Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Анализ полиморфизма гена BoLA-DRB3 в связи с генетической устойчивостью крупного рогатого скота к лейкозу и вирусоносительством

ВАК РФ 03.02.07, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Анализ полиморфизма гена BoLA-DRB3 в связи с генетической устойчивостью крупного рогатого скота к лейкозу и вирусоносительством"

На правах рукописи

Рузина Мария Николаевна

АНАЛИЗ ПОЛИМОРФИЗМА ГЕНА ВОЬА-ОЯВЗ В СВЯЗИ С ГЕНЕТИЧЕСКОЙ УСТОЙЧИВОСТЬЮ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА К ЛЕЙКОЗУ И ВИРУСОНОСИТЕЛЬСТВОМ

03.02.07 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 С („"¿П Ш2

Москва-2012

Работа выполнена в лаборатории сравнительной генетики животных Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института общей генетики им. Н.И. Вавилова Российской академии наук, г.Москва

Научный руководитель

доктор биологических наук, профессор

Сулимова Галина Ефимовна

Официальные оппоненты:

доктор сельскохозяйственных наук

кандидат биологических наук

Ковалюк Наталья Викторовна

Северо-кавказский НИИ животноводства Российской академии сельскохозяйственных наук, г. Краснодар-55, заведующая лабораторией биотехнологии.

Малинина Татьяна Владимировна

Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН, г. Москва, старший научный сотрудник лаборатории генетических проблем идентификации.

Ведущая организация: Московский государственный

университет имени М.В.Ломоносова, г.Москва

Защита состоится «24» мая 2012 г. в /у часов на заседании Диссертационного совета Д 002.214.01 на базе Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института общей генетики им. Н.И. Вавилова Российской академии наук по адресу: 119991, ГСП-1, г. Москва, ул. Губкина, д. 3. Факс: (499) 132-89-62, e-mail: aspirantura@vigg.ru.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института общей генетики им. Н.И. Вавилова Российской академии наук.

Автореферат разослан « лОу>

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

Ж-

2012г.

&

ХГинелыцикдва Татьяна Аркадьевна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

Одной из проблем российского животноводства является обеднение породного, а значит, и генетического разнообразия крупного рогатого скота (КРС). Из 70 пород, разводимых на территории бывшего СССР в 80-90е гг XX, на сегодняшний день официально зарегистрировано 18 отечественных пород крупного рогатого скота. Обеднение генетических ресурсов КРС, может привести к снижению эффективности селекции и снижению резистентности животных к постоянно эволюционирующим возбудителям заболеваний. В связи с этим, важно поддерживать максимально возможное разнообразие генофонда КРС.

Необходимым условием для проведения таких работ является проведение генетического мониторинга пород КРС на молекулярном уровне. Особый интерес представляют гены, участвующие в формировании полезных признаков. Одним из наиболее значимых в этом отношении генов является ген BoLA-DRB3, кодирующий антигены класса II главного комплекса гистосовместимости КРС, обладающий высоким аллельным разнообразием. Установлены ассоциации аллельных вариантов данного гена с устойчивостью к таким заболеваниям, как лейкоз, мастит, цистит, дерматофилоз, тейлериоз, кожному заболеванию, вызываемому иксодовыми клещами Boophilus microplus.

Особенно актуальным является изучение полиморфизма гена BoLA-DRB3 в связи с резистентностью к лейкозу. Лейкоз крупного рогатого скота (КРС) -хроническое инфекционное заболевание опухолевой природы, в основе которого лежит системное поражение лейкопоэтической ткани. Данное заболевание широко распространено в нашей стране и приносит значительный экономический ущерб сельскому хозяйству вследствие падежа животных, недополучения продуктов животноводства, потери уникального генофонда в молочном скотоводстве. В первую очередь лейкозу подвержены высокопродуктивные животные. Возбудителем данного заболевания является вирус лейкоза крупного рогатого скота (ВЛКРС). Для эффективной профилактики лейкоза важно не только учитывать данные о полиморфизме гена BoLA-DRB3 КРС в селекционной работе, но и рассматривать распространение различных форм ВЛКРС на территории регионов нашей страны. В странах Западной Европы и Америки обнаружены географические изоляты ВЛКРС, генотипы которых существенно различаются. Однако российские разновидности ВЛКРС не исследовались.

Таким образом, исследование полиморфизма гена BoLA-DRB3 у отечественных пород КРС актуально в связи с необходимостью разработки селекционно-генетических подходов к оздоровлению стад животных и проблемой сохранения пород и их биоразнообразия. Несомненный практический интерес представляет детекция эндемичных для России' разновидностей ВЛКРС.

Цель исследования

Цель данного исследования — анализ полиморфизма гена BoLA-DRB3 у калмыцкой, якутской, костромской, красно-пестрой, черно-пестрой пород КРС и зебувидного скота, а также детекция форм ВЛКРС, распространенных на территории Российской Федерации.

Задачи исследования:

• Изучить разнообразие и характер распределения аллелей и генотипов BoLA-DRB3 у шести пород КРС: у калмыцкой, якутской, костромской, красно-пестрой, черно-пестрой пород КРС, зебувидного скота и провести сравнительный анализ с ранее изученными породами.

• Оценить характер распределения BoLA-DRB3-amenePi и генотипов, ассоциированных с резистентностью к лейкозу, в исследованных породах КРС.

• Оценить характер распределения аллелей гена BoLA-DRB3, ассоциированных с резистентностью к другим заболеваниям (маститу, циститу, отслоению плаценты, клещевому заболеванию, вызываемому Boophilus microplus), в исследованных породах КРС.

• Оценить характер распределения аллелей гена BoLA-DRB3, ассоциированных с признаками молочной продуктивности, в исследованных породах крупного рогатого скота.

• На основании анализа полиморфизма гена pol выявить формы ВЛКРС, распространенные на территории РФ.

Научная новизна

Впервые получены данные о полиморфизме гена BoLA-DRB3 у пород отечественной селекции (калмыцкой, якутской, костромской пород КРС, зебувидного скота), хорошо приспособленных к суровым условиям обитания в регионах Российской Федерации, относящихся к различным географическим и климатическим зонам.

Впервые проведен сравнительный анализ разнообразия и характера распределения аллелей и генотипов BoLA-DRB3, ассоциированных с признаками молочной продуктивности и резистентностью к заболеваниям, у пород КРС российской селекции. Показана высокая частота аллелей и генотипов, определяющих устойчивость к лейкозу, у костромского, калмыцкого и зебувидного скота.

Впервые на основе анализа нуклеотидной последовательности вирусного гена pol охарактеризована изменчивость вируса лейкоза КРС в животноводческих хозяйствах на территории России и Украины.

Впервые выявлены новые формы ВЛКРС, эндемичные для России.

Предложена новая классификация форм ВЛКРС на основе анализа изменчивости областей гена pol, кодирующих обратную транскриптазу и интегразу.

Практическая значимость

Полученные в ходе выполнения работы данные по аллельному полиморфизму гена ВоЬА-ОЯВЗ и частотам встречаемости ценных аллелей, ответственных за устойчивость к заболеваниям, у широкого спектра отечественных пород, могут стать фундаментальной основой для разработки селекционно-генетических подходов к оздоровлению стад животных и сохранению биоразнообразия. Высокое содержание ценных аллелей и генотипов у костромского, калмыцкого и зебувидного скота может служить основанием для разработки программ по сохранению их генофондов и рациональному использованию в целях улучшения генофондов других пород КРС, разводимых в России.

Разработанные новые варианты аллель-специфичной ПЦР, позволяющие дифференцировать трудно тестируемые аллели (*07 и другие), могут быть использованы для разработки тест-систем с повышенной точностью типирования аллелей гена ВоЬА-ОЛВЗ и получить применение в научной и селекционной практике.

Обнаружение российских разновидностей ВЛКРС позволит в будущем создать эффективные диагностикумы для детекции вирусоносительства среди КРС с учетом эндемичных для России форм вируса.

Апробация результатов

Основные положения и результаты работы были представлены на XVII Международной конференции "Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии", секция - "Геномика. Гены и болезни" (Ялта-Гурзуф, 2009), на научно-практических конференциях «БиоТехЖ-2008» (Дубровицы, 2008), «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии», (Москва, 2010), «Популяционная генетика: современное состояние и перспективы», посвященная памятной дате, 75-летию со дня рождения академика Ю.П. Алтухова (Москва, 2011); на межлабораторном семинаре отдела генетики животных Института общей генетики им. Н.И.Вавилова РАН (Москва, 2011).

Декларация личного участия автора

Диссертация написана автором лично с использованием собственных результатов, а так же результатов, полученных ранее в лаборатории. Автор самостоятельно осуществлял выделение ДНК, постановку ПЦР и АС-ПЦР, рестрикционный анализ, электрофоретический анализ, статистическую обработку данных. Данные о полиморфизме гена ВоЬА-ОЯВЗ у костромского и якутского скота получены совместно с н.с. Т.А.Штыфурко. Данные о полиморфизме данного гена у ярославского и монгольского скота, использованные в сравнительном анализе, были получены ранее к.б.н. М. Мохаммад Абади. Обработка последовательностей ВЛКРС проводилась совместно с д.б.н. Б.В. Андриановым. Обсуждение результатов исследования и

написание научных публикаций осуществлялась при участии научного руководителя д.б.н. Сулимовой Г.Е.

Структура и объем диссертации

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов и обсуждения, выводов, списка литературы и приложения. Работа изложена на 147 страницах машинописного текста, включая 30 таблиц, 26 рисунков. Список литературы включает 190 наименований.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материалом для исследования полиморфизма гена BoLA-DRB3 послужили образцы крови животных калмыцкой (п=66), якутской (п=105), костромской (п=104), красно-пестрой (п=39), черно-пестрой (п=81) пород КРС и зебувидного скота (п=95).

Для исследования форм ВЛКРС были использованы образцы крови РИД-положительных животных, полученные в 2008-2010гг. из двух подмосковных хозяйств, одного хозяйства Краснодарского края и одного хозяйства Украины. Для анализа было взято от 5 до 8 образцов из каждого хозяйства. Для сравнительного анализа были использованы нуклеотидные

последовательности соответствующей области генома ВЛКРС, депонированные в базе данных NCBI.

