a2-macroglobulin-dependent signaling. J. Immunol. 174: 2092—2097.

164. Monach P.A., Meredith S.C., Siegel C.T., Schreiber H. 1995. A unique tumor antigen produced by a single amino acid substitution. Immunity. 2 : 45-59.

165. Moon W.S., Tarnawski A.S. 2003. Nuclear translocation of survivin in hepatocellular carcinoma: a key to cancer cell growth? Hum. Pathol. 34: 1119-1126.

166. Montalto G., Soresi M., Aragona F., Tripi S., Carroccio A., Anastasi G., Magliarisi C., Barresi E., Notarbartolo A. 1996. Procollagen III and laminin in chronic viral hepatopathies. Presse Med. 25 : 59—62.

167. Mumberg D., Wick M., Schreiber H. 1996. Unique tumor antigens redefined as mutant tumor-specific antigens. Seminars in Immunology. 8: 289-293.

168. Mungan U., Kirikali G., Celebi I., Kirikali Z. 1996. Significance of serum laminin PI values in patients with transitional cell carcinoma of the bladder. Urology. 48: 496-500.

169. Munro S., Pelham H.R.B. 1986. An Hsp70-like protein in the ER: identity with the 78 kd glucose-regulated protein and immunoglobulin heavy chain binding protein. Cell. 46 : 291—300.

170. Murray G.I., Taylor M.C., McFadyen M.C. McKay J.A., Greenlee W.F., Burke M.D., Melvin W.T. 1997. Tumor-specific expression of cytochrome P450 CYP1B1. Cancer Res. 57: 3026-3031.

171. Niimi T., Kumagai C., Okano M., Kitagawa Y. 1997. Differentiation-dependent expression of laminin-8 (alpha 4 beta 1 gamma 1) mRNAs in mouse 3T3-L1 adipocytes. Matrix Biol. 16 : 223—230.

172. Notsumata K., Unoura M., Kobayashi K., Hattori N. 1988. Paraneoplastik syndrome of hepatocellular carcinoma. Nippon Rinsho (Jpn. J. Clin. Med.) 46: 76-81.

173. Novelino L., Castelli C., Parmani G. 2005. A listing of human tumor antigens recognized by T cells: March 2004 update. Cancer Immunol. Immunother. 54: 187207.

174. Ozaki I., Yamamoto K., Mizuta T., Kajihara S., Fukushima N., Setoguchi Y., Morito F., Sakai T. 1998. Differential expression of laminin receptors in human hepatocellular carcinoma. Gut. 43: 837—842.

175. Park J., Kong G.H., Lee S.W. 2002. hMAGE-Al overexpression reducer TNF-a cytotoxity in ME-180 cells. Mol. Cells. 14: 122-129.

176. Patarroyo M., Tryggvason K., Virtanen I. 2002. Laminin isoforms in tumor invasion, angiogenesis and metastasis. Cancer Biology. 12: 197-207.

177. Peterson K., Rosenblum M.K., Kotanides H., Posner J.B. 1992. Paraneoplastic cerebellar degeneration. I. A clinical analysis of 55 anti-Yo antibody-positive patients. Neurology. 42: 1931-1937.

178. Pierce G.B., Speers W.C. 1988. Tumors as caricatures of the process of tissue renewal: prospects for therapy by directing differentiation. Cancer Res. 48: 1996.

179. Pitot H., Dragan Y. 1991. Facts and theories concerning the mechanisms of carcinogenesis. FASEB J. 5: 2280 -2286.

180. Pousette A., LeijonhufVud P., Arver S., Kvist U., Pelttari J., Hoog C. 1997. Presence of synaptonemal complex protein 1 transversal filament-like protein in human primary spermatocytes. Hum. Reprod. 12: 2414-2417.

181. Qin L.-X., Tang Z.-Y. 2002. The prognostic molecular markers in hepatocellular carcinoma. World J. Gastroenterol. 8: 385-392.

