Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Антигенная дивергенция опухолевых клеток как проявление нарушения цитодифференцировки при канцерогенезе
ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология
Автореферат диссертации по теме "Антигенная дивергенция опухолевых клеток как проявление нарушения цитодифференцировки при канцерогенезе"
РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ ЦИТОЛОГИИ
На правах рукописи
■ £ УДК 575.21:576.3:616-006
/ 6 [ДОЛ 1338
ИВАНОВ Вадим Александрович
АНТИГЕННАЯ ДИВЕРГЕНЦИЯ ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТОК КАК ПРОЯВЛЕНИЕ НАРУШЕНИЯ ЦИТОДИФФЕРЕНЦИРОВКИ ПРИ КАНЦЕРОГЕНЕЗЕ
03.00.25 - клеточная биология
ДИССЕРТАЦИЯ (в форме научного доклада) на соискание ученой степени доктора биологических наук
Санкт-Петербург 1998
Работа выполнена в Институте цитологии РАН, Санкт-Петербург
Официальные оппоненты:
доктор медицинских наук, профессор В.Б. ОКУЛОВ, НИИ онкологии им. проф. H.H. Петрова МЗ РФ, С.-Петербург доктор медицинских наук, профессор П.Г. НАЗАРОВ, НИИ экспериментальной медицины РАМН, С.-Петербург доктор биологических наук, профессор В.И. ВОРОБЬЕВ, Институт цитологии РАН, С.-Петербург
Ведущее учреждение: Онкологический научный центр РАМН,
Москва
Защита состоится «3» 1998 г. в «7-?» часов
на заседании Диссертационного совета Д.002.73.01 Института цитологии РАН по адресу: 194064, С.-Петербург, Тихорецкий пр., 4
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии РАН
Диссертация (в форме доклада) разослана « /» 1998 г.
Ученый секретарь Диссертационного совета доктор биологических наук ПИСАРЕВА
Общая характеристика работы
Актуальность проблемы. Проблема неопластической трансформации клеток является одной из основных проблем современной биологии и медицины. В этом направлении накоплен значительный экспериментальный материал, однако обилие важных сведений о канцерогенезе до сих пор еще не оформилось в единое, приемлемое для большинства специалистов теоретическое обобщение (Киселев, 1986). Такое положение объясняется прежде всего сложностью феномена малигнизации, недостаточной изученностью связанных с ним фундаментальных биологических процессов роста, пролиферации и диффе-ренцировки клеток.
Многолетние исследования причин возникновения злокачественных новообразований привели в настоящий момент к утверждению полиэтиологической теории возникновения опухолей и многостадийности этого процесса. Среди факторов, способных индуцировать неоплазмы, можно перечислить следующие: инородные тела - полимерный канцерогенез (Turner, 1941; Елисеев, Плисс, 1977; Можесс, 1981; 1986; Murhy, 1984, и др.), вирусы - вирусный канцерогенез (Зильбер, 1958; 1960; 1968; Зильбер и Абелев, 1962; Neinberg, 1980; Bernard et al., 1985, и др.), рентгеновское излучение - радиационный канцерогенез (Владимиров и др., 1972; Greenstock, 1984; Brasso-Ricci, 1985. и др.), химические агенты - химический канцерогенез (Bemblum, 1941; 1949; 1981; Коростелева, 1964; 1965; 1966; Рапопорт, 1970; Абелев, 1974; Оленов, 1977; Heidelberger, 1979, и др.).
В лаборатории цитологии опухолевого роста Института цитологии РАН на протяжении многих лет проводятся всесторонние исследования химического канцерогенеза. Такие исследования не теряют своей актуальности, поскольку механизмы химического канцерогенеза остаются не раскрытыми. При канцерогенезе происходит значительное нарушение нормального хода цитодифференцировки, что, естественно, находит свое выражение в нарушении биосинтетических процессов, в частности, в изменении антигенного состава трансформированных клеток. Антигенный состав той или иной разновидности соматических клеток весьма сложен и сохраняется неизменным на протяжении многих клеточных поколений, являясь стабильным признаком соответствующего клона клеток. Поэтому при изучении нарушений процесса цитодифференцировки в результате малигнизации необходимо проследить, как происходят изменения синтеза различных групп нормальных клеточных антигенов. Очевидно, что для того, чтобы составить представление о характере этих изменений, важно знать набор нормальных клеточных антигенов и параметры их синтеза на разных этапах канце-
рогенеза, чтобы соотнести эти данные с данными, полученными при исследовании формирующейся или уже сформировавшейся опухоли. Особое значение приобретает исследование ранних сроков канцерогенеза, поскольку известно, что наиболее существенные события, определяющие судьбу опухолевого процесса и организма, в котором он возник, происходят 8 значительной мере в ранние сроки после неопластической трансформации клеток. В процесс злокачественного превращения клеток могут быть вовлечены различные группы нормальных клеточных антигенов, синтез которых претерпевает при этом различные изменения. Дэй (Day, 1965) классифицировал эти изменения следующим образом. 1. Антигенное «упрощение» опухолевых клеток - утрата или значительное снижение синтеза некоторых нормальных клеточных антигенов (Weiler, 1952; 1956; 1959; Абелев и др., 1959). 2. Антигенная реверсия - реставрация опухолевыми клетками синтеза эм-бриоспецифических антигенов, свойственных нормальным исходным тканям в эмбриональный период их развития и отсутствующих в дефинитивных тканях (Hirschfeld, Halber, 1932; Maculla, 1947; Вязов, 1956; Абелев и др., 1963; Gold, Freedman, 1965, и др.). 3. Антигенная дивергенция - изменение антигенного состава опухоли, при котором в последней обнаруживаются антигены, свойственные нормальным тканям, негомологичным опухоли (Day, 1965; Фель, Иванов, 1965). Указанные изменения антигенного состава являются разными сторонами одного и того же процесса малигнизации клеток. Как видно из самих формулировок, антигенная реверсия и антигенная дивергенция в отличие от антигенного упрощения могут быть расценены как своеобразное антигенное усложнение, осуществляемое за счет тех или иных клеточных антигенов, входящих в «репертуар» нормального генома. Перечисленные изменения антигенного состава являются наиболее типичными проявлениями нарушения цитодифференцировки при малигнизации и, если первые два - антигенное «упрощение» и антигенная реверсия - достаточно полно исследованы, то феномен антигенной дивергенции опухолевых клеток изучен крайне недостаточно и по существу еще не осмыслен. Исследования в этом направлении чаще всего ограничиваются поисками опухолеассоциированных антигенов и выделением их из опухолевых клеток для использования в практических целях. В то же время изучению этого явления в более широком биологическом плане с целью использования полученных результатов для выяснения молекулярных и клеточных механизмов канцерогенеза, задающих направление нарушений дифференцировки малигнизирован-ных клеток, в научной литературе, к сожалению, почти не уделяется внимания.
В связи с тем, что было сказано выше, основная цель настоящей работы заключалась в исследовании антигенной дивергенции опухоле-
вых клеток, обусловленной экспрессией гетероорганных антигенов. Таким термином мы предложили обозначать антигены опухолевых клеток, присущие дефинитивным тканям, негомологичным исследуемой опухоли, содержание которых в опухоли повышено по сравнению с исходной нормальной тканью. В работе не только уделено внимание феноменологическому подходу при изучении антигенной дивергенции опухолевых клеток, но и предпринята попытка выяснить некоторые клеточные и молекулярные механизмы этого феномена.
Конкретные задачи работы.
1. Получить специфические иммуносыворотки к исследуемым антигенам.
2. С помощью полученных иммуносывороток при использовании иммунологических и биохимических методов исследования провести сравнительное изучение антигенного спектра нормальных тканей и опухолей различного гистогенеза и на разных стадиях опухолевой прогрессии.
3. Изучить гетероорганные антигены в различных компартментах клетки: в цитоплазме, в клеточных мембранах и в составе ядерных не-гистоновых белков хроматина. Для этого экспрессию гетероорганных антигенов определить в эмбриональных и дефинитивных тканых крыс, в условиях нормальной пролиферации клеток (костный мозг, кишечник, культура клеток), при репарации органа (процессы в регенерирующей печени после операции частичной гепатэктомии), при действии на животных канцерогенов и в уже сформировавшихся опухолях.
4. Изучить гетероорганные антигены при однократном воздействии на животных канцерогенов и их неканцерогенных структурных аналогов. Выяснить сроки появления гетероорганных антигенов, продолжительность синтеза и локализацию их в клетках.
5. Получить количественную характеристику синтеза гетероорганных антигенов.
6. Выделить отдельные гетероорганные антигены в очищенном виде, идентифицировать их и выявить их функциональное значение.
Научная новизна работы. 1. Впервые предложен термин «гетероорганные антигены» для обозначения группы клеточных антигенов, обнаруженных в опухолях, входящих в «репертуар» нормального генома, синтез которых присущ нормальным тканям негомологичным опухоли. Дана развернутая характеристика антигенной дивергенции опухолевых клеток, осуществляемой за счет гетероорганных антигенов, - как отмечалось выше, одного из наиболее характерных проявлений нарушения цитодифференцировки при неопластической трансформации клеток. В работе обобщен обширный оригинальный и по ряду позиций приоритетный экспериментальный материал.
2. Впервые показано, что в качестве гетероорганных антигенов могут выступать органоспецифические антигены, определяющие специфику отдельных органов и тканей животных данного вида и являющиеся своего рода «маркерами» дифференцированного состояния тканей.
3. Впервые показано, что гетероорганные опухолеассоциированные антигены одной тканевой принадлежности (почечные) могут быть выявлены в различных компартментах клетки (в цитоплазме, на наружных мембранах клетки и в составе ядерных негистоновых белков хроматина). Предложена гипотеза, согласно которой первоначальные изменения происходят в ядерных НГБ хроматина, которые как известно, участвуют в процессе транскрипции, что, вероятно, влечет за собой изменения антигенных свойств в других клеточных структурах.
4. Впервые показано, что гетероорганные антигены выявляются в определенных случаях и в неопухолевых тканях, клетки которых энергично пролиферируют - в регенерирующей печени крыс после операции частичной гепатэктомии и в печени вслед за воздействием на животных гепатоканцерогенов. При этом установлено, что гетероорган: ные антигены обнаруживаются в тканях-мишенях достаточно рано, уже через сутки после канцерогенного воздействия или операции частичной гепатэктомии; определены сроки синтеза исследованных гетероорганных антигенов: водно-растворимых, мембранных и в составе ядерных НГБ хроматина и обратимый характер их синтеза при однократном воздействии канцерогенов, что связано, по всей вероятности, с обратимым изменением активности соответствующих генов.
5. Впервые удалось выделить среди мембранных органоспецифиче-ских антигенов почек крыс ассоциированный с гепатомами мембранный гетероорганный антиген почечной природы с мол. массой около 50 кДа, обозначенный нами как МА-50. Также впервые выделен и охарактеризован гетероорганный НГБ-антиген почечной природы. Оказалось, что этот антиген обладает собственной фосфопротеинкиназной активностью и мол. массой 23 кДа. Этот антиген обозначен нами как рр23. Предложена гипотеза, согласно которой выявление мембранных и ядерных гетероорганных антигенов одного тканевого происхождения -не случайное совпадение, что в основе феномена лежат причинно-следственные связи. Предложен оригинальный подход при исследовании индукции мембранных гетероорганных антигенов в первичной культуре изолированных гепатоцитов интактных взрослых крыс под влиянием мономолекулярных фракций НГБ и, в частности, рр23. Кроме того показано, что рр23 влияет на пролиферацию покоящихся клеток в культуре. Результаты экспериментов позволяют допустить, что обнаруженный нами белок рр23 может выступать в качестве одного из эндогенных факторов регуляции экспрессии генов, задающего направле-
ние дисдифференцировки неопластически трансформированных клеток и влияющего на пролиферацию клеток.
Научно-практическое значение работы. Результаты работы важны прежде всего для понимания процессов неопластической трансформации клеток и выявления тех молекулярно-клеточных механизмов, которые при этом задействованы. Изучение антигенной дивергенции, обусловленной появлением в опухолевых клетках антигенов, входящих в «репертуар» нормального генома и свидетельствующей о дисдифференцировке при неопластической трансформации клеток, явится важным звеном в построении общей теории злокачественного превращения клеток. Полученные результаты, возможно, помогут дальнейшему развитию и использованию научно-обоснованных методов борьбы со злокачественными новообразованиями. В работе обсуждается значение исследования первичного действия химических канцерогенов как способа изучения общих механизмов канцерогенеза. Наиболее адекватные условия для изучения первичного действия химических канцерогенов могут быть созданы в экспериментах с однократным воздействием на животных канцерогенных веществ. В таких случаях взаимодействие канцерогена с компонентами клеток и влияние его на метаболистические процессы проявляются, так сказать, в первоначальном виде, при этом в клетках происходят изменения, характерные для уже сформировавшейся опухоли. Такой подход может быть использован и используется в экспериментальной работе. Гетероор-ганные антигены, появляющиеся в клетках сравнительно рано, спустя 1 сутки после канцерогенного воздействия, могут быть использованы в качестве маркеров дисдифференцировки и малигнизации клеток. Результаты работы вносят существенный вклад в понимание свойств отдельных негистоновых белков и их роли во внутриклеточных процессах. Полученные данные могут быть использованы для изучения механизмов регуляции экспрессии генов при дифференцировке и трансформации клеток.
Результаты работы включены в раздел о гетероорганных антигенах, входящий в главу об опухолевых антигенах учебника, предназна-ченнного для студентов медицинских вузов и широкого круга специалистов, утвержденный Министерством здравоохранения СССР (Р.В. Петров "Иммунология". изд. "Наука". Москва, 1982, 1987).
Предложен радиометрический метод для выявления невизуали-зируемых преципитатов в геле, который может быть использован при обнаружении очень малых концентраций антигена и используется в экспериментальной работе в Институте цитологии РАН, в Медицинской академии постдипломного образования и других научных учреждениях АН и АМН РФ.
Результаты работы включены в курс лекций по цитологии для студентов биолого-почвенного факультета СПбГУ.
Апробация работы. Работа суммирует результаты собственных исследований автора, выполненных в 1965 - 1996 гг. в лаборатории генетики опухолевых клеток (зав. лабораторией д.б.н., профессор Ю.М. Оленов) и в лаборатории цитологии опухолевого роста Института цитологии РАН (зав. лаб., д.б.н., профессор В.Я. Фель).
Материалы работы докладывались на VIII Конференции памяти A.A. Заварзина (Ленинград, 1965); на Конференциях Института цитологии РАН (1966, 1967, 1969, 1972); на Конференции специалистов г. Ленинграда по онкологии и иммунологии (Ленинград, 1968); на Съездах ВОГиС им. Н.И. Вавилова (1972, 1977, 1982); на Всесоюзном симпозиуме "Механизмы канцерогенеза" (Киев, 1972); на Всесоюзном симпозиуме "Механизмы канцерогенеза и действия противоопухолевых средств (Ленинград, 1974); на Всесоюзном симпозиуме "Иммунология опухолей" (Киев, 1975); на Международном симпозиуме "Молекулярная биология и биохимия раковой клетки" (Москва, 1975); на II Всесоюзном симпозиуме "Генетическая и биохимическая характеристика злокачественного превращения клеток" (Ленинград, 1976); на Советско-французском симпозиуме "Эмбриональные опухолевые антигены" (Москва, 1978); на Советско-американском симпозиуме "Иммунология опухолей" (Москва, 1979); на III Всесоюзном съезде онкологов (Ташкент, 1979); на Международном симпозиуме по онкобиологии и медицине (Таллин, 1980); на 6-ой Конференции биохимиков Прибалтийских республик, Белоруссии и Ленинграда (Рига, 1981); на I Всесоюзном симпозиуме "Генетические процессы в опухолевых клетках" (Ленинград, 1981); на Всесоюзном совещании "Клеточные и молекулярные механизмы канцерогенеза и антиканцерогенеза" (Ленинград, 1982); на II Всесоюзном симпозиуме "Стволовые клетки и опухолевый рост" (Киев, 1983); на Всесоюзном симпозиуме "Регуляторная роль мембран в процессах дифференцировки и пролиферации клеток" (Пущино, 1983); на Всесоюзном совещании "Актуальные вопросы клеточной биологии" (Ленинград, 1984); на Всесоюзном симпозиуме "Структура и функция клеточного ядра" (Пущино, 1984; Черноголовка, 1987; С.-Петербург, 1993); на VI Симпозиуме СССР - ФРГ "Структура и функция генома" (Ленинград, 1985); на II Европейском Конгрессе по клеточной биологии (Будапешт, 1986); на 1 Всесоюзном съезде иммунологов (Сочи, 1989); на Всесоюзном симпозиуме "Молекулярная и клеточная онкобиология" (Львов, 1990); на I Съезде иммунологов России (Новосибирск, 1992); на XVI Международном противораковом конгрессе (Нью-Дели, 1994); на Совещании "Биология клетки в культуре" (С.-Петербург, 1989, 1992, 1993, 1996).
Кроме того, результаты работы неоднократно докладывались на научном семинаре лаборатории генетики опухолевых клеток и лаборатории цитологии опухолевого роста и обсуждались на Научном собрании Института цитологии РАН.
Основные результаты работы и сделанные на их основе выводы изложены в общем виде в настоящем докладе.
Краткая характеристика объектов и методов исследования
Работа проведена в основном на белых крысах-самцах массой 150-180г (питомник Рапполово РАМН). Объектом исследований послужили 23 миогенные опухоли индуцированные 20-метилхолантреном (Бреслер, Григорьева, 1962; Бахтин, 1963): из них 6 первичноиндуциро-ванных и 17 перевивных опухолей; 28 гепатоцеллюлярных опухолей индуцированных с помощью Ы-нитрозодиэтиламина (Швембергер, 1963): из них 14 первичноиндуцированных и 14 перевивных; 12 опухолей почек индуцированных нитрозодиметиламином (Швембергер, Бахтин, 1965): из них 3 первичноиндуцированные и 9 перевивиных. Большая часть работы выполнена на гепатоцеллюлярных опухолях крыс. Для исследования первичного действия химических канцерогенов использованы те же гепатоканцерогены, которыми ранее были индуцированы уже "готовые" опухоли, и их неканцерогенные аналоги. Печень у крыс для исследования брали спустя 1-90 сут после однократного воздействия на животных канцерогена и его неканцерогенного аналога. Часть работы выполнена на культурах клеток нормальных и опухолевых тканей крыс, взятых для исследования в банке клеточных культур Института цитологии РАН.