Выделение ДНК. Суммарную геномную ДНК выделяли из крови животных стандартным гуанидинтиоционатным методом с использованием наборов "Magna DNA prep 200", выпускаемых ООО «Лаборатория изоген» (Москва), согласно рекомендациям фирмы производителя.

Типирование аллелей гена BoLA-DRB3. Для типирования аллелей гена BoLA-DRB3 было использовано три независимых подхода: рестрикционный анализ продуктов амплификации (ПЦР-ПДРФ), алельспецифичная ПЦР с праймерами ER-17 и VD-19, предложенная в работе (Xu et al., 1993), и аллель-специфичная ПЦР с праймерами HLO-3Ûd HLO-O7d и HLO-24d, разработанная нами совместно с д.б.н. Климовым Е.А. (табл. 1).

Амплификацию фрагмента экзона 2 гена BoLA-DRB3 проводили в один или два этапа (Nested-PCR) согласно опубликованным ранее протоколам (Van Eijk et al., 1992; Сулимова и др., 1995) с использованием набора «GenePakTM PCR Core» (Isogene Lab. ltd, Москва). Для одноэтапной ПЦР использовали праймеры HLO-30 и HLO-32. Для двухэтапной - для первого раунда HLO-30 и HLO-31, для второго раунда были использованы праймеры HLO-30 и HLO-32. Состав праймеров приведен в табл. 1.

Рестрикционный анализ продуктов амплификации проводили с использованием эндонуклеаз Rsal, Haelll и BstYl (XhoW). Продукты реакции разделяли с помощью электрофореза в 4% агарозном геле (ТорVision LE GQ

agarose, Fermentas, Канада) в присутствии бромистого этидия (5мМ/мл) и тестировали в УФ-свете.

Аллель-специфичная ПЦР. Характеристика праймеров для аллель-специфичной ПЦР и перечень тестируемых аллелей представлены в табл. 1.

Таблица 1. Характеристика праймеров для аллель-специфичной ПЦР и

детектируемые аллели гена BoLA-DRB3.

Праймеры Размер продукта п.H. Детектируемые аллели

Название Последовательность (5-3')

HLO-30 tcctctctctgcagcacatttcc *

ER-17 gacctcctctccgcccg 225 "7/(0902), »23(2701, 2702, 2703, 2705, 2706), »25(0701), *j 7(2801), »32(2401), »33(2704), *JJ(2101), *42(2802)

VD-19 cacctgtgcatgacgtctg 249 ♦0/(0503), »02(1301), »03(1001, 1002), ♦05(3301), *07(0201), »05(1201), »09(0301, 0302), »/0(1601), *11(1202), »/2(1701, 1702, 3201, 3202), »/3(0401), »/5(20011, 20012, 2002, 2003), ♦/6(1501, 1502), »/5(1801, 1802), »/9(2601), »20(2901, 3601), »2/(0801), »3/(2801), »34(3002), »35(2101), »4/(0502, 1901, 3801), »42(2802), »45(3401, 3402), »46(3501), »47(1703), »45(3901)

HL,0-30d ctctgcagcacatttcc ** -

HLO-O7d ctccaggatctcctg 206 »07(0201)

HLO-24d ctccaggaagtcct 208 *03(1001, 1002), *10(160I), »/5(20011, 20012, 2002, 2003), »2/(0801), »22(1101), »25(2701, 2702, 2703, 2705), »24(0102, 0101), »27(14011, 3101), »25(0701), »5/(2801), »33(2704), »35(2101), »4/(3801), »42(2802), »46(3501)

Примечания: Жирным шрифтом выделены праймеры, разработанные нами совместно с д.б.н. Климовым Е.А. * Праймер HLO-30 является прямым для праймеров ER-17 и VD-19. ** Праймер HLC)-30d является прямым для праймеров HLO-O7d и HLO-24d.

Аллель-специфичную ПЦР проводили с использованием наборов «GenPakR PCR Core» фирмы «IsoGene lab.», Россия. В качестве матрицы использовали ПЦР-продукты первого раунда Nested-PCR (2 мкл для праймеров ER-17 и VD-19, 1 мкл для праймеров HLO-O7d и HLO-24d). ПЦР проводили в многоканальном амплификаторе «Терцик» фирмы «ДНК-технология», Россия.

ПЦР-амплификацию ОТ- и Ин-фрагментов гена pol BJIKPC проводили с использованием разработанных нами RT- и IN-праймеров: RT-1: 5'-gaggtttgtgcatgacctacgagctaca-3'; RT-2: 5'-tagagacccattggaggtctcctaagac-3'; IN-1: 5 '-ggaggtgggaagatgcgaactatt-3 ' ; IN-2: 5 '-gtccgctctaccaaccctgaactt-3 '.

RT-праймеры использовали для амплификации ОТ-фрагмента гена pol (фрагмент участка, кодирующего обратную транскриптазу) размером 599 пн Центральная часть этого фрагмента размером 494 пн была выбрана для

последующего анализа. В полном геноме BJIKPC (GeneBank ID: AF033818) этот фрагмент соответствует области с 2325 по 2818 нуклеотид (рис.1).

IN-праймеры использовали для амплификации Ин-фрагмента гена pol (фрагмент участка, кодирующего интегразу) размером 347 пн. Для последующего анализа была выбрана центральная часть этого фрагмента размером 233 пн. В полном геноме BJIKPC (GeneBank ID: AF033818) этот фрагмент соответствует области с 3986 по 4218 нуклеотид.

Для проведения ПЦР использовали наборы "GenePak Core" ООО «Лаборатория изоген» (Москва) в условиях, рекомендованных производителем. Реакцию проводили в амплификаторе «Терцик» ООО «ДНК-технология» в следующих условиях: первичная денатурация - 5 мин при 95°С; 36 циклов: денатурация при 94°С - 30 сек, отжиг праймеров при 60°С - 30 сек, синтез при 72°С — 40 сек; завершающий синтез при 72°С — 7 мин. Продукты амплификации разделяли методом электрофореза в 1,8% агарозном геле.

Определение нуклеотидной последовательности. Для очистки продуктов ПЦР их фракционировали в 1% агарозном геле (смесь 1:1 легко- и тугоплавкой агарозы). Экстракцию продуктов ПЦР из геля и их очистку проводили с помощью наборов ООО «Омникс» (Санкт-Петербург) согласно протоколу производителя. Определение нуклеотидной последовательности было выполнено в ЗАО «Евроген» методом автоматического секвенирования на генетическом анализаторе ABI Prism 3130x1 (Applied Biosystems, США) с использованием наборов Big DyeTM Terminator v.3.1 Cycle Sequencing (Applied Biosystem, США).

Для статистического анализа данных использовали приложение «Exel Microsoft office», программы «GDA-1.1» и «Statistica 6». Для филогенетического анализа использовали следующие пакеты программ: «ChromasPro», «DNAStar» - для анализа последовательностей, «ClustalW2» -для построения выравниваний, «Mega5» - для построения филогенетических деревьев. В работе были использованы данные из базы NCBI http://www.ncbi.nlm.nih.gov/.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ Оптимизация условий типирования аллелей гена BoLA-DRB3

Для амплификации экзона 2 гена BoLA-DRB3 использовали метод как двухэтапной ПЦР с применением праймеров: HLO-30, HLO-31 и HLO-32, так и одноэтапной - с праймерами HLO-30 и HLO-32, описанными ранее (Van Eijk et al., 1992). Характеристики праймеров приведены в таблице 1. Праймер HL030 фланкирует экзон 2 гена с 5'-конца и его последовательность комплементарна 5'-концевой области экзона 2 (семь нуклеотидов) и прилегающей интронной области. Праймеры HLO-31 и HLO-32 фланкируют экзон 2 с З'-конца, при этом HLO-31 включает часть интронной последовательности и З'-конец экзона 2 (восемь нуклеотидов), a HLO-32

-6-

полностью локализован в 3'-концевой области экзона 2 и частично перекрывается с праймером HLO-31 (восемь нуклеотидов. В результате двухэтапной и одноэтапной ПЦР продукты реакции представлены одним фрагментом размером 284 пн. (281 пн в случае делеции для некоторых аллелей гена). Использование одноэтапной ПЦР позволило упростить метод, сократить время анализа, уменьшить вероятность загрязнения, а также снизить стоимость самого эксперимента.

Распределение сайтов рестрикции эндонуклеаз Rsa I, Наг III и Bst YI (Xho II) в экзоне 2 гена BoLA-DRB3 у разных аллельных вариантов гена BoLA-DRB3 различно, что приводит к образованию после обработки продуктов амплификации эндонуклеазами специфического спектра фрагментов ДНК, которые отличаются друг от друга по количеству и длине (ДНК-паттерны) (Van Eijk et al.,1992). Сопоставление ДНК-паттернов, полученных с использованием трёх указанных рестрицирующих эндонуклеаз, позволяет идентифицировать 54 аллеля гена BoLA-DRB3

(http://www.projects.roslin.ac.uk/bola/bolahome.html). Наиболее информативна эндонуклеаза Rsa I, для которой описано 19 типов ДНК-паттернов.

Для рестрикционного анализа продуктов амплификации, как правило, достаточно использования двух эндонуклеаз: Rsa I и Нае III. Однако в ряде случаев типирование аллелей на основе ДНК-паттернов двух указанных эндонуклеаз было затруднено, в особенности для аллелей, имеющих делеции, из-за близких размеров рестрикционных фрагментов. В этих случаях использовали рестрикционный анализ продуктов амплификации с помощью эндонуклеазы Xho II и аллельспецифичную ПЦР.

Разработка метода аллель-специфичной ПЦР для типирования аллелей гена BoLA-DRB3, ответственных за устойчивость или восприимчивость к лейкозу, стала возможной после анализа нуклеотидной последовательности этих аллелей и выяснения молекулярных механизмов этого явления (Xu et al., 1993). Было показано, что у всех аллелей, несущих устойчивость к лейкозу, есть общая последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность GIu-Arg в 70-71-м положении белковой молекулы, а у аллелей, ответственных за высокую восприимчивость к лейкозу, имеются общие нуклеотидные последовательности, кодирующие аминокислоты: Val-Asp-Thr-Tyr (Val) в 75-78-м положении. Аминокислоты, находящиеся в 70-71 положении молекулы класса И, входят в антиген-узнающий сайт молекул класса И, т.е. определяют специфичность взаимодействия с антигеном. Аминокислотная последовательность Val-Asp-Thr-Tyr(Val) является общей для всех аллелей, несущих повышенную восприимчивость к лейкозу и находится в участке связывания с рецепторами Т-клеток (Xu et al., 1993). Наличие мотивов последовательностей, общих для аллелей устойчивости и восприимчивости к лейкозу позволило разработать метод определения аллельных вариантов гена BoLA-DRB3 с помощью аллель-специфичной ПЦР, который позволяет

тестировать животных на основе электрофоретического анализа продуктов амплификации с праймерами HL030, ER-17 и VD-19 (Xu et al., 1993).