182. Rabbitts T.H. 1998. LMO T-cell translocation oncogenes typify genes activated by chromosomal translocations that alter transcription and developmental processes. Genes & Dev. 12: 2651-2657.

183. Raghow R. 1994. The role of extracellular matrix in postinflammatory wound healing and fibrosis. FASEB J. 8 : 823—831.

184. Ramakrishnan S., Eppenberger U., Mueller H., Shinkai Y., Narayanan R. 1998. Expression profile of the putative catalytic subunit of the telomerase gene. Cancer Res. 58: 622-625.

185. Ray R.B., Meyer K., Ray R. 1996, Suppression of apoptotic cell death by hepatitis C virus core protein. Virology. 226: 176 -182.

186. Ren P., Mehta P., Rush R. 1998. Inhibition of gap junctional intercellular• communication by tumor promoters in connexin 43 and connexin 32-expressing liver cells: cell specificity and role of protein kinase C. Carcinogenesis. 19: 160-175.

187. Rescan P.Y., Clement B., Yamada Y., Glaise D., Segui-Real B., Guguen-Guillouzo C., Guillouzo A. 1991. Expression of laminin and its receptor LBP-32 in human and rat hepatoma cells. Hepatology.13: 289-96.

188. Rimoldi D., Salvi S., Reed D., Coulie P., Jongeneel V.C., De Plaen E., Brasseur F., Rodriguez A.M., Boon T., Cerottini J.C. 1999. cDNA and protein characterization of human MAGE-10. Int. J. Cancer. 82: 901-907.

189. Robbins P.F., El-Gamil M., Li Y.F., Kawakami Y., Loflus D., Appella E., Rosenberg S.A. 1996. A mutated p-catenin gene encodes a melanoma-specific antigen recognized by tumor infiltrating lymphocytes. J. Exp. Med. 183: 1185-1190.

190. Roos P.H., Bolt H.M. 2005. Cytochrome P450 interactions in human cancers: new aspects considering CYP1B1. Expert Opinion on Drug Metabolism and Toxicology. 1: 187-202.

191. Rosen S.T., Mulshine J., Guttitta F., Fedorco J., Carneu D., Gazdar A., Minna J. 1984. Analysis of human small lung cancer differentiation antigens using a panel of rat monoclonal antibodies. Cancer Res. 44: 2052-2061.

192. Rudelstorfer R., Bieglmayer C., Nanz S. 1990. Serum laminin in pregnancy-induced hypertension a marker renal involvement? Gynecol. Obstet. Invest. 30 : 78—80.

193. Rudisky D., Hagios C., Bissel M. 2000. Tumors are unique organs defined by abnormal signaling and contact. Semin. Cancer Biol. 11: 87-95.

194. Ryu C. J., Cho D.-Y., Gripon P., Kim H. S., Guguen-Guillouzo C., Hong H. J. 2000. An 80-kilodalton protein that binds to the pre-Sl domain of hepatitis B virus. J. Virol. 74: 110—116.

195. Sahin U., Tiireci O., Chen Y.T., Seitz G., Villena-Heinsen C., Old L.J., Pfreundschuh M. 1998. Expression of multiple cancer/testis (CT) antigens in breastcancer and melanoma: basis for polyvalent CT vaccine strategies. Int. J. Cancer. 78: 387-389.

196. Sarobe P., Feijoo E., Alfaro C., Mazzolini G., Melero I. 2004. MAGE antigens: therapeutic targets in hepatocellular carcinoma. J. Hepatology. 40: 155-158.

197. Sasaki T., Fassler R., Hohenester E. 2004. Laminin: the crux of basement membrane assembly. J. Cell Biol. 164' 959-963.

198. Sasaki M., Kaneuchia M., Fujimotob S., Tanakaa Y., Dahiyaa R. 2003. CYP1B1 gene in endometrial cancer. Molecular and Cellular Endocrinology. 202: 171-176.

199. Sasaki M., Kleinman H.K., Huber H., Deutzmann R., Yamada Y. 1988. The A chain has a unique globular domain and homology with the basement membrane proteoglycan and the laminin B chains. J. Biol. Chem. 263: 16536-16544.