В качестве антигенов были использованы водно-солевые экстракты опухолевых и нормальных тканей, препараты клеточных мембран и ядерных негистоновых белков хроматина. Исследование гете-роорганных антигенов проведено на криостатных срезах различных тканей, изолированных клетках печени (живых и фиксированных) и различных культивируемых нормальных и опухолевых клетках, а также переживающей культуре гепатоцитов крыс.
В работе использованы иммунодиффузионные и иммунофлуо-ресцентные методы исследования, метод иммуноферментного анализа и иммуноэлектрофорез, метод иммуноцитофлуорометрии и имму-ноблотинга. Разработан и применен радиометрический метод выявления невизуализируемых преципитатов в геле с помощью ^Р, определения фосфопротеинкиназной активности белков. В работе использовали ионообменную хроматографию и гельфильтрацию препаратов НГБ, различные модификации солюбилизации мембранных препара-
тов, операцию частичной гепатэктомии, модифицированную методику перфузии гепатоцитов крыс для культивирования.
Исследования были проведены с помощью большого набора различных иммуносывороток, полученных нами для решения поставленных задач: антиопухолевые и органоспецифические, против гомо-генатов тканей, препаратов клеточных мембран и комплексов ДНК-НГБ, моноспецифические иммуносыворотки к определенному белку и моноклональные антитела к рр23.
Более подробная характеристика объектов исследования, приготовление тканевых срезов и клеток, их фиксация и обработка различными иммуносыворотками, дозы введения животным канцерогенов и их структурных неканцерогенных аналогов, способы солюбилизации мембранных препаратов, схемы иммунизации кроликов и получение иммуносывороток и т.д. и т.п. даны в статьях, приведенных в списке литературы.
Исследование цитоплазматических гетероорганных антигенов
Антигенные перестройки, происходящие в клетках вследствие их неопластической трансформации, следует рассматривать как иммунологическое и биохимическое выражение событий, отражающих в сумме своей и последовательности характер и этапы нарушения цитодиффе-ренцировки исходных дефинитивных тканей. Следствием такого процесса является нарушение генетически детерминированной антигенной композиции клеток исходных тканей и становление новой, необычной антигенной композиции, определяющей фенотип малигнизирован-ных клеток. К этому приводят изменения в составе нормальных клеточных антигенов, т.е. тех антигенов, регуляция синтеза которых входит в компетенцию нормального генома.
Прежде всего необходимо отметить разнонаправленность изменений синтеза различных групп нормальных клеточных антигенов при малигнизации: снижение синтеза одних из них (антигенное упрощение) и, напротив, возобновление или усиление синтеза других нормальных антигенов, не обнаруживаемых или обнаруживаемых в ничтожно малых количествах в исходных дефинитивных клетках (антигенное усложнение). Оба эти процесса относятся к числу наиболее типичных и закономерных проявлений злокачественного превращения клеток и обнаружены в самых разнообразных по гистогенезу опухолях человека, а также в спонтанных и индуцированных различными способами опухолях животных.
Главными составляющими феномена антигенного усложнения опухолевых клеток, осуществляемого за счет нормальных клеточных антигенов, являются: антигенная реверсия - синтез различного рода
эмбриоспецифических антигенов (в том числе эмбриональных форм изозимов) и антигенная дивергенция - синтез дефинитивных антигенов, свойственных гетерологичным органам.
Ярким примером антигенной реверсии можно считать появление в опухолевых клетках различных групп эмбриоспецифических антигенов: альфа-фетопротеина (Абелев и др., 1963, Татаринов, 1964), рако-во-эмбрионального антигена (Gold, Freedman, 1965), эмбрионального сульфогликопротеина, щелочной фосфатазы Регана (Alexander, 1972; Fishman, 1973).
Феномен антигенной дивергенции впервые был охарактеризован Дэем (Day, 1965, 1966), который показал, что в клетках первичных ге-патом крыс происходит замещение антигенного профиля гомологичной печеночной ткани антигенным профилем других нормальных тканей -почек и селезенки. Это позволило Дэю сформулировать положение, согласно которому появление в опухоли антигенов, негомологичных исходной ткани, является одним из проявлений антигенной перестройки клеток в процессе малигнизации. Этот феномен был назван антигенной дивергенцией (antigenic diversion).
Независимо от Дэя, к сходным выводам пришли и мы в работах, опубликованных в то же время (Фель и др., 1965; Фель и др., 1966) и послуживших началом наших последующих многолетних исследований. Антигены, за счет которых осуществляется антигенная дивергенция, мы обозначили как гетероорганные антигены, т.е. антигены, присущие дефинитивным тканям, негомологичным опухоли, содержание которых в опухоли повышено по сравнению с гомологичной нормальной тканью.
Данные получены нами при изучении индуцированных и перевиваемых опухолей крыс: гепатом, индуцированных 4-диэтилнитрозамином (Швембергер, 1966а), опухолей почек, индуцированных N-диметилнитрозамином (Швембергер, 19666) и рабдомиосар-ком, полученных при имплантации крысам малигнизировавшихся в однослойных культурах фибробластов новорожденных крыс (Швембергер, Бахтин, 1965), а также перевиваемой асцитной гепатомы Зайдела, индуцированной 4-диметиламиноазобензолом (Зайдела, 1963). Проведенные исследования показали, что гетероорганные антигены могут быть обнаружены в различных клеточных структурах: в цитоплазме, на наружных мембранах и в составе хромосомных негисто-новых белков. Начнем с рассмотрения исследований цитоплазматиче-ских гетероорганных антигенов. В качестве таковых изучали по преимуществу растворимые белки, экстрагируемые из клеток раствором 0,14 М NaCI. Для обнаружения в их составе гетероорганных антигенов методами иммунодиффузии использовали два подхода: прямой - с использованием органоспецифических иммуносывороток и инверсный - с
помощью соответствующих противоопухолевых иммуносывороток (Фель, Иванов и др., 1966а; Фель, Иванов и др., 19666, Фель и др., 1966в,г). В последнем случае применялась реакция специфической задержки преципитации в агаре: антиопухолевые сыворотки непосредственно на стекле истощали в отношении антигенов водно-солевых экстрактов гомологичных нормальных тканей, после чего тестировали экстрактами негомологичных тканей. При этом определяли минимальную концентрацию экстракта, использование которой для истощения антиопухолевой сыворотки приводило к нейтрализации антител в отношении тест-антигенов и вследствие этого к отрицательному результату в реакции преципитации. Минимальная концентрация экстракта ткани, негомологичной опухоли, была принята за 100 %, поскольку по этой концентрации можно судить о реальном содержании антител к исследуемым гетероорганным антигенам. В соответствии с этим было рассчитано (в процентах) содержание гетероорганных антигенов в опухолях и нормальных исходных тканях.
Рассмотрим результаты опытов с использованием антиопухолевых сывороток, приведенные в табл. 1, 2, 3. Как видно из результатов, представленных в таблицах, в экстрактах всех изученных нами опухолей по сравнению с экстрактами нормальных исходных тканей содержание гетероорганных антигенов увеличено в 2 - 8 раз. Следует отметить, что в экстрактах миогенных опухолей содержание 3 из 4 изученных гетероорганных антигенов возросло в 8 раз, в то время как в экстрактах опухолей почек и печени не более, чем в 3 раза.
Необходимо отметить и тот факт, что в экстрактах тканей новорожденных животных содержание гетероорганных антигенов, как правило, выше, нежели в экстрактах тех же тканей взрослых животных, хотя и не достигало опухолевого уровня. Интересно, что чем больше различие в содержании гетероорганных антигенов в тканях взрослых и новорожденных животных, тем больше это различие между опухолевой тканью и тканью взрослых животных. Указанная корреляция, очевидно, не случайна - она в известной мере отражает амплитуду колебаний в содержании гетероорганных антигенов в эмбриональной, дефинитивной и опухолевой ткани. При этом речь идет не только о некоторых общих чертах антигенной характеристики эмбриональных и опухолевых клеток, но прежде всего о весьма сходных механизмах антигенной перестройки. Нельзя, однако, признать, что подобного рода корреляция имела место во всех случаях: так, содержание мышечных антигенов в экстрактах почечных тканей новорожденных крыс оказалось в 4 раза ниже по сравнению с экстрактами почечной ткани взрослых крыс (табл. 2), а в экстрактах печеночной ткани от взрослых и новорожденных крыс различия в содержании почечных и легочных гетероорганных антигенов обнаружить не удалось (табл. 3).
Таблица 1
Сравнительное содержание гетероорганных антигенов в водно-солевых экстрактах миогенных опухолей крыс
"ест-аитигены Минимальная
органов Экстракты для истощения концентрация Содержание
зрослых крыс сыворотки против миогенных экстракта, ней- гетероорганных
концентрация опухолей трализующая антигенов
5 мг/мл) антитела к тест- (в %)
антигенам
(в мг/мл)
Печень Миогенная опухоль 2.5 100
Мышечная ткань взрослых крыс 20.0 12.5
Мышечная ткань новорожден- 5.0 50
ных
Печень взрослых крыс 2.5 100
Почки Миогенная опухоль 8.0 31.2
Мышечная ткань взрослых крыс >20.0 <12.5
Мышечная ткань новорожден- 5.0 50
ных
Почки взрослых крыс 2.0 100
Селезенка Миогенная опухоль 2.5 40
Мышечная ткань взрослых крыс 20.0 5
Мышечная ткань новорожден- 5.0 20
ных
Селезенка взрослых крыс 1.0 100
Легкие Миогенная опухоль 2.5 100
Мышечная ткань взрослых крыс 20.0 12.5
Мышечная ткань новорожден- 5.0 50
ных
Легкие взрослых крыс 2.5 100
Таблица 2
Сравнительное содержание гетероорганных антигенов в водно-солевых экстрактах опухолей почек крыс
Минимальная
Тест-антигены Экстракты для истощения концентрация Содержание
органов взрослых сыворотки против экстракта,ней- гетероорган-
крыс (концентра- опухолей почек трализующего ных антиге-
ция 5 мг/мл) антитела к нов (в %)
тест-антигенам
(в мг/мл)
Печень Опухоль почек 12,5 80
Почки взрослых крыс 30.0 33.3
Почки новорожденных >15.0 <66.6
крыс
Печень взрослых крыс 10.0 100
Селезенка Опухоль почек 12.5 40
Почки взрослых крыс >30.0 <16.6
Почки новорожденных >15.0 <33.3
крыс
Селезенка взрослых крыс 5.0 100
Легкие Опухоль почек 7.5 66.6
Почки взрослых крыс >30.0 <16.6
Почки новорожденных 15.0 33.3
крыс
Легкие взрослых крыс 5.0 100
Мышечная Опухоль почек 2.5 40
ткань Почки взрослых крыс 2.5 40
Почки новорожденных 10.0 10
крыс
Мышечная ткань взрослых 1.0 100
крыс
Таблица 3
Сравнительное содержание гетероантигенов в водно-солевых экстрактах опухолей печени крыс
Содержание
Тест- Минимальная гетероантигенов
антигены концентрация по отношению
органов Экстракты для истощения экстракта, к ткани,
взрослых сыворотки нейтрализующего для которой
крыс против опухолей печени антитела к тест- синтез этих анти-
(концен- антигенам генов является
трация (в мг/мл) характерным
5 мг/мл) (в%)
Почки Опухоль печени 5.0 100
Печень взрослых крыс 10.0 50
Печень новорожденных 10.0 50
крыс
Почки взрслых крыс 5.0 100
Селезенка Опухоль печени 5.0 50
Печень взрослых крыс 5.0 16.6
Печень новорожденных 7.5 33.3
крыс
Селезенка взрослых крыс 2.5 100
Легкие Опухоль печени 5.0 50
Печень взрослых крыс >5.0 <16.6
Печень новорожденных >5.0 <16.6
крыс
Легкие взрослых крыс 2.5 100
Эти примеры свидетельствуют, на наш взгляд, о том, что помимо ряда общих черт, процессы дифференцировки различных тканей имеют также свои, присущие только данной ткани особенности.
Было также показано, что миогенные опухоли по содержанию легочных и печеночных антигенов, а гепатоцеллюлярные опухоли по содержанию почечных гетероорганных антигенов оказались максимально сходными с теми негомологичными опухолям органами, для которых синтез указанных антигенов наиболее характерен (табл. 1,3). Значение этих изменений не следует переоценивать, т.к. в общем балансе тканевых антигенов удельный вес их не слишком значителен, но они несомненно являются выражением тех элементарных процессов,
из которых складывается процесс дисдифференцировки клеток, что находит в конечном счете свое выражение в морфологических различиях опухолевой и нормальной ткани.
В опытах с антиопухолевыми иммуносыворотками были получены результаты, косвенно свидетельствующие об увеличении содержания гетероорганных антигенов в опухолях, а прямые доказательства были получены при тестировании опухолевых экстрактов с помощью органоспецифических иммуносывороток, гомологичных гетероорган-ным антигенам. При этом в ряде случаев удалось установить не только сам факт наличия в исследуемых опухолях гетероорганных антигенов, но и идентифицировать их с органоспецифическими антигенами. Так, в экстрактах некоторых гепатом были обнаружены органоспецифические антигены почек (у 15 из 27) и скелетных мышц (у 3 из 21), а в экстрактах аденокарциномы почек (у 2 из 12) - скелетных мышц. В табл. 4 представлены результаты реакции преципитации органоспецифиче-ской антимышечной сыворотки с экстрактами мышечной ткани, почек и аденокарциномы почек крыс.
Таблица 4
Реакция преципитации органоспецифической антимышечной сыворотки с экстрактами мышечной ткани, почек и аденокарциномы
почек крыс
Тест-экстракты Доза тест-экстрактов (в мг/мл)
15.0 7.5 3.75 1.9 1.0 0.5 0.25
Мышечная ткань взрослых ++ ++ ++ ++ +
крыс Аденокарцинома почек крыс 12* + + - - - -
Почки взрослых крыс - - - - - - -
Почки новорожденных крыс - - - - - - -
Примечание. (+) - выявляемые полосы преципитации в РПА; (-) - отсутствие реакции.
Сыворотка проявляет один органоспецифический антиген в экстракте мышечной ткани взрослых крыс, взятом для тестирования в концентрации 0,5 мг/мл; в опытах с перевивной аденокарциномой почки подобный результат мог быть получен при тестировании экстракта
этой опухоли, взятого в концентрации не менее 3,75 мг/мл, т.е. в 7,5 раз больше по сравнению с мышечной тканью. В экстрактах почечной ткани от взрослых и новорожденных крыс органоспецифический антиген мышечной ткани обнаружить не удалось. Эти данные не находятся в противоречии с данными, полученными с помощью антиопухолевых сывороток, т.к. способ приготовления органоспецифических иммуносы-вороток предусматривает массивное их истощение тканями негомологичных органов, в том числе и почек.
Поэтому данные, приведенные в табл. 4, относятся лишь к антигенам, преимущественно синтезируемым в мышечной ткани (органоспецифическим в строгом смысле) или синтезируемым в значительно большем количестве по сравнению с почечной тканью. В этой связи нам представляется, что результат опытов с антиопухолевыми сыворотками в силу особенностей их приготовления (истощение только в отношении сывороточных белков интактных крыс) воссоздают более полную картину антигенной перестройки в процессе малигнизации.
Перейдем теперь к вопросу об идентичности гетероорганных антигенов в опухолях одинакового и различного гистогенеза. Учитывая вполне понятные трудности такого анализа с помощью антиопухолевых сывороток, мы ограничили свою задачу исследованием преимущественно органоспецифических антигенов.
С помощью антипочечной органоспецифической сыворотки в 15 экстрактах из 27 изученных гепатоцеллюлярных опухолей (сюда входили первичные и перевивные гепатомы) было выявлено по одному органоспецифическому антигену почек. 10 из 15 таких экстрактов (7 первичных и 3 перевивных гепатомы) были в различных сочетаниях на одном стекле тестированы в реакции преципитации с целью выявления феномена антигенной идентичности (табл. 5). При этом были изучены не все возможные варианты сочетаний (23 из 45), но во всех тех случаях, где сопоставление удалось провести, получен положительный результат, свидетельствующий о синтезе клетками гепатоцеллюлярных опухолей одного и того же почечного гетероорганного антигена.
С помощью антимышечной органоспецифической сыворотки в экстрактах 2 перевивных опухолей почек (из 12 исследованных) были обнаружены мышечные гетероорганные антигены: в опухоли 124 один антиген и в опухоли 123 два гетероорганных антигена, причем один из них оказался общим и для опухоли 124. Мышечные гетероорганные антигены были обнаружены в двух первичных гепатомах (16 и 17). Благодаря этому мы смогли сопоставить различные по своему гистогенезу группы опухолей. Оказалось, что гепатома 16 и аденокарцинома почек 123 обладают одним и тем же мышечным гетероорганным антигеном, другой общий антиген был обнаружен в гепатоме 17 и аденокарциноме 124.
Таблица 5
Исследование идентичности гетероорганных антигенов гепатом крыс с помощью органоспецифической антипочечной сыворотки
NN сравниваемых NN сравниваемых гепатом
гепатом 4 9 12 13 15 16 19 15 15 15
4 + +
9 + + + + + +
12 + + + + +
13 +
15 + + +
16 + +
19 + +
151 +
154 +
15е
Следовательно, происходящая в процессе малигнизации антигенная перестройка клеток может иметь некоторое сходство не только среди опухолей одного и того же гистогенеза, но, как показали опыты с растворимыми гетероорганными антигенами, и среди опухолей различного гистогенеза. Надо сказать, что во многом сходные сведения о растворимых гетероорганных антигенах опухолей мышей и крыс можно было встретить и в работах других авторов (Jurand, Hiramoto, 1966; Baldwin, 1967; Satoh, 1972).
Рассмотренная картина антигенных перестроек относится к уже сформировавшимся опухолям, достаточно далеко продвинутым по пути прогрессии. Однако, важно выяснить как эта картина складывалась на ранних этапах канцерогенеза, когда наследуемость тех или иных признаков антигенной перестройки не стала еще очевидной. Что касается изучения феномена антигенной дивергенции на ранних этапах канцерогенеза, то оно, насколько можно судить по литературе, еще не проводилось, хотя подобного рода изменения синтеза нормальных клеточных антигенов все же могут иметь место, на что косвенно указывают данные биохимических исследований (Taniguchi е.а., 1974; Fiala, Fiala 1973).
Для объективной оценки антигенных перестроек в ткани-мишени на ранних сроках после канцерогенного воздействия важно знать в какой мере эти перестройки соответствуют антигенным характеристикам клеток опухолей, возникающих в тех же тканях под влиянием того же канцерогенного агента. С этой целью нами было проведено сравнительное иммунологическое исследование печени крыс после однократного воздействия 4-диметиламиноазобензола (ДАВ) и его неканцерогенного аналога - 4-диэтиламиноазобензола (ДЭАБ), а также клеток перевиваемой на крысах асцитной гепатомы Зайдела, индуцированной в свое время ДАБ (Зайдела, 1963).