К сожалению, разработанный Xu et al. (1973) метод аллель-специфичной ПЦР для дифференциации BoLA-DRB3 аллелей, ассоциированных с устойчивостью и восприимчивостью к лейкозу, не всегда дает однозначные результаты, поэтому нами были разработаны новые варианты аллель-специфичной ПЦР, позволяющие дифференцировать трудно тестируемые аллели (состав праймеров, размер продуктов и перечень детектируемых аллелей приведены в табл. 1,). Для идентификации аллеля *7 нами был предложен вариант аллельспецифичной ПЦР с праймерами HLO-30d и HLO-07. ПЦР с праймерами HLO-30d и HLO-24d позволяет амплифицировать широкий спектр аллелей (15 аллелей), но в сочетании с данными рестрикционного анализа и аллель-специфичной ПЦР с праймерами ER-17 и VD-19 он обеспечивает возможность их дифференциации.

В дальнейшей работе нами были использованы для точного типирования аллелей гена BoLA-DRB3 три независимых подхода: рестрикционный анализ продуктов амплификации (ПЦР-ПДРФ), аллель-специфичная ПЦР с праймерами ER-17 и VD-19, предложенная в работе (Xu et al., 1993), и аллель-специфичная ПЦР с праймерами HLO-O7d и HLO-24d, разработанная нами.

Сравнительный анализ разнообразия и характера распределения аллелей гена BoLA-DRB3 у изученных пород крупного рогатого скота

Исследованные породы различались как по спектру аллелей гена BoLA-DRB3, так и по распределению их частот. Наиболее высокое разнообразие спектра аллелей гена BoLA-DRB3 было показано у калмыцкого (36 аллелей), ярославского (35 аллелей) и монгольского скота (35 аллелей). У черно-пестрого скота обнаружено 28 аллелей, у костромского — 23 аллеля, у красно-пестрого и зебувидного скота - по 22 аллеля. Низкий уровень генетического разнообразия по гену BoLA-DRB3 отмечен у якутского скота (14 аллелей). Распределение частот аллелей гена BoLA-DRB3 у исследованных пород представлено в таблице 2.

Высокий уровень аллельного разнообразия согласно нашим данным, а также данным по иранской зебувидной породе Систани (32 аллеля) (Мохаммади, 2009) характерен для национальных «местных» породам. В коммерческих породах КРС - голштинской (Kelm, 1997; Ledwidge, 2001), джерсейской (Sharif, 1998; Gillespie, 1999), айрширской (Удина, 2003; Удина, 1998), шортгорнской (Takeshima, 2002) - разными авторами было тестировано 11-18 аллелей. Исключение составила одна из популяций канадской голштинской породы (27 аллелей) (Sharif, 1998; Kulberg, 2007) и иранская голштинская порода (26 аллелей) (Нассири, 2005). Снижение числа аллелей у коммерческих пород по сравнению с местными может быть следствием повышенного селекционного давления на эти группы пород.

Таблица 2. Распределение частот аллелей гена ВоЬА-ОЯВЗ у исследованных пород КРС.

Монгольский КРС Калмыцкий КРС Якутский КРС Зебувндный КРС Костромской КРС Ярославский КРС Красно-пестрый КРС Черно-пестрый КРС

Аллель Р, % Р, % Р, % Р, % Р, % Р,% Р,% Р,%

*01 2,8 3,8 - 3,7 7,2 - 7,7 1,2

*02 2,8 - 0,5 - - 1,1 - 2,5

*03 2,8 - - 0,5 - 2,5 5,1 7,4

*04 - 2,3 - - - - 1,3 2,5

*05 - 1,5 - - - - - -

*06 - 1,5 - - - 1,4 - -

*07 5,6 3 1,9 8,4 3,8 - 15,4 4,9

*08 0,7 3 - 2,1 8,5 0,7 5,1 5,6

*09 0,7 - - - - - - -

*10 0,7 4,5 - - 22,5 2,1 5,1 5,6

41 2,1 3,8 - 2,1 12,7 0,4 10,3 1,2

*12 0,7 6,8 0,5 0,5 3,4 7,4 1,3 3,7

*13 0,7 0,8 - - 0,8 7,8 - 3,7

44 1,4 - - - - 2,5 - -

*15 - 5,3 - 1,1 2,1 5 1,3 1,9

*16 0,7 3,8 - - - 4,6 5,1 0,6

*17 - 1,5 0,5 - 0,4 0,4 - -

*18 8,5 3,8 8,6 - 0,4 1,4 - 2,5

*19 - 0,8 - - - - - -

*20 7,7 - - - 3 1,4 1,3 0,6

*21 1,4 2,3 0,5 - - 0,4 - 1,9

*22 0,7 1,5 4,8 14,2 2,1 2,1 12,8 11,1

*23 - 3 0,5 3,7 - 3,9 - 1,9

*24 1,4 7,6 - 16,8 - 16,3 9 15,4

*25 2,8 - - 1,1 0,4 0,4 2,6 0,6

*26 5,6 0,8 - 1,1 - 0,4 - 2,5

*27 3,5 2,3 - 15,3 0,4 0,4 2,6 -

*28 7 14,4 - 9,5 11,4 16 2,6 9,3

*29 5,6 - 42,9 - - - - -

*30 - - - - - - - -

*31 0,7 - 1,4 1,6 0,8 3,2 - 0,6

*32 - - 1 0,5 - 0,7 1,3 3,1

*33 - 0,8 - - - 0,4 - -

*34 4,2 0,8 - 3,2 - - - -

*35 - - - - - - 1,3 -

*36 4,9 2,3 - - 11,4 1,4 - 3,1

*37 2,8 1,5 - 1,6 1,3 0,7 - 3,7

*38 2,8 2,3 - 1,1 - - 1,3 -

*39 1,4 - - - - - - -

*40 - - - - - 4,3 - -

*41 - 0,8 - 1,1 1,7 - - 0,6

*42 0,7 - - 10,5 - 1,8 5,1 0,6

*43 2,8 3 - - 0,4 0,4 1,3 -

*44 0,7 - - - - 3,5 - -

*45 - 0,8 7,1 - - - 1,3 -

*46 5,6 0,8 - - - - - -

*47 - 1,5 - - - - - -

*48 - - - - 1,3 1,1 - 1,9

*49 5,6 - - - 1,7 - - -

*50 0,7 0,8 7,1 - - 0,7 - -

*51 - 3 - 0,5 2,1 2,8 - -

*52 0,7 1,5 - - - - - -

*53 - - - - - - - -

*54 - 2,3 22,9 - - 0,7 - -

Резко сниженное число ВоЬА-ОИВЗ-аллелей у якутского скота может быть следствием инбредной депрессии, вызванной низкой численностью данной породы, а также со сниженным количеством патогенов, встречающихся в области ее обитания.

У монгольского, калмыцкого, ярославского, красно-пестрого, черно-пестрого скота частоты аллелей гена ВоЬА-ПЛВЗ распределены относительно равномерно. У монгольского скота с частотой более 5% встречается восемь аллелей, самый распространенный из них (*/<§) представлен с р=8,5%. Доля аллелей с частотами менее 5% (27 аллелей) составила в сумме 48,6%. У калмыцкого скота наиболее часто встречались аллели: *28 (14,4%), *24 (7,6%) и *12 (6,8%), *15 (5,3%); суммарная доля тридцати двух аллелей с частотой менее 5% составила 65,9%. У ярославского скота преобладают четыре аллеля *24 (16,3%), *28 (16,0%), *12 (7,8%), *13 (7,8%). Суммарная частота редких аллелей (31 аллель) составляет 52,5%. У красно-пестрого скота обнаружено десять аллелей с р>5%. Это *01 (7,7%), *03 (5,1%), *07 (15,4%), *08 (5,1%), *10 (5,1%), *11 (10,3%), *1б (5,1%), *22 (12,8%), *24 (9,0%), *42 (5,1%). На долю двенадцати редких аллелей приходится всего 19,2%. У черно-пестрой породы КРС наиболее представленными являются аллели *03 (7,4%), *08 (5,6%), *10 (5,6%), *22 (11,1%), *24 (15,4%), *28 (9,3%). Двадцать два аллеля с р<5% составили по частот 45,7%. В целом, для монгольского, калмыцкого,

ярославского, красно-пестрого и черно-пестрого скота характерно относительно равномерное распределение частот BoLA-DRB3 аллелей с некоторым преобладанием у калмыцкого скота аллеля *28, и у ярославского скота аллелей *24 и *28.

Сходная ситуация по распределению частот BoLA-DRB3.2 аллелей была описана ранее у черно-пестрой (Удина, 1998) и красной горбатовской (Сулимова, 2006) пород КРС отечественной селекции. Аллели гена BoLA-DRB3 представлены в них относительно равномерно, максимальная частота аллелей у черно-пёстрого скота не превышает 9%, у красной горбатовской — 12,9%. Однако спектры преобладающих аллелей у данных пород иные. С наибольшей частотой у черно-пестрого КРС встречаются аллели *16 (8,86%), *24 (8,86%), *11 (6,63%), *12 (6,33%), *13 (7,59%), *51 (6,33%) (Удина, 1998). У красного горбатовского скота - *3 (12,9%), *16 (7,36%), *24 (7,4%), *11 (8,3%) (Сулимова, 2006). На долю аллелей с низкой частотой приходится 55,65% и 50,28% для черно-пестрой и красной горбатовской пород соответственно.