200. Satoh S. 1972. A hetero-organic antigens of rat ascites hepatoma. Gann. 63: 579-590.

201. Scanlan M.J., Chen Y.T., Williamson B., Gure A.O., Stockert E., Gordan J.D., Tlireci O., Sahin U., Pfreundschuh M., Old L.J. 1998. Characterization of human colon cancer antigens recognized by autologous antibodies. Int. J. Cancer. 76: 652-658.

202. Scanlan M.J., Simpson A.J., Old L.J. 2004. The cancer/testis genes: review, standartization, and commentary. Cancer Immunol. 4: 1-15.

203. Schapira F., Hatzfeld A., Reuber M.D. 1971. Fetal pattern of aldolase in transplantable hepatomas. Cancer Res. 33: 1224-1230.

204. Schapira F., Hatzfeld A., Weber A. 1975. Resurgence of some fetal isozymes in hepatoma. Isozymes. 3: 987-1003.

205. Schmits R., Cochlovius B., Treitz G., Regitz E., Ketter R., Preuss K.D., Romeike B.F., Pfreundschuh M. 2002. Analysis of the antibody repertoire of astrocytoma patients against antigens expressed by gliomas. Int. J. Cancer. 98: 73-77.

206. Seliger B., Maeurer M. J., Ferrone S. 2000. Antigen-processing machinery breakdown and tumor growth. Immunol. Today. 21:455-464.

207. Sell S., Ruoslahti E. 1982. Expression of fibronectin and laminin in the rat liver after partial hepatectomy, during carcinogenesis, and in transplantable hepatocellular carcinomas. J. Natl. Cancer Inst. 69 : 1105—1114.

208. Shapiro E.T., Bell G.I., Polynsky K.S., Rubenstein A.H., Kew M.C., Tager H.C. 1990. Tumor hypoglycemia: relationship to high molecular weight insulin-like growth factor-II. J. Clin. Invest. 85: 1672-1679.

209. Sharkey M.S., Lizee G., Conzales M.I., Patel S„ Topalian S.L. 2004. CD4 (+) T-cell recognition of mutated B-RAF in melanoma patients harboring the V599E mutation. Cancer Res. 64: 1595-1599.

210. Shay J.W., Bacchetti S. 1997. A survey of telomerase activity in human cancer. Eur. J. Cancer. 33:787-791.

211. Shell S. 1993. The role of determined stem-cells in the cellular lineage of hepatocellular carcinoma. Int. J. Dev. Biol. 37: 189-201.

212. Shell S., Pierce G.B. 1994. Maturation arrest of stem cell differentiation is a common pathway for the cellular origin of teratocarcinomas and epithelial cancers. Lab. Invest. 70: 6-21.

213. Sherman M. 1995. Hepatocellular carcinoma. Gastroenterology. 3: 55-66.

214. Shevchenko A., Wilm M., Vorm O., Mann M. 1996. Mass spectrometric sequencing of proteins silver-stained polyacrylamide gels. Anal Chem. 68 : 850—858.

215. Shiota G., Okano J., Kawasaki H., Kawamoto T., Nakamura T. 1995. Serum hepatocyte growth factor levels in liver diseases: clinical implications. Hepatology. 21: 106-112.

216. Showe L.C., Croce C.M. 1987. The role of chromosomal translocations in Band T-cell neoplasia. Ann. Rev. Immunology. 5: 253-277.

217. Sidhom G., Imam M. 1999. Evalution of serum laminins as a tumor marker in breast cancer. Int. J. Clin. Lab. Res. 29 : 26—29.

218. Simpson A.J.G., Caballero O.L., Jungbluth A., Chen Y.-T., Old L.J. 2005. Cancer/testis antigens, gametogenesis and cancer. Nature Rev. Cancer. 5: 615-625.

219. Sjogren H.O. 1964. Transplantation methods as a tool for detection of tumor-specific antigens. Prog. Exp. Tumor Res. 6: 259-322.

