Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование хромосомных негистоновых белков в нормальных и малигнизированных клетках

ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Исследование хромосомных негистоновых белков в нормальных и малигнизированных клетках"



На правах рукописи

ГРАНДИЛЕВСКАЯ Анна Борисовна

ИССЛЕДОВАНИЕ ХРОМОСОМНЫХ НЕГИСТОНОВЫХ БЕЛКОВ В НОРМАЛЬНЫХ И МАЛИГНИЗИРОВАННЫХ КЛЕТКАХ

03.00.25 - Клеточная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ ''1993

На правах рукописи

ГРАНДИЛЕВСКАЯ Анна Борисовна

ИССЛЕДОВАНИЕ ХРОМОСОМНЫХ НЕГИСТОНОВЫХ БЕЛКОВ В НОРМАЛЬНЫХ И МАЛИГНИЗИРОВАННЫХ КЛЕТКАХ

03.00.25 - Клеточная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ 1993

Работа выполнена в Институте цитологии РАН.

Научные руководители: кандидат химических наук В.П.Кушнер кандидат биологических наук В.А.'Иванов

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук П.Г.Назаров доктор биологических наук В.И.Воробьев

Ведущее учреждение: НИИ онкологии ш.Петрова, РАМН

Защита состоится''^"^¿¿Уая 199.4 г. в 13 часов на заседании Специализированного совета Д.002.73.01 при Институте цитологии РАН по адресу: 194064, С.-Петербург, Тихорецкий пр.,4.

С диссертацией модно ознакомиться в библиотеке Института цитологии РАН.

Автореферат разослан "21" декабря 1993.

Ученый секретарь специализированного совета

доктор биологических наук , Л.Н.Писарева

© - Институт цитологии РАН

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Одним из важных вопросов современной клеточной биологии является изучение регуляции генной экспрессии. Среди многообразия подходов к разрешению этой проблемы значительный интерес представляет исследование антигенных изменений при опухолевой трансформации как модели изучения регуляции генной активности. Основанием для этого может слудить представление об антигенной дивергенции опухолевых меток, формулированное Дэем (Дэй, 1966), суть которой состоит в появлении в опухолях антигенов, не свойственных нормальным дефинитивным тканям, но присущих в норме клеткам негомологичных тканей, впоследствии названных гете-роорганными антигенами. Процессы дисдифференцировни клеток опухолей, обусловленные экспрессией гетероорганных антигенов, могут служить примером изменения работы генома при ма-лигнизации и позволяют рассматривать спонтанное возникновение неопластпческой трансформации !сак результат действия эндогенных факторов, способных специфически воздействовать на характер экспрессии генов дифференцированной глотки (Кушнер, 1993).

Согласно современны?.! представлениям в первую очередь такого рода факторы следует искать среди ядерных белков и, в частности, среди негистсновых белков хроматина (НГБ). Накопленный к настоящему времени экспериментачьный материал позволяет говорить об активной участии отдельных компонентов этой весьма гетерогенной и многофункциональной группы белков в регуляции экспрессии генов ( Цанев, 1980; Phillips et al, 1980; Van Holde , 1988). В связи с этим значительный интерес представляет изучение.НГБ-антигенов, тем более, что они оказываются вовлеченными в процессы антигенной дивергенции при малигнизации клеток.Та: в составе хроматина клеток гепатоцеллюлярных опухолей и рабдомкосаркомы крыс были обнаружены гетероорганные НГБ-антигены, конститутивно присущие клеткам почек интактных крыс (ГАПП) , которые также появляются в ответ на однократное введение гепатоканцероге-нов в клетках печени и свойственны пролиферируюким клеткам

регенерирующей печени крыс после операции частичной гепа-тзктомии (Кушнер и др, 1984, 1992; Фель и др, 1984). Вместе с тем, имеются указания на возможную причинно-следственную связь между появлением в малигнизированных клетках печени НГБ-ГАПП и. мембранных гетероорганных антигенов той же почечной принадлежности (Фель, 1982).

Принимая во внимание эти сведения, а также сведения о роли НТВ в регуляции экспрессии генов ( Цанев, 1980; Phillips et al,1980; Van Holde. 1988),' можно предполагать, что указанные выше НГБ-антигены, вероятно, являются одними из эндогенных факторов дисдифференцировки в процессах клеточной пролиферации, и малигнизации. Идентификации этих компонентов НГБ и изучению их функциональных cbqhctb и посвящена проведенная работа.

Дели и задачи исследования.

1. Идентификация фракций гетероорганных НГБ-антигенов почечной природы, выявляемых в клетках гепатомы и печени крыс после однократного воздействия гепатоканцерогеном, с помощью биохимических и иммунологических методов.

2. Установление биологического действия хроматогра-фически индивидуальных фракций гетероорганных НГБ-антигенов почечной природы на непродиферирующие клетки в сравнении с нефракционированньми лрепаратами НГБ.

3. Получение и характеристика моноклональных антител к компонентам НГБ - гетероорганным антигенам почечной природы с целью их последующего применения в изучении молеку-лярно-биологических механизмов функционирования этих белков в различных клеточных процессах.

Научная новизна работы. ; В ходе работы идентифицирован один из НГБ-ГАПП, ассоциированных с гепатомами - фосфопро-теинкиназа с мол.массой около 23 кДа (рр23). Этот белок является основным компонентом узкой белковой фракции, элюиру-емой 0.4-0.5 М NaCL и обладающей собственной фосфопротеин-киназной активностью (СФА), неизменно наблюдаемой при разделении на фосфоцеллюлозе препаратов НГБ из гепатом, печени крыс после однократного введения гепатоканцерогенов, нор-

мальных почек, но никогда - при фракционировании НГБ из печени интактных крыс. Иными словами, установлено, что в ма-лигнизированных клетках печени синтезируется белок рр23, не обнаруживаемый в интактной печени, но свойственный интакт-ной почке.

В экспериментах по стимуляции синтеза днк в покоящихся мышиных фибробластах Swiss ЗТЗ было установлено, что стимулирующее пролиферацию действие НГБ из гепатом и "канцерогенной" печени крыс может быть объяснено, в частности, наличием в этих препаратах белка рр23.

Этот белок приводил к индукции на поверхности нормальных гепатоцитов мембранных ГАПП при воздействии на клетки как нефрэкционированными так и очищенными препаратами НГБ из хроматина малигнизированных клеток печени и клеток нормальных почек крыс.

В ходе работы были получены монокдональные антитела к фракции НГБ из хроматина почек крыс, связывающиеся с фосфопротеинкиназой рр23. С их помощью удалось установить исключительно ядерную локализацию этого белка в малигнизированных клетках печени.

Полученные данные могут служить свидетельством в пользу предположения о регуляторной роли отдельных компонентов НГБ в процессах пролиферации и опухолевой трансформации.

Научно-практическая ценность работы. Результаты работы вносят существенный вклад в понимание свойств отдельных НГБ и их роли во внутриклеточных процессах. Полученные данные могут быть использованы для изучения механизмов регуляции экспрессии генов при дифференцировке и трансформации клеток. Использованный подход к получению моноклональных антител может быть применен для получения антител к НТВ, содержащимся в хроматине в очень незначительных количествах .

В ходе работы разработана оригинальная методика выявления незизуализируемнх иммунопреципитатов (удостоверение N 86/163), значительно повышающая чувствительность метода

реакщта специфической задержки преципитации в агарозе.

Апробация работы.Материалы диссертации были доложены на IX Всесоюзном симпозиуме "Структура и функции клеточного ядра" (Черноголовка, 1987), на Всесоюзном совещании "Клеточные и молекулярные механизмы канцерогенеза" (Ленинград, 1988), на Всесоюзном совещании "Актуальные вопросы клеточной биологии" (Ленинград, 1989), на совещании "Биология клетки в культуре" (С.-Петербург, 1992), на Всероссийском симпозиуме "Структура и функции клеточного ядра" (С.-Петербург, 1993) и на научных семинарах лаборатории цитологии опухолевого роста Института цитологии РАН.

Публикации. По.теме диссертации опубликовано 12 работ.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 13^ страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов собственных исследований и обсуждения, выводов и списка литературы, содержащего публикаций. Материалы диссертации иллюстрированы 8 рисунками и 7 таблицами.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

В работе использовали самцов беспородных крыс весом 120-150 г и мышей линии ВАЬВ\С (питомник "Рапполово" РАМН). Ядра из печени, почек и гепатом крыс выделяли седиментацией через 2.2 М сахарозу (Марзлаф и Хуан, 1987). Из предварительно отмытых ядер выделяли комплексы НГБ-ДНК согласно описанному ранее методу (Кушнер и др, 1984) , которые были использованы для иммунизации животных при получении специфических нммуносывороток и моноклональных антител, а также для получения свободных от ДНК препаратов НТВ.

Для выделения чистых НТВ раствор, содержащий комплексы НГБ-ДНК, последовательно обрабатывали карбоксиметилсефа-дексом С-50 и ДЕАЕ-сефадексом А-50. Полученный раствор НГБ диализовали против Н2О в течение ночи. После отделения образовавшегося осадка центрифугированием при 25000ё получали фракцию водорастворимых НГБ.

Ионобменную хроматографию препаратов НТВ осуществляли на колонке с фосфоцеллюлозой, уравновешенной 0.05 М Трис-НСЬ буфером рН 7,5, содержаний,4 0.1 М МаСЬ. Элюцию вели тем же буфером с линейно нарастающей концентрацией НаСЬ от 0.1 до 1.0 М. Линейность градиента контролировали с помощью рефрактометра ИРФ-454.

СФА белков, содержащихся во фракциях, определяли по включению радиоактивной метки. Для этого из фракций отбирали аликвоты по 0.2 мл и вводили их в 0.05 М Трис-НСЬ буфер рН 7.5, содержащий 3.75 м М^г и г-33Р-АТФ (55-100 кБк). Пробы инкубировали 10 мин при 30.С. Реакцию останавливали добавлением 0.05 М АТФ, и бел 1 си осаждали на бумажных фильтрах, которые подвергали радиометрическому анализу на сцин-тилляционнсм счетчике фирмы Весктап.

Гель-фильтрацию препаратов фракций НТВ осуществляли на колонке диаметром 0.7 см и длиной 135-150 см, заполненной сефадекссм 0-75 или бисерным гелем Молселект Г-75, уравновешенным 0.01 М фосфатным буфером рН 7.3, тем же буфером с добавлением додецилсульфата натрия до 0.1Х или НгО. В этом же буфере наносили образцы в объеме не более 1 мл и 12.1 же вели элхщию. Колонку градуировали с помощью маркерных белков. О наличии во Фракциях интересующих нас белков судили по уровню СФА (как описано выше).

Исследование антигенных свойств препаратов НТВ и их Фракций проводили в реакции спецпфичеасой задержки преципитации в агарозе (Гершун и др., 1981). При изучении узких фракций НТВ из-за невозможности визуального контроля образования иммунопреципитатоп вследствие низких концентраций белков были использованы радиоактивные препараты (см. выше). В этих случаях по окончании реакции в блоке геля вырезали полосы шириной в диаметр лунки, соединяющие лунки крест-накрест через центральную лунку. Эти по/оски разделяли на равные участки. Каждый из таких кусочков геля промывали 0.01 М АТФ, 0.14 М МаСЬ и Н2О, обезвоживали и подвергали радиометрическому анализу.

Эксперименты по влиянию препаратов ПГБ на пролифера-тивную активность проводили на культивируемых мышиных фиб-

робластах Swiss ЗТЗ, адаптированных к росту в среде Игла с добавлением 10% сыворотки крупного рогатого скота (Ин-т цитологии РАН), Для прекращения пролиферации клетки переводили в среду с 0.5% сыворотки и инкубировали в течение 3 сут. После чего вводили исследуемые и контрольные препараты и через 21-23 ч оценивали интенсивность синтеза ДНК по включению 14С~тимидина.

Изучение влияния НГБ на экспрессию мембранных ГАПП проводили в суспензии нормальных гепатоцитов крыс, полученных в соответствии с рекомендациями Сеглена (Seglen, 1976) с некоторыми модификациями. Инкубацию гепатоцитов проводили в течение 5 ч с нефракционированными НГБ (100-200 мкг/мл) или с их фракциями (1-2 мкг/мл). Затем клетки промывали, обрабатывали специфической иммуносывороткой против мембранных ГАПП и иммуносывороткой против глобулинов кролика меченой ФИТЦ. Экспрессию мембранных ГАПП контролировали визуально по специфическому свечению мембран с помощью флуоресцентного микроскопа ЛШАМ.

Для получения моноклональных антител была проведена иммунизация группы мышей комплексами НГБ-ДНК из клеток нормальных почек крыс. В работе были использованы спленоцигы мыши с наиболее высоким титром специфических антител в крови. Слияние спленоцитов с метками мышиной миеломы NSP2\0 проводили по методике, описанной Келлером и Милштейном (Keller, Milstain, 1976). Тестирование клонов осуществляли с помощью твердофазного иммуноферментного анализа.

Электрофорез грепаратов НГБ в 12.5%-ном полиакриламид-ном геле производили по Лэммли (Laemmli, 1970). После чего осуществляли стандартную процедуру иммуноблоттинга.

Изучение специфичности полученных моноклональных антител методом непрямой иммунофлуоресценции проводили с использованием культивируемых клеток крысиной гепатомы 27, любезно предоставленных к.б.н. Т.В.Поспеловой (Ин-т цитологии 1*АН) и нормальных гепатоцитов крыс, выделенных как описано ранее. Клетки фиксировали 15 мин 2^-ным формальдегидом, инкубировали 10 мин в 1%-ном растворе Triton Х-100 и обрабатывали антителами по стандартной методике.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Идентификация НГБ-антигеноз почечкой природы, ассоциированных с гепато?/<ами.

При фракционировании на фосфоцеллолозе препаратов НГБ из малигшшровашшх клеток печени, содержащих гетероорган-ные антигены почечной природы, неизменно могло наблюдать белковые фракции, обладащив собственной фосфопротеиккииаз-ной активностью (ОМ), элюируешэ 0.4-0.5 М ПаСЬ (в дальнейшем узклэ ¡¿разщин НТВ). Эти фракции так*» неизменно обнаруживаются при аналогичном фракционировании НТВ из нормальных почек, по никогда - при телом г.з разделении !!ГЗ из нормальной пзпзап крь:с. Высказанное ранее предположение о соотззтствпл белков этих узких Фргзщпй готерооргашп:м ПГБ-антпген?:.! почечной природы (тол5 п др., 1931) послу.'";:,по отправной точкой ка'лпх иеслэдоззяий. Нзпссредствзшюз установление антигенных сво::ста этпк белкоз затруднено ж чрезвычайно низкой концонтрсцаэЛ. Однако СЪ\, присущая белкам узких фракций, поззоллда нал- полупиь радпспктлзпыз прзпа-ратн, лспользозалпз которих значительно погасило чувствительность пр:г-:опаегн.ч гзтолоз, что дало зоз^сгнюсть регистрировать п.". пзз!~лоцзГ;с?з:'.з с г.лгуизсизорои::::п. Длл эгого била прлмзпона рзащил спзцн>;1чсской згдорглг:г нрзцпилгацгл з агарозе (FC3IIA), подробно оппсгппал.ранее (Горт/п л др., 1931). В цептратьиуэ lyiiiiy галл (Fnc.l) bkocüin р:.;уноснзо-ротку протпз комплексов }!ГБ-Л1!К :?э пормгяьзЕЗД псгазк гр^с, пстоядеиузо непосредственно в голе d отнсг.з:иш ИГВ-аптлгопов клзток П8Ч31Ш ¡гаталтяих крис (ПГБ-L). Полнота пстоцэппя контролировалась визуально п ралиомзтрпческп по- отоутстшго реакции сызороткл с ЯГБ-L (луяка III). При таз:ой постзнозкэ реакции образование шэдпь-их пли радноактлзза.'х прзщшетатов соответствует НГБ-ГЛПП. В лунку I и II вносили радиоактивные препараты нефразщиошфованных ПГБ из клеток печени крыс после однократного введения канцерогена дизталпитрозамлна (НГБ-D) и их узких фракций (фрНГБ-D). После окончания реакции гель разрезали на равные участки (Рис.1) и подвергали радиометрическому анализу. В области участка 2 визуально

можно было наблюдать полосу преципитации, соответствующую ГАЛЛ. В этом же участке был зарегистрирован повышенный уровень радиоактивности (103 имп/шн), свидетельствующий о наличии фосфорилированных радиоактивных белков, преципитиро-ванных в этой полосе. Такая же зона повышенной радиоактивности была установлена и для фрНГБ-Б (участок 5 - 560 имп/мин), несмотря на отсутствие видимой полосы. Аналогичным образоы были протестированы узкие фракции НГБ из гепа-тоы. (фрНГБ-Н) и нормальных почек крыс (фрНГБ-К). В обоих случаях в той же зоне был установлен повышенный уровень радиоактивности, в то время как для НГБ-Ь радиоактивность аналогичных участков геля не превышала 20 имп/мин. Эти результаты позволяют говорить о формировании в указанной зоне радиоактивных иммунопреципитатов, соответствующих гетероор-ганным НГБ-антигенам почечной природы, вследствии взаимодействия белков узких фракций с истощенной антипочечной им-муносывороткой. Почечную природу исследованных антигенов подтверждают контрольные эксперименты, в которых та же сыворотка истощалась в отношении почечных антигенов ("гашение" преципитации). В этих случаях не было зафиксировано участков геля с повдаенной радиоактивностью (Таблица1).

Таблица 1

Г" " -......— ч | Истощение | 1 1 Радиоактивность имп/мин 1

1 г 1 1 1 | фрНГБ-К фрНГБ-Н фрНГБ-Э |

1 1 | НГВ-Ь 1 1 • 1 110 130 560 |

1 .....г | НГВ-К | 1 ,;,.„.' 1. 12 ■ 15 30 | 1

Таким образом, нам удалось установить, что белки узких фракций НГБ из малигнизированных клеток печени, с одной стороны обладают СФА, а с другой стороны в иммунологических реакциях выступают как гетероорганные НГБ-антигены почечной природы. Это дает возможность воспользоваться протеинкиназ-

1-8 - номера участков геля Ц - центральная лунка

I - НГБ-D '

II - фрНГБ-D

III - НГБ-L

IV - 0.14 М NaCl

Рис. 1 Схема разделения геля после РСЗПА.

В центре - гамма-глобулиновая фракция кроличьей иммуносы-воротки против комплексов НГБ-ДНК почек интактных крыс, истощенная антигенами НТВ печени интактных крыс.

Рис. 2 КрЯгвые элюции в двух опытах по гель-фильтрации маркеров и фр НГБ-О и фр НГБ-Н на сефвдексе (3-75.

По оси абЙдеес - объем элюции с колонки, мл. ПЬ<оеи ординат: - слева - УФ-поглощение в проточной кювете; справа -- радиоактивность,' имп/мин. Колонка О. 7X150.0 см;фракции по 2мл. Кривые УФ-поглощения, максимумы на которых соответствуют выходам: 1 - голубого декстрана ; 2 - сывороточного альбумина человека (65 кДа); 3 - яичного альбумина (43 кДа); 4 - папаина (23 кДа);5 -0.4 М фрНГБ-Б; 6,7 -значения радиоактивности проб из хроматографических фракций гель-фильтрации образцов фрНГБ-Н и фрНГБ-Б соответственно.,

ной активностью для идентификации этих НГБ-ГАПП.

Для выяснения белкового состава узких фракций НГБ, соответствующих ГАШ, ш провели гель-фпльтращш препаратов узких фракций НГБ из гепатом, печени крыс после однократного введения гепатоканцерогена, а тага:е из нормальных почек крыс. Для регистрации белков фракций, невыявляемых обычными способами из-за очень низких концентраций, ми воспользовались присущей им протеишшнашюй активностью. При гель-фильтрации всех исследованных препаратов (фрНГБ-Н, фрНГБ-О, фрНГБ-К) ?.гл получияп один и тот кэ результат -единственный значишЗ пик активности в области элюции белков с иол.массой около'23 1фа (Ряс.2). Эксперименты, в которых фосфоршшрованпз осуществляли не' до, а после хроматографии в каждой отдельной'фракции, свидетельствуют о наличии б этой области активной фосфопротеинкиназы, фосфори-лиру^щэй себя в отсутствии дополнительного субстрата. На основании зги;; данных ш сделали вывод о том, что основным компонентом уоких фракций НТВ из гепагои и клеток печени после воздействия гепатоканцэрогеном, соответствующих Ш'Б-ГАГШ, а таксе аналогичной узкой фраэдш НГБ из нормальных почек крыс, является фосфоярэтеппкнназа с мол.массой около 23 кДа (рр23). Этот белок, выделенный из гепатом и печени крыс после введения канцерогена, в РСЗПА образовывал преципитаты с телуносшзороткой против комплексов НГБ-ДНК из нормальных почек крыс, истощенной в отношении НГБ-антигенов пнтектной печени. Это говорит о его принадлежности к НГБ-ГАПП, т.е. бил идентифицирован один из опухолеассоции-рованных гетероорганных НТВ-антигенов почечной природы.

Таким образом, установлено, что в мал иг низ ированных клеисах'печени в отличие от клеток нормальных присутствует неизвестная ранее фосфопротеинкиназа рр23, ишунологпчески идентичная аналогичному белку из нормальных почек крыс.

Стимуляция пролиферативной активности покоящихся клеток Swiss ЗТЗ препаратами НГБ.

Культивируемые клетки Swiss ЗТЗ переводили в среду с пониженным содержанием сыворотки до полного прекращения пролиферации. После чего в среду вводили исследуемые препараты НГБ и их узкие фракции, а также в качестве положительного контроля - эпидермальный фактор роста (ЭФР). Стимуляцию оценивали по включению 14С-тимидина в ДНК. В ходе экспериментов было отмечено, что НГБ-К, НГБ-Н и НГБ-D обладают стимулирующим действием на покоящиеся клетки, хотя эффект был значительно ниже, чем при воздействии ЭФР. Так уровень синтеза ДНК был выше, чем в контроле (клетки бе? стимулирующих добавок) в 2.2 раза при введении НГБ-К, в 3-4 раза при введении НГБ-D и почти в 5 раз при введении НГБ-Н. Наибольшей эффективности стимуляции удалось добиться при введении препаратов узких фракций исследованных НГБ. Так фрНГБ-К вызывала почти в 3 раза большее повышение уровня включения 14С-тимидина в ДКК, чем нефракционированный препарат НГБ-К. Принципиально сходный результат получен и для фрНГБ-Н и НГБ-Н. Препараты фрНГБ содержат преимущественно белок рр23, в то время как в нефракционированных препаратах НГБ его содержание значительно ниже. Таким образом, повышение интенсивности включения метки при введении фрНГБ в тех же белковых концентрациях, что и суммарных НГБ, вероятно, объясняется повышением относительного содержания "работающего" белка, а именно белка рр23. Прямое доказательство этому получено в опытах по стимуляции клеток непосредственно белком рр23, очищенным гель-фильтрацией. Также как и для фрНГБ, его стимулирующий эффект составлял около 40-50% от действия "Т>Р.

Таким образом, белок рр23 способен стимулировать про-лиферативную активность покоящихся клеток Swiss ЗТЗ.

Индукция синтеза мембранных опухолеассоциированных ГАПП при воздействии НТВ на нормальные гепатоциты крыс.

В малигнизированных клетках печени наряду с НГБ-ГАПП были обнаружены мембранные гетероорганные антигены почечной природы (Иванов и др.,1978). Эти же мембранные опухолеассо-циированные антигены появляются в гепатоцитах после однократного введения гепатоканцерогена in vivo и in vitro (Фель,1990). Мы предполсшли, что одной из прнчин их появления могут быть НГБ-ГАПП и, в частности, белок рр23. Поэтому, воздействуя на нормальные гепатоциты в суспензии препаратами НГБ из малигнизированных клеток печени, а также препаратами НГБ-К и их узкими фракциями, мы исследовали возможное появление вышеуказанных мембранных ГАПП в реакции непрямой иммунофлуоресценции с помощью специфической имму-носыворотки к этим мембранным антигенам. Действительно, инкубация клеток с препаратами НГБ-К, НГБ-D, НГБ-Н, равно как и с фрНГБ-К, фрНГБ-D, фрНГБ-Н приводила к появлению на поверхности части клеток мембранных опухолеассоциированных ГАГШ (Таблица 2).

Таблица 2

1 I Воздействие на гепатоциты i Доля клеток с полож.реакцией!

7. |

| • НГБ-К 8.6-13.0 |

| :: НГБ-Н 7.0- 9.0 |

| НГБ-D 2.6- 3.0 |

Г. фрНГБ-К 8.1- 9.2 |

| фрНГБ-Н 7.0- 9.0 |

|• фрНГБ-D i • 2.8 | i

Следует отметить, что таких клеток не наблюдали ни в ' контрольных препаратах, ни при воздействии на гепатоциты препаратами НГБ-1..

Необходимо отметить, что количества вносимых препаратов были подобраны таким образом, что содержание рр23 и в нефракционированных препаратах и во фракциях было примерно одинаковым. Поэтому сходный эффект суммарных препаратов и их фракций обусловлен, по-видимому, действием рр23. Прямое подтверждение этому получено при воздействии на клетки белком рр23, очищенным гель-фильтрацией. Так рр23 из гепатомы 27 вызывал появление мембранных ГАПП у 7% клеток.

Таким образом, белок рр23 способен индуцировать появление мембранных опухолеассоциированных ГАПП на поверхности нормальных гепатоцитов.

Получение моноклональных антител к белку рр23.

Для иммунизации мышей были использованы комплексы НГВ-ДНК и свободные от ДНК препараты НГБ из нормальных почек крыс. Было установлено, что наиболее высоким титром специфических антител характеризуется кровь мышей, иммунизированных комплексом НГБ-ДНК, спленоциты одной из которых были использованы для получения гибридом.

'4з-за невозможности получения достаточных для тестирования количеств очищенного препарата рр23, содержащегося в хроматине в очень незначительных количествах, был применен поэтапный метод скрининга. Первичный масштабный скрининг выросших клонов (более 400) был произведен с помощью нефракционированных препаратов НГБ-К. Отобранные таким образом наиболее, жизнеспособные и продуктивные клоны тестировали с помощью фрНГБ-К, и окончательно клоны отбирали, используя в качестве антигена белок рр23, очищенный гель-фильтрацией. Клон 5Д2 оказался наиболее стабильным и был использован для дальнейшего клонироваания, в ходе которого были получены 2 субклона. Продуцируемые ими антитела не взаимодействовали с НГБ печени ин'"'«тных крыс, что подтвердило специфичность полученных антител по отношению к почечному белку, не обнаруживаемому в нормальной печени крыс. Клетки каждого из субклонов были использованы для наработки асцитной жидкости в мышах.

Как показывают предыдущие исследования, белок рр23 наряду с клетками почек обнаружен в малигнизированных, но не нормальных клетках печени крыс. Поэтому было проведено изучение взаимодействие антител 5Д2 с антигенами клеток крысиной гепатомы 27 и нормальных гепатоцитов крыс. В клетках гепатомы можно было наблюдать специфическое точечное свечение во внутренней области ядра, не обнаруживаемое при аналогичной обработке нормальных гепатоцитов. Такой результат не только наглядно подтверждает наличие белка рр23 в клетках гепатомы и отсутствие его в нормальных клетках печени, но и свидетельствует о внутриядерной его локализации.

При исследовании электрофоретически разделенных препаратов НГБ-К с помощью иммуноблоттинга антитела 5Д2 среди более сотни белков выявили три очень близкие полосы в области мол. масс 22-24 кДа (Рис.3).

Рис.3 - Схема иммуноблоттинга электрофоретических фракций НГБ-К с моноклональными антителами 5Д2.

Еще одним доказательством специфичности полученных антител может служить наличие у связывающегося с ними белю фосфопротеинкиназной активности. В ходе исследований было установлено специфическое взаимодействие иммобилизованных на нитроцеллюлозе антител 5Д2 с фосфорилированными радиоактивными фракциями, содержащими белок рр23.

Таким образом, в ходе проведенных исследований ИГЕ из хроматина некоторых нормальных и малигнизированных клеток

установлено появление в малигнизированных клетках печени, не свойственной печени нормальной фосфопротеинкиназы с мол. массой около 23 кДа, содержащейся в незначительных количествах. Этот белок в норме может быть обнаружен в почках интактных крыс. Рр23 способен стимулировать синтез ДНК в покоящихся клетках Swiss ЗТЗ и вызывать индукцию мембранных опухолеассоциированных ГАПП на поверхности нормальных гепа-тоцитов. Эти установленные нами свойства рр23 вместе с тем фактом, что он обнаруживается в клетках печени уже на самых ранних стадиях канцерогенеза (в первые сутки после однократного введения гепатоканцерогена) создают реальную основу для гипотезы о принадлежности этого белка к числу эндогенных факторов днсдифференцироЕКИ, т.е. к белкам-регуляторам специфической экспрессии генов. Это предположение подлежит дальнейшему изучению.

ВЫВОДЫ

. 1. Радиоактивно-иммунологическим методом показано, что не свойственные нормальной печени крыс гетероорганные НТВ-антигены почечной природы, выявляемые в гепатомах, печени крыс после однократного введения гепатоканцерогенов, а также в пролиферирующей печени проявляют феномен иммунологической идентичности с белковыми фракциями, элюируемыми 0.4-0.5 М NaCL при разделении на фосфоцеллюлозе вышеуказанных препаратов НТВ и КГБ из клеток почек интактных крыс...

2. Идентифицирован один из гетероорганных НГБ-антигенов почечной природы, ассоциированных с гепатомами. Им является фосфопротеинкиназа с мол. массой около 23 кДа -рр23.

3. Нсфракционированные и очищенные препараты НГБ из гепатом, печени крыс после однократного введения гепатоканцерогена, а также нормальных почек крыс, содержащие белок рр23, стимулировали пролиферативную активность покоящихся клеток Swiss, ЗТЗ. ' .

4. Белок рр23 способен вызывать появление на поверхности нормальных гепатоцитов мембранных- гетероорганных ан-

тигенов, ассоциированных с гепатомами.

5. Способность белка рр23 вызывать синтез вышеуказанных мембранных антигенов, а такие способность стимулировать пролиферацию указывают на принадлежность рр23 к группе эндогенных факторов, влияющих на состояние дифференцировки и уровень генной активности.

6. Получены иоиоклональные антитела к узкой фракции НГБ хрй.матина клеток почек нормальных крыс. Эти антитела связываются с фосфопротеинкиназой рр23. С их помощью в реакции непрямой иммунофлуоресценции зарегистрировано специфическое точечное свечение во внутренней области ядер клеток крысиной гепатомы 27, указывающее на исключительно ядерную локализацию белка рр23. В метках нормальных гена-тоцитов такое свечение не обнаружено.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. В.П.Кушнер, А.В.Грандилевская, В.А.Иванов, В.Я.Фель. Некоторые колекулярно-функщганальные характеристики ассоциированных с гепатомами крыс гетероорганных антигенов почечной . природы в составе негистоновых белков хроматина. IX Всесоюзный симпозиум "Структура и функции клеточного ядра " Черноголовка 1987, с. 167.

2. В.П.Кушнер, . А.В.Грандилевская, В.А.Иванов, В.Я.Фель. Радиометрическое выявление невизуализируемых преципитатов, образуекгых ассоциированными с гепатомами гетеро-органными антигенами почечной природы Р-фосфорилированных фракций негистоновых белков хроматина// Цитология. -1988. -т. 30. -С. 53-57.

3. В.П.Кушнер, В.А.Нванов, А.В.Грандилевская, А.А.Климова, В.Я.Фель. Гетероорганные антигены негистоновых хро-мосомаль'ных белков - эндогенные факторы дисдифференцировки клеток// Цитология.-1988.- т.30.-С.1135-1136.

4. В.П.Кушнер, А.В.Грандилевская, В.Я.Фель. Молекулярные массы, ассоциированных с гепатомами крыс гетероорганных НГБ-антигенов почечной природы// Цитология.-1988.- т.30.-С.

1226-1231.

5. Р.С.Баркан, А.Б.Грандилевская^ В.П.Кушнер,

B.Я.Фель. Стимуляция пролиферативной активности при введении в культуру покоящихся клеток айББ ЗТЗ хромосомных не-гистоновых белков и некоторых их мономолекулярных фракций// Цитология.-1989.-т.31.-С.1093.

6. В.А.Иванов, Л.Ю.Федоров, А.Б.Грандилевская, А.А.Климова, В.П.Кушнер, В.Я.Фель. Экспрессия ассоциированных с гепатомачи мембранных гетеросрганных почечных антигенов в первичной культуре гепатсцитов крыс под влиянием не-гистоиовых белков хроматина поче;с, гепатом или печени кркс после инъекции гепатоканцерсгепа // Цитология.-1989.-т.31.-

C.1102.

7. В.А.Иванов, Л.Ю.Федоров, А.Б.Грандилевская,

A.А.Климова,5 В.П.Кушнер, .В.Я.Фель. Влияние препаратов не-гистоновых белков хроматина на экспрессия мембранных гете-роорганных антигенов почечной природы в первичной культуре гепатоцитов кркс // Цитология.-1589.-т.32.-С.291-294.

. 8. Р.С.Баркан, А.Б.Грандилевская, В.П.Кушнер,

B.Я.Фель. Ст1!муляция синтеза ДНК в покоящихся клетках Згпбэ ЗТЗ негистоновыми хромосомальными белками // Цитология.-1990.-т. 32.-С. 524-527.

9. В.А.Иванов, Л.Ю.Федоров, А.Б.Грандилевская,

A.А.Климова, В.П.Кушнер, В.Я.Фель. Экспрессия гетероорган-ных антигенов почечной природы на поверхности культивируемых гепатоцитов крыс под влиянием узких фракций хромосо-мальных ■ негистоновых белков // Цитология.-1992.-т.34.-

C.80-83.

10. В.П.Кушнер, А .-А. Климова, А. Б. Грачдилевская, Л.Ю.Федоров, В.А.Иванов. Индукция синтеза мембранных гете-роорганных антигенов почечной природы в культуре гепатоцитов крыс с помощью идентифицированных'фракций негистоновых белков хроматина // Цитология.-1992.-т.34.-С.76-77.

11. А.Б.Грандилевская, Д.Г.Полынцев, В.П.Кушнер,

B.А.Иванов. Получение' монсклональных антител к негистоно-вым белкам хроматина почек крыс, ассоциированным с гепато-мами// Цитология.-1993.-т.35.-С.57-61.

12. А.Б.Грандилевская, Д.Г.Полынцев, В.П.Кушнер, В.А.Иванов. Моноклональные антитела к негистоновым хромосомным белкам почек крыс» ассоциированным с гепатомами// Цитология. -1993.-т.35.-С.