У якутского, зебувидного и костромского КРС наблюдается неравномерное распределение частот аллелей. У зебувидного скота с высокой частотой встречаются аллели *07 (8,4%), *22 (14,2%), *24 (16,8%), *27( 15,3%), *28 (9,5%), *42 (10,5%). Доля аллелей с частотами менее 5% (16 аллелей) составила в сумме 25,3%. У костромкого скота преобладают аллели *01 (7,2%), *08 (8,5%), *10 (22,5%), *//(12,7%), *28 (11,4%), *36 (11,4%). Суммарная доля 16 редких аллелей составила 26,3%.

Для большинства изученных ранее мировых пород КРС характерна такая же картина. Как правило, основную часть общего аллельного разнообразия составляют от двух-трех (35-43%) до пяти-шести аллелей (68-74%). Например, преобладание четырех аллелей обнаружено у бразильского скота гир (*16, *20, *2, *29, в сумме 51,7%) (da Mota, 2002), иранского зебувидного скота Систани (*8, *10, *20, *34, в сумме 48,4%) (Мохаммади, 2009), иранского голштинского скота (*8, *24, *11, *16, в сумме 67%) (Нассири, 2005). Доминирование по частотам для шести аллелей выявлено у джерсейской породы КРС ( *8, *10, *15, *21, *36, *ibe, в сумме 74%) (Gillespie, 1999), у иранского зебувидного скота Канкрэй (*34, *15, *б, *20, *37, *20, в сумме - 71%) (Behl, 2007), в одной из линий иранского голштинского скота (*8, *11, *16, *22, *23, *24, в сумме 69, 7%) (Pashmi, 2007), у японской Шортгорнской породы (*8, *9, *21, *27, *7, *24, в сумме 70%) (Takeshima, 2002).

Совершенно особая картина наблюдается у якутского скота. Разнообразие аллелей у этой породы резко снижено (всего 14 аллелей). Налицо доминирование двух аллелей - BoLA-DRB3.2*29(42,9%) и *54(22,9%). С частотой более 5% также встречаются аллели *18 (8,6%), *45 (7,1%), *50 (7,1%). На долю остальных аллелей приходится всего 11,4%. Такого низкого уровня аллельного разнообразия гена BoLA-DRB3 не было отмечено ни для одной из изученных пород КРС. Надо полагать, что столь низкий уровень аллельного разнообразия исследуемой популяции якутской породы из

Верхоянского района республики Саха по локусу ВоЬА-ОКВЗ обусловлен инбредной депрессией, возникшей в результате длительной изоляции данной группы и ее низкой численностью.

Сравнительный анализ разнообразия и характера распределения ВоЬА-ДДД5-генотипов у изученных пород крупного рогатого скота

Высокий уровень аллельного разнообразия гена ВоЬА-ОКВЗ у монгольского, калмыцкого и ярославского скота определил и высокий уровень разнообразия генотипов у этих пород - 56, 56 и 72 генотипа соответственно. У зебувидного, костромского, красно-пестрого, черно-пестрого КРС обнаружено 42, 55, 31, 50 генотипов соответственно. Минимум числа генотипов (18) обнаружен у якутской породы КРС. Во всех исследованных породах КРС, за исключением якутской, генотипы были распределены относительно равномерно.

В данных породах сложно выделить преобладающие генотипы. Так, у монгольского КРС с частотой больше 5% представлен только один генотип -*07/*07 (5,6%). У зебувидного скота пятипроцентный порог частоты встречаемости преодолели пять генотипов: *07/*24 (6,3%), *22/*24 (9,5%), *22/*27 (6,3%), *27/*27 (5,3%), *28/*42 (10,5%); у костромского - 4 генотипа: *01/*28 (5,1%), *10/*10 (10,2%), *10/*11 (5,9%), *36/*36 (5,9%); у ярославского - четыре генотипа: *12/*13 (7,8%), *24/*24 (7,8%), *24/*28 (5,7%), *28/*28 (9,9%); у красно-пестрого - шесть генотипов: *01/*07 (7,7%), *07/*07 (5,1%), *07/*22 (5,1%), *16/*24 (7,7%), *22/*24 (5,1%), *22/*42 (5,1%). У калмыцкого и черно-пестрого скота такие генотипы отсутствовали. Итак, можно сказать, что распределение частот ВоЬА-ОЯВЗ-генотипов у исследованных пород носит равномерный характер с преобладанием у зебувидного скота вариантов *28/*42 (10,5%) и *22/*24 (9,5%), у костромского КРС - *10/*10 (10,2%), у ярославского - *28/*28 (9,9%).

Описанная ситуация хорошо согласуется с мнением, согласно которому полиморфизм гена ВоЬА-ОКВЗ поддерживается на уровне популяции. В то время как одна особь может нести лишь два варианта данного гена, то набор аллелей в популяции может быть очень широким, а их сочетание в рамках генотипов - многообразным. Это обусловливает распознавание широкого спектра чужеродных антигенов.

У якутского КРС было обнаружено всего восемнадцать генотипов, пять из которых, *18/*29 (5,7%), *22/*54 (6,7%), *29/*29 (38,1%), *45/*50 (14,3%), *54/*54 (17,1%), были представлены с частотой более 5%. Суммарная частота остальных тринадцати генотипов составила 18,1%. Обращает на себя внимание генотип *29/*29, встречающийся чрезвычайно часто.

Во всех изученных породах КРС наблюдался недостаток гетерозигот (таблица 3). Это может быть связано с селекционным давлением в данных группах сельскохозяйственных животных. В диких же популяциях отбор поддерживает избыток гетерозигот по данному локусу, что способствует связыванию более разнообразного набора чужеродных антигенов.

Таблица 3. Оценка уровня гетерозиготности по ВоЬА-ПКВЗ у изученных пород

КРС.

Порода N(hm) N(ht) Но Не Х2 к D

Монгольская 16 55 0,7746 0,9532 0,033464 28 -0,18732

Калмыцкая 12 54 0,8182 0,9485 0,017900 24 -0,13739

Якутская 63 42 0,4000 0,7435 0,152335 4 -0,462

Зебувидный скот 10 85 0,8947 0,8952 0,000000 21 -0,00052

Костромская 32 86 0,7288 0,8889 0,028831 32 -0,18009

Ярославская 44 97 0,6879 0,9215 0,059218 37 -0,25345

Красно-пестрая 4 35 0,8974 0,9247 0,000806 13 -0,02948

Черно-пестрая 9 72 0,8889 0,9308 0,001886 28 -0,04503

Примечания: N(11111) - количество гомозигот в выборке. 1М(Ы) - количество гетерозигот в выборке. Но - уровень наблюдаемой гетерозиготности. Не - уровень ожидаемой гетерозиготности. у2 - значение критерия у2 Пирсона при сравнении Но и Не. к -количество степеней свободы, О - коэффициент Селендера. Различия Но и Не статистически недостоверны.

Анализ распределения аллелей гена ВоЬА-РКВЗ в связи с устойчивостью и восприимчивостью к лейкозу

Устойчивость к лейкозу определяется аллелями:*7, *11, *23, *28, восприимчивость к лейкозу - аллелями: *8, *16, *22, *24. Распределение частот BoLA-DRB3-aniienm, ассоциированных с устойчивостью к лейкозу представлено в таблице 4. Статистически значимые различия в представленности аллелей, различающихся по своей функциональной значимости, были получены только для трех пород из восьми исследованных. У монгольской и костромской пород аллели «устойчивости» к лейкозу встречались достоверно чаще, чем аллели «восприимчивости» к данному заболеванию (х= 10,84; V2=10,8; р=0,001; %\с поправкой Йетса)=9,53; р=0,002 и Х,2=22,88; V2=22,84; yv2(c поправкой Йетса)=21,78; р=0,00001 соответственно). У черно-пестрого КРС преобладали аллели, определяющие восприимчивость к лейкозу (х2= 10,29; р=0,0013; V2=10,26; р=0,0014; %2(с поправкой Йетса)=9,48; р=0,0021). У калмыцкого, якутского, зебувидного, ярославского, красно-пестрого, черно-пестрого КРС по данному признаку достоверных различий не обнаружено.

Таблица 4. Распределение частот ВоЬА-ОКВЗ-аллелей, ассоциированных с резистентностью к лейкозу. ______

Порода Монгольский КРС Калмыцкий КРС Якутский КРС Зебувидный КРС Костромской КРС Ярославский КРС Красно-пестрый КРС Черно-пестрый КРС

Частота аллелей, ассоциированных с устойчивостью к лейкозу

№ аллелея Р,% Р,% Р,% Р,% Р,% Р,% Р,% Р,%

*7 5,6 3,0 1,9 8,4 3,8 0 15,4 4,9

*и 2,1 3,8 0 2,1 12,7 0,4 10,3 1,2

*23 0 3,0 0,5 3,7 0 3,9 0 1,9

*28 7,0 14,4 0 9,5 11,4 16,0 2,6 9,3

Сумма 14,8 24,2 2,38 23,7 28 20,2 28 17,3

Частота аллелей, ассоциированных с восприимчивостью к лейкозу

№ аллеля Р, % Р, % Р, % Р,% Р,% Р, % Р, % Р,%

*8 0,7 3,0 0 2,1 8,5 0,7 5,1 5,6

*16 0,7 3,8 0 0 0 4,6 5,1 0,6

*22 0,7 1,5 4,8 0,0 2,1 2,1 12,8 11,1

*24 1,4 7,6 0 16,8 0 16,3 9,0 15,4

Сумма 3,52 15,9 4,76 18,9 10,6 23,8 32 32,7

Примечание: Различия в суммарных частотах аллелей, ассоциированных с устойчивостью к лейкозу, между породами статистически достоверны (х2=49, 32; к=7; р<0,001 для аллелей «устойчивости»; х2=87,87; к=7; р<0,001 для аллелей «восприимчивости»).

У большинства пород КРС, описанных в литературе, преобладают аллели, ассоциированные с восприимчивостью к лейкозу. Это канадская голштинская, иранская голштинская, аргентинская креольская, креольская сааведрино, иранская систани, японская шортгорнская, российская черно-пестрая и красная горбатовская. У айрширской, канадской джерсейской, бразильской зебувидной гир пород КРС преобладают аллели, ассоциированные с устойчивостью к лейкозу.