220. Sjogren H.O., Hellstrtom I., Klein G. 1961. Transplantation of polioma virus induced tumors in mice. Cancer Res. 21 : 329-337.

221. Smith J.W., Longo D.L., Urba W.J., Clark J.W., Watson T., Beveridge J., Con-Ion K.C., Sznol M., Creekmore S.P., Alvord W.G. 1991. Prolonged, continuous treatment of hairy cell leukemia patients with recombinant interferon-alpha 2a. Blood. 78: 1664-1967.

222. Song Z., Varani J., Goldstein I.J. 1993. Differences in cell surface carbohydrates, and in laminin and fibronectin synthesis, between adherent and non-adherent Ehrlich ascites tumor cells. Int. J. Cancer. 55: 1029-1035.

223. Soussi T. 2000. p53 antibodies in the sera of patients with various types of cancer. Cancer Res. 60: 1777 1788.

224. Sterk L.M., de Melker A.A., Kramer D., Kuikman I., Chand A., Claessen N., Weening J.J., Soknenberg A. 1998. Glomerular extracellular matrix components and integrins. Cell Adhes. Commun. 5 : 177—192.

225. Stunnenberg H.G., Garcia-Jimenez C., Betz J.L. 1998. Biochim. Biophys. Acta. 11423: F15-F33.

226. Sugawara S., Takeda K., Lee A., Dennert G. 1993. Suppression of stress protein GRP78 induction in tumor B/C10ME eliminates resistance to cell mediated cytotoxicity. Cancer Res. 53: 6001—6005.

227. Tada M., Omata M., Ohto M. 1990. Analysis of ras gene mutation in human hepatic malignant tumors by polymerase chain reaction and direct sequencing. Cancer Res. 50: 1121-1124.

228. Tagliabue E., Menard S., Delia Torre G., Barbanti P., Mariani-Constantini R., Porro G., Colnaghi M. 1985. Generation of monoclonal antibodies reacting with human epithelial ovarian cancer. Cancer Res. 45: 379-385.

229. Tahara H., Kuniyasu H., Yokozaki H., Yasui W., Shay J.W., Ide T., Tahara E. 1995. Telomerase activity in preneoplastic and neoplastic gastric and colorectal lesions. Clin. Cancer Res. 1: 1245 -1251.

230. Tajima K., Obata Y., Tamaki H., Yoshida M., Chen Y.T., Scanlan M.J., Old L.J., Kuwano H., Takahashi T., Takahashi T., Mitsudomi T. 2003. Expression of can-cer/testis (CT) antigens in lung cancer. Lung Cancer. 42: 23-33.

231. Takeuchi H., Kuo C., Morton D.L., Wang H.-J., Hoon D.S.B. 2003. Expression of Differentiation Melanoma-associated Antigen Genes Is Associated with Favorable Disease Outcome in Advanced-Stage Melanomas. Cancer Res. 63: 441-448.

232. Tan K., Shaw A.L., Madsen B., Jensen K., Taylor-Papadimitriou J., Freemont P.S. 2003. Human PLU-1 Has transcriptional repression properties and interact with the developmental transcription factors BF-1 and PAX-9. J. Biol. Chem. 278: 2050720513.

233. Tanikawa K. 1994. Serum marker for hepatic fibrosis and related liver pathology. Pathol Res Pract. 190 : 960—968.

234. Tapparel C., Reymond A., Girardet C., Guillou L., Lyle R., Lamon C., Hutter P., Antonarakis S.E. 2003. The TPTE gene family: cellular expression, subcellular localization and alternative splicing. Gene. 323: 189-199.

235. Tenen D.G., Hromas R., Licht J.O., Zang D.E. 1997. Transcription Factors, Normal Myeloid Development, and Leukemia. Blood. 90: 489-519.

236. Teryukova N.P., Blinova G.I., Tyuryaeva I.I., Ivanov V.A. 1999. Inhibitory Effect of Polyclonal Antibodies against Tumor-Associated Membranous Heteroorganic Antigen MA-50 on DNA Synthesis in Cultured Rat Cells. Experimental Oncology. 21 (2): 146-149.