Объектом исследования послужили органоспецифические печеночные антигены и гетероорганные антигены, вовлекаемые соответственно в процессы антигенного упрощения и антигенной дивергенции.
Рассмотрим сначала данные, касающиеся органоспецифических печеночных антигенов (Иванов и др., 1977, 1979, 1982). Опыты проводили на беспородных белых крысах-самцах массой 150 - 180 г. Канцерогенное вещество ДАБ и его неканцерогенный аналог ДЭАБ растворяли в смеси бензола с подсолнечным маслом и вводили внутрибрю-шинно из расчета 250 мг/кг массы животного (Ketterer е.а., 1967). Печень для исследования брали у животных спустя 1, 4, 11, 18, 21, 25, 30 и 40 сут после введения канцерогена и его неканцерогенного аналога; на каждый срок при этом приходилось не менее 4-5 крыс. Тест-объектами служили экстракты тканей печени крыс, обработанных указанным выше образом, печени интактных крыс и клеток асцитной гепатомы Зайдела. Экстрагирование проводилось 0,14 М раствором NaCI. В работе использовали иммуносыворотки против органоспецифических антигенов печени; способ их приготовления описан в работе Фель и др. 1966а. Исследование водно-растворимых антигенов проводили с помощью иммунодиффузионных методов: реакции преципитации в агаре (РПА) и ее специфической задержки в микромодификации на предметном стекле.
С помощью органоспецифической антипеченочной сыворотки в экстрактах печени крыс удавалось определить не менее 6 органоспецифических печеночных антигенов. При тестировании в тех же условиях аналогично приготовленных экстрактов клеток гепатомы Зайдела органоспецифические печеночные антигены не были выявлены. Совершенно очевидно, что в клетках гепатомы Зайдела синтез органоспецифических антигенов снижен, и это в целом соответствует сведениям о гепатоцеллюлярных опухолях, индуцированных с помощью других канцерогенных агентов (Фель и др., 1966а).
Тестирование антипеченочной органоспецифической иммуносы-вороткой экстрактов печени крыс, взятой у животных на 1 - 4-е сутки после действия ДАБ, выявляло не более 2-3 антигенов. Такой резуль-
щим использование противоопухолевой иммуносыворотки, конкретно -иммуносыворотки против клеток асцитной гепатомы Зайдела, что позволило сравнить антигенный состав печени крыс, получавших гепато-канцероген ДАБ или его неканцерогенный аналог ДЭАБ, с антигенным составом "готовой" гепатоцеллюлярной опухоли, индуцированной тем же канцерогеном. Антигепатомную сыворотку получали путем иммунизации кроликов гомогенатом опухолевых клеток с последующим ее истощением в отношении сывороточных антигенов интактных крыс (Иванов и др., 1968). Тест-объектами служили водно-растворимые антигены клеток гепатомы Зайдела и ряда органов (печени, селезенки, легких, почки) интактных крыс, а также печени крыс спустя 1, 4, 11, 18, 21, 25, 30, 40 сут после однократного воздействия ДАБ или ДЭАБ. Тестирование экстрактов проводили с помощью реакции специфической задержки преципитации в агаре. При этом антигепатомную сыворотку истощали непосредственно на стекле экстрактом печени интактных крыс, после чего тестировали с экстрактами гепатомы, гетерологичных органов интактных крыс, а также печени крыс, получавших ДАБ или ДЭАБ.
После нейтрализации антител против печеночных антигенов ан-тигепатомная сыворотка не давала реакции с экстрактом печени интактных крыс, но продолжала реагировать с экстрактом гепатомы, образуя 3-4 полосы преципитации и с экстрактами гетерологичных органов, образуя с экстрактами селезенки и почки по одной полосе преципитации, а с экстрактом легких - даже 2 полосы (табл. 6). В тех же условиях эксперимента тест-экстракты печени крыс, взятые в опыт в разные сроки после воздействия ДЭАБ, не давали положительной реакции с антигепатомной иммуносывороткой, так же как и экстракты печени интактных крыс.
Иную картину наблюдали при тестировании экстрактов печени крыс, взятых для исследования после однократного воздействия ДАБ. В этом случае антигепатомная иммуносыворотка проявляла одну полосу преципитации с экстрактом печени, взятой через 1 сут после аппликации канцерогена. Оказалось, что указанная полоса преципитации дает феномен идентичности с одной из полос, которую иммуносыворотка образует с экстрактом гепатомы и, кроме того, с полосой преципитации, проявленной при тестировании экстрактов селезенки или легких.
Эти данные могут служить несомненным свидетельством идентичности выявляемых посредством антигепатомной сыворотки антигенов гепатомы Зайдела и печени "канцерогенных" крыс, а также селезенки и легких интактных крыс. Иначе говоря, речь идет об обнаружении в печени "канцерогенных" крыс в 1-е сутки после воздействия ДАБ
гетероорганных антигенов селезеночного и легочного происхождения, свойственных вызванной тем же канцерогеном опухоли.
Таблица 6
Результат реакции преципитации в агаре экстрактов гепатомы Зайдела, органов интактных крыс и печени крыс после однократного воздейстия ДАБ и ДЭАБ (мг/кг) с антигепатомной иммуносывороткой, истощенной экстрактом печени интактных крыс
тест-экстракты
селе-
почки зенка легкие печень печень крыс в разные сроки
Воздей- гепа- интакт- интакт- интакт- интакт- после воздействия, сут
ствие на тома ных ных ных ных
крыс крыс крыс крыс крыс
1 4 11 18 21 30 40
Контроль +++ + + ++ -
ДАБ
250 + + + + - - -
125 + ± - - - - -
50 +
ДЭАБ
250
500
1250
Аналогичные результаты были зафиксированы и при исследовании экстрактов "канцерогенной" печени, взятой в опыт на 4,11 и 18-е сутки после воздействия ДАБ. Тестирование экстрактов "канцерогенной" печени, взятой через 21 30, 40 сут исследования уже не давало положительной реакции, т.е. результаты не отличались от результатов тестирования печени интактных животных. При использовании сниженных доз ДАБ (125 и 50 мг/кг) также удавалось зарегистрировать появление гетероорганных антигенов, однако сроки их выявления оказались существенно укороченными (1-4 сут). Что же касается действия неканцерогенного аналога - ДЭАБ, то обработка животных увеличенными в 2 и 5 раз дозами этого вещества не приводила к появлению растворимых гетероорганных антигенов подобно тому, как было показано и при использовании дозы ДЭАБ, эквимолярной по отношению к обычной дозе ДАБ (250 мг/кг).
Важно подчеркнуть, что весьма сходные по результатам данные были получены и в опытах на мышах линии СЗНА, испытавших однократное воздействие гепатоканцерогена - ортоаминоазобензола
(Иванов и др., 1977). В сходной постановке опытов тестирование тканевых экстрактов проводили с помощью иммуносыворотки против линейно-специфической гепатомы 22а, индуцированной тем же канцерогеном (Гельштейн, 1971). Будучи истощенной экстрактом печени ин-тактных мышей и утратив способность реагировать с ним, сыворотка продолжала реагировать с экстрактом гепатомы и ряда гетерологич-ных органов интактных мышей, а также с экстрактами печени мышей, приготовленными спустя 1 сут после аппликации канцерогена. При этом следует отметить идентичность антигенов, выявляемых антиге-патомной сывороткой в экстрактах "канцерогенной" печени и гетероло-гичных органов, например легких.
Из всего сказанного можно сделать вывод, что вслед за антигенным упрощением уже в течение первых суток после воздействия ге-патоканцерогеном в печени крыс выявляется другой характерный признак гепатоцеллюлярных опухолей - антигенная дивергенция, осуществляемая за счет растворимых, по преимуществу цитоплазматических гетероорганных антигенов. Это связано, по всей вероятности, со способностью гепатоканцерогенных веществ влиять определенным образом на ход биосинтетических процессов в клетках печени.
Исследование мембранных гетероорганных антигенов
Переходя к рассмотрению данных о выявлении гетероорганных опухолевых антигенов в составе других клеточных структур, следует отметить весьма частые случаи обнаружения в клетках гепатоцеллюлярных опухолей гетероорганных антигенов, не экстрагируемых растворами с низкой ионной силой (Иванов и др., 1975) и локализованных в обычных условиях в клеточных мембранах почек взрослых интактных крыс (Иванов и др., 1975; 1979; 1982). Их исследование осуществляли прямым способом - с помощью органоспецифической иммуносыворотки против клеточных мембран почек взрослых крыс. Тест-объектами в этих опытах служили печень и почки интактных крыс, клетки асцитной гепатомы Зайдела, а также печень крыс, взятая через 1, 4, 11, 18, 21, 30 и 40 суток после внутрибрюшинного введения ДАБ или ДЭАБ из расчета 250 мг/кг.
Иммуносыворотку получили путем иммунизации кроликов препаратами клеточных мембран почек крыс с последующим ее истощением гомогенатом гетерологичных органов и водно-солевым экстрактом почек. Полноту истощения сыворотки в отношении гетерологичных антигенов и растворимых почечных антигенов строго контролировали (Иванов и др., 1975).
Тестирование мембранных антигенов гепатомы Зайдела проводили на живых клетках с помощью непрямой реакции иммунофлуорес-
ценции (РИФ) по методу Лежневой (1968). Учет реакции производили по индексу флуоресценции (положительным считали индекс не ниже 0,20). При этом в качестве специфического мембранного рассматривали свечение "точечного" и "кольцевого" типа. Мембранные антигены печени и почек тестировали посредством РИФ на тканевых срезах, приготовленных в криостате и фиксированных ацетоном (Энгельгард, 1968).
Обработка противомембранной органоспецифической антипочечной иммуносывороткой срезов почки в РИФ вызывала яркое свечение щеточной каемки извитых канальцев и базальных мембран канальцев. При замене иммуносыворотки нормальной кроличьей сывороткой или обрабатывая срезы лишь флуоресцирующей сывороткой свечения клеточных структур на срезах почек не наблюдалось. Отрицательный результат был получен и при обработке антипочечной иммуносывороткой срезов печени интактных крыс. Следовательно, приведенные выше результаты свечения срезов почки, вызванного аппликацией антипочечной иммуносыворотки, служит основанием органос-пецифичности последней.
При тестировании той же иммуносывороткой живых клеток гепа-томы Зайдела специфическое свечение "кольцевого" и "точечного" типа было обнаружено у 90 - 94% опухолевых клеток (индекс флуоресценции 0,92 - 0,94). Таким образом, на поверхности клеток гепатомы Зайдела удалось выявить характерные для дефинитивных клеток почек органоспецифические антигены, которые могут быть отнесены к числу гетероорганных опухолевых антигенов.
Используя в РИФ указанную иммуносыворотку, мы смогли локализовать мембранные гетероорганные антигены на поверхности клеток гепатомы Зайдела, не имея при этом возможности установить, в какой мере набор органоспецифических антигенов представлен на мембранах гепатомных клеток. Ответ мы попытались найти в опытах по солю-билизации хотя бы части мембранных антигенов с последующим их тестированием методом иммунодиффузии. В качестве солюбилизи-рующих агентов были использованы Твин 80 и Тритон Х-100. Полученные солюбилизаты клеточных мембран печени и почек интактных крыс и гепатомы Зайдела испытывались в РПА с органоспецифической иммуносывороткой против клеточных мембран почек.
Указанная иммуносыворотка проявляла в солюбилизатах клеточных мембран гепатомы один из двух антигенов, обнаруженных в солюбилизатах клеточных мембран почек; с солюбилизатом клеточных мембран печени сыворотка в реакцию не вступала. Эти данные находятся в полном соответствии с результатами иммунофлуоресцентного исследования. На их основании можно прийти к заключению о том, что в антигенную структуру мембран клеток гепатомы Зайдела включен
по-крайней мере один из органоспецифических антигенов клеточных мембран почек.
Изучение мембранных гетероорганных антигенов в печени крыс, испытавших однократное воздействие ДАБ и неканцерогенного аналога ДЭАБ проведено на тканевых срезах с использованием непрямой реакции иммунофлуоресценции (Иванов, 1980,1982). Как отмечено выше, аппликация органоспецифической иммуносыворотки и вслед за тем флуоресцирующей сыворотки не вызывала свечения клеточных структур печени интактных крыс. При обработке в тех же условиях срезов печени, взятых у крыс спустя 1, 4, 11 и 18 сутки после введения ДАБ, было зарегистрировано четкое свечение поверхности гепатоци-тов, свидетельствующее о появлении на ней гетероорганных антигенов, свойственных почечной ткани интактных крыс. На более поздних сроках исследования (25 и 40 сут) уже не удавалось выявить указанного свечения, оно также не наблюдалось во всех случаях тестирования срезов печени крыс, получивших ДЭАБ. Отрицательные результаты были получены и тогда, когда животным вводили увеличенные в 2 и 5 раз дозы неканцерогенного аналога. С другой стороны, введение крысам сниженных в 2 и 5 раз доз канцерогена все же вызывало появление на поверхности гепатоцитов гетероорганных антигенов, однако подобно цитоплазматическим гетероорганным антигенам - лишь в начальные сроки наблюдения (1-4 сут).
Суммируя полученные нами данные об изменениях в составе цитоплазматических и мембранных антигенов, укладывающиеся в картину антигенной дивергенции и антигенного упрощения, а также литературные данные об антигенной реверсии, можно прийти к заключению, что изменения биосинтеза, возникающие в печени вслед за воздействием гепатоканцерогенов, развиваются по плану, характерному для гепатоцеллюлярных опухолей. Признаки этих изменений (снижение синтеза ряда органоспецифических антигенов и усиление синтеза гетероорганных антигенов) выявляются довольно рано - уже спустя 1 сутки после аппликации ДАБ и в дальнейшем регистрируются на протяжении 4-18 сут. Обработка подопытных животных в тех же условиях ДЭАБ не влечет за собой каких-либо заметных изменений в их печени; во всяком случае нам не удалось обнаружить ни снижения синтеза органоспецифических антигенов, ни интенсификации синтеза гетероорганных антигенов. Поэтому, антигенную перестройку в печени крыс под воздействием ДАБ следует, очевидно, связать с канцерогенными свойствами этого вещества, а не с токсическим (неспецифическим) его действием. В этом убеждает в известной мере то, что однократная инъекция животным уменьшенных доз ДАБ все же вызывала антигенные перестройки в печени, в то время как введение увеличенных доз очень близкого по химической структуре неканцеро-
генного аналога - ДЭАБ - к появлению такого рода перестроек не приводило.
В этой связи, на наш взгляд, представляет интерес сравнение однократного действия на крыс "слабого" канцерогена ДАБ и "сильного" канцерогена N-диэтилнитрозамина (ДЭНА), однократная аппликация которого в ряде случаев вызывает опухоли в тканях-мишенях (Farberet al., 1984). Экспрессия же синтеза гетероорганных антигенов почечной природы в гепатоцеллюлярных опухолях, вероятно, может быть обусловлена присутствием этих компонентов в печени эмбрионов, как в случае с у-глутамилтранспептидазой (Fíala, Fíala, 1973) и изозимом А альдолазы (Endo et al., 1970; Silber et al., 1975). Поэтому, мы предприняли поиск ассоциированных с гепатомами мембранных гетероорганных антигенов в печени эмбрионов крыс (Иванов, 1982; Иванов, Фель, 1995).
Имеющаяся в нашем распоряжении иммуносыворотка узкой специфичности, полученная нами при иммунизации кроликов полосой преципитации, вырезанной из агара и сформировавшейся в результате взаимодействия органоспецифической иммуносыворотки против клеточных мембран почек крыс и солюбилизированных препаратов мембран гепатомы Зайдела (Иванов, 1982) выявляла в реакции преципитации в агаре по одному идентичному антигену в солюбилизированных препаратах клеточных мембран почек интактных крыс и гепатомы Зайдела и не реагировала с аналогично приготовленными препаратами мембран печени интактных взрослых крыс. Такой результат указывает на то, что на мембранах клеток гепатомы Зайдела и почек обнаружен один и тот же антиген, отсутствующий в печени интактных взрослых крыс. Это удалось подтвердить и при использовании непрямой реакции иммунофлуоресценции. С помощью данной иммуносыворотки исследуемые антигены были локализованы на базальных мембранах извитых канальцев срезов почек интактных крыс и на поверхности клеток гепатомы Зайдела. В то же время на срезах печени интактных взрослых крыс не было отмечено свечение мембран гепатоцитов.
Иной характер носили результаты, полученные при исследовании срезов печени крыс, подвергнутых однократному воздействию ДАБ или ДЭНА. Печень у крыс брали для тестирования через 1-90 сутки после однократного введения канцерогенов с интервалом, не превышающим 10 суток. Свечение мембран гепатоцитов, положительный результат реакции иммунофлуоресценции, было обнаружено на срезах "канцерогенной" печени после воздействия как ДАБ, так и ДЭНА, и имело сходный характер. Таким образом, на поверхности некоторых гепатоцитов удалось зафиксировать появление гетероорганных антигенов почечного происхождения, ассоциированных с гепатомой Зайдела, причем синтез исследуемых антигенов был отмечен уже спустя 1
сутки после инъекции и ДАБ, и ДЭНА. Еще одно сходство в действии обоих канцерогенов заключается в том, что синтез гетероорганных антигенов оказался обратимым после действия на крыс "слабого" и "сильного" гепатоканцерогенов, хотя сроки экспрессии гетероорганных антигенов в печени тех и других "канцерогенных" животных в значительной степени различались. Срезы печени крыс, взятых в опыт спустя 21 сутки после аппликации ДАБ, уже не отличались от срезов печени взрослых интактных крыс. В то же время на срезах печени крыс, взятых после введения ДЭНА, свечение мембран гепатоцитов регистрировалось в течение 50 суток.