Распределение частот ВоЬА-Р11ВЗ-генотипов, ассоциированных с устойчивостью и восприимчивостью к лейкозу у изученных пород КРС

Степень генетической устойчивости породы к лейкозу важно также рассмотреть на уровне распределения частот генотипов, а не частот аллелей гена ВоЬА-ПЯВЗ. Это обусловлено тем, что устойчивость к данному заболеванию наследуется, как доминантный признак. Таким образом, если генотип несет хотя бы один аллель, ассоциированный с устойчивостью к лейкозу, то такой генотип можно считать генотипом «устойчивости» к лейкозу.

Генотипы, имеющие в своем составе хотя бы один аллель, ассоциированный с восприимчивостью к лейкозу, и не несущие аллелей, ассоциированных с устойчивостью к лейкозу, мы считали генотипами «восприимчивости» к данному заболеванию.

Исходя из функциональной значимости аллелей, мы разделили генотипы, представленные в породах на следующие группы: устойчивости/устойчивости (УУ); устойчивости/нейтральный (УН); устойчивости/восприимчивости (УВ); восприимчивости/нейтральный (ВН); восприимчивости/восприимчивости (ВВ); нейтральный/нейтральный (НН).

Генотипы «устойчивости» к лейкозу относятся к первым трем группам, «восприимчивости» к четвертой и пятой. Частоты генотипов, относящихся к данным группам, представлены на рисунке 1.

Подобный анализ проводился ранее для черно-пестрой породы КРС (Нассири, 2005). В исследуемую группу входили здоровые (п=17) и больные (п=33) животные. Среди здоровых животных частота встречаемости генотипов устойчивости была очень высокой - 70,5%, а у больных животных такие генотипы вообще не встречались, все генотипы в данной группе несли только аллели восприимчивости нейтральные аллели. Если рассматривать суммарную выборку животных этой породы, не учитывая их статус по отношению к лейкозу, то суммарная частота генотипов устойчивости составит 35,29%, а генотипов, несущих аллели восприимчивости и не несущих аллели устойчивости, - 61,77%, т.е. почти в два раза выше.

Практически у всех изученных пород, за исключением якутского и черно-пестрого КРС, преобладают ВоЬА-ВКВЗ-генотипы, ассоциированные с устойчивостью к лейкозу. У якутского и черно-пестрого скота преобладали генотипы, ассоциированные с восприимчивостью к данному заболеванию. Наиболее часто встречается сочетание в рамках одного генотипа аллеля, ассоциированного с устойчивостью к лейкозу, и аллеля, нейтрального по отношению к лейкозу, то есть генотип группы УН.

Достоверные различия выявлены у монгольской породы (х2=8,38; У2=8,32; х2 с поправкой Йетса=7,04; к=1; р=0,0038) и костромской породы (%2=48,64; У2=48,4; % с поправкой Йетса=46,59; к=1; р<0,001) КРС. Различия между частотами генотипов разных групп у калмыцкого скота соответствуют нижнему порогу уровня значимости (^2=3,59; р=0,058; У2=3,56; р=0,059; х2 с поправкой Йетса=2,91; к=1; р=0,088). У якутского, зебувидного, ярославского, красно-пестрого и черно-пестрого КРС различия между частотами генотипов разных групп недостоверны.

Обращает на себя внимание костромская порода КРС, у которой разница между частотами генотипов, определяющих устойчивость (преобладающие) и восприимчивость к лейкозу составляет 39,1%. Частота аллелей, ассоциированных с устойчивостью к данному заболеванию составляет 28%. Отмечено, что животные костромской породы редко заболевают лейкозом, что

Рисунок 1. Распределение ВоЬА-ОКВЗ-генотипов согласно их функциональной значимости у изученных пород КРС. Различия между частотами генотипов разных групп у изученных пород статистически достоверны (х2=52,15, р<0,001 для генотипов «устойчивости» и х2=51,17, р<0,001, к=7).

определяется высокой частотой генотипов (а не аллелей), ассоциированных с устойчивостью к данному заболеванию.

У монгольской и калмыцкой пород частота генотипов «устойчивости» к лейкозу (22, 4% и 37,5% соответственно) также превышает частоту аллелей «устойчивости» к этому заболеванию (14,8% и 24,2% соответственно). Эти породы относятся к единому турано-монгольскому корню происхождения. Согласно эпизоотическим исследованиям, животные этой группы обладают повышенной устойчивостью к лейкозу.

К данному корню происхождения относится и якутский КРС. Но у животных этой породы практически отсутствуют генотипы, определяющие устойчивость к лейкозу. Это может быть связано с тем, что данная порода долгое время формировалась без контакта с вирусом лейкоза крупного рогатого скота, что привело к исчезновению в популяции аллелей и генотипов, контролирующих устойчивость к этому типу рака.

У ярославского и красно-пестрого скота преобладают аллели, ассоциированные с восприимчивостью к лейкозу, а генотипы ассоциированные с устойчивостью к данному заболеванию, что позволяет поддерживать благоприятный фон по устойчивости к лейкозу в этих породах. У черно-пестрого КРС преобладают ВоЬА-БЯВЗ-аллели и генотипы, ассоциированные с восприимчивостью к данному заболеванию.

Неспецифическим фактором устойчивости к лейкозу популяции в целом может служить уровень гетерозиготности. Ранее было показано, что высокий уровень гетерозиготности в группе соответствует высокому уровню устойчивости к лейкозу. Во всех изученных породах, за исключением якутской, уровень гетерозиготности в популяции был высоким, хотя и ниже ожидаемого (-0,462<0<-0,00052), что указывает на высокий уровень общей резистентности у данных пород.

Распределение частот аллелей гена ВоЬА-РЯВЗ у исследованных пород КРС в связи с устойчивостью к другим заболеваниям

На сегодняшний день выделены аллели гена ВоЬА-011ВЗ, ассоциированные с устойчивостью (*07, *//, *13, *18, *27) и восприимчивостью (*16, *23, *2б) к маститу, а также с устойчивостью к таким заболеваниям, как цистит (*/б, *22), отслоение плаценты (*3), клещевое заболевание, вызываемое иксодовыми клещами ВоорИИш тгсгорЫ. Для аллелей *08, *22, *24 разные авторы отмечают ассоциации и с устойчивостью, и с восприимчивостью к маститу.

Все исследованные породы демонстрируют преобладание аллелей, ассоциированных с устойчивостью к маститу (31,34<х2<93,73; к=7; р<0,001). Аллели, ассоциированные с устойчивостью к клещевому заболеванию (ВоорИИт т1сгор1и$), достаточно хорошо представлены в изученных породах

- 17-

КРС (максимальная частота - 20,4% у монгольского КРС; минимальная частота - 3,7% у черно-пестрого КРС). Аллель *3, ассоциированный с низким риском отслоения плаценты, встречается у данных пород достаточно редко (максимальная частота - 7,4% обнаружена у черно-пестрого КРС; минимальная частота - 2,5% у ярославского КРС). У калмыцкого, якутского и костромского скота этот аллель отсутствовал. Максимальная частота (17,9%) аллелей, ассоциированных с устойчивостью к циститу, обнаружена у красно-пестрого КРС, минимальная (1,4%) - у монгольского КРС. Различия по частотам аллелей, ассоциированных с устойчивостью к данным заболеваниям между исследованными породами достоверны (37,35< Х2<44,87; к=7; р<0,001).

Распределение аллелей гена BoLA-DRB3, ассоциированных с признаками молочной продуктивности

Различные аллельные варианты гена BoLA-DRB3 ассоциированы с такими признаками молочной продуктивности, как количество соматических клеток (Somatic cell count, SCC) в молоке (повышенное - *8, *22, *23, сниженное - *3,*11), белковость молока (повышенная - *3, *9, *11, *26, сниженная - *22), объем удоев (повышенный - *8, *11, *23, сниженный -*22). По видимому, это связано с тесным физическим сцеплением гена BoLA-DRB3 и гена пролактина.

Преобладание у костромского КРС аллелей, ассоциированных в пониженным параметром SCC (суммарная частота 12,7%) хорошо согласуется с эпизоотическими данными об устойчивости этой породы к лейкозу и маститу. Преобладание у зебувидного скота аллелей, ассоциированных с повышенным SCC (суммарная частота 20%) может служить косвенным признаком предрасположенности животных этой породы к лейкозу и маститу. Преобладание у костромского КРС аллелей, ассоциированных с повышением удоев и белковости молока (суммарная частота 21,2%) хорошо согласуется с наблюдаемыми показателями молочной продуктивности у этой породы. У зебувидного скота велик процент неблагоприятных аллелей. Различия частот аллелей, ассоциированных с различными признаками молочной продуктивности, статистически достоверны (56,48<х2<122,51; к=7; р<0,001).

Характер распределения частот аллелей, ассоциированных с признаками молочной продуктивности схож у калмыцкой, костромской, канадской голштинской, иранской голштинской, иранской систани, красной горбатовской, японской шортгорнской, российской черно-пестрой пород КРС. У этих пород высоки частоты аллелей, ассоциированных с повышенным SCC и с увеличением удоев. У голштинского скота Канады и Ирана частоты этих аллелей крайне высоки. Айрширская порода КРС и

бразильская зебувидная гир обладают такими же низкими частотами аллелей, как и якутский КРС.

Идентификация новых форм и классификация изолятов вируса лейкоза крупного рогатого скота России и Украины, на основе анализа изменчивости вирусного гена рої

ВЛКРС принадлежит к семейству Яеїтоуігісіае, роду ОеЙагейхтпю. К этому же роду относятся и Т-лимфотропные вирусы человека I и II типов (НТЬУ). ВЛКРС обладает тропизмом к лимфоидным клеткам и размножается в них. Зрелые вирусы обнаруживаются в лимфоцитах и в молоке. Вирус проникает в клетку путем эндоцитоза, В клетке, на геномной РНК вируса обратная транскриптаза синтезирует двухцепочечную ДНК-копию, которая встраивается в геном, образуя провирус. Генетическая карта генома ВЛКРС представлена на рисунке 2.

Вирус Лейкоза Крупного Рогатого Скота

(референты* геном АР033818 (8419пн): Реігороиіоз, 1997)

ОТ-фрагмент Ин-фрагмент

(2325-2818гш) (3986-4218пн)

Рисунок 2. Структура провируса ВЛКРС. Провирус фланкирован двумя идентичными ДКП. Светло-серыми прямоугольниками под рисунком отмечены открытые рамки считывания. Темно-серыми прямоугольниками над рисунком отмечены изучаемые ОТ- и Ин-фрагменты. Локализация фрагментов дана относительно полногеномного сиквенса АР03381.