237. Theise N.D., Nimmakayalu M., Gardner R., Illei P.B., Morgan G., Teperman L., Henegariu O., Krause D.S. 2000. Liver from bone marrow in humans. Hepatology. 32: 11-16.

238. Theise N.D., Saxena R., Portmann B.C., Thung S.N., Yee H., Chiriboga L., Kumar A., Crawford J.M. 1999. The canals of Hering and hepatic stem cells in humans. Hepatology. 30: 1425-1433.

239. Theise N.D., Yao J.L., Harada K., Hytirogon P., Portmann B., Thung S.N., Tsui W., Ohta H., Nakanuma Y. 2003. Hepatic "stem cells" malingnancies in adults: four cases. Histopathology. 43: 263-271.

240. Thirkill C.E., Fitzgerald R.C., Sergott A.M., Roth N.K., Tyler N.C., Keltner J.L. 1989. Cancer-associated retinopathy (CAR syndrome) with antibodies reacting with retinal, optic-nerve, and cancer cells. N. Engl. J. Med. 321: 1589-1594.

241. Topalian S.L., Gonzales M.I., Ward Y., Wang X., Wang R.F. 2002. Revelation of a cryptic major histocompatibility complex class II-restricted tumor epitope in a novel RNA-processing enzyme. Cancer Res. 62: 5505-5509.

242. Triantafilou K., Fradelizi D., Wilson K„ Triantafilou M. 2001. GRP78, a core-ceptor for coxsackievirus A9, Interacts with major histocompatibility complex class I molecules which mediate virus internalization. J. Virology. 77: 2784—2788.

243. Tureci O., Sahin U., Zwick C., Koslowski M., Seitz G., Pfreundschuhet M. 1998. Identification of a meiosis-specific protein as a member of the class of can-cer/testis antigens. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95: 5211-5216.

244. Vedantham S., Camllel H., Colomb H. 1992. Mechanism of interferon action in hairy cell leukemia: a model of effective cancer biotherapy. Cancer Res. 52: 10561096.

245. Velculescu V.E., Madden S.L., Zhang L. et al. 1999. Analysis of human tran-scriptomes. Nat. Genet. 23: 387-388.

246. Vieta E., Berton M., Burger C., Kepron M., Lee W., Yin X. 1991. Memory B and T cells. Ann. Rev. Immunology. 9: 193-217.

247. Vigneron N., Ooms A., Morel S., Degiovanni G., Van Den Eynde B.J. 2002. Identification of a new peptide recognized by autologous cytolytic T lymphocytes on a human melanoma. Cancer Immun. 2: 9-13.

248. Virtanen I., Laitinen L., Korhonen M. 1995. Differential expression of laminin polypeptides in developing and adult human kidney. J. Histochem. Cytochem. 43 : 621—628.

249. Vonderheide R.H., Hahn W.C., Schultze J.L., Nadler L.M. 1999. The telom-erase catalytic subunit is a widely expressed tumor-associated antigen recognized by cytotoxic T lymphocytes. Immunity. 10: 673-679.

250. Von der Mark K., Risse G. 1987. Izolation and Characterization of Laminin Receptors. Metods in enzymology. 144 : 490—507.

251. Wang R. F., Appella E., Kawakami Y., Kang X., Rosenberg S. A. 1996. Identification of TRP-2 as a human tumor antigen recognized by cytotoxic T lymphocytes. J.Exp. Med. 184:2207-2216.

252. Wang R.F., Wang X., Atwood A.C., Topalian S.L., Rosenberg S.A. 1999a. Cloning genes encoding MHC class II-restricted antigens: mutated CDC27 as a tumor antigen. Science. 284: 1351-1354.

253. Wang R.F., Wang X., Rosenberg S.A. 1999b. Identification of a novel major histocompatibility complex class II-restricted tumor antigen resulting from a chromosomal rearrangement recognized by CD4(+) T cells. J. Exp. Med. 189: 1659-1668.