Используя ту же иммуносыворотку узкой специфичности с помощью реакции иммунофлуоресценции мы исследовали также срезы печени эмбрионов, взятой у крыс на 17 - 18-е сутки беременности. Полученные результаты свидетельствуют о том, что основная масса клеток эмбриональной печени не имеет на поверхности гетероорганных антигенов почечной природы, однако все же мембраны отдельных клеток эмбриональной печени отчетливо светятся, т.е. эти клетки несут на своей поверхности исследуемые антигены. Следовательно, синтез ассоциированных с клетками гепатомы мембранных антигенов в определенной степени присущ клеткам эмбриональной печени, не обнаруживается в печени взрослых интактных крыс и возобновляется на ранних сроках после воздействия гепатоканцерогенами. Выявленные на поверхности небольшой части гепатоцитов эмбриональной печени мембранные гетероорганные антигены лишь в определенной мере следует рассматривать как эмбриональные антигены, так как истинные эмбриональные антигены синтезируются в данном органе только в эмбриональном периоде развития животных и не регистрируются, как правило, в его дефинитивном состоянии (Бойд, 1969; Петров, 1982). Сказанное в полной мере может быть отнесено и к у-глутамилтранспептидазе и изозиму А альдолазы, которые являются маркерами дефинитивного состояния клеток почки, обнаруживаются и в эмбриональной печени, а у взрослых животных в условиях канцерогенного воздействия проявляются в этом периоде в качестве гетероорганных антигенов. Такого рода результаты приводят к заключению о том, что возможность синтеза гетероорганных антигенов как бы скована рамками генетической детерминации тех или иных органов и тканей.
С помощью той же иммуносыворотки к мембранным гетероор-ганным антигенам почечной природы при использовании метода имму-ноцитофлуорометрии на изолированных гепатоцитах печени крыс, подвергнутых однократному воздействию "слабого" (ДАБ) и "сильного" (ДЭНА) гепатоканцерогенов, на регенерирующей печени после частичной гепатэктомии, на печени 18-суточных эмбрионов, а также на гепатоцитах интактных взрослых крыс и клетках гепатомы Зайдела прове-
дено сравнительное изучение экспрессии синтеза гетероорганных антигенов в каждом конкретном случае и определено процентное содержание клеток, имеющих на поверхности исследуемые антигены (Рис.1). Результат количественного анализа содержания мембранных антигенов в гепатоцитах и клетках гепатомы позволяют заключить, что в первые 4 сут после воздействия на крыс канцерогенов и частичной гепа-тэктомии синтез мембранных гетероорганных антигенов достигает максимума, после чего начинает снижаться. При этом, если принять уровень содержания исследуемых антигенов на клетках гепатомы Зай-дела за 100%, то уровень содержания их на поверхности клеток эмбрионов составил не более 15%, регенерирующей печени крыс после частичной гепатэктомии - 50%, после воздействия ДАБ - 68%, а после воздействия ДЭНА - достигал уровня, характерного для гепатомных клеток. Кроме того, представляло интерес выяснить в каждом конкретном случае процентное содержание клеток, несущих на своей поверхности исследуемые гетероорганные антигены.
Рис.1. Реакция иммунофлуоресценции изолированных клеток с использованием иммуноцитофлуориметра. По оси абсцисс ~ время, сут; по оси ординат - интенсивность флуоресценци!
усл. ед.
1- гепатоциты интактных крыс, 2- эмбриональные гепатоциты, 3- гепатоциты регенерирующей печени, 4- гепатоциты после действия ДАБ, 5- гепатоциты после действия ДЭНА, 6- гепатома Зайдела.
При подсчете результатов оказалось, что в гепатоме Зайдела обнаружено 96 - 98% светящихся клеток, после канцерогенного воздействия и регенерирующей печени - в пределах 20 - 30% светящихся клеток, в печени 17-сугочных эмбрионов можно выявить до 1% таких клеток.
Таким образом, с помощью реакции непрямой иммунофлуорес-ценции на тканевых срезах ассоциированные с клетками гепатомы Зайдела мембранные гетероорганные антигены почечного происхождения, локализованные обычно на поверхности извитых канальцев почки интактных крыс, были обнаружены также на поверхности части гепатоцитов печени крыс спустя 1 сут после воздействия ДАБ, ДЭНА и частичной гепатэктомии. Синтез исследуемых антигенов оказался обратимым, поскольку через 12 сут после оперативного вмешательства, через 21 и приблизительно через 70 сут после аппликации ДАБ и ДЭНА соответственно установить их наличие на тканевых срезах и на изолированных клетках печени не удавалось, так же, как не удавалось выявить эти антигены на мембранах гепатоцитов взрослых интактных крыс.
Полученные результаты связываются в первую очередь со значительным увеличением в печени "канцерогенных" и частично гепат-эктомированных крыс экспрессии генов, контролирующих синтез гете-роорганных антигенов почечной природы, синтез которых свойственен единичным эмбриональным гепатоцитам и является характерным признаком клеток гепатоцеллюлярных опухолей. Нетрудно заметить соответствие приведенных результатов упомянутым выше литературным данным о случаях ограничения антигенной дивергенции опухолевых клеток рамками детерминации исходных нормальных клеток.
Далее была предпринята нами попытка выделения и идентификации мембранных гетероорганных антигенов почечной природы (Терюкова, Иванов, 1993). Ассоциированные с гепатомами мембранные гетероорганные антигены, которые появляются уже спустя 1 сутки после действия канцерогена, можно рассматривать в качестве маркеров трансформированных клеток. Поэтому, на наш взгляд, несомненный интерес представляют выделение и характеристика индивидуальных мембранных гетероорганных антигенов и использование их в этом качестве при исследовании нормальных и опухолевых клеток. Препараты клеточных мембран печени, почек и гепатомы Зайдела получали в соответствии с рекомендациями Белошапкиной и Абелева (Ве^вИарЫпа, АЬе1еу, 1965). Фракцию плазматических мембран клеток гепатомы Зайдела выделяли по Хеффнеру (НаеАпег е1 а!.. 1980) с некоторыми модификациями. С помощью аффинной хроматографии при использовании иммобилизировэнных на С^г-сефарозе антител из кроличьей органоспецифической иммуносыворотки против почек ин-
тактных взрослых крыс выделены мембранные гетероорганные антигены почечной природы из клеточных мембран асцитной гепатомы Зайдела и органоспецифические антигены из почечных мембран. По результатам электрофоретического анализа элюированных с иммуно-сорбента белков, мембранные органоспецифические антигены почки представлены по меньшей мере 6 компонентами. При этом лишь фракция с мол. массой около 50 кДа соответствует единственному компоненту, идентифицируемому как гетероорганный антиген почечной природы, который был выделен из клеточных мембран гепатомы Зайдела. Специфичность антипочечной иммуносыворотки в отношении этого белка подтверждена с помощью иммуноблотинга.
Таким образом, по сравнению с печенью антигенный спектр клеточных мембран гепатомы Зайдела обогащен белком с мол. массой 50 кДа, который, судя по результатам электрофореза, является одним из основных компонентов органоспецифических антигенов почечных мембран.
Антигенный состав плазматических мембран опухолевых клеток определяет их способность к неограниченной пролиферации, адгезии, инвазивному росту и отчасти уникален для каждой отдельной опухоли благодаря наличию в их составе опухолеассоциированных антигенов. Исследованию опухолеассоциированных антигенов посвящена большая научная литература, однако, преимущественно данная группа антигенов исследуется с целью дальнейшего применения в клинической практике и лишь немногие работы уделяют внимание изучению цитологических аспектов этих антигенов. Так, например, показано, что в составе ассоциированных с меланомой кожи человека антигенов наружных мембран опухолевых клеток можно выделить по меньшей мере 4 главные антигенные системы: 1) онкофетальные белки, обеспечивающие адгезию клеток, подвижность и межклеточные контакты; 2) факторы роста и рецепторы к ним; 3) белки, осуществляющие транспорт и связывание катионов; 4) антигены гистосовместимости.
Нами проведено исследование мембранных опухолеассоциированных антигенов гепатоцеллюлярных опухолей крыс с использованием иммуносыворотки против плазматических мембран клеток гепатомы Зайдела (Терюкова и др., 1996). Методом электрофоретического разделения в полиакриламидном геле и последующего иммуноблотинга показано, что мембранные опухолеассоциированные антигены клеток гепатомы Зайдела представлены по крайней мере 10 компонентами с мол. массой около 22, 25, 31, 33,42,46, 56, 65, 96 и 180 кДа, тогда как с белками гепатоцитов интактных взрослых крыс взаимодействия той же опухолеспецифической иммуносыворотки на авторадиограмме не обнаружено.
Известно, что антигенный спектр наружных мембран опухолевых клеток может включать как уникальные для данной опухоли компоненты, так и общие для опухолей различного происхождения (Schreiber, 1989). В этой связи, на наш взгляд, представляет интерес вопрос о том, в какой степени опухолеассоциированные антигены, обнаруженные в составе клеточных мембран гепатомы Зайдела, специфичны или присущи лишь данной опухоли. В частности, имеет ли место экспрессия антигенов, ассоциированных с опухолевыми клетками гепатомы Зайдела на поверхности культивируемых клеток гепатом иного происхождения, а также на мембранах активно пролиферирующих, но не опухолевых клеток, например культивируемых миогенных клеток L-8 и фибробластов почек крысы. При тестировании культивируемых клеток антиопухолевой сывороткой против мембран гепатомы Зайдела, в реакции непрямой иммунофлуоресценции специфическое свечение наружных мембран "кольцевого" типа четко выявлено для гепатом 27, НТС и "точечное" свечение - для миогенных клеток. В контрольных вариантах постановки опыта, при обработке клеток только флуоресцирующей сывороткой или сывороткой интактного кролика, специфического свечения клеточных мембран не наблюдалось.
Количественная оценка взаимодействия опухолеспецифической иммуносыворотки с антигенами гепатоцитов, клеток гепатомы Зайдела и культивируемых клеток, экстрагированных ЗМ KCl, получена методом иммуноферментного анализа. В этих опытах специфичность иммуносыворотки в отношении антигенов клеточных экстрактов оценивали как отношение светопоглощения, регистрируемого при взаимодействии антигенов с иммуносывороткой, к светопоглощению, регистрируемому при их взаимодействии с сывороткой интактного кролика. При этом оказалось, что специфичность антиопухолевой сыворотки в отношении антигенов клеток гепатомы Зайдела составляет в среднем 8,7 ± 0,71, тогда как с антигенами гепатоцитов интактных крыс иммуносыворотка практически не взаимодействовала (1,46 ± 0,14). Результаты тестирования антигенов культивируемых гепатом НТС (4,66 ± 0,34) и 27 (4,78 ± 0,37), а также миогенных клеток (5,55 ± 0,44) свидетельствуют о достоверных различиях их антигенного состава и клеток асцитной гепатомы Зайдела. С другой стороны, специфичность иммуносыворотки в отношении антигенов культивируемых клеток достоверно выше соответствующего показателя для антигенов гепатоцитов интактных крыс. Высокий уровень взаимодействия антиопухолевой сыворотки с антигенами фибробластов почки (10,03 + 1,13), по-видимому объясняется наличием в ее составе антител к общему антигену, который был идентифицирован нами в составе наружных мембран клеток гепатомы Зайдела как гетероорганный антиген почечной природы с помощью органоспеци-фической иммуносыворотки против клеточных мембран почек крысы.
Достоверные различия в специфичности взаимодействия антиопухолевой сыворотки в отношении антигенов культивируемых гепатом НТС и 27 и гепатоцитов интактных крыс, также отражают наличие в антигенном составе этих клеток общих компонентов и, по-видимому, в первую очередь, гетероорганных антигенов, присущих дефинитивной ткани почек. Действительно, с помощью органоспецифической иммуносы-воротки против клеточных мембран почек интактных крыс нам удалось получить данные об экспрессии гетероорганных почечных антигенов на поверхности клеток культивируемых гепатом НТС и 27 (Терюкова и др., 1996).
В этой работе проведено исследование антигенов клеточных мембран некоторых опухолей и гомологичных им дефинитивных тканей с помощью указанной иммуносыворотки при использовании методов иммунофлуоресценции и иммуноферментного анализа. Ранее с помощью органоспецифической иммуносыворотки против клеточных мембран почек нами был обнаружен и выделен белок с мол. массой около 50 кДа из солюбилизата клеточных мембран асцитной гепатомы Зай-дела, идентифицированный как мембранный гетероорганный антиген почечной природы (Иванов и др., 1975; Терюкова, Иванов, 1993). В то же время не установлено, являются ли мембранные антигены, присущие почечной ткани, характерной особенностью данной гепатоцеллю-лярной опухоли или же могут быть выявлены в опухолях иного гистогенеза.
Еще одна задача данного исследования заключалась в том, чтобы выяснить: связано ли появление мембранных гетероорганных антигенов с процессом пролиферации клеток. Таким образом объектами исследования были выбраны: гепатоциты интактных взрослых крыс использовали в качестве контроля; клетки перевиваемой асцитной гепатомы Зайдела, индуцированной 4-диметиламиноазобензолом; культивируемые клетки гепатомы НТС, индуцированной у крыс 2,7-фторэтилен-бис-2,2,2- трифторацетамидом и гепатомы 27, индуцированной N-дизтилнитрозамином; клетки перевиваемой солидной раб-домиосаркомы РА-2 крыс, как клетки миогенной опухоли, т.е. отличные по гистогенезу от гепатоцеллюлярных; клеточную культуру высоко-дифференцирующихся миогенных клеток использовали, с одной стороны, в качестве контроля к клеткам рабдомиосаркомы, а с другой стороны, как активно пролиферирующие, но не опухолевые клетки; фиб-робласты почек крысы использовали в качестве положительного контроля в предварительных экспериментах по определению гетероорганных антигенов в составе мембранных белков, экстрагируемых ЗМ KCl.
При тестировании исследуемых клеток методом непрямой иммунофлуоресценции с помощью органоспецифической антипочечной
сыворотки не обнаружено свечения клеточной поверхности гепатоци-тов интактных взрослых крыс и культивируемых высокодифференци-рующихся миогенных клеток. В то же время, специфическое свечение "кольцевого" и "точечного" типов на поверхности клеток четко выражено для рабдомиосаркомы РА-2 и культивируемых клеток гепатоцеллю-лярных опухолей крыс НТС и 27.
Количественная характеристика взаимодействия иммуносыво-ротки с мембранными антигенами клеток получена методом иммуно-ферментного анализа. Результаты тестирования фракций плазматических мембран клеток перевиваемых опухолей - гепатомы Зайдела и рабдомиосаркомы РА-2 и препаратов клеточных мембран гомологичных им органов - крысиной печени и мышц, показали, что взаимодействие иммуносыворотки с мембранами клеток рабдомиосаркомы РА-2 примерно в 5 раз превышает взаимодействие с клеточными мембранами мышц, тогда как соответствующее значение для мембран гепатомы Зайдела и клеточных мембран печени составляет 3. Полученные данные, по-видимому, позволяют утверждать, что гетероорганные антигены, присущие дефинитивной ткани почек, широко представлены в составе наружных мембран клеток рабдомиосаркомы РА-2 крыс.
Таким образом, появление мембранных гетероорганных антигенов почечной природы в составе клеточных мембран опухолей, отличающихся по своей этиологии и гистогенезу, указывает на закономерный характер феномена и поднимает вопрос о функциональном значении почечных гетероорганных антигенов в процессе малигнизации. Что же касается предположения о их роли в процессе малигнизации, то, вероятно, их появление не совсем связано с пролиферацией опухолевых клеток. Ранее нами было показано, что синтез ассоциированных с гепатомами мембранных гетероорганных антигенов в культуре не про-лиферирующих, а переживающих гепатоцитов взрослых крыс имеет место только в результате воздействия гепатоканцерогена (Назаров, Иванов, 1989). Вместе с тем, согласно данным рассматриваемой работы, нам не удалось выявить гетероорганные антигены почки в составе клеточных мембран активно пролиферирующих миогенных клеток крыс. Таким образом, представляется справедливым заключение о том, что появление гетероорганных антигенов является не столько следствием активной пролиферации клеток, сколько результатом влияния других факторов, связанных с неопластической трансформацией клеток.
Исследование гетероорганных антигенов в составе
хромосомных негистоновых белков
Эта группа белков выбрана нами для исследования не случайно; во-первых, выбор обусловлен имевшимися в литературе сведениями об их тканеспецифических антигенных различиях (Chytil, Speiberg, 1971; Гершун и др., 1980), во-вторых, связанным с этим предположением о причастности НГБ к регуляции транскрипции, т.е. в конечном счете, цитодифференцировки (Chiu et а!., 1975; Kleinsmith et al., 1975; Цанев, 1980; Chiu, 1985; Holde, 1988) и, в-третьих, данными, свидетельствующими об антигенных изменениях НГБ в опухолевых клетках (Schmidt et al., 1984; Наназашвили и др., 1984).
Прежде всего была проделана работа по выделению ядер исследуемых тканей, дегистонизированного хроматина (комплекса НГБ-ДНК) и дальнейшая очистка уже свободных от ДНК препаратов НГБ (Кушнер и др., 1984). Антигенные же свойства, полученных таким образом препаратов, изучали в реакции специфической задержки преципитации в агарозе (РСЗПА) при использовании иммуносывороток против комплексов НГБ-ДНК хроматина почек интактных взрослых крыс. В то же время при градиентной ионообменной хроматографии препаратов НГБ асцитной гепатомы Зайдела на фосфоцеллюлозе во фракциях, элюируемых 0,4 - 0,5М NaCI, появляются пики собственной фосфопро-теинкиназной активности, не свойственные НГБ печени, но присущие НГБ почек интактных крыс (Кушнер и др., 1985). Следует ли это рассматривать как частный случай, имеющий место только в опытах с ге-патомой Зайдела, или подобные явления характерны вообще для ге-патоканцерогенеза (у крыс, по крайней мере)? Ответить на этот вопрос можно было путем сравнения антигенных и фосфопротеинкиназных свойств НГБ из клеток еще одного образца перевиваемой гепатоцел-люлярной опухоли крыс, например солидной гепатомы 27, а также клеток печени крыс после однократного введения гепатоканцерогенов: 4-диметиламиноазобензола (ДАБ), с помощью которого была индуцирована гепатома Зайдела и N-диэтилнитрозамина (ДЭНА), которым индуцирована гепатома 27.
Таким образом мы вновь, уже при исследовании гетероорганных антигенов в составе негистоновых белков, попытались сравнить антигенный спектр уже сложившихся гепатоцеллюлярных опухолей и печень крыс на ранних этапах канцерогенеза, после однократной инъекции животным тех же канцерогенов, которыми были индуцированы гепатомы (Фель и др., 1984; Кушнер и др., 1985; Кушнер и др., 1988а).
Оказалось, что указанная иммуносыворотка, будучи тщательно истощенной препаратами НГБ печени и утратив способность реагировать с соответствующими антигенами, продолжала вступать в реакцию
преципитации не только с препаратами НГБ почек, что вполне естественно, но и с препаратами НГБ из клеток обеих гепатом - 27 и Зайдела. Эти результаты доказывают наличие в составе хромосомных НГБ клеток гепатом крыс гетероорганных антигенов почечной природы, подобно тому, как ранее гетероорганные антигены той же тканевой природы были обнаружены нами в их цитоплазме и на наружных мембранах. Особо следует подчеркнуть тот факт, что исследуемые гетероорганные НГБ-антигены, выявленные в хроматине клеток асцитной гепатомы Зайдела и солидной гепатомы 27 идентичны. Оказалось, что эти антигены проявляют феномен антигенной идентичности также и с препаратами НГБ почек и печени крыс после введения гепатоканцерогенов. Это означает, что часть гетероорганных НГБ-антигенов, определяемых в составе НГБ печени крыс после введения гепатоканцерогенов, оказались идентичными тем антигенам, которые присущи НГБ клеток исследованных нами гепатоцеллюлярных опухолей. Полученные данные трудно интерпретировать иначе как способность ДАБ и ДЭНА вызывать даже при кратковременном действии на животных изменения в составе ядерных белков печени - НГБ, сходные с теми, которые характерны для клеток уже сформировавшихся опухолей того же гистогенеза, индуцируемых с помощью тех же канцерогенов. Нужно отметить, что сведения о неидентифицированных НГБ, свойственных клеткам гепатом, но не определяемых в исходной дефинитивной ткани, получены и другими авторами (Schmith et al., 1982; Перевощикова и др., 1983).
Судить о том, насколько устойчив рассматриваемый эффект однократного воздействия гепатоканцерогенов позволяют данные, приведенные в табл. 7. Знаком "+" отмечены все случаи положительных реакций вне зависимости от того, сколько полос преципитации давала истощенная НГБ-антигенами печени иммуносыворотка против НГБ-антигенов почки с исследуемыми препаратами НГБ в реакции СЗПА. Эффект после однократного действия гепатоканцерогенов проявлялся уже спустя сутки, при этом эффект от действия ДАБ наблюдался в течение 15 суток, тогда как при введении ДЭНА четкие полосы преципитации отмечались даже на 64 сутки. Однако, обнаруженный эффект оказался обратимым и через 15 суток в случаен ДАБ и 64 суток в случае ДЭНА, исследуемые гетероорганные НГБ-антигены нельзя было выявить, также как и в препаратах печени интактных взрослых животных.
Полученные результаты свидетельствуют о том, что ДЭНА вызывает более устойчивые изменения в составе ядерных НГБ, чем ДАБ. Эти различия зависят, по-видимому, от свойств данных веществ: ДЭНА, как известно, в отличие от ДАБ в некоторых случаях индуцирует у крыс гепатоцеллюлярные опухоли даже при однократной аппликации (Швембергер, 1966; Druckray et al., 1962; Alonso et al., 1970). Можно до-
пустить, что одним из условий, определяющих туморогенные потенции ДЭНА, является его наиболее выраженное промоторное действие.
Таблица 7
Выявление гетероорганных антигенов почки и пиков собственной фосфопротеинкиназной активности в хроматографических фракциях, элюируемых 0,4 - 0,5М №С1, в разные сроки после однократного введения крысам ДАБ и ДЭНА
Гепато-канцероген Сроки после воздействия ДАБ и ДЭНА, сутки
1-е 4-е 7-е 12-е 15-е 17-е 18-е 25-е 40-е 64-е 112-е
ДАБ + + + + ± - -
ДЭНА + + + + + ± + + + + -
Поскольку выделяемая нами водно-растворимая фракция НГБ - очень гетерогенная популяция ядерных белков, которые выполняют самые разнообразные функции в геноме (Gershun et al., 1981), поэтому в нашей лаборатории была предпринята попытка фракционировать некоторые из них при ионообменной хроматографии на фосфоцеллюлозе путем элюции колонок градиентом концентраций NaCI 0,1 -1,0 М и исследовать фосфопротеинкиназную активность фракций с помощью эн-зиматической реакции переноса радиоактивного фосфора с уЗЗр-АТФ на белки, осуществляемой фосфопротеинкиназами, крайне лабильными и специфическими внутриядерными ферментами (Кушнер и др., 1985). В литературе есть сведения о том, что фосфорилирование НГБ и сам его уровень могут влиять на характер экспрессии генов в клетках эукариот (Kleinsmith et al., 1975; Blot et al., 1983). Следовательно, можно было ожидать, что в спектрах собственной протеинкиназной активности НГБ при их хроматографии на фосфоцеллюлозе могут произойти специфические изменения, если клетки исследуемой ткани претерпевают трансформацию к опухолевому фенотипу. Мы нашли, что препараты НГБ асцитной гепатомы Зайдела содержат активные фосфопро-теинкиназные фракции, злюируемые при концентрации NaCI 0,4 - 0,5 М, т.е. в зоне молярности, где мы никогда не наблюдали пиков активности для препаратов НГБ печени интактных крыс, но всегда обнаруживали их для препаратов НГБ почек интактных крыс. Таким образом,
намечалась определенная корреляция между появлением гетероор-ганных антигенов почечной природы и пиков собственной фосфопро-теинкиназной активности в зоне 0,4 - 0,5 М №С1. Далее мы проанализировали спектры собственной фосфопротеинкиназной активности всех многочисленных препаратов НГБ, полученных в разные сроки после введения крысам ДАБ или ДЭНА и выяснили, что всегда, когда отмечается появление почечных гетероорганных антигенов, обнаруживаются также и пики собственной протеинкиназной активности во фракциях, элюируемых 0,4 - 0,5 М №С1. Их наличие также отражено знаком "+" в таблице 7. Они характерны и для препаратов НГБ солидной гепатомы 27. По-видимому, корреляция антигенных и фосфопро-теинкиназных свойств, соответствующих НГБ, имеет весьма общее значение для гепатоканцерогенеза. Интересно также, что обнаруженные нами гетероорганные НГБ-антигены обладают фосфопротеинкиназной активностью - свойством, которым обладают и некоторые онко-белки, экспрессируемые при соответствующих условиях клеточными онкогенами (Шапот и др., 1983; Киселев, 1983).
Однако концентрация белков во фракциях, элюируемых 0,4 - 0,5 М ЫаС1 при ионообменной хроматографии на фосфоцеллюлозе, очень низка (примерно 10"10 г/мл) и это обстоятельство не позволяет получить при постановке РСЗПА визуально наблюдаемых полос преципитации и таким образом непосредственно установить антигенную принадлежность белков, дающих специфические пики собственной фосфопротеинкиназной активности. Вместе с тем способность к собственному фосфорилированию указанных фракций НГБ, в присутствии у33р_ АТФ позволяет получить меченные ЗЗр белки этих фракций для последующего использования в РСЗПА и выявить радиометрически наличие в блоке агарозного геля невидимых глазом преципитатов. Возможность выявления преципитатов при этом в зависимости от удельной активности уЗЗр-АТФ возрастает на несколько порядков и "концентрационные барьеры" оказываются преодоленными. Такой метод визуализации препаратов был предложен в нашей лаборатории (Кушнер и др., 1988а; Кушнер и др., 19886). Суть метода заключалась в том, что после взаимодействия в РСЗПА иммуносыворотки против комплекса НГБ-ДНК почек, истощенной предварительно на стекле препаратами НГБ печени интактных крыс, с меченными ЗЗр белками фракций НГБ, элюируемых 0,4 - 0,5 М ЫаС1, вырезали полосы агарозного геля шириной приблизительно 4 мм в направлении диффузии компонентов между центральной и периферическими лунками и подвергали радиометрическому исследованию. Равные части геля тщательно отмывали для удаления несвязавшихся антигенов, обезвоживали этиловым спиртом, подсушивали и заливали в виалах стандартным толуоловым сцинтиллятором, радиоактивность измеряли на счет-
чике фирмы Весктап. Полученные результаты свидетельствуют о том, что заметно выше уровня среднестатистического фона величина радиоактивности там, где, как правило, визуализируется полоса преципитации для нефракционированных препаратов НГБ почек или НГБ гепа-томы. Радиоактивность участков, относящихся к элюированным 0,4 -0,5 М N801 фракциям пиков собственной фосфопротеинкиназной активности, превышает таковую для участков нефракционированного препарата, что можно объяснить концентрированием в узких фракциях соответствующих гетероорганных антигенов почечной природы.
В том, что именно с этими НГБ-антигенами связана повышенная радиоактивность соответствующих участков агарозного геля, нас убеждают результаты подобного же опыта, в котором использовались антипочечная иммуносыворотка, истощенная НГБ-антигенами почек ин-тактных крыс. При такой нейтрализации в иммуносыворотке антител к НГБ-антигенам почек ("гашение") радиоактивность всех участков агарозного геля мало отличается от фона, т.е. в этом случае не наблюдалось образование радиоактивных преципитатов с препаратами НГБ почек и гепатомы 27.
С помощью гельфильтрации и электрофореза в полиакрила-мидном геле была определена молекулярная масса узких фракций хромосомных НГБ, элюируемых 0,4 - 0,5 М N801 при градиентной ионообменной хроматографии на фосфоцеллюлозе и обладающих собственной фосфопротеинкиназной активностью. Оказалось, что основной компонент этих фракций имеет мол. массу порядка 23 кДа и обнаруживается в составе хромосомных НГБ клеток как почек крысы, так и солидной гепатомы 27 (Кушнер и др., 1988а). Результат РСЗПА, который был получен количественным радиометрическим способом свидетельствует о том, что основной компонент меченный 33Р идентифицируется как гетероорганный антиген почечной природы. Аналогичным способом была определена мол. масса и других гетероорганных НГБ антигенов, т.е. узких фракций НГБ, полученных из асцитной гепатомы Зайдела, печени крыс, после воздействия на них различными канцерогенами и др. и в каждом случае молекулярная масса оказывалась около 23 кДа.
Таким образом, нами экспериментально установлено, что в ответ на действие канцерогенов на поверхности гепатоцитов в составе негистоновых белков хроматина крыс экспрессируются ассоциированные с гепатомами гетероорганные антигены почечной природы. Появление гетероорганных антигенов одной тканевой принадлежности в составе хромосомных фракций и на клеточной поверхности гепатоцитов, можно полагать, представляет собой не случайный феномен. Согласно литературным данным, НГБ способны определенным образом участвовать в процессах транскрипции, а стало быть, при определенных условиях могут, вероятно, выступать в роли факторов, регулирующих
генную экспрессию клеток (Kleinsmith et al., 1975; Stein et al., 1975; Левитина и др., 1982; Jen-Fu Chiu, 1982; Liew et al., 1985; Van Holde, 1988).
Исходя из сказанного, наша задача заключалась в том, чтобы определить возможность индукции мембранных гетероорганных антигенов почечной природы при контакте препаратов НГБ, выделенных из почек интактных крыс и гепатом (27 и Зайдела), а также из печени крыс после канцерогенного воздействия (ДЭНА), с гепатоцитами, изолированными из печени взрослых интактных крыс (Иванов и др., 1990). В этой работе были использованы нефракционированные препараты НГБ, суспензию гепатоцитов получали в соответствии с рекомендациями Сеглена (Seglen, 1976) с некоторыми модификациями. Клетки инкубировали в среде Willliams Е (2x10° кл/мл) в течение 6 часов при 37° С в контакте с теми или иными препаратами НГБ (120-200 мкг/мл) и без них, при легком покачивании. До и после инкубации клетки проверяли на жизнеспособность с помощью окраски трипановым синим. Как правило, жизнеспособными оказывалось около 80 - 85% гепатоцитов. По окончании инкубации гепатоциты отмывали охлажденным раствором Рингера и исследовали методом непрямой иммунофлуоресценции, используя кроличью иммуносыворотку узкой специфичности против мембранных антигенов почек крыс, ассоциированных с гепатомами.
Таблица 8
Выявление мембранных гетероорганных антигенов почечной природы в реакции непрямой иммунофлуоресценции в первичной культуре
гепатоцитов крыс
Воздействие на гепатоциты Доля клеток с положительной реакцией, %
Без воздействия 0
НГБ из печени 0
НГБ из почек 10,84 + 0,23
НГБ из гепатом 8,06+0,12
НГБ из канцерогенной печени 2,82 + 0,02
Полученные результаты представлены в таблице N8 и свидетельствуют о том, что контакт с НГБ из почек интактных крыс, из клеток гепатомы 27 и Зайдела, а также из клеток печени крыс, взятой на 4-е сут после введения ДЭНА приводит к появлению на наружной мембране части гепатоцитов (3 - 13%) специфического свечения "кольцевого" и "точечного" типа, наблюдаемого обычно при выявлении у гепатомных
клеток мембранных гетероорганных антигенов почечной природы. Такое свечение мембран отсутствует при инкубации гепатоцитов в среде без добавления каких-либо препаратов НГБ или содержащей НГБ из печени интактных крыс.
Сравнивая в пределах опыта результаты, полученные при подсчете количества клеток, имеющих на мембране специфическое свечение, следует обратить внимание на то, что доля таких клеток незначительно варьировала от опыта к опыту. Вместе с тем в условиях данной постановки экспериментов прослеживались некоторые количественные различия во влиянии тех или иных препаратов НГБ на экспрессию мембранных гетероорганных антигенов почечной природы. Так, в условиях наших опытов наиболее высокую долю положительных реакций, свидетельствующих об экспрессии указанных антигенов, можно было обнаружить после инкубации гепатоцитов с препаратами НГБ из почек интактных крыс (от 8 до 13%). При этом в контрольных вариантах (обработка таких же клеток нормальной кроличьей сывороткой или лишь флуоресцирующей сывороткой) не было обнаружено клеток с подобным свечением. Важно отметить тот факт, что выявленное свечение гепатоцитов отсутствовало в том случае, когда клетки обрабатывали иммуносывороткой узкой специфичности, предварительно истощенной "своими" антигенами - препаратами мембран почек интактных крыс. Этот контроль вместе с другими подтверждает специфический характер регистрируемой реакции иммунофлуоресценции. Дополнительным контролем могут служить также отрицательные результаты опытов, в которых гепатоциты, испытавшие воздействие препаратов НГБ, тестировали иммуносывороткой против комплексов НГБ-ДНК из печени интактных крыс. Они свидетельствуют в том числе и о том, что наблюдаемые нами случаи положительных реакций иммунофлуоресценции не были обусловлены сорбцией НГБ на поверхности исследуемых клеток. После инкубации гепатоцитов с препаратами НГБ, полученными из клеток гепатом 27 и Зайдела, количество положительных реакций варьировало в пределах 7-9%; более низкая доля таких реакций была зафиксирована после действия на клетки НГБ из печени крыс, испытавших однократное воздействие гепатоканцерогеном, - от 2,6 до 3%. Во всех вариантах опыта, когда гепатоциты инкубировали в равных условиях с препаратами НГБ из печени интактных крыс, экспрессию гетероорганных антигенов почечной природы выявить не удалось.
Полученные результаты связаны скорее всего с действием не всех молекулярных компонентов НГБ, а их узкой фракции, наделенной фосфо-протеинкиназной активностью и имеющей молекулярную массу порядка 23 кДа. Эта фракция является конститутивным компонентом хромосомных НГБ почек, иммунологически идентичным соответствующим
фракциям НГБ, закономерно выявляемым в гепатомах и в печени крыс после воздействия гепатоканцерогенами и рассматриваемым в качестве гетероорганных антигенов. Важно отметить, что выявить указанную фракцию в препаратах НГБ из печени интактных крыс не удалось. Следовательно, не исключено, что именно эти, выявляемые в исследуемых препаратах НГБ-компоненты почечной природы могли оказаться способными при контакте с гепатоцитами возбуждать в некоторых из них синтез мембранных гетероорганных антигенов. Поэтому в следующей работе (Иванов и др., 1992) мы использовали для контакта с культурой гепатоцитов крыс уже хроматографически чистые фракции НГБ, т.е. с основным компонентом с мол. массой 23 «Да, обозначенным нами как белок рр23. Полученные результаты, представленные в табл. N9, свидетельствуют о том, что в результате контакта препаратов рр23, выделенных из почек интактных крыс, печени крыс после однократного канцерогенного воздействия и гепатом с гепатоцитами, на поверхности части из них выявляются мембранные антигены почечной природы.
Таблица 9
Выявление мембранных гетероорганных антигенов у гепатоцитов крыс при действии на них фракций препаратов НГБ
Источник НГБ Доля гепатоцитов, у которых выявлены гетероорганные антигены, %
Почки интактных крыс Гепатома Зайдела Гепатома 27 Рабдомиосаркома Печень крыс, которым был введен ДЭНА 8,65 ± 0,06 7,60 + 0,04 8,25 ±0,14 5,45 ± 0,03 2,80 + 0,01
Отрицательный результат получен в тех случаях, когда гепато-циты инкубировали с фракцией НГБ из печени интактных взрослых крыс или без добавления НГБ.
Схема постановки экспериментов была такой же, как и в предыдущей работе, но здесь хотелось бы упомянуть лишь о том, что во всех опытах для каждого варианта просчитывалось не менее 500 клеток и, указанные в таблице результаты являются средними значениями положительных реакций иммунофлуоресценции, выраженными в процентах от общего числа исследованных клеток. Если сравнить долю гепатоцитов со светящейся мембраной, полученную в указанной выше работе, в которой использовали нефракционированные препараты НГБ, и долю таких же НГБ, элюированных с фосфоцеллюлозы 0,4-0,5 М №С1,
то следует обратить внимание на тот факт, что в последнем случае доля окрашенных гепатоцитов, свидетельствующая об экспрессии мембранных гетероорганных антигенов почечной природы, либо не изменяется (как в случае действия ДЭНА-НГБ или НГБ гепатом), либо снижается не более, чем на 20%. При этом количество выделяемого во фракциях материала, вводимого в культуральную среду суспензии гепатоцитов, было уменьшено почти в 10 раз по сравнению с тем, что мы имели в случае нефракционированных НГБ. Согласно законам ферментативной химии, это соответствует степени очистки "действующего начала" в весовом отношении по крайней мере в 10 раз.
Следует особо отметить еще один результат, полученный в этой работе: индукцию синтеза у 5,2%-5,7% гепатоцитов мембранных гетероорганных антигенов почечной природы в результате контакта их с фракцией НГБ из опухоли миогенного происхождения - рабдомиосар-комы РА-235. Можно сказать, что исследуемая группа гетероорганных антигенов почечной природы, ассоциированных с гепатомами, выявленная и в опухоли иного гистогенеза, обладает сходными свойствами. Таким образом, можно прийти к заключению, что рр23 (гетероорганный антиген почечного происхождения) выступает в роли фактора, влияющего на генную экспрессию и изменяющую ее в направлении, характерном для клеток гепатоцеллюлярных опухолей (и не только их) или печени крыс, испытавших действие гепатоканцерогенов.
Согласно современным представлениям, НГБ могут выполнять в геноме функцию регуляторов генной экспрессии. Известны случаи выявления в опухолевых тканях особых фракций НГБ, которые отсутствуют в исходных нормальных тканях (Наназашвили и др., 1984; Schidt et al., 1984; Збарский и др., 1992). К их числу относятся и гетероорган-ные НГБ-антигены почечной природы неизменно обнаруживаемые в гепатоцеллюлярных опухолях и "канцерогенной" печени. Кроме того, эти НГБ-антигены обладают собственной фосфопротеинкиназной активностью - свойством, характерным для большинства мембранных рецепторов эпидермального фактора роста, тромбоцитарного фактора роста, инсулина и т.д. (Никольский и др., 1987).
Сказанное, очевидно, позволяет допустить возможность какого-то сопряжения пролиферативной активности в исследуемых тканях с изменениями в составе их хромосомных НГБ. С целью проверки этого допущения были предприняты опыты, в которых исследовалось влияние препаратов узких фракций НГБ (рр23) из указанных выше тканей на пролиферативную активность в культуре покоящихся мышиных клеток линии Swiss ЗТЗ. Предполагается, что рр23 из почек интактных крыс, рассматриваемый как гетероорганный антиген ассоциированный с гепатомами, может выступать в качестве фактора, причастного к ре-
гуляции клеточной пролиферации, в том числе и в ксеногенной системе.
В нашей лаборатории получены данные по ионообменной хроматографии на фосфоцеллюлозе, гельфильтрации и исследованию собственной фосфопротеинкиназной активности препаратов рр23 из почек и печени крыс, быка и человека (Грандилевская и др., 1995). По своим молекулярным и биохимическим свойствам все препараты рр23, выделенные из почек крыс, быка и человека оказались практически одинаковыми, при том, что в печени, вне зависимости от видовой принадлежности, соответствующего гетероорганного антигена не было обнаружено.
Далее были проведены эксперименты по изучению влияния нефракционированных препаратов НГБ из печени, почек, гепатомы 27 и клеток печени крыс на 4-е сут после введения ДЭНА на пролифера-тивную активность покоящихся в культуре мышиных клеток Swiss ЗТЗ (Баркан и др., 1990). НГБ добавляли в чашечки с покоящимися клетками по 50-100 нг на 1 мл кондиционированной культуральной среды. Для контроля эффекта стимуляции синтеза ДНК в часть чашек вводили ЭФР и инсулин отдельно или в комбинации. Через 21-23 ч после введения изучаемых факторов оценивали интенсивность синтеза ДНК по включению 14С-тимидина (клетки инкубировали с 14С-тимидином 1 ч при 37°С). Полученные результаты бесспорно свидетельствуют о наличии стимулирующего синтез ДНК действия различных по происхождению НГБ в клетках ЗТЗ, хотя эффективность их действия ниже, чем эффективность ЭФР. Фракционированные препараты НГБ (рр23), выделенные из почек крысы и быка были использованы в аналогичных экспериментах. При этом оказалось, что препараты рр23 как крысы, так и быка инкубированные с покоящейся культурой клеток Swiss ЗТЗ вызывают повышенный в 2 раза синтез ДНК, определяемый по включению Зн-тимидина. Это указывает на то, что рр23 независимо от видот вой принадлежности стимулирует гетерологичные по отношению к ним мышиные клетки к пролиферации (Кушнер и др., 1996).
Однако, видовая принадлежность рр23, оказалось, имеет значение в тех случаях, когда мы пытались индуцировать синтез мембранного опухолеассоциированного антигена на поверхности части клеток в культуре гепатоцитов при инкубации с препаратами рр23. Если рр23 почек крыс вызывает синтез мембранного антигена, то рр23 почек быка остается инертным в этой системе в отличие от процесса пролиферации (Kusher et.al„ 1997).
В нашей лаборатории были получены моноклональные антитела (МКА) к рр23 из почек крыс и обозначены 5Д2 (Грандилевская, 1993). Проведено сравнительное изучение взаимодействия моноклональных антител 5Д2 с ядерными антигенами культивируемых клеток гепатомы
27 и нормальных гепатоцитов крыс в реакции непрямой иммунофлуо-ресценции. В клетках гепатомы, обработанных антителами 5Д2 наблюдали специфическое точечное свечение в области ядра, не обнаруживаемое в нормальных интактных гепатоцитах после аналогичной обработки. Такой результат свидетельствует о том, что в ядрах клеток гепатомы 27 имеется белок, взаимодействующий с антителами, полученными к почечному белку рр23 и что в нормальных гепатоцитах такой белок не обнаруживается. Таким образом, мы еще раз получили наглядное подтверждение установленному ранее другими методами факту присутствия в гепатомах гетероорганого НГБ-антигена почечного происхождения - белка рр23, не обнаруживаемого в нормальной печени.
Изучение специфичности моноклональных антител 5Д2 было продолжено с помощью иммуноблотинга. Препараты НГБ характеризуются высокой гетерогенностью, часто количество выделяемых отдельных белков в значительной степени зависит от применяемых метод и варьирует в работах разных авторов. В нашем случае, обычно с помощью вОЗ-элктрофореза в полиакриламидном геле удается разделить не менее сотни компонентов. Обработка электрофоретически разделенных суммарных препаратов НГБ, перенесенных на нитроцеллюлозу, антителами 5Д2 выделяет среди этой массы компонентов три очень близкие полосы, соответствующие белкам с молекулярной массой 22-24 кДа. Следует сказать, что введя ранее сокращение рр23 как обозначение фракции, выходящей единым пиком при гель-фильтрации в области элюции белков с мол. массой 23 кДа, идентифицируемой по собственной фосфопротеинкиназной активности, мы предполагали наличие в ней одной протеинкиназы. Однако разрешающей способности применявшегося метода недостаточно для разделения близких по массе компонентов. Таким образом, почечные НГБ-антигены, реагирующие с антителами 5Д2, или фракция рр23, могут быть представлены по крайней мере тремя компонентами с очень близкой мол. массой и несущими идентичные эпитопы. Поскольку негистоновые белки характеризуются значительной модификационной изменчивостью, то наиболее вероятным кажется предположение о том, что такие близкие по свойствам полипептиды являются тремя модификациями одного белка.
Еще одним доказательством специфичности МКА 5Д2 может служить наличие у связывающегося с ними белка фосфопротеинкиназной активности. Для установления этого факта проводили стандартное фосфорилирование фракции НГБ-почек, обогащенной рр23 и в качестве контроля - фракции НГБ-печени интактных крыс, элюируемой с фосфоцеллюлозы аналогичным образом, не содержащей рр23. Полученные результаты свидетельствуют о специфическом взаимодейст-
вии МКА лишь с фосфорилированным белком из фракции НГБ-почек, которая содержит в основном рр23.
Таким образом МКА 5Д2 специфически связываются с НГБ-антигеном почечной природы, ассоциированным с гепатомами и не обнаруживаемым в нормальной печени. Этот белок обладает собственной фосфопротеинкиназной активностью и имеет мол. массу около 23 кДа. Он входит в число выявляемых в гепатомах и опухолях миогенно-го происхождения гетероорганных НГБ-антигенов почечной природы, которые, вероятно, могут выступать в роли эндогенных факторов клеточной пролиферации и дисдифференцировки.
Исследование гетероорганных антигенов регенерирующей
печени крыс.
Исследование антигенной дивергенции, осуществляемой за счет гетероорганных антигенов, было бы неполным, если бы не были представлены результаты изучения регенерирующей печени крыс. При этом мы хотели ответить на вопрос: характерен ли рассматриваемый нами феномен лишь для опухолевых клеток? Такой вопрос приобретал существенное значение, потому что в литературе уже имелись в то время указания на то, что синтез другой разновидности антигенов, обнаруживаемых в опухоли, -эмбриоспецифических - является не специфической особенностью злокачественного превращения, а следствием интенсивной пролиферации клеток независимо от причин ее вызвавших (Абелев и др., 1963). Это обстоятельство и побудило нас провести исследование гетероорганных антигенов клеток печени крыс в процессе их пролиферации, обусловленной частичной гепатэктомией (Higgins, Anderson, 1931). Полученные нами данные свидетельствуют о том, что процесс регенерации, вызванный операцией частичной гепатэктомии, приводит к появлению гетероорганных антигенов почечной природы в клетках печени и среди растворимых, по преимуществу цитоплазмати-ческих белков, и на наружных мембранах, и в составе хромосомных НГБ.
Растворимые гетероорганные антигены регенерирующей печени исследовали на 1-7-е, 14-е и 21 сутки после операции, на каждый срок исследования приходилось не менее 6 крыс. Антигенные свойства регенерирующей печени изучали с помощью реакции преципитации и специфической задержки преципитации в агаре. В качестве антигенов использовали водно-солевые экстракты регенерирующей печени, а также интактной печени, почек, селезенки, легких, скелетных мышц и клеток гепатомы Зайдела. В опытах использовали органоспецифиче-ские иммуносыворотки и антигепатомную, против гепатомы Зайдела (Иванов и др., 1969). Использование антигепатомной сыворотки помог-
ло составить определенное представление о характере изменений синтеза отдельных гетероорганных антигенов в процессе регенерации печени. Если содержание исследованных селезеночных и мышечных антигенов в процессе регенерации печени существенных изменений не претерпевают, то иная картина наблюдалась в отношении антигенов легочного и почечного происхождения. Усиление синтеза легочных антигенов имело место в течение всей первой недели после гепатэкто-мии и лишь спустя 2-е недели после операции содержание легочных антигенов нормализовалось, т.е. становилось неотличимым от содержания в интактной печени. Наиболее выраженные различия были выявлены при изучении почечных антигенов, которые были выявлены на всех сроках исследования и их содержание в регенерирующей печени увеличивается примерно в 2 раза по сравнению с интактной печенью.
Еще более определенные результаты были получены при использовании органоспецифической антипочечной сыворотки, с помощью которой в водно-солевом экстракте почек крыс выявляли не менее 5 органоспецифических антигенов. В экстрактах регенерирующей печени на 1-14 сут после операции можно было выявить 1-2 растворимых гетероорганных антигена почечной природы.
Итак, проведенные исследования показали, что в процессе регенерации, вызванной частичной гепатэктомией, в пролиферирующих клетках печени происходит усиление синтеза некоторых гетероорганных растворимых антигенов. Особенно отчетливо это проявилось в тех случаях, когда в качестве гетероорганных антигенов выступали орга-носпецифические почечные антигены.
Предпринимая исследование в клетках регенерирующей печени крыс мембранных гетероорганных антигенов мы имели в виду сопоставить полученные результаты с данными о выявлении мембранных гетероорганных антигенов в клетках гепатоцеллюлярных опухолей (Иванов и др., 1975), чтобы обсудить условия, приводящие к синтезу указанных антигенов (Иванов, Фель, 1979).
Антигенные свойства регенерирующей печени изучали с помощью метода непрямой иммунофлуоресценции на срезах почки и печени интактных крыс, а также печени крыс после частичной гепатэктомии на протяжении 15 сут. Срезы толщиной в 3 мкм готовили в криостате и фиксировали ацетоном. В работе использовали иммуносыворотку против клеточных мембран почек крыс. При обработке этой иммуносыво-роткой и вслед за тем флуоресцирующей сывороткой срезов почки интактных крыс обнаружено четкое специфическое свечение в щеточной каемке извитых канальцев и базальных мембранах канальцев. Однако такая процедура не приводит к свечению клеточных структур печени интактных крыс. Иной результат получен при исследовании регенерирующей печени. Уже через 1 сут после операции на срезах печени об-
наружено яркое специфическое свечение поверхности гепатоцитов. Анализ полученных результатов с учетом различных контролей реакции иммунофлуоресценции позволяет прийти к заключению, что регенераторный процесс, развивающийся в печени вслед за операцией частичной гепатэктомии, приводит к появлению на поверхности гепатоцитов гетероорганных антигенов, свойственных в норме клеточным мембранам почек взрослых крыс. Указанные антигены обнаруживаются на срезах печени на протяжении 12 сут. Результаты тестирования срезов печени на 13-15 сут после операции практически не отличались от результатов контрольного тестирования срезов печени интактных крыс. Надо сказать, что в эти сроки происходит почти полное восстановление исходного веса органа (Сидорова и др., 1966; Саркисов, 1970). Вместе с тем необходимо отметить, что интенсивность свечения не была одинаковой на всех сроках исследования, более яркое свечение наблюдалось в 1-5 сут после гепатэктомии. Можно предположить, что такой результат служит выражением более интенсивного синтеза гетероорганных почечных антигенов в эти сроки после операции, также, как ранее мы показали, что на 2-6-е сут после операции гепатоциты оегенерирующей печени синтезируют больше растворимых органоспе-цифических почечных антигенов, нежели на более поздних сроках [Иванов и др., 1969). На ранних сроках отмечается также изменение активности и изозимного спектра некоторых ферментов (Walker, Potter, 1972; Berges et al., 1974), к этому можно добавить и синтез а-фетопротеина (Sell et al., 1974; Энгельгард и др., 1976). Следует подчеркнуть, что выраженность указанных изменений биосинтеза и сроки /IX выявления в клетках регенерирующей печени хорошо коррелируют с интенсивностью и продолжительностью митотической активности гепа-гоцитов после операции частичной гепатэктомии (Сидоров и др., 1966).
С помощью метода цитофлуорометрии при использовании им-иуносыворотки узкой специфичности против гетероорганных антигенов точечной природы, свойственных клеткам гепатомы Зайдела нам удаюсь не только локализовать исследуемые антигены на поверхности полированных гепатоцитов, но и получить некоторые количественные <арактеристики их синтеза. Гетероорганные почечные антигены были обнаружены на поверхности 20-30% клеток, изолированных из печени 4а 4-е сут после операции частичной гепатэктомии. При этом содержа-we этих антигенов на исследуемых клетках составляло около 40% относительно их содержания на поверхности клеток гепатомы Зайдела, гаторые были приняты за 100% (Иванов, Фель, 1975).
Важный аспект результатов этой работы - обратимый характер выявляемых изменений биосинтеза. В своей основе они несомненно связаны с действием эпигенотипических механизмов - деблокированием активности тех генов, в компетенцию которых входит синтез нор-
мальных клеточных антигенов, выступающих в качестве гетероорган-ных. Сходные изменения биосинтеза претерпевают и клетки опухолей (в том числе гепатоцеллюлярных), однако здесь в отличие от клеток регенерирующей печени они становятся необратимыми, наследуемыми на этапах опухолевой прогрессии (Фель, Швембергер, 1968). Прекращение синтеза гетероорганных антигенов в регенерирующей печени к моменту затухания пролиферативных процессов и, напротив, выявление этого признака в ряду многих поколений безудержно размножающихся опухолевых клеток ставит рассматриваемый феномен в зависимость от пролиферации. Правда такая зависимость не всегда выявляется: мы, например, не смогли обнаружить растворимые гетероор-ганные антигены при тестировании экстрактов усилено пролифери-рующих клеток костного мозга (Иванов и др., 1973) и мембранные гете-роорганные антигены на поверхности активно пролиферирующих, но не опухолевых клеток - культуры миогенных клеток (Терюкова и др., 1996). Поэтому кажется допустимым предположение, согласно которому синтез гетероорганных антигенов может быть связан не только или не столько с пролиферацией клеток, сколько с их автономизацией от некоторых регулирующих воздействий - временной при регенерации и практически необратимой при малигнизации.
Исследование гетероорганных антигенов почечной природы в составе ядерных негистоновых белков (НГБ) регенерирующей печени крыс проводили с помощью реакции специфической задержки преципитации в агаре (РСЗПА), используя иммуносыворотку против комплексов НГБ-ДНК из почек интактных крыс, которая предварительно истощалась препаратами НГБ печени интактных крыс (Кушнер и др., 1986; Фель и др., 1984). Антигенные свойства препаратов НГБ регенерирующей печени взятой в опыт спустя 4 и 20 сут после операции частичной гепатэктомии сравнивали с антигенными свойствами препаратов НГБ почек и печени интактных крыс, печени после ингаляционного отравления крыс парами ССЦ, взятой на 4-е сут после воздействия и клеток гепатомы 27. Иммуносыворотка не выявляла полос преципитации с препаратами НГБ печени интактных крыс, также как и крыс, взятых на 4-е сут после воздействия ССЦ. В то же время препараты НГБ регенерирующей печени на 4-е сутки (РП-4) и гепатомы 27 образуют четкие полосы преципитации. Некоторые из них отчетливо демонстрируют феномен идентичности с полосами преципитации, образуемыми препаратами НГБ почек интактных крыс, что позволяет в конечном счете говорить об обнаружении в препаратах НГБ РП-4 и гепатомы 27 гетероорганных антигенов почечной природы. Через 20 сут после операции частичной гепатэктомии обнаружить последние в препаратах НГБ печени уже не удавалось. Выявление в препаратах НГБ из гепатомы и РП-4 идентичных гетероорганных антигенов почечной природы позво-
ляет предположить наличие общих условий, сопряженных с экспрессией их синтеза. К таковым, очевидно, следует прежде всего отнести пролиферативную активность клеток гепатоцеллюлярной опухоли и клеток печени после частичной гепатэктомии. Видимо, сходным образом действуют и гепатоканцерогены. Рассматриваемые антигены не удалось выявить в печени крыс на 4-е сут после воздействия CCI4 на 20 сут после частичной гепатэктомии, что, по-видимому, связано с отсутствием или недостаточной выраженностью регенерационного процесса в первом случае (Zimmerman, 1978), а во-втором - с его завершением. Не исключено поэтому, что экспрессия синтеза гетероорган-ных НГБ-антигенов почечного происхождения имеет какое-то отношение к появлению или заметному повышению содержания некоего про-лиферативного фактора, связанного, возможно, с деблокированием клеточного онкогена. В настоящее время примеры такой связи найдены экспериментально. Как известно, большинство онкобелков проявляют фосфопротеинкиназную активность (Киселев, 1983; Шапот и др., 1983). Обнаруженные нами гетероорганные антигены почечной природы оказались сопряженными с фракциями НГБ, элюируемыми 0,4-0,5 М NaCI при хроматографии на фосфоцеллюлозе и обладающими специфической собственной фосфопротеинкиназной активностью. Фос-фопротеинкиназы многочисленны и разнообразны по свойствам и функциям и, вероятно, активация синтеза некоторых из них может быть ответственна за появление в гепатомах, регенерирующей печени, а также в печени крыс, испытавших действие гепатоканцерогенов , гете-роорганных антигенов как самих НГБ, так и любого другого типа, например, растворимых цитоплазматических или мембранных гетероор-ганных антигенов почечного происхождения. В любом случае процессы специфического фосфорилирования в геноме независимо от состояния клеточных онкогенов могут приводить к эпигенотипическим сдвигам экспрессии генов в клетках, влияя на фенотип (Kleinsmith et al., 1975). Поэтому, вероятно, неудивительно, если впервые обнаруженные и характеризуемые нами ассоциированные с гепатомами крыс гетероорганные НГБ-антигены почечной природы окажутся связанными с факторами, имеющими отношение к клеточной пролиферации в регенерирующей или подвергнутой действию канцерогенов печени.
Обращает на себя внимание тот факт, что гетероорганные антигены одной тканевой принадлежности, а именно почечного происхождения, обнаружены нами в цитоплазме, на наружных мембранах и в составе хромосомных НГБ клеток гепатоцеллюлярных опухолей, а также в клетках печени крыс, испытавших однократное воздействие гепатоканцерогенов или операцию частичной гепатэктомии. Не исключено, что появление этих антигенов в различных компартментах клетки - не случайное совпадение, а обусловленная причинно-следственными от-
ношениями цепь событий, начальным звеном которой могут быть изменения в составе НГБ. Согласно литературным данным НГБ способны определенным образом участвовать в процессе транскрипции и, вероятно, выступать в качестве факторов, регулирующих генную экспрессию. Необходимо прежде всего искать ответ на вопрос, почему НГБ-антигены почечной природы, являясь конститутивными компонентами хроматина клеток почек, оказываются в числе антигенов, отличающих НГБ двух изученных нами гепатом от НГБ дефинитивной печени и почему появление их в составе последних после канцерогенного воздействия свидетельствует, во всяком случае феноменологически, о сдвигах в сторону малигнизированных клеток? Одним из возможных объяснений может быть следующее. Если эти фракции НГБ являются продуктами активности клеточных онкогенов, то до появления малиг-низирующего действия необходимо их определенное сочетание (Шапот и др., 1983), которого, видимо, нет в клетках почек интактных крыс, но которое может возникнуть при соответствущих условиях в клетках печени крыс, получавших гепатоканцерогены или, естественно, существовать в клетках зрелых гепатом.
Выводы
1. Исследование антигенных свойств 63 индуцированных и перевивных опухолей крыс гепатоцеллюлярного, почечного и скелетно-мышечного происхождения выявило разнонаправленный характер нарушения синтеза некоторых нормальных клеточных антигенов, проявляющийся в одних и тех же опухолях в некоррелируемой степени снижения или, напротив, в интенсификации синтеза отдельных групп антигенов.
2. При изучении гепатоцеллюлярных, почечных и миогенных опухолей закономерно выявляются гетероорганные антигены, синтез которых свойствен главным образом дефинитивным тканям, негомологичным исследуемым опухолям.
3. В качестве гетероорганных антигенов в ряде случаев могут выступать органоспецифические антигены: в частности водно-растворимые почечные и мышечные антигены в экстрактах гепатом, мышечные антигены в экстрактах аденокарцином почек и мембранные антигены почек на поверхности асцитной гепатомы Зайдела.
4. Гетероорганные антигены выявляются в определенных случаях и в неопухолевых тканях, клетки которых пролиферируют - в печени вслед за воздействием гепатоканцерогенами, в регенерирующей печени после операции частичной гепатэктомии. В процессе регенерации печени, вызванной частичной гепатэктомией в пролиферирующих клетках печени крыс происходит усиление синтеза гетероорганных ан-
гигенов и, в частности, органоспецифических антигенов. Наряду с этим, в клетках костного мозга, кишечника для которых пролиферация является нормой, гетероорганных антигенов выявить не удалось.
5. Небольшая доля (около 1%) клеток эмбриональной печени (рыс (17-18 суточные эмбрионы) содержит мембранный гетероорганный антиген почечной природы.
6. Гетероорганные антигены одного тканевого происхождения обнаруживаются в различных клеточных структурах: в цитоплазме, на иембранах и в составе хромосомных негистоновых белков.
7. В результате однократного воздействия на крыс гепатоканце-эогенов гетероорганные антигены выявляются в тканях-мишенях уже ^рез 1 сутки после воздействия; их можно обнаружить в течение 21 ;уток после аппликации 4-диметиламиноазобензола и 70 суток после аппликации М-диэтилнитрозамина. Исследуемые антигены не обнаружены в клетках печени крыс после однократного воздействия на них соответствующих неканцерогенных аналогов, так же как не обнаружены и в гепатоцитах взрослых интактных крыс.
8. С помощью электрофоретического разделения элюированных ; иммуносорбента белков выделены мембранные органоспецифиче-;кие антигены почек крыс, представленные 6 компонентами, один из <оторых идентифицирован как мембранный гетероорганный опухоле-эссоциированный антиген почечного происхождения с мол. массой эколо 50 кДа, обозначенный нами как МА-50.
9. Выделен и охарактеризован гетероорганный антиген почечной природы в составе хромосомных негистоновых белков. Им оказалась протеинкиназа с мол. массой 23 кДа, обозначенная нами как рр23. Результаты работы позволяют допустить, что этот белок можно рассмат-эивать в качестве одного из эндогенных факторов регуляции экспрес-:ии генов, влияющих на дисдифференцировку и пролиферацию клеток.
Список работ, опубликованных по теме диссертации
1. Фель В.Я., Швембергер H.H., Иванов В.А. К исследованию специфи-
ческих антигенов, вызванных у крыс введением N-нитроздиэтила-мина.//Цитология. 1965. Т.7, N3. С.416-420.
2. Фель В.Я., Иванов В.А., Цикаришвили Т.Н., Швембергер И.Н. К им-
мунологической характеристике гепатоцеллюлярных опухолей крыс.//В сб.: Клеточная наследственность и злокачественный рост. М.-Л. 1966а. С. 123-134.
3. Фель В.Я., Иванов В.А., Бахтин Ю.Б., Швембергер И.Н. К иммуноло-
гической характеристике миогенных опухолей крыс.//В сб.: Клеточная наследственность и злокачественный рост. М.-Л. 19666. С.113-122.
4. Фель В.Я., Иванов В.А., Швембергер И.Н. Иммунологическая харак-
теристика опухолей почек крыс и некоторые общие замечания о характере антигенной перестройки экспериментальных опухо-лей.//В сб.: Клеточная наследственность и злокачественный рост. М.-Л. 1966в; С. 134-145.
5. Фель В.Я., Иванов В.А., Цикаришвили Т.Н., Бахтин Ю.Б., Швембер-
гер И.Н., Оленов Ю.М. Характеристика гетероантигенов экспериментальных опухолей крыс.//В сб.: Клеточная наследственность и злокачественный рост. М.-Л. 1966г. С.146-153.
6. Фель В.Я., Иванов В.А., Бахтин Ю.Б., Оленов Ю.М. О гетероантиге-
нах миогенных опухолей крыс.//ДАН СССР. 1966. Т.168, N2. С.451-453.
7. Иванов В.А., Фель В.Я., Оленов Ю.М. О некоторых антигенах в клет-
ках асцитной гепатомы Зайдела.//Цитология. 1968. Т. 10, N3. С.364-372.
8. Ivanov V.A., Fei V.Ja., Olenov Ju.M. The investigation of some antigens
of Zajdela ascitic rat hepatoma cells.//Cancer Research. 1968. V.28, N8. P.1524-1530.
9. Иванов В.А., Фель В.Я., Оленов Ю.М. О гетероорганных антигенах
регенерирующей печени крыс.//Цитология. 1969. Т. 11, N10. С.1306-1312.
10. Иванов В.А. О нарушениях синтеза некоторых нормальных клеточ-
ных антигенов печени крыс в процессе малигниза-ции.//Автореферат канд.дисс. Л. 1970. 20с.
11. Fei V.Ja., Ivanov V.A., Olenov Ju.M. Some characteristic of organic
specific antigens of tumor cells.//Tenth International Cancer Congress. Houston USA. 1970. P.226-227.
12. Фель В.Я., Иванов B.A., Оленов Ю.М. Изучение гетероорганных ан-
тигенов опухолевых клеток и проблемы канцерогене-
за.//Материалы Всесоюзного симпозиума "Механизмы канцерогенеза". Киев. 1972. С.99-100.
13. Иванов В.А., Фель В.Я., Оленов Ю.М. Исследования синтеза гете-
роорганных антигенов как метод эпигеномной изменчивости опухолевых клеток.//В сб.: Структура, функция и реактивность клеток. Л. 1973. С.67-68.
14. Иванов В.А., Фель В.Я., Оленов Ю.М. Сравнительное изучение по-
верхностных антигенов клеток асцитной гепатомы Зайдела методами иммунодиффузии и иммунофлуоресценции.//В сб.: "Функциональная морфология, генетика и биохимия клетки". Л. 1974. С. 155-157.
15. Иванов В.А., Фель В.Я. О гетероорганных антигенах мембран опу-
холевых клеток./ГГез. докл. Всесоюзного симпозиума "Молекулярные механизмы канцерогенеза и действия противоопухолевых средств". Ленинград. 1974. С.83-84.
16. Иванов ВА., Фель В.Я., Оленов Ю.М. О мембранных антигенах
клеток асцитной гепатомы Зайдела.//Цитология. 1975. Т. 17, N1. С. 24-29.
17. Аверцев С.А., Иванов В.А., Фель В.Я., Оленов Ю.М. Иммунологиче-
ское изучение первичного действия канцерогенов.//Тез. докл. Всесоюзного симпозиума "Иммунология опухолей". Киев. 1975. С.7-9.
18. Иванов В.А., Аверцев С.А., Фель В.Я., Оленов Ю.М. Антигенная пе-
рестройка в печени мышей и крыс вследствие однократного канцерогенного воздействия./ЛЦитология. 1977. Т.19, N7. С.781-785.
19. Иванов В.А., Аверцев С.А. Гетероорганные антигены как маркеры
нарушения цитодифференцировки при малигнизации./ГГруды ill Всесоюзного съезда ВОГиС им. Н.И.Вавилова. Ленинград. 1977. Т.2, N1. С.82-83.
20. Иванов В.А., Фель В.Я. Исследование мембранных гетероорганных
антигенов регенерирующей печени крыс.//Цитология. 1979. Т.21, N1. С.115-118.
21. Иванов В.А., Белишева Н.К., Якобидзе В.Э., Фель В.Я. К оценке из-
менений антигенной структуры печени крыс после однократного канцерогенного воздействия.//Цитология. 1979. Т.21, N7. С.836-841.
22. Захарова Н.В., Медведева Н.Д., Ходосова И.А., Иванов В.А., Фель
В.Я. Локализация эмбрионального изофермента в клетках печени крыс после однократной инъекции канцерогена 4-диметиламиноазобензола и его неканцерогенного анало-га.//Цитология. 1980. Т.22, N7. С.800-804.
23. Fei V.Ja., Zakharova N.V., Ivanov V.A., Medvedeva N.D., Khodosova
I.A. Manifestation of alpha-fetoprotein, aldolase fetal isoenzyme (A)
and heteroorganic antigens of kidney origin in rat liver cell in short space of time after a signle hepatocarcinogen treatment.// Vlll-th Meeting of Internftional Society for Oncodevelopmental Biology and Medicine. Tallinn. 1980. P.38-39.
24. Ivanov V.A., Fel V.Ja. On some similarity between membrane antigens
of the cell of Zajdela hepatoma and liver of rats subjected to a single 4-dimethylaminoazobenzene injection.//Neoplasma. 1980. V.27, N6. P.745-750.
25. Fel V.Ja., Zacharova N.V., Ivanov V.A., Medvedeva N.D., Khodosova
I.A. Expression of a-fetoprotein, aldolase fetal isozyme A and heteroorganic antigens in rat liver cell after a single hepatocarcinogen treatment.//Onco-developmental Biol, and Medicine. 1981, T.2, N3. P.197-201.
26. Подгоецкая Д.Я., Гершун B.A., Иванов B.A., Фель В.Я. Сравнение
антигенного состава нуклеопротеидных компонентов из ядер нормальных и опухолевых клеток.//Тез. докл. VI Конференции биохимиков Прибалтийских республик, Белоруссии и Ленинграда. Рига. 1981. С. 150-151.
27. Иванов В.А., Ходосова И.А., Захарова Н.В., Медведева Н.Д. Экс-
прессия генов, контролирующих синтез эмбриональных и гетеро-органных антигенов в клетках печени крыс после однократного воздействия гепатоканцерогеном 4-диметиламиноазобензолом. Труды IV съезда ВОГиС им. Н.И.Вавилова. 1982. Т.1. С.95-96.
28. Иванов В.А. Антигенные перестройки клеточных структур как след-
ствие первичного действия химических канцерогенов.//Глава в коллективной монографии: "Цитологические аспекты первичного действия химических канцерогенов". "Наука". -Ленинград. 1982. С.23-58.
29. Иванов В.А. Выявление ассоциированных с опухолью мембранных
гетероорганных антигенов почечной природы в печени крыс после однократного воздействия 4-диметиламиноазобензола.//Тез. докл. Всесоюзного совещания "Клеточные и молекулярные механизмы канцерогенеза и антиканцерогенеза". Цитология. 1982. Т.24, N9. С.1099-1100.
30. Кушнер В.П., Гершун В.А., Горячева А.А., Иванов В.А., Фель В.Я.
Изменения в составе ядерных негистоновых белков печени крыс, связанные со стимуляцией пролиферативной активности гепато-цитов после частичной гепатэктомии и действия канцерогенных факторов.//Цитология. 1984. T.26..N9. С.1072-1073.
31. Фель В.Я., Кушнер В.П., Иванов В.А., Трошин А.С. Ядерные негис-
тоновые белки гепатом и печени крыс после действия гепатокан-церогенов и частичной гепатэктомии.//ДАН СССР. 1984. T.279.N4. С.1008-1011.
32. Кушнер В.П., Гершун В.А., Горячева А.А., Иванов В.А., Фель В.Я.
Выявление общих черт в антигенной структуре и спектрах собственной фосфопротеинкиназной активности водорастворимых фракций свободных от ДНК негистоновых ядерных белков гепа-том и печени крыс после однократного введения гепатоканцеро-генов.//Экспериментальная онкология. 1985. Т.7, N5. С.30-34.
33. Кушнер В.П., Иванов В.А., Фель В.Я. Гетероорганные антигены по-
чечной природы в составе ядерных негистоновых белков регенерирующей печени крыс.//Цитология. 1986. T.28.N1. С.96-101.
34. Ходосова И.А., Иванов В.А., Захарова Н.В., Фель В.Я. Морфологи-
ческая и иммунологическая характеристика печени крыс после однократного воздействия гепатоканцерогенов.//Эксперименталь-ная онкология. 1986. Т.8, N1. С.36-39.
35. Ivanov V.A., Kushner V.P., Fel V.Ja. Antigenic diversion of rat liver cells
characteristic of hepatocellular tumors after a single carcinogenic treatment and partial hepatectomy. Biologica Hungarica. 1986. V.37. P.225.
36. Кушнер В.П., Грандилевская А.Б., Иванов B.A., Фель В.Я. Некото-
рые молекулярно-функциональные характеристики ассоциированных с гепатомами крыс гетероорганных антигенов почечной природы в составе негистоновых белков хроматина.//Тез.докл. на Всесоюзном симпозиуме "Структура и функции клеточного ядра". Черноголовка. 1987. С.167.
37. Кушнер В.П., Иванов В.А., Грандилевская А.Б., Фель В.Я. Радио-
метрическое выявление невизуализируемых иммунопреципита-тов, образуемых ассоциированными с гепатомой гетероорганны-ми антигенами почечной природы 33Р-фосфорилированных фракций негистоновых белков хроматина.//Цитология. 1988. Т.ЗО, N1. С.53-57.
38. Кушнер В.П., Грандилевская А.Б., Иванов В.А. Молекулярные мас-
сы ассоциированных с гепатомами крыс НГБ-антигенов почечной природы.//Цитология. 1988а. Т.ЗО, N10. С.1226-1231.
39. Назаров И.В., Иванов В.А., Фель В.Я. Антигенная дивергенция в
первичной культуре гепатоцитов крыс после воздействия гепато-канцерогеном 1М-нитрозодиэтиламином.//Цитология. 1989. Т.31, N3. С.352-355.
40. Иванов В.А., Кушнер В.П., Фель В.Я. Гетероорганные антигены как
маркеры дисдифференцировки опухолевых клеток.//Тез.докп. I Всесоюзного съезда иммунологов. Сочи. 1989. Т.2. С.55-56.
41. Иванов В.А., Федоров Л.Ю., Грандилевская А.Б., Климова А.А.,
Кушнер В.П., Фель В.Я. Влияние препаратов негистоновых белков хроматина на экспрессию мембранных гетероорганных антигенов
почечной природы в первичной культуре гепатоцитов крыс.//Цитология. 1990. Т.32, N1. С.291-294.
42. Кушнер В.П., Климова A.A., Федоров Л.Ю., Иванов В.А. Выявление
гетероорганных антигенов хромосомных негистоновых белков почечной природы ассоциированных с гепатомами крыс в составе миогенных опухолей.//Экспериментальная онкология. 1992. Т.14, N2. С.36-39.
43. Иванов В.А., Кушнер В.П. Гетероорганные антигены и дисдиффе-
ренцировка опухолевых кпеток.//Тез.докл. на I Съезде иммунологов РСФСР. Новосибирск. 1992. С.179-180.
44. Иванов В.А., Федоров Л.Ю., Грандилевская А.Б., Климова A.A.,
Кушнер В.П., Фель В.Я. Экспрессия гетероорганных антигенов почечной природы на поверхности культивируемых гепатоцитов крыс под влиянием узких фракций хромосомальных негистоновых белков.//Цитология. 1992. Т.34, N1. С.80-В4.
45. Грандилевская A.B., Полынцев Д.Г., Кушнер В.П., Иванов В.А. По-
лучение моноклональных антител к негистоновому белку хроматина почек крыс, ассоциированному с гепатомами.//Цитология. 1993. Т.35, N9. С.57-61.
46. Терюкова Н.П., Иванов В.А. Выделение и характеристика мембран-
ных гетероорганных антигенов почечной природы, ассоциированных с гепатомой Зайдела.У/Цитология. 1993. Т.35, N8. С.59-64.
47. Иванов В.А., Фель В.Я. Сравнительное изучение синтеза мембран-
ных гетероорганных антигенов почечной природы на тканевых срезах и изолированных клетках после однократного канцерогенного воздействия на крыс.//Цитология. 1995. Т.37, N3. С.227-231.
48. Кушнер В.П., Грандилевская А.Б., Климова A.A., Блинова Г.И., Ива-
нов В.А. Сравнительное изучение хромосомных негистоновых белков (рр23) из почек крыс и быка.//Цитология. 1996. Т.38, N6. С.596-599.
49. Терюкова Н.П., Тюряева И.И., Грандилевская А.Б., Иванов В.А.
Мембранные гетероорганные антигены опухолевых клеток гепа-тоцеллюлярного и миогенного происхождения.//Цитология. 1996. Т.38, N6. С.1092-1097.
50. Терюкова Н.П., Тюряева И.И., Грандилевская А.Б., Иванов В.А. Вы-
явление мембранных опухолеассоциированных антигенов гепа-томы Зайдела на поверхности культивируемых клеток крыс.//Цитология. 1997. Т.39, N7. С.577-581.
51. Kushner V.P., Blinova G.I., Grandilevskaya A.B., Klimova A.A., Ivanov
V.A. Stimulation of cell proliferation by chromosomal nonhistone proteins pp23.//Experimental oncology. 1997. V.19, N4. P.300-306.
Текст научной работыДиссертация по биологии, доктора биологических наук, Иванов, Вадим Александрович, Санкт-Петербург
^ л. (
РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ ЦИТОЛОГИИ
:дйум ВАК Р о с с тШ™
УДК 575.21:Г
(pc.iv:
к... г,, 1-й 7ф
............ \ ЪГ'ТИ
& рукописи .3:616-006
■У
1 Г
Начал!
ИВАНОВ.
наук
Х^ОССН
м Александрович
«•—• у
АНТИГЕННАЯ ДИВЕРГЕНЦИЯ ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТОК КАК ПРОЯВЛЕНИЕ НАРУШЕНИЯ ЦИТОДИФФЕРЕНЦИРОВКИ ПРИ КАНЦЕРОГЕНЕЗЕ
03.00.25 - клеточная биология
ДИССЕРТАЦИЯ (в форме научного доклада) на соискание ученой степени доктора биологических наук
Санкт-Петербург 1998
Работа выполнена в Институте цитологии РАН, Санкт-Петербург
Официальные оппоненты:
доктор медицинских наук, профессор В.Б. ОКУЛОВ, НИИ онкологии им. проф. H.H. Петрова МЗ РФ, С.-Петербург доктор медицинских наук, профессор П.Г. НАЗАРОВ, НИИ "экспериментальной медицины РАМН, С.-Петербург доктор биологических наук, профессор В.И. ВОРОБЬЕВ, Институт цитологии РАН, С.-Петербург
Ведущее учреждение: Онкологический н *"L
Москва
Защита состоится «,5»__w
на заседании Диссертациош цитологии РАН по адресу: 1 >
С диссертацией можно оз?
Инс'1 гута цитологии РАН
Диссертация (в форме доклада) разослана « / » ¿{/СМА- 1998 г.
Ученый секретарь Диссертащюншдго совета
доктор биологически^ча^к^/^^^й^ JI.H. ПИСАРЕВА
'j > • J 1
il
Общая характеристика работы
Актуальность проблемы. Проблема неопластической трансформации клеток является одной из основных проблем современной биологии и медицины. В этом направлении накоплен значительный экспериментальный материал, однако обилие важных сведений о канцерогенезе до сих пор еще не оформилось в единое, приемлемое для большинства специалистов теоретическое обобщение (Киселев, 1986). Такое положение объясняется прежде всего сложностью феномена малигнизации, недостаточной изученностью связанных с ним фундаментальных биологических процессов роста, пролиферации и диффе-ренцировки клеток.
Многолетние исследования причин возникновения злокачественных новообразований привели в настоящий момент к утверждению полиэтиологической теории возникновения опухолей и многостадийности этого процесса. Среди факторов, способных индуцировать неоплазмы, можно перечислить следующие: инородные тела - полимерный канцерогенез (Turner, 1941; Елисеев, Плисс, 1977; Можесс, 1981; 1986; Murhy, 1984, и др.), вирусы - вирусный канцерогенез (Зильбер, 1958; 1960; 1968; Зильбер и Абелев, 1962; Neinberg; 1980; Bernard et al., 1985, и др.), рентгеновское излучение - радиационный канцерогенез (Владимиров и др., 1972; Greenstock, 1984; Brasso-Ricci, 1985. и др.), химические агенты - химический канцерогенез (Bernblum, 1941; 1949; 1981; Коростелева, 1964; 1965; 1966; Рапопорт, 1970; Абелев, 1974; Оленов, 1977; Heidelberger, 1979, и др.).
В лаборатории цитологии опухолевого роста Института цитологии РАН на протяжении многих лет проводятся всесторонние исследования химического канцерогенеза. Такие исследования не теряют своей актуальности, поскольку механизмы химического канцерогенеза остаются не раскрытыми. При канцерогенезе происходит значительное нарушение нормального хода цитодифференцировки, что, естественно, Заходит свое выражение в нарушении биосинтетических процессов, в Частности, в изменении антигенного состава трансформированных клеток. Антигенный состав той или иной разновидности соматических клеток весьма сложен и сохраняется неизменным на протяжении мно-Ьш клеточных поколений, являясь стабильным признаком соответст-Ьующего клона клеток. Поэтому при изучении нарушений процесса ци-[годифференцировки в результате малигнизации необходимо проследить, как происходят изменения синтеза различных групп нормальных ¿клеточных антигенов. Очевидно, что для того, чтобы составить предоставление о характере этих изменений, важно знать набор нормальных „клеточных антигенов и параметры их синтеза на разных этапах канце-
рогенеза, чтобы соотнести эти данные с данными, полученными при исследовании формирующейся или уже сформировавшейся опухоли. Особое значение приобретает исследование ранних сроков канцерогенеза, поскольку известно, что наиболее существенные события, определяющие судьбу опухолевого процесса и организма, в котором он возник, происходят в значительной мере в ранние сроки после неопластической трансформации клеток. В процесс злокачественного превращения клеток могут быть вовлечены различные группы нормальных клеточных антигенов, синтез которых претерпевает при этом различные изменения. Дэй (Day, 1965) классифицировал эти изменения следующим образом. 1. Антигенное «упрощение» опухолевых клеток - утрата или значительное снижение синтеза некоторых нормальных клеточных антигенов (Weiler, 1952; 1956; 1959; Абелев и др., 1959). 2. Антигенная реверсия - реставрация опухолевыми клетками синтеза эм-бриоспецифических антигенов, свойственных нормальным исходным тканям в эмбриональный период их развития и отсутствующих в дефинитивных тканях (Hirschfeld, Halber, 1932; Maculla, 1947; Вязов, 1956; Абелев и др., 1963; Gold, Freedman, 1965, и др.). 3. Антигенная дивергенция - изменение антигенного состава опухоли, при котором в последней обнаруживаются антигены, свойственные нормальным тканям, негомологичным опухоли (Day, 1965; Фель, Иванов, 1965). Указанные изменения антигенного состава являются разными сторонами одного и того же процесса малигнизации клеток. Как видно из самих формулировок, антигенная реверсия и антигенная дивергенция в отличие от антигенного упрощения могут быть расценены как своеобразное антигенное усложнение, осуществляемое за счет тех или иных клеточных антигенов, входящих в «репертуар» нормального генома. Перечисленные изменения антигенного состава являются наиболее типичными проявлениями нарушения цитодифференцировки при малигнизации и, если первые два - антигенное «упрощение» и антигенная реверсия - достаточно полно исследованы, то феномен антигенной дивергенции опухолевых клеток изучен крайне недостаточно и по существу еще не осмыслен. Исследования в этом направлении чаще всего ограничиваются поисками опухолеассоциированных антигенов и выделением их из опухолевых клеток для использования в практических целях. В то же время изучению этого явления в более широком биологическом плане с целью использования полученных результатов для выяснения молекулярных и клеточных механизмов канцерогенеза, задающих направление нарушений дифференцировки малигнизирован-ных клеток, в научной литературе, к сожалению, почти не уделяется внимания.
В связи с тем, что было сказано выше, основная цель настоящей работы заключалась в исследовании антигенной дивергенции опухоле-
вых клеток, обусловленной экспрессией гетероорганных антигенов. Таким термином мы предложили обозначать антигены опухолевых клеток, присущие дефинитивным тканям, негомологичным исследуемой опухоли, содержание которых в опухоли повышено по сравнению с исходной нормальной тканью. В работе не только уделено внимание феноменологическому подходу при изучении антигенной дивергенции опухолевых клеток, но и предпринята попытка выяснить некоторые клеточные и молекулярные механизмы этого феномена.
Конкретные задачи работы.
1. Получить специфические иммуносыворотки к исследуемым антигенам.
2. С помощью полученных иммуносывороток при использовании иммунологических и биохимических методов исследования провести сравнительное изучение антигенного спектра нормальных тканей и опухолей различного гистогенеза и на разных стадиях опухолевой прогрессии.
3. Изучить гетероорганные антигены в различных компартментах клетки: в цитоплазме, в клеточных мембранах и в составе ядерных не-гистоновых белков хроматина. Для этого экспрессию гетероорганных антигенов определить в эмбриональных и дефинитивных тканых крыс, в условиях нормальной пролиферации клеток (костный мозг, кишечник, культура клеток), при репарации органа (процессы в регенерирующей печени после операции частичной гепатэктомии), при действии на животных канцерогенов и в уже сформировавшихся опухолях.
4. Изучить гетероорганные антигены при однократном воздействии на животных канцерогенов и их неканцерогенных структурных аналогов. Выяснить сроки появления гетероорганных антигенов, продолжительность синтеза и локализацию их в клетках.
5. Получить количественную характеристику синтеза гетероорганных антигенов.
6. Выделить отдельные гетероорганные антигены в очищенном виде, идентифицировать их и выявить их функциональное значение.
Научная новизна работы. 1. Впервые предложен термин «гетероорганные антигены» для обозначения группы клеточных антигенов, обнаруженных в опухолях, входящих в «репертуар» нормального генома, синтез которых присущ нормальным тканям негомологичным опухоли. Дана развернутая характеристика антигенной дивергенции опухолевых клеток, осуществляемой за счет гетероорганных антигенов, - как отмечалось выше, одного из наиболее характерных проявлений нарушения цитодифференцировки при неопластической трансформации клеток. В работе обобщен обширный оригинальный и по ряду позиций приоритетный экспериментальный материал.
2. Впервые показано, что в качестве гетероорганных антигенов могут выступать органоспецифические антигены, определяющие специфику отдельных органов и тканей животных данного вида и являющиеся своего рода «маркерами» дифференцированного состояния тканей.
3. Впервые показано, что гетероорганные опухолеассоциированные антигены одной тканевой принадлежности (почечные) могут быть выявлены в различных компартментах клетки (в цитоплазме, на наружных мембранах клетки и в составе ядерных негистоновых белков хроматина). Предложена гипотеза, согласно которой первоначальные изменения происходят в ядерных НГБ хроматина, которые как известно, участвуют в процессе транскрипции, что, вероятно, влечет за собой изменения антигенных свойств в других клеточных структурах.
4. Впервые показано, что гетероорганные антигены выявляются в определенных случаях и в неопухолевых тканях, клетки которых энергично пролиферируют - в регенерирующей печени крыс после операции частичной гепатэктомии и в печени вслед за воздействием на животных гепатоканцерогенов. При этом установлено, что гетероорганные антигены обнаруживаются в тканях-мишенях достаточно рано, уже через сутки после канцерогенного воздействия или операции частичной гепатэктомии; определены сроки синтеза исследованных гетероорганных антигенов: водно-растворимых, мембранных и в составе ядерных НГБ хроматина и обратимый характер их синтеза при однократном воздействии канцерогенов, что связано, по всей вероятности, с обратимым изменением активности соответствующих генов.
5. Впервые удалось выделить среди мембранных органоспецифиче-ских антигенов почек крыс ассоциированный с гепатомами мембранный гетероорганный антиген почечной природы с мол. массой около 50 кДа, обозначенный нами как МА-50. Также впервые выделен и охарактеризован гетероорганный НГБ-антиген почечной природы, Оказалось, что этот антиген обладает собственной фосфопротеинкиназной активностью и мол. массой 23 кДа. Этот антиген обозначен нами как рр23. Предложена гипотеза, согласно которой выявление мембранных и ядерных гетероорганных антигенов одного тканевого происхождения -не случайное совпадение, что в основе феномена лежат причинно-следственные связи. Предложен оригинальный подход при исследовании индукции мембранных гетероорганных антигенов в первичной культуре изолированных гепатоцитов интактных взрослых крыс под влиянием мономолекулярных фракций НГБ и, в частности, рр23. Кроме того показано, что рр23 влияет на пролиферацию покоящихся клеток в культуре. Результаты экспериментов позволяют допустить, что обнаруженный нами белок рр23 может выступать в качестве одного из эндогенных факторов регуляции экспрессии генов, задающего направле-
ние дисдифференцировки неопластически трансформированных клеток и влияющего на пролиферацию клеток.
Научно-практическое значение работы. Результаты работы важны прежде всего для понимания процессов неопластической трансформации клеток и выявления тех молекулярно-клеточных механизмов, которые при этом задействованы. Изучение антигенной дивергенции, обусловленной появлением в опухолевых клетках антигенов, входящих в «репертуар» нормального генома и свидетельствующей о дисдифференцировке при неопластической трансформации клеток, явится важным звеном в построении общей теории злокачественного превращения клеток. Полученные результаты, возможно, помогут дальнейшему развитию и использованию научно-обоснованных методов борьбы со злокачественными новообразованиями. В работе обсуждается значение исследования первичного действия химических канцерогенов как способа изучения общих механизмов канцерогенеза. Наиболее адекватные условия для изучения первичного действия химических канцерогенов могут быть созданы в экспериментах с однократным воздействием на животных канцерогенных веществ. В таких случаях взаимодействие канцерогена с компонентами клеток и влияние его на метаболистические процессы проявляются, так сказать, в первоначальном виде, при этом в клетках происходят изменения, характерные для уже сформировавшейся опухоли. Такой подход может быть использован и используется в экспериментальной работе. Гетероор-ганные антигены, появляющиеся в клетках сравнительно рано, спустя 1 сутки после канцерогенного воздействия, могут быть использованы в качестве маркеров дисдифференцировки и малигнизации клеток. Результаты работы вносят существенный вклад в понимание свойств отдельных негистоновых белков и их роли во внутриклеточных процессах. Полученные данные могут быть использованы для изучения механизмов регуляции экспрессии генов при дифференцировке и трансформации клеток.
Результаты работы включены в раздел о гетероорганных антигенах, входящий в главу об опухолевых антигенах учебника, предназна-ченнного для студентов медицинских вузов и широкого круга специалистов, утвержденный Министерством здравоохранения СССР (Р.В. Петров "Иммунология", изд. "Наука". Москва, 1982, 1987).
Предложен радиометрический метод для выявления невизуали-зируемых преципитатов в геле, который может быть использован при обнаружении очень малых концентраций антигена и используется в экспериментальной работе в Институте цитологии РАН, в Медицинской академии постдипломного образования и других научных учреждениях АН и АМН РФ.
Результаты работы включены в курс лекций по цитологии для студентов биолого-почвенного факультета СПбГУ.
Апробация работы. Работа суммирует результаты собственных исследований автора, выполненных в 1965 - 1996 гг. в лаборатории генетики опухолевых клеток (зав. лабораторией д.б.н., профессор Ю.М. Оленов) и в лаборатории цитологии опухолевого роста Института цитологии РАН (зав. лаб., д.б.н., профессор В.Я. Фель).
Материалы работы докладывались на VIII Конференции памяти A.A. Заварзина (Ленинград, 1965); на Конференциях Института цитологии РАН (1966, 1967, 1969, 1972); на Конференции специалистов г. Ленинграда по онкологии и иммунологии (Ленинград, 1968); на Съездах ВОГиС им. Н.И. Вавилова (1972, 1977, 1982); на Всесоюзном симпозиуме "Механизмы канцерогенеза" (Киев, 1972); на Всесоюзном симпозиуме "Механизмы канцерогенеза и действия противоопухолевых средств (Ленинград, 1974); на Всесоюзном симпозиуме "Иммунология опухолей" (Киев, 1975); на Международном симпозиуме "Молекулярная биология и биохимия раковой клетки" (Москва, 1975); на II Всесоюзном симпозиуме "Генетическая и биохимическая характеристика злокачественного превращения клеток" (Ленинград, 1976); на Советско-французском симпозиуме "Эмбриональные опухолевые антигены" (Москва, 1978); на Советско-американском симпозиуме "Иммунология опухолей" (Москва, 1979); на III Всесоюзном съезде онкологов (Ташкент, 1979); на Международном симпозиуме по онкобиологии и медицине (Таллин, 1980); на 6-ой Конференции биохимиков Прибалтийских республик, Белоруссии и Ленинграда (Рига, 1981); на i Всесоюзном симпозиуме "Генетические процессы в опухолевых клетках" (Ленинград, 1981); на Всесоюзном совещании "Клеточные и молекулярные механизмы канцерогенеза и антиканцерогенеза" (Ленинград, 1982); на II Всесоюзном симпозиуме "Стволовые клетки и опухолевый рост" (Киев, 1983); на Всесоюзном симпозиуме "Регуляторная роль мембран в процессах дифференцировки и пролиферации клеток" (Пущино, 1983); на Всесоюзном совещании "Актуальные вопросы клеточной биологии" (Ленинград, 1984); на Всесоюзном симпозиуме "Структура и функция клеточного ядра" (Пущино, 1984; Черноголовка, 1987; С.-Петербург, 1993); на VI Симпозиуме СССР - ФРГ "Структура и функция генома" (Ленинград, 1985); на II Европейском Конгрессе по клеточной биологии (Будапешт, 1986); на I Всесоюзном съезде иммунологов (Сочи, 1989); на Всесоюзном симпозиуме "Молекулярная и клеточная онкобиология" (Львов, 1990); на I Съезде иммунологов России (Новосибирск, 1992); на XVI Международном
-
Иванов, Вадим Александрович
-
доктора биологических наук
-
Санкт-Петербург, 1998
-
ВАК 03.00.25
- Цитофотометрический анализ функционального состояния клеточных популяций в норме и при канцерогенезе
- Перекисное окисление липидов в патогенезе опухолевой болезни
- Выявление и идентификация мембранного антигена, ассоциированного с гепатоцеллюлярными опухолями крыс
- Закономерности изменения скелетных структур ядра и цитоплазмы при дифференцировке клеток in vitro
- Актомиозин из равдомиосарком и генетическая регуляция цитодифференцировки