ВЛКРС распространен по всему миру. Показано, что у молочных пород доля инфицированных животных выше, чем у мясных (Murakami et al., 2011). Для ВЛКРС, как и для других Т- лимфотропных вирусов характерна строгая видоспецифичность по отношению к хозяину и медленное развитие инфекционного процесса. Вероятность инфицирования человека изучалась с применением ряда молекулярных методов (иммуноцитохимия, ПЦР, ОТ-

ПЦР). Наличие провируса ВЛКРС в тканях грудных желёз показано у ряда пациентов. Анализ выборки здоровых людей, контактирующих с коровами, (240 человек) в 50% случаев показал наличие специфических антител к ВЛКРС (Buehring et al., 2003). Опасность развития лейкоза у человека в результате инфекции ВЛКРС оценивается как маловероятная, но не исключена полностью (Calattini et al, 2006).

В настоящее время основным методом обнаружения ВЛКРС и исследования разнообразия его форм является реакция иммунной диффузии, (РИД) и метод иммуноферментного анализа (ИФА). Методы ДНК-диагностики находятся в стадии разработки и оптимизации. Для последней используют ПЦР на вирусные гены: gag (ген белка нуклеокапсида), pol (ген обратной транскриптазы), env (ген белка внешней оболочки), tax (транскрипционный активатор вирусной экспрессии). Наиболее подробные данные получены по изменчивости гена env. Описано несколько типов этого гена, среди которых есть как широко распространённые, так и эндемичные для отдельных географических локальностей (Rodriguez et al., 2009; Moratorio et al., 2010; Matsumura et al., 2011). Интерес к гену env определён вероятным участием этого гена в определении степени инфекционное™ данного изолята вируса. Вместе с тем, высокая изменчивость env генов может привести к ложноотрицательным результатам типирования. Для надёжного выявления всех вариантов вируса лучше подходит самый консервативный вирусный ген pol, кодирующий белок с доменами обратной транскриптазы (ОТ), интегразы (Ин) и другие консервативные энзиматические домены.

Поэтому в данной работе нами исследовано разнообразие ВЛКРС на территории России и сопредельных территорий (Украины) на основе анализа полиморфизма нуклеотидных последовательностей ОТ- и Ин-фрагментов гена pol. Анализируемый ОТ-ПЦР фрагмент соответствует домену обратной транскриптазы гена pol ВЛКРС, а Ин-ПЦР фрагмент соответствует домену интегразы. Два фрагмента гена pol были взяты для анализа для того, чтобы можно было выявить возможные рекомбинационные события и их значимость для эволюционного изменения генома вируса.

Всего нами получено и проанализировано 18 нуклеотидных последовательностей ОТ-фрагмента и 21 последовательность для ИН-фрагмента гена pol ВЛКРС. Полученные нуклеотидные последовательности зарегистрированы в базе данных GeneBank под номерами JQ319122-JQ319160. Помимо собственных данных для проведения сравнительного анализа были взяты имеющиеся в базе данных NCBI последовательности: Аргентина (FJ914764, АР257515), США (AF033818, EF600696 , К02120, Ml0987), Австралия (D00647), Бразилия (DQ288972, DQ288973, DQ288977, DQ288979, DQ288980), Северная Италия (S83529).

Реконструкция филогенетических отношений изолятов ВЛКРС построенная на основе анализа изменчивости ОТ-фрагмента приведена на

рис. 3. Анализ филограммы ОТ-фрагментов выявляет несколько кластеров с бутстреп поддержкой менее 50% и низкой внутригрупповой изменчивостью (не более 2%). Эти группы на рисунке обозначены как ВЬУ формы. Сравнение филограмм ОТ- и Ин-фрагментов не выявляет топологических конфликтов. Следовательно, рекомбинация внутри гена ро1, нами не выявлена.

26

80

42

83

661 Мозс<м1110

1 МоэсоиЛЮ Мозсои/116 МоэсоиНЭ

КгаэпоаагЗ

11кгате2 841 икга1пе8

иЗА_АР033818 97 I и5А_М 10987 Kгasnodar1 Кгавпойаг4 Krasnodar2 991 икгатеб I икгате1 I АгдепГта_АР257515

Л—,

99

991-Агдепйпа_Р^14764

Мозсо\лг13 Моэсо\М2 Мозсои/11 Мозссм15 -икга>пе4

МозссплМ

иЭА ЕР600696

ВШ-1

ВIV-2

В1Л/-3

В1Л/-4

• иЭА_К02120 □ ВIV-5

□ В1Л/-6 ■ Аиз1гаМа_000647 Д В1Л/-7

0.005

Рисунок 3. Реконструкция филогенетических взаимоотношений изолятов ВЛКРС по изменчивости ОТ-фрагмента гена ро1. Филограмма построена методом Ш с бутстерп поддержкой 500 реплик. Цифры обозначают величину бутстреп поддержки ветвей филограммы. Масштаб горизонтальной оси обозначает долю изменчивых нуклеотидов между сравниваемыми последовательностями.

Сопоставление географической локализации изучаемых изолятов и их филогенетической близости позволяет сделать ряд выводов. Наиболее гетерогенная популяция ВЛКРС выявлена нами в Украинском хозяйстве. В нём найдено три дальнородственных типа ВЛКРС, которые вероятно попали в него с разными животными.

Образцы первого хозяйства из Подмосковья по ОТ-фрагменту образуют один кластер. Это говорит о том, что данное хозяйство было заражено один раз одной разновидностью вируса, который затем распространился внутри хозяйства. Во втором Подмосковном хозяйстве, единый кластер, распадается на две ветви, что может быть результатом мутации вируса внутри хозяйства в ходе его экспансии, или о двух событиях проникновения ВЛКРС, относящихся к одному типу. Образцы из хозяйства в Краснодаре попадают в два разных кластера, что говорит о том, что данное хозяйство было заражено минимум дважды.

Таким образом, мы предлагаем использовать наиболее консервативный домен обратной транскриптазы вируса ВЛКРС как стандарт для определения форм вируса. Учитывая редкость рекомбинационных событий в генофонде ВЛКРС, можно предположить, что биологические свойства отдельных изолятов вируса, такие как инфекционность и вирулентность можно будет обобщать на всех представителей данной формы вируса.

Полученные данные позволили предложить классификацию изолятов ВЛКРС и метод их обнаружения, пригодный для практического животноводства

ВЫВОДЫ:

1. Высокий уровень аллельного разнообразия гена ВоЬА-БШЗ показан для монгольской, калмыцкой, ярославской и черно-пестрой пород крупного рогатого скота. Число аллелей варьировало у этих пород от 28 до 36. Для якутского скота продемонстрирован крайне низкий уровень аллельного разнообразия гена ВоЬА-ОВ.ВЗ (14 аллелей), что, по-видимому, объясняется инбредной депрессией, возникшей в результате длительной изоляции данной группы и ее низкой численностью.

2. Характер распределения частот аллелей гена ВоЬА-ОКВЗ у костромского, зебувидного и якутского КРС сходен с описанным для большинства европейских пород: на 5-6 аллелей приходится 74-88,6% аллельного разнообразия, остальные встречаются с частотой менее 5%. У монгольского, калмыцкого, ярославского, черно-пестрого КРС частоты аллелей распределены более равномерно: на долю 4-8 аллелей с частотой более 5% приходится 34,1-54,3% аллельного разнообразия.

3. Генотипы по ВоЬА-ОЯВЗ во всех изученных породах КРС, за исключением якутской, распределены равномерно. Во всех исследованных породах наблюдается недостаток гетерозигот (-0,462<0<-0,00052).

4. Аллели и генотипы по BoLA-DRB3, ассоциированные с устойчивостью к лейкозу и маститу, широко представлены у монгольского, калмыцкого, зебувидного и костромского скота, что указывает на высокий генетический потенциал местных пород в отношении устойчивости к заболеваниям.

5. Выявлены новые эндемичные для России формы вируса лейкоза КРС на основе анализа полученных в работе нуклеотидных последовательностей двух областей гена pol, кодирующих обратную транскриптазу и интегразу.

6. Предложена новая классификация форм вируса лейкоза КРС на основе анализа изменчивости гена pol. Рекомбинация между разновидностями вируса не выявлена.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

Статьи в журналах, рецензируемых ВАК:

1. Генджиева О.Б., Рузина М.Н., Сулимова Г.Е. Анализ генетических факторов устойчивости калмыцкой породы крупного рогатого скота к лейкозу// Молочное и мясное скотоводство. 2008. №12. С.9-10.

2. Рузина М.Н., Штыфурко Т.А., Мохаммад Абади М.Р., Генджиева О.Б., Цэндсурен Цедев, Сулимова Г.Е.. Полиморфизм гена BoLA-DRB3 у крупного рогатого скота монгольской, калмыцкой и якутской пород И Генетика, 2010, т.46, № 4, С.517-525.

3. Сулимова Г.Е., Лазебная И.В., Перчун A.B., Воронкова В.Н., Рузина М.Н., Бадин Г.А. Уникальность костромской породы крупного рогатого скота с позиции молекулярной генетики // Достижения науки и техники АПК. 2011. №9. С 52-54.

4. Рузина М.Н., Андрианов Б.В., Шайхаев Г.О., Сулимова Г.Е. Идентификация новых форм и классификация изолятов вируса лейкоза крупного рогатого скота России и Украины, на основе анализа изменчивости вирусного гена pol II Генетика. 2012. т.48. № 7. С.810-815.

Тезисы научных докладов:

1. Рузина М.Н., Штыфурко Т.А., Мохаммад Абади М., Генджиева О.Б., Цедев Ц., Сулимова Г.Е. Полиморфизм гена BoLA-DRB3 у крупного рогатого скота якутской, калмыцкой и монгольской пород // «Постгеномная эра в биологии и проблемы биотехнологии», КГУ, Казань, 15-16 сентября 2008г.

2. Рузина М.Н., Штыфурко Т.А., Мохаммад Абади М.2, Генджиева О.Б., Цедев Ц., Сулимова Г.Е. Аллельный полиморфизм гена BoLA-DRB3 у

пород крупного рогатого скота турано-монгольского корня // «БиоТехЖ-2008», ВИЖ, Дубровицы, 16-17 октября 2008г.

3. Рузина М.Н., Ребриков Д.В., Сулнмова Г.Е. Сравнение нуклеотидных последовательностей разных субтипов вируса лейкоза крупного рогатого скота // Материалы 12-й международной школы-конференции молодых ученых «Биология - наука ХХГвека», Пущино, 10-14 ноября 2008г.

4. Сулимова Г.Е., Рузина М.Н., Ребриков Д.В. Существуют ли российский субтипы вируса лейкоза крупного рогатого скота // Материалы XVII Международной конференции: «Новые информационные технологии а медицине, биологии, фармакологии и экологии». Ялта-Гурзуф. 2009. С.43-45.

5. Рузина М.Н., Штыфурко Т.А., Мохаммад Абади М.Р., Генджиева О.Б., Цэндсурен Цедев, Сулимова Г.Е. Исследование полиморфизма гена BoLA-DRB3 у крупного рогатого скота турано-монгольского корня // V съезд Вавиловского общества генетиков и селекционеров, ИОГен им. Н.И. Вавилова РАН и МГУ им. М.В. Ломоносова, Москва, 21-27 июня 2009г.

6. Рузина М.Н., Сулимова Г.Е. Анализ полиморфизма гена BoLA-DRB3 у Костромского КРС // 10-я научная конференция молодых ученых «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии», 07.04.2010г., Москва.

7. Рузина М.Н., Штыфурко Т.А., Мохаммад Абади М.Р.,Сулимова Г.Е. Анализ полиморфизма гена BoLA-DRB3 у костромской, ярославской, красно-пестрой и черно-пестрой пород КРС. // Международная молодёжная конференция «Популяционная генетика: современное состояние и перспективы», посвященная памятной дате, 75-летию со дня рождения академика Ю.П. Алтухова, 17-18 ноября 2011г., Москва, Россия.

Заказ № 116-П/04/2012 Подписано в печать 19.04.2012 Тираж 100 экз. Усл. п.л.1,25

"Цифровичок", тел. (495) 649-83-30 www.cfr.ru; е-тай: info@cfr.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Рузина, Мария Николаевна, Москва

61 12-3/908

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова Российской академии наук

На правах рукописи

РУЗИНА МАРИЯ НИКОЛАЕВНА

АНАЛИЗ ПОЛИМОРФИЗМА ГЕНА В()1,Л-ОИВЗ В СВЯЗИ С ГЕНЕТИЧЕСКОЙ УСТОЙЧИВОСТЬЮ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА К ЛЕЙКОЗУ И

ВИРУСОНОСИТЕЛЬСТВОМ

ДИССЕРТАЦИЯ

на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.02.07 - генетика

Научный руководитель-доктор биологических наук, профессор Сулимова Г.Е.

МОСКВА 2012

СОДЕРЖАНИЕ:

ВВЕДЕНИЕ__4

1. ОБЗОР ЛИТЕР АТУРЫ__7

1.1. Ген ВоЬА-ВЯВЗ как один из ключевых генов Главного Комплекса Гистосовместимости___7

1.1.1. Главный Комплекс Гистосовместимости (ГКГ): общие положения_7

1.1.2. Главный комплекс гистосовместимости крупного рогатого скота (ВоЬА)_15

1.1.3. Ген ВоЬА-ОЯВЗ: структура, функции, полиморфизм в популяциях_18

1.2. Вирус лейкоза крупного рогатого скота (ВЛКРС): патогенность, геном, методы детекции, распространение__ _3?

1.2.1.Патогенност ь___ 32

1.2.2.Геном ВЛКРС_34

1.2.3.Методы детекции ВЛКРС_46

1.2.4.Мировое распространение ВЛКРС_49

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ_52

2.1. Выделение ДНК___52

2.2. Определение концентрации ДНК_ 53

2.3.Анализ полиморфизма гена ВоЬА-БКВЗ методом ПЦР-ПДРФ_54

2.4. Анализ последовательностей От- и Ин-фрагментов генаро1 ВЛКРС_60

2.5. Методы статистической обработки данных_62

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ_64

3.1. Сравнительный анализ разнообразия и характера распределения аллелей гена ВоЬА-ОЯВЗ у изученных пород крупного рогатого скота_64

3.1.1. Оптимизация условий типирования аллелей гена ВоЬА-ВЯВЗ_64

3.1.2. Сравнительный анализ разнообразия и характера распределения аллелей гена ВоЬА-ВЯВЗ у изученных пород крупного рогатого скота_67

3.1.3. Сравнительный анализ разнообразия и характера распределения ВоЬА-ВЯВЗ-генотипов у изученных пород крупного рогатого скота_75

3.2. Анализ полиморфизма гена ВоЬА-ВЯВЗ в связи с резистентностью к лейкозу, ряду других заболеваний, признаками молочной продуктивности_79

3.2.1. Анализ распределения аллелей гена ВоЬА-ВЯВЗ в связи с устойчивостью и восприимчивостью к лейкозу_79

3.2.2. Распределение частот ВоЬА-ВЯВЗ-генотипов, ассоциированных с устойчивостью и восприимчивостью к лейкозу у изученных пород КРС_83

2

3.2.3. Распределение частот аллелей гена ВоЬА-ОЯВЗ у исследованных пород КРС в связи с резистентностью к маститу С) ^

3.2.4. Распределение частот аллелей гена ВоЬА-ОКВЗ в связи с устойчивостью к другим

заболеваниям__п.

------—-------У4

3.2.5. Распределение аллелей гена ВоЬА-ОЯВЗ, ассоциированных с признаками молочной продуктивности ____^

3.3. Идентификация новых форм и классификация изолятов вируса лейкоза крупного рогатого скота России и Украины, на основе анализа изменчивости вирусного гена

рЫ---------101

ЗАКЛЮЧЕНИЕ____т

выводы_____П2

СПИСОК ЛИТЕ ПРИЛОЖЕНИЕ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ___1,3

128

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. Одной из проблем российского животноводства является обеднение породного разнообразия крупного рогатого скота (КРС). В России в 80-90е гг XX века разводилось около 70 пород КРС различных направлений продуктивности и адаптированных к разнообразным климатическим и экономическим условиям нашей страны. Однако за последние двадцать пять лет более половины этих пород были потеряны. К 2001г. в Российской Федерации осталось 33 породы, из которых всего 16 имели достаточную численность для нормального воспроизводства, в 2003г. прошли бонитировку 22 породы. В 58 регионах России разводится черно-пестрая порода, в 30 -симментальская, в 28 - голштинская, в 23 - айрширская.

Таким образом, богатство генофонда КРС России, явившееся результатом долгой и успешной селекционной работы, обеспечивающей устойчивость животных к возбудителям болезней и внешним неблагоприятным условиям, оказалось частично утраченным. Обеднение генетических ресурсов сельскохозяйственных животных, в частности КРС, может привести к снижению эффективности селекции и снижению резистентности животных к постоянно эволюционирующим возбудителям заболеваний. В связи с этим, важно поддерживать максимально возможное разнообразие генофонда КРС.

Необходимым условием для проведения таких работ является проведение генетического мониторинга пород КРС на молекулярном уровне. Особый интерес представляют гены, участвующие в формировании хозяйственно-ценных признаков.

Одним из наиболее значимых в этом отношении генов является ген BoLA-DRB3, кодирующий антигены класса II главного комплекса гистосовместимости КРС. Молекулы класса II располагаются на поверхности B-клеток, которые после внутриклеточного процессинга представляют чужеродные антигены Т-клеткам для обеспечения иммунного ответа гуморального типа. На сегодняшний день методом ПЦР-ПДРФ описано 54 аллеля данного гена, методом секвенирования - более ста. Высокое аллельное разнообразие данного гена обусловлено необходимостью связывания широкого спектра чужеродных антигенов. Установлены ассоциации некоторых аллельных вариантов данного гена с резистентностью к таким заболеваниям, как лейкоз, мастит, цистит, дерматофилоз, тейлериоз, кожному заболеванию, вызываемому иксодовыми клещами Boophilus microplus.

Особенно актуальным является изучение полиморфизма гена BoLA-DRB3 в связи с резистентностью к лейкозу. Лейкоз крупного рогатого скота - хроническое инфекционное

заболевание опухолевой природы, в основе которого лежит системное поражение лейкопоэтической ткани.

По данным официального отчета Россельхознадзора за 2011 год лейкоз занимает второе место в структуре заболеваемости КРС в России и входит в список шестнадцати заболеваний, представляющих наибольшую угрозу для животноводства и птицеводства. Ситуация по лейкозу в нашей стране эндемична, данные о распространении заболевания плохо поддаются пространственному и временному контролю. Установлено, что в 2011 году появилось 117 новых очагов болезни. Ежегодно методом реакции иммунной диффузии (РИД) исследуется более 50% списочного поголовья из них до 10% оцениваются как положительные по результатам гематологического исследования (неопластические изменения и изменение лейкоформулы). При этом выбраковываются около 5% от числа положительных особей. Фактически в хозяйствах остаются не только вирусоносители (РИД-положительные особи), но и животные с субклиническими и клиническими признаками заболевания, что обуславливает высокий риск его распространения.

Лейкоз КРС приносит значительный экономический ущерб сельскому хозяйству вследствие падежа животных, недополучения продуктов животноводства, потери уникального генофонда в молочном скотоводстве. В первую очередь лейкозу подвержены высокопродуктивные животные.

С устойчивостью к лейкозу ассоциированы аллели ВоЬА-ОКВ3.2*7, *11, *23, *28 (номенклатура по ПДРФ), с чувствительностью - ВоЬА-ВКВ3.2*3, *8, *1б, *22, *24. Установлено, что устойчивость к данному заболеванию наследуется как доминантный признак. Отбор поддерживает в природных популяциях избыток гетерозигот, что способствует связыванию широкого спектра чужеродных антигенов.

Возбудителем данного заболевания является вирус лейкоза крупного рогатого скота (ВЛКРС), относящийся к группе ретровирусов. Его структура, химические, биологические и иммунологические свойства хорошо изучены на сегодняшний день. Установлено сходство ВЛКРС с вирусами НТЬУ-1, НТЪУ-1У, вызывающими Т-клеточную лейкемию у человека.

Для эффективной профилактики лейкоза важно не только учитывать данные о полиморфизме гена ВоЬА-ОЯВЗ КРС в селекционной работе, но и рассматривать распространение различных форм ВЛКРС на территории регионов нашей страны. В странах Западной Европы и Америки обнаружены географические изоляты ВЛКРС, генотипы которых существенно различаются. Однако российские разновидности ВЛКРС не исследовались.

Таким образом, исследование полиморфизма гена BoLA-DRBS у отечественных пород КРС актуально в связи с необходимостью разработки селекционно-генетических подходов к оздоровлению стад животных и проблемой сохранения видов и их биоразнообразия. Несомненный практический интерес представляет детекция эндемичных для России разновидностей BJIKPC.

Цель данного исследования - анализ полиморфизма гена BoLA-DRB3 у калмыцкой, якутской, костромской, красно-пестрой, черно-пестрой пород КРС и зебувидного скота, а также детекция форм ВЛКРС, распространенных на территории Российской Федерации.

Задачи исследования. Для выполнения цели работы были поставлены следующие задачи:

• Изучить разнообразие и характер распределения аллелей и генотипов BoLA-DRB3 у шести пород КРС: у калмыцкой, якутской, костромской, красно-пестрой, черно-пестрой пород КРС, зебувидного скота и провести сравнительный анализ с ранее изученными породами.

• Оценить характер распределения BoLA-DRB3-аллелей и генотипов, ассоциированных с резистентностью к лейкозу, в исследованных породах КРС.

• Оценить характер распределения аллелей гена BoLA-DRB3, ассоциированных с резистентностью к другим заболеваниям (маститу, циститу, отслоению плаценты, клещевому заболеванию, вызываемому Boophilus microplus), в исследованных породах КРС.

• Оценить характер распределения аллелей гена BoLA-DRB3, ассоциированных с признаками молочной продуктивности, в исследованных породах крупного рогатого скота.

На основании анализа полиморфизма гена pol выявить формы ВЛКРС, распространенные на территории РФ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Ген BoLA-DRB3 как один из ключевых генов Главного Комплекса Гистосовместимости

1.1.1. Главный Комплекс Гистосовместимости (ГКГ): общие положения. Главный комплекс гистосовместимости - это группа генов и кодируемых ими антигенов клеточной поверхности, которые играют важнейшую роль в распознавании чужеродных антигенов и развитии иммунного ответа.

Основными импульсами в изучении гистосовместимости явились открытие Landshteiner (1900) системы групп крови, что послужило началом изучения аллоантигенов, и сформулированные Little (1916) пять законов трансплантации, из которых явственно следует, что приживаемость трансплантатов подчиняется законам классического менделеевского наследования при полигибридном скрещивании. Тем самым подтверждено, что гистосовместимость генетически обусловлена, и ее проявление носит полигенный характер.

Впервые существование локуса гистосовместимости было обнаружено у мышей. Работая с кроличьей антисывороткой к эритроцитам мыши, Gorer (1936-1947) показал, что угнетение роста аллотрансплантанта опухоли сопровождается выработкой антител, которые можно обнаружить по агглютинации с эритроцитами донора. Однако мыши оказались единственным видом млекопитающих, у которых антигены тканевой совместимости расположены на эритроцитах, а не на лейкоцитах. В результате сложилось мнение, что основные антигены, ответственные за совместимость тканей, содержатся на эритроцитах. Поэтому большинство изоантигенов человека и других млекопитающих оставались неизвестны длительное время. В 50-е годы появились данные об отторжении аллогенных тканей при максимальной совместимости донора и реципиента по эритроцитарным антигенам. Интенсивные поиски закончились выделением новой системы групповых антигенов, а именно изоантигенов лейкоцитов, непосредственно участвующих в отторжении аллотрансплантантов. Вскоре аналогичные комплексы были обнаружены у всех изучавшихся видов млекопитающих и птиц, поэтому вновь открытая система антигенов лейкоцитов получила общее название - главный комплекс гистосовместимости (ГКГ).

На сегодняшний день он отмечен у рыб, птиц, амфибий, рептилий и млекопитающих (Rask et al., 1990; Flajnik et al., 1990; Figueroa et al., 1990; Kaufman et al., 1990), проведены исследования ГКГ различных видов животных (табл.1). Первая

специфичность ГКГ у человека была выявлена 1957г. При выборе номенклатуры ГКГ разных видов животных была выбрана терминология, близкая к ГКГ человека (табл.1).

Таблица 1. Номенклатура ГКГ некоторых видов млекопитающих (из:Карамышева, 1998).

Вид Обозначения ГКГ Авторы

Мышь Н-2 Gorer, 1936

Курица В Briles, Mc Gibbon, 1948; Pazderka, 1975

Человек HLA Paune, 1957; Dausset, 1958; Van Rood et al. 1958

Макака-резус RhLA Balner et al., 1965

Собака DLA Kazakura et al., 1964

Свинья SLA Vaiman et al., 1970

Кролик RLA Terasaki et al., 1961

Коза GLA Van Dam et al., 1976

Овца OLA Millot, 1971; Ford, 1975

Лошадь ELA Bailey et al., 1979

Крупный рогатый скот BoLA Caldwell et al., 1977; Spooner et al., 1978; Amorena, Stone, 1978

Крыса RTI Bogden, Artenmak, 1960

В иммунной системе ГКГ участвует в механизмах отторжения трансплантатов тканей, стимуляции образования антител, стимуляции реакции в смешанной культуре лимфоцитов, реакции «трансплантат против хозяина», клеточной реакции лимфоцитов, рестрикции иммунного ответа, контролирует гены иммунного ответа (Ir-гены), играет важную роль в созревании и дифференцировке клеток, особенно Т-лимфоцитов («Главный комплекс...», 1993).

Строение ГКГ достаточно консервативно, что позволяет рассмотреть его структуру на примере ГКГ любого вида млекопитающих. Наиболее детально изучен ГКГ человека. Поэтому целесообразно рассмотреть структуру комплекса HLA.

ГКГ расположен у человека на 6-й хромосоме и занимает значительный участок ДНК, включающий около 50 генов. Локусы системы HLA кодируют антигены, подразделяющиеся в зависимости от строения и функции на классы I, И, и III (рис.1). Номера кластеров отражают порядок их открытия, а не расположение на хромосоме.

Между молекулами первых двух классов имеются выраженные структурные различия, но при этом по общему плану строения все они однотипны. В то же время

между продуктами генов класса III. с одной стороны, и классов I и II. с другой стороны, не найдено никакого функционального или структурного сходства.

D-область ФНО МНС класса II С4В C4ABfC2 aß МНС класса I В С А I

1 CYP21 CYP21P LTB I

■4— Направление транскрипции

<— DPE ----------Q- ¡2 DPB1 DNA DMB DQB2 DQB3 DPA2 DPA1 DMA DOB DQA2 DQA1 DRB2 DRB9 DQB1 DRB1 DRB3 DRA

Рисунок I. Структура ГКГ человека (Бурмеистер. Пецутто, 2007). Антигены класса I кодируюся генами, расположенными в трех смежных локусах. Гены, колирующие антигены класса 1!. организованы в комплексы 011. ПС). ПР. Другие структурно связанные с ними гсиы в большинстве своем являются нетранслируемыми псевдогенами с неясными функциями. Гены, кодирующие компоненты комплемента С2, С4. ВГ расположены между генами молекул ГКГ класса I и И. Продукты экспрессии этих генов раньше называли антигенами класса III. Для них так же характерен широкий полиморфизм. В пределах комплекса Ш.А расположены и другие важные гены, кодирующие фактор некроза опухолей (ФНО-а. ФНО-р), родственный им лимфотоксин 1.ТВ. ферменты СУР21а и СУР21Ь. На рисунке не указаны гены транспортных белков ТАР1 и ТАР2, расположенные между ПР и ПО. Продукты их экспрессии играют важную роль в транспорте антигенных пептидов к молекуле Н1.А.

К классу I относятся классические трансплантационные антигены НГА-А. -В и -С (рис.2). Антигены класса I представлены на поверхности практически всех ядросодержащих клеток. Данные молекулы представляют собой димер, образванный а- и р- цепями. Цепь а (45кДа) является продуктом генов НГА-А, -В или -С. Молекула состоит из трех внеклеточных доменов ос1. «2, аЗ, содержащих по 90 аминокислотных остатков, а также трансмембранной (25 остатков) и цитоплазматической (30 остатков) порций. Полиморфные последовательности сосредоточены в доменах сх1 и а2. Наиболее высокая изменчивость связана с остатками в положении 68-80, с группами остатков около позиции 110 и 135. С доменом аЗ пековалептно связана (3-цспь. представляющая собой [32-микроглобулин и являющаяся продуктом гена, не связанного с ГКГ (локализован на хромосоме 15). Микроглобулин р2 и домен аЗ прилегают к мембране. Эти участки молекулы антигена гомологичны доменам иммуноглобулинов и имеют сходную пространственную организацию: два антипараллельные р-слоя. образованные 3 и 4 отрезками полипептидной цепи свернутой в виде гармони и скрепленные дисульфидной

9

связью. Над этими глобулами располагаются домены а1 и а2, не относящиеся к суперсемейству иммуноглобулинов. К1-концевая часть этих доменов формирует Р-слой в виде платформы, на которой располагаются две «-спирали, сформированные С-концевыми порциями доменов разной длины. Как показали результаты рентгеноструктуриого анализа, домены «I и а2 формируют щель (щель Бьоркмана), стенки которой образованы внутренними поверхностями «-спиральных участков, а дно -(3-слоем (рис.3). Со стенками щели Бьоркмана связаны практически все гипервариабельные участки молекулы. Эта щель заполняется пептидным фрагментом антигена и является структурной основой презентации антигена. Вариабельности остатков и, следовательно, конфигурация щели определяют разнообразие молекул ГКГ по их сродству к различным пептидам (Ярилин, 1999).

КЛАСС 1 КЛАСС II

а 1ЫИИ 1

|и-СПИРАЛЬ | ПОЛОСТЬ |

\ МЕМБРАНА

с ООН С :оон :оон

Рисунок 2. Структура молекулы антигенов класса I и II (Рабсон, 2006). На рисунке представлены домены и трансмембранныс сегменты молекул: а- спирали и р-складчатый слой. Объяснения см. �