254. Wang J., Xie L.Y., Allan S., Beach D., Hannon G.J. 1998. Myc activates te-lomerase. Genes Dev. 12: 1769-1774.

255. Wang H.Y., Zhou J., Zhu K., Riker A.I., Marineóla F.M., Wang R.F. 2002. Identification of a mutated fibronectin as a tumor antigen recognized by CD4+ T cells: its role in extracellular matrix formation and tumor metastasis. J. Exp. Med. 195: 1397-1406.

256. Weber J., Salgaller M., Samid D., Johnson B., Herlyn M., Lassam N., Treis-man J., Rosenberg S.A. 1994. Expression of the MAGE-1 tumor antigen is upregu-lated by the demethylating agent 5-aza-2'-deoxycytidine. Cancer Res. 54: 1766-1771.

257. Weinberg R.A. 1989. Oncogenes, antioncogenes, and the molecular bases of multistep carcinogenesis. Cancer Res. 49: 3713-3721.

258. Wewer U.M., Engvall E., Paulsson M., Yamada Y., Albrechtsen R. 1992. Laminin A, Bl, B2, S and M subunits in the postnatal rat liver development and after partial hepatectomy. Lab. Invest. 66 : 378—389.

259. Winquist E.W., Laskey J., Crimp M., Khamsi F., Shepherd F.A. 1995. Keto-conazole in the management of paraneoplastic Cushing syndrome secondary to ectopic adrenocorticotropin production. J. Clin. Oncol. 13: 157-164.

260. Wright C.L., Beckett M.L., Starling J.J., Schellhammer P.F., Sieg S.M., Ladaga L.E., Poleskic S. 1983. Immunohistochemical localization of prostate carcinoma-associated antigens. Cancer Res. 43: 5509-5516.

261. Xu H.P., Yuan L., Shan J., Feng H. 2004. Localization and expression of TSP50 protein in human and rodent testes. Urology. 64: 826-832.

262. Yamaguchi Y., Nozawa K., Savoysky E., Hayakawa N., Nimura Y., Yoshida S. 1998. Change in telomerase activity of rat organs during growth and aging. Exp. Cell Res. 242: 120 -127.

263. Yoshida K., Tadaoka Y., Manabe T. 1996. Expression of laminin in hepatocellular carcinoma: an adjunct for its histologocal diagnosis. Jap. J. Clin. Oncology. 26: 70-76.

264. Yotnda P., Garcia F., Peuchmaur M., Grandchamp B., Duval M., Lemonnier F., Vilmer E., Langlade-Demoyen P. 1998. Cytotoxic T cell response against the chimeric ETV6-AML1 protein in childhood acute lymphoblastic leukemia. J. Clin. Invest. 102: 455-458.

265. Yudoh K., Matsui H., Kanamori M., Ohmori K., Tsuji H., Tatezaki S. 1994. Serum levels of laminin and type III procollagen peptide as markers for detection of metastasis. Jpn. J. Cancer Res. 85 : 1263-1269.

266. Zak-Nejmark N., Stenden J., Radzikowski C. 1978. Mammary leukemia (ML) antigen isolated from L 1210 leukemia cells. Int. J. Cancer. 21: 490-495.

267. Zhu H., Chen X.P., Zhang W.G., Luo S.F., Zhang B.X. 2005. Expression and significance of new inhibitor of apoptosis protein survivin in hepatocellular carcinoma. World J. Gastroenterol. 11: 3855-3859.

268. Zorn E., Hercend T. 1999. A natural cytotoxic T cell response in a spontaneously regressing human melanoma targets a neoantigen resulting from a somatic point mutation. Eur. J. Immunol. 29: 592-601.

Информация о работе

Тюряева, Ирина Ивановна
кандидата биологических наук
Санкт-Петербург, 2006
ВАК 03.00.25

Диссертация

Выявление и идентификация мембранного антигена, ассоциированного с гепатоцеллюлярными опухолями крыс - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы